JP2016517274A - 効率的な転写終結による改善されたrnaの生成及び送達のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
別段の定義がない限り、本明細書で使用されているすべての技術的及び科学的用語は、当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、別段の定めがない限り、その用語の複数形も想定されている。別段の記載がない限り、本明細書の文中の核酸配列は、プロモーターに関して5’から3’への方向に与えられる。
本開示は、高効率でコストパフォーマンスの高い転写RNA分子の生成及び送達のための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、転写RNA分子はタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、転写RNA分子は調節RNAをコードする。いくつかの実施形態では、転写RNA分子はdsRNAである。いくつかの実施形態では、転写RNA分子は、標的遺伝子を抑制し得る、安定化した少なくとも一部が二本鎖RNA(dsRNA)分子を形成するセンス配向セグメント及びアンチセンス配向セグメントの両方を含む。いくつかの実施形態では、転写RNA分子は、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、転写RNA分子は調節RNAである。
本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、第3のRNAセグメントにより実質的に相補的な第2のRNAセグメントに連結した第1のRNAセグメントを含むRNA分子のインビボまたはインビトロ製造のためのベクター及びシステムに関する。第1及び第2のRNAセグメントは、RNA分子の長さ内にあり、互いの実質的に逆方向反復であり、ゆえに、第1及び第2のRNAセグメント間の相補性は、一本鎖ループを形成する第3のRNAセグメントにより第1及び第2のセグメントの各々の一端部で共に連結された二本鎖RNAステムを形成するように、インビボ及びインビトロでハイブリダイズする2つのセグメントの能力をもたらす。第1及び第2のセグメントは、抑制のために標的とされるヌクレオチド配列に対して実質的同一性を示す配列のセンス及びアンチセンスそれぞれに対応する。いくつかの実施形態では、RNA分子は、少なくとも第2の標的配列を抑制する、少なくとも第2のステム−ループ形成領域をさらに含む。
本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、RNAコード要素に作動可能に連結されたプロモーターを含むRNAのインビボ及びインビトロ転写のための操作された発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、RNAは、dsRNAであってもよい。他の実施形態では、RNAは、タンパク質をコードしてもよい、または調節RNAであってもよい。本明細書に記載されている操作された発現構築物は、有利に、複製可能なベクターの一部を形成してもよい。本明細書に記載されている実施形態では、操作されたRNA発現構築物からのRNA生成の効率は、ベクターバックボーンからのRNAの不所望の転写を防止または最小化することにより改善される。ベクターバックボーンの不所望の転写を防止または最小化するいくつかの方法が企図され、及び独立してまたは組み合わされて使用されてもよい。いくつかの実施形態では、2つまたは3つ以上の転写ターミネーター配列が、RNAコード要素の3’端のプロモーターの下流に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、2つまたは3つ以上の隣接する中サイズのヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列は、RNAコード要素の3’端のプロモーターの下流に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムにおいて好適に見出されていない1つまたは複数の制限部位が、RNAコード要素に対して3’に提供される。この制限における開裂は、切断部位の下流で不所望の転写を防止する。いくつかの実施形態では、相補的塩基対を介して1つまたは複数のステムループ構造を形成し得るRNA転写をコードする合成ヌクレオチド配列は、RNAコード要素の3’端の下流でプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、dsRNA結合タンパク質のための1つまたは複数の結合部位をコードするヌクレオチド配列は、RNAコード要素に対して3’に提供される。いくつかの実施形態では、操作されたRNA発現構築物はRho依存性終結シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ベクターバックボーンの大きさが低減されて、不所望の転写を最小化する。
いくつかの実施形態は、対象生物に上記のような非機能性配列の非生産的転写を最小化するように設計された操作された発現構築物から転写されたdsRNAを送達する組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、dsRNAは、操作された発現構築物からインビトロで合成されて、対象生物に提供される。他の実施形態では、対象生物に提供されるdsRNAは、操作された発現構築物から宿主細胞(インビボ)において転写される。
dsRNA生成ベクターの設計
標的配列、すなわち、配列番号1のヌクレオチド30−309は、COPIコートマーの推定コロラドハムシ(CPB)オルソログから選択された。
コロラドハムシ(CPB)dsRNAのインビボ生成
1.形質転換
pCPB−hp+2T及びpLac−T7プラスミドは、実施例1で説明したように、大腸菌株HT115(DE3)に形質転換された。形質転換に続いて、大腸菌細胞は塗布され、単一のコロニーが選択された。
単一のコロニーが、種培養物を生成するように、100μg/mlのアンピシリン及び12.5μg/mlのテトラサイクリンを含む3mlのLB培地において37℃で6−8時間成長された。dsRNAの発現を誘導するように、200ulの種培養物が、100μg/mlのアンピシリン及び12.5μg/mlのテトラサイクリンを含む50mlの自己誘導培地(AIM)(Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207−234)を用いて250mlのフラスト内に植菌され、次いで、培養された。4℃で10分間6000gの遠心分離により細胞が回収された。
細菌のRNAが、下記のようなRNA抽出バッファーに対する改変によりSteadのSNAPプロトコル(Steadら,Nucleic Acids Res.2012 Nov 1;40(20):e156)から適合された方法を用いて単離された。細菌培養物の1ml(〜108細胞)が16,000gで30秒間遠心分離して、上澄み液が除去された。細胞ペレットが、抽出の準備ができるまでに、ドライアイス中に保存された。細胞ペレットは、次いで、激しくボルテックスすることにより100μlの改変されたRNA抽出溶液(18mMのEDTA、0.025%のSDS、5mMのTCEP、95%のホルムアミド(RNAグレード))中に再懸濁された。SteadのSNAPプロトコルのRNA抽出溶液中に用いられる1%の2−メルカプトエタノールは、TCEPが2−メルカプトエタノールに比べてかなり低い毒性及び2−メルカプトエタノールと同等の有効性を有するために、5mMのTCEPと置き換えられた(データは示されていない)。
インビボ及びインビトロ転写RNAの比較
pCPB−hp+2Tプラスミドは、線状化され、RNAのインビトロ転写のためのテンプレートとして使用された。インビトロ転写RNA(図5A、レーン9及び10)は、実施例1において説明された改変されたSNAPプロトコルにより精製された細菌転写RNAと共にアガロースゲル上に乗せられ、直接H2Oで希釈されて(図5A、レーン5及び6)、または、30Kで分子を分画する濾過膜(Amicon)でフィルタリングされて、RNA転写の大きさを決定するようにH2Oで希釈する(図5A、レーン5及び6)前に、EDTA、SDS、TCEP及びホルマリンなどの試薬を除去した。インビトロ転写RNAは、細菌転写RNA(図5Aを参照されたい)より大きいことが観測された。
大腸菌の加熱死滅
細胞溶解を伴わずに大腸菌HT115(DE3)細胞を加熱死滅させる温度範囲が実験的に決定された。大腸菌HT115(DE3)細胞は、37℃乃至72℃の異なる温度で30分間培養された。加熱処理された細胞は、続いて、溶解が生じて、LBプレート上に広がり、加熱処理後の生存率を決定するよう一晩中培養されたかどうかを判定するように、顕微鏡で検査された。表1に示すように、59℃及びそれ以上の温度への加熱はすべての細胞を死滅させるが、まだ、細胞溶解は、72℃までの試験される温度のいずれにおいても観測されなかった(図6を参照されたい)。
すべての細胞は異なる温度で30分間処理された。低ODはOD600’’0.2及び高ODはOD600’’2である。
細菌dsRNA収率−成長培地の最適化
3つの豊富な培地、すなわち、自己誘導培地(AIM)(Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207−234)、Super Broth(Atlas,R.M.Handbook of microbiological media.1997.CRC Press,New York,USA)+培地及びプラスミド+AIM培地が、細菌RNA生成収率が培地選択により改善され得るかどうかを判定するために試験された。
コロラドハムシにおけるdsRNAの生物有効性
3つのdsRNAサンプル、すなわち、非溶解の加熱死滅pCPB−hp+2T大腸菌HT115(DE3)、精製された細菌転写CBP dsRNA及びインビトロ転写CBP dsRNAが、コロラドハムシ(CPB)、すなわちLeptinotarsa decemlineataに対してdsRNA調製の生物有効性を試験するために、上記のように生成された。
表2:CPB dsRNA死亡バイオアッセイ
表3:CPB dsRNA成長阻害バイオアッセイ
DV49 dsRNAの生物有効性
アンチセンスDV49+ループ+センスDV49+PTH−ターミネーター+pET−T7ターミネーターの発現を駆動するT7プロモーターを有するpUCバックボーンプラスミドが構築された。図8を参照されたい。DV49発現構築物のヌクレオチド配列が配列番号4において提供される。
配列番号4:
溶解細菌対非溶解細菌の生物有効性
pCPB−hp+2T大腸菌HT115(DE3)の培養が調製され、細胞は、実施例4に記載されているように加熱死滅される。加熱死滅pCPB−hp+2T大腸菌HT115(DE3)細胞のアリコートは、続いて、細胞溶解物を生成するように、化学、酵素、凍結融解または機械的手段により溶解される。細胞溶解物のアリコートは、続いて、細胞破片を除去するように、遠心分離により部分的に精製される。3つのサンプル、非溶解の加熱死滅pCPB−hp+2T大腸菌HT115(DE3)細胞、非精製細胞溶解物及び部分的精製細胞溶解物が、続いて、上記の実施例6に記載されているように、コロラドハムシ(CPB)、すなわちLeptinotarsa decemlineataに対して生物有効性が試験される。これら3つのサンプルのアリコートは、期間を長くするために、凍結乾燥もしくは凍結、室温、4℃及び0℃などの温度などの異なる調製をさらに受け、種々の調製及び保存条件の下に置かれるサンプルの生物有効性が、上記の実施例6に記載されているようなバイオアッセイを実行することにより決定される。異なるサンプル調製のバイオアッセイが比較され、高度の生物有効性及び安定性を示す調製が選択される。
dsRNA収量の最適化−ターミネーターの数及び組み合わせ
有効なdsRNA生成のためのプラスミドベクターが、転写ターミネーター配列がプロモーターとの機能的組み合わせを形成するように、PTHターミネーター、pET−T7ターミネーター、T3−Tφターミネーター、pBR322−P4ターミネーター、水疱性口内炎ウイルスターミネーター、rrnB−Tlターミネーター、rrnCターミネーター、TTadc転写ターミネーターからなる群から独立して各々選択される、dsRNAコード配列、すなわち、2、3、4、5または6個の転写終結配列に対して位置3’で挿入されることによってに構築される。
dsRNA収量の最適化−プラスミドの大きさ
効率的なdsRNA生成に対するプラスミドベクターが、プロモーターと、dsRNAコード要素と、2つまたは3つ以上の終結配列とを含む操作されたdsRNA発現構築物を、タンパク質ベースの選択可能マーカー及び/または非必須スペーサー配列を含まない最小のプラスミドベクターに挿入することにより、構築される。操作されたdsRNA発現構築物を含むベクターの予測される大きさが、効率的なプラスミド複製の最小の大きさを下回る場合、1つまたは複数の付加的な操作されたdsRNA発現構築物またはdsRNAコード要素はベクターに挿入されて、結果として得られる発現ベクターの効率的な複製のための最小の大きさを達成する。宿主細胞は、dsRNA発現ベクターにより形質転換される。必要に応じて、dsRNA発現ベクターからのdsRNA転写を駆動するRNAポリメラーゼをコードするベクターは共形質転換される。最小のベクターバックボーンは、ベクターバックボーンのより大きい割合を有するプラスミドに比較してdsRNAの収量を改善して、非dsRNAコード配列の非生産的読み過ごしのための縮小テンプレートを提供する。
dsRNA収量の最適化−線状化テンプレート
効率的なdsRNA生成のためのプラスミドベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたdsRNAコード配列に対して3’ である位置において、宿主細胞ゲノム(たとえば、大腸菌ゲノム、ZFN制限部位またはTALEN制限部位におけるいずれかの部位を有しないI−Scel)を切断しないエンドヌクレアーゼのための制限部位を挿入することにより構築される。たとえば、図9を参照されたい。宿主細胞は、dsRNA+エンドヌクレアーゼ生成ベクター及び制限部位を認識するエンドヌクレアーゼをコードするベクターにより共形質転換される。いくつかの例では、エンドヌクレアーゼの発現は誘導的であり、このエンドヌクレアーゼは、dsRNA生成を駆動するRNAポリメラーゼをさらにコードするベクター上にコードされてもよい。エンドヌクレアーゼの発現は、dsRNA生成ベクターを線状化し、それにより、ベクター配列の非生産的読み過ごしが排除され、最小化非線状化プラスミドに比較してdsRNAの収量が改善される。
RNA収量の最適化−ターミネーター組み合わせの比較
RNA生成収量の比較が、同じ発現プラスミドにクローニングされた異なるターミネーターを用いて行われる。
異なるターミネーターまたはターミネーターの組み合わせを有する9個のプラスミドベクターが、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌lac Z遺伝子のNターミナルフラグメント、複数のクローニング部位及び複製の起点を含むpUC19クローニングベクターを用いて構築された。下記の表4に示しているターミネーター配列は、異なるターミネーターまたはターミネーターの組み合わせを有する9個の異なるベクターを生成するように、T7プロモーターの下流のpUC19ベクターにクローニングされる。CPB−hpをコードするDNA配列(配列番号2)は、T7プロモーターの下流及びターミネーター配列の上流でベクターに挿入された。
プラスミドベクターは、大腸菌HT115(DE3)細胞に形質転換された。各プラスミドベクターに対する単一のコロニーが選択され、種培養物を生成するように、100μg/mlのアンピシリン及び12.5μg/mlのテトラサイクリンを含む3mlのLB培地において37℃で6−8時間生育された。dsRNAの発現を誘導するように、種培養物の200μlが、100μg/mlのアンピシリン及び12.5μg/mlのテトラサイクリンを含む自己誘導媒体(AIM)(Studier,Protein Expression and Purification 41(2005)207−234)を有する250mlのフラスコ内に植菌され、続いて、培養された。4℃で10分間6000gで遠心分離することにより、細胞が回収された。
総RNAが、実施例2に記載されているプロトコルにしたがって、細菌細胞から精製され、生成されるRNA量を測定するように、アガロースゲル上に乗せられた。図10に示すように、高レベルのRNA生成が、タンデムに2つのターミネーター(PTH及びPET)を含むRNA生成ベクターから得られた。単一のターミネーターを含む殆どのRNA生成ベクターは、検出可能なレベルのRNAを生成しなかった。特定の理論により制約されることは望まれずに、T7転写を停止させる単一のターミネーターによる障害は、乏しいRNA生成をもたらす。PETまたはrrn BT2単一ターミネーターを含むRNA生成ベクターは検出可能な量のRNAを生成したが、PET及びrrn BT2生成ベクターからの収量は、2つのターミネーターを含むRNA生成ベクター(それぞれ、16%及び40%)に比べて、かなり低かった。図10を参照されたい。
これらのターミネーターにより形成された二次構造は、CLC Main Workbench(version6.8.4)を使用して解析された。この二次構造の自由エネルギーも決定された。表5を参照されたい。図11に示すように、最も高いRNA生成の収量(PET、rrn BT2及びPTH;PET)を提供したターミネーターは、約10乃至20塩基対のステムを有するヘアピン構造である類似した二次構造を有する。RNA生成ベクターからの検出可能なRNA生成が殆どないまたは全くないRNA生成に関連するターミネーターは、転写を停止させるのに短過ぎるまたは長過ぎるヘアピンを有していた。他の単一のターミネーター構築物と比較して、最も高い収量を与えた2ターミネーター構築物PTH;PETは隣接する小及び中サイズのヘアピンを有することが、判明した。図11を参照されたい。
表5:二次構造の自由エネルギー
RNA収量に対する二次構造の効果の評価
RNA生成収量の比較が、同じRNA生成ベクターにクローニングされた異なる長さのヘアピンコード配列により行われた。
RNA収量に対するターミネーター数及び二次構造の効果
RNA生成収量の比較が、同じRNA生成ベクターにクローニングされた複数の異なるターミネーターにより行われた。
表6:複数のターミネーター
増加したRNA収量を提供する隣接するrrn BT2+PET+PTH+PETターミネーター
PTH+PET及びPET+rrn BT+PTH+PETターミネーターに対するRNA生成収量の比較が付加的な遺伝子について行われた。
増加したタンパク質収量を提供する隣接するrrn BT2+PET+PTH+PETターミネーター
タンパク質A(MW 21k)をコードするDNA配列は、pUC19−PETターミネーター、pUC19−rrn BT2ターミネーター、pUC19−PTH+PETターミネーター及びpUC19−rrn BT2+PET+PTH+PETターミネーターベクターにクローニングされた。プラスミドは、確認され、かつBL21(DE3)細胞に形質転換された配列である。発現プラスミドを含む細胞が選択され、続いて、カルベニシリンを有するLB培地において培養された。OD600が0.5に達したとき、1mM IPTGが各培養体に加えられた。細胞は、誘導の4時間後に回収された。総タンパク質は、2X SDS−PAGE負荷バッファー中で5分間、細胞を煮沸させることにより、細胞から単離された。5ulの各サンプルをSDS−PAGEゲルに負荷した。図16に示すように、pUC19−PTH+PET及びpUC19−rrn BT2+PET+PTH+PET発現プラスミドを含む細胞は、最も高い標的タンパク質の収量を生成した。
増加したRNA及びタンパク発現のための合成ターミネーター設計
rrn BT2+PET+PTH+PET終結配列(配列番号18)は、非ヘアピン形成配列及びヘアピン形成領域内の塩基対のミスマッチを除去するように改変され、その結果として得られる合成配列、すなわち、配列番号21が、ヘアピン形成領域においてミスマッチがない3つの隣接する中サイズのヘアピンを有する二次構造を形成するように、CLC Main Workbench(version6.8.4)により予測された。図17Bを参照されたい。配列番号21を含むDNAポリヌクレオチドが合成された。配列番号21を含むDNAポリヌクレオチドが、T7プロモーターの下流でpUC19ベクターにクローニングされた。
表7:合成ターミネーター
RNA収量の最適化−合成ターミネーター
宿主細胞は、対象のRNAをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターとの機能的組み合わせにおいて、配列番号21、22または23に記載されているような操作されたターミネーター配列を含む操作されたベクターにより形質転換される。プロモーターからの配列をコードするRNAの転写が誘導される。各操作されたターミネーター配列の終結効率が決定される。最も高い終結効率を示す操作された終結配列が選択される。隣接する中サイズのヘアピンが転写の速度を落とすまたは転写を停止して、ベクター配列の非生産的読み過ごしを最小化し、RNA収率を改善するように、操作されたターミネーター配列により形成された中サイズのヘアピンの数が増加するにつれて、RNA生成収量は増加する。
T3、SV40、SP6、T5、β−ラクタマーゼプロモーター、大腸菌プロモーター、アラビノースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター、ラクトースオペロン(lac)プロモーター、lacUV5プロモーター、trcプロモーター及びtacプロモーターからなる群から選択されるプロモーターとの機能的組み合わせを転写ターミネーター配列が形成するように、RNA生成のためのプラスミドベクターは、RNAコード配列、PET、PTH+PET、またはrrn BT2+PET+PTH+PET終結配列に対して位置3’に挿入することにより構築される。
Claims (34)
- a.プロモーター;
b.前記プロモーターの下流に転写的に位置付けられた第1の核酸配列であって、前記第1の核酸配列はdsRNAまたはタンパク質をコードする、前記第1の核酸配列;及び
c.前記第1の核酸配列に対して3’に位置付けられた第2の核酸配列であって、前記第2の核酸配列は、2つまたは3つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する、前記第2の核酸配列;
を含み、
前記第1の核酸配列及び前記第2の核酸配列は、前記プロモーターに作動可能に連結される;
操作された発現構築物。 - 前記第2の核酸配列は、少なくとも3つのヘアピンを含む二次構造を形成する、請求項1に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記ヘアピンの各々は少なくとも5塩基対を含む、請求項1または2に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記ヘアピンの各々は5乃至30塩基対を含む、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記ヘアピンの各々は9乃至18塩基対を含む、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記ヘアピンは、10個またはそれ未満のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される、請求項1乃至5のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記第2の核酸配列は、配列番号13、18及び21−23からなる群から選択される、請求項1乃至6のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記プロモーターはバクテリオファージプロモーターである、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記プロモーターは、T7、T3、SV40、SP6、T5、β−ラクタマーゼプロモーター、大腸菌ガラクトースプロモーター、アラビノースプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター、ラクトースオペロン(lac)プロモーター、lacUV5プロモーター、trcプロモーター及びtacプロモーターからなる群から選択される、請求項1乃至7のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
- 前記第1の核酸配列は、配列番号2、4、14、15及び20からなる群から選択される、請求項1乃至9のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物。
- 宿主細胞に対して請求項1乃至10のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物を提供することを含むRNA生成の改善方法。
- 前記宿主細胞は大腸菌HT115(DE3)細胞である、請求項11に記載の前記RNA生成の改善方法。
- 宿主細胞に対して請求項1乃至10のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物を提供することを含むタンパク質生成の改善方法。
- 前記宿主細胞はBL21(DE3)細胞である、請求項13に記載の前記RNA生成の改善方法。
- 前記ベクターはプラスミドベクターである、請求項1乃至10のいずれか一項に記載の前記操作された発現構築物を含むベクター。
- 請求項15に記載の前記ベクターを含む細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞はRNAse Aを発現しない、請求項16に記載の前記細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞は大腸菌細胞である、請求項16または17に記載の前記細菌宿主細胞。
- 請求項16乃至18のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞及び成長培地を含むdsRNAのインビボ合成のための細胞培養システム。
- 前記成長培地は、3.2%のトリプトン、2%の酵母エキス、0.5%のNaCl、1%のグリセロール、0.1%のグルコース、0.4%のアルファ乳糖、50mMの(NH4)2SO4、10mMのKH2PO4、40mMのNa2HPO4、2mMのMgSO4を含む、請求項18に記載の前記細胞培養システム。
- 前記細菌宿主細胞は死滅していて、かつ溶解されない、請求項16乃至18のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞を含む有害無脊椎動物侵入を制御する組成物。
- 請求項16乃至18のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞の溶解物を含む有害無脊椎動物侵入を制御する組成物。
- 植物に対して請求項21または22に記載の前記組成物を適用することを含む有害無脊椎動物侵入の制御方法。
- 前記細菌宿主細胞は死滅していて、かつ溶解されない、請求項16乃至18のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞を含む植物群におけるウイルス疾患の蔓延を阻止する組成物。
- 請求項16乃至18のいずれか一項に記載の前記細菌宿主細胞の溶解物を含む植物群におけるウイルス疾患の前記蔓延を阻止する組成物。
- 植物に対して請求項24または25に記載の前記組成物を適用することを含む植物群におけるウイルス疾患の前記蔓延の阻止方法。
- 2つまたは3つ以上のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を含む転写ターミネーター。
- 前記核酸配列は少なくとも3つのヘアピンを含む二次構造を形成する、請求項27に記載の前記転写ターミネーター。
- 前記ヘアピンの各々は5乃至30塩基対を含む、請求項27または28に記載の前記転写ターミネーター。
- 前記ヘアピンの各々は9乃至18塩基対を含む、請求項27乃至29のいずれか一項に記載の前記転写ターミネーター。
- 前記ヘアピンは、10個またはそれ未満のヌクレオチドを含むスペーサー領域により分離される、請求項27乃至30のいずれか一項に記載の前記転写ターミネーター。
- 前記ヘアピンの各々は、3つ未満の不対ヌクレオチドを有するステム領域を含む、請求項27乃至31のいずれか一項に記載の前記転写ターミネーター。
- 前記ヘアピンの各々は、不対ヌクレオチドを有しないステム領域を含む、請求項32に記載の前記転写ターミネーター。
- 前記核酸配列は、配列番号13、18及び21−23からなる群から選択される、請求項27に記載の前記転写ターミネーター。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019163827A1 (ja) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 味の素株式会社 | Rnaサイレンシングを誘導する方法 |
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Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
US9121022B2 (en) | 2010-03-08 | 2015-09-01 | Monsanto Technology Llc | Method for controlling herbicide-resistant plants |
US8916358B2 (en) | 2010-08-31 | 2014-12-23 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods for control of flux in metabolic pathways through protease manipulation |
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AR091143A1 (es) | 2012-05-24 | 2015-01-14 | Seeds Ltd Ab | Composiciones y metodos para silenciar la expresion genetica |
BR112015015975A2 (pt) | 2013-01-01 | 2018-11-06 | A. B. Seeds Ltd. | moléculas de dsrna isoladas e métodos de uso das mesmas para silenciamento das moléculas alvo de interesse. |
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US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
US9445603B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-09-20 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for the production and delivery of double stranded RNA |
US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
RU2703498C2 (ru) | 2013-07-19 | 2019-10-17 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Композиции и способы борьбы с leptinotarsa |
BR112016002494A2 (pt) | 2013-08-05 | 2017-09-05 | Greenlight Biosciences Inc | Proteí-nas construídas com um sítio de clivagem de protease, ácido nucléico, vetor, célula e processo de engenharia de uma proteína recombinante e de um grande número de variantes de ácidos nucleicos que codificam proteínas recombinantes |
AU2014341879B2 (en) | 2013-11-04 | 2020-07-23 | Beeologics, Inc. | Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations |
UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
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WO2016118762A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling leptinotarsa |
MX2017012665A (es) | 2015-03-30 | 2018-04-24 | Greenlight Biosciences Inc | Produccion de acido ribonucleico libre de celulas. |
UY36703A (es) | 2015-06-02 | 2016-12-30 | Monsanto Technology Llc | Composiciones y métodos para la administración de un polinucleótido en una planta |
WO2016196782A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants |
BR112017027260A2 (pt) | 2015-07-14 | 2018-08-28 | Transalgae Israel Ltd | microalgas transgênicas e uso das mesmas como uma alimentação para administração de moléculas de rna interferente |
CN105219796A (zh) * | 2015-09-29 | 2016-01-06 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 | 一种转录终止子及其在基因克隆中的应用 |
JP2018529386A (ja) * | 2015-10-05 | 2018-10-11 | シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー | リボ核酸の生物活性を保存する方法 |
EP3429336A4 (en) | 2016-03-15 | 2019-10-30 | Apse, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASED DOUBLE-STRAND RNA PRODUCTION |
EP4293104A3 (en) | 2016-04-06 | 2024-04-24 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
JP7186167B2 (ja) | 2017-01-06 | 2022-12-08 | グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド | 糖の無細胞的生産 |
WO2018134386A1 (en) | 2017-01-23 | 2018-07-26 | Novozymes A/S | Host cells and methods for producing double-stranded rna |
MX2019013997A (es) * | 2017-05-22 | 2020-07-29 | Pebble Labs Usa Inc | Regulacion transbiotica de expresion genica bacteriana. |
BR112020002689A2 (pt) | 2017-08-07 | 2020-08-25 | Pebble Labs Usa Inc. | sistemas e métodos para o controle de doença de necrose hepatopancreática aguda |
AU2018347405B2 (en) | 2017-10-11 | 2022-02-03 | Greenlight Biosciences, Inc. | Methods and compositions for nucleoside triphosphate and ribonucleic acid production |
CN108165559B (zh) * | 2017-11-29 | 2021-06-18 | 昆明理工大学 | 一种c2h2型转录因子基因及其应用 |
CN108570434A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-09-25 | 苏州博悦曼环保科技有限公司 | 高效降解餐厨垃圾的复合菌剂及其制造方法 |
CN113943764B (zh) * | 2021-12-20 | 2022-03-04 | 中国海洋大学 | 一种制备双链rna的方法 |
CN114774456A (zh) * | 2022-04-19 | 2022-07-22 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种营养缺陷型拟轮枝镰孢菌突变体构建方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012164100A2 (en) * | 2011-06-03 | 2012-12-06 | Sandoz Ag | Transcription terminator sequences |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100581990B1 (ko) * | 1997-07-01 | 2006-05-23 | 캄비아 바이오시스템즈 엘엘씨 | 척추 동물 텔로머라제 유전자 및 단백질과 이의 용도 |
DE19806872A1 (de) * | 1998-02-19 | 1999-08-26 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von Biotin |
CN101422167A (zh) * | 2004-04-09 | 2009-05-06 | 孟山都技术有限公司 | 用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法 |
US8853489B2 (en) * | 2005-09-16 | 2014-10-07 | Devgen Nv | Transgenic plant-based methods for plant pests using RNAi |
EP2426208B1 (en) * | 2005-09-16 | 2016-11-09 | Monsanto Technology, LLC | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
US9121022B2 (en) * | 2010-03-08 | 2015-09-01 | Monsanto Technology Llc | Method for controlling herbicide-resistant plants |
WO2012015938A2 (en) * | 2010-07-27 | 2012-02-02 | The Johns Hopkins University | Obligate heterodimer variants of foki cleavage domain |
EP2627768A4 (en) * | 2010-10-15 | 2014-04-02 | Univ Queensland | SMALL VIRAL RNA MOLECULES AND THEIR USE |
WO2012170433A1 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Sutro Biopharma, Inc. | Multiple rna polymerase terminator cassettes for efficient transcription of discrete rna templates |
US9445603B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-09-20 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for the production and delivery of double stranded RNA |
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012164100A2 (en) * | 2011-06-03 | 2012-12-06 | Sandoz Ag | Transcription terminator sequences |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
J. BIOL. CHEM., 2001, VOL.276, NO.45, P.41850-41855, JPN6017046014 * |
NUC. ACIDS RES., 2001, VOL.29, NO.17, P.3583-3594, JPN7017003981 * |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 1995, VOL.92, P.8793-8797, JPN6017046011 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020512007A (ja) * | 2017-03-28 | 2020-04-23 | 味の素株式会社 | Rnaの製造方法 |
WO2019163827A1 (ja) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 味の素株式会社 | Rnaサイレンシングを誘導する方法 |
JPWO2019163827A1 (ja) * | 2018-02-20 | 2021-02-18 | 味の素株式会社 | Rnaサイレンシングを誘導する方法 |
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Publication | Publication Date | Title |
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