CN103981195A - 一种双加氧酶基因pbaAaAbAcAd及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双加氧酶基因pbaAaAbAcAd及其编码的蛋白质和应用。本发明克隆的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。其编码的双加氧酶PbaAaAbAcAd能催化3-苯氧基苯甲酸生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚，催化4-苯氧基苯甲酸生成4-羟基苯甲酸和邻苯二酚。PbaAaAbAcAd基因可用于构建通过降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的转基因作物，也可用于土壤、水体中3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基残留的消除和化工产品的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及一种双加氧酶基因pbaAaAbAcAd及其编码的蛋白质和应用。
背景技术
菊酯类农药降解的第一步是在菊酯水解酶的作用下生成3-苯氧基苯甲酸，然后再通过其它的酶系降解3-苯氧基苯甲酸。3-苯氧基苯甲酸是拟除虫菊酯杀虫剂在土壤中的降解产物，也是许多拟除虫菊酯在植物、昆虫和鸟类体内的代谢产物。3-苯氧基苯甲酸对真菌的毒性大于拟除虫菊酯，且与拟除虫菊酯不同，它可以在土壤中迁移，因此它在环境的危险性相对而言比菊酯大，而且具有二苯醚醛键的物质广泛存在于自然界中，如霉菌的次生代谢产物、木质素、甲状腺素、二苯呋喃等其他杀虫剂，它们对环境存在着潜在的威胁。Edward Topp等研究表明3-PBA在土壤中的半衰期达到180天，因此，这类物质作为微生物降解顽固化合物的典型也越来越受到人们的关注。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一个新的降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的角度双加氧酶基因pbaAaAbAcAd。
本发明的另一目的是提供该基因编码蛋白质。
本发明的又一目的是提供该基因及其编码的蛋白质的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd，该基因由核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID NO.2所示的小亚基基因pbaAb、SEQ ID NO.3所示的电子传递体电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc和SEQ ID NO.4所示的电子传递体电子传递体还原酶基因pbaAd组成。
一个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAc，该基因由核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID NO.2所示的小亚基基因pbaAb和SEQ ID NO.3所示的电子传递体电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc组成。
本专利所用的出发菌株为一株能够降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的细菌菌株Sphingobium wenxiniae JZ-1（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编 号为CGMCC NO.1.7748）。菌株JZ-1降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的第一步反应是在一个角度双加氧酶的催化下生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚（3-苯氧基苯甲酸）以及4-羟基苯甲酸和邻苯二酚（4-苯氧基苯甲酸）。
降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd的获得是采用现代生物信息学手段获得（技术路线见图1～图2）。即通过比较已报道的9个角度双加氧酶核酸序列与JZ-1的全基因组信息，寻找JZ-1中的可能的3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸双加氧酶基因。首先提取JZ-1的总DNA，把总DNA进行基因组测序，组装，KEGG数据库比对。测序结果表明，野生株JZ-1基因组大小为4766968bp，99个scaffold，G＋C含量为63.25%;预测有4887个基因,其中62个双加氧酶基因。
经过对已报道的9个角度双加氧酶大亚基核酸序列（DxnA1,Sphingomonas sp.RW1,3426122;CarAa,Sphingomonas sp.CB3,AF060489;DfdA1,Terrabacter sp.YK3,22036072;DbfA1,Terrabacter sp.DBF63,AB054975;CarAa1,Sphingomonas sp.KA1,113473718;CarAa，Pseudomonas stutzeri OM1,AB001723;CarAa,Janthinobacterium sp.J3,75765412;CarAa,Pseudomonas sp.CA10,2317678;PobA,P.pseudoalcaligenes POB310）与JZ-1（CGMCC NO.1.7748）的全基因组信息比对，发现JZ-1全基因组中有一个双加氧酶大小亚基和铁氧还蛋白蛋白类型的基因与9个角度双加氧酶大亚基核酸序列同源性较高，该大小亚基和Sphingomonas sp.RW1（购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ,DSM-No.DSM-6014,www.dsmz.de）中的一个双加氧酶DxnA1A2同源性分别为66%和53%。该三个基因G+C为55.4%，明显不同于JZ-1全基因组G+C（63.2%），并且三个基因两侧各有一个转座酶基因，说明该三个基因可能来自基因的水平转移。将包含该三个基因的3.4K片段（见图4）通过PCR从野生菌株中扩增出来酶连在pBBR1MCS-2构建重组载体，通过转化的方法导入到E.coli DH5α，获得了重组菌株E.coli DH5α(pBBRAaAbAc)，通过三亲结合将该重组载体转到Sphingomonas sp.RW1获得重组菌株获得重组菌株Sphingomonas sp.RW1（pBBRAaAbAc）（技术流程见图2）。检测了Sphingomonas sp.RW1（pBBRAaAbAc）对3-苯氧基苯甲酸的降解情况，结果表明Sphingomonas sp.RW1（pBBRAaAbAc）获得了降解3-苯氧基苯甲酸的能力，表明该基因确实为降解3-苯氧基苯甲酸的目标基因。另外，在pbaAaAbAc的下游发现了邻苯二酚的降解基因簇，与已报道的邻苯二酚代谢基因簇同源性较高（99%）。
为了获得PbaAaAbAc所需的合适的另一个电子传递体还原酶，将JZ-1全基因组序列与Sphingomonas sp.RW1中的RedA2基因序列进行比对（见图3），找到一个还原酶基因，氨基酸 序列与RedA2同源性为59%。通过重叠延伸PCR将该还原酶基因前面加上pET-29a(+)中的T7启动子和SD序列，连到pBBR1MCS-5上，构建重组载体pBBRAd,然后转到E.coli BL21(DE3)（pBBRAaAbAc）中，检测了E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）对3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的降解情况，结果表明E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）获得了3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的降解能力。用液质联用检测了JZ-1、Sphingomonas sp.RW1（pBBRAaAbAc）和E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）对3-苯氧基苯甲酸的降解代谢产物（见图4），以及E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）对4-苯氧基苯甲酸的降解代谢产物（见图5）。结果表明JZ-1、Sphingomonas sp.RW1（pBBRAaAbAc）降解3-苯氧基苯甲酸生成3-羟基苯甲酸；E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）降解3-苯氧基苯甲酸生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚；E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）降解4-苯氧基苯甲酸生成4-羟基苯甲酸和邻苯二酚。由此可以推测JZ-1降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的途径如图4。3-苯氧基苯甲酸在PbaAaAbAcAd的作用下生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚,与此类似的，4-苯氧基苯甲酸在PbaAaAbAcAd的作用下生成4-羟基苯甲酸和邻苯二酚，3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸不能被继续降解，而邻苯二酚可以在邻苯二酚邻位双加氧酶的作用下继续开环降解。JZ-1和Sphingomonas sp.RW1（pBBRAaAbAc）检测不到中间产物邻苯二酚，可能是因为邻苯二酚的降解速度大于其产生速度。
所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd编码的蛋白质PbaAaAbAcAd，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc编码的蛋白质pbaAaAbAc，氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7。
含有本发明所述的pbaAaAbAc基因或pbaAaAbAcAd基因的重组表达载体。
含有所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组表达载体优选pBBRAaAbAc：将包含所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pBBR1MCS-2的HindIII和Sac I位点之间所得。
含有所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组表达载体优选pETAaAbAc：将包含所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pET29a(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。
含有所述的双加氧酶基因pbaAd的重组表达载体优选pBBRAd：将包含所述的SEQ ID NO.4所示的电子传递体pbaAd的核酸片段插入pBBR1MCS-5的HindIII和Sac I位点之间所得。
含有本发明所述的pbaAaAbAc基因或pbaAaAbAcAd基因的基因工程菌株，优选将上述的重组表达载体导入宿主菌所得，进一步优选含有所述的重组表达载体pBBRAaAbAc的基因工程菌株RW-1(pBBRAaAbAc)或者含有所述的重组表达载体pETAaAbAc和pBBRAd的基因工程菌株E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）。
所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd在降解和转化3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸中的应用。
所述的含有双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组表达载体在降解和转化3-苯氧基苯甲酸中的应用。
所述双加氧酶基因pbaAaAbAcAd在构建抗3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸的转基因作物中的应用。
所述双加氧酶基因pbaAaAbAc在构建抗3-苯氧基苯甲酸的转基因作物中的应用。
所述双加氧酶PbaAaAbAcAd在降解3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸中的应用。
所述双加氧酶PbaAaAbAc在降解3-苯氧基苯甲酸中的应用。
所述双加氧酶PbaAaAbAcAd在去除土壤、水体中3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸残留中的应用。
所述双加氧酶PbaAaAbAc在去除土壤、水体中3-苯氧基苯甲酸残留中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明从出发菌株鞘酯菌（Sphingobium.sp.）JZ-1（CGMCC NO.1.7748）中克隆到降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长（从起始密码子到终止密码子）分别为1308、531、321和1227bp，编码435、176、106和408个氨基酸。该基因能够降解3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸，可在构建抗3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸的转基因作物中应用。该基因的编码蛋白可在降解3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸或除土壤、水体中3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸残留中应用。
附图说明
图1降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶pbaAaAbAcAd基因克隆技术路线图。
图2双加氧酶基因pbaAaAbAcAd功能验证技术路线图。
图3还原酶基因pbaAd的查找和功能验证技术路线
图4为pbaAaAbAcAd所在的转座子序列及下游的邻苯二酚基因簇
图5基因工程菌株降解3-苯氧基苯甲酸的液质检测图谱
a～c图依次为3-苯氧基苯甲酸、3-羟基苯甲酸和邻苯二酚标准品液相检测图谱；
d图为JZ-1降解3-苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
e图为d图中产物3-羟基苯甲酸的质谱图。
f图为重组菌株Sphingomonas sp.RW1(pBBRAaAbAc)降解3-苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
g图为f图中产物的质谱图。
h图为重组菌株E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）降解3-苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
i～j图为h图中产物的质谱图。
图6基因工程菌降解4-苯氧基苯甲酸的液质检测图谱
a～c图依次为4-苯氧基苯甲酸、4-羟基苯甲酸和邻苯二酚标准品液相检测图谱；
d图为重组菌株E.coli BL21(DE3)（pETAaAbAc/pBBRAd）降解4-苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
e～f图为d图中产物的质谱图。
生物材料保藏信息
3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸降解菌JZ-1,分类命名为Sphingobium wenxiniae JZ-1，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.1.7748，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年8月2日。
具体实施方式
实施例1.3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆（策略图见图1）
1.2细菌基因组总DNA的提取
菌株JZ-1（Sphingobium sp.）（CGMCC NO.1.7748）大量培养后，采用高盐结合CTAB法提取高纯度、大片段的JZ-1的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
1.3DNA样品寄送与检测
细菌基因组测序要求样品OD值在1.8-2.0之间，浓度越高越好，浓度不低于30ng/μL，达到精细图至少需要样品量30微克。将准备好的足量的DNA样品在干冰保温下寄送至美吉生物科技。
样品检测采用：1.浓度检测，琼脂糖凝胶电泳定量；2.OD260:280和OD260/230检测方法：NanoDrop。
1.4菌株基因组测序
DNA样品检测合格后建库，测序，并对数据进行基本分析(包括碱基识别、过滤接头序列、去污染)。然后进行后续生物信息分析，主要包括基因组序列组装、基因组成分分析、基因功能注释以及比较基因组分析等。
1.5测序片段组装与分析
运用SOAPdenovo组装软件对reads数据进行组装，得到scaffold序列并作相关基本数据统计。
1.6基因预测与功能注释
采用Glimmer3.0基因预测软件对组装结果进行基因de novo预测，并对预测的基因与数据库比对并进行功能注释。
基因注释主要基于蛋白序列比对。将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。由于每一条序列可能会有许多比对结果，这里为了保证其生物意义，我们保留一条比对效果最好的结果，作为此条基因的注释。所有的注释均使用BLAST软件结合各个数据库的特点完成。BLAST的版本为：blastall2.2.21，供注释的蛋白库为：KEGG、GO等。
1.7菌株JZ-1全基因组信息和9个角度双加氧酶大亚基核酸序列的比对的比较
基因组测序结果，野生株JZ-1基因组大小为4766968bp，99个scaffold，通过de novo预测共4887个ORF；突变株MJZ-1基因组大小为4641033bp，178个scaffold，通过de novo预测共4620个ORF。
采用OMIGA3.0将9个角度双加氧酶大亚基核酸序列（DxnA1,Sphingomonas sp.RW1,3426122;CarAa,Sphingomonas sp.CB3,AF060489;DfdA1,Terrabacter sp.YK3,22036072;DbfA1,Terrabacter sp.DBF63,AB054975;CarAa1,Sphingomonas sp.KA1,113473718;CarAa，Pseudomonas stutzeri OM1,AB001723;CarAa,Janthinobacterium sp.J3,75765412;CarAa,Pseudomonas sp.CA10,2317678;PobA,P.pseudoalcaligenes POB310）与JZ-1（CGMCC NO. 1.7748）的全基因组信息比对，结果发现，野生菌株JZ-1基因组中有1个双加氧酶大小亚基和铁氧还蛋白基因，放在NCBI网上BlastP，比对结果发现双加氧酶大小亚基和Sphingomonas sp.RW1DxnA1A2同源性分别为66%和53%，铁氧还蛋白与DxnA1A2相配套的Fdx1无同源性，但与Sphingomonas sp.RW1中的另一铁氧还蛋白同源性为59%，命名该双加氧酶大小亚基和铁氧还蛋白为PbaAaAbAc，氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，相应的基因为pbaAaAbAc。
实施例2双加氧酶基因pbaAaAbAc功能验证技术路线图（策略图见图2）
2.1菌株JZ-1基因组DNA提取
同1.1
2.2包含pbaAaAbAc基因的3.4K核酸片段（见图4）PCR扩增
以引物pbaF（SEQ ID NO.9）和pba2R（SEQ ID NO.10），用PCR从Sphingobium JZ-1（CGMCC NO.1.7748）基因组DNA中扩增3.4K-pbaAaAbAc。（见图4）
扩增体系：
PCR扩增程序：
a.98℃变性1min；
b.98℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸70s，进行30个循环；
c.72℃延伸10min，冷却到室温。
2.3PCR产物用Hind III和SacI双酶切。
酶切体系：
在37℃水浴中，反应10h以上。酶切产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。
2.4pBBR1MCS-2（购自上海北诺生物科技有限公司）用Hind III和SacI双酶切（参考2.3）。
2.5转化
2.3中的回收片段和2.4中酶切好的pBBR1MCS-2进行酶连。酶连好pBBRAaAbAc重组质粒转化到E.coli DH5α（购自TransGen Biotech）获得重组E.coli DH5α(pBBRAaAbAc)，挑取阳性克隆子。E.coli DH5α(pBBRAaAbAc)在辅助菌E.coli HB101（pRK600）（购自Novegen公司）的辅助下，将pBBRAaAbAc通过三亲结合互补到Sphingomonas sp.RW1中，接合子涂布在含有50mg/kg Str和50mg/kg Km的LB平板上，长出的单菌经过提取质粒验证，获得阳性克隆子和Sphingomonas sp.RW1(pBBRAaAbAc)。
2.6基因工程菌株降解效果的验证及产物的鉴定
将Sphingomonas sp.RW1(pBBRAaAbAc)接种到含有50mg/kg Km的100LB液体中生长至对数中后期，离心收集菌体，用灭过菌的蒸馏水离心洗涤菌体2遍。然后菌体分别添加在含100mg·L-13-苯氧基苯甲酸的基础盐培养基中，使基础盐培养基OD600=2，37℃，180r·min-1摇床培养48h。基础盐培养基配方为：5.0g·L-1葡萄糖,1.0g·L-1NH4NO3,1.0g·L-1NaCl,1.5g·L-1K2HPO4,0.5g·L-1KH2PO4,0.02g·L-1MgSO4·7H2O,调节pH到7.0。
采用液质联用测定降解效果，方法如下：首先将上述基础盐培养基进行真空冷冻干燥，然后加入1mL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。液相色谱条件：流动相为乙腈：水(50：50，V/V)加入0.5%乙酸，Zorbax C218ODS Spherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，柱温为室温，紫外检测器，测定波长230nm，进样量20μL，流速为0.8mL·min-1。结果见图4和图5。一级质谱条件：离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为负离子；离子化方式为电喷雾离子化；毛细管电压为4000伏；干燥气温度：330℃；干燥气流速：10.0L/min，雾化气压力：35psi，碰撞电压：135伏；质量扫描范围（m/z）：300-500。
结果显示，Sphingomonas sp.RW1(pBBRAaAbAc)可以降解3-苯氧基苯甲酸，生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚（图5）。
实施例3还原酶基因pbaAd的查找和功能验证技术路线（见图3）
3.1菌株JZ-1基因组DNA提取
同1.1
3.2包含pbaAaAbAc基因的2.2K核酸片段PCR扩增
以引物Ni-AaAbF（SEQ ID NO.11）和Ni-AcR（SEQ ID NO.12），用PCR从Sphingobium JZ-1 （CGMCC NO.1.7748）基因组DNA中扩增2.2K-pbaAaAbAc,用NdeI和XhoI双酶切,连到同样双酶切的pET29a(+)载体上，构建重组质粒pETAaAbAc。
3.3pbaAd基因的查找和包含pbaAd基因的1.9K核酸片段PCR扩增
将JZ-1全基因组序列和Sphingomonas sp.RW1中还原酶RedA2基因进行比对，找到一个还原酶基因pbaAd，氨基酸序列与Sphingomonas sp.RW1中RedA2基因同源性为59%。以引物pbaAdF（SEQ ID NO.13）和pbaAdR（SEQ ID NO.14），用PCR从Sphingobium JZ-1（CGMCC NO.1.7748）基因组DNA中扩增1.2K-pbaAd,通过重叠PCR将pET29a(+)上的T7启动子和SD序列（引物：T7SDF（SEQ ID NO.15）和T7SDR（SEQ ID NO.16））加到pbaAd前面，用Hind III和SacI双酶切，连到同样双酶切的pBBR-1MCS5载体上，构建重组质粒pBBRAd。
3.4转化
将pETAaAbAc和pBBRAd重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)（购自TransGen Biotech）获得重组E.coli BL21(DE3)(pETAaAbAc/pBBRAd)，挑取阳性克隆子。
2.6基因工程菌株降解效果的验证及产物的鉴定
将E.coli BL21(DE3)(pETAaAbAc/pBBRAd)接种到含有50mg/kg Km和30mg/kg Gm的100LB液体中生长至对数中后期，离心收集菌体，用灭过菌的蒸馏水离心洗涤菌体2遍。然后菌体分别添加在含100mg·L-13-苯氧基苯甲酸和100mg·L-14-苯氧基苯甲酸的基础盐培养基中，使基础盐培养基OD600=2，37℃，180r·min-1摇床培养48h。
采用液质联用测定降解效果结果（图5和图6）显示，E.coli BL21(DE3)(pETAaAbAc/pBBRAd)可以降解3-苯氧基苯甲酸，生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚，降解4-苯氧基苯甲酸，生成4-羟基苯甲酸和邻苯二酚。
Claims (10)
1.一个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd，其特征在于该基因由核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID NO.2所示的小亚基基因pbaAb、SEQ ID NO.3所示的电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc和SEQ ID NO.4所示的电子传递体还原酶基因pbaAd组成。
2.一个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAc，其特征在于该基因由核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID NO.2所示的小亚基基因pbaAb和SEQ ID NO.3所示的电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc组成。
3.权利要求1所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd编码的蛋白质PbaAaAbAcAd，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
4.权利要求2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc编码的蛋白质pbaAaAbAc，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7。
5.含有权利要求1或2所述的基因的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于将包含权利要求2所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pBBR1MCS-2的HindIII和Sac I位点之间得到含有权利要求2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组载体pBBRAaAbAc；或者将包含权利要求2所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pET29a(+)的NdeI和XhoI位点之间得到含有权利要求2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组载体pETAaAbAc；或者将包含权利要求1所述的SEQ IDNO.4所示的电子传递体pbaAd的核酸片段插入pBBR1MCS-5的HindIII和Sac I位点之间得到含有权利要求1所述的双加氧酶基因pbaAd的重组载体pBBRAd。
7.含有权利要求1或2所述的双加氧酶基因的基因工程菌，优选将权利要求5所述的重组表达载体导入宿主菌所得；进一步优选将权利要求6所述的重组载体pBBRAaAbAc导入RW1所得，或者将权利要求6所述的重组载体pETAaAbAc和pBBRAd导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)所得。
8.权利要求1或2所述的双加氧酶基因在降解和/或转化3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸中的应用。
9.权利要求1或2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd在构建抗3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸转基因作物中的应用。
10.权利要求3所述的双加氧酶PbaAaAbAcAd在降解3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸中的应用，优选权利要求3所述的双加氧酶PbaAaAbAcAd在去除土壤、水体环境中3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸残留中的应用。
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