CN116144529B - 一株水稻科萨克氏菌oor3-1菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株水稻科萨克氏菌OOR3‑1菌株及其应用。本发明所述OOR3‑1菌株于2022年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62681。所述OOR3‑1菌株具有抗逆相关基因acds并编码ACC脱氨酶，能产生可提高植物抗逆性的生物膜，同时还具有解有机磷、解无机磷、解钾和产IAA的促生功能，可以提高楚粳28在干旱条件下的存活率，提高楚粳28幼苗的株高、根长、鲜重、叶绿素和无机营养(氮、磷和钾)含量，提高籽粒产量。此外，OOR3‑1菌株还可以改善作物生长的环境条件，对环境友好，可将其用于制备提高水稻抗旱能力、促进水稻幼苗生长及增产的产品。

Description

一株水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域。更具体地，涉及一株水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界重要的粮食作物之一，全球约50％的人口以稻米为主食，在亚洲以稻米为主食的人口约占总人口的95％。我国作为世界上最大的水稻生产国和消费国，水稻年产量居世界首位，占全球稻谷年产量的37％左右。

水稻在生产过程中对水分的需求量较大。随着全球变暖趋势的加剧，水资源短缺问题日趋严重，干旱也开始普遍发生，近年来更有加剧的趋势。水资源短缺所造成的干旱已经成为制约水稻产量持续增长的主要因素。据统计，干旱造成的水稻减产可超过其它因素所造成减产的总和，同时严重影响水稻的产量、品质及种植面积，全球已经有三分之一以上的耕地受到干旱胁迫的影响。在此背景下，提高水稻抗旱能力已经成为急需解决的关键问题。

植物内生细菌能够定殖在植物各种组织和器官的细胞间或细胞内，通过分泌植物激素、联合固氮菌、溶解磷、产生铁载体等，直接或间接的影响宿主植物对营养的吸收，促进宿主植物的生长发育，增强其抵抗外来病原菌侵染的能力。同时，植物内生细菌也会通过产生抗逆相关酶类(ACC脱氨酶等)和生物膜等物质增强寄主抵御非生物胁迫和恶劣环境的能力。虽目前已报道了一批具有提高宿主植物抗旱能力和促进宿主植物生长的植物内生细菌，但可提高水稻抗旱能力的菌株相对较少，需不断丰富相关的菌株库。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一株水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株，同时提供其在提高水稻抗旱能力，促进水稻生长中的应用。

本发明的第一个目的是提供一株水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株。

本发明的第二个目的是提供所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻抗旱能力或在制备提高水稻抗旱能力的产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在促进水稻生长或在制备促进水稻生长的产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻千粒重或在制备提高水稻千粒重的产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在增加水稻单株有效穗数或在制备增加水稻单株有效穗数的产品中的应用。

本发明的第六个目的是提供所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻产量或在制备提高水稻产量的产品中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种提高水稻植株抗旱能力和/或提高水稻产量的方法。

本发明的第八个目的是提供一种提高水稻植株抗旱能力和/或提高水稻产量的制剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明采用表面消毒研磨法及平板稀释分离法从陆稻品种“紫谷”根部中分离得到一株具有抗旱相关基因acds并编码ACC脱氨酶，能产生可提高植物抗旱性的生物膜，同时还具有解有机磷、解无机磷、解钾和产IAA的促生功能，具有提高水稻抗旱能力和促生的能力的水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株。在催芽前或移栽前，利用所述OOR3-1菌株对楚粳28进行浸泡处理，可著提高楚粳28水稻的抗旱能力，同时显著促进楚粳28水稻幼苗生长，提高植株株高、根长，鲜重及叶绿素、氮含量、磷含量和钾含量，最终提高籽粒产量。因此，本发明申请保护所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株及其应用。

本发明请求保护一株水稻科萨克氏菌(Kosakonia oryzae)OOR3-1菌株，所述OOR3-1菌株于2022年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62681。

本发明还请求保护所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻抗旱能力或在制备提高水稻抗旱能力的产品中的应用。

本发明还请求保护所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在促进水稻生长或在制备促进水稻生长的产品中的应用。

本发明还请求保护所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻千粒重或在制备提高水稻千粒重的产品中的应用。

本发明还请求保护所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在增加水稻单株有效穗数或在制备增加水稻单株有效穗数的产品中的应用。

本发明还请求保护所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻产量或在制备提高水稻产量的产品中的应用。

具体地，所述水稻为粳稻。

更具体地，所述水稻为楚粳28。

本发明还提供了一种提高水稻植株抗旱能力和/或提高水稻产量的方法，所述方法为：催芽前或移栽前，先用所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株的菌液进行浸泡处理。

具体地，所述菌液的浓度为1.0×10⁷cfu/mL～1.0×10⁹cfu/mL，浸种或浸泡处理时间为10～14h。

本发明还提供了一种提高水稻植株抗旱能力和/或提高水稻产量的制剂，所述制剂是以所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株或其菌液为活性成分。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株，所述菌株于2022年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62681。本发明所述OOR3-1菌株具有抗逆相关基因acds并编码ACC脱氨酶，能产生可提高植物抗逆性的生物膜，同时还具有解有机磷、解无机磷、解钾和产IAA的促生功能。催芽前或移栽前，利用本发明所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株处理楚粳28，可以提高楚粳28的抗旱能力，促进其生长。水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株不仅显著提高了楚粳28在干旱条件下的存活率，还提高了楚粳28幼苗的株高、根长、鲜重、叶绿素和无机营养(氮、磷和钾)含量，最终提高了籽粒产量，可将其用于制备提高水稻抗旱能力、促进水稻幼苗生长及增产的产品。

此外，OOR3-1菌株还可以改善作物生长的环境条件，对环境友好。

附图说明

图1为OOR3-1菌株的单菌落形态图；图中标尺为2mm。

图2为OOR3-1菌株的革兰氏染色结果；图中标尺为10μm。

图3为OOR3-1菌株16S rDNA序列的PCR扩增检测结果；图中M为DNA marker；泳道1为OOR3-1菌株的16S rRNA基因。

图4为OOR3-1菌株的系统发育树。

图5为OOR3-1菌株产生物膜实验结果。

图6为OOR3-1菌株acds基因的PCR扩增检测结果；图中M为DNA marker；泳道1为OOR3-1菌株的acds基因。

图7为OOR3-1菌株解有机磷能力检测结果。

图8为OOR3-1菌株解无机磷能力检测结果。

图9为OOR3-1菌株解钾能力检测结果。

图10为OOR3-1菌株固氮能力检测结果。

图11为OOR3-1菌株产铁载体能力检测结果。

图12为OOR3-1菌株产IAA能力的定性实验结果。

图13为OOR3-1菌株对楚粳28抗旱能力的影响结果；其中，图A为楚粳28在干旱处理过程中0h的生长情况；图B为楚粳28在干旱处理过程中72h的生长情况；图C为楚粳28在复水后5d的生长情况；图D为楚粳28干旱处理后的死亡率统计结果；CK代表未接菌处理/对照；**代表p＜0.01。

图14为OOR3-1菌株浸种处理后的楚粳28幼苗与对照组幼苗的对比图；图中标尺为10cm。

图15为OOR3-1菌株对楚粳28产量性状指标的影响结果；图中A～E依次为OOR3-1菌株对楚粳28的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、单株有效穗数、单株产量的影响结果；CK为未接菌对照，Treatment代表浸OOR3-1菌株处理后的植株；*代表p＜0.05。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所述OOR3-1菌株均为水稻科萨克氏菌(Kosakonia oryzae)OOR3-1菌株，该菌株于2022年9月14日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62681，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。

以下实施例中所用培养基，若无特殊说明，均经121℃灭菌20分钟后再使用。

实施例1 OOR3-1菌株的分离、纯化和培养

本发明所述水稻科萨克氏菌(Kosakonia oryzae)OOR3-1菌株分离自陆稻品种“紫谷”根部。

1、OOR3-1菌株的分离和纯化：

本发明采用表面消毒研磨法及平板稀释分离法对“紫谷”根部的内生菌进行分离：剪取健康“紫谷”的根部组织，自来水冲洗表面污渍后，用滤纸吸干表面水分，对其进行表面消毒；表面消毒程序为：75％酒精浸泡5min，无菌水漂洗1次，2.5％次氯酸钠浸泡3min，无菌水漂洗3次；将表面消毒完成的“紫谷”根部组织用灭菌滤纸吸干组织表面水分后，放入无菌研钵中，加入适量无菌水研磨，对研磨液进行稀释(10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)，吸取100μL稀释后的研磨液至NA培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0～7.5)上，用无菌涂布器涂匀；同时吸取100μL第3次漂洗液涂板，用来检测组织表面消毒是否彻底；最后将NA培养基倒置于37℃黑暗培养箱中培养1～2d至有菌落长出；对菌落进行纯化后编号保存。

2、OOR3-1菌株的培养：

将-80℃条件下保存的OOR3-1菌株的菌种取出，用接种环蘸取一环菌液于NA平板表面上划线，37℃倒置培养1～2d，挑取单菌落于800μL的NB培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0～7.5)中打匀，37℃，200rpm，振荡培养16～24h。

37℃为本发明所述OOR3-1菌株的最适生长温度，其在28℃～37℃范围内均可生长。

实施例2 OOR3-1菌株的鉴定

1、形态学鉴定

(1)菌落形态特征

将培养所得OOR3-1菌株在NA平板上划线，于28℃恒温培养箱中培养24h后使用体式镜观察该菌株的单菌落形态特征。OOR3-1菌株的单菌落形态如图1所示，由图1可知，所述OOR3-1菌株的菌体呈黄色，圆形，凸起明显，表面光滑，边缘整齐，菌落大小为2～5mm。

(2)菌落革兰氏染色特征

从NA平板上挑取OOR3-1菌株单菌落于NB培养基中打匀，37℃，200rpm振荡培养16～24h，取适量菌液进行革兰氏染色并于显微镜下观察其菌落的革兰氏染色特征。革兰氏染色的步骤为：

①涂片固定：

菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定时，通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

②染色

a.加上结晶紫后，染色1分钟，水洗；

b.加上碘液后染色1分钟，水洗；

c.加上脱色液，摇动玻片，根据玻片厚度，脱色约40秒，水洗，吸去水分；

d.加上番红后，染色1分钟，水洗；

e.吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。

OOR3-1菌株的革兰氏染色结果如图2所示，由图2可知，OOR3-1菌株为革兰氏阴性，杆状，菌体大小为0.5～0.8μm×4.0～6.0μm。

2、分子生物学鉴定

(1)PCR扩增

提取OOR3-1菌株的DNA并对其16S rRNA基因片段进行PCR扩增，所用的扩增引物为：

16S rRNA(27F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

16S rRNA(1492R)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 12.5μL、2mM dNTPs 5μL、10pmoL/mL 27F 0.75μL、10pmoL/mL 1492R 0.75μL、KOD FX(1.0U/μL)0.5μL、DNA 1.0μL、ddH₂O 4.5μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸90s，共35次循环，最后68℃延伸5min。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验并测序。OOR3-1菌株16S rDNA序列的PCR扩增检测结果如图3所示，由图3可知，本发明成功扩增得到了OOR3-1菌株的16S rDNA。

(2)序列测定及系统发育树的构建

将扩增所得PCR产物进行测序，测序后将所得序列在NCBI进行比对，利用mega X建立系统发育树，OOR3-1菌株的16S rRNA序列如下所示，构建所得的OOR3-1菌株的系统发育树如图4所示。

OOR3-1菌株的16S rRNA序列：

TCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAACGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCGGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTCGGTTAATAACCGTGCTGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACCTGGCAGAGATGCCGGGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGA

经同源性比对和系统发育进化树分析发现，OOR3-1菌株的16S rRNA序列与水稻科萨克氏菌(Kosakonia oryzae)NAC43和NAC51菌株(GenBank accession No：MK872330.1和MK872336.1，均分离自土壤)相似性最为接近(相似性为99.85％)，且聚集到同一个进化分支。综合形态学和分子鉴定结果可知，本发明分离所得OOR3-1菌株为水稻科萨克氏菌(Kosakonia oryzae)(图4)。

实施例3 OOR3-1菌株的抗旱相关功能鉴定

1、OOR3-1菌株具有产生物膜功能

细菌生物膜的形成不仅可以提高菌株的存活率，还可提高菌株和宿主植物对不利环境的适应性和耐受性，确保菌株稳定发挥益生作用。

取-80℃保藏的OOR3-1菌株于LB固体培养基上，37℃培养24h活化，将活化好的菌株溶于1mL LB液体培养基中，37℃静态培养48h，用空白LB培养基做对照。清除管内所有培养基，用灭菌水洗涤试管并清除所有悬浮培养基，加入5mL甲醇到试管内室温孵化15min，去除管内甲醇，加入5mL 1％结晶紫溶液至管内室温孵化5min，孵化后轻轻倒出结晶紫并用灭菌水洗涤2次。生物膜会浸入结晶紫，若培养基和空气接触的界面有紫色生长环证明有生物膜，没有生长环则无生物膜。

OOR3-1菌株产生物膜实验的结果如图5所示，由图5可知，OOR3-1菌株能够产生物膜，表明其能够增强菌株和寄主的抗旱性。

2、OOR3-1菌株抗旱相关acds基因检测及ACC脱氨酶活性测定

(1)acds基因检测

具有ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)脱氨酶活性的植物内生菌，能将合成乙烯的前体ACC水解成α-丁酮酸和氨后，将其作为碳源和氮源利用，来降低植物内的乙烯水平，提高植物抗旱性，从而促进植物生长。本发明对OOR3-1菌株的acds基因进行了PCR扩增，acds基因的扩增引物如下所示：

acdS-F3：5'-ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC-3'

acdS-R4：5'-GGCACGCCGCCCARRTGNRCRTA-3'

PCR反应体系为：2×KOD FX Buffer 10μL、2mM dNTPs 4.0μL、10pmoL/mL acdS-F30.5μL、10pmoL/mL acdS-R4 0.5μL、KOD FX NEO(1unit/μL)0.5μL、DNA(菌液)2.0μL、ddH₂O2.5μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性45s，65℃退火45s(每个循环减0.5℃)，72℃延伸1min，20次循环，再加94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，18次循环，72℃延伸10min。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检验。OOR3-1菌株acds基因的PCR扩增检测结果如图6所示，由图6可知，利用OOR3-1菌株能扩增出目的条带acds基因，条带大小与预期相符(760bp)，说明OOR3-1菌株acds基因，能够编码ACC脱氨酶。

(2)ACC脱氨酶活性测定

测定方法为：将OOR3-1菌株在TSB培养液中过夜培养，4℃离心收集，菌体细胞用DF盐培养液(不加硫酸铵)洗涤离心(8000×g,10min)3次，重新悬浮于DF盐培养液，28℃、200r/min振荡培养24h，以诱导产生ACC脱氨酶；4℃离心收集菌体，用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)洗涤离心(8000×g,10min)3次，重悬浮于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入30μL甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞；取200μL含甲苯的细胞提取物，加入20μL 0.5mol/L ACC混匀，同时做不添加ACC的空白对照试验，30℃培养15min。添加1mL0.56mol/L HCl，16000×g离心5min；取1mL上清液，加入800μL 0.56mol/L HCl和300μL 2,4-二硝基苯肼，30℃保温30min，加入2mL 2mol/L NaOH，用紫外分光光度仪在540nm波长下测定吸光度，以α-丁酮酸制作标准曲线，根据提取液中α-丁酮酸的含量，计算出单位时间ACC脱氨酶催化ACC生成α-丁酮酸的量，即单位酶活力，用μmol/min表示。菌体细胞抽提物中总蛋白含量测定采用Bradford比色法，以牛血清白蛋白为蛋白质(Pr)测定标准样品。然后用单位酶活除以总蛋白浓度即比活力(U/mg)表示ACC脱氨酶活性。

经测定和计算发现，本发明所述OOR3-1菌株的ACC脱氨酶的比活力为0.0216U/mg，说明OOR3-1菌株具有ACC脱氨酶活性。

实施例4OOR3-1菌株的促生功能鉴定

1、OOR3-1菌株具有解有机磷、无机磷功能

菌株解有机磷和无机磷能力的鉴定方法为：采用滤纸片法，吸取5μL活化好的OOR3-1菌株的菌液分别接种在贴于有机磷和无机磷培养基的滤纸片上，将培养基上接种了NB培养基的滤纸片作为对照(CK)，在28℃培养箱倒置培养2～3d后观察是否有透明圈，根据透明圈和菌落圈比值(记为Mp)判断其解磷能力。

有机磷培养基：葡萄糖10g，卵磷脂0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，NaCl 0.3g，(NH₄)₂SO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，NaCl 0.3g，酵母膏0.4g，CaCO₃ 5g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；混匀后调节pH为7.0。

无机磷培养基：葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，NaCl 0.2g，KCl 0.2g，MnSO₄ 0.03g，FeSO₄ 0.003g，酵母膏0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.03g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；混匀后调节pH为6.8～7.0。

OOR3-1菌株解有机磷能力检测结果如图7所示，由图7可知，OOR3-1菌株接种至有机磷培养基上培养后，产生了透明圈，表明OOR3-1菌株具有解有机磷能力，通过计算所得OOR3-1菌株解有机磷的Mp值为1.31±0.029。

OOR3-1菌株解无机磷能力检测结果如图8所示，由图8可知，OOR3-1菌株接种至无机磷培养基上培养后，产生了透明圈，表明OOR3-1菌株具有解无机磷能力，通过计算OOR3-1菌株解无机磷的Mp值为1.25±0.032。

2、OOR3-1菌株不具有解钾功能

菌株解钾能力的鉴定方法为：采用滤纸片法，吸取5μL活化好的OOR3-1菌株的菌液接种在贴于解钾培养基的滤纸片上，将解钾培养基上接种了NB培养基的滤纸片作为对照，28℃倒置培养2～3d后观察是否有透明圈，根据透明圈和菌落圈比值(记为Mp)判断其解钾能力。

解钾培养基：蔗糖5.0g，MgSO₄ 0.5g，CaCO₃ 2.5g，FeCl₃ 0.2g，NaH₂PO₄ 2.0g，钾石灰粉1.0g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；混匀后调节pH为7.0～7.1。

OOR3-1菌株解钾能力检测结果如图9所示，由图9可知，OOR3-1菌株不具有解钾功能。

3、OOR3-1菌株不具有固氮功能

菌株固氮能力的鉴定方法为：采用划线法，在Ashby培养基上接种OOR3-1菌株，将接种了NB培养基的Ashby培养基作为对照，28℃倒置培养2～3d，菌株能够稳定生长视为有固氮功能，菌株不能稳定生长视为没有固氮功能。

Ashby培养基：甘露醇5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO₄·2H₂O0.1g，CaCO₃ 5g，琼脂15g；混匀后调节pH为7.0。

OOR3-1菌株固氮能力检测结果如图10所示，由图10可知，OOR3-1菌株不具有固氮功能。

4、OOR3-1菌株不具有产铁载体功能

菌株产铁载体能力的鉴定方法为：采用滤纸片法，在CAS培养基上接种OOR3-1菌株，将接种NB培养基的CAS培养基作为对照，然后在28℃倒置培养2～3d后观察是否有透明圈，根据透明圈和菌落圈比值(记为Mp)判断其产铁载体能力。

CAS培养基：A液：0.012g铬天青(CAS)溶于10mL水，加入2mL浓度为1mmol/L的FeCl₃。B液：0.015g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于8mL水。C液：将A液加入B液中，混匀备用。

10×MM9溶液：Na₂HPO₄ 30g，KH₂PO₄ 1.5g，NaCl 2.5g，NH₄Cl 5g，水500mL，混匀后稀释10倍备用。D液：取10×MM9液20mL，加入到150mL溶解有6.04g 1,4-哌嗪二乙磺酸的水中，混匀后调节pH到6.8，然后加入琼脂粉3.2g。

CAS检测培养基：混匀C液和D液，加入0.2mL浓度为1mmol/L CaCl₂，4mL浓度为1mmol/L MgSO₄·7H₂O，2mL 20％葡萄糖溶液，4mL 10％酪蛋白氨基酸溶液。

OOR3-1菌株产铁载体能力检测结果如图11所示，由图11可知，OOR3-1菌株不具有产铁载体能力。

5、OOR3-1菌株具有产IAA功能

(1)IAA定性测定

菌株产IAA能力的鉴定方法为：采用比色法，将OOR3-1菌株接种至King B培养基中，摇床28℃125r/min培养2d；然后吸取50μL菌悬液和50μL Salkowski’s试剂与白色点滴板上，并设置阳性对照和阴性对照，阳性对照加入50μL 50mg/L吲哚乙酸，阴性对照加入King B培养基；将点滴板避光30min后观察其颜色变化，变为粉红色说明其能产生IAA。

King B培养基：色氨酸0.1g，K₂HPO₄ 1.725g，蛋白胨20g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，丙三醇15mL，蒸馏水1000mL，混匀后调节pH为7.0。

OOR3-1菌株产IAA定性实验结果如图12所示，由图12可知，OOR3-1菌株具有产IAA能力。

(2)IAA定量测定

IAA定量测定：配制质量浓度为10mg/L～60mg/L，间隔为10mg/L的IAA标准品溶液，同时吸取2mL OOR3-1菌株的菌悬液和2mL Salkowski’s试剂混合，室温避光30min，分别在OD_530nm条件下测定其吸光度值，吸取2mL King B培养基与2mL Salkowski’s试剂混合液为空白对照，以IAA标准溶液质量浓度为横坐标，OD_530nm值为纵坐标绘制IAA标准曲线。将OOR3-1菌株接种于King B培养基中，每个菌株3个重复，37℃、200r/min条件下培养48h后取出，10000r/min离心10min，取上清液2mL与等体积Salkowski显色剂混合，25℃避光反应30min，测定OD_530nm值。经计算，本发明所述OOR3-1菌株产IAA量为5.68±0.044mg/L。

实施例5 OOR3-1菌株提高楚粳28的抗旱能力

为验证本发明所述OOR3-1菌株是否可以提高水稻的抗旱能力，本发明以粳稻品种楚粳28为例，利用OOR3-1菌株对其进行了试验。

分别选取健康一致的楚粳28种子，在42℃条件下烘种2d以打破休眠，在超净工作台内用75％酒精洗2次，每次5min，15％次氯酸钠洗3次，每次8min进行消毒，用提前活化好的OOR3-1菌株的菌液(菌液浓度为1.0×10⁸cfu/mL)浸种12h，对照使用NB培养基浸种12h，然后催芽至漏白，随后播种于装有灭菌土的苗盘中，每穴9粒种子，每个处理3个重复，待长到4叶期时进行干旱处理，当处理或对照其中一方卷叶并萎蔫时进行复水，干旱处理过程中，分别在0h、72h、复水后5d时拍照记录，复水后记录处理与对照各自的存活率。

OOR3-1菌株对楚粳28抗旱能力的影响结果如图13所示，图13中的A为楚粳28在干旱处理过程中0h的生长情况，图13中的B为楚粳28在干旱处理过程中72h的生长情况，图13中的C为楚粳28在复水后5d的生长情况，图13中D为楚粳28干旱处理后的死亡率统计结果。由图13可知，OOR3-1菌株处理的水稻植株的存活率为85.18％，显著高于未接种的水稻植株的存活率(11.11％)，表明OOR3-1菌株能够提高楚粳28的抗旱能力。

实施例6 OOR3-1菌株促进楚粳28的幼苗生长

为验证本发明所述OOR3-1菌株是否可以促进水稻生长，本发明以粳稻品种楚粳28为例，利用OOR3-1菌株对其进行了试验。

分别选取健康一致的楚粳28种子，在42℃条件下烘种2d以打破休眠，在超净工作台内用75％酒精洗2次，每次5min，15％次氯酸钠洗3次，每次8min进行消毒，用提前活化好的OOR3-1菌株的菌液(菌液浓度为1.0×10⁸cfu/mL)浸种12h，对照使用NB培养基浸种12h，然后催芽至漏白，随后播种于装有灭菌土的苗盘中，每穴9粒种子，每个处理3个重复，待楚粳28长到4叶期时统计其株高、根长、鲜重和叶绿素含量。

OOR3-1菌株浸种处理后的楚粳28幼苗与对照组幼苗的对比图片如图14所示，由图14可知，OOR3-1菌株处理后的楚粳28幼苗粗壮，根系发达，根长及株高促生效果明显，说明OOR3-1菌株能够促进水稻的生长。

OOR3-1菌株对楚粳28幼苗的促生效果如表1所示：

表1 OOR3-1菌株对楚粳28幼苗的促生效果

不同数字代表差异显著，p＜0.05。

由表1所示结果可知，OOR3-1菌株处理后的楚粳28株高、鲜重和叶绿素含量显著大于CK(p<0.05)。以上结果说明，OOR3-1菌株能够促进楚粳28的细胞伸长、生物量积累和光合作用。

实施例7 OOR3-1菌株促进楚粳28植株对氮、磷、钾的吸收

在测定OOR3-1菌株对于楚粳28幼苗生长的生理指标后，将实验组和对照组的楚粳28植株干重分为地下部(根系)、地上部(叶片)两个部分，粉碎后过420μm筛，用浓硫酸消化制成待测液，用Auto Analyzer3(AA3)连续流动分析仪和火焰分光光度计测定其氮、磷、钾含量，结果如表2所示。

表2 OOR3-1菌株对楚粳28植株内氮、磷、钾的影响

*表示差异显著，p＜0.05。

由表2所示结果可知，OOR3-1菌株可以显著提高楚粳28植株的地下部(根系)、地上部(叶片)的氮、磷、钾含量(p＜0.05)，表明OOR3-1菌株能促进楚粳28对氮、磷、钾的吸收。

实施例8科萨克氏菌OOR3-1菌株提高楚粳28籽粒产量

为验证本发明所述OOR3-1菌株是否可以提高水稻最终产量，本发明以粳稻品种楚粳28为例，利用OOR3-1菌株对其进行了试验。

分别选取健康一致的楚粳28植株，用提前活化好的OOR3-1菌株的菌液(菌液浓度为1.0×10⁸cfu/mL)在室温条件下浸泡根部12h，移栽至温室，培养至成熟收获，进行产量性状指标评价。

OOR3-1菌株对楚粳28产量性状指标的影响结果如图15所示，图15中的A～E依次为OOR3-1菌株对楚粳28的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、单株有效穗数、单株产量的影响结果；CK为未处理对照，Treatment代表浸OOR3-1菌株处理后的植株；*代表p＜0.05。由图15可知，OOR3-1菌株处理后的楚粳28的单株籽粒产量显著高于未处理对照CK，OOR3-1处理后的楚粳28的产量提高了5.15％左右。千粒重和有效穗表型分析显示OOR3-1处理后的楚粳28千粒重和有效穗均显著高于未处理对照CK，说明OOR3-1促进籽粒产量可能是通过促进分蘖和灌浆进而提高单株产量。

上述结果表明，水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株可以在楚粳28中定殖，并调节体内内生菌生态系统，最终增加籽粒产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株水稻科萨克氏菌（Kosakonia oryzae）OOR3-1菌株，其特征在于，所述菌株于2022年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62681。

2.权利要求1所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻抗旱能力或在制备提高水稻抗旱能力的产品中的应用。

3.权利要求1所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在促进水稻生长或在制备促进水稻生长的产品中的应用。

4.权利要求1所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻千粒重或在制备提高水稻千粒重的产品中的应用。

5.权利要求1所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在增加水稻单株有效穗数或在制备增加水稻单株有效穗数的产品中的应用。

6.权利要求1所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株在提高水稻产量或在制备提高水稻产量的产品中的应用。

7.根据权利要求2～6任一所述应用，其特征在于，所述水稻为粳稻。

8.一种提高水稻植株抗旱能力和/或提高水稻产量的方法，其特征在于，所述方法为：催芽前或移栽前，先用权利要求1所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株的菌液进行浸泡处理。

9.一种提高水稻植株抗旱能力和/或提高水稻产量的制剂，其特征在于，所述制剂是以权利要求1所述水稻科萨克氏菌OOR3-1菌株或其菌液为活性成分。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述菌液的浓度为1.0×10⁷cfu/mL～1.0×10⁹cfu/mL，浸种或浸泡处理时间为10～14h。