CN114164123B - 一株能促进杉木生长的内生真菌s24 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株能促进杉木生长的内生真菌，该真菌为胶孢炭疽菌S24（Colletotrichum gloeosporioides S24），已于2020年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020009。所述的胶孢炭疽菌S24是从杉木组织中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的。本发明为内生真菌在促进杉木生长中的应用与开发提供了借鉴。
Description
技术领域
本发明涉及杉木生长领域，具体涉及一株能促进杉木生长的内生真菌S24。
背景技术
杉木（Cunninghamia lanceolata），是中国南方最常见的树种，也是人工林和经济林的主要树种，生长面积大，分别占中国和世界森林林木面积的18%和5%。生长快，品质好，产量高，这是杉木的三大特点，因此可以作为亚热带森林中最具优势的经济树种。杉木人工林和经济林造林面积日益增加，同一块地上对杉木进行多代连栽，导致了土地营养肥力减弱和生产力下降，发生了严重的“第二代效应”。此外，人工林的营林、管理维护措施不当，也会导致林地营养和地力的衰退，进而导致杉木质量和产量下降，造成了生态破坏和巨大的经济损失。
据科学家估计，世界中分布分微生物种类超过了900万，微生物数量大，生活范围广，内生菌更是如此，基本上各种植物体内（包括了藻类、苔藓类、蕨类等低等植物，高等裸子植物和被子植物）都存在内生真菌，从目前的研究情况来看，只有极少部分的微生物被认识和研究。内生菌不仅数量大，研究发现对某一种植物内生菌进行分离和纯化工作，最终可以得到近百种，甚至超多百种的内生真菌，运用高通量测序手段能够得到更加全面和详细的内生菌种类和分布特点；并且在植物中分布更广，根部、根际土壤、茎部、叶片和果实等部位，经研究发现，这些部位均可分离纯化出内生菌，只是数量有差异，这个与内生菌分布的普遍性和在植物体内分布的特异性有关。子囊菌（Sac fungi）、担子菌（basidiomycete）、接合菌（Zygomycotina）、有孢子菌（Mitoporic fungi）和无孢菌（Mycelia sterile）等内生真菌被逐步研究发现出来[25]。
植物内生菌在植物体内生存时，与宿主植物保持了较为一致的生命活动周期，在物质和能量进行交换，并且在生命周期内能够发挥一定的生理作用。研究发现，内生菌能够对植物的生长发育或其他生理活性具有影响作用，其中根部作为与土壤交换界面，微生物、根际微生物的效应最为明显；叶片是呼吸和光合效应的场所、与外界环境接触，受到内生菌的影响较根部弱；茎干因起到支撑、物质运输等作用，内生菌的生存数量较少。经过研究，内生菌具有促生菌、固氮菌、益生菌和生防菌等多种功能，共同影响植物的生长发育。影响方式不仅是内生菌自身作为调节因子起作用，还可以通过其代谢产物等方式起到影响作用。内生菌在不同组织器官中生活，与宿主植物形成了物质能量交换关系，因此，内生菌具有特定性、多样性等特点，因植物体内特定的生活环境和条件的不同，具有不同的功能和效应。
基于此，本发明研究内生真菌对杉木的作用，获得有促生作用的内生真菌，为杉木种植技术的研究提供参考，为内生真菌在促进杉木生长中的应用与开发提供借鉴。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能促进杉木生长的内生真菌S24。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一株能促进杉木生长的内生真菌，所述真菌分类命名为胶孢炭疽菌S24（Colletotrichum gloeosporioides S24），已于2020年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2020009。
进一步的，上述内生真菌是从杉木根部组织中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的。
上述杉木内生真菌的分离方法，具体步骤如下：
（1）材料获取：将采集到的杉木的根部用自来水清洗干净，用脱脂棉吸干表面水分，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存备用；
（2）外植体表面消毒：70%酒精浸泡1min——无菌水浸洗3次——2%次氯酸钠浸泡3min——无菌水浸洗3次——无菌滤纸吸干表面残留水分；
（3）接种：用灭菌后的解剖刀分别将消毒后的根部切成1cm长的小段，放在PDA培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养10 天，进一步纯化，得到所述杉木内生真菌纯菌株。
进一步的，上述杉木内生真菌在PDA培养基上28℃培养10 天后，得到的菌落呈白色团状。
进一步的，上述杉木内生真菌显微形态为：分生孢子长圆形、圆筒形，单胞，无色，有小而黑色的基座；分生孢子梗平行排列，无色。
本发明还提供了上述一株杉木内生真菌胶孢炭疽菌S24（Colletotrichum gloeosporioides S24）在促进杉木生长方面的应用。
进一步的，上述应用具体为：将胶孢炭疽菌S24（Colletotrichum gloeosporioides S24）接入PDB液体培养基中，于28℃恒温振荡培养箱中在180r/min的条件下摇培3-4天，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用无菌水配制成浓度为5.5×106cfu/mL的菌液，按每株100ml从杉木顶端施浇，确保植株叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液；其中，PDB液体培养基配方为：葡萄糖20g，马铃薯200g，水1000ml。
本发明的显著优点在于：
本发明所述一种能促进杉木生长的内生真菌，经微生物分类学鉴定为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，保藏编号为CCTCC NO：M 2020009，保藏日期为2020年1月3日，中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，所述的内生真菌是从杉木组织中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的。该内生真菌可分泌生长素（IAA），并可成功定殖于杉木幼苗根部，显著促进杉木地径的生长，提高杉木幼苗地上部干重、地下部干重及根冠比，并提高杉木幼苗地上部碳、氮、磷元素含量。
附图说明
图1：胶孢炭疽菌S24的菌落形态图。
图2：ITS目的片段扩增结果。
图3：胶孢炭疽菌S24系统发育树图谱。
图4：胶孢炭疽菌S24生长素检测结果
图5：胶孢炭疽菌S24在杉木幼苗体内定殖情况。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
本发明胶孢炭疽菌S24（Colletotrichum gloeosporioides S24）是从杉木根部组织中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的。
以下实施例中各培养基的配方如下：
PDB液体培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，水1000ml；
PDA固体培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂18g，水1000ml；
King B液体培养基：蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，无菌水1000ml。
实施例1
将采集到的杉木根用自来水清洗干净，用脱脂棉吸干表面水分，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存备用。对外植体进行表面消毒，具体步骤为：70%酒精浸泡1min——无菌水浸洗3次——2%次氯酸钠浸泡3min——无菌水浸洗3次——无菌滤纸吸干表面残留水分。用灭菌后的解剖刀分别将消毒后根的切成1cm长的小段，放在PDA固体培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养10天，进一步纯化，得到杉木内生真菌纯菌株，将其命名为S24。该杉木内生真菌的菌落形态如图1所示，菌落白色丝团状 ；菌体白色丝状。该杉木内生真菌显微形态为：分生孢子长圆形、圆筒形，单胞，无色，有小而黑色的基座；分生孢子梗平行排列，无色。
采用Fungal DNA Mini Kit试剂盒（购自OMEGA公司）提取菌株S24基因组DNA，然后采用Unversal DNA Purification Kit试剂盒（购自TIANGEN公司）对提取的DNA进行纯化回收，PCR扩增菌株S24的ITS片段。所用到的引物为：
ITS1（SEQ ID NO.1）：5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，
ITS4（SEQ ID NO.2）：5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
PCR反应体系：2X Reaction Mix 25 μL，Golden DNA Polymeraes 1U 0.5μL，10μmol/LITS1和ITS4 各2μL，模板DNA 2μL，ddH20 18.5 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃充分延伸5min，4℃保存。
取PCR产物在琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到ITS目的片段长为600bp（图2）。将含有目标片段的产物委托宝生物工程公司完成测序，得到的实际有效核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。用BLAST程序进行比对分析，选取具有较高同源性的序列用Clustal X和MEGA软件对需要进行绘制系统发育树的序列进行比对，再采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，确定菌株S24与Colletotrichum gloeosporioides（FN566873.1）和Colletotrichum gloeosporioides strain W-1（KT390189.1）的亲缘关系最近（图3），同源性分别为100%和99%，形成一个族群。结合菌株S24的形态观察以及DNA系统发育树中的同源性分析，最终判定其为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。
实施例2
采用Salkowski比色法检测胶孢炭疽菌S24是否能够分泌生长素（IAA）。将分离得到的胶孢炭疽菌S24接入PDB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养3-4天，吸取50μL菌液（5.5×106 cfu/mL）转接至 250mL King B液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养1天。培养结束后，将菌液在10000 r/min的条件下离心10 min，吸取1ml上清液到新的试管中，向其中加入1ml Salkowski试剂（购自宝生物工程公司），置于黑暗条件下反应25min，反应后，如果试管内溶液呈红色，则说明该菌株可以分泌生长素。以无菌水作为对照。
结果如图4所示，胶孢炭疽菌S24可分泌生长素。
实施例3
本实施例采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省连城邱家山国有林场提供的生长健壮、无病害的020号无性系杉木幼苗。选择长势一致的苗木于2018年3月定植于直径20cm，高40cm的塑料花盆中，所用土壤是经过甲醛熏蒸灭菌后的黄心土，栽植时，严格控制每盆土的质量为4kg。经过2个月的恢复性生长后，于5月15日从杉木幼苗顶端浇施100mL菌液，确保植株叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液。在施浇菌液后的第15天，采集杉木幼苗的少许根系制作切片，并通过台盼蓝染色法进行染色，放于光学显微镜下进行观察，拍照。
其中，菌液制备方法为：将胶孢炭疽菌S24接入装有500mL PDB液体培养基的三角瓶中，在恒温振荡培养箱中于28℃、180r/min的条件下摇培3-4天，使用血球计数板计算菌液浓度，用无菌水配制成浓度为5.5×106 cfu/mL的菌液。
结果如图5所示，在杉木根系细胞中观察到胶孢炭疽菌S24的菌丝，表明胶孢炭疽菌S24在杉木幼苗根部定殖成功。
实施例4
本实施例采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省连城邱家山国有林场提供的生长健壮、无病害的020号无性系杉木幼苗。选择长势一致的苗木于2018年3月定植于直径20cm，高40cm的塑料花盆中，所用土壤是经过甲醛熏蒸灭菌后的黄心土，栽植时，严格控制每盆土的质量为4kg。经过2个月的恢复性生长后， 于5月15日从杉木幼苗顶端浇施100mL菌液，确保植物叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液。在施浇菌液后的第60天，测量地径。以无菌水为对照。
其中，菌液制备方法为：将胶孢炭疽菌S24接入装有500mL PDB液体培养基的三角瓶中，在恒温振荡培养箱中于28℃、180r/min的条件下摇培3-4天，使用血球计数板计算菌液浓度，用无菌水配制成浓度为5.5×106 cfu/mL的菌液。
结果如表1所示，胶孢炭疽菌S24能够显著促进杉木幼苗地径的生长，其对杉木幼苗地径的增长率高于对照组的增长率。
表1 内生真菌对杉木幼苗地径的影响
实施例5
本实施例采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省连城邱家山国有林场提供的生长健壮、无病害的020号无性系杉木幼苗。选择长势一致的苗木于2018年3月定植于直径20cm，高40cm的塑料花盆中，所用土壤是经过甲醛熏蒸灭菌后的黄心土，栽植时，严格控制每盆土的质量为4kg。经过2个月的恢复性生长后，于5月15日从杉木顶端浇施100mL菌液，确保植物叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液。在施浇菌液后的第60天，拔苗，分别将杉木幼苗的地上和地下部分洗净烘干，测定其鲜重和干重，根冠比以地下部分与地上部分的干重的比值表示。以无菌水为对照。
其中，菌液制备方法为：将胶孢炭疽菌S24接入装有500mL PDB液体培养基的三角瓶中，在恒温振荡培养箱中于28℃、180r/min的条件下摇培3-4天，使用血球计数板计算菌液浓度，用无菌水配制成浓度为5.5×106 cfu/mL的菌液。
结果如表2所示，接种胶孢炭疽菌S24的杉木幼苗的地上干重、地下干重及根冠比均高于对照。
表2 内生真菌对杉木幼苗生物量和根冠比的影响
实施例6
本实施例采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省连城邱家山国有林场提供的生长健壮、无病害的020号无性系杉木幼苗。选择长势一致的苗木于2018年3月定植于直径20cm，高40cm的塑料花盆中,所用土壤是经过甲醛熏蒸灭菌后的黄心土,栽植时，严格控制每盆土的质量为4kg。经过2个月的恢复性生长后， 于5月15日从杉木顶端浇施100mL菌液，确保植物叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液。在施浇菌液后的第30天，拔苗，测定其地上部碳含量和氮含量。以无菌水为对照。
其中，菌液制备方法为：将胶孢炭疽菌S24接入装有500mL PDB液体培养基的三角瓶中，在恒温振荡培养箱中于28℃、180r/min的条件下摇培3-4天，使用血球计数板计算菌液浓度，用无菌水配制成浓度为5.5×106 cfu/mL的菌液。
结果如表3所示，胶孢炭疽菌S24能够有效提高杉木幼苗地上部碳、氮元素含量，同时具有较高的增长率，接种胶孢炭疽菌S24的杉木幼苗地上部碳、氮元素含量均高于对照组。
表3 混合内生真菌对杉木幼苗碳和氮元素的影响
实施例7
本实施例采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省连城邱家山国有林场提供的生长健壮、无病害的020号无性系杉木幼苗。选择长势一致的苗木于2018年3月定植于直径20cm，高40cm的塑料花盆中，所用土壤是经过甲醛熏蒸灭菌后的黄心土，栽植时，严格控制每盆土的质量为4kg。经过2个月的恢复性生长后， 于5月15日从杉木顶端浇施100mL菌液，确保植物叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液。在施浇菌液后的第30天，拔苗，测定其地上部及地下部磷含量。以无菌水为对照。
其中，菌液制备方法为：将胶孢炭疽菌S24接入装有500mL PDB液体培养基的三角瓶中，在恒温振荡培养箱中于28℃、180r/min的条件下摇培3-4天，使用血球计数板计算菌液浓度，用无菌水配制成浓度为5.5×106 cfu/mL的菌液。
结果如表4所示，胶孢炭疽菌S24能够有效提高杉木幼苗地上部磷元素含量，其地上磷元素含量高于对照组。
表4 内生真菌对杉木幼苗磷元素的影响
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一株能促进杉木生长的内生真菌S24
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 575
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ctgagtttac gctctacaac cctttgtgaa 60
catacctata actgttgctt cggcgggcag ggtctccgtg accctcccgg cctcccgccc 120
ccgggcgggt cggcgcccgc cggaggataa ccaaactctg atttaacgac gtttcttctg 180
agtggtacaa gcaaataatc aaaactttta acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg 240
aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 300
tttgaacgca cattgcgccc gccagcattc tggcgggcat gcctgttcga gcgtcatttc 360
aaccctcaag ctctgcttgg tgttggggcc ctacagctga tgtaggccct caaaggtagt 420
ggcggaccct cccggagcct cctttgcgta gtaactttac gtctcgcact gggatccgga 480
gggactcttg ccgtaaaacc cccaattttc caaaggttga cctcggatca ggtaggaata 540
cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaa 575
Claims (3)
1.一株能促进杉木生长的内生真菌，其特征在于：所述内生真菌分类命名为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）S24，已于2020年1月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2020009。
2.一种如权利要求1所述的内生真菌在促进杉木生长方面的应用。
3.根据权利要求2所述的内生真菌在促进杉木生长方面的应用，其特征在于：将胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）S24接入PDB液体培养基中，于28℃恒温振荡培养箱中在180r/min的条件下摇培3-4天，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用无菌水配制成浓度为5.5×106 cfu/mL的菌液，按每株100ml从杉木顶端施浇，确保植株叶片、茎干、根部以及土壤中均有菌液；其中，PDB液体培养基配方为：葡萄糖20g，马铃薯200g，水1000ml。
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