JPWO2019163827A1 - Rnaサイレンシングを誘導する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する方法であって、
微生物の死菌体を対象生物に摂取させる工程を含み、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。
[2]
前記工程の前に、さらに、前記微生物の菌体を前記処理に供することにより前記死菌体を調製する工程を含む、前記方法。
[3]
前記死菌体を、前記RNAの量に換算して、10pg-RNA/個体〜10μg-RNA/個体の量で前記対象生物に摂取させる、前記方法。
[4]
対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物の製造方法であって、
前記微生物の菌体を有機溶媒による処理に供することにより死菌体を調製する工程を含み、
前記組成物が、前記死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。
[5]
前記有機溶媒が、アルコールである、前記方法。
[6]
前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、前記方法。
[7]
前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は30%(v/v)以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は50%(v/v)以上である、前記方法。
[8]
前記処理が、1分以上実施される、前記方法。
[9]
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、前記方法。
[10]
前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌またはエシェリヒア(Escherichia)属細菌である、前記方法。
[11]
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)またはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、前記方法。
[12]
前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、前記方法。
[13]
前記対象生物が、害虫である、前記方法。
[14]
対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物であって、
微生物の死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、組成物。
[15]
前記有機溶媒が、アルコールである、前記組成物。
[16]
前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、前記組成物。
[17]
前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は30%(v/v)以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は50%(v/v)以上である、前記組成物。
[18]
前記処理が、1分以上実施される、前記組成物。
[19]
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、前記組成物。
[20]
前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌またはエシェリヒア(Escherichia)属細菌である、前記組成物。
[21]
前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)またはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、前記組成物。
[22]
前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、前記組成物。
[23]
前記対象生物が、害虫である、前記組成物。
対象生物は、有効成分(すなわち本発明の死菌体)を摂取できるものであれば、特に制限されない。対象生物としては、害虫が挙げられる。害虫としては、農業害虫、貯穀害虫、衛生害虫、食品害虫、財産害虫、家畜害虫、不快害虫が挙げられる。
有効成分(すなわち本発明の死菌体)は、本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供することにより得られる。すなわち、本発明は、本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供する工程を含む、有効成分の製造方法を提供する。同工程を、「有機溶媒処理工程」ともいう。有機溶媒処理工程は、具体的には、本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供することにより有効成分を調製する工程であってもよい。
本発明の微生物は、有効成分(すなわち本発明の死菌体)を調製できるものであれば特に制限されない。有効成分は、目的RNAを含有する。よって、有機溶媒処理に供される菌体(すなわち本発明の微生物の菌体)は、目的RNAを含有する。したがって、本発明の微生物は、目的RNAの生産能を有する微生物である。本発明の微生物は、1種の目的RNAの生産能を有していてもよく、2種またはそれ以上の目的RNAの生産能を有していてもよい。同様に、有効成分および有機溶媒処理に供される菌体(すなわち本発明の微生物の菌体)は、いずれも、1種の目的RNAを含有していてもよく、2種またはそれ以上の目的RNAを含有していてもよい。
「目的RNAの生産能を有する微生物」とは、培地で培養したときに、目的RNAを発現し、RNAサイレンシング誘導効果が得られる程度に菌体内に蓄積する能力を有する微生物をいう。目的RNAの生産能を有する微生物は、例えば、1 mg/L-培養液以上、2 mg/L-培養液以上、5 mg/L-培養液以上、10 mg/L-培養液以上、20 mg/L-培養液以上、50 mg/L-培養液以上、または100 mg/L-培養液以上の量で目的RNAを菌体内に蓄積することができる微生物であってもよい。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
目的RNAは、RNAサイレンシング用のRNAである。「RNAサイレンシング用のRNA」とは、対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する(引き起こす)ことができるRNAをいう。目的RNAとしては、1種のRNAを利用してもよく、2種またはそれ以上のRNAを利用してもよい。また、1種の対象遺伝子に対して、1種の目的RNAを利用してもよく、2種またはそれ以上の目的RNAを利用してもよい。2種またはそれ以上の目的RNAを利用する場合、それら目的RNAは、単一の微生物により発現させてもよく、複数の微生物により発現させてもよい。
本発明の微生物は、リボヌクレアーゼIII(RNaseIII)の活性が低下するように改変されていてよい。本発明の微生物は、具体的には、リボヌクレアーゼIIIの活性が非改変株と比較して低下するように改変されていてよい。リボヌクレアーゼIIIの活性は、例えば、非改変株の、50%以下、20%以下、10%以下、5%以下、または0%に低下してよい。すなわち、本発明の微生物は、例えば、リボヌクレアーゼIIIの活性が欠損(消失)するように改変されていてもよい。リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように微生物を改変することにより、同微生物の目的RNAの生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物による目的RNAの生産を増大させることができる、と期待される。
<2−2−1>培養
本発明の微生物を培養することにより、本発明の微生物の菌体が得られる。
本発明の微生物の菌体を有機溶媒処理に供することにより、有効成分(すなわち本発明の死菌体)が得られる。
本発明の組成物は、有効成分(すなわち本発明の死菌体)を含有する組成物である。
本発明の方法は、有効成分(すなわち本発明の死菌体)を対象生物に摂取させることを含む方法である。
また、本発明は、上記のような用途での有効成分の使用を提供する。すなわち、本発明は、例えば、RNAサイレンシング誘導、対象生物の活動の抑制、対象生物の駆除、または対象生物による害の防除のための有効成分の使用や、RNAサイレンシング誘導用、対象生物の活動の抑制用、対象生物の駆除用、または対象生物による害の防除用の組成物の製造のための有効成分の使用を提供する。
C. glutamicum 2256株(ATCC13869株、以降、2256株とだけ記すこともある)のリボヌクレアーゼIII(RNaseIII)ホモログ遺伝子(以降、rnc遺伝子と記す)の破壊株を以下のようにして作製した。
2256株は、内在性プラスミドとしてpAM330を有する(Yamaguchi, Ryuji, et al. "Determination of the complete nucleotide sequence of Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and analysis of its genetic information." Agricultural and biological chemistry 50.11 (1986): 2771-2778.)。pAM330とエシェリヒア・コリ用汎用ベクターであるpHSG399(TAKARA BIO製)とのコンポジットプラスミドpVC7(特開1997-070291)にsacB遺伝子を搭載したpVC7-sacBを作製した。具体的には、pBS4Sプラスミドを鋳型として、配列番号9と配列番号10のプライマーを使用し、PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseにてPCR増幅し、sacB遺伝子の増幅断片を得た。また、pVC7プラスミドを鋳型として、配列番号11と配列番号12のプライマーを使用し、KOD FX NEO(TOYOBO製)にてPCR増幅し、pVC7ベクターの増幅断片を得た。このようにして得た増幅断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック製)使用して互いに連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル(TAKARA BIO製)を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離した。こうして得られた形質転換体から常法によりプラスミドDNAを抽出し、DNA配列の解読により目的とするプラスミドを確認し、これをpVC7-sacBと命名した(図2)。2256Δrnc株にpVC7-sacBを電気パルス法により導入し、クロラムフェニコール5μg/mlを含むCM-Dex寒天培地に塗布し30℃で一晩培養後、2256Δrnc/pVC7-sacB株の形質転換体を複数個取得した。続いて、それらの株をCM-Dex培地で一晩培養し、さらに、これらの株をDex-S10寒天培地に塗布して、30℃にて一晩培養することで、pVC7-sacBが脱落しスクロース非感受性となった2256ΔrncΔpAM330株を取得した。
プラスミドpVC7(特開1997-070291)において、pVC7の全塩基配列6679 bpのうち、1172番目(制限酵素HindIIIの切断認識部位の5’末端から2つ目の塩基Aを+1とする)の塩基をシトシン(C)からグアニン(G)に置換することで、pVC7H2を取得した。なお、pVC7H2は、KOD -Plus- Mutagenesis Kit(東洋紡社製)を用いて作製した。具体的には、プラスミドpVC7を鋳型とし、上記キットに添付の作成プロトコルに従い、配列番号13及び配列番号14のプライマーを用いることでpVC7H2を作成した。pVC7H2を、常法に従い2256ΔpAM330株へ形質転換した。選択培地はクロラムフェニコール(5 μg/ml)を含むCM-Dex培地を使用した。その結果、コロニーは良好に形成し、そのコロニーを、クロラムフェニコール(5mg/L)を含むCM-Dex液体培地に加え、30℃にて終夜振とう培養した。その培養液より常法に従い、保持するプラスミドを抽出し、その調製したプラスミド溶液の一部をアガロース電気泳動にかけ、プラスミドのDNAバンドを調べたところ、pVC7H2は、高コピー数を示した。
目的RNAとしてHv-iap RNAをF1プロモーターの制御下で双方向に発現するプラスミドpVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1revを以下の手順で構築した。
上記の実施例で作成したプラスミドpVC7H2とpVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1revを、それぞれ上記の実施例に記載した方法で、C. glutamicum 2256ΔrncΔpAM330株へ導入し、形質転換体を取得した。そして、これらの形質転換体を5 μg/mlのクロラムフェニコールを添加したCM-Dex培地で24時間振盪培養した。その後、その培養液から一部を抜き取り、107倍に希釈し、CM-Dex寒天培地へ撒くことで、上記の培養液に含まれる生菌数を計測した。その結果、生菌数は4.4x109個/mLと判明した。次に、上記の培養液0.2mLを遠心し、菌体を集菌した。その菌体へ、表1に記載の各濃度のエタノールを含む10 mMリン酸バッファー(pH6.8)1mLを添加し、よく混合することで菌体をエタノール処理した。すなわち、エタノール処理開始時の生菌体濃度は約109個/mLであった。なお、処理温度と処理時間は、室温(約25℃)で10分間とした。処理後の菌体懸濁液を遠心(12,000rpm, 2分間)し、上清を除いたのち、そこへ0.2mLのCM-Dex培地を加えて菌体を懸濁した。その懸濁液0.1mL(生菌数として約4x108個)をCM-Dex寒天培地へ撒き、生育を確認した。
実施例<5>と同様に、10%〜95%濃度(v/v)メタノール/10 mMリン酸バッファー(pH6.8)を用いてコリネ型細菌菌体を処理し、コリネ型細菌の生存率と目的RNAの蓄積量を評価した。
実施例<5>で得た培養液0.2mLを無菌的にエッペンドルフチューブへ入れて、遠心して得た菌体を1 mlの10 mMリン酸バッファー(pH6.8)で懸濁し、10分間静置した。それを再度遠心して得た菌体を、100℃に設定したヒートブロックで30分間、加温することで殺菌処理を行った。殺菌処理後の菌体に0.2mLのCM-Dex培地を加えて菌体を懸濁し、その0.1mL分をCM-Dex寒天培地へ撒いたところ、寒天培地上には一つもコロニーは形成しなかった。すなわち、生菌率としては少なくとも10-8以下となった。このことから、100℃で30分間の加熱処理にて本コリネ型細菌菌体は事実上完全に死滅することが判明した。こうして、加熱滅菌した目的RNA含有菌体を調製した。
実施例<5>および<6>で調製した各アルコールの濃度(v/v)が80%の条件で処理を行った菌体と、実施例<7>で調製した熱処理(100℃、30分間)を行った菌体を用いて、ニジュウヤホシテントウへの投与試験を実施した。すなわち、Hv-iap生産菌としては、2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2-Pf1-Hv-iap-Pf1rev株を用いた。また、対照区として、Hv-iapを生産しないベクターのみを導入した2256ΔrncΔpAM330/pVC7H2株を用いた。それぞれの処理後の菌体内のRNAを非変性PAGEで評価した結果、熱処理と比較してエタノール処理およびメタノール処理では目的RNAであるHv-iapのRNAバンドが明確に見られ、Hv-iapが菌体内に安定に保持されていることが確認できた(図7)。
目的RNAとしてHv-iap RNAをT7プロモーターの制御下で双方向に発現するプラスミドpL4440-Pt7-Hviap-Pt7revを以下の手順で構築した。
pVC7を鋳型とし配列番号32と配列番号33のプライマーを使用し、KOD FX NEO(TOYOBO製)にてPCR増幅し、pVC7のDNA断片を得た。次に、[T7プロモーター領域-KpnI制限酵素サイト-XhoI制限酵素サイト-逆向きT7プロモーター領域]を含むDNA断片取得のため、配列番号34と配列番号35のDNA断片を合成しアニーリングした。両DNA断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック製)にて連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル(TAKARA BIO製)を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7revと命名した。
ニジュウヤホシテントウ由来のアポトーシス阻害因子IAPをコードするiap遺伝子由来cDNAの部分配列であるHv-iap(配列番号15)のDNA断片を鋳型として、配列番号36と配列番号37のプライマーを使用し、KOD FX NEO(TOYOBO製)にてPCR増幅し、[KpnI制限酵素サイト-Hv-iap配列-XhoI制限酵素サイト]を含むDNA断片を得た。そして、本DNA断片とpVC7-Pt7-KpnI-XhoI-Pt7revのそれぞれを制限酵素KpnI及びXhoIで切断し、MinElute PCR Purification Kit(キアゲン製)で精製した。両精製物を混合し、Ligation high Ver.2(TOYOBO製)でライゲーション反応を実施することで、両DNA断片を連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル(TAKARA BIO製)を形質転換し、クロラムフェニコール25μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpVC7-Pt7-Hviap-Pt7revと命名した。
プラスミドL4440(US2017-0137841)を鋳型とし、配列番号38と配列番号39のプライマーを使用し、KOD FX NEO(TOYOBO製)にてPCR増幅し、DNA断片を得た。また、プラスミドpVC7-Pt7-Hviap-Pt7revを鋳型とし、配列番号40と配列番号41のプライマーを使用し、KOD FX NEO(TOYOBO製)にてPCR増幅し、DNA断片を得た。両DNA断片を混合し、In-Fusion HD Cloning Kit(クロンテック製)にて連結した。次に、この反応溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109株のコンピテントセル(TAKARA BIO製)を形質転換し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し、得られた形質転換体から常法によりプラスミドを抽出した。DNA配列決定により目的とするプラスミドであることを確認し、これをpL4440-Pt7-Hviap-Pt7revと命名した。
プラスミドpL4440-Pt7-Hviap-Pt7revをE. coli HT115(DE3)株(GE Healthcare Dharmacon社)へ導入し、形質転換体pL4440-Pt7-Hviap-Pt7rev/HT115(DE3)を取得した。この形質転換体を100μg/mLのアンピシリンを添加したLB培地で37℃、120rpmで振盪培養した。培養開始の約3時間後に培養液のOD660が0.5付近になった時点でIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)を終濃度1mMになるように添加し、更に3時間培養した。その培養液から一部を抜き取り、LB培地にて104倍に希釈し、この希釈液の0.1mLをLB寒天培地へ撒くことで、この培養液に含まれる生菌数を計測した。その結果、生菌数は約2 x 107個/mLと判明した。次に、この菌体に対してエタノール処理を施した。エタノール処理は、培養液5.6mLから遠心分離により集菌した菌体に80%のエタノールを含む10mMリン酸バッファー(pH6.8)を5.6mL添加し、よく混合したのち、室温(25℃)で10分間静置することで実施した。その後、遠心分離によりエタノール処理菌体を回収した。
実施例<10>で調製したエタノール処理した各菌体サンプルに50 μlの蒸留水を加え懸濁することで、各々の菌体懸濁液を調製した。そして、この菌体懸濁液0.5 μlをニジュウヤホシテントウの3齢幼虫に経口にて摂取させた。また、対照区としては、水のみをニジュウヤホシテントウの3齢幼虫に摂取させた。すなわち、実験区は、表4に示す3つの区とし、各実験区について幼虫を5匹用いた。上記の試料(菌体懸濁液または水)を摂取させた後、幼虫を摂食用の芋葉に移した。24時間後に、新たな芋葉へ各実験区の幼虫を移し、摂食させた古い芋葉を回収した。さらに24時間後(試料摂取の48時間後)に、摂食させた芋葉を回収した。0〜24時間と24〜48時間での幼虫による芋葉の摂食の程度を測定し、それぞれ、「24時間後」と「48時間後」の摂食のデータとした。
配列番号1〜14:プライマー
配列番号15:Hv-iapの塩基配列
配列番号16:F1プロモーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号17:F1プロモーターの塩基配列
配列番号18〜29:プライマー
配列番号30:C. glutamicum 2256(ATCC 13869)のrnc遺伝子の塩基配列
配列番号31:C. glutamicum 2256(ATCC 13869)のRncタンパク質のアミノ酸配列
配列番号32〜41:プライマー
Claims (23)
- 対象生物においてRNAサイレンシングを誘導する方法であって、
微生物の死菌体を対象生物に摂取させる工程を含み、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。 - 前記工程の前に、さらに、前記微生物の菌体を前記処理に供することにより前記死菌体を調製する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記死菌体を、前記RNAの量に換算して、10pg-RNA/個体〜10μg-RNA/個体の量で前記対象生物に摂取させる、請求項1または2に記載の方法。
- 対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物の製造方法であって、
前記微生物の菌体を有機溶媒による処理に供することにより死菌体を調製する工程を含み、
前記組成物が、前記死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、方法。 - 前記有機溶媒が、アルコールである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は30%(v/v)以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は50%(v/v)以上である、請求項6に記載の方法。
- 前記処理が、1分以上実施される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌またはエシェリヒア(Escherichia)属細菌である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)またはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象生物が、害虫である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 対象生物におけるRNAサイレンシング誘導用の組成物であって、
微生物の死菌体を含有し、
前記微生物が、RNAサイレンシング用のRNAの生産能を有し、
前記死菌体が、有機溶媒による処理に供されており、
前記死菌体が、RNAサイレンシング用のRNAを含有する、組成物。 - 前記有機溶媒が、アルコールである、請求項14に記載の組成物。
- 前記有機溶媒が、エタノールまたはメタノールである、請求項14または15に記載の組成物。
- 前記処理の際の前記有機溶媒の濃度が、該有機溶媒がエタノールである場合は30%(v/v)以上であり、該有機溶媒がメタノールである場合は50%(v/v)以上である、請求項14〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記処理が、1分以上実施される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、請求項14〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌またはエシェリヒア(Escherichia)属細菌である、請求項14〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)またはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項14〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記微生物が、非改変株と比較して、リボヌクレアーゼIIIの活性が低下するように改変されている、請求項14〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記対象生物が、害虫である、請求項14〜22のいずれか一項に記載の組成物。
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