CN112111431A - 一株植物促生菌株xn-k13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株植物促生菌株XN‑K13，分类命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN‑K13，于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。本发明提供的植物促生菌株XN‑K13可以色氨酸为前体合成植物生长激素吲哚乙酸(IAA)，由于其吸附在种子和根系的表面，可直接被植物利用，同时也可能与植物本身内生的IAA共同作用刺激植物细胞的生长和增殖，从而促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分，并参与植物体内其他生命活动的调节。

Description

一株植物促生菌株XN-K13及其应用

技术领域

本发明属于植物促生菌技术领域，具体涉及的是一株解难溶性钾的植物促生菌株XN-K13及其应用。

背景技术

化肥在现代农业生产中发挥着巨大作用，但是随着化肥使用量的增加，其利用率逐年降低。农药和化肥残留，向环境释放了大量的有害物质，污染了土壤、水源和食品，对人类健康及生存环境构成了极大威胁，要求保护生态环境和生产安全食品的呼声日益强烈。因此，开发利用替代化学肥料的新肥源，以适应发展绿色农业和绿色食品的需要已是当务之急。而微生物肥料可使土壤中无效营养有效化，预防和控制农作物病害，减少农药和化肥的使用，是解决土壤、水源和食品污染的根本途径，被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量的方法。

微生物肥料是一类含有微生物活体的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应，其中，制品中活微生物起关键作用。目前，一般将微生物肥料制品分为两大类：一类是狭义的微生物肥料，指通过微生物的生命活动，增加了植物营养元素的供应量，包括土壤和生产环境中植物营养元素的供应总量，导致植物营养状况的改善，进而增加产量；这一类微生物肥料的代表是根瘤菌肥；另一类是广义的微生物肥料，指通过其中微生物的生命活动，不但能提高植物营养元素的供应量，还能产生植物生长激素，促进植物对营养元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻农作物病虫害间接提高作物产量。与化学肥料相比，微生物肥料具有以下优点：不破坏土壤结构；保护生态、不污染环境，对人畜无毒无害；肥效持久；提高作物产量，改善作物品质；成本低廉，经济有效。

植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria PGPR)是一类能高密度定殖在植物根际的微生物，兼有抑制植物病原菌、根际有害微生物，以及促进植物生长并增加作物产量的作用。作为生物肥料和生物农药的重要资源库，PGPR的研究和应用已经起到了举足轻重的作用，从资源再生利用的角度来研究和开发微生物肥料则对资源综合利用和环境保护更具有现实意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明目的在于提供一种能耐盐解难溶态钾的菌株XN-K13及其应用，该菌是一种新的植物根际促生菌，可应用于植物促生剂或微生物肥料的制备。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一株植物促生菌株XN-K13，分类命名为路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigil)XN-K13，于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。

上述的植物促生菌株XN-K13在促进植物生长中的应用。

优选地，所述植物促生菌株XN-K13通过产酸的方式将难溶性钾转化成植物可以吸收利用的速效钾，从而提高植物对钾离子的吸收。

优选地，所述植物促生菌株XN-K13通过利用色氨酸合成生长素IAA、合成植物生长调节剂5-氨基乙酰丙酸的方式促进植物生长。

优选地，所述植物促生菌株XN-K13通过合成5-氨基乙酰丙酸促进植物种子萌发和净光合速率，增强植物的耐受性，保护其免受许多非生物胁迫的影响。

优选地，所述植物促生菌株XN-K13将难溶无机磷转化成可溶的速效磷，提高植物对磷元素的吸收利用。

优选地，所述植物促生菌株XN-K13通过合成嗜铁素与植物病原菌竞争铁离子，抑制植物病原菌的生长，减少其在植物生长中过程中的危害作用。

上述植物促生菌株XN-K13在制备促进植物生长制剂中的应用，所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：

(1)本发明提供的植物促生菌株XN-K13为首次从广西壮族自治区兴宁药用植物园的植物根际土壤中筛选分离得到的，检测结果表明该菌是一株能够高效溶解难溶态钾的新的路德维希肠杆菌种，命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13；

(2)本发明提供的植物促生菌株XN-K13由于其能产酸类物质可以高效溶解难溶态钾，释放可溶性钾，以增加土壤中速效钾含量，可以促进植物生长；

(3)本发明提供的植物促生菌株XN-K13可以色氨酸为前体合成植物生长激素吲哚乙酸(IAA)，由于其吸附在种子和根系的表面，可直接被植物利用，同时也可能与植物本身内生的IAA共同作用刺激植物细胞的生长和增殖，从而促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分，并参与植物体内其他生命活动的调节；

(4)本发明提供的植物促生菌株XN-K13由于其能够溶解并利用培养基中的磷酸钙，同时还具有合成嗜铁素、5-氨基乙酰丙酸和固氮等特性，能够提高盐碱土壤中的营养平衡。

保藏信息说明

植物促生菌株XN-K13于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。

附图说明

图1为本发明植物促生菌株XN-K13在LB固态培养基上的菌落形态。

图2为本发明植物促生菌株XN-K13的显微镜观察。

图3为本发明植物促生菌株XN-K13的扫描电镜图。

图4为本发明植物促生菌株XN-K13在解钾培养基上的解钾定性分析。

图5为钾标准曲线。

图6为本发明植物促生菌株XN-K13在不同NaCl浓度下的解钾效率与培养液pH的影响。

图7为本发明植物促生菌株XN-K13在10g/LNaCl浓度下培养基上清液中钾长石溶解量与pH值的关系。

图8为本发明植物促生菌株XN-K13在两种钾源条件下对苗期玉米促生25天时生物量的比较；其中A为植物促生菌株XN-K13在两种钾源条件下对苗期玉米促生25天时地上部分鲜重的比较，B为植物促生菌株XN-K13在两种钾源条件下对苗期玉米促生25天时地下部分鲜重的比较，C为植物促生菌株XN-K13在两种钾源条件下对苗期玉米促生25天时地上部分干重的比较，C为植物促生菌株XN-K13在两种钾源条件下对苗期玉米促生25天时地下部分干重的比较。

图9为本发明植物促生菌株XN-K13在两种钾源条件下对苗期玉米促生25天时植株速效钾的比较。

图10为本发明植物促生菌株XN-K13在两种钾源条件下对苗期玉米促生25天时植株速效磷的比较。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下列实施例中，使用的改良的解钾菌选择培养基组成为蔗糖5g，Na₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeCl₃ 0.005g，CaCO₃ 0.1g，钾长石粉1g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH7.0，100mg/L BTB显色剂，115℃灭菌20min。

使用的解钾能力测试培养基组成为蔗糖10g，Na₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O0.5g，(NH₄)₂SO₄ 1g，NaCl 10g，酵母膏0.5g，钾长石粉10g，去离子水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min。

实施例1

植物促生菌株XN-K13的分离和鉴定

1.1植物促生菌株XN-K13的分离

植物促生菌株XN-K13的分离包括取样、富集和初筛，复筛三个步骤，具体如下：

1.1.1取样

从广西药用植物园(E108°19'，N22°51')的土壤中采样，装入干净的采样袋中，做好标记，于4℃冰箱中保存，作为根际土壤样品。

1.1.2富集和初筛

称取1.0g根际土壤样品，置入装有9mL无菌去离子水试管中，充分振荡混匀，37℃，200r/min，振荡培养30min，将其按十步梯度稀释，得到稀释液；为分离耐盐菌添加NaCl质量浓度为10g/L作为盐胁迫，吸取100uL稀释液涂布于含有NaCl质量浓度为10g/L的牛肉膏蛋白胨固态培养基上，37℃培养2天，用灭菌的牙签将牛肉膏蛋白胨培养基上的单菌落点种到改良的解钾菌选择培养基上37℃培养5天，根据解钾圈的大小，从中筛选出解钾能力较强的菌株。

1.1.3复筛

将初筛得到的菌株接种于解钾能力测试培养基中，37℃，200r/min，振荡培养4天，通过四苯硼钠比浊法对其定量，分离得到了一株解钾能力较强的菌株，将其接种于LB固体培养基上多次划线纯化，将纯化好的菌种斜面保藏于冰箱中。

1.2植物促生菌株XN-K13的鉴定

对上述分离纯化得到的纯培养物进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取，16SrDNA的扩增和测序，所得结果如下：

1.2.1该菌株在LB固态培养基上形成圆形或近圆形、乳白色、中央微凸起、表面光滑湿润有光泽、边缘较整齐的菌落(图1)。

显微镜镜检显示短杆状、革兰氏阴性细菌(图2)。

扫描电镜观测菌体呈短圆杆状、无鞭毛、无芽孢，菌体大小为(1.0～1.5)um(0.4～0.6)um(图3)。

其他检测项目如表1所示：

表1植物促生菌株XN-K13的生理生化特征

注：“+”表示阳性反应，存在或有，“-”表示阴性反应，不存在或没有。

1.2.2利用引物F27和R1492进行扩增16S rDNA，引物序列如下

F27:5'-AGAGTTGATCATGGCAG-3'，如SEQ ID NO.1所示；

R1492:5'-TAGGGTTACCTTGTTACGCTT-3'，如SEQ ID NO.2所示

PCR扩增条件为95℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃90s、30个循环，72℃10min，4℃保存。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示，植物促生菌株XN-K13菌株的16S rDNA的序列长度为1440bp，经同源性比对，其与Enterobacter ludwigii straincjy09(GenBank accession no.MN177186.1)具有99％的高度相似性，结合植物促生菌株XN-K13菌株形态学和生理生化特性，鉴定该菌株为Enterobacter ludwigii菌属的一个菌株，命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)XN-K13，将其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO.M2020145。

实施例2

植物促生菌株XN-K13解钾的准确定性：

通过改良的解钾菌选择培养基初步评估了路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)XN-K13对难溶态钾的溶解能力：用无菌牙签将1.1.3分离纯化所得菌株点刺于在含有钾长石作为不溶性钾源的改良的解钾菌选择培养基中心，置于37℃培养箱中培养5d，每组处理三次重复，观察出现解钾圈测量菌落直径(d)和解钾圈直径(D)，结果如表2所示，计算解钾圈与菌落直径的比(图4)；从表2和图4可以得出耐环境胁迫菌株XN-K13的解钾圈与菌落直径的比达到4.62，具有较高的溶钾能力。)

表2植物促生菌株XN-K13解钾的定性分析

菌株	解钾圈直径D(mm)	菌落直径d(mm)	解钾圈/菌落直径(D/d)
				XN-K13	23.35±0.04	5.05±0.04	4.62±0.03

实施例3

植物促生菌株XN-K13解钾的定量分析：

钾标准溶液：准确称取烘干(105℃烘干4-6小时)的分析纯KCl 1.9068g溶于200mL去离子水中，并定容至1L，摇匀即得含钾1000mg/L，吸取上述溶液25mL至250mL容量瓶中定容摇匀后，即为含钾100mg/L的钾标准溶液。

3％四苯硼钠溶液：称取3g四苯硼钠溶于100mL去离子水中，加入10滴0.2mol/L氢氧化钠溶液，使pH调至8-9，静置过夜后，用致密滤纸过滤，贮于棕色瓶中。

0.05mol/L硼砂溶液：称取19.07g硼砂溶于1000mL去离子水中。

甲醛-EDTA溶液：称取2.5g EDTA二钠盐溶于20mL 0.05mol/L硼砂溶液中，加入80ml 37％甲醛，用0.2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至9。

本实施例采用四苯硼钠比浊法测定溶液中速效钾含量，其原理为样品中的K⁺在微碱性介质中与四苯硼钠(NaTPB)反应，生成溶解度很小的微小颗粒四苯硼钾(KTPB)白色沉淀，用分光光度计检验其浊性，从而得到样品中可溶性钾的含量。若待测液中含有NH⁴⁺，将会生成四苯硼铵白色沉淀，从而干扰钾的测定，其干扰可以在碱性条件下用甲醛掩蔽，甲醛能与NH⁴⁺缩合生成水溶性而且稳定的六亚甲基四铵，若待测液中含有Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺，在碱化时都会生成白色沉淀从而干扰试验，其用EDTA掩蔽。

钾标准曲线的绘制：分别吸取100mg/L的KCl标准溶液0mL、1.5mL、2.5mL、3.5mL、5.0mL、7.5mL、10mL于50mL比色管中，先加入1mL甲醛-EDTA掩蔽剂，摇匀后，再用移液枪快速准确地加入1mL 3％四苯硼钠溶液，立即振荡摇匀，室温放置30min，摇匀后，用分光光度计在420nm处测定吸光值。以测得吸光值为纵坐标，可溶性钾含量mg/L为横坐标，绘制标准曲线，如图5所示。

样品测试：将改良的解钾菌选择培养基筛选得到的植物促生菌株XN-K13制成种子液，取4mL接种于解钾能力测试培养基中，200r pm，37℃摇床培养4天，将培养液8000r/min离心15min，上清液作为供试液，吸取5mL供试液于50mL比色管中，加入1mL甲醛-EDTA掩蔽剂，摇匀后，再用移液枪快速准确地加入1mL 3％四苯硼钠溶液，立即振荡摇匀，去离子水定容至50mL，室温放置30min，摇匀后，用分光光度计在420nm处测定吸光值。与标准曲线对比，得到溶液中可溶性钾的含量。

结果计算：由供试液比浊所得的吸光值，在钾标准曲线(图5)上查出相应的钾含量，再按下式计算发酵液中速效钾的含量，再按公式(2)计算解钾效率：

解钾量(mg/L)＝比浊液的吸收值(mg/L)×稀释倍数；

解钾效率计算方法如下：

解钾效率(％)＝(X₁-X₀)/(M×W×2×10⁴)×100％ (2)

式中：X₁-实验组钾含量(mg/L)；X₀-空白组钾含量(mg/L)；M-钾长石重量(g)；W-钾长石中钾含量(％)，本试验钾长石中K含量为13％。

结果表明，本发明的路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13摇瓶培养的解钾量为176.15(±0.46)mg/L，解钾效率为13.81％，如表3所示：

表3植物促生菌株XN-K13解钾的定量分析

菌株	平均OD	解钾量(mg/L)	解钾效率(％)	pH值
					XN-K13	1.037	176.15±0.46	13.81	3.94±0.07

实施例4

植物促生菌株XN-K13在不同盐浓度下解钾能力的测定：

在不同NaCl浓度(10、20、50、100g/L)下对植物促生菌株XN-K13的解钾能力进行定量分析，结果如表4所示，菌株XN-K13的解钾量含量随着盐浓度的升高而大幅度减弱，在10g/L NaCl浓度下时，其解钾量含量最高，为176.90(±0.73)mg/L。在此培养条件下对菌株解钾效率与培养液pH进行了测定(图6)，植物促生菌株XN-K13解钾效率随着盐浓度的升高而不断降低，其培养液pH不断升高。在10g/L NaCl浓度条件下时，菌液pH最低，解钾效率最高，对10g/L NaCl浓度下培养液上清液中的钾长石溶解量和pH值之间作相关性分析(图7)，得到回归方程y＝-47.168x+359.75，相关性系数R²＝0.8789，皮尔逊系数r＝-0.935(P<0.0001)，说明钾长石溶解量与pH值在P<0.0001水平上呈极显著负相关关系，这可能是因为植物促生菌株XN-K13产生的一些酸类物质与难溶钾长石中的阳离子进行了螯合作用，将难溶性钾长石转化成可溶的速效钾。

表4不同盐浓度下植物促生菌株XN-K13解钾定量分析

盐浓度NaCl(g/L)	10	20	50	100
					解钾量含量(mg/L)	176.90±0.73	119.66±0.06	32.80±0.02	17.74±0.67

实施例5

植物促生菌株XN-K13在不同盐浓度下合成生长激素IAA含量的测定：

植物促生菌株XN-K13，即路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13菌株在不同盐浓度IAA检测培养基(Trytone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 5g，色氨酸5g，去离子水1000mL，pH 7.0，115℃灭菌20min)中，37℃，200r/min振荡培养24h，取样菌液OD₆₀₀，当OD₆₀₀＝0.5时收集菌液。取2mL菌液加入到2mL EP管中，1200r/min离心2min，取1mL上清液加入1mL Salkowski显色剂(含150mL浓硫酸、250mL去离子水和7.5mL 0.5mol/L FeCl₃)，室温避光静置30min后，用不接菌的IAA检测培养基相同处理作为空白对照调零，测定各混合液的OD₅₃₅值，每组都做三次重复。

以浓度为0、10、20、30、40、50、60ug/mL的IAA标准品同方法做标准曲线，其标准曲线方程为y＝0.0151x+0.0568(R²＝0.9974)。

结果表明，本发明的植物促生菌株XN-K13在不同盐浓度(0、10、20、50g/L NaCl)下都具有合成IAA的能力(表5)。在10g/L NaCl浓度下IAA合成量最高，为17.64(±0.36)ug/mL，表明路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13能够利用色氨酸产生IAA。

表5不同盐浓度下植物促生菌株XN-K13产IAA的定量分析

盐浓度NaCl(g/L)	0	10	20	50	100
						IAA合成量(mg/L)	17.51±0.13	17.64±0.36	12.34±0.14	0.69±0.09	ND

实施例6

植物促生菌株XN-K13在不同盐浓度下合成次生长激素5-氨基乙酰丙酸(ALA)含量的测定：

将活化12h的植物促生菌株XN-K13，即路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13一式两份接种于补充有15mM甘氨酸和琥珀酸的10mL不同盐浓度LB培养基中，在静止的生长条件下37℃培养48h，取出后在离心机中10000r/min离心10min，取上清液2mL加入等体积的2mol/L乙酸钠缓冲液(pH 4.6)和0.5mL乙酰丙酮，混合均匀后，冷却至室温，取2mL反应液加入2mL的Ehrlich试剂混匀，显色15min后，以去离子水为空白对照测定554nm处吸光值。以浓度为0、5、10、15、20、25、30ug/mL的ALA标准品同方法做标准曲线，其标准曲线方程为y＝0.1157x+0.0353(R²＝0.9980)。

结果表明，本发明路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13在20g/LNaCl浓度条件下时，其5-氨基乙酰丙酸合成量最高为13.54(±0.16)ug/mL(表6)：

表6不同盐浓度下植物促生菌株XN-K13产5-氨基乙酰丙酸的定量分析

盐浓度NaCl(g/L)	0	10	20	50	100
						ALA合成量(mg/L)	13.07±0.10	13.11±0.33	13.54±0.16	7.27±0.13	ND

实施例7

植物促生菌株XN-K13在不同盐浓度下摇瓶培养可溶性磷含量的测定：

钼锑抗显色液的配置：

(1)取酒石酸氧锑钾[K(Sb0)C₄H₄0₆]0.5g，溶解于100mL水中；

(2)称取钼酸铵[(NH₄)₆Mo₇0₂₄4H₂0]10g溶于450mL水中，缓慢地加入153mL浓硫酸H₂S0₄，边加边搅；

(3)再将上述步骤(1)所得溶液加入到步骤(2)所得溶液中，最后加水至1L，充分摇匀，贮于棕色瓶中，此为钼锑抗试剂，有效期24h。

植物促生菌株XN-K13在10mL LB液态培养基中，37℃，200r/min，振荡培养12h，取1mL培养液接种于装有100mL不同盐浓度的NBRIP液体培养基的三角瓶中，设置3个重复及对照组(不接菌)。置于37℃摇床200r/min培养5d后，取5mL发酵液，8000rpm离心取上清液。本实施例采用钼锑抗比色法测定发酵液中无机磷溶解量可溶性磷含量，吸取1mL离心后的发酵液加入比色管中，再加入5mL钼锑抗显色剂(5.5mol/L H₂S0₄，10g/L钼酸铵0.5g/L酒石酸氧锑钾，15g/L抗坏血酸)，加去离子水定容至50mL，静置15-20min以后，以对照组为空白，于650nm下测定OD值。

以浓度为0、5、10、15、20、25mg/L的KH₂PO₄标准品以相同方法做标准曲线，其标准曲线方程为y＝0.2338x+0.0562(R²＝0.9903)。

结果表明，本发明的路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13摇瓶培养的可溶性磷含量随着盐浓度的升高而大幅度减弱，在10g/L NaCl浓度下时，其无机磷溶解量最高，为186.45(±1.64)mg/L(表7)。

表7不同盐浓度下植物促生菌株XN-K13无机磷溶解能力的定量分析

实施例8

植物促生菌株XN-K13嗜铁素合成能力的测定：

将植物促生菌株XN-K13接种于LB培养基中活化12h后，取2mL培养液接种于装有100mL MKB液态培养基中，37℃，200r/min摇床振荡培养48h后，将培养液转移至无菌的50mL离心管中，8000r/min离心8min，取上清液与等体积CAS蓝色检测液充分混合均匀，静止1h，使其充分反应后，测定630nm波长处的吸光值为A，用同样的方法测定未接种MKB培养液为对照，与CAS等体积混匀后，测得参比值为Ar，每组处理三次重复，从而得到嗜铁素相对含量A/Ar，A/Ar值在0-1.0之间代表菌株具有合成嗜铁素的能力，该值越低，表明嗜铁素含量越高，对其产嗜铁素的能力进行划分，A/Ar从1.0～0之间以0.2为间隔，每减少0.2增加一个“+”。

表8植物促生菌株XN-K13产嗜铁素能力分析

样品名	XN-K13
		产铁载体能力	+++

结果如表8所示，从表8中可以看出本发明的植物促生菌株XN-K13具有较高合成铁载体的能力。

实施例9

植物促生菌株XN-K13在可溶性钾和不溶性钾环境下对苗期玉米的促生效果：

在可溶性钾源和不溶性钾源条件下采用灌根方式对玉米进行珍珠岩盆栽促生实验，为期25天，期间浇灌5次菌液，观察浇灌菌液的玉米植株的地上部分的鲜重、干重，地下部分的鲜重、干重，速效钾含量，速效磷含量与未浇灌菌液的玉米相比较生长的状况，具体如图8-10所示。

用于玉米促生实验的两种钾源分别为可溶性的KNO₃和不溶性的钾长石粉，其中钾长石粉购于义翔新材料公司，K₂O的含量为13％，过100目筛后用1mol/L盐酸浸泡24h，反复用去离子水冲洗，利用旋涡混合仪充分混合，清洗30min后在7000rpm，6min离心机中离心沉淀，倒掉上清液，去除钾长石粉中的可溶性钾，阴干备用。

菌液制备：将植物促生菌株XN-K13接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃培养12h活化菌株后，取2mL菌液接种于含有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min摇床培养24h，在4℃下10000r/min离心10min来收集细菌细胞，用无菌水洗涤3次以彻底去除培养基，最后悬浮于无菌水中直至菌液浓度达到10⁸CFU/mL。

珍珠岩盆栽试验：将120g珍珠岩倒入至已经用75％乙醇消毒的花盆(直径13cm，高度15cm)中，并用无菌去离子水反复洗涤后，放置于高压灭菌锅中121℃灭菌20min后烘干待用，花盆无排水孔。将颗粒饱满、健康的玉米种子用去离子水清洗3次后置于1％次氯酸钠溶液中灭菌10min，然后用无菌水反复冲洗7次，晾干后分别置于上述相应细菌悬液中在28℃恒温培养箱中恒温浸种30min，结束后，放于湿润无菌的双层滤纸平板上，28℃恒温培养箱中黑暗催芽三天，定时用无菌水冲洗以去除掉种子萌发所产生的代谢物，待玉米达到发芽标准(根长1cm)时进行播种，用无菌镊子将其转移至花盆中，每盆均匀植苗3株。在播种发芽种子之前将钾长石粉以1.0g/kg的比例作为不溶性K源添加到相对应的盆中与珍珠岩混匀，每盆均匀植苗3株，同时浇灌Hoagland’s缺K营养液以保证植物对其他营养元素的吸收；其中可溶性K源的处理中每盆也均匀植苗3株，将含有水溶性K源的Hoagland’s营养液作为可溶性K源添加到相对应的盆中。与此同时，根据相关处理，每一株幼苗接种1mL相应菌悬液，用无菌去离子水作为空白对照的添加(每5天补充一次)。所有试验处理都在温室中进行，该温室为16h光照/8h黑暗，日/夜温度为28℃(白天)/25℃(夜间)，相对湿度为70％，光照强度为300μmol m^-2s^-1。为了保证所有设置的均匀性，消除蒸发、蒸腾、光、温度等因素的影响，每天交换各种处理的位置。此外，每日使用无菌水以称重的形式进行灌溉，使提供80％的水分含量，每3天补充一次Hoagland营养液，其中，用Hoagland’s缺K营养液浇灌钾长石处理的玉米植株，当玉米幼苗在盆中生长25d后，收获植物。

测定经植物促生菌株XN-K13处理的玉米25天后，与对照相比，地上部分鲜重、干重，地下部分鲜重、干重，植株速效钾含量，植株速效磷含量变化如表9所示。从表9以及图8-10可以看出本发明的植物促生菌株XN-K13活菌在可溶性钾源和不溶性钾源条件下都促进了苗期玉米的地上部分、地下部分生物量的增加，溶解了钾长石，促进了玉米植株对钾元素和磷元素的吸收，提高了钾的利用效率。

表9植物促生菌株XN-K13在玉米苗期促生长25天时地上、地下部分生物量，植株速效钾、植株速效磷的变化

综上所述，本发明路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13由于其能产生酸类物质，螯合难溶态钾矿化物中的阳离子，将钾长石中的钾转化成可溶性的速效钾，高效溶解难溶钾，释放速效钾，以增加土壤中速效钾含量，可以解除植物缺钾胁迫，促进植物生长。同时能够合成吲哚乙酸，从而能够为植物提供吲哚乙酸，降低外界的高渗透压力，调节植物细胞的增大和分化，增强植物的抗氧化酶系统，减少盐胁迫对植物所造成的生长抑制。此外，路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13还具有合成植物生长调节剂5-氨基乙酰丙酸(ALA)的能力，调节植物呼吸和光合作用，促进种子萌发和植株生长。其还能溶解并利用培养基中的磷酸钙，高效溶解难溶磷，释放可溶性磷，促进植物生长，协助改良土壤。另外，还可以产生铁载体，通过螯合或配体交换Fe³⁺来抑制寄主植物根际的病原微生物的增殖，减少植物在生长过程中的危害作用，提高植物对离子的吸收。因此，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以该菌可以作为广泛的促生菌应用于植物促生长当中。

本发明菌株增加土壤中速效钾的含量能够促进植物生长，其原因在于，钾是作物营养的三大要素之一，不仅参与渗透、细胞膜电位和pH的调节，还参与活化植物重要代谢过程中的酶从而促进合成植物生长所需的蛋白质、参与植物的光合作用，同时钾元素会直接影响作物的抗倒伏强度，增强植物的耐寒和耐旱性；在农业生产中，作为肥料三要素之一的钾元素，在长期施用单一氮肥的土壤中，也是最短缺的元素之一，一般土壤中都含有丰富的钾源，但它们大多以植物难以直接吸收利用的难溶态钾形式存在，特别是在高盐、低营养、强缓冲能力的盐碱地，速效钾含量更低，土壤解钾微生物能够溶解难溶态钾，释放速效钾，满足植物对钾元素的需求，起到节约钾肥，改良土壤的作用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一株植物促生菌株XN-K13及其应用

<130> JC

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

agagttgatc atggcag 17

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tagggttacc ttgttacgct t 21

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> Enterobacter ludwigil

<400> 3

ggctgcggca gctacacatg caagtcgaac ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac 60

gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg 120

aaacggtagc taataccgca taacgtcgca agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt 180

gccatcagat gtgcccagat gggattagct agtaggtggg gtaatggctc acctaggcga 240

cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg 360

ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcggggag gaaggtgttg 420

tggttaataa ccacagcaat tgacgttacc cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca 540

cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcattcg 600

aaactggcag gctagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca 720

ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgtcgacttg gaggttgtgc ccttgaggcg tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcgac 840

cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc 960

agagaacttt ccagagatgg attggtgcct tcgggaactc tgagacaggt gctgcatggc 1020

tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1080

ctttgttgcc agcggtccgg ccgggaactc aaaggagact gccagtgata aactggagga 1140

aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgagta gggctacaca cgtgctacaa 1200

tggcgcatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa gtgcgtcgta 1260

gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgtagatc 1320

agaatgctac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1380

tgggttgcaa aagaagtagg tagcttaacc ttcgggaggg cgctaccact ttgatcaggg 1440

Claims (9)

1.一株植物促生菌株XN-K13，其特征在于：所述植物促生菌株XN-K13分类命名为路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigil)XN-K13，于2020年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC NO：M 2020145。

2.根据权利要求1所述的植物促生菌株XN-K13在促进植物生长中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的植物促生菌株XN-K13通过产酸的方式将难溶性钾转化成植物可以吸收利用的速效钾，从而提高植物对钾离子的吸收。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物促生菌株XN-K13通过利用色氨酸合成生长素IAA、合成植物生长调节剂5-氨基乙酰丙酸的方式促进植物生长。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物促生菌株XN-K13通过合成5-氨基乙酰丙酸促进植物种子萌发和净光合速率，增强植物的耐受性，保护其免受许多非生物胁迫的影响。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物促生菌株XN-K13将难溶无机磷转化成可溶的速效磷，提高植物对磷元素的吸收利用。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物促生菌株XN-K13通过合成嗜铁素与植物病原菌竞争铁离子，抑制植物病原菌的生长，减少其在植物生长中过程中的危害作用。

8.根据权利要求1所述植物促生菌株XN-K13在制备促进植物生长制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

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