CN103255154A - 一种加氧酶基因caceO及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种加氧酶基因caceO及其编码的蛋白质和应用。本发明克隆的加氧酶基因caceO序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物CaceO序列为SEQ ID NO.2。CaceO能催化乙草胺水解生成2-氯-N-（2-乙基-6-甲基苯基）乙酰胺，水解甲草胺和丁草胺生成2-氯-N-（2，6-二乙基苯基）乙酰胺。CaceO可用于构建通过降解甲草胺、乙草胺和丁草胺而获得抗这些除草剂的转基因作物，也可用于土壤、水体中甲草胺、乙草胺和丁草胺残留的消除和化工产品的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。

Description

一种加氧酶基因caceO及其编码的蛋白质和应用
技术领域
本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及一种加氧酶基因caceO及其编码的蛋白质和应用。 
背景技术
除草剂的使用在减轻农业劳动强度、保证农业正常生产的同时，其残留也带来了严重的作物药害问题，据统计我国每年农田受除草剂药害面积达到3000万亩，其中严重药害面积达到500万亩，每年造成几十亿元的损失，而抗除草剂转基因是解决除草剂药害的最佳途径。氯代乙酰胺类除草剂是一类高效、高选择性的触杀性除草剂，对禾本科杂草具有非常显著的杀除效果。氯代酰胺类除草剂是目前国际上大量使用的除草剂之一，至2007年，年产量与使用面积仅次于有机磷除草剂，居世界第二位，其主要代表品种甲草胺、乙草胺和丁草胺，其中以乙草胺的使用量最大。随着农业劳动力的减少和农业耕种方式的改变，该类除草剂的需求和使用量还将持续增加。 
氯代乙酰胺类除草剂化学性质较稳定，在土壤残留期长，并且该类除草剂及其代谢产物会从土壤迁移进入地下水，造成生活水源污染。研究表明该类除草剂有些品种具有致畸变和致突变性，甲草胺、乙草胺和丁草胺被美国环保局定为B-2类致癌物，异丙甲草胺被定为C类致癌物(USEAP,1994)，因此，环境及农产品中氯代乙酰胺类除草剂残留严重危害人类健康。 
氯代乙酰胺类除草剂对鱼类有很强的毒性，比对哺乳动物的毒性大500-10000倍，因此该类除草剂进入水体将会对渔业资源带来严重的危害。乙草胺和丁草胺对土壤微生物数量及土壤中细菌、放线菌、真菌生长速率均有抑制作用，并显著降低土壤微生物多样性。 
此外，氯代乙酰胺类除草剂如乙草胺和丁草胺对农作物具有较严重的药害，特别是在有机质含量较低的砂型土壤、或用药量过大、或施药后遇持续低温高湿天气时，会严重影响作物的生长，近年来我国因乙草胺和丁草胺因使用不当带来的作物药害时有发生，对农业造成严重的损失。 
因此，土壤和水体环境中氯代乙酞胺类除草剂残留污染严重危害人类健康、破坏生态环境及对作物具有严重药害。获得氯代乙酰胺类除草剂的降解菌株和降解基因在治理除草剂残留，消除其药害技术研发中具有以下作用和功能，（一）通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的能降解氯代乙酰胺类除草剂抗性转基因作物，（二）用于土壤、水体中除草剂氯代乙 酰胺类除草剂残留中间产物的消除，（三）用于有用化工产品及药物合成的生物转化。因此降解基因在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。 
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个新的降解甲草胺、乙草胺和丁草胺等多种氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因caceO。 
本发明的另一目的是提供该基因编码蛋白质。 
本发明的又一目的是提供该基因及其编码的蛋白质的应用。 
本发明的目的通过如下技术方案实现： 
一个降解氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因caceO，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。 
本专利所用的出发菌株为一株能够降解氯乙酰胺除草剂的细菌菌株Sphingobium sp.DC-2（保藏于中中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012190）。通过多次传代获得了一个该菌株的突变株DC-2MUT(保藏日期2013.4.28，保藏号为：CCTCCNO：M2013164)。菌株DC-2MUT（CCTCCNO：M2013164)失去了降解甲草胺、乙草胺和丁草胺等氯乙酰胺除草剂的能力。菌株DC-2降解乙草胺的第一步反应是在一个加氧酶的催化下生成生成2-氯-N-（2-乙基-6-甲基苯基）乙酰胺。 
降解氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因caceO的获得是采用生现代生物信息学手段获得（技术路线见图1）。即通过比较野生株DC-2和突变株DC-2MUT的基因组信息，寻找在野生株DC-2基因组存在，但在突变株DC-2MUT中缺失的加氧酶基因。首先提取野生株DC-2和突变株DC-2MUT的总DNA，把总DNA进行基因组测序，组装，KEGG数据库比对。测序结果表明，野生株DC-2基因组大小为6,334,837bp，481个scaffold；突变株DC-2MUT基因组大小为6,325,634bp，892个scaffold。 
经过对野生株DC-2（CCTCCNO：M2012190）和突变株DC-2MUT（CCTCCNO：M2013164)比对，发现在野生菌株总基因组中一个Rieske(2Fe-2S)domain-containing蛋白类型的加氧酶基因在突变株DC-2MUT中丢失了，该蛋白和Sphingomoans RW1中的一个加氧酶vanillate monooxygenase同源性43%。将包含该基因的1.2K片段通过PCR从野生菌株中扩增出来酶连在pBBR1MCS-5构建重组载体，通过转化的方法导入到E.coli DH5α，获得了重组菌株E.coli DH5α-CaceO，通过三亲结合将包含该加氧酶基因的重组载体互补到突变株DC-2MUT获得重组菌株DC-2MUT-CaceO（技术流程见图2）。检测了重组菌株E.coli DH5α-CaceO和DC-2MUT-CaceO 对甲草胺、乙草胺和丁草胺的降解情况，结果表明获得该加氧酶基因的重组菌株E.coli DH5α-CaceO和DC-2MUT-CaceO均获得了降解甲草胺、乙草胺和丁草胺的能力，表明该基因确实为降解氯代乙酰胺除草剂的目标基因，将该基因命名为caceO。气质联用检测了E.coli DH5α-CaceO对乙草胺的降解代谢产物，结果表明E.coli DH5α-CaceO水解乙草胺生成2-氯-N-（2-乙基-6-甲基苯基）乙酰胺（见图3）。 
所述的加氧酶基因caceO编码的蛋白质CaceO，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。 
含有所述的加氧酶基因caceO的重组表达载体pBBR1MCS5-caceO。 
含有所述的重组表达载体pBBR1MCS5-caceO的基因工程菌株E.coli DH5α-CaceO。 
所述的加氧酶基因caceO在降解和转化氯乙酰胺除草剂中的应用。其中所述的氯乙酰胺除草剂优选甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一种或多种。 
所述的含有加氧酶基因caceO的重组表达载体在降解和转化氯乙酰胺除草剂中的应用。其中所述的氯乙酰胺除草剂优选甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一种或多种。 
所述加氧酶基因caceO在构建抗氯乙酰胺除草剂的转基因作物中的应用。其中所述的氯乙酰胺除草剂优选甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一种或多种。 
所述加氧酶CaceO在降解氯乙酰胺除草剂中的应用。其中所述的氯乙酰胺除草剂优选甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一种或多种。 
所述加氧酶CaceO在去除土壤、水体中氯乙酰胺除草剂残留中的应用。其中所述的氯乙酰胺除草剂优选甲草胺、乙草胺或丁草胺中的一种或多种。 
本发明的有益效果如下： 
本发明出发菌株为一株鞘酯菌（Sphingobium.sp.）DC-2（CCTCCNO：M2012190），菌株DC-2能够降解乙草胺生成2-乙基-6-甲基苯胺；降解甲草胺和丁草胺生成2,6二乙基苯胺。在此基础上，从菌株DC-2中克隆到降解甲草胺、乙草胺和丁草胺的加氧酶基因caceO。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长（从起始密码子到终止密码子）为1047bp，编码348个氨基酸。该基因能够降解氯乙酰胺除草剂，可在构建抗氯乙酰胺除草剂的转基因作物中应用。该基因的编码蛋白可在降解氯乙酰胺除草剂或除土壤、水体中氯乙酰胺除草剂残留中应用。 
附图说明
图1降解氯代乙酰胺类除草剂的加氧酶caceO基因克隆技术路线图。 
图2加氧酶基因caceO功能验证技术路线图。 
图3A图为乙草胺标准品液相检测图谱； 
B图为重组菌株E.coli DH5α-CaceO降解乙草胺的液相检测图谱； 
C图为B图中产物的质谱图。 
D图为甲草胺标准品液相检测图谱 
E图为重组菌株E.coli DH5α-CaceO降解甲草胺的液相检测图谱； 
F图为E图中产物的质谱图。 
G图为丁草胺标准品液相检测图谱 
H图为重组菌株E.coli DH5α-CaceO降解丁草胺的液相检测图谱； 
I图为H图中产物的质谱图。 
生物材料保藏信息 
氯代乙酰胺类除草剂降解菌DC-2,分类命名为Sphingobium quisquiliarum DC-2，保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2012190，保藏日期为2012年5月30日。 
突变株DC-2MUT，分类命名为Sphingobium sp.DC-2MUT，保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013164，保藏日期为2013年4月28日。 
实施例1.乙草胺降解基因的克隆（策略图见图1） 
1.1突变株DC-2MUT的获得 
常温下乙草胺的水溶性225mg/kg，所以含有400mg/kg乙草胺的LB平板产生浑浊，降野生菌株DC-2（CCTCC NO：M2012190）划线在LB平板（含有400mg/kg乙草胺）上30℃培养时会有透明圈的出现，以此肉眼简单的来判断乙草胺的降解。然而经过多次传代，发现一个菌落其周边没有产生透明圈。挑选此菌落至100ml LB液体培养基中，待菌株培养至对数后期，6,000离心蒸馏水洗涤2遍，重悬至20ml（含100mg/kg乙草胺）无机盐验证效果。结果表明其丢失了降解乙草胺的功能，命名此菌株DC-2MUT（CCTCC NO：M2013164）。 
1.2细菌基因组总DNA的提取 
菌株DC-2（Sphingobium sp.）（CCTCCNO：M2012190）及DC-2MUT（CCTCC NO：M2013164）大量培养后，采用高盐结合CTAB法提取高纯度、大片段的DC-2的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。 
1.3DNA样品寄送与检测 
细菌基因组测序要求样品OD值在1.8-2.0之间，浓度越高越好，浓度不低于30ng/μL，达到精细图至少需要样品量30微克。将准备好的足量的DNA样品在干冰保温下寄送至美吉生物科技。 
样品检测采用：1.浓度检测，琼脂糖凝胶电泳定量；2.OD260:280和OD260/230检测方法：NanoDrop。 
1.4菌株基因组测序 
DNA样品检测合格后建库，测序，并对数据进行基本分析(包括碱基识别、过滤接头序列、去污染)。然后进行后续生物信息分析，主要包括基因组序列组装、基因组成分分析、基因功能注释以及比较基因组分析等。 
1.5测序片段组装与分析 
运用SOAPdenovo组装软件对reads数据进行组装，得到scaffold序列并作相关基本数据统计。 
1.6基因预测与功能注释 
采用Glimmer3.0基因预测软件对组装结果进行基因de novo预测，并对预测的基因与数据库比对并进行功能注释。 
基因注释主要基于蛋白序列比对。将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。由于每一条序列可能会有许多比对结果，这里为了保证其生物意义，我们保留一条比对效果最好的结果，作为此条基因的注释。所有的注释均使用BLAST软件结合各个数据库的特点完成。BLAST的版本为：blastall2.2.21，供注释的蛋白库为：KEGG、GO等。 
1.7菌株DC-2基因组和DC-2MUT基因组的比较 
基因组测序结果，野生株DC-2基因组大小为6,334,837bp，481个scaffold，大于1000bp的scaffold有388个，通过de novo预测共6612个ORF；突变株DC-2MUT基因组大小为6,325,634bp，892个scaffold，大于1000bp的scaffold有704个，通过de novo预测共6779个ORF。 
采用OMIGA3.0将菌株DC-2MUT的892个scaffold与野生菌株DC-2基因组一一比较，结果发现，野生菌株DC-2基因组中有50个片段大约20KB序列在DC-2MUT中没有找到。20KB的序列中有可能含有传代过程中丢失的功能片段。然后对20KB的序列进行ORF预测，蛋白的翻译，重点寻找Rieske(2Fe-2S)domain-containing蛋白类型的加氧酶，把这些加氧酶放在NCBI网上Blast，比对结果发现其中一个Rieske(2Fe-2S)domain-containing蛋白类型的加氧酶和Sphingomoans RW1vanillate monooxygenase同源性43%，命名此蛋白为CaceO，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，相应的基因为caceO，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 
1.8设计引物对含caceO片段PCR扩增验证 
根据含caceO片段设计引物对野生菌株DC-2菌落及突变菌株DC-2MUT菌落进行PCR扩增，结果只有野生菌株DC-2中能扩增到相应的片段。 
1.9野生菌株DC-2PCR产物测序 
将1.7中的PCR产物TA克隆到pMD-18T simple载体上送至南京金丝瑞生物科技公司测序。结果与预测的片段100%同源。 
实施例2加氧酶基因caceO功能验证技术路线图（策略图见图2） 
2.1菌株DC-2基因组DNA提取 
同1.1 
2.2包含caceO基因的1.2K核酸片段PCR扩增 
以正向引物：5-CGGGATCCCGGCCAGTTCCGCCGCCCCAAAATCCA（SEQ ID NO.3）下划线为EcoR I酶切位点和反向引物：A2:5-CGGAATTCCGCTACCCCGCCGACACAGCGACGACC（SEQ ID NO.4）下划线BamH I酶切位点为引物，用PCR从Sphingobium DC-2（CCTCCNO：M2012190）基因组DNA中扩增1.2K-caceO。 
扩增体系： 
Figure BDA00003199924200061
PCR扩增程序： 
a.98℃变性1min； 
b.98℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸70s，进行30个循环； 
c.72℃延伸10min，冷却到室温。 
2.3PCR产物用BamH I和EcoRI双酶切。 
酶切体系： 
Nde I               1μl 
EcoRI               1μl 
DNA                 ≤1μg 
灭菌的蒸馏水  加至   20μl 
在37℃水浴中，反应10h以上。酶切产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。 
2.4pBBR1MCS-5（购自上海北诺生物科技有限公司）用BamH I和EcoRI双酶切（参考2.3）。 
2.5转化 
2.3中的回收片段和2.4中酶切好的pBBR1MCS-5进行酶连。酶连好pBBR1MCS5-caceO重组质粒转化到E.coli DH5α（购自TransGen Biotech）获得重组E.coli DH5α-CaceO，挑取阳性克隆子。E.coli DH5α-CaceO在辅助菌E.coli HB101（pRK600）（购自Novegen公司）的辅助下，将pBBR1MCS5-caceO互补到突变株DC-2MUT(降解乙草胺性状丢失)中，结合子涂布在含有100mg/kg Str和50mg/kg Gm的LB平板上，长出的单菌经过提取质粒验证，获得阳性克隆子DC-2MUT-CaceO。 
2.6基因工程菌株降解效果的验证及产物的鉴定 
将E.coli DH5α-CaceO和DC-2MUT-CaceO接种到含有50mg/kg Gm的100LB液体中生长至对数中后期，离心收集菌体，用灭过菌的蒸馏水离心洗涤菌体2遍。然后菌体分别添加在含100mg·L-1甲草胺、乙草胺和丁草胺的基础盐培养基中，使基础盐培养基OD600=2，37℃，180r·min-1摇床培养48h。基础盐培养基配方为：5.0g·L-1葡萄糖,1.0g·L-1NH4NO3,1.0g·L-1NaCl,1.5g·L-1K2HPO4,0.5g·L-1KH2PO4,0.02g·L-1MgSO4·7H2O,100mg·L-1维生素B12，调节pH到7.0。 
采用高效液相色谱测定降解效果，方法如下：首先往上述基础盐培养基中分别加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1ml下层二氯甲烷挥发完全后，加入1mL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。液相色谱条件：流动相为甲醇：水(80：20，V/V)，Zorbax C218ODS Spherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，柱温 为室温，紫外检测器，测定波长230nm，进样量20μL，流速为0.8mL·min-1。结果见图3。 
余下的滤液取10μL采用气质联用检测的提取液中的成分，检测方法：柱型：BD-5MS石英毛细管柱(15m×0.25mm×0.25μm)；样品进样量：2μL；分流比：30；载气：氦气；载气流速1ml/min；进样口温度为230℃，柱温为200℃。一级质谱条件：离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为负离子；离子化方式为电喷雾离子化；毛细管电压为4000伏；干燥气温度：330℃；干燥气流速：10.0L/min，雾化气压力：35psi，碰撞电压：135伏；质量扫描范围（m/z）：300-500。二级子离子质谱条件：碰撞电压：90伏；质量扫描范围（m/z）：30-400。 
结果显示，基因工程菌株催化乙草胺水解生成2-氯-N-（2-乙基-6-甲基苯基）乙酰胺，水解甲草胺和丁草胺生成2-氯-N-（2，6-二乙基苯基）乙酰胺。 
Figure IDA00003199925200011
Figure IDA00003199925200021
Figure IDA00003199925200031

Claims (10)

1.一个降解氯乙酰胺除草剂的加氧酶基因caceO，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述的加氧酶基因caceO及编码的蛋白质CaceO，其特征在于氨基酸序列为SEQID NO.2。
3.含有权利要求1所述的加氧酶基因caceO的重组载体pBBR1MCS5-caceO，其特征在于将包含权利要求1所述的加氧酶基因caceO的核酸片段插入pBBR1MCS-5的BamH I和EcoR I位点之间所得。
4.含有权利要求1所述的加氧酶基因caceO的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌是将权利要求3所述的重组载体pBBR1MCS5-caceO导入大肠杆菌E.coli DH5α获得。
6.权利要求1所述加氧酶基因caceO在降解和转化氯乙酰胺除草剂中的应用，所述的氯乙酰胺除草剂优选自甲草胺、乙草胺、丁草胺中的一种或多种。
7.权利要求1所述加氧酶基因caceO在构建抗氯乙酰胺除草剂转基因作物中的应用。
8.权利要求2所述的加氧酶CaceO在降解氯乙酰胺除草剂中的应用。
9.权利要求2所述的加氧酶CaceO在去除土壤、水体环境中氯乙酰胺除草剂残留中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的氯乙酰胺除草剂选自甲草胺、乙草胺、丁草胺中的一种或多种。
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