KR20140109922A

KR20140109922A - 연관된 방선균의 유전적 형질전환을 위한 플라스미드인 액티노플라네스 sp. SE50/110으로부터 유래한 신규한 방선균류 통합 및 접합 인자

Info

Publication number: KR20140109922A
Application number: KR1020147018467A
Authority: KR
Inventors: 안드레아스 클라인; 클라우스 젤버; 헤르만 벨만; 빈프리트 로젠; 알프레드 퓔러; 파트릭 슈빈텍; 외른 칼리노브스키; 우도 베마이어
Original assignee: 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2014-09-16
Also published as: US20160130622A1; US20140349346A1; ES2718331T3; WO2013083566A1; IL232587A0; HK1203970A1; JP2015501641A; EP2788373A1; IN2014CN04155A; CA2858259A1; EP2788373B1; US9562249B2; AR089117A1; IL232587A; US9217154B2; CN104144942A

Abstract

본 발명은 방선균류 통합 및 접합 인자(AICE)의 구조와 유사한 액티노플라네스 sp. SE50/110의 완전한 게놈 서열 내 자연적(innate) DNA 서열에 관한 것이다. 관련 AICE는 이전에 다른 박테리아의 유전자 조작 방법 구축에 사용되었다. 여기에서, 본 발명자들은 액티노플라네스 sp. SE50/110에서 발견된 특이적 AICE의 독특한 특징을 기술하였으며, 이것은 공지된 다른 AICE와는 전반적으로 명백하게 다르지만 다른 종의 기타 특성화된 AICE와 다양한 서열 유사성을 갖는 일부를 공유한다.

Description

연관된 방선균의 유전적 형질전환을 위한 플라스미드인 액티노플라네스 sp. SE50/110으로부터 유래한 신규한 방선균류 통합 및 접합 인자{NEW ACTINOMYCETE INTEGRATIVE AND CONJUGATIVE ELEMENT FROM ACTINOPLANES SP. SE50/110 AS PLASMID FOR GENETIC TRANSFORMATION OF RELATED ACTINOBACTERIA}

원핵생물 액티노플라네스(Actinoplanes) sp. SE50/110은 알파-글루코시다제 저해제 아카보즈(acarbose)를 생산하며, 아카보즈는 세계적으로 제2형 진성 당뇨병 치료에 사용되고 있다. 제2형 당뇨병의 발병이 세계적으로 급속하게 늘어가고 있는 사실에 기초하여 장차 아카보즈의 수요가 증가할 것으로 예상된다. 이러한 예상에 부응하기 위해서, 아카보즈 수율 증대를 목표로 하여 이 균주와 그의 유도체에 대한 유전자 조작이 수행되어야 한다. 그러나, 현재로는 이 균주에 대한 어떠한 유전자 조작 기술도 존재하지 않아 균주를 개선하는 방법을 제한하고 있다.

액티노플라네스 sp. SE50/110은 약 9.25 MB 크기의 G+C 함량이 높은 게놈을 갖는 그람 양성, 호기성 박테리아다(Schwientek et al., 2012). 의학적으로 중요한 이 유기체는 인간의 알파-글루코시다제를 저해하는 것(Caspary and Graf, 1979)으로 밝혀진 다양한 화학적 연관 물질의 천연 제조체이며, 이들은 약학적 응용에 특별히 적합화되었다(Frommer et al., 1975, 1977 a, 1977 b, 1979). 구체적으로, 잘 특성화된 아카보즈 유전자 클러스터(Wehmeier and Piepersberg, 2004)에서 코딩된 효소에 의해 합성된 슈도테트라사카라이드(pseudotetrasaccharide) 아카보즈는 세계적으로 제2형 진성 당뇨병(비인슐린 의존성)의 치료에 사용되고 있다.

제2형 진성 당뇨병은 전세계에서 2억 5천만 명 이상이 앓고 있는 만성 질환이다. 부적절하게 관리되거나 치료하지 않으면 신부전, 실명, 상처치유 지연 및 동맥질환, 예를 들어 관상동맥 죽상동맥경화증의 중증을 유발할 수 있다(IDF, 2009). 제2형 당뇨병 발생은 세계적으로 빠르게 증가하고 있으므로 아카보즈 같은 당뇨병 치료제에 대한 수요 증가를 예상해야만 한다. 슈도테트라사카라이드 아카보즈는 현재 야생형 박테리아 액티노플라네스 sp. SE50/110(ATCC 31044; CBS 674.73)을 기반으로 한 수율 최적화 균주의 산업적 발효에 의해 생산된다. 통상적인 돌연변이를 통한 균주의 고전적 최적화는 과거에 아카보즈 생산을 증가시키는 매우 성공적인 방법이었지만, 이 방법은 이제 그 한계에 도달한 것으로 보인다. 생산 효율을 더욱 증가시키기 위해 표적화된 유전자 조작방법이 적용되어야만 하고, 이것은 액티노플라네스 sp. SE50/110에 대한 작용성 형질전환 시스템을 필요로 한다. 이전 실험에서는 액티노플라네스 sp. SE50/110과 Actinoplanes friuliensis(및 짐작컨대 대부분의 다른 Actinoplanes spp.)가 다양한 노력에도 불구하고 전기천공법 또는 PEG-매개 형질전환 같은 표준 형질전환 방법이 허용되지 않는 것으로 나타났다(Heinzelmann et al., 2003). 이와 관련하여, 방선균류 통합 및 접합 인자 (AICE)가 액티노플라네스 sp. SE50/110 게놈(GenBank:CP003170)에 대해 동정되었으며, 이는 관련 종에 대해 이전에 보여진 바(Hosted et al., 2005)와 같은 목적으로 사용될 수 있다.

AICE는 절제/통합, 복제, 접합 전달 및 조절을 위한 작용 모듈을 갖는 고도로 보존된 구조적 구성을 보유하는 일종의 이동성 유전성분이다(te Poele, Bolhuis, et al., 2008). 독자적으로 복제가능한 이들은 내성과 대사형질 같은 작용을 코딩하는 추가 모듈의 획득을 매개한다고 알려져 있으며, 이는 특정 환경 조건 하에서 숙주에게 선택적 이점을 제공한다(Burrus and Waldor, 2004). 신규한 AICE는 pACPL로 표시되며 액티노플라네스 sp. SE50/110의 완전한 게놈 서열에서 동정되었다(도 1). 그의 13.6 kb 크기와 구조적 유전자 구성은 Micromonospora rosario, Salinispora tropica 또는 Streptomyces coelicolor(te Poele, Bolhuis, et al., 2008) 같은 밀접하게 연관된 종의 공지된 다른 AICE와 잘 부합한다.

도 1: 액티노플라네스 sp. SE50/110으로부터 유래한 새로 동정된 방선균류 통합 및 접합 인자(AICE) pACPL의 구조적 구성. 다른 AICE에서도 발견되는 전형적 유전자는 색깔에 따라 표시하였다: 절제/통합(오렌지색), 복제(노란색), 주전달 (main transfer)(진한 파란색), 접합(파란색), NUDIX 하이드롤라제(진한 녹색), 조절(녹색), 기타 주석이 달린 작용(빨간색), 미지 작용(회색).
도 2: 짝지어진(paired) 말단과 전체 게놈 숏건(shotgun) 파이로시퀀싱 (pyrosequencing) 결과물의 자동 조합된 어셈블리로 얻어진 571 액티노플라네스 sp. SE50/110 콘틱(contig)의 산포도. 염기당 데이터(reads)의 평균수는 21.12이고 플롯 내에 '평균'이라고 기재된 중심대각선으로 표시하였다. 추가 선들은 염기 당 데이터의 과다- 및 과소표시의 인자가 각각 최대 10 및 1/10 배 팩터임을 나타내고 있다. 축은 로그 스케일을 나타낸다. 대량 및 고도로 과다표시된 콘틱을 특정 기호로 강조하였다. 각 콘틱은 다음 기호 중 하나로 표시되었다: 다이아몬드형, 정상 콘틱; 사각형, 방선균류 통합 및 접합 인자(AICE)와 연관된 콘틱; 삼각형, 리보솜 오페론(rrn)에 연관된 콘틱; 원형, 트랜스포손(transposons)과 연관.

대부분의 공지된 AICE는 그의 숙주 게놈 내에 게놈 (attB) 및 AICE (attP) 각각에 위치한 결합 부위 내에서 두 개의 짧은 동일 서열(att 동일성 세그먼트) 사이에 부위 특이적 재조합에 의해 tRNA 유전자의 3' 말단에 통합하여 존재한다(te Poele, Bolhuis, et al., 2008). pACPL에서, att 동일성 세그먼트는 43 nt의 크기이고 attB는 프롤린 tRNA 유전자의 3' 말단과 오버랩한다. 또한, attP 내의 동일성 세그먼트는 2개 미스매칭을 함유하는 2개의 21 nt 반복물: GTCACCCAGTTAGT(T/ C)AC(C/T)CAG이 측면에 배치된다. 이들은 Strepomyces ambofaciens의 AICE pSAM2에서 동정된 암 타입(arm-type) 부위에 대해 높은 유사성을 나타낸다. pSAM2에 대하여는 인테그라제(integrase)가 이러한 반복물에 결합하며 이들은 효과적인 재조합에 필수적인 것으로 나타났다(Raynal et al., 2002).

프롤린 tRNA 게놈 통합 부위 이외에, pACPL은 평균 액티노플라네스 sp. SE50/110 세포의 염색체외 성분으로서 적어도 12 카피(도 2) 내에 존재하는 것으로 나타났다(Schwientek et al., 2012). pACPL은 22 단백질 코딩 서열을 호스팅(hosting)한다.

본 발명의 방선균류 통합 및 접합 인자는

a) 서열번호 1의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드,

b) 엄격한(stringent) 조건 하에 (a)에서 특정된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 및

c) 서열번호 1의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 군에서 선택된다.

서열번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 AICE가 바람직하다. 서열번호 1의 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 AICE가 더욱 바람직하다. 본 발명은 또한 상기한 방선균류 통합 및 접합 인자로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 가장 바람직한 숙주 세포는 액티노플라네스 sp.이다. 숙주 세포는,

a) 숙주 세포를 유용한 배지에서 배양하고,

b) 배양물로부터 생성물을 수확하여

c) 생성물을 단리하고 정제하는 단계를 포함하는 생물학적 생성물의 제조방법에 유용하다.

본 방법에서 가장 바람직한 생성물은 아카보즈(acarbose)이다.

pACPL 의 22 단백질 코딩 서열에 대한 상세한 설명

int 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6310)는 388 아미노산 길이를 갖는 AICE의 인테그라제(integrase)를 코딩한다. 그 서열은 Streptomyces griseoflavus Tu4000의 인테그라제(GenBank: EFL40120.1)에 대하여 최초 383 아미노산 내에서 74%의 유사성을 나타낸다. 단백질의 인테그라제 도메인은 아미노산 182 - 365부터 위치하며 Int/Topo IB 시그니처 모티프(보존 도메인: cd01182)에 대해 높은 유사성(e-값 2.90e-21)을 나타낸다. 인테그라제는 두 개의 유사 결합 부위, 염색체 상의 attB와 AICE 상의 attP 사이에 발생하는 부위 특이적 재조합에 의한 tRNA 유전자 내로의 통합을 담당한다(te Poele, Bolhuis, et al., 2008).

xis 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6309)는 68 아미노산 길이를 갖는 AICE의 제거효소(excisionase)를 코딩한다. 이것은 Streptosporangium roseum DSM 43021의 가상 단백질(hypothetical protein) Sros_7036 (GenBank: ACZ89735.1)에 대하여 고도의 유사성을 나타낸다. 이 단백질은 아미노산 9-55 사이에 적당히 보존된(e-값: 1.31e-07) 나선 대 나선(helix-turn-helix) 모티프(pfam12728)를 함유한다. Xis는 증폭 및 다른 숙주로의 전달을 위한 제조에서 염색체로부터 AICE의 절제를 매개하기 위한 Int와의 조합에 필요하다(te Poele, Bolhuis, et al., 2008).

repSA 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6308)는 598 아미노산 길이를 갖는 AICE의 복제 개시 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 추정 플라스미드 복제 개시 단백질(GenBank: ADL48867.1)에 대해 고도의 유사성을 갖는다. 이 단백질은 Streptomyces ambofaciens의 잘 특성화된 RepSA 단백질과 유사하며, 회전고리형 복제 메카니즘(Hagege et al., 1993)을 적용하는 것으로 확인되었다.

aicel 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6307)는 97 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이것은 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 가상 단백질 Micau_5360(GenBank: ADL48866.1)에 대해 최초 80 아미노산에서 68%의 유사성을 나타낸다.

spdA 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6306)는 107 아미노산 길이를 갖는 AICE의 추정 스프레드(spread) 단백질을 코딩한다. SpdA는 Frankia sp. CcI3의 스프레드 단백질(GenBank: ABD10289.1)에 대해 54%의 유사성을 나타낸다. 스프레드 단백질은 포크(pock) 형성에 연관되어 있으며, 이것은 공여체 세포로부터 AICE를 획득하는 과정에 있는 수용체 세포의 일시적 성장 지연을 나타낸다. 따라서, 스프레드 단백질은 균사체내 확산(intramycelial spread)을 돕는다(Kataoka et al., 1994; Grohmann et al, 2003; te Poele, Bolhuis, et al., 2008).

spdB 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6305)는 169 아미노산 길이를 갖는 AICE의 추정 스프레드 단백질을 코딩한다. SpdB는 Micromonospora rosaria의 스프레드 단백질(GenBank: AAX38998.1)에 대해 아미노산 40 - 131 사이에서 84%의 유사성을 나타낸다. 스프레드 단백질은 포크 형성에 연관되어 있으며, 이것은 공여체 세포로부터 AICE를 획득하는 과정에 있는 수용체 세포의 일시적 성장 지연을 나타낸다. 따라서, 스프레드 단백질은 균사체내 확산을 돕는다(Kataoka et al., 1994; Grohmann et al, 2003; te Poele, Bolhuis, et al., 2008). 시그널 펩티드가 SpdB에서 발견되었으며, 그의 절단부위는 위치 18인 것으로 추정된다. 또한, 3개의 막관통 나선이 위치 i53-70o75-97il09-l3lo에서 확인되었다.

aice2 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6304)는 96 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 가상 단백질 Micau_5358(GenBank: ADL48864.1)에 대해 아미노산 12 - 89 사이에서 57%의 유사성을 나타낸다.

aice3 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6303)는 61 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 공용 데이터베이스 중의 어떤 단백질에 대해서도 의미 있는 유사성을 나타내지 않는다.

aice4 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6302)는 138 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 가상 단백질 Micau_5357(GenBank: ADL48863.1)에 대해 최종 113 아미노산에서 69% 유사성을 나타낸다.

aice5 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6301)는 108 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 가상 단백질 Micau_5356(GenBank: ADL48862.1)의 완전한 아미노산 서열에 대해 79% 유사성을 나타낸다. 이 단백질은 세포질외 작용(ECF)을 갖는 시그마 인자에 대해 낮은 pfam 히트(e-값 0.0022)를 갖는다. 시그마 인자들은 특정 유전자의 전사를 자극하기 위해 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있다. 이들은 환경으로부터 자극을 받을 때 활성화되는 것으로 보이며, 종종 하나 이상의 네거티브 조절인자와 공동 전사된다(Helmann, 2002).

aice6 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6300)는 149 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Verrucosispora maris AB-18-032의 가상 단백질 VAB18032_01645(GenBank: AEB47413.1)의 완전한 아미노산 서열에 대해 50% 유사성을 나타낸다.

aice7 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6299)는 66 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 공용 데이터베이스 중의 어떤 단백질에 대해서도 유사성을 나타내지 않는다. Aice7은 아미노산 9 - 31 범위에 있는 단일 막관통 나선을 함유한다.

tra 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6298)는 293 아미노산 길이를 갖는 AICE의 주요 전달 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 세포분화단백질(GenBank: ADL48859.1)에 대한 주요부분 전체에 걸쳐서 74%의 유사성을 나타낸다. Tra는 모든 AICE 및 스트렙토마이세스(Streptomyces) 트랜스퍼라제 유전자에서 발견된, 아미노산 29 - 187 사이의 FtsK/SpoIIIE 도메인에 대해 상당한 유사성(e-값 3.1e-14)을 갖는 도메인을 함유한다(te Poele, Bolhuis, et al., 2008). 몇몇 실험에서는 Tra의 동족체가 수용체 균주로의 이중가닥 DNA의 전좌 (translocation)를 담당하는 증거가 제공되었다. 전좌는 교배(mating) 균사체의 균사 팁에서 일어난다(Possoz et al., 2001 ; Reuther et al., 2006).

aice8 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6297)는 124 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Mycobacterium colombiense CECT 3035의 FadE6 단백질(GenBank: EGT86701.1) 서열에 대해 아미노산 44 - 116 사이에서 44%의 유사성을 나타낸다. 완전한 FadE6 단백질은 아실-CoA 데히드로게나제와 비슷한 733 아미노산을 갖지만, Aice8은 FadE6의 촉매성 도메인을 함유하지 않고 단지 124 아미노산 길이이기 때문에 유사한 작용을 갖지 않을 것으로 보인다.

aice9 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6296)는 320 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 가상 단백질 Micau_5352(GenBank: ADL48858.1)에 대한 서열의 주요부분 전체에 걸쳐서 68%의 유사성을 나타낸다. 이 단백질은 위치 i32-51o57-79i88-110o-134i에 4개의 막관통 나선을 함유한다.

aice1O 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6295)는 69 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 공용 데이터베이스 중의 어떠한 단백질과도 의미 있는 유사성을 나타내지 않는다.

pra 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6294)는 repSA, xis 및 int 유전자의 활성인자를 코딩하는 것으로 보인다. 이 유전자는 105 아미노산 길이를 가지며 Micromonospora aurantiaca ATCC 27029의 가상 단백질 Micau_5352(GenBank: ADL48857.1)에 대한 완전한 서열 전체에 걸쳐서 90% 유사성을 나타낸다. AICE의 전달과 복제를 조절하는 Pra는 Streptomyces ambofaciens의 AICE pSAM2 내에서 전사 조절인자 KorSA에 의해 억제되는 것으로 생각된다(Sezonov et al., 2000). Pra를 억제하여 AICE는 염색체 상에서 그의 통합된 형태로 남는다.

reg 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6293)는 444 아미노산 길이를 갖는 AICE의 조절 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 Streptomyces cattleya NRRL 8057의 추정 조절인자(GenBank: CCB75999.1)에 대한 완전한 서열 전체에 걸쳐서 50% 유사성을 나타낸다. Reg는 나선-대-나선(helix-turn-helix) 도메인을 함유하며, 아미노산 4 - 72 범위이다. pSAM2로부터의 KorSA와 Reg 간 서열 유사성은 매우 낮지만, pra와 nud 유전자 사이의 reg 위치는 KorSA에 대한 동족체와 유사한 Reg의 지표일 수 있으며, 이것은 주로 유전적 구조 내에서 발견된다(te Poele, Bolhuis, et al., 2008).

nud 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6292)는 아미노산 29 - 144 사이의 NUDIX-하이드롤라제 도메인을 함유하는 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 172 아미노산 크기를 가지며, 스트렙토마이세스 sp. AA4 및 밀접하게 연관된 종의 다양한 NUDIX 하이드롤라제의 가상 단백질(GenBank: EFL09132.1)에 대한 서열 전체에 걸쳐서 72%의 유사성을 나타낸다. Nud는 pSAM2의 Pif 단백질에 대해 아미노산 21 - 108 사이에서 42%의 유사성을 나타낸다. Pif는 또한 NUDIX-하이드롤라제 도메인을 함유하며 세포내 시그널링에 연관된 것으로 나타났고, 이것은 pSAM2 담지 세포들 사이에서 불필요한 전달을 방지하기 위해 AICE의 복제 및 전달을 저해하는 것으로 보인다(Possoz et al., 2003; te Poele, Bolhuis, et al., 2008). 따라서, pACPL 내 Pra, Reg 및 Nud는 Pra와 같은 유사한 조절 메카니즘을 따르고, KorSA 및 Pif는 pSAM2에 대한 것일 가능성이 있다.

mdp 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6291)는 80 아미노산 길이를 갖는 금속 의존성 포스포하이드롤라제를 코딩한다. 이 유전자는 Frankia sp. CcI3의 금속 의존성 포스포하이드롤라제(GenBank: ABD10513.1)에 대해 그의 서열 전체에 걸쳐서 66%의 유사성을 나타낸다. Mdp 코딩 유전자는 주로 다른 AICE 상에서 pra, reg 및 nud 동족체와의 클러스터로 발견된다(te Poele, Bolhuis, et al., 2008). 금속 의존성 포스포하이드롤라제는 신호 전달 또는 핵산 대사에 연관될 수 있다(te Poele, Samborskyy, et al., 2008).

aice11 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6290)는 256 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 공용 데이터베이스 중의 어떠한 단백질에 대해서도 의미 있는 유사성을 나타내지 않는다.

aice12 유전자(게놈 위치 태그: ACPL_6289)는 93 아미노산 길이를 갖는 작용이 알려지지 않은 단백질을 코딩한다. 이 유전자는 공용 데이터베이스 중의 어떠한 단백질에 대해서도 의미 있는 유사성을 나타내지 않는다.

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SE50/110 <400> 18 atgaaccctc tccgcaggaa ggcggcccaa cagccgacca ccggcccggc cgcccccgcg 60 agcgtcaacc tcaccgaaca gttcgccatc gagtacgcca agagcgccgt cccgaacatg 120 ctcaaggcca tcgacagcgt caaacgctac aaccgagcca ccctcatcgg cgcactgatc 180 accagctacc tccaccaggc ccactacctg gccagcaccg gcgcgggcta cttcgcctac 240 ctacccccgg cgatcttcga caccgccatg gtctcgatgc tgatcgtcgt ccgcaccccc 300 ggcatcgtca aagacgccaa acgctgggcc atggccgtct tcatcggcgc agccctgctc 360 tcggccaccg tcaacttcgc cgccccggcg acctcggcat gcgcatcgtc ttcgccctgg 420 tcgtcgtcgt ggtcatcggc gtcgaactcg tcgccggacg catccgcccc gacttcaccg 480 ccatcgacaa acaagccacc gaactcatga 510 <210> 19 <211> 324 <212> DNA <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 19 atgaccgccg tcaacaagat caaagcccgc ggtacggcga ccactccgga accggagcac 60 accaccaccg gcccgaccgc tccggtcgaa cagccggcca ccccacagac cgcgccggtc 120 gtcccggctc acctgctgcc cgccgcccgg ttctcggtcg tccagcacga gcagaccacc 180 ggccagccca tcaccgccga cgacctcgcc ctgcgactca acatcacccc ggccgtcgcc 240 gaaaccctga tcaccaccat ccgggacacc aacccggcac gcatcaacgg gcacatcccg 300 accctgaccg gcggcgcccg atga 324 <210> 20 <211> 294 <212> DNA <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 20 atgaccttcg tccacgtcga catccaccac atcacccaca cctgcccagc caaccctgag 60 ctgcacccgt tcgacacccg ccgcaccatc gtcgccaccg tcgacggcgg cccctgccgc 120 aaccccatct ccatccgctg cggcgacaag accgccgtta tcgactgcgg ccgtcacgaa 180 ccccaccatc ggcaatgccc ggcctgccgc atcaccgtca tcgaacggca catcaccagc 240 accttcgtcg gccaccacgg cccgcagctc gccaccacca ggatcgctgc ctga 294 <210> 21 <211> 1797 <212> DNA <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 21 atgagcacgt cgacgctgga cctcgcaccc cgggagaact ctgcccgggg tgcgggctcg 60 aacgccgacg cctggacacc cccacccgcc gactacaccg cagccggcca agccctcacc 120 cgcgccaccc aacccggcta cttcgactgg ctcgaccacg tccgcgccgc cgccgggtgc 180 acccgcccgg tccggctcac cggcaccctc gacaccatcg aagccaccac cgggcgcctg 240 ctcgactccc ggcacaccga ccaacttccc gatgccgcta tctacaaggc ctgcggtaac 300 cggcgctcca ccgtgtgccc cgcctgcgcc cgcacctacc agcgcgacgc gttccagatc 360 ctgcgcgccg ggctcatcgg cggcaaaggc gtccccacca cggtcgcccg gcaccccgcc 420 gtgttcgtca ccctcaccgc cccctccttc ggcgcggtcc acacccgcca cgtccgcaaa 480 cacacctgca cgaatcgcgc ccgctgtagc tgccgccccg aaccctgcca cgcccgccgc 540 aaccccggcc tctgccagca ctaccaaccc gccgtctgct gggcacgcca cgaacccggc 600 gacccccagc tcggccgtcc cctctgcctg gactgctacg accaccagca ccacgtcgtc 660 tggaacctgt tctccggcga actctggcac cgcaccaaac aggacgccga acgccgcctc 720 gccaaactct gcaaagcccg cggcatcccg ttccacgagg tcagcaacgg caaaaacctg 780 cgccggatcc caccggtccg cctcgcccac ggcaaagccg ccgagatgca acgccgcggc 840 gcggtccact tccacgccct gatccggctc gacggcatcg accccaccga ccccacccgc 900 gtcgtcgccc caccacccgg catcggcctc aacgacctgg tcgacgcact caccgccgcc 960 agcgacatcg acttcaccac cccagaccac cctgaccggc cggacggctg gccgatggcc 1020 tggggcgaac agatcgacat ccgcccgatc agcctcaccg gcaccggcga agtcaccgac 1080 agcatggtcg ccggatacct cgccaagtac gccaccaaaa gcaccgagat caccggccac 1140 aattcgacgc gcatcaccgg cgacaccatc acgcagcacg ccgatcccgc cggagaccac 1200 atcgcccggc tcatccacgc ctgctggcat ctcggcaacg accccgacgc cccagctggc 1260 aaaacggcga tccgactccc cgtctacacc ggcaccgccg gtgccaaaat ccggcagccc 1320 tttggagcgc cccgccactg tccggactgc ggtacccgca cccgctaccg gacctgccct 1380 gtatgcgtcg ccgaacgtca agccagcctt gacacccaac ggcccaacga ccgccagccc 1440 accccatacg cccggctccg ccgctgggcg cacatgctcg gcttcggcgg ccacttcctc 1500 accaaagccc gccggtactc ggtcaccttc cgcctgctcc gcgagactcg catcgacttc 1560 cgccgggctg agcccgatcc ggccgacaac gccaccgtgc acaccgtcga ccacctcgac 1620 gaaaccacgc ttatcgtcgg caccctgacc ttcgccggag tcggctggca caccaccggc 1680 gacgcactcc tcgccaacac cgctgcggct caggcccgcg agcgacaagc catcggccga 1740 gaggaactcg cgcacgaagc gagcacgtcc cggcctgtcg ccttgaacgc cgcctga 1797 <210> 22 <211> 207 <212> DNA <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 22 ttggacggca tcaccccgaa ggcgctctac cgcatcccgg aagccatgcg gatgctgagc 60 ttgagccgtt ccgtcatcta tgaactgatc cgctcggggc ggttgcgcac cgtcaaggag 120 ggtcgcaccc ggctggtccc ggccagcgcc atcaccgcct acgtcaccct gctcgaacag 180 gaaagcaaga aaggagtcgc cgcatga 207 <210> 23 <211> 1167 <212> DNA <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 23 atgaccaaac gccgcagccg tggagacggc gggctgcact gggacgaaca gcgccagcgc 60 tggatcgcct cggtcaccgt cggatacacc ccggccggta aacgcatcgt ccgtaaggca 120 agcggcaaga ccaagaccga ggccaacaat gcactccgtc agaagatccg tgagtaccag 180 gacgggctgt cgatccccac gaccggctac acggtcgccg acgccgtcac ggactggctc 240 acctacggac ttcccgacgt cgacgaggaa acggtcaaca actacacgct gctggccaac 300 ggtcacatca tcccggcgat cggtgcacgc aagctccgtg accccagcaa acagaaggaa 360 ctcagcgcca ccgacattga caggtggctg gccgacaaag ccaagattct cagcacccgc 420 acgctgcgac tgctgcactc gatcgcgaat cgcgccatca accgagcgat ggcccgcgac 480 aaggtcatgc gcaacgtcgt cgcactctgc aaggtaccga ccggcaccgc cggacgaccc 540 tccaagtcac tcacctacga gcaggccaaa gcgctcctcg tcgctgccga gtcgagcagc 600 ctgcacgcgt atgtagtttt gtcgctgctg accggtgctc gtaccgagga actgcgagaa 660 ctcacctggc agcacgtcga cctggtcgga cgtccggacg ccgagccacc gattccgccg 720 gccatccacg tatggcattc ggtgcgcgcc cacggtgaca ccaagaccaa gaagtcacgg 780 cgttcactcg ccctgccggt tcgctgtgtc cgggtcctca ccgcgcaacg cgcggcgcac 840 ggagatccac gaccggatga ctacgtctgc gccagcaagg tcggcaccca gctcgaccgg 900 cacaacgtgc tgcgagcctt ccgcgcgatc gtcgcggctg tccccggaat gaatccggct 960 gaatggacgc cccgcgaatt acggcacagt ttcgtttcgc tgctgtccga caatgggatg 1020 agcatcgagg aaatcgccga cctgtgtggt cattccggca cctcgatcac cgagaccgtt 1080 taccgccacc aactgcgccc ggttctgctg aacggcgcgg tggccatgga ccggatcttc 1140 ggtccggatg acactcctgg ggcttag 1167 <210> 24 <211> 93 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 24 Met Asp Ala Leu Ala Ser Ile Phe Ser Thr Ala Glu Phe Arg Lys Cys 1 5 10 15 Met Ser Glu Trp Arg Trp Ala Phe Glu Gln Ala Ala Ile Ala His Lys 20 25 30 Glu Tyr Gln Thr Phe Cys Ala Ala Pro Gln Val Gly Pro Asp Asn Pro 35 40 45 Lys His Glu Glu Gln Phe Ile Lys Leu Arg Asp Asp Arg Gln Tyr Arg 50 55 60 Ile Asp Ala Phe Gly Glu Ala His Lys Arg Leu Cys Glu Leu Ala Ala 65 70 75 80 Lys Asp Val Gln Gly Val Asn Ser Ser Leu Thr Leu Lys 85 90 <210> 25 <211> 256 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 25 Met Glu Thr Arg Leu His Glu Ile Trp Arg Ile Pro Asp Val Val Glu 1 5 10 15 Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Gln Ala Gly Ile Val Ala Gly Gly Val Thr 20 25 30 Asn Ser Thr Ser Leu Arg Arg Asp Thr Leu Asn Val Arg Pro Ala Thr 35 40 45 Trp Gln His Ile Arg Glu Asp Ala Phe Arg Arg Leu Val Cys Pro Ser 50 55 60 Asp His Arg His Gly Pro Asn Asp Ile Gly Glu Leu Ala Asp Ser Tyr 65 70 75 80 Ala Leu Thr Glu Pro Val Gly Cys Arg Ile Leu Phe Lys Leu Ser Val 85 90 95 Arg Leu Gln Gly Gly Pro Lys Arg Ala Ala His Ala Ala Ala Trp Ala 100 105 110 Arg Ala Gly Arg Leu Ala Gly Ala His Asp Arg His Ala Gly Ser Pro 115 120 125 Ser Ala Gly Val Gln Glu Arg Ile Gly Pro Arg Arg Arg Gln Ser Asn 130 135 140 Arg Arg Val Glu Ala Gly Glu Phe Gly Arg Cys Arg Pro Val Arg Pro 145 150 155 160 Gly Arg Arg Gly Arg Ala Ala Ala Arg Gly Arg Ser Ala Ser His Gly 165 170 175 Arg Arg Pro Pro Gly Ala Ala Ala Arg Ser Val Ser Gly Pro Leu Leu 180 185 190 Arg Gly Gln Gly Arg Phe Ala Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ser Gly Arg 195 200 205 Pro Gly Pro Arg Ser Leu Cys Gly Pro Ser Gly Gln Val Val Lys Arg 210 215 220 Gln Ala Asp Gly Leu Pro Ala Gly Gly Arg Ala Pro Pro His Pro Val 225 230 235 240 His Pro Thr Leu Gln Glu Pro Phe Ala Thr Ser Ala Ser Met Arg Asn 245 250 255 <210> 26 <211> 80 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 26 Met Arg Gly Leu Ala Glu Glu Leu Ala Ala Phe His Asp Glu Ala Ser 1 5 10 15 Pro Val Arg Asp Ala Leu Trp Phe Cys Asp Leu Thr Thr Thr Pro Asp 20 25 30 Gly Glu Arg Thr Thr Phe Glu Glu Arg Val Ala Glu Ile Lys Glu Arg 35 40 45 Tyr Gly Pro Gly His Leu Val Thr Ala Phe Ile Thr Glu Ala Ala Asp 50 55 60 Asp Leu Asn Ala Ala Ile Ala Arg Thr Ser Glu Arg Met Glu Arg Arg 65 70 75 80 <210> 27 <211> 172 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 27 Met Thr Leu Ala Glu Asp Leu Asp Arg Glu Gly Glu Pro Glu Arg Glu 1 5 10 15 Phe Asn Pro Gly Ile Ala Gln Arg Leu Pro Arg Lys Arg Val Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Leu Ile Arg Asp Ser Ala Asp Arg Ile Leu Phe Val Val Pro 35 40 45 Asn Tyr Lys Pro Leu Leu Asp Ile Pro Gly Gly Ile Ala Glu Gly Asn 50 55 60 Glu Ser Pro Leu Ala Ala Cys Arg Arg Glu Ile Lys Glu Glu Ile Gly 65 70 75 80 Leu Asp Leu Pro Ile Gly Arg Leu Leu Val Val Asp Trp Ile Pro Gln 85 90 95 His Gly Val Trp Pro Asp Gly Val Met Phe Ile Phe Asp Gly Gly Arg 100 105 110 Leu Thr Asp Asp Glu Ser Arg Asp Leu Lys His Thr Asp Asp Glu Leu 115 120 125 Val Gly Leu Lys Phe Leu Ala Leu Asp Asp Ala Arg His Gln Leu Arg 130 135 140 Pro Ser Met Val Arg Arg Leu Glu Ala Gly Ile Glu Ala Leu Ser Asp 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Tyr Leu Glu Phe Gly Arg Thr Gln 165 170 <210> 28 <211> 444 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 28 Met Thr Pro Leu Arg Leu Glu Arg Gln Lys Leu Gly Trp Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Leu Ala His Glu Leu Glu Arg Arg Ala Gln Gly Arg Phe Ser Leu 20 25 30 Ala Thr Arg Ala Ser Leu Leu Arg Met Ile Ser Ala Trp Glu Ser Gly 35 40 45 Ala Arg Asp Thr Ser Asp Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Cys Glu Ala Tyr 50 55 60 Gly Arg Thr Ala Asp Glu Leu Gly Leu Gly Gly Gly Thr Asp Arg Ala 65 70 75 80 Glu Ser Ser Val Gly Leu Ser Tyr Ala Ser Ser Leu Asp Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ile Leu Ser Asp Leu Ala Arg Phe Asp Asp Met Lys His Pro Ala 100 105 110 Val Ser Gln Gly Arg Tyr Gln Pro Asp Ala Leu Asn Ala Val Cys Leu 115 120 125 Asp Trp Leu Phe Gly Thr Ala Ser Asn Asp Met Pro Ala Gly Ala Gly 130 135 140 Lys Arg Val Thr Met Lys Asp Val Glu Glu Ile Arg Ala Thr Thr Ser 145 150 155 160 Met Phe Asp Ser Leu Asp Arg Arg Phe Gly Gly Glu Asn Ala Arg Ser 165 170 175 Met Ala Val Arg Phe Leu Arg Glu Ala Val Leu Pro Arg Phe Gly Lys 180 185 190 Thr Ser Asp Gln Thr Val Thr Thr Glu Leu Tyr Arg Ala Ala Ala Ile 195 200 205 Leu Cys Glu Leu Ile Gly Trp Met Ser Phe Asp Thr Ser Arg Asn Ser 210 215 220 Leu Ala Gln Arg Tyr Phe Thr Gln Ala Leu Arg Leu Ala Glu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Asp Arg Ala Tyr Ala Ser Tyr Ile Leu Ala Ser Met Ala Asp Gln 245 250 255 Ala Leu Phe Leu Lys Arg Pro Asp Gln Ala Leu Arg Leu Ala Gln Val 260 265 270 Ala Arg Asp Ala Gly Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Ala Thr Thr Glu 275 280 285 Ala Ser Met Leu Glu Ala Arg Ala Phe Ala Ala Gln Gly Asp Glu Ser 290 295 300 Gly Cys Thr Arg Ala Leu Leu Arg Ala Glu Ala Ala Phe Asn Ser Ile 305 310 315 320 Ser Ala Asp Asp Asn Pro Ser Trp Ala Asn His Trp Gly Asp Ile Leu 325 330 335 Phe Ala Ser His Ala Gly Thr Cys Trp Val Asp Leu Gly Ala Pro Lys 340 345 350 Glu Ala Ala Ser Leu Val Arg Thr Val Trp Asp Ser Ala Lys Asp Gln 355 360 365 Ala Arg Arg Arg Val Tyr Ser Gly Val Gln Leu Ala Arg Val Ala Leu 370 375 380 Leu Thr Asn Glu Val Glu Gln Ala Val Ser Tyr Gly Ile Ala Ala Leu 385 390 395 400 Glu Ala Thr Ser Gly Leu Thr Ser Asn Arg Ser Leu Gln Gln Leu Arg 405 410 415 Asp Leu Arg Asp Gln Leu Gly Asn His Ala Lys His Pro Ala Val Val 420 425 430 Glu Phe Glu Glu Arg Ala Arg Leu Val Leu Ala Ala 435 440 <210> 29 <211> 105 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 29 Met Lys Leu Tyr Val Asp Thr Thr Gly Lys Gln Val Thr Val Ser Lys 1 5 10 15 Pro Thr Glu Pro Lys Asn Asp Gln Asn Gly Asn Gln Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Asn Thr Gly Arg Pro Met Trp Ser Thr Gln Val Ile Val Leu Asp Glu 35 40 45 Thr Gly Gly Glu Val Ile Ala Ile Thr Thr Ala Gly Glu Lys Pro Asn 50 55 60 Val Thr Val Gly Gln Leu Val Ala Ile Glu Gln Leu Glu Ala Ile Pro 65 70 75 80 Trp Ala Thr Asn Gly Arg Asn Gly Val Ala Phe Arg Ala Val Ser Leu 85 90 95 Lys Pro Leu Ser Gly Ala Ser Ala Lys 100 105 <210> 30 <211> 69 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 30 Met Phe Arg Tyr Tyr Val Ser Tyr Met Phe Gln Gly Gly Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Ile Asp Ile His Ser Lys Asn Pro Ile Thr Glu Gln Gly Asp Leu Leu 20 25 30 Glu Thr Lys Asp Leu Ile Asn Gln Ala Ala Gly Arg Ile Leu Pro Gly 35 40 45 Leu Thr Val Met Ala Phe Ser Arg Tyr Gly Ser Val Gln Pro Lys Pro 50 55 60 Gln Arg Ala Gln Arg 65 <210> 31 <211> 306 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 31 Met Ser Lys Ser Thr Arg Pro Gly Arg Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr 1 5 10 15 Val Thr Val Ile Glu Gln Arg Val His Arg Ser Ala Ala Glu Asn Ala 20 25 30 Arg Phe Ala Phe Ile Phe Thr Val Ile Val Ser Gly Leu Val Ala Leu 35 40 45 Val Val Ala Lys Gly His Met His Pro Leu Leu Ala Ala Phe Val Ala 50 55 60 Ala Pro Ile Ala Ala Val Cys Gly Ala Leu Val Trp Ala Leu Val Arg 65 70 75 80 Ser Trp Pro Val Leu Arg Met Leu Trp Trp Trp Thr Pro Glu Ile Gly 85 90 95 Ala Thr Val Leu Leu Ala Trp Gly Trp Thr Ala Leu Ala Ala Ser Thr 100 105 110 Ser Gln Ile Leu Thr Ala Val Ile Leu Ala Val Leu Val Gly Gly Pro 115 120 125 Ala Cys Val Pro Val Leu Arg Arg Trp Thr Val Ala Ile Phe Trp Cys 130 135 140 Val Ala Val Arg His Arg Leu Arg Val Cys Phe Ser Gln Phe Ile Ile 145 150 155 160 Thr Asn Arg Ser Gly Ser Leu Pro Leu Ile Leu Gly Ala Trp Pro Thr 165 170 175 Pro Val Gly Glu Arg Val Trp Val Leu Leu Arg Pro Gly Leu Ser Val 180 185 190 Asp Tyr Leu Thr Gln Gln Val Gly Lys Ile Ala Val Ala Cys His Ala 195 200 205 Lys Thr Val Arg Val Asp Leu Ala Gly Ser Thr Asn Ser Ala Phe Val 210 215 220 Arg Phe Asp Ile Lys Arg Arg Glu Val Leu Thr Ala Lys Val Ser Thr 225 230 235 240 Pro Leu Ile Asp Glu Ile Asp Pro Ile Val Pro Leu Asp Asp Lys Glu 245 250 255 Ser Ala Thr Val Thr Gly Leu Asp Leu Pro Asp Ile Asp Asp Ile Pro 260 265 270 Thr Ala Thr Glu Pro Ala Ile Pro Lys Gln Ala Ala Ala Ser Ser Asn 275 280 285 Gly Arg Lys Pro Ala Thr Ala Ala Asp Asp Gly Asp Asp Ile Asn Gln 290 295 300 Trp Ile 305 <210> 32 <211> 124 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 32 Met Ser Ile Phe Asp Leu Tyr Gly Gln Thr Gln His Leu Glu Arg Leu 1 5 10 15 Asp Pro Gln Gly Val Thr Asp Phe Val Asn Asp Glu Leu Ile Val Ser 20 25 30 Asp Ile Asp Ser Arg Gln Ala Leu Glu Asp Leu Ala Trp Met Thr Ala 35 40 45 Gly Leu Phe Ser Asp Gly Asn Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Ile Asp Asp 50 55 60 Gly Trp Asp Val Thr Asp Gly Ser His His Gly Leu Thr Glu Gln Gln 65 70 75 80 Arg Gly Glu Leu Ile Ala Arg Leu Gly Thr Ile Ala His Asn Cys Gly 85 90 95 Gln Leu Val Ala Glu Leu Cys Arg Arg Ala Ser Ala Val Lys Arg Glu 100 105 110 Ser Gly Trp Asp Pro Leu Val Thr Thr Glu Pro Ile 115 120 <210> 33 <211> 293 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 33 Met Ser Thr Ile Ala Cys Asp Pro Leu Gly Thr Asp Arg Val Pro Val 1 5 10 15 Gly Pro Gly Met Ser Met Phe Asp Pro Leu Phe Ile Gly Ile Asp Glu 20 25 30 Phe Gly Glu His Val Thr Leu Asp Ile Val Tyr His Asn Leu Leu Thr 35 40 45 Ala Gly Glu Pro Gly Gly Gly Lys Ser Gly Leu Leu Asn Leu Val Ala 50 55 60 Ala Thr Ala Ala Leu Ser Asp Asn Thr Arg Leu Ile Gly Met Asp Gly 65 70 75 80 Lys Trp Val Glu Leu Gly Pro Trp Glu Pro Ile Met Asp Ala Phe Ile 85 90 95 Gly Asp Asp Ile Asp Leu Ala Ile Lys Thr Val Arg Arg Leu Leu Thr 100 105 110 Val Ala Arg Asn Arg Tyr Arg Trp Leu Leu Ala Asn Arg Arg Arg Lys 115 120 125 Ile Thr Arg Glu Asp Asn Leu Ser Thr Ile Ile Thr Ile Ile Asp Glu 130 135 140 Ile Ala Met Phe Ser Thr Val Leu Gly Thr Lys Ala Gln Gln Glu Glu 145 150 155 160 Phe Ser Thr Leu Leu Arg Gly Leu Val Ala Leu Gly Arg Ala Cys Ala 165 170 175 Met Pro Val Val Gly Ala Thr Gln Arg Pro Ser Trp Asp Ile Ile Pro 180 185 190 Ala Ser Leu Arg Asp Leu Phe Gly Tyr Arg Cys Ala Phe Arg Cys Thr 195 200 205 Thr Val Gly Ser Ser Asp Val Ile Leu Gly Ser Gly Leu Ala Glu Val 210 215 220 Gly Phe Asp Ala Ser Thr Ile Ser Pro Asp Asn Pro Gly Glu Ala Leu 225 230 235 240 Leu Arg Ala Glu Lys Lys Leu Pro Tyr Pro Ile Lys Ala Ala Trp Leu 245 250 255 Ser Asp Asp Asp Ile Tyr Ala Ile Ala Asp Tyr Ala Ala Trp Leu Arg 260 265 270 Arg Pro Thr Asn Pro Ala Thr Thr Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Thr Gln 275 280 285 Trp Glu Met Ala Ala 290 <210> 34 <211> 66 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 34 Met Thr Glu Thr Arg Ala Gln Ala Ile Thr Gly Val Ile Ala Gly Thr 1 5 10 15 Ala Thr Thr Thr Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Leu Val Gly His Leu Thr 20 25 30 Arg His Gln Ala Pro Val Gly Val Leu Ala Leu Ala Ile Thr Ala Ala 35 40 45 His Val Arg Lys His His Pro Arg Arg Trp Thr Ala Pro Gly Thr Thr 50 55 60 Thr Ala 65 <210> 35 <211> 149 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 35 Met Lys Pro Thr His Gln Pro Ala Asn Thr Pro Val Thr Asp Pro Thr 1 5 10 15 Met Thr Pro Ala Ala Leu Leu Arg Ala Ala Ala Leu Tyr Leu Gln Gln 20 25 30 His Gly Trp Thr Gln His Gln Phe Tyr Asp Leu Val Ala Ile Thr Asp 35 40 45 Gly Gln Phe Pro Pro Ala Cys Ala Ser Gly Ala Ile Met Thr Ala Ala 50 55 60 Thr Gly Arg Cys Leu Ala Ser Gly Val Cys Thr Leu Asp Gly Asp Pro 65 70 75 80 Asp Thr Ile Ala Ala Ile Arg Ala Leu Arg Val Phe Ala Ala Trp Leu 85 90 95 Asp Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Gly Phe Tyr Glu Thr Ser Ala Ile Asp 100 105 110 Val Val Gly Asp Trp Asn Asp Tyr Glu Gly Arg Thr Arg Asp Glu Val 115 120 125 Ile Glu Thr Leu Thr Asp Ala Ala Asp Asp Trp Asp Arg Leu His His 130 135 140 Thr Gly Gly Ala Arg 145 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 36 Met Ser Leu Ser Tyr Val Asn Pro Ala Leu Thr Pro Thr Ala Pro Ala 1 5 10 15 Gly Asp Ser Arg Pro Ser Lys Pro Arg Arg Arg Asp Val Val Glu Asn 20 25 30 Asp Glu Tyr Ala Ala Phe Val Arg Arg Ile Ile Arg Ala Phe Ala Lys 35 40 45 Arg Val Ala Thr Gly Asp Val Glu Ala Leu Arg Asp Met Val Gly Leu 50 55 60 Ser Ala Gln Leu Asp Asp Ala Ile Ser Glu Ala Val Ile Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Tyr Ser Trp Ala Glu Ile Gly Asp Arg Leu Gly Ile Ser 85 90 95 Arg Gln Ala Ala Gln Gln Arg Trp Gly Gly Asp Lys 100 105 <210> 37 <211> 138 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 37 Met Thr Thr Ser Ala Leu Thr Asn Asp Tyr Leu Glu Ala Leu Gly Ala 1 5 10 15 Arg Thr Gly Ile Arg Val Glu Phe Tyr Asp Pro Thr Gly Ser Arg Tyr 20 25 30 Gly Phe Pro Thr Phe Pro Tyr Arg Gln Ala Pro Glu His Leu Ala Thr 35 40 45 Arg Arg Gln Leu Arg Ala Asp Gly Leu Cys Pro Asn Gly Tyr Asp Pro 50 55 60 Val Ala Gln Ile Leu Trp Met His Arg Gly Gln Arg Arg Val Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Arg Asp Leu Ala Lys Pro Lys Arg Val Pro Thr Ala Ala 85 90 95 Gln Leu Ala Val Val Ala Lys Met Leu Leu Ala Arg Arg Thr Cys Asp 100 105 110 Ser Cys Gly Val Thr Arg Asp Tyr Tyr Ile Pro Arg Arg Thr Gly Ile 115 120 125 Cys Leu Ser Cys Glu Val Gly Gly Ser Arg 130 135 <210> 38 <211> 61 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 38 Met Thr Thr Asp Pro Glu Asn Asn Ser Pro Ala Thr Thr Arg Cys Gln 1 5 10 15 Cys Gly Asp His Tyr Cys Ala Glu Val Met Pro Lys Asp Gln Asp Arg 20 25 30 Ser Gln Cys Cys Gln Tyr Cys Gly Tyr Arg Asp Cys Asp Val Cys Gly 35 40 45 Trp Thr Asp Gln Ala Leu Arg Ser Pro Glu Val Ser Arg 50 55 60 <210> 39 <211> 96 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 39 Met Ser Leu Ile Asp Leu Gly Lys His Leu Ala Thr Asp Asn Cys Leu 1 5 10 15 Trp Cys Ile Gly Gly Met Ser Pro Ala Gly Ile His Pro Asp Leu Gly 20 25 30 Pro Val Leu Cys Leu Cys Pro Thr Glu Gln Trp Cys Asp Glu Cys Gly 35 40 45 Ser Thr Ser Leu Phe Pro Ala Glu Tyr Glu Thr Leu Asp Asp Arg Ile 50 55 60 Asn Glu Leu Phe Asp Asp Gly Leu Ser Ala Val Trp Cys Glu Ala Cys 65 70 75 80 Met Gly Val Val Ala Val Ile Pro Val Thr Asn Asp Gly Gly Ile Arg 85 90 95 <210> 40 <211> 169 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 40 Met Asn Pro Leu Arg Arg Lys Ala Ala Gln Gln Pro Thr Thr Gly Pro 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ala Ser Val Asn Leu Thr Glu Gln Phe Ala Ile Glu Tyr 20 25 30 Ala Lys Ser Ala Val Pro Asn Met Leu Lys Ala Ile Asp Ser Val Lys 35 40 45 Arg Tyr Asn Arg Ala Thr Leu Ile Gly Ala Leu Ile Thr Ser Tyr Leu 50 55 60 His Gln Ala His Tyr Leu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Tyr Phe Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Pro Pro Ala Ile Phe Asp Thr Ala Met Val Ser Met Leu Ile Val 85 90 95 Val Arg Thr Pro Gly Ile Val Lys Asp Ala Lys Arg Trp Ala Met Ala 100 105 110 Val Phe Ile Gly Ala Ala Leu Leu Ser Ala Thr Val Asn Phe Ala Ala 115 120 125 Pro Ala Thr Ser Ala Cys Ala Ser Ser Ser Pro Trp Ser Ser Ser Trp 130 135 140 Ser Ser Ala Ser Asn Ser Ser Pro Asp Ala Ser Ala Pro Thr Ser Pro 145 150 155 160 Pro Ser Thr Asn Lys Pro Pro Asn Ser 165 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 41 Met Thr Ala Val Asn Lys Ile Lys Ala Arg Gly Thr Ala Thr Thr Pro 1 5 10 15 Glu Pro Glu His Thr Thr Thr Gly Pro Thr Ala Pro Val Glu Gln Pro 20 25 30 Ala Thr Pro Gln Thr Ala Pro Val Val Pro Ala His Leu Leu Pro Ala 35 40 45 Ala Arg Phe Ser Val Val Gln His Glu Gln Thr Thr Gly Gln Pro Ile 50 55 60 Thr Ala Asp Asp Leu Ala Leu Arg Leu Asn Ile Thr Pro Ala Val Ala 65 70 75 80 Glu Thr Leu Ile Thr Thr Ile Arg Asp Thr Asn Pro Ala Arg Ile Asn 85 90 95 Gly His Ile Pro Thr Leu Thr Gly Gly Ala Arg 100 105 <210> 42 <211> 97 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 42 Met Thr Phe Val His Val Asp Ile His His Ile Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 15 Ala Asn Pro Glu Leu His Pro Phe Asp Thr Arg Arg Thr Ile Val Ala 20 25 30 Thr Val Asp Gly Gly Pro Cys Arg Asn Pro Ile Ser Ile Arg Cys Gly 35 40 45 Asp Lys Thr Ala Val Ile Asp Cys Gly Arg His Glu Pro His His Arg 50 55 60 Gln Cys Pro Ala Cys Arg Ile Thr Val Ile Glu Arg His Ile Thr Ser 65 70 75 80 Thr Phe Val Gly His His Gly Pro Gln Leu Ala Thr Thr Arg Ile Ala 85 90 95 Ala <210> 43 <211> 598 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 43 Met Ser Thr Ser Thr Leu Asp Leu Ala Pro Arg Glu Asn Ser Ala Arg 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Asn Ala Asp Ala Trp Thr Pro Pro Pro Ala Asp Tyr 20 25 30 Thr Ala Ala Gly Gln Ala Leu Thr Arg Ala Thr Gln Pro Gly Tyr Phe 35 40 45 Asp Trp Leu Asp His Val Arg Ala Ala Ala Gly Cys Thr Arg Pro Val 50 55 60 Arg Leu Thr Gly Thr Leu Asp Thr Ile Glu Ala Thr Thr Gly Arg Leu 65 70 75 80 Leu Asp Ser Arg His Thr Asp Gln Leu Pro Asp Ala Ala Ile Tyr Lys 85 90 95 Ala Cys Gly Asn Arg Arg Ser Thr Val Cys Pro Ala Cys Ala Arg Thr 100 105 110 Tyr Gln Arg Asp Ala Phe Gln Ile Leu Arg Ala Gly Leu Ile Gly Gly 115 120 125 Lys Gly Val Pro Thr Thr Val Ala Arg His Pro Ala Val Phe Val Thr 130 135 140 Leu Thr Ala Pro Ser Phe Gly Ala Val His Thr Arg His Val Arg Lys 145 150 155 160 His Thr Cys Thr Asn Arg Ala Arg Cys Ser Cys Arg Pro Glu Pro Cys 165 170 175 His Ala Arg Arg Asn Pro Gly Leu Cys Gln His Tyr Gln Pro Ala Val 180 185 190 Cys Trp Ala Arg His Glu Pro Gly Asp Pro Gln Leu Gly Arg Pro Leu 195 200 205 Cys Leu Asp Cys Tyr Asp His Gln His His Val Val Trp Asn Leu Phe 210 215 220 Ser Gly Glu Leu Trp His Arg Thr Lys Gln Asp Ala Glu Arg Arg Leu 225 230 235 240 Ala Lys Leu Cys Lys Ala Arg Gly Ile Pro Phe His Glu Val Ser Asn 245 250 255 Gly Lys Asn Leu Arg Arg Ile Pro Pro Val Arg Leu Ala His Gly Lys 260 265 270 Ala Ala Glu Met Gln Arg Arg Gly Ala Val His Phe His Ala Leu Ile 275 280 285 Arg Leu Asp Gly Ile Asp Pro Thr Asp Pro Thr Arg Val Val Ala Pro 290 295 300 Pro Pro Gly Ile Gly Leu Asn Asp Leu Val Asp Ala Leu Thr Ala Ala 305 310 315 320 Ser Asp Ile Asp Phe Thr Thr Pro Asp His Pro Asp Arg Pro Asp Gly 325 330 335 Trp Pro Met Ala Trp Gly Glu Gln Ile Asp Ile Arg Pro Ile Ser Leu 340 345 350 Thr Gly Thr Gly Glu Val Thr Asp Ser Met Val Ala Gly Tyr Leu Ala 355 360 365 Lys Tyr Ala Thr Lys Ser Thr Glu Ile Thr Gly His Asn Ser Thr Arg 370 375 380 Ile Thr Gly Asp Thr Ile Thr Gln His Ala Asp Pro Ala Gly Asp His 385 390 395 400 Ile Ala Arg Leu Ile His Ala Cys Trp His Leu Gly Asn Asp Pro Asp 405 410 415 Ala Pro Ala Gly Lys Thr Ala Ile Arg Leu Pro Val Tyr Thr Gly Thr 420 425 430 Ala Gly Ala Lys Ile Arg Gln Pro Phe Gly Ala Pro Arg His Cys Pro 435 440 445 Asp Cys Gly Thr Arg Thr Arg Tyr Arg Thr Cys Pro Val Cys Val Ala 450 455 460 Glu Arg Gln Ala Ser Leu Asp Thr Gln Arg Pro Asn Asp Arg Gln Pro 465 470 475 480 Thr Pro Tyr Ala Arg Leu Arg Arg Trp Ala His Met Leu Gly Phe Gly 485 490 495 Gly His Phe Leu Thr Lys Ala Arg Arg Tyr Ser Val Thr Phe Arg Leu 500 505 510 Leu Arg Glu Thr Arg Ile Asp Phe Arg Arg Ala Glu Pro Asp Pro Ala 515 520 525 Asp Asn Ala Thr Val His Thr Val Asp His Leu Asp Glu Thr Thr Leu 530 535 540 Ile Val Gly Thr Leu Thr Phe Ala Gly Val Gly Trp His Thr Thr Gly 545 550 555 560 Asp Ala Leu Leu Ala Asn Thr Ala Ala Ala Gln Ala Arg Glu Arg Gln 565 570 575 Ala Ile Gly Arg Glu Glu Leu Ala His Glu Ala Ser Thr Ser Arg Pro 580 585 590 Val Ala Leu Asn Ala Ala 595 <210> 44 <211> 68 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 44 Met Asp Gly Ile Thr Pro Lys Ala Leu Tyr Arg Ile Pro Glu Ala Met 1 5 10 15 Arg Met Leu Ser Leu Ser Arg Ser Val Ile Tyr Glu Leu Ile Arg Ser 20 25 30 Gly Arg Leu Arg Thr Val Lys Glu Gly Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Ala Tyr Val Thr Leu Leu Glu Gln Glu Ser Lys Lys 50 55 60 Gly Val Ala Ala 65 <210> 45 <211> 388 <212> PRT <213> Actinoplanes sp. SE50/110 <400> 45 Met Thr Lys Arg Arg Ser Arg Gly Asp Gly Gly Leu His Trp Asp Glu 1 5 10 15 Gln Arg Gln Arg Trp Ile Ala Ser Val Thr Val Gly Tyr Thr Pro Ala 20 25 30 Gly Lys Arg Ile Val Arg Lys Ala Ser Gly Lys Thr Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Asn Ala Leu Arg Gln Lys Ile Arg Glu Tyr Gln Asp Gly Leu Ser 50 55 60 Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Val Ala Asp Ala Val Thr Asp Trp Leu 65 70 75 80 Thr Tyr Gly Leu Pro Asp Val Asp Glu Glu Thr Val Asn Asn Tyr Thr 85 90 95 Leu Leu Ala Asn Gly His Ile Ile Pro Ala Ile Gly Ala Arg Lys Leu 100 105 110 Arg Asp Pro Ser Lys Gln Lys Glu Leu Ser Ala Thr Asp Ile Asp Arg 115 120 125 Trp Leu Ala Asp Lys Ala Lys Ile Leu Ser Thr Arg Thr Leu Arg Leu 130 135 140 Leu His Ser Ile Ala Asn Arg Ala Ile Asn Arg Ala Met Ala Arg Asp 145 150 155 160 Lys Val Met Arg Asn Val Val Ala Leu Cys Lys Val Pro Thr Gly Thr 165 170 175 Ala Gly Arg Pro Ser Lys Ser Leu Thr Tyr Glu Gln Ala Lys Ala Leu 180 185 190 Leu Val Ala Ala Glu Ser Ser Ser Leu His Ala Tyr Val Val Leu Ser 195 200 205 Leu Leu Thr Gly Ala Arg Thr Glu Glu Leu Arg Glu Leu Thr Trp Gln 210 215 220 His Val Asp Leu Val Gly Arg Pro Asp Ala Glu Pro Pro Ile Pro Pro 225 230 235 240 Ala Ile His Val Trp His Ser Val Arg Ala His Gly Asp Thr Lys Thr 245 250 255 Lys Lys Ser Arg Arg Ser Leu Ala Leu Pro Val Arg Cys Val Arg Val 260 265 270 Leu Thr Ala Gln Arg Ala Ala His Gly Asp Pro Arg Pro Asp Asp Tyr 275 280 285 Val Cys Ala Ser Lys Val Gly Thr Gln Leu Asp Arg His Asn Val Leu 290 295 300 Arg Ala Phe Arg Ala Ile Val Ala Ala Val Pro Gly Met Asn Pro Ala 305 310 315 320 Glu Trp Thr Pro Arg Glu Leu Arg His Ser Phe Val Ser Leu Leu Ser 325 330 335 Asp Asn Gly Met Ser Ile Glu Glu Ile Ala Asp Leu Cys Gly His Ser 340 345 350 Gly Thr Ser Ile Thr Glu Thr Val Tyr Arg His Gln Leu Arg Pro Val 355 360 365 Leu Leu Asn Gly Ala Val Ala Met Asp Arg Ile Phe Gly Pro Asp Asp 370 375 380 Thr Pro Gly Ala 385

Claims

a) 서열번호 1의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드,
b) 엄격한(stringent) 조건 하에 (a)에서 특정된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 및
c) 서열번호 1의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 군에서 선택된 방선균류 통합 및 접합 인자.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 방선균류 통합 및 접합 인자.
제1항 또는 제2항의 방선균류 통합 및 접합 인자로 형질전환된 숙주 세포.
제3항에 있어서, 액티노플라네스(Actinoplanes) sp.인 숙주 세포.
a) 제3항 또는 제4항의 숙주 세포를 유용한 배지에서 배양하고,
b) 배양물로부터 생성물을 수확하여
c) 생성물을 단리하고 정제하는 단계를 포함하는 생물학적 생성물의 제조방법.
제5항에 있어서, 생성물이 아카보즈인 방법.