CN116478870A - 一株嗜麦芽寡养单孢菌olr3-17菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株嗜麦芽寡养单孢菌OLR3‑17菌株及其应用。本发明所述嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)OLR3‑17菌株于2023年2月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63190，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。本发明所述OLR3‑17菌株不仅可以促进多年生稻对氮、磷等元素的吸收，促进多年生稻的生长并提高其产量，可用于制备促进多年生稻生长和增产的产品。此外，本发明所述OLR3‑17菌株还具有解磷等功能，可以防止或缓解土壤酸化、板结等土地退化现象，有助于多年生稻的高产稳产。
Description
技术领域
本发明属于植物内生菌技术领域。更具体地，涉及一株嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株名称及其应用。
背景技术
多年生稻(Perennial rice)是指种植一次可以连续收获多年(季)的新型稻作品种。相对于一年生水稻，多年生稻从第二季起，在稻作生产过程中不再需要买种、育秧、犁田、耙田、移栽等生产环节，其间只需进行浇水、施肥、喷药等田间管理就能获得可观的产量。多年生稻通过简化水稻种植环节，在产量与传统水稻相比基本不变的前提下，大大降低劳动力投入和生产成本，从而提高水稻生产效益，是一种绿色轻简化的新型稻作生产模式。发展多年生稻，能够大幅提高水稻种植效益、降低劳动强度、促进土壤生态修复，缓解劳动力短缺，保障国家粮食安全。
多年生稻技术虽有免耕少耕等优势，但由于连续种植，免耕免种，使其无法进行翻耕、疏松土壤，养分的补充来源主要依靠施用化肥。而化肥中不含有机质和腐殖质，大量使用化肥易导致土壤有机质和腐殖质缺乏，土壤团粒结构遭到破坏，造成土壤酸化、板结，进而引起多年生稻产量下降。因此，基于免耕少耕的多年生稻的稻作生产需要更有效的营养补充策略。
植物内生菌能够定殖在植物的各种组织和器官的细胞间或细胞内，与植物建立和谐共生关系，通过分泌植物激素、联合固氮菌、溶解磷等功能，直接或间接地影响宿主植物对营养的吸收，促进寄主植物的生长发育，或可满足多年生稻稻作生产过程中的营养补充需要。目前虽已发现了一些能促进多年生稻吸收营养物质，促进多年生稻生长发育的植物内生菌，但其实际生产应用还需要很长的路要走，需要丰富的微生物资源。而持续挖掘具有促生功能的植物内生菌对促进多年生稻的生长发育并保证多年生稻高产稳产方面具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有缺乏可用于促进多年生稻生长和增产的菌株的不足，提供一株嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)OLR3-17菌株及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株。
本发明的第二个目的是提供所述OLR3-17菌株在促进多年生稻生长中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述OLR3-17菌株在制备促进多年生稻生长的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述OLR3-17菌株在促进多年生稻氮、磷元素吸收中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述OLR3-17菌株在制备促进多年生稻氮、磷元素吸收的产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述OLR3-17菌株在提高多年生稻产量中的应用。
本发明的第七个目的是提供所述OLR3-17菌株在制备提高多年生稻产量的产品中的应用。
本发明的第八个目的是提供一种促进多年生稻生长及增产的制剂。
本发明的第九个目的是提供一种促进多年生稻生长及增产的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)OLR3-17菌株，所述菌株已于2023年2月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo：63190，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。
本发明提供的嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株可以促进多年生稻对氮和磷元素的吸收，促进多年生稻幼苗的生长，提高多年生稻的产量。因此，本发明申请保护所述OLR3-17菌株的以下应用：
本发明请求保护所述OLR3-17菌株在促进多年生稻生长中的应用。
本发明还请求保护所述OLR3-17菌株在制备促进多年生稻生长的产品中的应用。
本发明还请求保护所述OLR3-17菌株在促进多年生稻氮、磷元素吸收中的应用。
本发明还请求保护所述OLR3-17菌株在制备促进多年生稻氮、磷元素吸收的产品中的应用。
本发明还请求保护所述OLR3-17菌株在提高多年生稻产量中的应用。
本发明还请求保护所述OLR3-17菌株在制备提高多年生稻产量的产品中的应用。
本发明所述多年生稻包括多年生稻籼稻品种和多年生稻粳稻品种。在本发明的实施例中，所使用的多年生稻籼稻品种为云大107，粳稻品种为云大25或PR23。
本发明还提供了一种促进多年生稻生长及增产的制剂。
具体地，所述制剂中的活性成分包括本发明所述OLR3-17菌株。除所述OLR3-17菌株外，该制剂中还可以包括提高OLR3-17菌株活性的成分等。
本发明还提供了一种促进多年生稻生长及增产的方法，所述方法为：在多年生稻种子催芽或移栽前，先用所述OLR3-17菌株的菌液进行浸种或浸根处理。
具体地，浸种或浸根时所使用的菌液的浓度为1.0×107～1.0×109cfu/mL。
具体地，浸种或浸根时间为10～14h。
具体地，所述多年生稻包括多年生稻籼稻品种和多年生稻粳稻品种。
更具体地，所述多年生稻籼稻品种为云大107，所述多年生稻粳稻品种为云大25或PR23。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)OLR3-17菌株，于2023年2月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63190，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。本发明所述OLR3-17菌株不仅可以促进多年生稻对氮、磷等元素的吸收，促进多年生稻的生长并提高其产量，可用于制备促进多年生稻生长和增产的产品。此外，本发明所述OLR3-17菌株还具有解磷功能，可以防止或缓解土壤酸化、板结等土地退化现象，有助于多年生稻的高产稳产。
附图说明
图1为OLR3-17菌株的单菌落形态特征图。
图2为OLR3-17菌株的革兰氏染色特征图。
图3为OLR3-17菌株的16S rRNA的PCR扩增检测电泳图；图中M为DNA marker，1为扩增得到的OLR3-17菌株的16S rRNA基因。
图4为OLR3-17菌株的系统发育进化树。
图5为OLR3-17菌株的菌液浸种处理后的多年生稻品种“云大107”、“云大25”和“PR23”和对照处理的幼苗的对比图；图中CK为未处理对照，Treatment代表OLR3-17菌株浸种处理后的植株。
图6为OLR3-17菌株对多年生稻稻品种“云大107”、“云大25”和“PR23”产量的影响结果；图中CK为未处理对照，Treatment代表OLR3-17菌株浸种处理后的植株；图中的A～E依次为OLR3-17菌株对云大107的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、有效穗数和单株产量的影响结果；图中的F～J依次为OLR3-17菌株对云大25的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、有效穗数和单株产量的影响结果；图中的K～O依次为OLR3-17菌株对PR23的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、有效穗数和单株产量的影响结果；*代表p＜0.05，**代表p＜0.01。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例中所述的嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)OLR3-17菌株已于2023年2月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：63190，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼3楼。
NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0～7.5，121℃灭菌20min。
NB培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5 g，蒸馏水定容至1L，调pH至7.0～7.5，121℃灭菌20min。
实施例1嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株的分离和纯化
本发明所述嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株是通过表面消毒研磨法及平板稀释分离法从长雄野生稻的根系中分离得到，具体分离过程如下所示：
剪取健康长雄野生稻的根部，自来水冲洗表面污渍后，用滤纸吸干表面水分，进行表面消毒，表面消毒程度为：75％酒精浸泡5min，无菌水漂洗1次，2.5％次氯酸钠浸泡3min，无菌水漂洗3次；灭菌滤纸吸干表面水分后放入无菌研钵中，加入适量无菌水研磨，取研磨液进行梯度稀释(10-2、10-3、10-4、10-5)，取稀释后的研磨液100μL至NA培养基上，用无菌涂布器涂匀；另吸取100μL第3次漂洗的漂洗液涂板，用于检测组织表面消毒是否彻底；将NA培养基倒置于37℃黑暗培养箱中培养1～2d至有菌落长出，观察菌落形态，挑取形态不同的细菌菌落进行纯化；纯化所得菌株用甘油保存法，于-80℃下保存菌种。
实施例2嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株的培养和鉴定
菌液的培养：将-80℃下保存的嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌种取出，用接种环蘸取一环菌液于NA平板表面划线，37℃倒置培养1～2d，挑取单菌落于800μL的NB培养基中打匀，37℃，200rpm，振荡培养16～24h。
1、形态学鉴定
(1)菌落形态特征
取培养所得菌液在NA平板表面划线，37℃恒温培养箱培养24h后用体式镜观察嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株的单菌落形态特征。
嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株的单菌落形态特征如图1所示，由图1可知，该菌株的菌体呈黄色，圆形，凸起不明显，表面光滑，边缘整齐，菌落大小为4～5mm。
(2)菌落革兰氏染色特征
取培养所得菌液涂片固定后进行革兰氏染色，油镜镜检。嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株的革兰氏染色特征如图2所示，由图2可知，该菌株为革兰氏阴性菌，杆状，菌体大小为0.5～0.8μm×6.0～9.0μm。
2、分子生物学鉴定
(1)PCR扩增
提取OLR3-17菌株的DNA并通过PCR扩增其16S rRNA基因片段，PCR扩增所用引物和PCR反应条件如下所示：
16S rRNA(27F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
16S rRNA(1492R)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应体系：2×PCR Buffer 12.5μL、2mM dNTPs 5μL、10pmoL/mL 27F0.75μL、10pmoL/mL 1492R 0.75μL、KOD FX(1.0U/μL)0.5μL、DNA1.0μL、ddH2O 4.5μL；
PCR扩增程序：94℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸90s，共35次循环，最后68℃延伸5min。
OLR3-17菌株的16S rRNA的PCR扩增检测电泳图如图3所示，由图3可知，本发明成功扩增得到了OLR3-17菌株的16S rRNA基因片段，大小与预期相符。
(2)OLR3-17菌株16S rRNA测序及系统发育树的构建
对反应所得PCR产物进行测序，将测序所得序列在NCBI中进行比对，利用mega X建立系统发育树。
OLR3-17菌株的16S rRNA序列如下所示：
TGGAGGCAGCTACACATGCAGTCGAACGGCAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCCGGCTAATACCTGGTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTGTTTAAGTCTGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGAAACTGGACAACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTGCCACGGTGACCCCATTGGG
OLR3-17菌株的系统发育进化树如图4所示，树经同源性比对和系统发育进化树分析发现，OLR3-17菌株的16S rRNA序列与嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonasmaltophilia)5Kp26菌株(GenBank accession No.KT825822.1，分离自结球白菜)的相似性最高(99.93％)，且同属与同一个进化分支。综合形态学和分子鉴定结果表明，OLR3-17菌株为嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)。
实施例3嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株促进多年生稻幼苗生长
分别选取饱满一致的多年生稻品种“云大107”、“云大25”和“PR23”的种子在42℃下烘种2d以打破休眠；在超净工作台内用75％酒精清洗2次，每次清洗5min，再用15％次氯酸钠洗3次，每次8min进行消毒；用提前活化好的OLR3-17菌株的菌液(菌液浓度为：1.0×108cfu/mL)，浸种处理12h，对照(CK)用NB培养液浸种处理12h，然后置于37℃恒温培养箱，催芽至漏白，随后播种于装有灭菌土的苗盘中，每穴9粒种子，每个处理3个重复，待多年生稻长到4叶期时统计其根长、鲜重和叶绿素含量。
OLR3-17菌株的菌液浸种处理后的多年生稻品种“云大107”、“云大25”和“PR23”和对照处理的幼苗的对比图如图5所示。OLR3-17菌株对多年生稻“云大107”、“云大25”和“PR23”幼苗的促生效果如表1所示。
表1 OLR3-17菌株对“云大107”、“云大25”和“PR23”幼苗的促生效果
表中*表示p＜0.05。
由图5和表1可以看出，OLR3-17菌株浸种处理后，云大107的株高、根长、鲜重和叶绿素含量显著大于CK(p<0.05)；云大25的株高、鲜重和叶绿素含量显著大于CK(p<0.05)；PR23的株高和叶绿素含量显著大于CK(p<0.05)。以上结果表明，OLR3-17菌株能够促进多年生稻籼型品种“云大107”的细胞伸长、适应性、生物量积累和光合作用，以及促进多年生稻粳型品种“云大25”和“PR23”的生物量积累和光合作用。
实施例4嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株提高多年生稻植株的营养元素积累
在测定过嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株处理的多年生稻3个品种和对照的幼苗的生理指标后，将实验组和对照组植株的根、茎、叶三个部分的干重分别粉碎，过420μm筛，用浓硫酸消化制成待测液，用Auto Analyzer3(AA3)连续流动分析仪和火焰分光光度计测定氮、磷和钾的含量，探究OLR3-17菌株对多年生稻植株内营养元素的影响。OLR3-17菌株对多年生稻植株内营养元素的影响结果如表2所示。
表2OLR3-17菌株对多年生稻植株内营养元素的影响结果
表中*表示p＜0.05。
由表2可以看出，OLR3-17菌株可以显著提高“云大107”、“云大25”和“PR23”植株的根、茎和叶部的氮、磷含量(p＜0.05)，但未提高钾的含量。
实施例5嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株提高多年生稻植株籽粒产量
为验证嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17菌株是否对多年生稻的最终产量具有促进作用，本发明在温室分别移栽了OLR3-17菌株菌液浸种处理(菌液浓度为1.0×108cfu/mL，置于37℃恒温培养箱，浸种处理12h)后的“云大107”、“云大25”和“PR23”的植株，常规管理并培养至成熟收获，进行产量性状指标评价，测定了植株的结实率(Setting rate)、每穗(籽)粒数(Grain number panicle)、千粒重(Thousand-grain weight)、有效穗数(Paniclenumber per plant)和单株产量(Yield plant)。
OLR3-17菌株对多年生稻稻品种“云大107”、“云大25”和“PR23”产量的影响结果如图6所示；其中，A～E依次为OLR3-17菌株对云大107的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、有效穗数和单株产量的影响结果；F～J依次为OLR3-17菌株对云大25的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、有效穗数和单株产量的影响结果；K～O依次为OLR3-17菌株对PR23的结实率、每穗(籽)粒数、千粒重、有效穗数和单株产量的影响结果。由图6可以看出，嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17处理后的多年生稻的单株籽粒产量显著高于未接种对照CK，OLR3-17处理后将产量提高了4.05％左右。千粒重表型调查结果显示嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17处理后的多年生稻的千粒重显著高于未接种对照CK，表明OLR3-17促进籽粒产量可能是通过促进灌浆进而提高单株产量。
由上述结果可知，嗜麦芽寡养单孢菌OLR3-17可以在多年生稻品种“云大107”、“云大25”和“PR23”中稳定定殖，调节多年生稻的生理代谢，最终增加籽粒产量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一株嗜麦芽寡养单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)OLR3-17菌株，其特征在于，该菌株于2023年2月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：63190。
2.权利要求1所述OLR3-17菌株在促进多年生稻生长中的应用。
3.权利要求1所述OLR3-17菌株在制备促进多年生稻生长的产品中的应用。
4.权利要求1所述OLR3-17菌株在促进多年生稻氮、磷元素吸收中的应用。
5.权利要求1所述OLR3-17菌株在制备促进多年生稻氮、磷元素吸收的产品中的应用。
6.权利要求1所述OLR3-17菌株在提高多年生稻产量中的应用。
7.权利要求1所述OLR3-17菌株在制备提高多年生稻产量的产品中的应用。
8.一种促进多年生稻生长及增产的制剂，其特征在于，所述制剂中的活性成分包括权利要求1所述OLR3-17菌株。
9.一种促进多年生稻生长及增产的方法，其特征在于，多年生稻种子催芽或移栽前，先用权利要求1所述OLR3-17菌株的菌液进行浸种或浸根处理。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述菌液的浓度为1.0×107～1.0×109cfu/mL。
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