JPS58192900A - 複合プラスミド - Google Patents

複合プラスミド

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JPS58192900A
JPS58192900A JP57074845A JP7484582A JPS58192900A JP S58192900 A JPS58192900 A JP S58192900A JP 57074845 A JP57074845 A JP 57074845A JP 7484582 A JP7484582 A JP 7484582A JP S58192900 A JPS58192900 A JP S58192900A
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JP
Japan
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plasmid
complex
glutamic acid
coryneform
host
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JP57074845A
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English (en)
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Kiyoshi Miwa
清志 三輪
Masato Terabe
寺部　真人
Koichi Ito
宏一 伊藤
Masaaki Ishida
雅昭 石田
Kazuhiko Matsui
和彦 松井
Shigeru Nakamori
茂 中森
Takanosuke Sano
佐野　孝之輔
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Publication date
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、複合プラスミドに関し、特に、コリネホル
ム・グルタミン酸生産菌を宿主とする複合プラスミドに
関する。
コリネ本生産０グルタミン酸生産画は大量のし一グルタ
ミン酸を生産することが知られていて、またその変異株
はリジン等のアミノ酸、イノシン酸等のプ替ンヌクレオ
チＦを生産するものが知られていて、工業的に有用な微
生物である。一方、最近ＤＮＡ組換え技術による工業微
生物の育種、改良がエシェリヒア・コリ等により試みら
れているが、コリネホルム・グルタミン酸生産菌（つい
ては、これらの微生物を宿主とするに適したペタターが
開発されておらず、ＤＮＡ組換え（よるコリネホルム番
グルタミン酸生産菌の育種、改良の妨げとなっていた。
本発明者らはこのような背景【おいて、コリネホルム・
バクテリアに適したベクターを開発スべく鋭意研究し、
つい【、ベクターとして用いるのに適した、あるいはベ
クターとして加工するに適したプラスミドである儀つか
のプラスミドをコリネホルム・グルタミン酸生産菌より
分離することに成功した。具体的にはブレビバクテリウ
ム−ラクトファーメンタムより分離されたｐＡＭ３３Ｇ
及びコリネバタテリウム嗜グルタミヵムより分ｍされた
ｐＡＭ２８６及び９８Ｍ１５１９がある。　また金子ら
【より（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｍ、ｔ　　
ロ。
８６７（１Ｇ７Ｑ））ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムから分離された分子量３７メガダルトンのプ
ラスミドが知られている。
しかるに、これらコリネホルム・グルタミン酸生産菌よ
り分離されたプラスミドはいずれも、プラスミドを識別
しうる特定の遺伝形質が見い出されていないので、それ
らのプラスミド自体、あるな いは他の選択困難−遺伝子が組み込まれているプラ、ｘ
ｉドな含有する微生物を選別することが困難である。従
って、これらのプラスミドは、遺伝子組換えによる育種
のために用いるベクターとしては不適当である。更に、
これらのプラスミＦは、よく研究がなされ、性質がよく
わかっていてかつ安全であることが確認されているエシ
ェリヒア・ブリするいはバチルス・ズブチリスＭ株を宿
主として増殖でかないので、これらの宿主菌を用いてこ
れらのプラスミドまた゛は、これらプラスミドに他９遺
伝子を組込んだプラスミドをこれらの宿主菌内で増巾せ
しめたり、目的とするプラスミドを選別したりすること
ができない。
本発明者らは、叙上のような状況下においてこれらコリ
ネホルム・グルタミン酸生産菌より得られたマルチコピ
ープラスミドのドライブユニットと、エシェリヒア・コ
リの薬剤゛耐性の遺伝情報を有スるマルチコピープラス
ミド又は、バチルス。
ズブチリスの薬剤耐性の遺伝清報を有するマルチコピー
プラスミドのドライブユニット及び薬剤耐性遺伝子とを
組合せて複合プラスミドを得ることニ成功した。この複
合プラスミドはコリネホルム・グルタミン酸生産菌とエ
シェリヒア・コリ又は、ｚ：　＋　４　Ｘ・３ズブチリ
スの両者を宿主とすることができる。コリネホルム轡グ
ルタミン酸生産菌を宿主したときは、薬剤耐性を発現す
るので、コリネｄｓｋｉ・／４タミン酸生産菌を宿主と
するプラスミドベクターとしては好適である。
即ち、この発明はコリネホルム・グルタミン酸生産菌よ
り得られるマルチコピープラスミドであるプラスミド（
ａ）と、エシェリヒア・ブリを宿主として増殖し、薬剤
耐性を遺伝情報として持っているマルチコピープラスミ
ド、又はバチルス１ズブチリスを宿主として増殖し薬剤
耐性の遺伝情報を有しているマルチコピープラスミドで
あるプラスミド（ｂ）とからなり、少なくともプラスミ
ド（ａ）のドライブユニットとプラスミド（ｂ）のドラ
イブユニット１、及び薬剤耐性に関餐する遺伝情報とを
有してぃる複合プラスミドである。
「マルチコピープラスミド」は通常の定１１に従って用
いられる。即ち、宿主細胞内にてプラスミド数が複数個
となりうるものをいう。
「薬剤耐性」も通常の定義に従って用いられ、抗生物質
その他の薬剤による生育阻害に対する耐性を意味する。
「ドライブユニット」は、プラスミドの増殖を司どる遺
伝子領域を意味する。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、好気性、無胞子
、非抗酸性、グラム陽性、不定性の桿菌である、所謂コ
リネホルム・バクテリアの内のグルタミン酸を多量に生
産するものであり、以下【その一部を具体的に例示する
。
ブレビバクテリウム・７ンそニアゲネス　　　　ＡＴＣ
Ｃ１３フ４５ブレビバクテリウム・デイバリカタム　　
　　　ＡＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラバ
ム　　　　　　　　ＡＴＣＣ１３８２６プレビパクテリ
ウム・イマリオフイラム　　　　ＡＴＣＣ１４０６ｇブ
レビバクテリウム・ケトグルタミクム　　　　ＡＴＣＣ
１５８Ｂ？プレビバクテリウム−ラクトフッ−メンタム
　　ＡＴＣＣ１３８１５・ブレビバクテリウム＠−ゼウ
ム　　　　　　　　ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリ
ウム争サツカｐリテイカム　　　ＡＴＣＣ１４０６６プ
レビパクテリウム弗チオゲニタリス　　　　　ＡＴＣＣ
１９２４０コリネバクテリウム吻ア七トアシドフイラム
　　ＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・アセトグ
ルタミヵム　　　ＡＴＣＣ１５８０６コリネパタテリウ
ムｅアルカノリテカム　　　　ＡＴＣＣ２１５１１コリ
ネバクテリウム・カルナエ　　　　　　　　ＡＴＣＣ１
５１１コリネバクテリウム・グルタミクム　　　　　　
ＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウム・ハイドロカー
ボタラスメスＡＴＣＣ１６６９２コリネバクテリウム−
リリウム　　　　　　　　　ＡＴＣＣ１５９９Ｇコリネ
バクテリウムリラセコラ　　　　　　　ＡＴＣＣ１７９
６６ミクｐパクテリウ五番７７七エアフィラム　　　Ａ
ＴＣＣ１６３５４アルスーバクター・シトレウス　　　
　　　　　ＡＴＣＣ１７７７６アルスロバクター命バラ
フイネウス　　　　　　＾ＴＣＣ１９０６４アルスロバ
クタ−働シンプレッタス　　　　　　ＡＴＣＣｌ　６７
９９フリネホルム・グルタミン酸生産菌には、上記野性
株のはか、これらの野性株から誘導した変異株、グルタ
ミン酸生産能を失った菌株、更にアミノ酸、有機酸、プ
リン塩基、プリンヌクレオシド、チ プリンヌクレオシド、その他の生産性を獲得した菌株も
含まれる。
複合プラスミドのいずれかの位置に外来遺伝子が挿入さ
れれば、その外来遺伝子の遺伝情報を宿主であるコリネ
ホルム・グルタミン酸生産菌細胞内で発現せしめること
ができ、これら宿主微生物の遺伝形質を変換せしめるこ
とができる。
本発明の複合プラスミドの材料となるコリネホルム・グ
ルタミン酸生産菌より得られるマルチコピープラスミド
を具体的に例示すれば、以下のものがある。
ｐＡＭ３３０　　：分子量は３０メガダルトン（アガー
−スゲルミ気泳動法、及び電子顕微鏡観察（よる）であ
り、各種制限酵素に対する感受性は第１表に示すとおり
であや、制限酵素切断地図は第１図に示すとおりである
。第１図の制限酵素切断地図は全長を１００とし、Ｈ４
ｎｄ　Ｉ切断位置を◎の位置（定めて表わした。
プラスミドｐＡＭ３３０　　は、ブレビバクテリウム−
ラクト７７−　）　ンタＡＡＴＣＣ１３８６＋１　ｊ’
）、分離、精製できる。
第　　１　　表 制限酵素　　　　　由　　　　　　米　　　　　切断数
（Ｂａｃｉ　ｌｌｕ＠ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｊｅ
ｎ＠）　Ｈ）Ｂｃｌ　　Ｉ　　Ｃバチルス・カルトリテ
ィクス　　　　　１（Ｂａｃｉｌｌｕ＠　ｃａｌｄｏｌ
ｙｔｉｃｕａ　　）　　）（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ＠ａ
ｅｇｙｐｔｉｕｓ＋　）　）旧ｎｄｌ（同　　　　　　
　上　　　　）　　　ｌ制限酵素　　　　　由　　　　
　　来　　　　　　切ＩＩＦＩｌｋ（Ｐｒｏｔｅｕｓ　
ｖｕｌｇｍｒｉｓ　）　）Ｓａｃｌ（ストレプトミセス
・アタリそゲネス　　　Ｏ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｉ
　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　）　）ｓａｉｌ（ストレ
プトミセス・アルプス　　　　　０（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅ＠ａｌｂｕｍ　）　）（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
　ｂａｄｙ％％）〕Ｘｈｏｌ（キサントモナ７−１１ホ
リプーラ　　　　　ｌ（Ｘｍｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｂｏ
ｌｉｃｏｌｍ　）　）（Ｘｍｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒ
ｙｇａｅ　）　）ｐＡＭ２８６　　：分子量は３．θメ
ガダルトン（アガー−スゲルミ気泳動法、及び電子顕微
鏡観察ｔこよる）であや、各種制限酵素に対する感受性
は第２表に示すとおりであり、制限酵素切断地図は第２
図に示すとおりである。第２図の制限酵素切断地図は全
長を１００とし、Ｂｉｎｄ■　切断位置を００位置【定
めて表わした。
プラスミドｐＡＭ２８６は、コリネバクテリウム・グル
タミクム＾Ｊ１１６６０．ＦＥＲＭ−Ｐ５４８５より、
実施例２Ｃ記載された方法により、分離、精製できる。
第　　２　　表 制限酵素　　　　　由　　　　　来　　　　　切断数Ａ
ｌｕｌ（アースロパクター拳ルテウス　　　　≧４（入
ｒｔｂｒｏｂａｃｔ＠ｒ　　１ｕｔｅｕａ　））Ａｖｍ
ｌ（アナペナ・パリアビリス　　　　　　≧２（＾ｎａ
ｂｅｎａ　　ｖａｒｉｓ＋ｂｉｌｉａ　　）　　）制限
酵素　　　　　由　　　　　　来　　　　　　切断数Ｂ
ｇ１１（バチルス争グービジィ　　　　　　　　Ｏ（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｇｌｏｂｉｇｉｉ　）　）（Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ　ａｅｇｙｐｔｉｕｓ　）　）Ｈ４ｎｄ
ｌ（同　　　　　　上　　　　　〕　　　ｌ制限酵素　
　　　　由　　　　　　来　　　　　切断数ｐＨＭ１５
１９：コリ本バタテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３
０５！ｌより、分離されたものであり、分子量１．８メ
ガダルトンである。
各１１１１１１酵素に対する感受性は第３表に示すとお
りであり、制限酵素切断地図は第３図に示すとおりであ
る。
第　　３　　表 制限酵素　　　　　由　　　　　　来　　　　　切断数
ｓｇｔＵ（バチルス・グロビジイ　　　　　　　　ｌ（
Ｂａｃｉｌｌｕａ　ｇｌｏｂｉｇｌｉ　）　）制限酵素
　　　　　由　　　　　来　　　　　切断数ｘｂａｌ（
キサントモナス・バドリ　　　　　　　０（Ｘａｎｔｈ
ｏｍｏｎａａ　ｂａｄｒｉｉ　）　）Ｘｈｏｌ（キサン
トモナス・ホリコーラ　　　　　０（Ｘａｎｔｈｏｍｏ
ｎａａ　ｈｏｌｉｅｏｌａ　）　）エシェリヒア・プリ
を宿主とし、薬剤耐性を遺伝情報として有するマルチコ
ピープラスミドとしては、例えば、以下のものがある。
ｐＡｃ１０６、Ｒ９Ｆ２１２４、ｐｃＲ１％ｐＭＢ９、
ｐＢＲ３１３、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２４、ｐＢＲ３
２５、ｐＢＲ３２？、ｐＢＲ３２８、ｐＫＹ２２８９、
ｐＫＹ２７００．ｐＫＮ８Ｇ、ｐＫＣ７、ｐＫＢ１６８
、ｐＭＫ２Ｇ０４、ｐＡｃＹｃ１？？、ｐＡｃＹｃ１８
４（木材、島田、蛋白質、核酸、酵素２６＊　　４３５
（ｔ＊ｓｔ）参ｊｌ）。
バチルス・ズブチリスを宿主とし、薬剤耐性を遺伝情報
として有するマルチコピープラスミドとしては例えば以
下のものがある。
ｐＴ１２７．ｐｃ目Ｉ％ｐＣ２２１、ｐＣ２２３、ｐＵ
Ｂ１１２、　ｐＵＢ１１Ｇ％　ｐｓＡＯ５０１％ｐＳＡ
２１０Ｇ、ｐＥ１９４、ｐＴＰ４、ｐ’ｒｐｓなと（魚
住、植針、蛋白質、核酸、酵素１見、　４６４（１１ｉ
１８１）参照）。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌のマルチコピープラ
スミドとニジ菰すヒア・プリ又はバチルス・ズブチリス
のマルチコピープラスミドより複合プラスミドを調製す
る方法は、通常の方法（より行なうことができる。例え
ば、各々のプラスミドを同一の制限酵素又は、切断点に
おいて相補的な塩基配列をもしくは等長２本鎖ＤＮＡ（
プラントエンド）を生成せしめるような制限酵素で切断
し、又はせん断力で２本鎖り、ＮＡを切ったのち、ター
ミナルトランスフェラーゼで相補的な１本鎖オリゴヌク
レオチドを付加したのち、それらを９ガーゼで連結せし
める。コリネホルム・グルタミン酸生産菌のマルチコピ
ープラスミドの切断程度については、ドライブユニット
以外の部分が少ない断片を得るのが望ましいので、消化
程度が異なるように、反応時間を巾広く変化せしめるの
がよい。エシェリヒア・ツリ又はバチルス・ズプチｌレ
スのマルチコピープラスミドについてもドライブユニッ
ト及び薬剤耐性の遺伝情報以外の部分が少ない方が望ま
しいので反応時間を巾広く変化せしめた方がよい。尚、
エシェリヒア・コリ又はバチルス・ズプチルスのマルチ
コピープラスミドの切断１個所がｌである場合には完全
消化であってもよい。
又、適当な制限酵素でコリネホルム・グルタミン酸生産
面のマルチコピープラスミド及びニジ峯すヒア・プリ又
はバチルス・ズブチリスのマルチコピープラスミドを切
断した後、必要によりエキソヌクレアーゼで処理した後
、切断点においてターミナルトランフェラーゼ、もしく
はリンカ−を用いて相補的な塩基配列を生成せしめ、両
者を７ニーリングすることにより複合プラスミドを調製
することができる。
本発明の複合プリスミＦの宿主としてはコリネホルム・
グルタミン酸生産菌エシェリヒア・プリ及びバチルス・
ズブチリスの制限系酵素欠失株が望ましいが、実験上の
多少の不便を忍べば、どのような菌株でもよく、また、
これら微生物ψ変異株であってもよい。またプリネホル
ムダルタミン酸生産菌より誘導されたアミノ酸、核酸塩
基、プリンタクレオチド、プリンヌクレすシト、有機酸
等の生産菌であってもよい。
複合プラスミドをこれら宿主細胞内へ移入する方法とし
ては、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２で報告されているよ
う【低温のもとで菌を塩化カルシウムで処理して菌膜の
透過性を増大せしめ、プラスミドを移入する方法（Ｍａ
ｎｄａｔｅ　Ｍ　ａｎｄ　Ｈｉｇａｌ　Ａｅｌ　Ｊ、　
Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、、５３．’　　１６９（１９７０））、枯草
菌で報告されているように増殖のある段階で自然にプラ
スミドを取り込みやすくなること（いわゆるフンピーテ
ントな状Ｉｌ）を利用して、プラスミドを移入する方法
（Ｄｕｎｃａｎ＋　Ｃ，Ｈ，ｌ　Ｗｉｌｓｏｎ＋　Ｇ、
　Ａ、　ａｎｄＹｏｕｎｇ＋　　Ｆ、　　Ｅ、＋　　Ｇ
ｅｎｅ＋　　工、　　　　１６３（１９７？））更には
枯草菌、放線菌、酵母の報告にあるように細胞ヲプロト
プラスト又はスフニーブラストにしてプラスミドを移入
する方法（Ｃｈａｎｇｅ　Ｓ　ａｎｄＣｏｈａｎ、Ｓ、
Ｎ、＋　　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、＋　　　
１　６８　　＋１１１（’１９７９）；Ｂ＋ｂｂ＋Ｍ、
Ｊ、、Ｗａｒｄ、ＪｌＭ。
ａｎｄ　Ｉ（ｏｐｗｏｏｄ、Ｄ、　　Ａｅｌ　　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　　２７４　　＋　　　３９８（１９７８）；
　Ｈｉｎｎｅｎ＋　Ａ、Ｉ　Ｈｉｃｋａ＋　　Ｊ、Ｂ、
ａｎｄＦｉｎｋ＋　　Ｇ、　　Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、＋　　ＵＳＡ＋１互、　　
１９１９（１９７８）遵が知られている。
コリネホルム・グルタミン酸生産菌のマルチコピープラ
スミドのドライブユニットを有する複合プラスミドを選
択する方法はプリネホルム拳グルタミン酸生産菌な宿主
として増殖できるプラスミドを分離すればよい。又、エ
シェリヒアφコリ又はバチルス・ズブチリスのマルチコ
ピープラスミドの薬剤耐性遺伝情報とドライブユニット
を有する複合プラスミドを選別する方法はエシェリヒア
・コリ又はバチルス・ズブチリスを宿主として増殖せし
め薬剤耐性を発現するようなプラスミドを選別すればよ
い。
本発明の複合プラスミドは上記のようにコリネホルム・
グルタミン酸生産菌を宿主としてよく増殖するので、こ
のプラスミドのドライブユニット以外のいずれかの位置
に他の遺伝子が挿入されれば、その遺伝子が有する遺伝
清報を宿主微生物内で発現せしめることができる。
実施例１ エシェリヒア・コリのプラスミドｐＢＲ３２６とブレビ
バクテリウム・ラクトフェルメンタムのプラスミドｐＡ
Ｍ３３０　　を連結した複合プラスミドｐＡＪ６６５を
以下のように調製した。
１）プラスミドｐＢＲ３２６ プラスミドｐＢＲ３２５は分子量３．６メガダルトンで
エシェリヒア・コリにテトラサイクリン耐性（Ｔｃｒ）
、アンピシリン耐性（Ａｐ’　）、タロラムフェニコー
ル耐性（Ｃｍ’）の性質な餐えるプラスミドである（　
Ｂｏｌｉｖｒｖ、　Ｆ、　Ｇｅｎｅ＋　　１１ｚｔ１９
７ｇ））。本例では市販品（ペセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリイ社製）をメーカーの指示に従って使用した。
２）プラスミドｐＡＭ３３０ ｐＡＭ３３Ｇ　　を保有するブレビバクテリウム・ラク
トフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９を１ｔのＣＭＧ培
地（純水１１ＣペプトｙｌＯｆ、酵ｆｆ１−キス１０９
％ＮｉＣ１５ｔ１グル：２−ｙ、５ｔを含み、ｐＨを７
．２に調整したもの）に接種し、３０Ｃで対数後期まで
培養したのちリゾチームＳＤＳ処理により溶菌せしめ、
３０，０００Ｘｆ。
３０分の遠心分離により上清を得た。この上清にポリエ
チレングリコールを添加してプラスミドＤＮＡを沈澱、
濃縮後、アガロース電気泳動法により最終７４μｔのＤ
Ｎ入を採取した。
３）　　９　Ｂ　Ｒ３２６とｐＡＭｓｓＧの連結１）ｐ
Ｂ１３２６　　ＤＮＡ　０．２μ？に制限酵素Ｂａｍ）
ｌ　　ｌ　　１ユニツト（ペセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ（以下（ＢＲＬ　）社製）を添、加し３７ＵＥ６０
分、保持し消化させた。
ｍ’）　　２）で採取したｐＡ１３３Ｇ　　ＤＮＡ　１
．２μｆに制限酵素Ｍｂ０１（ＢＲＬ社ｌ１１）０．２
−Ｌニット加え、３７ＣＩＣ１６分間保持して部分消化
させた。
１）　　（１）と（麺）の反応線を混合し、６５Ｃにて
１０分間加熱処理後、ＡＴＰおよびジチオスレイトール
存在下、大腸面のＴ４　　ファージ由来のＤＮＡ　リガ
ーゼ０．０１ユニツトを添加し２２ｔｌ”ｃ２時間保持
して連結せしめ、ｅｓｃｃて１０分加熱処理後、２倍容
のエタノールを加え反応終了後の複合プラスミドＤＮＡ
を沈澱せしめ、遠心分離により集め、これを緩衝液２０
０μｔに溶解して←）の形質転換実験に供した。
Ｉν）工７エリヒア・コリｃ−ａｏｏ：スレオニン。
ロイシン、サイアミン要求、制限系欠損株（Ｍｅｉｅｌ
ｓｏｎ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｙｕａｎ＋　Ｒ，Ｍａｔｕｒ
ｅ　２１７＋１１１０（１９６８））をＣＭＧ培地を用
イテ培養し、対数中期の菌体を採取し、この菌体なりＮ
Ａの受容菌として、（−）で得た複合プラスミドによる
形質転換を行なった。方法はＫｕｓｈｎｅｒらの方法に
従った（　＠Ｇｅｎ＠ｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　
’　Ｐ、　１７、Ｅｌｓｅｖｉｏｒ　／　Ｎｏｒｔｈｊ
ｌｏｌｌａｕｄ　Ｂｉｎｍｅｄｌｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ　
Ｉ　Ｑ　７８　）。
形質転換株は、りｐラムフエニプ−に２０μｔ／−を含
むＣＭＧ寒天培地を用いて３７Ｃにて２４時間培養し、
生育してくるコロニーを採取した。得られた数百のコロ
ニーから任意に一２０個を選択して、アンピシリン２０
μｔ／−を含むＣＭＧ平板培地と、テトラサイクリン２
０μｌ／−を含むＣＭＧ平板培地にそれぞれ纏えつけ、
１１者では生育出来るが、後者ではできない５つのコロ
ニーを選択した。
この内ＡＪ１１８１１２をとり、ＣＭＧ液体培地で３７
０％　１６時間培養した菌体な日中らの方法　（Ｊ、Ｂ
ａＣ１ｅｒｉＯ１１２１１３５４（１９７５））Ｃより
溶菌せしめ、ｇｈａｒｐらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　上２　、　３０５５（１９７３））により１ガ
ロース電気泳動を行い−、分子量６．６メガダルトンの
ｐＡＪ６５６と命名した複合プラスミドを得た。このプ
ラスミドの制限酵素切断地図は第４図に示すようＥ、ｐ
ＢＲ３２５とｐＡＭ３３Ｇの複合プラスミドであり、エ
シェリヒア・コリで増殖できることが証明された。この
複合プラスミドｐＡＪ６５５　　ｔｘ保有する―株ＡＪ
１１８８２はＦＥＲＭ−Ｐｌｒｔ７　　　として寄託し
た。
実施例２ エシェリヒア・コリのプラスミドｐＢＲ３２５とコリネ
バクテリウム・グルカミカムのプラスミドｐＡ１２８６
を連結した複合プラスミドｐＡＪ６１１を以下のように
して輿製した。
１）　プラスミドｐＢＲ３２５ 本プラスミドは実施例１と同様に市販品を使用した。
２）プラスミドｐＡＭ２８６ プラスミドｐＡＭＺ８６　　を含むコリネバクテリウム
・グルカミカムＡＪ１１６６ＧをＣＭＧ培地に接種し、
実施例！と同様の操作で最終２０μｆのＤＮＡを採取し
た。
３）ｐＢＲ３２５とｐＡＭ２８６の連結ｐＢＲ３２６Ｄ
ＮＡ０．２／ｊＦＥ制限酵素ＢａｍＨ１１ｚ＝ツト（Ｂ
ＲＬ製）を添加し３７ｔ？に６０分間保持してＤＮＡを
分解せしめ以後実施例１と同様の操作で、複合プラスミ
ドヲ得た。これを用いてエシェリヒア・コリｃ−６００
を？１転換し、クロラムフェニコールトアンヒシリンに
耐性を示し、テトラサイクリンに感受性を示す形質転換
株を得、この中がら＾Ｊ　１１８８４を選択した。
−ＡＪ１１８８４からｐＡＪ６１１　　と命名した分子
量６．６メガダルトンの複合プラスミドを得た。本プラ
スミドの制限酵素切断地図は第５図に示した。この図か
ら明らかなようにこのプラスミドはｐＢＲ３２５とｐＡ
Ｍ２８６　の複合プラスミドであり、エシェリヒア・コ
リの中で増殖することが示された。ｐ、ＡＪ６１１　　
を含むエシェリヒア・コリＡＪ１１８８４はＦＥＲＭ−
Ｐ６ｓ−ｔ　ｙｌ　　として寄託されている。
実施例３ エシェリヒア・コリのプラスミドｐＢＲ３２６と、フリ
ネパクテリウム争グルタミカムのプラスミドｐＨＭ１６
１９を連結した複合プラスミドｐＡＪ１８４４を次のよ
うにして調製した。
１）プラスミドｐＢＲ３２５ 本プラスミドは実施例１と同様に市販品を使用した。
２）プラスミドｐｉ（Ｍｉ＆１Ｇ プラスミドｐＨＭ１５１Ｇを含有する菌株、）替ネバク
テリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０６Ｂ　　を用い
、実施例１と同様の方法で、最終２４μｔのＤＮＡを得
た。
エシェリヒア・プリのプラスミドｐＢＲ３２５と、ｐＨ
Ｍ１５１９の連結と単離同定は以下の様に行なった。１
）ＢＲ３２！１　　は実施例１と同様に処理した。
ｐＨＭ１６１９　　ＤＮＡ　１．０μｔ　をとり、これ
に制限酵素Ｂｇｌｌ（ベーリンガーマンハイム社製）５
ユニツトを添加し、？７Ｃに６０分間保持した。
以下実施例１と同様の操作でクロラムフェニコールとア
ンピシリンに耐性を、テトラサイクリンに感受性を示す
コロニーを得た。このフロニーの中から実施例１と同様
の操作でプラスミドの調製を行ない、分子量が５．４メ
ガダルトンのｐＡＪ１８４４と命名した複合プラスミド
を得た。本プラスミドの制限酵素切断地図を第６図に示
した。第６図から明らかなように、本プラスミドは、ｐ
ＢＲ３２５とｐＨＭ１５１９からなる複合プラスミドで
エシェリヒア・ブリの中で増殖できることが示された。
ｐＡＪ１８４４　　を含んでいるエシェリヒアｅコリＡ
Ｊ　１１８８３はＦＥＲＭ−Ｐ　　ｔＦ７Ｆ　　として
寄託されている。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＡＭ３３０の制限酵素切断地図
を示す。第２図は、プラス４）’ｐＡＭ２８６の制限酵
素切断地図を示す。第３図は、プラスミドｐＨＭ１６１
９の制限酵素切断地図を示す。第４図は、複合プラスミ
ドｐＡＪ６５６の制限酵素切断地図を示す。第５図は、
複合プラスミドｐＡＪ６１１　　の制限酵素切断地図を
示す。 第６図は、複合プラスミドｐＡＪ１８４４の制限酵素切
断地図を示す。 特許出願人　味の素株式会社 Ｏｅ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、　コリネホルムのグルタミン酸生産菌より得られる
    マルチコピープラスミドであるプラスマルチフピー・プ
    ラスミド又はバチルス−ズブチリスを宿主として増殖し
    薬剤耐性の遺伝清報を有しているマルチコピープラスミ
    ドであるプラスミー（ｂ）とからなり、少なくともプラ
    スミド（ａ）のドライブユニットとプラスミド（ｂ）の
    ドライブユニット及び薬剤耐性に関惨する遺伝清報とを
    有している複合プラスミド。 龜　プラスミド（ａ）がｐＡＭ３３Ｇである特許請求の
    範囲第１項記載の複合プラスミド。 λ　プラスミド（ａ）がｐＡＭ２８６　　である特許請
    求の範囲第１項記載の複合プラスミド。 本　プラスミド（ａ）がｐＨＭ１６１Ｇである特許請求
    の範囲第１項記載の複合プラスミド。 ＆　コリネホルム・グルタミン酸生産菌が、ブレビバク
    テリウム・ラクトファーメンタム又は、コリネバクテリ
    ウム・グルタミン酸である特許請求の範囲第１項記載の
    複合プラスミド。 ６、、　　複合−プラスミドがコリネホルム・グルタミ
    ン酸生産−の細胞内に含まれているものである特許請求
    の範囲第１項記載の複合プラスミド。 ７、　コリネホルム・グルタミン酸生産菌がプレビバタ
    テリウムφラタトフアーメンタム又はコリネバクテリウ
    ム・グルタミン酸である特許請求の範囲第６項記載の複
    合プラスミド。 ＆　複合プラスミドがエシェリヒア・コリ又はバチルス
    ・ズブチリスの細胞内に含まれているものである特許請
    求の範囲第１項記載の複合プラスミド。 龜　エシェリヒア・コリがエシェリヒア・コリに−１２
    （ＡＴＣＣ１０７９８）’ｔ’ある特許請求の範囲第８
    項記載の複合プラスミド。 １０　　複合プラスミド内ｉ他の遺伝子が挿入されてい
    るものである特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミ
    ド。 １１、　　：ｆｆリネホルム中グルタミン酸生産菌、ニ
    ジエリア・コリ又はバチルス・ズブチリスの細胞内に含
    まれている特許請求の範囲第１０項記載の複合プラスミ
    ド。
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