CN103266117A

CN103266117A - 苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA及其应用

Info

Publication number: CN103266117A
Application number: CN2013102021224A
Authority: CN
Inventors: 李顺鹏; 闫新; 谷涛; 何健; 洪青; 蒋建东; 黄星; 孙纪全
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN103266117B

Abstract

本发明公开了苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因及其应用。一种苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长为1907bp，G＋C含量为55.37%，大亚基编码459个氨基酸，小亚基编码176个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明提供的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶PudmA能够把异丙隆和绿麦隆等苯基脲类除草剂的N-甲基脱除，使其失去除草活性。因此苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA可用于构建抗苯基脲类除草剂的转基因作物。此外苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA及其编码的蛋白质PudmA也可以用于消除环境中残留的苯基脲类除草剂。

Description

苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA及其应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA及其应用。

背景技术

农药在农业生产、农作物病虫害防治、清除杂草以及控制人畜传染病等方面发挥了巨大的作用，但是同时也带来严重的环境问题，农药污染直接导致农产品中农药超标，产品品质下降，严重影响了我国农副产品的出口；另一方面，环境中残留农药通过各种途径，主要是食物链富集，最终直接威胁到人类的生命健康；此外，农药残留还间接导致生态系统结构改变、功能破坏。

异丙隆和绿麦隆等苯基脲（或称取代脲）类除草剂（phenylurea herbicides）是根据在脲分子中氨基上的取代基和在苯环上取代基不同而合成一系列除草剂，它们主要是通过抑制光合作用起到除草的效果，大多数取代脲类除草剂主要作苗前土壤处理剂，防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，虽然此类除草剂被作为一种低毒除草剂在世界范围内广泛应用，但是其大量使用而造成的一系列环境问题已经引起人们的重视，如异丙隆等苯基脲类除草剂在环境中的残留对水生无脊椎动物、藻类以及微生物的活动会产生不良影响，而且异丙隆是一种致癌物。因此对其残留的微生物降解机理及其基因在修复中的应用的研究成为了热点。

微生物修复技术具有高效、绿色、成本低廉、无二次污染等特点，受到环境微生物学领域专家的广泛关注，应用前景十分广阔。微生物降解修复农药的本质是微生物产生的酶对农药的降解作用，从微生物中提取的降解酶系来消除农药残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因的获得在该类除草剂污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时可通过基因改造扩大脱甲基的作用底物范围和作用强度，广泛应用于环境中苯基脲类除草剂的降解，保护环境。另外构建和种植抗除草剂转基因是解决除草剂药害的最佳途径。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因，该基因可用于构建抗苯基脲类除草剂的转基因作物，也可用于土壤、水体中苯基脲类除草剂残留的去除。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本专利所用的出发菌株为一株能够降解苯基脲类除草剂的细菌菌株YBL3（CCTCC NO:M208076）在分类上属于鞘氨醇杆菌（Sphingobium sp），质谱分析结果表明菌株YBL3可以把异丙隆等苯基脲类除草剂的N-甲基脱除，使其失去除草活性。

苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA采取的策略为转座子标签法。虽然转座子随机插入突变法随机性较差，在实际应用中效率很低，但如果在基因组序列已知的情况下，该方法的效率就会大大提高。YBL3（CCTCC NO:M208076）能在无机盐平板上利用异丙隆等苯基脲类除草剂为唯一碳氮源生长，通过三亲接合利用质粒pSC123(见图1)将转座子mini-Tn5随机插入YBL3基因组后，将在LB加抗生素平板上长出的菌落分别点于无机盐加异丙隆平板和无机盐加葡萄糖及硫酸铵平板，前者用来筛选不能以异丙隆为碳氮源生长的菌株，后者用来排除那些随机插入产生的营养缺陷型，利用本课题组发明的SEFA-PCR技术分别扩增出突变子的上游序列，通过和基因组序列比对锁定mini-Tn5的插入位点，然后再分析验证是否失活了异丙隆降解过程中的某步基因。

用上面的策略筛选到一株不能在无机盐加农药的平板上生长但可以在LB平板上正常生长的突变株，进一步的降解实验表明该突变子不能降解异丙隆。设计引物，进行SEFA-PCR，多次PCR测序后，拼接结果表明插入位点为双加氧酶基因的β亚基，该基因包含两个亚基，全长为1907bp（其中α亚基长度为1380bp，编码459个氨基酸；β亚基长度为531bp，编码176个氨基酸），命名为pudmA。这是首个报道的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因。

所述的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA核苷酸序列所编码的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因蛋白PudmA，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

含有所述的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA插入pET-29a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得。

含有所述的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA的基因工程菌。

所述的基因工程菌优选以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。

所述苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA在构建抗苯基脲类除草剂的转基因作物中的应用。

所述苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA在降解苯基脲类除草剂中的应用。

所述苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA在去除土壤、水体中苯基脲类除草剂残留中的应用。

所述苯基脲类除草剂N-脱甲基酶蛋白质PudmA在去除土壤、水体中苯基脲类除草剂残留中的应用。

本发明的有益效果如下：

1.本发明用转座子标签法成功的从菌株YBL3（CCTCC NO:M208076）中克隆出苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长（从起始密码子到终止密码子）为1907bp，G+C含量为55.37%，大亚基编码459个氨基酸，小亚基编码176个氨基酸。

2.本发明对经过IPTG诱导的大肠杆菌，做了降解能力的测定，能有效的降解异丙隆（见图2）。pudmA可用于构建抗苯基脲类除草剂的转基因作物，也可用于土壤、水体中苯基脲类除草剂残留的去除，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明

图1苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA在BL21（pET-29a(+)）中表达策略图。

图2苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA表达产物降解异丙隆的液相色谱图；

图3苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA表达产物降解异丙隆的一级质谱图；

图4异丙隆的离子二级质谱图。

图5异丙隆N上脱一个甲基后的产物（MDIPU）离子二级质谱图。

图6异丙隆N上脱二个甲基后的产物(DDIPU)离子二级质谱图。

图7苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA产物降解异丙隆的途径。

生物材料保藏信息

鞘氨醇杆菌YBL3，分类命名为Sphingobium sp.YBL3，保存在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M208076，保藏日期为2008年5月22日。

具体实施方式

实施例1.苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA的克隆

1.1转座子标签法建库

YBL3（CCTCC NO:M208076）能在无机盐平板上利用异丙隆等苯基脲类除草剂为唯一碳氮源生长，通过三亲接合将转座子mini-Tn5随机插入YBL3（CCTCC NO:M208076）基因组后，将在LB加抗生素平板上长出的菌落分别点于无机盐加异丙隆平板和无机盐加葡萄糖及硫酸铵平板，前者用来筛选不能以异丙隆为碳氮源生长的菌株，后者用来排除那些随机插入产生的营养缺陷型。通过这种方法获得功能基因突变的突变株。

1.2YBL3全基因测序

转座子随机插入突变法随机性较差，在实际应用中效率很低，但如果在基因组序列已知的情况下，该方法的效率就会大大提高。因此有必要将YBL3全基因组测序。测序与华大基因公司合作，运用新一代测序技术平台和生物信息学平台对YBL3的基因组进行序列测定，拼接和比对注释。本课题组提供菌株YBL3的基因组DNA，华大负责测序和拼接，双方共同对其进行注释。

1.3SEFA-PCR侧翼序列扩增

利用本实验室王世明博士发明SEFA-PCR技术，分别扩增出突变子的上下游序列，通过和基因组序列比对锁定mini-Tn5的插入位点，通过BlastX比对初步确定基因功能。利用OMIGE软件确定序列编码的ORF信息。

1.4基因核苷酸序列的测定

南京金斯瑞生物技术有限公司进行序列测定异丙隆脱甲基酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1，根据异丙隆脱甲基酶基因核苷酸序列所推到的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA在BL21(pET-29a(+))中的高效表达（图2）

2.1苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA的PCR扩增

以正向引物P1:5’-GGAATTCCATATGTTTCGCTACGATCAAGTA-3’（SEQ ID NO.3）和反向引物P2:5’-CCGGAATTCCTAAAGAAAGATGGCCAGGTT-3’（SEQ ID NO.4）为引物，用PCR方法从鞘氨醇杆菌Sphingobium sp.YBL3（CCTCC NO:M208076）总DNA中扩增出苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA片段。

扩增体系：

PCR扩增程序：

2.2PCR产物的验证。

将PCR产物回收，取几微升加A尾，连在pMD19-T载体上，挑选连入正确的转化子送南京金斯瑞生物技术有限公司测序，验证PCR产物的正确性。验证正确后用于以下实验。

2.3PCR产物用Nde I和EcoR I双酶切。

酶切体系：

在37℃水浴中，反应3h以上。

酶切产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2.4pET-29a(+)用Nde I和EcoR I双酶切（参考2.2）。

2.5转化和表达

2.2中的回收片段和2.3中酶切好的pET-29a(+)进行酶连。

酶连体系如下：

酶连好的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组表达菌。

2.6验证阳性转化子表达产物对异丙隆的降解功能

阳性转化子在LB培养基中培养至0D₆₀₀0.6-0.8之间，加IPTG至浓度0.4mM，15℃低温诱导18h。在100ml基础盐培养基（1.5g K₂HPO₄,0.5g KH₂PO₄,0.2g MgSO₄　7H₂O,1.0g NaCl,1.0g(NH₄)₂SO₄,1.0g每L）中加入20mg/L异丙隆，20%接种量接入阳性转化子培养液，30℃振荡培养5d。

用4ml二氯甲烷分两次全量提取2ml的培养液，用液相色谱检测降解效果，检测条件如下：色谱柱为Kromasil100-5C18填充的色谱分离柱(内径：4.6mm；长：25cm)。流动相为甲醇：水(70:30，V:V)，流速为0.7mL/min，使用紫外检测器检测，检测波长为250nm。结果显示：基因工程菌对20mg/L异丙隆能完全降解（图2～图7）。

以上实施例中使用的微生物来源如下：

T-A克隆载体（测序）Pmd19-T 购自TAKARA公司

大肠杆菌高表达载体pET-29a(+) 购自Novegen公司，

表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3) 购自上海英骏生物技术有限公司。

Claims

1.苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA核苷酸序列所编码的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶蛋白质PudmA，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

3.含有权利要求1所述的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于是将权利要求1所述的苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA插入pET-29a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得。

5.含有权利要求1所述的抗苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1所述苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA在构建抗苯基脲类除草剂的转基因作物中的应用。

8.权利要求1所述苯基脲类除草剂N-脱甲基酶基因pudmA在降解苯基脲类除草剂中的应用。

9.权利要求2所述苯基脲类除草剂N-脱甲基酶蛋白质PudmA在去除土壤、水体中苯基脲类除草剂残留中的应用。