CN111394274A - 降解杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯的菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境污染生物修复领域，公开了降解杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯的菌剂及其应用。一种用杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯的降解菌株D‑6生产的降解菌剂；所述的降解菌株D‑6于2017年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO.M 2017537。使用本菌剂可在短时间内使土壤中的噻嗪酮的残留量降低95％以上，在一定时间内使土壤中的联苯菊酯的残留量降低70％以上，其降解性状相比于已报道的降解菌株Rhodococcus sp.YL‑1更加稳定，可用于清除环境中的噻嗪酮和联苯菊酯残留污染。

Description

降解杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯的菌剂及其应用

分案说明

本发明为申请日为2017年11月3日，申请号为2017110691438，发明名称为“一株能够降解杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯的细菌及其生产的菌剂”的分案申请。

技术领域

本发明生物高技术领域，公开了降解杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯的菌剂及其应用。

背景技术

化学农药在作物的病、虫、草害的综合治理中起到重要的作用，大大促进了现代农业的发展，但是同时也带来了严重的环境问题。首先，农产品因农药残留超标，品质降低，出口受限；其次，农药残留可以通过食物链富集，威胁人类的生命健康；此外，农药残留危害非靶标生物，间接改变生态系统结构、破坏其功能。

噻嗪酮是一种高效广谱的三嗪类的杀虫剂，对飞虱、叶蝉和粉虱等害虫防治效果显著。自上世纪90年代起被广泛的施用，噻嗪酮残留超标的问题屡见报道。噻嗪酮在有氧的田间的半衰期为50到70天，在水淹的稻田中其半衰期为36-104 天。环境中的噻嗪酮残留对水生生物和某些非靶标益虫危害严重，易经口腔、皮肤表面以及呼吸道被人体吸收，对人类健康造成潜在威胁。联苯菊酯是一种高效的拟除虫菊酯类的杀虫剂，广泛应用于农业生产和城市环境。联苯菊酯不仅对水生生物危害严重，对人类健康也存在着潜在危害。2009年，联苯菊酯被世界卫生组织(WHO)列入二级(中毒)工业品的名单中。

由于噻嗪酮和联苯菊酯都对茶树中的茶小绿叶螨具有较好的防治效果，加上农户对农药的不规范使用，导致两种杀虫剂在茶园土壤中的复合污染。土壤中的杀虫剂残留经雨水冲刷进入到水体，造成环境中的污染，对人类健康造成潜在威胁。以微生物降解为基础的生物修复技术具有安全、有效、廉价、无二次污染的特点，其应用前景广阔。能够同时降解噻嗪酮和联苯菊酯的微生物在应用中更具有优势。噻嗪酮和联苯菊酯的结构类似，能同时降解这两种杀虫剂的只有Rhodococcus sp.YL-1，但其降解基因易丢失，降解性状不稳定，不利于进行大规模的工业化生产，制约着利用该菌对环境中噻嗪酮和联苯菊酯残留的修复。因此，有必要继续筛选能同时降解这两种农药且降解性状稳定的菌株实现菌剂的大规模工业化生产，实现对环境中对这两种农药残留的修复。

发明内容

技术问题本发明的目的在于针对以上问题，开发研制出一种性状稳定的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使噻嗪酮的残留量降低95％以上，使联苯菊酯的残留量降低70％以上。

技术方案下面为本方案的主要内容：

本发明提供一种消除噻嗪酮和联苯菊酯的降解菌，其菌株是一株革兰氏染色反应阳性菌D-6(2017年9月25日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO.M2017537)，经鉴定为红球菌属(Rhodococcus sp.)。其主要的生物学特性为革兰氏染色阳性，无芽孢，细胞形态呈短杆状。菌落形态为浅粉色不透明、边缘光滑、隆起、质地粘稠且湿润。不能运动，好氧。在实验室摇瓶条件下，48h内对50mg·L^-1的噻嗪酮的降解率高达95％以上，72h内对50mg·L^-1的联苯菊酯的降解率为70％以上。菌株D-6的降解性状比已报道的噻嗪酮、联苯菊酯降解菌株Rhodococcus sp.YL-1更稳定，菌株YL-1在LB培养基中连续传代 3次后，其降解性状丢失率为1％，其在LB培养基中连续传代10次后，其降解性状丢失率为15％，而菌株D-6在同等传代次数后未见性状丢失的菌落，因此使用菌株D-6进行发酵工业生产更具优势。

使用噻嗪酮、联苯菊酯降解菌株D-6生产菌剂的工艺为：斜面种——摇瓶种子液——种子罐——产品(包装菌剂为液体菌剂或者固体吸附菌剂)。

本发明的详细实施步骤为：

1、将噻嗪酮、联苯菊酯残留降解菌株D-6的试管斜面种接种于含有LB培养基的摇瓶中，震荡培养至对数期生长期；

2、将上述培养好的菌种按照10％的接种量接种至500L的种子罐，培养至对数生长期。种子罐的培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄ 1％，K₂HPO₄ 0.2％， MgSO₄ 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO₃ 0.3％，酵母膏0.02％，pH值为7.2～7.5。

3、将种子液以10％的接种量接入生产罐培养，生产罐的培养基与种子罐的相同。

在种子罐和生产罐的生产过程中，无菌空气的通气量为体积比1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分钟，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为96-108h。发酵完成后，菌体数量达10亿个/mL，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或者采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

有益效果

本发明提供一种能够高效、快速且稳定的降解噻嗪酮残留的菌株D-6。在48h 内对50mg·L^-1的噻嗪酮降解率高达95％以上，在72h内对50mg·L^-1的联苯菊酯降解率高达70％以上，且其降解性状较已报道的菌株Rhodococcus qingshengii YL-1稳定，因此具有广泛的应用潜力和价值。

使用该菌剂生产的具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或者有绿色商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民身体健康，提高农产品的附加值有重要的意义。本发明成功的解决了农业生产中农药残留超标的问题，既发挥了化学农药在植物虫害防治中的高效快速作用，又可生产出无毒无公害的绿色农产品。

生物材料保藏信息

D-6，分类命名为红球菌D-6(Rhodococcus sp.D-6)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌株的保藏编号为CCTCC NO.M 2017537，保藏日期为2017年9 月25日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

附图说明

图1菌株D-6的菌落形态照片

图2菌株D-6对噻嗪酮的生长降解曲线

图3菌株D-6降解噻嗪酮(A)和联苯菊酯(B)生成产物的HPLC-MS图谱

图4温度对菌株D-6降解噻嗪酮的影响

图5 pH对菌株D-6降解噻嗪酮的影响

图6噻嗪酮的初始浓度对菌株D-6降解噻嗪酮的影响

具体实施方式

实施例1菌株的分离与鉴定

本发明提供一种性状稳定且高效降解噻嗪酮和联苯菊酯的菌株及其生产的菌剂D-6，分离自江苏省某长期受噻嗪酮污染的土壤中。菌株的筛选方法为：取 5g土样加入到100mL的含有50mg·L^-1噻嗪酮的基础盐培养基(以下简称BMM) 的摇瓶中，置于30℃、150rpm的摇床中培养，5天后以5％的接种量转移到含有新鲜BMM的摇瓶中，连续进行三次富集培养。将最后一次传代的富集液稀释涂布于BMM固体培养基上，30℃培养5天后挑取形成透明圈的单菌落于装有4 mL的LB试管中进行培养。菌体长浓后，一部分菌体用于保存，另一部分菌体用于降解活性的检测以获得噻嗪酮的降解菌株。噻嗪酮降解的检测方法为将菌体转接至装有20mL BMM培养基的摇瓶中，置于30℃、150rpm的摇床中培养5 天后，用等体积的二氯甲烷萃取，通过紫外分光光度计检测降解效果。联苯菊酯降解的检测方法为将菌体转接至装有20mL含有50mg·L^-1联苯菊酯的基础盐培养基的摇瓶中，置于30℃、150rpm的摇床中培养3天后，观察培养基的颜色变化，并用等体积的乙酸乙酯萃取，通过UHPLC-MS检测降解效果。

菌株D-6经鉴定属于Rhodococcus sp.,于2017年9月25日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌株的保藏编号为CCTCC NO.M 2017537。菌株D-6在LB 平板上生长的形态特征为浅粉色不透明、边缘光滑、隆起、质地粘稠且湿润，相比于已报道的噻嗪酮、联苯菊酯降解菌株YL-1，菌株D-6的菌落颜色较浅，形状较大，质地较湿润(图1A、1B)。主要生物学特征为革兰氏染色阳性(图1C)，不能产生芽孢，不能运动的好氧细菌；其甲基红试验、淀粉水解酶试验、氧化酶试验以及硝酸还原酶试验均为阴性；其V.P.试验、尿素酶试验以及过氧化氢酶试验均为阳性。将菌株D-6的16S rRNA基因序列在数据库EzBilCloud中比对分析，结果显示菌株D-6与Rhodococcus属的亲缘关系最近，其中与Rhodococcus qingshengii JCM 15477^T的相似性为100％。根据菌落形态、生理生化特征以及16S rRNA基因序列的进化发育分析，初步将菌株D-6鉴定为Rhodococcus sp.。

实施例2实验室降解实验

2.1种子液制备

挑取在平板上活化好的单菌落，接种于LB培养基中，置于30℃，150rpm 的摇床中培养至OD₆₀₀≈1.0。离心收集菌体(4℃，6000rpm离心5min)，用基础盐培养基洗涤两次后重悬菌体至OD₆₀₀≈2.0，此为种子液。

2.2菌株D-6对噻嗪酮的降解

以2％的接种量将菌株D-6的种子液接种至BMM中，置于30℃，150rpm 的摇床中培养48h。每隔8h取3mL培养液，HPLC检测并计算出培养基中剩余噻嗪酮的浓度与降解率，同时将定时取样的培养液稀释涂布LB固体培养基，计算菌体生长量，绘制菌株D-6对噻嗪酮的生长降解曲线(如图2)。菌株D-6能以噻嗪酮作为唯一碳源生长，在48h内将50mg·L^-1的噻嗪酮降解95％以上。图 3A为菌株D-6降解噻嗪酮生成产物的HPLC-MS图谱。

2.3温度对菌株D-6降解噻嗪酮的影响

以2％的接种量将菌株D-6的种子液接种至BMM中，分别置于转速统一设置为150rpm，温度分别为20℃、25℃、30℃和37℃的摇床中进行培养(中共培养48h)。每隔8h取3mL培养液，HPLC检测并计算出培养基中剩余噻嗪酮的浓度与降解，确定温度对菌株D-6降解噻嗪酮的影响。如图4所示，菌株D-6 在30℃时对噻嗪酮的降解率最高，降解的最适范围为25-30℃，低温(20℃)或高温(37℃)都会影响降解效率，而高温(37℃)对降解效率的影响较为显著。

2.4初始pH对菌株D-6降解噻嗪酮的影响

分别用HCl和NaOH将MSM的pH调节为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。向不同pH的基础盐培养基中加入终浓度为50mg·L^-1的噻嗪酮，并将种子液以 2％的接种量分别接种至上述pH 4.0～10.0的培养基中，置于30℃，150rpm的摇床中培养48h。每隔8h取3mL培养液，HPLC检测并计算出培养基中剩余噻嗪酮的浓度与降解，确定pH对菌株D-6降解噻嗪酮的影响。如图5所示，菌株 D-6在pH 7.0时对噻嗪酮的降解效率最高；当pH为5.0和9.0时，会对其降解活性有一定的影响；当pH为4.0时，菌株D-6的降解效率会有显著性的降低，这表明菌株D-6在碱性环境中对噻嗪酮的降解效率优于在酸性环境中。

2.5噻嗪酮的初始浓度对菌株D-6降解噻嗪酮的影响

将种子液以2％的接种量分别接种至噻嗪酮终浓度分别为30mg·L^-1，50 mg·L^-1，100mg·L^-1和200mg·L^-1的基础盐培养基中，置于30℃，150rpm的摇床中培养48h。每隔8h取3mL培养液，HPLC检测并计算出培养基中剩余噻嗪酮的浓度与降解，确定噻嗪酮的初始浓度对菌株D-6降解噻嗪酮的影响。如图6 所示，当噻嗪酮的初始浓度低于50mg·L^-1时，菌株D-6在48h之内对噻嗪酮的降解效率都能达到95％以上；而当噻嗪酮的初始浓度为100mg·L^-1时，菌株D-6 在48h内对噻嗪酮的降解效率下降到50％；当噻嗪酮的初始浓度为200mg·L^-1时，在48h内其噻嗪酮降解效率仅有30％，说明高浓度的噻嗪酮对菌株D-6的降解活性具有抑制作用。

2.6菌株D-6对联苯菊酯的降解

以2％的接种量将菌株D-6的种子液接种至含有50mg·L^-1联苯菊酯的基础盐培养基中，置于30℃，150rpm的摇床中培养。培养72h后可观察到培养液有明显的颜色变化，相比于对照组，处理组变成了黄色。图3B为菌株D-6降解联苯菊酯生成产物的HPLC-MS图谱。通过对培养液中残留联苯菊酯浓度的检测，计算出菌株对联苯菊酯的降解效率。菌株D-6在72h内可将联苯菊酯降解70％以上。

实施例3降解稳定性实验

由于已报道的菌株Rhodococcus qingshengii YL-1(CCTCC AB 2017132)噻嗪酮的降解性状不稳定，因此有必要对菌株D-6降解性状的稳定性进行评估。分别挑取菌株D-6与菌株YL-1在BMM平板上新鲜活化的形成透明圈的单菌落，接种于装有4mL LB培养基的试管中，置于30℃，150rpm的摇床中培养至OD₆₀₀≈1.0。将此菌液以1％的接种量转接至另一根装有4mL LB培养基的试管中，以相同的培养条件培养至OD₆₀₀≈1.0，此为第1次传代。将第1次传代的菌液稀释适当倍数(10^-4～10^-6)后涂布BMM平板，待菌落长出后，统计不能形成透明圈的菌落数占全部菌落数的百分比。依次进行10次传代，并统计每次传代中不能形成透明圈菌落的百分比。统计结果表明，菌株YL-1在LB中连续传代3次后，在其菌液稀释后涂布的BMM平板上，即可观察到不能形成透明圈的菌落，该菌落占全部菌落的1％，并且该比例随着传代次数的增加而增大，当连续传代10 次后，菌株YL-1的降解性状丢失率可达15％；相反，菌株D-6在LB中连续传代3次后，在其菌液稀释后涂布的BMM平板上并没有观察到不能形成透明圈的菌落，因而继续对菌株D-6进行传代。在第10次传代后，在其菌液稀释后涂布的BMM平板上依然没有观察到不能形成透明圈的菌落。这两株菌的菌落在 BMM固体培养基上能否形成透明圈与能否降解噻嗪酮存在着一一对应的关系，由此说明菌株D-6的噻嗪酮降解性状更稳定。

实施例4土壤降解实验

供试土样采自紫金山脚下田园土，过2mm筛，待用。用噻嗪酮或联苯菊酯的甲醇母液浸泡硅藻土，使农药被其完全吸附。将浸泡后的硅藻土置于通风橱中挥干后，拌入准备好的田园土中，使得土样中噻嗪酮和联苯菊酯的浓度分别为 10mg·kg^-1。每份土样的质量为500g，含水量维持在35％，并置于30℃黑暗条件下恒温培养。向土样中接入种子液，混匀，使得土壤中的菌株D-6的浓度达到 10⁸个细胞每克土，以不接菌的土壤作为对照。培养20d后，通过HPLC测量土样中噻嗪酮和联苯菊酯的残留量。菌株D-6对土壤中残留的噻嗪酮降解效率达到 95.6％，对土壤中残留的联苯菊酯降解效率达到73.5％。

实施例5菌剂制备

将本发明的噻嗪酮、联苯菊酯降解菌株D-6的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mL LB培养基(LB培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，水1L，pH 7.4)的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50L，投料量 40L，培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄ 1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄ 0.05％， NaCl 0.01％，CaCO₃ 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50L一级种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分钟，无菌空气通入量为1:0.6-1.2。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入二级种子罐。二级种子罐500L，投料量400L，培养基配方和培养条件与一级种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2 的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至30℃，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分钟，整个工艺流程培养时间为96-108 小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL。

发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

Claims (4)

1.一种用杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯的降解菌株D-6生产的降解菌剂；其特征在于所述的降解菌株D-6于2017年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO.M 2017537。

2.根据权利要求1所述的降解菌剂，其特征在于所述的降解菌剂是通过以下方法生产而成：

1)将菌种保藏号为CCTCC NO.M 2017537的降解菌株D-6试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH₄)₂SO₄ 1％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.05％，NaCl0.01％，CaCO₃ 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

4)发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体制剂或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂制剂；

其中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为体积比1：0.6－1.2，搅拌速度为180－240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为96－108小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

3.权利要求1所述的菌剂在降解杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于权利要求1所述的菌剂在降解土壤中残留的杀虫剂噻嗪酮和联苯菊酯中的应用。

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