JP2015501641A

JP2015501641A - 関連するアクチノバクテリアの遺伝的形質転換のためのプラスミドとしての、アクチノプラネス属ｓｅ５０／１１０由来の新規な放線菌組込み接合エレメント

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Publication number: JP2015501641A
Application number: JP2014545206A
Authority: JP
Inventors: アンドレアス・クライン; クラウス・ゼルバー; ヘルマン・ヴェールマン; ヴィンフリート・ローゼン; アルフレート・ピューラー; パトリック・シュヴィーンテック; イェルン・カリノウスキー; ウド・ヴェーマイアー
Original assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Current assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2015-01-19
Also published as: EP2788373A1; AR089117A1; CN104144942A; IN2014CN04155A; IL232587A0; HK1203970A1; US9562249B2; EP2788373B1; ES2718331T3; IL232587A; US20160130622A1; WO2013083566A1; US9217154B2; CA2858259A1; US20140349346A1; KR20140109922A

Abstract

本発明は、放線菌組込み接合エレメント（ＡＩＣＥ）の構造に似た、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０の完全なゲノム配列内の生来のＤＮＡ配列を対象とする。関連するＡＩＣＥは、過去に他の細菌のための遺伝子操作ツールを確立するために用いられた。本明細書において、我々は、全体として任意の他の既知のＡＩＣＥとは明らかに異なるが、他種由来の他の特徴づけられたＡＩＣＥと様々な配列類似性で小部分を共有する、アクチノプラネス属ＳＥ５０／１１０で発見された特定のＡＩＣＥの独自の特徴について記載する。

Description

発明の説明
原核生物アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０は、２型糖尿病の治療において世界中で使用されている、α−グルコシダーゼ阻害剤アカルボースを産生する。２型糖尿病の発生率が世界的に急速に上昇しているという事実に基づいて、アカルボースの需要の増大が、将来的に予測されている。これらの期待に応えるために、株およびその誘導体の遺伝子操作は、アカルボース収量を増大させることを目指して行われなければならない。しかしながら、現在、この株のための遺伝子操作のためのツールは存在しておらず、菌株改良の過程を妨げている。

本発明は、放線菌組込み接合エレメント（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）（ＡＩＣＥ）の構造に似た、アクチノプラネス属ＳＥ５０／１１０の完全なゲノム配列内の生来のＤＮＡ配列を対象とする。関連するＡＩＣＥは、過去に他の細菌のための遺伝子操作ツールを確立するために用いられた。本明細書において、我々は、全体として任意の他の既知のＡＩＣＥとは明らかに異なるが、他種由来の他の特徴づけられたＡＩＣＥと様々な配列類似性で小部分を共有する、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０で発見された特定のＡＩＣＥの独自の特徴について記載する。

発明の説明
アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０は、約９．２５ＭＢの大きさの高Ｇ＋Ｃ含量のゲノムを有する、グラム陽性、好気性細菌である（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋｅｔａｌ．，２０１２）。その医学的に重要な生物は、ヒトα−グルコシダーゼを阻害することが見出された様々な化学的に関連する物質の天然の生産者であり（ＣａｓｐａｒｙａｎｄＧｒａｆ，１９７９）、医薬用途に特に適している（Ｆｒｏｍｍｅｒｅｔａｌ．，１９７５，１９７７ａ，１９７７ｂ，１９７９）。特に、十分に特徴付けられたアカルボース遺伝子クラスターにコードされる酵素によって合成される、シュードテトラサッカライドアカルボースは、２型糖尿病（インスリン非依存性）の治療に世界中で使用されている。

２型糖尿病は、世界的に、２億５０００万人以上の影響を受けた人々がいる慢性疾患である。不適切に投与または処置されると、腎不全、失明、遅い創傷治癒、および冠状動脈アテローム性動脈硬化症を含む動脈疾患の重症なケースにつながり得る（ＩＤＦ，２００９）。２型糖尿病の発生率が世界的に急速に上昇するにつれ、アカルボースのような糖尿病薬の需要が益々増大すると予想される必要がある。シュードテトラサッカライドアカルボースは、現在、野生型微生物アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０に基づく、収率が最適化された株の工業的発酵により生産されている。従来の突然変異誘発による古典的な菌株最適化は、過去、アカルボースの生産を増加させる大成功した方法であったが、この戦略は今では限界に達しているようである。さらに生産効率を高めるために、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０のための機能的形質転換システムを必要とする、標的遺伝子工学的方法が適用されなければならない。以前の実験は、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０およびアクチノプラネス・フリウリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｆｒｉｕｌｉｅｎｓｉｓ）（ならびに、おそらく他のほとんどのアクチノプラネス属）が、行われてきた真剣な努力にもかかわらず、エレクトロポレーションまたはＰＥＧ媒介形質転換のような標準的な形質転換法を可能にしないことを明らかにした（Ｈｅｉｎｚｅｌｍａｎｎｅｔａｌ．，２００３）。本文脈において、関連する種について以前に示されているように（Ｈｏｓｔｅｄｅｔａｌ．，２００５）、この目的のために使用することができる、放線菌組込み接合エレメント（ＡＩＣＥ）が、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００３１７０）上で同定されている。

ＡＩＣＥは、切除／組込み、複製、接合伝達および調節のための機能的モジュールを有する、高度に保存された構造組織を保有する、可動性遺伝因子のクラスである（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。自律的に複製することができ、それらはまた、特定の環境条件下で宿主に選択的優位性を付与する、抵抗および代謝特性などの、機能をコードするさらなるモジュールの取得を媒介すると言われている（ＢｕｒｒｕｓａｎｄＷａｌｄｏｒ，２００４）。ｐＡＣＰＬと呼ばれる、新規のＡＩＣＥが、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０の完全なゲノム配列中で同定された（図１）。その１３．６ｋｂの大きさと構造的遺伝子構成は、ミクロモノスポラ・ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｒｏｓａｒｉｏ）、サリニスポラ・トロピカ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａｔｒｏｐｉｃａ）またはストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のような近縁種の他の既知のＡＩＣＥに良く一致する（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。

アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０由来の新たに同定された放線菌組込み接合エレメント（ＡＩＣＥ）ｐＡＣＰＬの構造的構成。他のＡＩＣＥ上でも見られる典型的な遺伝子はカラー表示されている：切除／組込み（オレンジ）、複製（黄）、主要な伝達（濃青）、接合（青）、ＮＵＤＩＸヒドロラーゼ（濃緑）、調節（緑）、他の注釈付き機能（赤）、未知の機能（灰色）。ペアードエンドおよびホールゲノムショットガンパイロシークエンスの実行の自動的に組み合わせたアセンブリから生じる、５７１個のアクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）の散布図。塩基ごとの読み込みの平均数は２１．１２であり、「平均」でマークされた中央の斜線によってプロットに描かれている。さらなる線は、それぞれ最大で１０倍および１／１０倍の係数（ｆａｃｔｏｒ）の、塩基ごとの読み込みの過剰および過小出現の係数を示す。軸は対数スケールを表す。大規模で高度に過剰出現したコンティグは、特別な記号で強調表示されている。各コンティグは、以下の記号の一つで表される：菱形、通常のコンティグ；正方形、放線菌組込み接合エレメント（ＡＩＣＥ）に関連するコンティグ；三角形、リボソームオペロン（ｒｒｎ）に関連するコンティグ；丸、トランスポゾンに関連する。

最も知られているＡＩＣＥは、それぞれ、ゲノム上に位置する付着部位（ａｔｔＢ）およびＡＩＣＥ（ａｔｔＰ）内の２つの短い同一の配列（ａｔｔ同一セグメント（ａｔｔｉｄｅｎｔｉｔｙｓｅｇｍｅｎｔｓ））の間の部位特異的組換えによるｔＲＮＡ遺伝子の３’末端への組込みにより、それらの宿主ゲノムにおいて存在する（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。ｐＡＣＰＬでは、ａｔｔ同一セグメントは大きさが４３ｎｔであり、ａｔｔＢはプロリンｔＲＮＡ遺伝子の３’末端に重複している。さらにまた、ａｔｔＰにおける同一セグメントは、２つのミスマッチを含有する２つの２１ｎｔの繰り返し：ＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＴＡＧＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＧによって隣接されている。これらはストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）由来のＡＩＣＥｐＳＡＭ２で同定されたアーム型部位に高い類似性を示す。ｐＳＡＭ２については、インテグラーゼがこれらの繰り返しに結合し、かつ効率的な組換えのためにそれらが不可欠なことが示された（Ｒａｙｎａｌｅｔａｌ．，２００２）。

プロリンｔＲＮＡゲノム組込み部位に加えて、ｐＡＣＰＬは、平均的なアクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）ＳＥ５０／１１０細胞における染色体外エレメントとして（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋｅｔａｌ．，２０１２）、少なくとも１２コピーで存在することが示された（図２）。ｐＡＣＰＬは２２個のタンパク質をコードする配列を有する。

本発明の放線菌組込み接合エレメントは：
ａ）配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド、
ｂ）（ａ）で特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
ｃ）配列番号１の配列と少なくとも９０％同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択される。

配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有するＡＩＣＥが好ましい。配列番号１の配列と少なくとも９８％同一性を有するＡＩＣＥがより好ましい。本発明はさらに、上述の放線菌組込み接合エレメントで形質転換された宿主細胞に関する。最も好ましい宿主細胞はアクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）である。該宿主は、
ａ）有用な培地において上記宿主細胞を培養する段階、
ｂ）培養物から産物を回収する段階、および
ｃ）産物を単離および精製する段階
を含む、生物学的産物の調製のための方法において有用である。この方法における最も好ましい産物はアカルボースである。

ｐＡＣＰＬの２２個のタンパク質をコードする配列の詳細な説明
遺伝子ｉｎｔ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３１０）は、３８８アミノ酸の長さを有するＡＩＣＥのインテグラーゼをコードする。その配列は、最初の３８３アミノ酸内で、ストレプトマイセス・グリセオフラブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ）Ｔｕ４０００のインテグラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦＬ４０１２０．１）に７４％の類似性を示す。該タンパク質のインテグラーゼドメインは、アミノ酸１８２−３６５に位置し、Ｉｎｔ／ＴｏｐｏＩＢシグネチャーモチーフ（保存ドメイン：ｃｄ０１１８２）に高い類似性（ｅ値２．９０ｅ−２１）を示す。該インテグラーゼは、２つの類似する、染色体上の付着部位ａｔｔＢおよびＡＩＣＥ上のａｔｔＰの間で生じる、部位特異的組換えによる、ｔＲＮＡ遺伝子内への組込みの原因である（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。

遺伝子ｘｉｓ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０９）は６８アミノ酸の長さを有するＡＩＣＥの除去酵素をコードする。それは、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）ＤＳＭ４３０２１由来の推定タンパク質Ｓｒｏｓ＿７０３６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＺ８９７３５．１）に最も高い類似性を示す。該タンパク質は、アミノ酸９−５５の間に中程度に保存された（ｅ値：１．３１ｅ−０７）ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ（ｐｆａｍ１２７２８）を含有する。Ｘｉｓは、増幅および他の宿主への伝達に備えて、染色体からのＡＩＣＥの削除を媒介するために、Ｉｎｔと組み合わせて必要である（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。

遺伝子ｒｅｐＳＡ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０８）は、５９８アミノ酸の長さを有するＡＩＣＥの複製開始タンパク質をコードする。それは、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の推定プラスミド複製開始タンパク質に最も高い類似性を有する。該タンパク質は、ローリングサイクル複製機構を適用することが見出されたストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）由来の十分に特徴付けられたＲｅｐＳＡタンパク質に似ている。

遺伝子ａｉｃｅ１（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０７）は、９７アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、最初の８０アミノ酸において、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の推定タンパク質Ｍｉｃａｕ＿５３６０（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＬ４８８６６．１）に６９％の類似性を示す。

遺伝子ｓｐｄＡ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０６）は、１０７アミノ酸の長さを有するＡＩＣＥの推定拡散タンパク質（ｓｐｒｅａｄｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする。ＳｐｄＡはフランキア属（Ｆｒａｎｋｉａｓｐ．）ＣｃＩ３由来の拡散タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＤ１０２８９．１）に５４％の類似性を示す。拡散タンパク質は、ドナー細胞からＡＩＣＥを獲得する過程に存在する、レシピエント細胞の一時的な増殖遅延を反映する、ポック形成に関与している。それゆえ、拡散タンパク質は菌糸内拡散（ｉｎｔｒａｍｙｃｅｌｉａｌｓｐｒｅａｄ）を補助する（Ｋａｔａｏｋａｅｔａｌ．，１９９４；Ｇｒｏｈｍａｎｎｅｔａｌ．，２００３；ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。

遺伝子ｓｐｄＢ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０５）は、１６９アミノ酸の長さを有するＡＩＣＥの推定拡散タンパク質をコードする。ＳｐｄＢは、アミノ酸４０−１３１の間で、ミクロモノスポラ・ロザリア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｒｏｓａｒｉａ）由来の拡散タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＸ３８９９８．１）に８４％の類似性を示す。拡散タンパク質は、ドナー細胞からＡＩＣＥを獲得する過程に存在する、レシピエント細胞の一時的な増殖遅延を反映する、ポック形成に関与している。それゆえ、拡散タンパク質は菌糸内拡散（ｉｎｔｒａｍｙｃｅｌｉａｌｓｐｒｅａｄ）を補助する（Ｋａｔａｏｋａｅｔａｌ．，１９９４；Ｇｒｏｈｍａｎｎｅｔａｌ．，２００３；ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。ＳｐｄＢについてシグナルペプチドが発見され、その切断部位は位置１８と予測される。またさらに、３つの膜貫通ヘリックスが位置ｉ５３−７０ｏ７５−９７ｉ１０９−１３１ｏで発見された。

遺伝子ａｉｃｅ２（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０４）は、９６アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、アミノ酸１２−８９の間で、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の推定タンパク質Ｍｉｃａｕ＿５３５８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＬ４８８６４．１）に５７％の類似性を示す。

遺伝子ａｉｃｅ３（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０３）は、６１アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、公開データベース中のいずれのタンパク質にも著しい類似性を示さなかった。

遺伝子ａｉｃｅ４（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０２）は、１３８アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、最後の１１３アミノ酸において、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の推定タンパク質Ｍｉｃａｕ＿５３５７（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＬ４８８６３．１）に６９％の類似性を示す。

遺伝子ａｉｃｅ５（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３０１）は、１０８アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の推定タンパク質Ｍｉｃａｕ＿５３５６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＬ４８８６２．１）の完全アミノ酸配列に７９％の類似性を示す。このタンパク質は、細胞質外機能（ＥＣＦ）を備えるシグマ因子に対する低いｐｆａｍヒット（ｅ値０．００２２）を有する。これらのシグマ因子は、特定の遺伝子の転写を刺激するためにＲＮＡポリメラーゼに結合できる。それらは、環境からの刺激を受けて活性化されると考えられ、多くの場合、１以上の負の調節因子と共転写される（Ｈｅｌｍａｎｎ，２００２）。

遺伝子ａｉｃｅ６（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６３００）は、１４９アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、ベルコシスポラ・マリス（Ｖｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａｍａｒｉｓ）ＡＢ−１８−０３２由来の推定タンパク質ＶＡＢ１８０３２＿０１６４５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＢ４７４１３．１）の完全アミノ酸配列に５０％の類似性を示す。

遺伝子ａｉｃｅ７（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９９）は、６６アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、公開データベース中のいずれのタンパク質にも類似性を示さなかった。Ａｉｃｅ７はアミノ酸９−３１の範囲に単一膜貫通ヘリックスを含有する。

遺伝子ｔｒａ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９８）は、２９３アミノ酸の長さを有するＡＩＣＥの主要な伝達タンパク質をコードする。それは、大部分にわたって、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の細胞分裂タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＬ４８８５９．１）に７４％の類似性を示す。Ｔｒａは、アミノ酸２９−１８７の間で、全てのＡＩＣＥおよびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）トランスフェラーゼ遺伝子において見られる、ＦｔｓＫ／ＳｐｏＩＩＩＥドメイン（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）に著しい類似性（ｅ値３．１ｅ−１４）を有するドメインを含有する。いくつかの実験は、Ｔｒａのホモログがレシピエント株への二本鎖ＤＮＡの移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に関与しているという証拠を提供した。移行は、交配（ｍａｔｉｎｇ）菌糸体の菌糸先端で生じる（Ｐｏｓｓｏｚｅｔａｌ．，２００１；Ｒｅｕｔｈｅｒｅｔａｌ．，２００６）。

遺伝子ａｉｃｅ８（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９７）は、１２４アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、アミノ酸４４−１１６の間で、マイコバクテリウム・コロンビエンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｅ）ＣＥＣＴ３０３５由来のＦａｄＥ６タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＧＴ８６７０１．１）の配列に４４％の類似性を示す。完全なＦａｄＥ６タンパク質は、７３３アミノ酸を有し、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼに似ているが、Ａｉｃｅ８は、それがＦａｄＥ６の触媒ドメインを含有せず、長さ１２４アミノ酸のみであるため、同様の機能を有する可能性は低い。

遺伝子ａｉｃｅ９（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９６）は、３２０アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、配列の大部分にわたって、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の推定タンパク質Ｍｉｃａｕ＿５３５２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＬ４８８５８．１）に６８％の類似性を示す。このタンパク質は位置ｉ３２−５１ｏ５７−７９ｉ８８−１１０ｏ１１５−１３４ｉに４つの膜貫通ヘリックスを含有する。

遺伝子ａｉｃｅ１０（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９５）は、６９アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、公開データベース中のいずれのタンパク質にも著しい類似性を示さなかった。

遺伝子ｐｒａ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９４）は、ｒｅｐＳＡ、ｘｉｓおよびｉｎｔの活性化因子をコードするようである。それは、１０５アミノ酸の長さを有し、かつ、完全配列にわたって、ミクロモノスポラ・オーランティアカ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａａｕｒａｎｔｉａｃａ）ＡＴＣＣ２７０２９由来の推定タンパク質Ｍｉｃａｕ＿５３５２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＬ４８８５７．１）に９０％の類似性を示す。ＡＩＣＥの伝達および複製を調節するＰｒａは、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）由来のＡＩＣＥｐＳＡＭ２において、転写調節因子ＫｏｒＳＡによって抑制されると考えられている（Ｓｅｚｏｎｏｖｅｔａｌ．，２０００）。Ｐｒａを抑制することにより、ＡＩＣＥは染色体上に組み込まれた形で残る。

遺伝子ｒｅｇ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９３）は、４４４アミノ酸の長さを有するＡＩＣＥの調節タンパク質をコードする。それは、完全配列にわたって、ストレプトマイセス・カトレヤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｔｌｅｙａ）ＮＲＲＬ８０５７由来の推定調節因子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＣＢ７５９９９．１）に５０％の類似性を示す。Ｒｅｇはアミノ酸４−７２の範囲にヘリックス−ターン−ヘリックスドメインを含有する。ＲｅｇとｐＳＡＭ２由来のＫｏｒＳＡとの間の配列類似性は非常に低いが、ｐｒａとｎｕｄ遺伝子の間のｒｅｇの局在は、この遺伝子構成で頻繁に見られ、ＲｅｇがＫｏｒＳＡに対するホモログに似ていることを表し得る（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。

遺伝子ｎｕｄ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９２）は、アミノ酸２９−１４４の間にＮＵＤＩＸ−ヒドロラーゼを含有するタンパク質をコードする。それは、１７２アミノ酸の大きさを有し、かつ、配列にわたって、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）ＡＡ４の推定タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦＬ０９１３２．１）および近縁種由来の様々なＮＵＤＩＸヒドロラーゼに７２％の類似性を示す。Ｎｕｄは、アミノ酸２１−１０８の間で、ｐＳＡＭ２のＰｉｆタンパク質に４２％の類似性を示す。Ｐｉｆはまた、ＮＵＤＩＸ−ヒドロラーゼドメインを含有し、かつ、ｐＳＡＭ２を有する細胞との間の重複した伝達を防止するために、ＡＩＣＥの複製および転写を阻害すると考えられている、細胞間シグナル伝達に関与することが示された（Ｐｏｓｓｏｚｅｔａｌ．，２００３；ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。それゆえ、ｐＡＣＰＬにおけるＰｒａ、ＲｅｇおよびＮｕｄは、ｐＳＡＭ２についてＰｒａ、ＫｏｒＳＡおよびＰｉｆが行うような同様の調節メカニズムに似ている可能性が高い。

遺伝子ｍｄｐ（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９１）は、８０アミノ酸の長さを有する金属依存性ホスホヒドロラーゼをコードする。それは、その配列にわたって、フランキア属（Ｆｒａｎｋｉａｓｐ．）ＣｃＩ３由来の金属依存性ホスホヒドロラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＤ１０５１３．１）に６６％の類似性を示す。Ｍｄｐをコードする遺伝子は、ｐｒａ、ｒｅｇおよびｎｕｄホモログを有するクラスター内および他のＡＩＣＥ上で頻繁に見られる（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｂｏｌｈｕｉｓ，ｅｔａｌ．，２００８）。金属依存性ホスホヒドロラーゼは、シグナル伝達または核酸代謝に関与し得る（ｔｅＰｏｅｌｅ，Ｓａｍｂｏｒｓｋｙｙ，ｅｔａｌ．，２００８）。

遺伝子ａｉｃｅ１１（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２９０）は、２５６アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、公開データベース中のいずれのタンパク質にも著しい類似性を示さなかった。

遺伝子ａｉｃｅ１２（ゲノム遺伝子座タグ：ＡＣＰＬ＿６２８９）は、９３アミノ酸の長さを有する機能未知のタンパク質をコードする。それは、公開データベース中のいずれのタンパク質にも著しい類似性を示さなかった。

参考文献

Claims

ｄ）配列番号１の配列を有するポリヌクレオチド、
ｅ）（ａ）で特定されるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および
ｆ）配列番号１の配列と少なくとも９０％同一性を有するポリヌクレオチド
からなる群から選択される、放線菌組込み接合エレメント。
配列番号１の配列と少なくとも９５％同一性を有する、請求項１の放線菌組込み接合エレメント。
配列番号１および２の放線菌組込み接合エレメントで形質転換された宿主細胞。
細胞がアクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｓｐ．）である、請求項３の宿主細胞。
ｄ）有用な培地において請求項３または４の宿主細胞を培養する段階、
ｅ）培養物から産物を回収する段階、および
ｆ）産物を単離および精製する段階
を含む、生物学的産物の調製のための方法。
産物がアカルボースである、請求項５の方法。