CN111440754A

CN111440754A - 一种利用基因工程改造的甲烷氧化菌消除土壤中有机污染物残留的方法

Info

Publication number: CN111440754A
Application number: CN202010194553.0A
Authority: CN
Inventors: 闫新; 刘永闯
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2040-03-19
Also published as: CN111440754B

Abstract

本发明公开了一种利用基因工程改造的甲烷氧化菌消除土壤中有机污染物残留的方法。一种基因工程菌，该基因工程菌以甲烷氧化菌为宿主,通过基因工程手段导入了某有机污染物降解酶基因。本发明借助基因工程手段将编码污染物降解酶的基因导入该菌株中，并通过优化转录和翻译元件使该基因功能性表达，从而赋予菌株分解目标污染物的能力。本发明首先利用基因工程手段将编码污染物降解酶基因导入甲烷氧化菌中，赋予这些菌株分解有机污染物的能力；然后将一定量的工程菌混合到污染土壤中，并通过提供充足的甲烷来促进工程菌的存活和繁殖，从而有效分解污染物。

Description

一种利用基因工程改造的甲烷氧化菌消除土壤中有机污染物残留的方法

技术领域

本发明属于生物高技术领域，公开了一种用于消除土壤中有机污染物残留的方法。

技术背景

土壤污染是全球关注的热点问题。土壤中常见的有机污染物包括农药(杀虫剂、除草剂和杀菌剂等)、抗生素、多环芳烃和化工中间体等。这些污染物导致严重的环境问题和健康问题。此外，除草剂残留还可能会毒害作物，造成减产甚至绝收。针对该问题，多种土壤修复方法被开发出来，包括物理法、化学法和生物法。物理法和化学法虽然见效快但成本高且有二次污染风险。

生物法主要是指通过投加功能微生物来分解土壤中的有机污染物。该方法优点是成本低、无二次污染，缺点是修复效果不稳定。修复效果不稳定的重要原因之一是投加的功能微生物这个“外来客”竞争不过土壤中的“地头蛇”(土著微生物)，生存和增殖都难以实现，修复效果自然无法保证。因此，生物法待解决的关键问题之一是如何使功能微生物在污染土壤中存活并大量繁殖。然而，针对该问题目前尚无有效办法。

甲烷氧化菌是一类代谢方式独特的细菌，它们仅能以甲烷或甲醇等一碳化合物为碳源和能源生长，但无法利用分子中多于1个碳原子的化合物。该特性赋予该类细菌在一定条件下具有生长优势，比如，若环境中主要碳源是甲烷，该类细菌将大量繁殖，而其它微生物则难以生长。本发明就是利用甲烷氧化菌这一特性开发出一种有效消除土壤中有机污染物的方法(图1)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于有机污染土壤修复的基因工程菌。

本发明的另一目的是提供该基因工程菌在有机污染土壤修复中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种基因工程菌，该基因工程菌以甲烷氧化菌为宿主,通过基因工程手段导入了某有机污染物降解酶基因。本发明借助基因工程手段将编码污染物降解酶的基因导入该菌株中，并通过优化转录和翻译元件使该基因功能性表达，从而赋予菌株分解目标污染物的能力。

所述的甲烷氧化菌选自Methylomonas sp.LW13：DSM 24493，Methylosinustrichosporium OB3b：ATCC 35070，Methylococcus capsulatus Bath：ATCC 19069或Methylomicrobium alcaliphilum 20Z：DSM 19304中的任意一种，或其他甲烷氧化菌。

其中，所述的有机污染物降解酶基因优选自磺酰脲类除草剂降解酶基因sulE，或针对其他农药、抗生素、多环芳烃和化工中间体有机污染物的降解酶基因。

所述的基因工程菌进一步优选是以Methylomonas sp.LW13为宿主菌，将包含磺酰脲类除草剂水解酶基因sulE的片段整合到Methylomonas sp.LW13基因组中得到。

所述的基因工程菌最优选通过以下方法构建：

以Hansschlegelia zhihuaiae S113(DSM 18984^T)的基因组DNA为模板，用引物sule-F和sule-R扩增出携带sulE的片段1；以质粒pAWP89为模板，用引物km-F和km-R扩增出携带卡那霉素抗性基因的片段2；以菌株Methylomonas sp.LW13的基因组DNA为模板，用引物LF-F和LF-R扩增出片段3，用引物RF-F和RF-R扩增出片段4；然后，通过融合PCR方法用引物LF-F和RF-R将这四个片段按照片段3-片段1-片段2-片段4顺序连接成一条片段，命名为片段5；最后，通过电击转化方法将片段5导入菌株Methylomonas sp.LW13中，用添加卡那霉素(50mg/L)的固体NMS培养基筛选出目标转化子，即为所述的基因工程菌。

本发明所述的基因工程菌在修复土壤有机污染中的应用。

一种消除土壤中有机污染物残留的方法，在土壤中接种本发明所述的基因工程菌，并向接菌土壤持续提供甲烷化合物。

所述的方法优选在受苄嘧磺隆污染的土壤中接种本发明所述的基因工程菌，并向接菌土壤持续提供甲烷化合物。

将收集的工程菌细胞投加到污染土壤中并混匀；然后把土壤移入于一个可密闭的装置中，并在该装置中充入30％的甲烷(甲烷与空气之比)；最后将密闭后的装置室温放置7到10天，期间每隔1天摇动装置一次以保证土壤通气良好，每隔两天换一次气以保证气体量的充足。

有益效果

本发明首先利用基因工程手段将编码污染物降解酶的基因导入甲烷氧化菌中，获得具有分解有机污染物的能力工程菌；然后将一定量的工程菌混合到污染土壤中，并通过提供充足的甲烷来促进工程菌的存活和繁殖，从而有效分解污染物(图1)。本发明可实现功能微生物在污染土壤中大量增殖，从而有效分解土壤中的目标污染物。

附图说明

图1本发明技术原理

图2工程菌构建(A)和降解功能验证(B)

图3土壤修复效果的生物检测

具体实施方式

实施例1基因工程菌的构建

为了将磺酰脲类除草剂水解酶基因sulE整合到菌株Methylomonas sp.LW13的染色体上，首先，以Hansschlegelia zhihuaiae S113(DSM 18984^T)的基因组DNA为模板用引物sule-F和sule-R扩增出携带sulE的片段1，以质粒pAWP89(Puri A W et al.,Appliedand Environmental Microbiology,2015,81(5):1775-1781.doi:10.1128/AEM.03795-14)为模板用引物km-F和km-R扩增出携带卡那霉素抗性基因的片段2，以菌株Methylomonassp.LW13的基因组DNA为模板，用引物LF-F和LF-R扩增出片段3，用引物RF-F和RF-R扩增出片段4；然后，通过融合PCR方法用引物LF-F和RF-R(Shevchuk NA et al.,Nucleic AcidsResearch,2004,32(2),e19.doi:10.1093/nar/gnh014)将这四个片段按照3-1-2-4顺序连接成一条片段，命名为片段5；最后，通过电击转化方法(Xin,Y et al.,Applied andEnvironmental Microbiology,2016,82(7),AEM.03724-03715.doi:10.1128/AEM.03724-15)将片段5导入菌株Methylomonas sp.LW13中，用添加卡那霉素(50mg/L)的固体NMS培养基(Whittenbury R et al.,Journal of General Microbiology,1970,61(2):205-218.doi:10.1099/00221287-61-2-205)筛选出目标转化子，命名为工程菌LW13-sulE(图2A)。参考已报道的方法(Hang B J et al.,Applied and Environmental Microbiology,2012,78(6):1962-1968.doi:10.1128/AEM.07440-11)在三角瓶中验证工程菌LW13-sulE降解磺酰脲类除草剂的能力，结果显示菌株LW13-sulE在12小时对10mg/L的苄嘧磺隆的降解率超过99％(图2B)。

实施例2工程菌LW13-sulE的发酵培养

为了获得工程菌LW13-sulE的细胞，首先，将该菌划线于固体NMS培养基上，并将划线后平板置于可密封的罐子中，充入30％甲烷(甲烷与空气比例)后置于30℃培养3天；然后把固体NMS培养基上的细胞转接于液体NMS培养基的中，将液体培养物置于可封闭的培养瓶中，充入30％甲烷(甲烷与空气比例)后置于30℃培养3天；最后通过离心方式(5000转/分钟，10分钟)收集细胞。

实施例3用工程菌LW13-sulE修复受苄嘧磺隆污染的土壤

苄嘧磺隆是一种典型的磺酰脲类除草剂。在土壤中分别添加3个浓度的苄嘧磺，0mg/kg、0.4mg/kg(田间最大推荐使用量)和4mg/kg(10倍于田间最大推荐使用量)，获得三种土壤样品。然后，每种土壤样品都分别设置不接菌、接种菌株LW13以及接种工程菌LW13-sulE三种处理。在接菌的处理中接菌量为10⁵CFU/g土壤。将接菌后土壤置于可密闭罐中，充入30％甲烷(甲烷与空气比例)后于室温培养10天，期间每隔1天摇动装置一次以保证土壤通气良好，每隔两天换一次气，保证气体量的充足。修复完成后，用生物检测法(在土壤中种植对该除草剂敏感的植物)和液相色谱法(Zhang H et al.,Journal of Agriculturaland Food Chemistry,2018,acs.jafc.8b00041.doi:10.1021/acs.jafc.8b00041)检测修复效果。生物检测法结果显示，经工程菌LW13-sulE修复后的土壤对玉米无明显药害作用，而对于不接菌或接种菌株LW13的处理，修复后的土壤对玉米产生明显药害(图3)。液相色谱法结果显示工程菌LW13-sulE能降解土壤中95％以上的苄嘧磺隆。两种检测结果一致说明工程菌LW13-sulE能有效修复受苄嘧磺隆污染的土壤。

表1本发明所用引物

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种利用基因工程改造的甲烷氧化菌消除土壤中有机污染物残留的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctaagaatc acacggattc 20

<210> 2

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtccacacat tatacgagcc gatgattaat tgtcaacagc tcatttcaga gcggtatctg 60

gacctgtttt c 71

<210> 3

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attaatcatc ggctcgtata atgtgtggac tctgtcagga ggaacaagca atggaaaccg 60

ataaaaaaac cgg 73

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgagtttt tctaatcagc tttcgttctg atcta 35

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cagaacgaaa gctgattaga aaaactcatc gagca 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttaaggaat ctctgggcct tgtggggtca gttcc 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaccccaca aggcccagag attccttaag catta 35

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctatagctc agcgtttgca 20

Claims

1.一种基因工程菌,其特征在于该基因工程菌以甲烷氧化菌为宿主,通过基因工程手段导入了某有机污染物降解酶基因。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述的甲烷氧化菌选自Methylomonas sp.LW13：DSM 24493，Methylosinus trichosporium OB3b：ATCC35070，Methylococcus capsulatus Bath：ATCC 19069或Methylomicrobium alcaliphilum 20Z：DSM 19304中的任意一种，或其它甲烷氧化菌。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述的有机污染物降解酶基因选自磺酰脲类除草剂降解酶基因sulE，或针对其他农药、抗生素、多环芳烃和化工中间体有机污染物的降解酶基因。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的基因工程菌，其特征在于以所述的基因工程菌是以Methylomonas sp.LW13为宿主菌，将包含磺酰脲类除草剂水解酶基因sulE的片段整合到Methylomonas sp.LW13基因组中得到。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌通过以下方法构建：

以Hansschlegelia zhihuaiae S113的基因组DNA为模板，用引物sule-F和sule-R扩增出携带sulE的片段1；以质粒pAWP89为模板，用引物km-F和km-R扩增出携带卡那霉素抗性基因的片段2；以菌株Methylomonas sp.LW13的基因组DNA为模板，用引物LF-F和LF-R扩增出片段3，用引物RF-F和RF-R扩增出片段4；然后，通过融合PCR方法用引物LF-F和RF-R将这四个片段按照片段3-片段1-片段2-片段4顺序连接成一条片段，命名为片段5；最后，通过电击转化方法将片段5导入菌株Methylomonas sp.LW13中，用添加卡那霉素50mg/L的固体NMS培养基筛选出目标转化子，即为所述的基因工程菌。

6.权利要求1所述的基因工程菌在修复土壤有机污染中的应用。

7.一种消除土壤中有机污染物残留的方法，其特征在于在土壤中接种权利要求1所述的基因工程菌，并向接菌土壤持续提供甲烷气体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在受苄嘧磺隆污染的土壤中接种权利要求5所述的基因工程菌，并向接菌土壤持续提供甲烷气体。