CN114561324B - 一株番茄青枯病拮抗菌株及其在防治番茄青枯病方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生防菌领域，具体涉及一株番茄青枯病拮抗菌株及其在防治番茄青枯病方面的应用，该拮抗菌株为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa B‑6，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，于2021年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No：24048；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。本发明的拮抗菌株B‑6具有良好的生防潜能，可开发具有促生抗病作用的生防菌剂。
Description
技术领域
本发明涉及生防菌领域，具体涉及一株番茄青枯病拮抗菌株及其在防治番茄青枯病方面的应用。
背景技术
番茄青枯病是茄科蔬菜一种典型的土传性细菌病害，由青枯劳尔氏菌(
Ralstonia
solanacearum)侵染引起的，在全国各地均有发病。该病会造成侵染作物大面积萎蔫甚至死亡，在发病严重田块上青枯病发病率可高达80%以上，严重影响番茄的产量，严重时造成绝收。当番茄株高30厘米左右时，青枯病株开始显症，会出现叶片萎焉下垂但仍保持绿色的现象，剖开病株茎基部，维管束为褐色。一般田块在生长中后期即进入果实膨大期症状明显，植株枯死。
目前防治土传性病害主要依赖于化学药剂，但大量施用化学农药带来环境污染和食品安全问题，同时造成土壤板结，农药残留、破坏有益微生态体系等不良影响。生物防治因其安全、与环境兼容性好，无污染等成为目前植物病害防治的重要措施之一，近年来受到人们的广泛关注与研究。利用有益微生物降低或消灭病原菌生物的数量不仅会保护生态环境，而且能有效控制植物病害的发生和发展。有益微生物菌群的广泛应用可调节土壤微生物群落的分布状况，且具有控制病害的发生和提高农作物产量两种作用。因此，利用有益微生物制成的生物制剂在进行植物病害防治时能够维持农业生态环境的稳定和避免人类身体健康遭受侵害，同时能安全使用在田间发挥稳定效果。对于番茄青枯病常用的防治方法主要有：施用化学药剂、改良土壤结构和性质以及选育抗病品种等，但这些防治方法效果均不稳定，因此利用拮抗菌防治番茄青枯病成为具有应用前景的防治措施之一，如何分离筛选出在室内有较好抑菌效果的菌株并可在田间发挥理想的防治效果，是生物防治面临解决的关键性问题。目前番茄青枯病生物防治方法大都处于试验阶段，进入实际生产的很少。前人筛选出来的拮抗菌株在室内的盆栽试验当中效果明显，但在田间条件下出现防治效果不太稳定的现象。因此从健康番茄植株根基土壤中分离筛选出对番茄青枯病菌有拮抗作用的拮抗菌株，并对其进行鉴定，对进一步开发新的生防菌剂具有重大意义，且为生物防治的研究提供菌种，丰富番茄病害的生物防治资源菌库，为进一步开发生物菌剂提供理论基础。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一株番茄青枯病拮抗菌株及其在防治番茄青枯病方面的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明的拮抗菌株为铜绿假单胞菌
Pseudomonas aeruginosa B-6，其16S rDNA序列如SEQ ID NO: 1所示，于2021年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No：24048；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明的拮抗菌株经革兰氏染色镜检可知G+,菌体短杆状,无荚膜,菌体形态呈短杆状，菌体大小为（1.5～2.7）µm×（0.5～1.2）µm，不具有鞭毛，单个或2～4个细胞形成短链，孔雀石绿染色镜检可知其产生芽孢，芽孢短圆柱形。平板培养性状其菌落不规则圆形,呈淡黄色,不透明,微隆起,略有光泽度,边缘不整齐,有刺激性气味产生。拮抗菌株B-6在液体培养液中培养，培养液逐渐变浑浊，3d后，试管内出现乳白色沉淀，5d后在液体表面长出了白色菌璞，在培养液中出现片状菌膜。
本发明的菌株的最佳发酵条件的组合为：发酵时间24h、装液量100/250 mL、接种量1%，pH 8。
本发明的菌株可用于防治番茄青枯病，治疗效果中，稀释50倍的拮抗菌株B-6发酵液的防治效果为68.03%，化学药剂春雷霉素稀释液防效为73.13%，拮抗菌株B-6发酵液稀释50倍防效略低于施用春雷霉素的防效；预防效果中，稀释50倍的拮抗菌株B-6发酵液的防效为70.41%，化学药剂春雷霉素稀释液防效为68.03%，稀释50倍发酵液的防效大于春雷霉素的防治效果。试验过程中，拮抗菌株B-6发酵液处理的番茄幼苗在株高和茎粗生长方面较空白对照明显，该拮抗菌株发酵液对番茄植株有促进生长的作用。
本发明的该菌株的发酵液可促进胚芽及胚根的生长，具有促进植株生长的作用。
综上所述，本发明的拮抗菌株B-6具有良好的生防潜能，可开发具有促生抗病作用的生防菌剂。
附图说明
图1为拮抗菌株对番茄青枯雷尔氏菌的抑制效果；
图中：（a）为B-6，（b）为B-17。
图2为拮抗菌株B-6平板单菌落平板培养性状图。
图 3为拮抗菌株 B-6液体培养性状。
图4 为拮抗菌株B-6菌株电镜下的形态特征。
图5为拮抗菌株B-6染色反应图；
图中：（a）为革兰氏染色，（b）为孔雀石绿染色）。
图6 为拮抗菌株B-6的基因组DNA电泳图。
图7 为拮抗菌株B-6的PCR扩增产物电泳图。
图8为拮抗菌株B-6测序结果比对。
图9为拮抗菌株B-6构建系统发育树。
图10为拮抗菌株B-6的生长曲线。
图11为 拮抗菌株B-6对番茄种子的促生作用。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
番茄青枯病拮抗菌的筛选及鉴定
1.材料
1.1供试土样 土样采集于太谷县范村镇象谷村健康番茄植株的根际土壤，共采集38份土样。
1.2供试菌株 番茄青枯病菌（
Ralstonia solanacearum），由山西农业大学植物病理实验室保存提供。
1.3供试培养基 NA培养基：蔗糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，琼脂粉15 g，1000mL蒸馏水，pH7.0；NA培养基中不加琼脂粉即NB培养基
2.方法
2.1番茄根际土样中微生物的分离
采用稀释涂布分离法，每份土样取10 g，碾碎后加入（有玻璃珠）三角瓶中，再加入90 mL无菌水振荡30 min，静止后依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6g.mL-1浓度梯度的菌悬液，每个梯度取0.1 mL涂布在NA平板上，然后置于30℃的培养箱中，培养24 h 后观察，挑取不同形态特征的单菌落纯化后进行编号。
番茄青枯病菌拮抗菌株的筛选
初选：采用对峙培养法，将培养48h的番茄青枯病菌菌悬液稀释1000倍后涂布在NA平板上，静止10min后，将上述2.1分离纯化的147个菌株均匀点接在平板上，每个平板点接4个菌株，在30℃培养24 h 后观察，记录有抑菌效果的菌株，每个处理重复3次。
复选：将上述初选具有拮抗效果的细菌菌株18个分别接种到NB培养液中，置于28℃培养箱中培养48 h制成菌悬液，稀释1000倍后取0.1 mL均匀涂布在NA平板上，静止20min后将蘸有番茄青枯病菌发酵液的无菌滤纸小圆片接在平板中央，置于28℃培养箱中培养，观察病记录抑菌圈的大小，每个处理重复3次。
菌株的保存：用30%的甘油1:1（V:V）将菌体制成菌悬液，-70℃冷冻保存。
番茄青枯病拮抗菌株B-6的鉴定
2.3.1形态鉴定
观察NA平板上细菌菌落的大小、颜色、边缘形状以及菌落隆起形状和透明度;观察在NB液体培养液菌株的培养性状，如有无色素的产生、有无沉淀、有无菌璞和菌膜的产生、特殊气味等。通过革兰氏染色和孔雀石绿染色，在显微镜下观察菌体的形态及是否有芽胞存在，通过扫描电镜在电镜下观察菌体的形态大小等特征。
生理生化鉴定
测定生理生化指标的具体实验方法参照R.E.布坎南等《伯杰细菌鉴定手册》和东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》。具体操作方法如下：生长温度与耐热性：将培养24 h的菌种挑取一环转入NB培养液，分别置于4 ℃、20 ℃、30 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃和65 ℃的条件下培养，其中37 ℃以上的温度置于水浴锅内。如果该菌在此温度下生长，则需做3次重复来确定。耐盐性与需盐性：将培养细菌24 h的菌种挑取一环接到浓度分别为2%、5%、7%、10%的NaCl的培养液中，以不加NaCl接种的培养液和不加NaCl未接种的培养液作为对照。培养3d和7 d，与对照试管进行对比，目测生长情况。丙二酸利用： 将培养24 h的幼龄菌种接种于加丙二酸钠和不加丙二酸钠的培养基上，适温培养1~2天，若培养基由绿变蓝者为阳性，培养基不变色者为阴性。荧光色素：以24 h培养的幼龄菌种培养物接种于斜面培养基上，置30℃培养1 d、3 d、5 d后，在紫外灯下观察有无荧光。接触酶：用接种环取一小环培养24 h的斜面菌种涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。
葡萄糖氧化发酵：将培养24 h的细菌穿刺接种于休和利夫森二氏培养基和博德和霍尔二氏培养基平板上。其中2支用灭菌的凡士林石蜡油封盖，约0.5~1.0 cm，作为闭管。另2支不封油为开管，同时在设置不接种的闭管和开管作对照。置于25 ℃恒温培养箱中分别在培养1 d、2 d、3 d、7 d和14 d观察结果。若只有开管产酸变黄者为氧化型，开管和闭管均产酸变黄者为发酵型。糖类发酵：将斜面培养物分别穿刺接种于芽孢菌培养基与乳酸菌培养基（参考文献），适温培养1 d、3 d、5 d后观察，如指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝（紫）则为阴性。淀粉水解：在肉汁胨中加0.2 %可溶性淀粉，制成平板备用。取新鲜斜面培养物接种于上述平板，适温培养2~5 d，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，若菌落周围出现不变色透明圈，表示淀粉水解呈阳性，仍是蓝黑色则为阴性。甲基红：将筛选出的拮抗菌株接种于相关培养液中，每次3个重复，置适温培养2-6 d。然后在培养液中加入1滴甲基红试剂，若变为红色则为阳性，黄色则为阴性。V-P测定：接种试验菌于相应培养基中，每次2个重复，置适温培养2-6 d。取培养液和40%NaOH等量相混，再加少许肌酸，10min后如培养液出现红色，即为试验阳性反应。（有时需放置更长时间才出现红色反应）硝酸盐还原：经待测菌株接种于硝酸盐液体培养液中，置适温培养1、3、5d，每次两个重复，另留两管不接种作对照。取两支干净的试管倒入少许培养1、3、5d的培养液，在接种的和对照的管中各加入一滴指示剂A液及B液，溶液如变为粉红色、橙色、棕色等表示为硝酸盐还原阳性；如无红色反应，则可加一、二滴二苯胺试剂，如呈蓝色反应，表示无硝酸盐还原反应；如不呈蓝色反应，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。柠檬酸盐利用：制作西蒙斯氏柠檬酸盐培养基，调pH为7.0并加入指示剂，分装试管摆成斜面。在斜面上划线接种，适温培养3-7 d，每次3个重复。培养基为碱性（指示剂蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。
分子生物学鉴定
2.3.3.1基因组DNA的提取
（1） 将Spin Column置于Collection Tube中，加入250 uLBuffer BL，12000 rpm/min离心1 min活化硅胶膜；
（2） 取样本干燥组织（不大于20 mg），加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5 mL离心管中，加入400 uLBuffer gP1，涡旋振荡1 min，65℃水浴10 - 30 min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；
（3） 加入150 uL Buffer gP2，涡旋振荡1 min，冰浴5 min；
（4） 12000 rpm/min离心5 min，将上清转移至新的离心管中；
（5） 加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12,000 rpm/min离心30 s，弃废液；
（6） 向Spin Column中加入500 uL Buffer Pw（使用前已加入无水乙醇）， 12000rpm/min离心30 s，弃废液；
（7） 向Spin Column中加入500 uL Wash Buffer（使用前已加入无水乙醇），12000rpm/min离心30 s，弃废液；
（8） 重复操作步骤7；
（9） 将Spin Column放回Collection Tube中，12,000 rpm/min离心2 min，开盖晾干1 min；
（10） 取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50 -100uL TE Buffer（65℃预热TE Buffer），20 -25℃放置2 min，12,000 rpm/min 离心2 min。
2.3.3.2 16S rDNA的PCR扩展：
（1）16S rDNA PCR反应的正反向引物：
Forward primer：5´AGTTTGATCMTGGCTCAG 3´
Reverse primer：5´GGTTACCTTGTTACGACTT 3´
（2）PCR反应体系（uL）：
（3）PCR反应程序：98℃预变性2 min，（98℃变性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸10s/kb）35个循环，72℃终延伸5min。
（4）PCR反应完成后，将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将准备好PCR扩增产物送至测序公司进行测序。
2.3.3.3分析16S rDNA 序列相似性及构建系统发育树
用Blast软件将经擎科生物测得16S rDNA 序列与NCBI数据库中已登录的16SrDNA 序列进行相似性分析，运用Clustal在线分析软件、PAUP软件等，构建系统发育树。
结果与分析
3.1 拮抗菌株的分离、筛选结果
从38份土样中共分离筛选出147株平板菌落形态特征不同的菌株，初筛出18株有抑菌效果的拮抗菌株，经纯化和复筛，其中拮抗菌株B-6与B-17菌株抑菌效果最好，且比较稳定，其中B-6抑菌圈直径达到13.8mm，B-17抑菌圈直径达到12.3mm，其拮抗菌株的平板抑菌效果见图1。
3.2 拮抗菌株B-6菌落培养性状及菌体形态
平板培养性状：通过梯度稀释法获得拮抗菌株B-6的单菌落如图2所示,菌落不规则圆形,呈淡黄色,不透明,微隆起,略有光泽度,边缘不整齐,有刺激性气味产生。液体培养性状：拮抗菌株在液体培养液中培养，培养液逐渐变浑浊，3d后，试管内出现乳白色沉淀，5d后在液体表面长出了白色菌璞，在培养液中出现片状菌膜，如图3所示。通过电镜观察如图4所示,拮抗菌株B-6细胞为短杆状,菌体大小约为1.5-2.7×0.5-1.2μm,不具有鞭毛,单个或2～4个细胞形成短链。
拮抗菌株B-6染色反应：其经革兰氏染色镜检可知G+,菌体短杆状,无荚膜,无鞭毛；孔雀石绿染色镜检可知其产生芽孢,芽孢短圆柱形,菌体和芽孢染成不同的颜色,菌体呈红色,芽孢绿色,如图5所示。
拮抗菌株B-6生理生化特性
生防菌生理特征：拮抗菌B-6在20℃、30℃、37℃下均会生长，在30-37℃之间生长量最大，4℃以下和41℃以上则停止生长；观察到拮抗菌B-6在耐盐性与需盐性中第三天含2％、5％、7％NaCl的试管以及不含NaCl接种的试管均出现不同程度的浑浊，含2％的试管出现最大程度的浑浊，二含10%NaCl的试管以及不含NaCl未接种的试管没有变化，第七天含2％、5％、7％、10%NaCl的试管以及不含NaCl接种的试管均出现不同程度的浑浊，表明含盐量浓度超过10%后会抑制拮抗菌的生长；丙二酸利用中接种菌种培养后培养基由绿变蓝色为阳性；荧光色素中菌种在培养1、3、5d后在紫外灯下观察均有荧光；柠檬酸盐利用中在斜面培养基上接种菌株培养3-7d后指示剂变成蓝色，则为阳性。
生防菌生化特征：葡萄糖氧化发酵中经连续观察发现休和培养基和博德培养基接种菌种的开管和闭管均产酸变黄，而未接种的开管和闭管均无变化，因此为发酵型；在接触酶有菌种培养液的玻片上滴加3％过氧化氢有气泡产生为阳性； 糖类发酵菌种接种在两种指示剂上经连续观察后均没有变色为阴性；甲基红试验中菌种培养2d和6d后在培养液中加入一滴甲基红试剂菌出现红色，表明甲基红试验为阳性反应；淀粉水解反应中在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围出现不变色的透明圈，表明淀粉水解阳性；V-P测定中菌株培养2d、6d及延长培养后加入指示剂均没有颜色变化，表明为阴性反应；硝酸盐还原测定中菌株培养1d、3d和5d后加入指示剂均出现粉红色颜色变化，为硝酸盐还原阳性。
拮抗菌株B-6的生理生化鉴定结果见表1。
注：“＋”表示阳性，“-”表示阴性。
拮抗菌株B-6的分子生物学鉴定
通过提取拮抗菌株B-6的基因组DNA（检测结果如图6）并进行PCR扩增，得到一条长约1500 bp的DNA片段（如图7），经扩增产物测序后得到长度为1424 bp的16S rDNA序列。对比结果表明，拮抗菌株B-6与假单胞菌的遗传距离最近，且它与铜绿假单胞菌（
Pseudomonas
aeruginosa）处于同一分支上,拮抗菌株B-6 的16S序列比对结果为
Pseudomonas
aeruginosa strain Pa84（或同属），测序结果对比如图8。用Blast软件将上述16S rDNA与NCBI数据库中已注册的16S rDNA序列进行同源相似性比较，同时构建系统发育树（如图9）。综合拮抗菌株B-6的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为铜绿假单胞菌（
Pseudomonas aeruginosa）。
PCR产物送至擎科生物测序，测序结果如下：
TCGAGGACTACCTGCAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACTTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTACCACGTAGTC
拮抗菌株B-6发酵培养基和发酵条件的优化
1. 材料
1.1供试菌株：番茄青枯病菌（
Ralstonia solanacearum）和拮抗菌株B-6。
1.2 NA培养基：蔗糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，琼脂粉15 g，1000 mL蒸馏水，pH7.0；NB培养基即NA培养基中不加琼脂粉。
1.3试剂：葡萄糖、果糖、酵母膏、胰蛋白胨、NaCl、KCl等
2.方法
2.1拮抗菌株B-6生长曲线的测定及种子培养
将拮抗菌株B-6菌株活化后，从平板上挑取2环接种于50 mL（250 mL锥形瓶）NB培养基中，于28℃，180 r/min振荡培养，每隔1 h取出一瓶测其吸光度（OD600），重复3次。以OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制拮抗菌株B-6的生长曲线。根据生长曲线培养菌种直到生长到对数期后将其接种于发酵培养基中进行后续的试验。
拮抗菌株B-6发酵培养基的优化
最佳碳源的筛选：蛋白胨5 g、氯化钠3 g、蒸馏水1000 mL，pH调至7.0左右，分装于250 mL的锥形瓶中，每瓶装液量50 mL，制成无碳源基础培养液。将葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉及果糖共5种碳源配置成含量为10%的溶液，与基础培养液分开灭菌。灭菌完毕后,将碳源溶液以1%的量添加到各基础培养液中。待冷却后加入1%的拮抗菌株种子液，置于28℃，180 r/min摇床中培养24 h，将发酵液取0.1 mL涂布在NA平板上，平板中央点接番茄青枯病菌进行平板对峙，根据其抑菌圈大小来确定最佳碳源。
最佳氮源的筛选：蔗糖10 g、氯化钠3 g、蒸馏水1000 mL、pH调至7.0左右，分装于250 mL的锥形瓶中，每瓶装液量50 mL，制成无氮源基础培养基。将蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、氯化铵及硫酸铵共5种氮源配置成含量为5%的溶液，与基础发酵培养基分开灭菌。灭菌完毕后，将氮源溶液以0.5%的量添加到基础发酵培养基中。方法同上，根据其抑菌圈大小选出最佳氮源。
最佳无机盐的筛选：蔗糖10 g、氯化钠3 g、蒸馏水1000 mL、pH调至7.0左右，分装于250 mL的锥形瓶中，每瓶装液量50 mL，制成无氮源基础培养基。将蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、氯化铵及硫酸铵共5种氮源配置成含量为5%的溶液，与基础发酵培养基分开灭菌。灭菌完毕后，将氮源溶液以0.5%的量添加到基础发酵培养基中。方法同上，根据其抑菌圈大小选出最佳无机盐。
正交试验发酵培养基各因素间最佳配比组合：以抑菌圈直径的大小为衡量指标，对发酵培养基中的碳源浓度（A）、氮源浓度（B）、无机盐浓度（C）进行优化。每个影响因素设置3个水平，组成3因素3水平正交试验。各因素水平对应取值见表2，后按SPSS正交试验设计出的各因素水平的组合方案进行试验，每个处理重复3次。将培养基分装50 mL（250 mL锥形瓶）NB培养基中，接种1%的菌株种子液，后置于28℃，180 r/min的恒温摇床中培养24 h，通过对峙试验测量其抑菌圈直径大小。对测量结果进行极差分析和方差分析，确定各因素各水平间的最佳组合。
表2 发酵培养基因素水平对应表
2.3拮抗菌株B-6发酵条件的优化
以确定的最佳发酵培养基为基础，选出对发酵效果影响较大的发酵时间（D）、装液量（E）、接种量（F）及pH（G）4个因素进行优化试验。每个因素设置3个水平，组成4因素3水平试验（见表3），使用SPSS进行正交试验设计，确定组合方式进行试验。各处理分别置于相应的培养条件下进行发酵培养，24 h后与番茄青枯病原菌进行平板对峙测量其抑菌圈直径大小，需3次重复。对测量结果进行极差分析和方差分析，经综合分析确定最佳发酵条件。
表3发酵条件因素水平对应表
2.4数据处理
采用Excle2019进行图表的制作；采用SPSS21.0进行数据处理、极差分析及显著性分析。
结果与分析
3.1拮抗菌株B-6的生长曲线
由图10可知，B-6菌株生长曲线分布为0~7 h为延迟期，8~22 h为对数生长期，23~25 h为稳定期，25 h后细菌生长进入衰亡期。在菌株的对数生长期内，菌株生长迅速，代谢旺盛，适合做种子液，即母液。因此最终确定B-6菌株发酵用种子液培养时间为22 h。
拮抗菌株B-6发酵培养基配方的优化
碳源：通过比较不同培养基发酵所得到的发酵培养液的抑菌效果发现，如表3-3所示，当发酵培养基的碳源为麦芽糖时，抑菌效果最佳，抑菌圈直径可达到15.8±0.3mm。
氮源：通过比较加入不同氮源发酵得到的发酵培养液的抑菌效果发现，如表3-3所示，当发酵培养基氮源为蛋白胨时，抑菌效果最佳，抑菌圈直径可达到16.2±0.2mm。
无机盐：通过试验添加5种不同的无机盐所得到的发酵培养液测定的抑菌效果发现，如表4所示，当发酵培养基无机盐为氯化钠时，抑菌效果最佳，抑菌圈直径可达到13.4±0.25mm。
表4拮抗菌株B-6发酵培养基配方的优化
3.2正交试验结果
拮抗菌株B-6发酵培养基各组分正交后结果如下：在确定拮抗菌株B-6合适的发酵培养液各组分种类的基础上，进行正交优化试验。结果如表5所示，3个因素的极差R值存在差异，各因素间对拮抗菌株B-6生长量的影响大小通过R值反应，R值越大则表明该因素对菌株的影响效果越大，反之则越小。由表所示，RC> RA>RB，即无机盐浓度＞碳源浓度＞氮源浓度，无机盐对菌株的拮抗活性抑菌效果影响最大，其次依次为碳源浓度和氮源浓度，通过表3-4数据显示，A3B2C2组合所产生的抑菌圈直径16.5mm与采用的基础发酵培养基培养所得的发酵液产生的抑菌效果和抑菌圈直径13.8mm相比，发酵优化后抑菌圈直径增加了19.6%，差异较明显。通过方差分析和显著性检验如表3-5显示，碳源浓度、氮源浓度及无机盐浓度的P值均大于0.05（P＞0.05），表明三种因素差异均不显著，但从表格中可以看出这三种发酵因素浓度的变化对拮抗菌株B-6拮抗活性物质的生物量影响差异大小依次为无机盐浓度＞碳源浓度＞氮源浓度，即无机盐浓度变化对其影响较大，氮源浓度变化对其影响较小。经综合极差分析和方差分析结果，最终确定拮抗菌株B-6最佳发酵培养基组合为A3B2C2即麦芽糖3%（30g）、蛋白胨1%（10g）、氯化钠1%（10g），蒸馏水1000mL。
表5 B-6菌株发酵培养基最佳组合的正交试验结果及极差分析
表6 拮抗菌株B-6发酵培养基最佳组合的方差分析结果
拮抗菌株B-6发酵培养基培养条件正交后结果
拮抗菌株B-6最佳发酵条件正交试验及结果分析如表7所示，4个因素极差R值有差异，对于拮抗菌株B-6产生拮抗物质生物量大小的影响通过R值大小反应，R值越大，则表明该因素对菌株的影响效果越大，反之则越小。由表可知，RD＞RG＞ RE＞RF，即发酵条件对拮抗菌株B-6拮抗活性的影响依次为发酵时间＞pH＞装液量＞接种量，说明发酵时间对拮抗菌株B-6的拮抗活性物质的生物量影响最大，其次依次为pH、装液量及接种量。通过方差分析和显著性检验如表8显示，发酵时间、装液量、接种量及pH的P值均大于0.05（P＞0.05），表明四种因素差异均不显著，但从表格中可以看出这四种发酵条件因素的变化对拮抗菌株B-6拮抗活性物质影响的差异大小依次为pH＞装液量＞发酵时间＞接种量，即pH值变化对其影响较大，接种量变化对其影响较小。经综合极差分析和方差分析结果，最终确定拮抗菌株B-6的最佳发酵条件的组合为D1E3F1G3，即发酵时间24h、装液量100/250 mL、接种量1%（1mL），pH 8。
表7拮抗菌株B-6发酵条件的正交试验结果及极差分析
表8拮抗菌株B-6发酵条件正交试验结果方差分析
拮抗菌株B-6对番茄青枯病盆栽防效研究及对番茄种子发芽的影响
1.材料
1.1供试菌株
拮抗菌株B-6和番茄青枯病菌（
Ralstonia solanacearum）（由山西农业大学植物病理学重点实验室保存）。
1.2供试番茄品种及育苗基质
维也纳2号（由巨鑫园区提供供试番茄育苗）、白果强丰（河北省泊头市永红种子有限公司，购于山西省晋中市太谷县种子市场）、育苗基质（山东昊喆农业科技有限公司生产）。
1.3供试培养基与试剂
NA培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂粉15g、蒸馏水1000mL；LB培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠8g、蒸馏水1000mL；NB培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL；2%春雷霉素水剂。
方法
2.1番茄育苗移栽及培养
当幼苗培养至一周左右，待番茄幼苗长出2至3片真叶时，称取1kg灭菌土和少量的基质混合均匀后装于11cm×8cm×9cm（口径×底径×高）的塑料盆中，将番茄苗移栽到盛好混合土的盆内，主要移栽时不要伤到幼苗的根部。移栽后的番茄幼苗需立即浇透一次水，从而利于它根系和土壤的接触。此时不能让幼苗被强光暴晒，等其适应坏境后逐渐加强光照，所处坏境需温暖通风，移栽后期需定期为番茄苗铺上一层薄基质确保其充足的养分，之后根据盆内土壤干湿度每天进行合理浇水。
番茄青枯病菌菌悬液及拮抗菌株B-6发酵液的制备
拮抗菌株B-6发酵液的制备：将保存于 -80℃甘油管保存的拮抗菌株B-6，使用NA平板进行活化，在培养箱中28℃培养24h后，挑单菌落接到LB培养基中，28℃，180r.min-1，振荡培养24h制成种子液，取1mL种子液接种到100mL的LB培养基中，28℃，180r.min-1，振荡培养48h，将其置于4℃冰箱备用。
青枯雷尔氏菌菌悬液的制备：将将保存于 -80℃甘油管的青枯雷尔氏菌接种在NA平板上划出单菌落，取单菌落接种于NB液体培养基中，28℃，180r.min-1条件下震荡培养48h。
拮抗菌株B-6发酵液对番茄青枯病的治疗效果
使用“ 2.1”的方法进行育苗，缓苗培养15天后，待番茄长到6-8片真叶时，进行灌根接种处理试验，试验共设6个处理，选取生长大体一致的番茄，每盆采用伤根灌根法接种青枯病原菌，3d后，接种制备好的拮抗菌株B-6发酵液沿着番茄根部上方的茎缓慢灌入30ml，发酵液设定4个稀释浓度：50倍、100倍、150倍与200倍，每盆接种注射发酵液30ml，以2%春雷霉素水剂（稀释1000倍）作为对照，以等量无菌水为空白对照。每组处理10株，重复3次，接种25d后调查番茄的生长及发病情况，隔天观察一次，按分级标准记录并计算其病情指数及防治效果。
拮抗菌株B-6发酵液对番茄青枯病的预防效果
使用“ 2.1”的方法进行育苗，缓苗培养15天后进行试验。将6-7叶株龄的番茄幼苗从土壤中连根拔出，洗净根部的土壤，将其浸泡在经筛选得到的拮抗菌株B-6制备成的发酵液，发酵液设定4个稀释浓度：50倍、100倍、150倍与200倍，在各个稀释浓度发酵液浸根6h，相同处理以等量2%春雷霉素水剂（稀释1000倍）作为对照，以无菌水为空白对照进行浸根，然后移栽到盆钵中，3d后，每盆采用伤根灌根法接种青枯病原菌。每组处理10株，重复3次，温室控温28℃条件下让番茄幼苗发病，接种25d后调查番茄的生长及发病情况，隔天观察一次，按分级标准记录并计算其病情指数及防治效果。
分级标准与调查方法
病情调查中观察每株的叶片，以发病叶片萎焉程度作为病害分级指标。病害分级标准如下：
病情指数和防治效果用以下公式计算：
病情指数=×100；
防控效果(%)=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数×100
2.6拮抗菌株B-6对番茄种子发芽的影响
番茄种子进行消毒处理，28℃催芽24h。拮抗菌株B-6在NB培养液中摇瓶培养，28℃培养48h，配置成菌悬液。把番茄种子在菌悬液里浸泡上30min，放在培养皿里，摆在灭菌后的滤纸上面，灭菌的棉花蘸取少量无菌水放在培养皿四周角落，26℃培养72h，测量其胚芽、胚根的长度，观察并算出发芽率。无菌水浸泡种子作为空白对照，每处理10粒种子，3次重复。
数据统计与分析
采用Excle2019进行图表的制作，采用SPSS17.0进行数据处理及显著性分析。
结果与分析
3.1拮抗菌株B-6发酵液对番茄青枯病的治疗效果
拮抗菌株B-6发酵液及化学药剂对番茄青枯病治疗试验结果见表9，拮抗菌株B-6发酵液稀释50倍时，防效达68.03%，稀释100倍时，防效达66.67%，稀释150倍时，防效达64.62%，稀释200倍时，防效达62.93%，春雷霉素防效达73.13%，由表可知，施用春雷霉素1000倍稀释液的发病率最低，防治效果最好，随着拮抗菌株B-6发酵液稀释倍数的升高，防治效果逐渐降低。拮抗菌株B-6发酵液稀释50倍防效略低于施用春雷霉素的防效，证明拮抗菌株B-6对番茄青枯病具有较好的治疗作用。并且拮抗菌株B-6发酵液的加入对番茄幼苗的生长具有促进作用，用拮抗菌处理过的幼苗株高明显高于对照组。
表9拮抗菌株B-6发酵液对番茄青枯病的治疗效果
注：CK为清水空白对照，表格中小写字母表示P＜0.05水平下的差异显著性。
3.2拮抗菌株B-6发酵液对番茄青枯病的预防效果
拮抗菌株B-6发酵液及化学药剂对番茄青枯病预防试验结果见表10，拮抗菌株B-6发酵液稀释50倍时，防治效果达到70.41%，稀释100倍时，防治效果为69.05%，稀释150倍时，防治效果为67.68%，稀释200倍时，防效为65.65%，春雷霉素防效达到68.03%。施用稀释50倍发酵液的病情指数最低，对番茄青枯病的防效高于施用春雷霉素1000倍稀释液，证明了拮抗菌株B-6发酵液对病害有良好的预防效果。
表10拮抗菌株B-6发酵液对番茄青枯病的预防效果
注：CK为清水空白对照，表格中小写字母表示P＜0.05水平下的差异显著性。
3.3拮抗菌株B-6对番茄种子发芽的影响
番茄种子经过拮抗菌株B-6菌悬液浸泡处理后，其胚根及胚芽的长度明显长于空白对照即未经过拮抗菌株B-6菌悬液处理的番茄种子，如图10所示。
经过拮抗菌株B-6菌悬液处理过的番茄种子胚根平均长度为28.73mm，胚芽平均长度为21.59mm，空白对照处理过的番茄种子胚根平均长度为23.25mm，胚芽平均长度为14.82mm，处理与空白的番茄种子发芽率均为100%。由表11可以看出，拮抗菌株B-6对种子没有负面作用，而且具有促生效果。经拮抗菌株B-6菌悬液浸泡过的番茄种子其胚根和胚芽的长度均长于空白对照，且差异较明显。因此，对于番茄种子进行催芽时可以预先用拮抗菌株B-6菌悬液浸泡处理，从而促进胚芽及胚根的生长。
表11 拮抗菌株B-6对番茄种子发芽的影响
通过室内盆栽试验，表明拮抗菌株B-6发酵液对番茄青枯病具有良好的治疗和预防效果。在治疗试验中，稀释50倍的拮抗菌株B-6发酵液的防治效果为68.03%，化学药剂春雷霉素稀释液防效为73.13%，拮抗菌株B-6发酵液稀释50倍防效略低于施用春雷霉素的防效。在预防试验中，稀释50倍的拮抗菌株B-6发酵液的防效为70.41%，化学药剂春雷霉素稀释液防效为68.03%，稀释50倍发酵液的防效大于春雷霉素的防治效果。试验过程中，拮抗菌株B-6发酵液处理的番茄幼苗在株高和茎粗生长方面较空白对照明显，且用拮抗菌株B-6菌悬液浸泡处理番茄种子，可促进胚芽及胚根的生长，证明其发酵液具有促进植株生长的作用。综上所述，拮抗菌株B-6具有良好的生防潜能，可开发具有促生抗病作用的生防菌剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种番茄青枯病拮抗菌株及其在防治番茄青枯病方面的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列Artificial Sequence
(tcgaggacta cctgcagtcg agcggatgaa gggagcttgc tcctggattc agcggcggac 60
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agaagtagct agtctaaccg caagggggac ggtaccacgt agtc 1424)
<400> 1
Claims (4)
1.一株番茄青枯病拮抗菌株，其特征在于：该拮抗菌株为铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）B-6，于2021年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No：24048。
2.如权利要求1所述的菌株的应用：其特征在于：该菌株用于防治番茄青枯病。
3.如权利要求1所述的菌株的应用：其特征在于：该菌株的发酵液用于促进番茄生长。
4.如权利要求1所述的菌株的应用：其特征在于：该菌株的发酵液用于促进番茄胚芽及胚根的生长。
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