KR20080032641A - 티오코랄린의 생합성에 수반되는 유전자 및 그의 이종적생산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 티오코랄린 생합성에 수반되는 유전자 및 그의 이종적 생산에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자의 클러스터가 동정되고 클로닝되었다. 상기 유전자 클러스터는 항종양 및 항박테리아 활성을 가진 티오코랄린의 이종적 생산에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터 및 티오코랄린의 이종적 생산에서의 그의 용도에 관한 것이다.
티오코랄린 (I)
은 해양 방선균, 구체적으로는 미크로모노스포라세 (Micromonosporaceae) 패밀리로부터 분리되는 시클로이량체성 티오뎁시펩티드이다 (Perez Baz et al., J. Antibiotics, 50(9), 738-741, 1997; Romero et al., J. Antibiotics, 50(9), 734-737, 1997). 티오코랄린이 미크로모노스포라 마리나 (Micromonospora marina) 또는 미크로모노스포라 종 (Micromonospora sp .) L-13-ACM-092 으로부터 수득된다는 것이 기재되어 왔지만, 후속적인 연구는 상기 화합물이 방선균 미크로모노스포라 종 (Micromonospora sp .) ML1 로부터도 분리될 수 있다는 것을 보였는데, 이것은 모잠비크의 인도양 해안에서 발견되는 해양 연체동물에서 분리된다 (Espliego, F. Ph.D. Thesis, 1996, University of Leon; de la Calle, F. Ph.D. Thesis, 1998, Autonomous University of Madrid).
시험관내 연구는, 흑색종, 유방암, 작지 않은 (non-microcytic) 폐암 및 대장암과 같은 다양한 타입의 고체 종양의 세포주 성장을 저해하는 티오코랄린의 역량을 보여줬다. 티오코랄린은 또한 인간 암종 이종이식편에 대한 생체내 검정에서 괄목할 항종양 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다 (Faircloth et al. Eur. J. Cancer, 33, 175, 1997 (abstract)). 티오코랄린은 추가로 그람-양성 박테리아에 대한 항박테리아 활성을 보여준다.
상기 해양 방선균 (Micromonospora sp. ML1) 유래의 티오코랄린을 수득하는 것은 작은 규모 상에서 실행가능하지만, 큰 규모에서는 상기 수득은 상기 미생물에서 관찰되는 변이성으로 인해 제한된다. 한편, 상기 유기체에서의 티오코랄린의 생산은 상기 유기체의 느린 성장 속도로 인해 시간 소모적인 프로세스이며, 상이한 뱃치마다 생산 수율에 있어서 상당한 변동성을 나타낸다.
따라서, 한편으로는 상기 해양 방선균에서 티오코랄린을 수득하는 것이 상당히 제한된다는 사실과, 다른 한편으로는 티오코랄린 분자가 복잡한 구조를 가져 공업적 수준에서 그의 합성은 번잡할 수 있다는 사실로 인해, 지령된 방식으로 상기 수득물에 작용할 수단을 창출하고자 하는 목적으로 그의 생합성의 유전적 근간을 이해하는 것이 바람직하다. 자연 생산 균주들은 일반적으로 상기 생성물을 매우 불규칙한 방식으로 낮은 농도로 생산하니, 그러한 이해는 생산될 티오코랄린의 증량을 유도할 수도 있다. 마찬가지로, 이는 또한 자연적으로는 상기 화합물을 생산하지 않는 숙주에서의 티오코랄린 생산을 가능하게 할 수도 있다.
재조합 DNA 기술의 발전은, 주로 방선균 군 유래 박테리아의, 상기 생활성 화합물의 생합성에 수반되는 유전자를 취급함으로써 생활성 화합물을 생성 및 생산하기 위한 흥미있는 연구 분야를 개척했다. 상기 기술은 기존의 공지된 자연 화합물의 생산 개선에 이용될 수 있는데, 이는 자연 균주가 일반적으로 관심대상의 대사물을 낮은 농도로 생산하기 때문이다.
마찬가지로, 유전자 조작 및 발효작용에 더욱 적합한 다른 방선균에서의 티오코랄린의 생합성에 수반되는 유전자 클러스터의 이종적 발현은, 더 짧은 발효작용 시간에 더 큰 재현가능한 수율로 상기 화합물을 생산하는 것을 가능하게 할 것이다.
공지된 바와 같이, 다수의 박테리아 및 진균이, 항종양 및 항박테리아 펩티드 등을 포함하여, 비-리보좀 기원을 가진 광범위한 생물학적 활성 펩티드를 합성한다. 상기 화합물 패밀리의 생합성은 비-리보좀 펩티드 합성효소 (NRPS) 에 의해 수행되는데, 이는 모듈성의 촉매 도메인 구성을 가진 다관능성 효소이다. 각각의 상기 모듈은 연장 순환 (elongation cycle) 을 수행하는데, 즉 특이적 아미노산을 화합물의 최종 구조로 활성화 및 혼입한다. 최소 모듈은 3 개의 도메인에 의해 형 성된다: (i) 특정 아미노산을 선택하고, ATP 를 이용하여 그의 아데닐화 아미노아실 버젼을 생성하는 이행능력이 있는 아데닐화 도메인, (A, 약 550 개의 아미노산이 있음); (ii) 보조인자로서 작용하는 포스포판테테인온 (PP) 보결분자단을 포함하며, 공유 결합에 의해 P 도메인에 결합하는 펩티딜 캐리어 도메인 (P, 약 80 개의 아미노산이 있음); 상기 도메인은 이후 반응 중심으로 이동하기 전에 활성화된 아데닐화 아미노산을 고정하는 이행능력이 있음; 및 (iii) 2 개의 연속적인 P 도메인에 위치하는 2 개의 아데닐화 아미노아실 부분 사이에 신규한 펩티드 결합을 생성하는 축합 도메인 (C, 약 450 개의 아미노산이 있음). C 도메인은 계의 첫번째 아미노산을 활성화시키는 모듈에는 부재한다. 소정의 NRPS 는 D-아미노산을 유도하는 에피머화, N- 또는 C-타입 메틸화, L-Cys 또는 L-Ser 아미노산 상에 작용하는 순환 작용 (circulation) 과 같은 특이적인 활성을 수행하기 위한 가외의 도메인을 갖는다. 마지막 모듈 다음에 위치하는 최종 도메인은 일반적으로 중간체 효소를 방출하고, 선형 또는 환형 펩티드를 생성하는 이행능력을 갖는다. 일반적 규칙으로서, 상이한 모듈의 구조는 생성물 펩티드의 최종 아미노산 서열을 반영한다. 이러한 상관성 규칙은 NRPS 에서의 각 모듈에 대한 특이적인 활성화 관능을 정하도록 해 준다. NRPS 에 대한 정보는, 예를 들어 Quing-Tao, S. et al., 2004. Dissecting and Exploiting Nonribosomal Peptide Synthetases. Acta Biochimica et Biophysica. Sinica, 36 (4): 243-249 에서 찾을 수 있다.
발명의 개요
본 발명의 중요한 목적은 티오코랄린 생산 이행능력이 있는 단백질을 코딩하는 온전한 뉴클레오티드 서열을 분리 및 특징분석하는 것으로 이루어진다. 이를 토대로, 티오코랄린의 생합성에 수반되는 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 기능이 분리 및 결정될 수 있다. 상기 목적은 온전한 생합성적 티오코랄린 생산 경로와 관련된 모든 단백질을 코딩하는, 분리되어 임의로는 정제되는 신규한 핵산 분자를 제공함으로써 도달될 수 있다.
본 발명자들은 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 모든 유전자, 즉 티오코랄린의 생합성에 수반되는 유전자 클러스터를 동정 및 클로닝하여, 지령된 방식으로 상기 화합물의 생산 취급을 개선하기 위한 유전자적 기반을 제공할 수 있었다.
비-리보좀성 펩티드 합성효소 (NRPS) 의 콘센서스 서열로부터 유도된 개시자 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, 미크로모노스포라 종 ML1 염색체의 6 개의 분절을 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 으로 증폭하고, 이들 모든 분절이 PSV1, PSV2, PSV3, PSV4, PSV5 및 PSV6 로 지칭되는 추정 (가설적인) NRPS 아데닐화 도메인 절편을 포함한다 (실시예 3). 삽입에 의한 상기 아데닐화 도메인의 불활성화는 이들 중 두가지가 (PSV2 및 PSV5) 티오코랄린을 생산하지 않는 돌연변이체를 생성한다는 것을 나타내어, 이들이 티오코랄린의 생합성에 수반된다는 것을 시사했다 (실시예 7 및 10).
약 64.6 킬로베이스 (kb) 의 DNA 영역 (서열 식별 번호: 1) 의 서열분석은 36 개의 온전한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 및 또다른 2 개의 불완전한 ORF 가 존재함을 나타냈다 (실시예 12, 표 1). 26 개의 상기 ORF 를 포함하는 약 53 kb 의 영역의, 스트렙토마이세스 코엘리콜라 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) 및 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) 에서의 이종적 발현은 상기 방선균들에서의 티오코랄린의 생산을 유도한다 (실시예 19).
티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터는 도 1 에 도식적으로 나타냈다. 놀랍게도, 티오코랄린 유전자의 클러스터는 펩티드 골격의 아미노산의 갯수를 근거로 예측되는 것보다 더 많은 NRPS 코딩 유전자를 포함한다. 예를 들어 Tio12, Tio17, Tio18, Tio19, Tio20, Tio21, Tio22, Tio27 및 Tio28 로 식별되는 몇가지 NRPS 와 같은, 소정의 동정된 단백질은 티오코랄린 펩티드 구조의 형성에 수반된다. Tio20 및 Tio21 로 식별되는 단백질은 티오코랄린 골격의 생합성에 수반되는 NRPS 를 형성하며, 추측컨대 Tio27 및 Tio28 으로 식별되는 다른 두 NRPS 도 미크로모노스포라 종 ML1 에서의 티오코랄린의 생합성 조절에 수반될 작은 펩티드의 생합성 이행능력이 있을 것이다. 내성 프로세스과 관련될 수도 있는, Tio5, Tio6 및 Tio23 와 같은 몇가지 단백질도 있다. 서열분석 영역에서 동정된 티오코랄린 경로의 가능한 조절자는 Tio3, Tio4, Tio7, Tio24 및 Tio25 에 해당된다. 최종적으로, 개시자 유닛 3-히드록시-퀴날데이트의 생성에 관련된 몇가지 단백질, Tio8, Tio9, Tio10 및 Tio11 도 있다. 유전자들 중, 그의 차단이 티오코랄린을 생산하지 않는 표현형을 생성하는 유전자들은 별표로 도 1 에 표시되었다 (tio20, tio27 및 tio28).
따라서, 본 발명은 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 동정 및 클로닝에 관한 것이다. 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 상기 유전자 클러스터 및 적합한 숙주 세포에서의 그의 발현은 티오코랄린의 효율적인 생산을 가능하게 한다.
후속하여, 한 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 핵산 분자 또는 그의 절편을 포함하는 프로브에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 그의 게놈이 조작된 바 있는 티오코랄린-생산 유기체의 이용을 포함하는, 티오코랄린의 생합성에 수반되는 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 또다른 방선균에서의 티오코랄린 생산을 위한, 미크로모노스포라 종 ML1 유래의 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자의 이용을 기반으로 하는 공정에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1. 서열분석된 미크로모노스포라 종 ML1 염색체 영역의 유전자 구성을 포함하는, 티오코랄린 유전자 및 그것을 둘러싼 유전자의 클러스터의 도식적 도면. 티오코랄린 유전자 클러스터의 이종적 발현을 위한 플라스미드 구축에 이용된 제한 부위를 나타냈다.
도 2. 코스미드 cosV33-D12 및 pCT2c 의 도식적 도면. ori: 에셰리키아 콜라이 (E. coli.) 에 대한 복제 기원, SCP2: 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 에 대한 복제 기원. aac (3)IV: 아프라마이신 내성 유전자. neo: 네오마이신 내성 유전자. bla: 앰피실린 내성 유전자. SV40 ori: 에피좀 복제에 대한 진핵 기원.
도 3. 플라스미드 pFL1036 구축을 위해 수행된 클로닝의 다이어그램. ori: 에셰리키아 콜라이에 대한 복제 기원. M13 ori: M13 파아지에 대한 복제 기원. oriT: 콘쥬게이트성 (conjugative) 이동 기원. lacZ: 베타-갈락토시다아제 유전자. kan R : 카나마이신 내성 유전자. aac (3)IV: 아프라마이신 내성 유전자. bla: 앰피실린 내성 유전자.
도 4. 플라스미드 pFL1041 구축을 위해 수행된 클로닝의 다이어그램. ori: 에셰리키아 콜라이에 대한 복제 기원. SCP2: 스트렙토마이세스에 대한 복제 기원. oriT: 콘쥬게이트성 (conjugative) 이동 기원. lacZ: 베타-갈락토시다아제 유전자. aac (3)IV: 아프라마이신 내성 유전자.
도 5. 플라스미드 pAR15AT 구축을 위해 수행된 클로닝의 다이어그램. ori p15A: 에셰리키아 콜라이에 대한 복제 기원. oriT: 콘쥬게이트성 (conjugative) 이동 기원. int φ C31: φC31 파아지 인테그라아제 유전자. attP: 부위-특이적 재조합 부위. kan R : 카나마이신 내성 유전자. aac (3)IV: 아프라마이신 내성 유전자. K: 에셰리키아 콜라이 DNA 폴리머라아제의 Klenow 절편을 이용해 처리한 절단 부위.
도 6. 플라스미드 pAPR 구축을 위해 수행된 클로닝의 다이어그램. ori p15A: 에셰리키아 콜라이에 대한 복제 기원. oriT: 콘쥬게이트성 (conjugative) 이동 기원. ori M13: M13 파아지의 복제 기원. ori: 에셰리키아 콜라이에 대한 복제 기원. lacZ: 베타-칼락토시다아제 유전자. lacI: 락토오스 오페론 억제 유전자. int φ C31: φC31 파아지 인테그라아제 유전자. attP: 부위-특이적 재조합 부위. kan R : 카나마이신 내성 유전자. aac (3)IV: 아프라마이신 유전자. K: 에셰리키아 콜라이 DNA 폴리머라아제의 Klenow 절편을 이용해 처리한 절단 부위. P ermE : ermE 유전자 프로모터.
도 7. 플라스미드 pFL1048, pFL1048r 및 pFL1049 의 도시. ori p15A: 에셰리키아 콜라이에 대한 복제 기원. oriT: 콘쥬게이트성 (conjugative) 이동 기원. int φC31: φC31 파아지 인테그라아제 유전자. attP: 부위-특이적 재조합 부위. aac (3)IV: 아프라마이신 유전자.
도 8A. R5A 배지에서의 성장 7 일 후 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) (pFL1049) 배양 추출물의 HPLC 크로마토그램. 티오코랄린에 해당하는 정점 및 그의 체류 시간인 27 분을 나타냈다.
도 8B. 도 8A 에 나타낸 27 분의 정점에 존재하는 생성물 (티오코랄린) 의 UV 흡수 스펙트럼.
도 8C. 도 8A 에 나타낸 27 분의 정점에 존재하는 생성물 (티오코랄린) 의 질량 스펙트럼.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따르면, 온전한 생합성적 티오코랄린 생산 경로에 수반되는 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는, 신규하며 분리된, 임의로는 정제된 핵산 분자 가 제공된다.
따라서, 한 국면에서, 본 발명은, 하나 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 이후 본 발명의 핵산 분자로 지칭될, 바람직하게는 임의로는 정제된, 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질은 일반적으로 비-리보좀성 펩티드 합성효소 (NRPS) 이다. NRPS 는 티오코랄린 생합성 이행능력이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질에 적용되는 표현 "생물학적 활성 절편" 은, 전장 단백질의 활성 관능을 보유하는 단백질 구조의 일부분에 관한 것이다. 상기 생물학적 활성 절편은 본 발명의 핵산 분자의 상응하는 영역에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자의 상기 영역의 크기는 광범위하게 다양할 수 있으나; 그럼에도 불구하고, 한 가지 특별한 구현예에서, 상기 영역은 10, 15, 20, 25, 50, 100, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 20,000, 25,000 개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 영역은 일반적으로 100 내지 10,000 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 100 내지 7,500 개의 길이를 갖고, 생물학적으로 관능성인데, 즉 이들은 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질의 생물학적 활성 절편을 코딩할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 분자일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 단일 가닥 핵산 분자 또는 유도된 이중 가닥 핵산 분자일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자의 설명을 위한 비제한적 예시에는, 게놈 DNA (gDNA) 분자, 메신저 RNA (mRNA) 분자 및 mRNA 분자에 대한 상보적 DNA (cDNA) 분자가 포함된다.
본 발명의 핵산 분자의 돌연변이체 및 변이체는 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 돌연변이체 및 변이체에는, 하나 이상의 분자가 변경, 치환, 결실 또는 삽입된 본 발명의 핵산 분자가 포함된다. 설명을 위해, 본 발명의 핵산 분자의 돌연변이체 및 변이체는 뉴클레오티드에서 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 200, 500 개 및 그 이상의 변화 (변경, 치환, 결실 또는 삽입) 가 있을 수 있다. 동일한 단백질을 코딩하는 축퇴성 변이체 (degenerate variant) 뿐만 아니라 상이한 단백질을 코딩하는 비축퇴성 변이체 (non-degenerate variant) 가 또한 가능하다. 상기 돌연변이체 및 변이체의 뉴클레오티드 서열은, 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 임의의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 에 의해 코딩되는 상응하는 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성 또는 관능을 보유하는 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩한다. 상기 클러스터의 대립형질 형태 뿐만 아니라 다형질상도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 전부 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 임의로는 정제된, 분리된 핵산 분자이다. 상기의 경우, 본 발명의 핵산 분자는 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자의 온전한 클러스터를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자의 온전한 클러스터의 뉴클레오티드 서열은, 미크로모노스포라 종 ML1 의 64,650 염기쌍(bp) 게놈 DNA 서열의 서열 식별 번호: 1 에 포함되어 있다. 본 발명의 범위는 또한 서열 식별 번호: 1 에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 대한 상보적인 가닥, 즉 서열 식별 번호: 1 에 표시된 것과 상보적인 뉴클레오티드 (예를 들어, A 는 T 로 치환되고, C 는 G 로 치환되고, 반대의 경우도 마찬가지) 에 의해 형성되는 것이 포함되며/되거나 역방향 서열 [즉, 리딩 방향 (reading direction) 을, 예를 들어 (5'→3') 를 (3'→5') 로 바꿔 형성되는 서열] 이 포함된다.
본 발명은 추가로 서열 식별 번호: 1 에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 본 발명의 핵산 분자 또는 그의 상보적인 가닥에 혼성화하는 핵산 분자를 포함하는데; 상기 분자는 티오코랄린-생산 유기체로부터 분리되고, 하나 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질을 코딩할 수 있다. 당업자에게 공지된 전형적인 혼성화 기술은, 예를 들어 Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) 에 언급되어 있다. 통상적이거나 또는 엄격한 혼성화 기술은 일반적으로 동종 프로브에 대해 이용되며, 덜 엄격한 혼성화 조건은 표적으로 하는 핵산 분자 서열에 대해 100% 미만의 상동성을 가진 부분적 동종 프로브에 이용된다. 후자 (부분적 동종 프로브) 의 경우, 상이한 조건을 이용한 일련의 서던 (Southern) 또는 노던 (Northern) 혼성화가 수행될 수 있다. 설명하자면, 포름아미드를 포함하는 용매에서 혼성화를 수행하는 경우, 바람직한 조건에는 6×SSC, 50% 의 포름아미드를 포함하는 용액 및 약 42℃ 의, 일정한 온도 및 이온 세기의 이용이 포함된다. 덜 엄격한 혼성화 조건에서는, 상기의 경우 어닐링 완충액 중의 포름아미드의 양은 더 적더라도 (약 45% 내지 0%), 동일한 온도 및 이온 세기를 이용할 수 있다. 대안적으로, 혼성화는 포름아미드를 포함하지 않는 수용액에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 수성 매질에서의 혼성화를 위해서는, 수용액의 이온 세기는, 일반적으로는 약 1 M Na+ 로 일정하게 유지되며, 어닐링 온도는 68℃ 에서 42℃ 로 강하될 수 있다.
티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자의 온전한 클러스터 (서열 식별 번호: 1) 의 서열분석은 36 개의 온전한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 및 또다른 2 개의 불완전한 ORF (ORF1 및 ORF38, 하기 참조) 가 존재함을 보여줬다. 표 1 (실시예 12) 은 생합성적 티오코랄린 생산 경로에 수반되는 상이한 ORF 의 위치 뿐만 아니라 상기 ORF 에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 보여준다.
티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자의 클러스터를 포함하며, 티오코랄린의 생산에 필수적인 생합성적 단백질 전부를 코딩하는 온전한 염색체 (게놈) DNA 분자는 2 개의 플라스미드, 구체적으로는 코스미드 SuperCos1 및 pKC505 에 유효하게 패키지되었다 (실시예 1 및 2). 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자의 클러스터를 포함하는 상기 두 코스미드는, 티오코랄린 생산을 위한 온전한 생합성적 경로를 재형성하기에 충분하다. 따라서, 한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명은 티오코랄린 생산에 실질적으로 더욱 효율적인 수단을 이용하도록 하는 두 코스미드에서 생합성적 티오코랄린 유전자의 온전한 클러스터를 제공한다.
한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 임의로는 정제된, 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자이다. 한 가지 특이적인 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 하기로 이루어진 군:
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 2-535 (orf1) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 993-1130c (orf2) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 1517-2131 (tio3) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 2154-2822c (tio4)를 포함하는 핵산 분자 ;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 2970-3791c (tio5) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 3794-4777c (tio6) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 4904-5611 (tio7) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 5701-6426c (tio8) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 6426-7688c (tio9) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 7733-8524c (tio10) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 8791-10002 (tio11) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 10002-11590c (tio12) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 11847-13634 (tio13) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 13734-15005c (tio14) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 15005-16354c (tio15) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 16441-18744c (tio16) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 18774-19055c (tio17) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 19260-20036 (tio18) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 20146-20880c (tio19) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 21188-28969 (tio20) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 28979-38398 (tio21) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 38449-38661 (tio22) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 38642-41263 (tio23) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 41835-42368 (tio24) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 42395-43255c (tio25) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 43340-43741c (tio26) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 44152-49563 (tio27) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 49635-53669 (tio28) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 53749-55305c (orf29) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 55384-57222c (orf30) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 57895-58467c (orf31) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 58535-59206c (orf32) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 59298-59564c (orf33) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 59611-60114c (orf34) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 60202-60888 (orf35) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 60960-62240 (orf36) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 62300-62833 (orf37) 를 포함하는 핵산 분자;
- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 62925-64650 (orf38) 를 포함하는 핵산 분자; 또는
생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 이들의 절편으로부터 선택된다.
또다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 임의로는 정제된, 2 개 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자이다. 한 가지 특이적인 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 orf1, orf2, tio3, tio4, tio5, tio6, tio7, tio8, tio9, tio10, tio11, tio12, tio13, tio14, tio15, tio16, tio17, tio18, tio19, tio20 , tio21 , tio22 , tio23 , tio24 , tio25 , tio26 , tio27 , tio28 , orf29 , orf30, orf31, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38 로 식별되는 유전자 및 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 그의 절편으로부터 선택되는 2 개 이상의 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체이며, 여기서 상기 단백질은 ORF1 (서열 식별 번호: 2), ORF2 (서열 식별 번호: 3), Tio3 (서열 식별 번호: 4), Tio4 (서열 식별 번호: 5), Tio5 (서열 식별 번호: 6), Tio6 (서열 식별 번호: 7), Tio7 (서열 식별 번호: 8), Tio8 (서열 식별 번호: 9), Tio9 (서열 식별 번호: 10), Tio10 (서열 식별 번호: 11), Tio11 (서열 식별 번호: 12), Tio12 (서열 식별 번호: 13), Tio13 (서열 식별 번호: 14), Tio14 (서열 식별 번호: 15), Tio15 (서열 식별 번호: 16), Tio16 (서열 식별 번호: 17), Tio17 (서열 식별 번호: 18), Tio18 (서열 식별 번호: 19), Tio19 (서열 식별 번호: 20), Tio20 (서열 식별 번호: 21), Tio21 (서열 식별 번호: 22), Tio22 (서열 식별 번호: 23), Tio23 (서열 식별 번호: 24), Tio24 (서열 식별 번호: 25), Tio25 (서열 식별 번호: 26), Tio26 (서열 식별 번호: 27), Tio27 (서열 식별 번호: 28), Tio28 (서열 식별 번호: 29), ORF29 (서열 식별 번호: 30), ORF30 (서열 식별 번호: 31), ORF31 (서열 식별 번호: 32), ORF32 (서열 식별 번호: 33), ORF33 (서열 식별 번호: 34), ORF34 (서열 식별 번호: 35), ORF35 (서열 식별 번호: 36), ORF36 (서열 식별 번호: 37), ORF37 (서열 식별 번호: 38), ORF38 (서열 식별 번호: 39) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 상기 단백질은 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자의 클러스터 (서열 식별 번호: 1) 의 상응하는 상기 언급된 orf (orf1, orf2, tio3, tio4, tio5, tio6, tio7, tio8, tio9, tio10, tio11, tio12, tio13, tio14, tio15, tio16, tio17, tio18, tio19, tio20, tio21, tio22, tio23, tio24, tio25, tio26, tio27, tio28, orf29, orf30, orf31, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38), 또는 그의 상응하는 영역, 그의 돌연변이체 또는 변이체로부터 수득될 수 있다.
또다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 임의로는 정제된, 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편의 하나 이상의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자이며, 여기서 상기 변이체는 아미노산 서열에 있어서 서열 식별 번호: 2 내지 39 에 나타낸 아미노산 서열을 가진 단백질, 또는 그의 생물학적 활성 절편으로부터 선택된 단백질의 아미노산 서열에 대해 30% 이상, 유리하게는 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱더 바람직하게는 80% 이상, 특별하게는 90% 이상, 더욱 특별하게는 95% 이상 상동이다. 상기 변이체는 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 임의의 orf 로 코딩되는 상응하는 단백질의 기능의 하나 이상의 생물학적 활성을 보존한다.
또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자, 바람직하게는 분리된 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 가지 특별한 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 또다른 특별한 구현예에서, 상기 조성물은 2 가지 이상의 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 상기 핵산 분자는 DNA 및 RNA 의 두가지 모두일 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 자연적으로 또는 재조합적으로 티오코랄린을 생산하는 임의의 유기체로부터 분리될 수 있고, 이는 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 클러스터가 적합한 숙주 세포에 삽입되기 때문인데; 그럼에도 불구하고, 한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 상기 핵산 분자는 해양 방선균 미크로모노스포라 종 ML1 (실험 부분의, 단계 1, 실시예 1 내지 4 를 참조) 에서 분리되었다.
적합한 숙주 세포 유래의 (염색체) 게놈 DNA 및 클로닝된 재조합 DNA 의 분리 및 특징분석은, 적합한 유전자 라이브러리의 추적을 위한 프로브로서 뉴클레오티드 서열 전체 또는 일부를 이용하여, 통상적 또는 엄격한 혼성화 기술로 수행될 수 있다.
따라서, 또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 그의 절편을 포함하는 프로브에 관한 것이다. 일반적으로, 적합하게는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 20 내지 60 개 뉴클레오티드의 길이를 가진 서열이 바람직하다. 한 가지 특별한 구현예에서, 상기 프로브는 미크로모노스포라 종에서의 티오코랄린의 생합성에 수반되는 유전자를 추적하기 위해 사용될 수 있다. 티오코랄린의 생합성과 관련된 핵산, 예를 들어 gDNA, cDNA 또는 mRNA 를 추적하기 위한 상기 프로브의 이용은 본 발명의 추가적인 국면을 형성한다.
대안적으로, 적합한 숙주 세포 유래의 (염색체) 게놈 DNA 및 클로닝된 재조합 DNA 의 분리 및 특징분석은 핵산의 효소적 증폭을 기반으로 하는 기술로 수행될 수 있다. 설명하자면, 기타 상동이거나 또는 연관된 서열을 증폭 및 동정하기 위해, 효소적 증폭 반응, 예를 들어 PCR 에 이용될 수 있는 개시자 올리고뉴클레오티드가 고안될 수 있다 (티오코랄린 생합성에 수반되는 DNA 및 단백질의 공지된 서열을 기반으로 함).
본 발명의 핵산 분자는 통상적인 방법으로 분리되며, 원하는 경우 정제될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 일반적으로 재조합 또는 분리 방법으로 수득되지만, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자가 화학 합성으로 수득될 가능성도 감안하며, 상기 방법에서 분자는 야생형 (wt) 및 돌연변이체 티오코랄린-생산 유기체 모두에서 유도된 것과 동일하거나, 또는 실질적으로 동일한 구조를 가질 것이다.
또다른 국면에서, 본 발명은, 이후 본 발명의 벡터인, 하나 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터와 같은 생물학적 관능성 벡터 또는 플라스미드이다.
한 가지 특이적인 구현예에서, 본 발명의 벡터는 클로닝 벡터, 바람직하게는 코스미드이다. 바람직한 클로닝 벡터는 큰 DNA 서열 (예를 들어, 관심대상의 생성물의 생합성에 수반되는 유전자의 온전한 클러스터) 을 혼입하는 그의 용량에 의해 선택된다. 상기 벡터는 일반적으로 통상적인 벡터이며, 보통 입수가능하다. 본 발명은 추가로, 상기 유전자 물질이 당업자에게 공지된 기술에 의한 유전자 조작으로 단일한 클로닝 벡터 또는 플라스미드 (예를 들어, 코스미드) 에 최종적으로 포함되도록 감량될 수 있다는 것도 감안한다. 재배열은 클로닝, PCR, 합성 유전자 또는 당업계에 공지된 임의의 상기 기술의 조합으로 수행될 수 있다.
또다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 벡터는 적합한 숙주 세포에 대한 그의 삽입에 적합한 발현 벡터이다. 상기 벡터의 상기 적합한 숙주 세포로의 삽입은 임의의 통상적인 유전자 물질 이동 방법 (예를 들어, 형질전환, 트랜스펙션 등) 에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 또다른 국면에서, 본 발명은, 이후 본 발명의 숙주 세포로 지칭되는, 본 발명의 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 상기 숙주 세포는 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 또다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 2 개 이상의 본 발명의 핵산 분자를 포함하며; 상기의 경우, 상기 본 발명의 핵산 분자는 상동이거나 또는 상이할 수 있다.
본 발명의 바람직한 숙주 세포는 하나 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 (외인성) 핵산 분자를 포함하는 본 발명의 벡터를 사용하여, 티오코랄린의 생합성 및/또는 재배열을 지령하기에 충분한 방식으로 안정하게 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포이다. 숙주 세포는 바람직하게는 미생물, 더욱 바람직하게는 박테리아이다. 한 가지 특별한 구현예에서, 상기 숙주 세포는, 예를 들어 방선균, 스트렙토마이세트와 같은 그람-양성 박테리아이다.
스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스 ( Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 와 같은 상이한 스트렙토마이세트 종이 본 발명의 예시에서 이종성 숙주로서 이용될 수 있지만, 티오코랄린의 생합성에 수반되는 유전자의 이종적 발현이 다른 스트렙토마이세스, 방선균 등에서 수행될 수 있으며, 단 이들은, 바람직하게는 안정한 방식으로, 본 발명의 벡터에 형질전환될 수 있다. 그 단백질의 시험관내 발현은, 원하는 경우 통상적인 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 재조합 박테리아와 같은, 본 발명의 핵산 분자의 하나 이상의 영역이 변경되어 상응하는 비-재조합체, 즉 야생형인 티오코랄린-생산 세포 (박테리아) 에 필적하는 변경된 티오코랄린 수준을 제공하는 재조합 박테리아와 같은 재조합 숙주 세포를 제공하게 되는, 본 발명의 숙주 세포를 제공한다. 그러한 목적으로, 당업자에게 공지된 통상적인 기술이 이용될 수 있으며, 여기에는 예를 들어 티오코랄린 생산에 수반되는 NRPS 의 가장 중요한 도메인에 대한 이행능력이 있는 유전자의 카피수를 증가시키거나, 또는 당업자에게 공지된 유전공학 기술에 의해 상기 유전자의 유전자 발현 조절 서열을 증가시켜 티오코랄린 생산에서 수율을 증가시키는 것이 포함된다.
또다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는, 이후 본 발명의 단백질로 지칭되는 단백질에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질" 은 티오코랄린 생산을 위한 생합성적 경로에 의해 포함되는 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는, 폴리펩티드, 효소 등을 의미한다. 본 발명의 단백질에는, 전장 아미노산을 포함하여 다양한 길이의 아미노산 사슬로서 아미노산 부분이 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 아미노산 사슬이 포함되며, 그 뿐만 아니라 티오코랄린의 생합성에 수반되는 상기 단백질의 생물학적 활성 절편 및 그의 생물학적 활성 변이체가 포함된다. 본 발명의 단백질은 자연, 재조합 또는 합성일 수 있다. 설명의 수단으로, 티오코랄린 생합성에 수반되는 상기 단백질은, 적합한 발현 벡터에 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하고 적합한 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 통상적인 재조합 DNA 기술을 통하여, 또는 예를 들어 아미노산을 개별적으로 차례차례 아미노산 사슬로 결합해 나가는 Merrifield 의 고상 펩티드 합성 (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)) 을 수단으로 하는 통상적인 화학 펩티드 합성을 통해 생산될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 단백질은 상이한 제조사 (예를 들어, Perkin-Elmer, Inc.) 에 의해 시판되는 자동화된 단백질 합성 장치를 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 범위에 포함되는 생물학적 활성 변이체는, 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 하나 이상의 생물학적 활성 절편을 포함하며, 즉 단백질의 활성 관능을 보유하는 단백질 구조의 일부, 예를 들어 상기 tio18 유전자에 의해 코딩되는 Tio18 와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 활성을 가진 tio18 유전자에 의해 코딩되는 티오에스테르 부분을 포함하며, 예를 들어 이는 약 70% 이상, 유리하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 유사성 또는 파워를 갖는다.
본 발명의 단백질의 생물학적 활성 변이체에는 아미노산, 자연 발생 대립형질 등이 결실, 치환 또는 부가된 활성 아미노산 구조가 포함된다. 생물학적 활성 절편은, 절편 제조를 위해 전장 단백질을 화학적 또는 효소적 절단에 적용한 후 전장 단백질과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 보존하는 아미노산 구조 절편을 검정하여 용이하게 동정할 수 있다.
한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 단백질은 임의로는 정제된, orf1, orf2, tio3, tio4, tio5, tio6, tio7, tio8, tio9, tio10, tio11, tio12, tio13, tio14, tio15, tio16, tio17, tio18, tio19, tio20, tio21, tio22, tio23, tio24, tio25, tio26 , tio27 , tio28 , orf29 , orf30 , orf31, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37 및 orf38 로 식별되는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 코딩되는 티오코랄린의 생합성에 수반되는 분리된 단백질이다.
또다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 단백질은, 임의로는 정제된, ORF1 (서열 식별 번호: 2), ORF2 (서열 식별 번호: 3), Tio3 (서열 식별 번호: 4), Tio4 (서열 식별 번호: 5), Tio5 (서열 식별 번호: 6), Tio6 (서열 식별 번호: 7), Tio7 (서열 식별 번호: 8), Tio8 (서열 식별 번호: 9), Tio9 (서열 식별 번호: 10), Tio10 (서열 식별 번호: 11), Tio11 (서열 식별 번호: 12), Tio12 (서열 식별 번호: 13), Tio13 (서열 식별 번호: 14), Tio14 (서열 식별 번호: 15), Tio15 (서열 식별 번호: 16), Tio16 (서열 식별 번호: 17), Tio17 (서열 식별 번호: 18), Tio18 (서열 식별 번호: 19), Tio19 (서열 식별 번호: 20), Tio20 (서열 식별 번호: 21), Tio21 (서열 식별 번호: 22), Tio22 (서열 식별 번호: 23), Tio23 (서열 식별 번호: 24), Tio24 (서열 식별 번호: 25), Tio25 (서열 식별 번호: 26), Tio26 (서열 식별 번호: 27), Tio27 (서열 식별 번호: 28), Tio28 (서열 식별 번호: 29), ORF29 (서열 식별 번호: 30), ORF30 (서열 식별 번호: 31), ORF31 (서열 식별 번호: 32), ORF32 (서열 식별 번호: 33), ORF33 (서열 식별 번호: 34), ORF34 (서열 식별 번호: 35), ORF35 (서열 식별 번호: 36), ORF36 (서열 식별 번호: 37), ORF37 (서열 식별 번호: 38), ORF38 (서열 식별 번호: 39), 및 이들의 조합으로 식별되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 티오코랄린의 생합성에 수반되는 분리된 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편이다. 상기 단백질의 추정되는 기능은 표 1 에 포함되어 있다.
상기 화합물의 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는, 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 orf 는 통상적인 기술을 이용하여 동정될 수 있다. 상기 기술의 설명을 위한 비제한적 예시에는 정지 및 개시 코돈의 위치, 코돈의 빈도를 근거로 한 리딩 (reading) 프레임의 추정되는 위치, 다른 방선균에서 발현되는 유전자에 대한 유사성에 의한 배열 등을 위한 전산적 분석이 포함된다. 이에, 본 발명의 단백질은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 동정될 수 있으며, orf 또는 이들에 의해 코딩되는 단백질은 분리될 수 있고, 원하는 경우 정제되거나 또는 대안적으로는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. orf 를 근거로 한 상기 생성물의 발현을 위한 유전자 구축물이 고안될 수 있으며, 적합한 발현 조절 구성원 (프로모터, 종결자 등) 이 포함될 수 있고, 상기 유전자 구축물이 하나 이상의 orf 에 의해 코딩되는 단백질 또는 단백질들의 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 단백질은 분리될 수 있으며, 원하는 경우 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있다. 일반적으로 약 80% 내지 90% 인 더 낮은 수준의 순도가 또한 허용될 수도 있지만, 단백질은 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태로 수득된다. 본 발명은 또한 본 발명의 단백질이 화학 합성에 의해 수득되는 가능성을 감안하며, 여기서 단백질은 야생형 (wt) 및 돌연변이체 티오코랄린-생산 유기체로부터 직접 유도되는 것과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 구조를 갖는다.
또다른 국면에서, 본 발명은 적합한 (영양 및 환경) 조건 하에서의 티오코랄린-생산 유기체의 배양 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린의 생합성에 수반되는 하나 이상의 상기 단백질의 분리 단계를 포함하는, 티오코랄린의 생합성에 수반되는 본 발명의 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 원하는 경우, 본 발명의 상기 단백질은 상기 기재된 것들과 같은 통상적인 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
또다른 국면에서, 본 발명은 티오코랄린-생산 유기체를 상기 화합물 생산에 적합한 조건 하에 배양하여 티오코랄린 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는 유전자의 카피수를 증가시키는 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린을 분리하는 단계를 포함하는, 티오코랄린의 생산 방법에 관한 것이다.
한 가지 특별한 구현예에서, 티오코랄린-생산 유기체는 예를 들어 미크로모노스포라 종과 같은 방선균인데, 여기서 티오코랄린의 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는 유전자의 카피수는 증가된다. 티오코랄린의 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는 유전자의 카피수 증가는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기의 경우, 상기 기재된 방법은 티오코랄린 생산에 수반되는 유전자의 발현에 적합한 영양 및 환경 조건 하에 상기 유기체를 배양하는 것을 포함한다. 원하는 경우, 생산된 티오코랄린은 통상적인 방법에 의해 배양 배지로부터 분리 및 정제될 수 있다.
또다른 국면에서, 본 발명은, 티오코랄린 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 조작 또는 치환에 의해, 또는 상기 유전자 발현 조절 이행능력이 있는 서열의 조작에 의해 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 조절되는 티오코랄린-생산 유기체를 상기 화합물 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린을 분리하는 단계를 포함하는 티오코랄린의 생산 방법에 관한 것이다. 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현은 바람직하게는 개선된다. 상기 목적을 위해, 티오코랄린 생합성 공정에 필수적이지 않은 유전자 서열은 제거되거나, 또는 상기 유전자의 유전자 발현 조절 서열의 효율은 당업자에게 공지된 유전공학적 서열에 의해 증가될 수 있다. 이에 따라, 티오코랄린 생산에서 수율은 증가될 수 있다. 티오코랄린 생합성 과정에서 불필요한 유전자 서열을 제거하거나 또는 상기 유전자의 유전자 발현 조절 서열의 효율 증가를 위한 유전자 조작법은 당업자에게 공지된 유전공학 기술에 의해 수행될 수 있다.
한 가지 특별한 구현예에서, 티오코랄린-생산 유기체는 예를 들어, 미크로모노스포라 종과 같은 방선균인데, 여기서 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 단백질을 코딩하는 유전자는 티오코랄린 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 조작 또는 치환하거나, 또는 상기 유전자의 발현 조절 이행능력이 있는 서열을 조작함으로써 조절되며, 이는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기의 경우, 상기 기재된 방법은 티오코랄린 생산에 수반되는 유전자 발현을 위한 적합한 영양 및 환경 조건 하에 상기 유기체를 배양하는 단계를 포함한다. 원하는 경우, 생산된 티오코랄린은 통상적인 방법에 의해 배양 배지로부터 분리 및 정제될 수 있다.
또다른 국면에서, 본 발명은 티오코랄린 생산에 적합한 조건 하에서, 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자의 클러스터를 포함하는 본 발명의 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린을 분리하는 단계를 포함하는 티오코랄린의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 (영양, 환경 등) 조건은 숙주 세포의 특성에 따라 선별될 것이다.
한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 티오코랄린을 원래 생산하는 유기체, 원래는 티오코랄린을 생산하지 않는 유기체 및 티오코랄린을 생산하도록 유전적으로 조작된 유기체로부터 선택된다. 한 가지 특별한 구현예에서, 본 발명의 상기 숙주 세포는 방선균 또는 스트렙토마이세트이다.
또다른 국면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 미크로모노스포라 종 ML1 유래의 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 이용을 근간으로 한, 또다른 방선균에서의 상기 화합물의 생산 방법에 관한 것이다:
(1) 티오코랄린 생합성 경로의 특이적 유전자에 타격을 받은 돌연변이체를 수득하는 단계;
(2) 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터를 포함하는 미크로모노스포라 종 ML1 염색체 영역을 분리하는 단계;
(3) 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열을 수득하고 분석하는 단계; 및
(4) 다른 방선균에서 티오코랄린을 이종적으로 생산하는 단계.
티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자의 클러스터를 포함하는 미크로모노스포라 종 ML1 염색체의 동정 및 분리 뿐만 아니라 상기 클러스터의 뉴클레오티드 서열의 분석은, 명세서에 첨부되어 있는 실시예에서의 비제한적 방식으로 설명되는 본 발명의 교시를 토대로 하여 수행될 수 있다.
티오코랄린 생합성 경로의 특이적 유전자에 타격을 받은 돌연변이체는 통상적인 방법에 의해 동정될 수 있다. 한 가지 특별한 구현예에서, 상기 돌연변이체는, 통상적인 방법, 예를 들어 실시예 5 에 언급된 바와 같이 배양 및 티오코랄린 생산의 HPLC-MS 에 의한 측정을 수단으로 하여 동정될 수 있다.
티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 전부 또는 일부는, 티오코랄린의 이종적 생산을 위해 통상적인 방법, 예를 들어 형질전환 또는 트랜스펙션에 의해 방선균에 도입될 수 있으며, 원하는 경우 상기와 같이 수득된 티오코랄린은 통상적인 방법으로 분리 및/또는 정제될 수 있다.
티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 결정은 상당한 상업적 중요성이 있다. 본 발명에 의해 제공되는 티오코랄린 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 분리 및 완전한 설명은 티오코랄린 생산 증가 및 티오코랄린-생산 유기체의 조작을 가능하게 한다. 그러한 맥락에서, 티오코랄린 생산에 수반되는 NRPS 의 가장 중요한 도메인에 대한 이행능력이 있는 유전자의 카피수는 당업자에게 공지된 유전자 조작 기술로 증가될 수 있거나 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 효율이 당업자에게 공지된 유전공학적 기술로 증가될 수 있고, 그에 따라 그의 생산 수율도 증가될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 티오코랄린 유전자의 온전한 클러스터의 동정 및 클로닝과 연관된 또다른 장점은 티오코랄린의 효율적인 생산에 관한 것이다. 사실, 이는 더 적은 수의 단계를 거쳐 큰 관심대상인 화합물을 수득하게끔 한다. 클러스터 돌연변이체에서의 생합성 공정에서의 필수적이지 않은 서열의 제거는 관심대상의 화합물의 생산에 필요한 시간을 상당히 줄인다. 나머지 서열들로 충분하며, 티오코랄린 생산을 위해 그의 관능성을 유지한다.
실험부
본 발명의 실험 과정들에는 당업계의 현재의 통상적인 분자생물학적 방법이 포함된다. 본원에서 설명되지 않은 기술의 상세한 설명은, Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Great Britain, 2000) 및 Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2001) 의 매뉴얼에서 찾을 수 있다. 하기의 단계들은 제한성이 없이 본 발명을 상세하게 설명한다.
단계 1.
티오코랄린
생합성 경로 유전자를 포함하는
미크로모노스포라
종
ML1
염색체 영역의 분리
실시예 1. 미크로모노스포라 종 ML1 염색체 DNA 유래의 SuperCos1 에서의 유전자 라이브러리의 구축
염색체 DNA 는 염석 프로토콜 (Kieser et al. 2000) 을 이용하여, MIAM2 배지 (5 g/l 의 효모 추출물, 3 g/l 의 육류 추출물, 5 g/l 의 트립톤, 5 g/l 의 글루코오스, 20 g/l 의 덱스트린, 4 g/l 의 CaCO3, 10 g/l 의 해수염. pH 6.8) 중의, Pharma Mar, S.A. 배양물 콜렉션에서 입수가능한 미크로모노스포라 종 ML1 배양물로부터 수득했다 (Espliego, F. Ph.D. Thesis, 1996, University of Leon; de la Calle, F. Ph.D. Thesis, 1998, Autonomous University of Madrid). 상기 염색체 DNA 는 BamHI 엔도뉴클레아제를 이용한 부분 효소절단에 적용하고, 수득한 절편은 BamHI 로 효소절단된 코스미드 SuperCos 1 (Stratagene) 에서의 유전자 라이브러리 형성에 이용했다. 에셰리키아 콜라이 XL-1 Blue MR (Stratagene) 에서의 상기 유전자 라이브러리의 형성은, 이미 기재한 과정 (Sambrook et al. 2001) 에 따라, 시험관내 패키징 키트 (in vitro packaging kit) Gigapack III Gold Packaging Extract Kit (Stratagene) 를 이용하여 수행했다.
1,000 개의 에셰리키아 콜라이 형질유도 콜로니는, 일반적 프로토콜 (Sambrook et al. 2001) 을 이용한 제자리 (in situ) 콜로니 혼성화 분석 수행을 위해 나일론 멤브레인으로 옮겼다.
실시예 2. 미크로모노스포라 종 ML1 염색체 DNA 유래의 pKC505 에서의 유전자 라이브러리의 구축
염색체 DNA 는 염석 프로토콜 (Kieser et al. 2000) 을 이용하여 MIAM2 배지 중의 미크로모노스포라 종 ML1 배양물로부터 수득했다. 상기 염색체 DNA 는 Sau3AI 엔도뉴클레아제를 이용한 부분 효소절단에 적용하고, 수득한 절편은 이관능성 코스미드 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) pKC505 (Richardson at al. 1987, Gene 61, 231-241) 에서의 유전자 라이브러리 형성에 이용했고, BamHI 로 효소절단했다. 에셰리키아 콜라이 ED8767 에서의 상기 유전자 라이브러리의 형성은, 이미 기재된 과정 (Sambrook et al. 2001) 및 시험관내 패키징 키트 (in vitro packaging kit) Gigapack III Gold Packaging Extract Kit (Stratagene) 을 이용하여 수행했다.
3,300 개의 에셰리키아 콜라이 형질유도 콜로니를 25 ㎍/ml 의 아프라마이신이 있는 TSB 배지 (Merck) 를 포함하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 넣고, 30℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 상기 클론은 25 ㎍/ml 의 아프라마이신이 있는 TSA (Tryptic Soy Agar) 플레이트에 복제하고, 30℃ 에서 밤새 둔 후, 콜로니를 일반 프로토콜 (Sambrook et al. 2001) 을 이용하는 제자리 (in situ) 콜로니 혼성화 분석 수행을 위해 나일론 멤브레인에 옮겼다.
실시예 3. NRPS 에서의 아데닐화 도메인에 대한 특이적 올리고뉴클레오티드의 고안 및 미크로모노스포라 종 ML1 염색체 DNA 로부터의 그의 PCR 증폭
티오코랄린의 구조를 근거로, 그의 생합성 이행능력이 있는 NRPS 는 L-시스테인을 활성화시키는 1 내지 3 개의 아데닐화 도메인 및 글리신을 활성화하는 1 개의 도메인을 가질 것으로 예상되었다. 이를 토대로, NRPS 아데닐화 도메인의 증폭을 위해 문헌에 기재된 올리고뉴클레오티드와 조합된 NRPS 아데닐화 도메인을 코딩하는 DNA 절편을 특이적으로 증폭할 수 있는, NRPS 아데닐화 도메인 내부의 보존된 영역을 기준으로 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 고안했다.
개시자 올리고뉴클레오티드:
MTF2 (5'-GCNGGYGGYGCNTAYGTNCC-3'; Neilan et al. 1999. J. Bacteriol. 181(13):4089-4097) 및
PSV-4 (5'-SAGSAGGSWGTGGCCGCCSAGCTCGAAGAA-3')
를 이용한 PCR 증폭은 1.3 kb 밴드를 생성하여, pGEM-T Easy vector (Promega) 에 클로닝했다. 사용한 PCR 프로그램은, 95℃-2 분; 60℃-15 분; 72℃-6 분의 개시 싸이클, 이어서 20 싸이클로 95℃-1 분; 60℃-2 분; 72℃-2 분. 미크로모노스포라 종 ML1 염색체 DNA 를 템플레이트로 이용했다.
제한효소절단 절편 길이 다형상 (RFLP) 에 의한 클론의 분석은 펩티드 합성효소에 상응하는 3 개 타입의 상이한 클론 pGPSV1, pGPSV2 및 pGPSV3 이 있음을 보여줬는데, 이들은 각각 PSV1, PSV2 및 PSV3 로 지칭되는 아데닐화 도메인 절편을 포함한다.
후속적으로, 클론의 삽입체는 EcoRI 제한효소절단으로 방출하고, 절편은 pBBR1-MCS2 (Kovach, M.E. et al. 1995. Gene. 166:175-176) 으로 클로닝하여, 각각 플라스미드 pBPSV1, pBPSV2 및 pBPSV3 를 구축했는데, 이는 각각 PSV1, PSV2 및 PSV3 로 지칭되는 아데닐화 도메인 절편을 포함한다.
개시자 올리고뉴클레오티드 MTF2 및 PS4 를 이용하여 수득한 PCR 밴드로부터, 네스티드-PCR (30 싸이클의 95℃-1 분; 60℃-1 분; 72℃-1 분) 을 개시자 올리고뉴클레오티드 PS2-TG: 5'-ACNGGNMRNCCNAARGG-3' 및 MTR: 5'-CCNCGDATYTTNACY-3' (Neilan et al. 1999. J. Bacteriol. 181(13):4089-4097) 을 이용하여 수행하여, 750 bp 밴드를 수득하고, 이를 pGEM-T Easy vector (Promega) 에 클로닝했다. RFLP 에 의한 클론의 분석은 각각 펩티드 합성효소에 해당하는 2 개의 신규한 타입의 상이한 클론 pGPSV4 및 pGPSV5 이 있음을 보여줬는데, 이들은 각각 PSV4 및 PSV5 로 지칭되는 아데닐화 도메인 절편을 포함한다.
개시자 올리고뉴클레오티드 PS2M: 5'- TACACSGGCWSSACSGG-3' 및 PSV-4 를 이용한 PCR 증폭은 1.3 kb 밴드를 제공하여, 이를 pGEM-T Easy vector (Promega) 에 클로닝했다. 사용한 프로그램은, 72℃ 의 어닐링 온도에서 5 싸이클, 이어서 10 싸이클로 70℃ 에서 어닐링하고 68℃ 로 종결한 후, 20 싸이클 (96℃-1 분; 72℃- 68℃-2 분; 72℃-3 분) 로 한 터치 다운 스타팅 (Touch-down starting) 이었다. RFLP 에 의한 클론의 분석은 각각 펩티드 합성효소에 해당하는 신규한 타입의 상이한 클론 pGPSV6 이 있음을 보여줬는데, 이들은 PSV6 로 지칭되는 아데닐화 도메인 절편을 포함했다.
실시예 4. 콜로니 혼성화에 의한 유전자 라이브러리의 분석
SuperCos1 및 pKC505 (실시예 1 및 2) 에서 구축한 유전자 라이브러리는 각각 DIG DNA Labeling and Detection Kit system (Roche) 를 이용한 제자리(in situ) 콜로니 혼성화 분석 (Sambrook et al. 2001) 에 적용했다. PSV1 내지 PSV6 로 지칭되는 6 개의 아데닐화 도메인을 프로브로 이용했다.
하기의 것은 SuperCos1 에서 구축된 유전자 라이브러리로부터 수득했다:
- 절편 PSV1 에 혼성화된, pCT1a, pCT1b 및 pCT1c 로 명명된 3 개의 양성 코스미드 (클론);
- 절편 PSV2 에 혼성화된, pCT2a, pCT2b 및 pCT2c 로 명명된 3 개의 양성 코스미드 (클론); 상기 절편들 중, pCT2c 는 또한 절편 PSV5 와 혼성화함;
- 절편 PSV3 에 혼성화된, pCT3a 및 pCT3b 로 명명된 2 개의 양성 코스미드 (클론); 추가로, 이들 모두는 또한 절편 PSV6 에 혼성화함; 및
- PSV4 에 혼성화된, pCT4a 로 명명된 1 개의 양성 코스미드 (클론).
55 개의 양성 코스미드가 pKC505 에서 구축된 유전자 라이브러리에서 수득되었다:
- 절편 PSV2 에 혼성화된, cosV1-F8, cosV7-D2, cosV7-D12, cosV14-H4, cosV19-B4, cosV29-B9, cosV31-B11, cosV31-H10, cosV33-D12, cosV33-F7 로 명명된 10 개의 양성 코스미드 (클론);
- 절편 PSV5 에 혼성화된, cosV1-B6, cosV6-H8, cosV11-F10, cosV20-F8, cosV22-F7, cosV25-B3, cosV32-B4 로 명명된 7 개의 양성 코스미드; 및
- 절편 PSV1, PSV3, PSV4 또는 PSV6 에 혼성화된, cosV1-B7, cosV1-F5, cosV2-E5, cosV2-F11, cosV3-D9, cosV4-D2, cosV5-D7, cosV5-G6, cosV6-A7, cosV6-A12, cosV7-E7, cosV8-F8, cosV9-H7, cosV10-A3, cosV11-B4, cosV11-G2, cosV12-B12, cosV13-B2, cosV16-H11, cosV17-A3, cosV19-F4, cosV20-B3, cosV20-H5, cosV21-H6, cosV22-B11, cosV23-F8, cosV26-H11, cosV28-G1, cosV29-E1, cosV29-G6, cosV30-G5, cosV31-A12, cosV31-E10, cosV32-A7, cosV32-D10, cosV33-A8, cosV33-D10, cosV33-F10 로 명명된 38 개의 양성 코스미드.
단계 2. 6 개의 분리된
아데닐화
영역에서의 돌연변이체 생성
미크로모노스포라 종 ML1 염색체 DNA 로부터 미리 증폭된 6 개의 아데닐화 도메인 절편 (PSV1, PSV2, PSV3, PSV4, PSV5 및 PSV6) 을 티오코랄린 생합성에 수반되는 영역 평가를 위한 목적으로 독립적인 유전자 차단 실험에 사용했다 (실시예 6 내지 11).
콘쥬게이트성 플라스미드 에셰리키아 콜라이/스트렙토마이세스 pOJ260 (Bierman et al. 1992, Gene 116, 43-49) 를, 각각 영역 PSV1 내지 PSV6 를 포함하는 구축물 pFL903, pFL904, pFL905, pFL906, pFL940 및 pFL941 형성에 이용했다. 상기 구축물들은 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주 (Kieser et al. 2000) 에 도입했고, 그로부터 콘쥬게이션에 의해 기재된 과정 (Kieser et al. 2000) 을 이용하여 미크로모노스포라 종 ML1 균주에 도입했다. 트랜스콘쥬게이트성 클론을 아프라마이신을 이용해 선별하고, 적합한 염색체 영역으로의 통합은 아데닐화 도메인 절편 PSV1 내지 PSV6 의 상응하는 영역을 이용하는 서던 혼성화 (Southern hybridization) 로써 밝혀냈다. PSV 아데닐화 도메인 (PSV1 내지 PSV6) 의 각각의 영역으로부터 선별한 트랜스콘쥬레이트물 (transconjugant) 은 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양하고, 후속하여 그의 균사체는 아세토니트릴로 추출하고, HPLC-MS 로 분석했다 (실시예 5). 아데닐화 도메인 PSV2 및 PSV5 에 타격을 받은 돌연변이체만은 티오코랄린을 생산하지 않는 표현형을 갖는다 (실시예 7 및 10). PSV1, PSV3, PSV4 및 PSV6 이 결실된 돌연변이체에서의 티오코랄린의 생산은 야생형의 것과 유사했다 (실시예 6, 8, 9 및 11). 상기 실험들은 아데닐화 도메인 PSV2 및 PSV5 가 티오코랄린 생합성에 수반된다는 것을 보여줬다.
실시예 5. 티오코랄린 생산의 HPLC 검출
상이한 분석 균주의 아세토니트릴을 이용한 추출물은 회전 증발기에서 농축하고, HPLC-MS 분석에 사용하기 전에 DMSO 에 재현탁시켰다.
아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산의 수중 혼합물을 용매로 이용하는 역상 컬럼 (Symmetry C18, 2.1 X 150 mm, Waters) 을 이용하여 샘플 (10 ㎕) 을 HPLC 로 분석했다. 처음 4 분 동안은 10% 의 아세토니트릴이 있는 이동상의 농도는 일정하게 유지되었다. 이후, 30 분까지는 아세토니트릴의 10% 에서 100% 로의 선형구배가 시작되었다. 사용된 유량은 0.25 ml/분이었다. 정점의 분광 검출 및 특징분석은 포토다이드 검출기 (photodiode detector) 를 이용하고, Millennium 컴퓨터 소프트웨어 (Waters) 를 이용하여 수행되었다. 크로마토그램은 230 nm 에서의 흡광도로 추출되었다.
실시예 6. PSV1 영역에서의 유전자 차단
PSV1 영역은 플라스미드 pBPSV1 으로부터 1.3 kb EcoRI 밴드로서 수득했고, 콘쥬게이트성 플라스미드 에셰리키아 콜라이/스트렙토마이세스 pOJ260 의 EcoRI 부위에 클로닝하여, pFL903 을 형성했다. pOJ260 은 스트렙토마이세스에서 아프라마이신 내성을 보유한 유전자를 포함하며, 상기 세포에서 이는 자살 플라스미드이다.
구축물 pFL903 은 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주로 도입되어, 여기에서 콘쥬게이션에 의해, 기재된 과정 (Kieser et al. 2000) 을 이용하여 미크로모노스포라 종 ML1 에 도입되었다. 트랜스콘쥬게이트성 클론은 25 ㎍/ml 의 아프라마이신을 이용하여 선별되었고, 그의 염색체 DNA 로부터 PSV1 영역이 실제로 차단되었다는 것은 서던 혼성화로 밝혔다. 상기의 경우 사용된 프로브는 PSV1 밴드였다.
돌연변이체 미크로모노스포라 종 ΔPSV1 을 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양하고, 후속하여 그의 균사를 아세토니트릴로 추출하여, HPLC-MS 로 분석해 (실시예 5 참고) 티오코랄린 생산체라는 것을 밝혀냈다. 리터 당 배양 배지 MT4 의 조성은 하기와 같다: 6 g 대두분, 2.5 g 맥아 추출물, 2.5 g 펩톤, 5 g 덱스트로오스, 20 g 덱스트린, 4 g 의 CaCO3, 10 g 의 해수염, pH 는 6.8 로 조정.
실시예 7. PSV2 영역에서의 유전자 차단
PSV2 영역은 플라스미드 pBPSV2 로부터 1.3 kb EcoRI 밴드로서 수득하고, 플라스미드 pOJ260 의 EcoRI 부위에 클로닝하여 pFL904 를 형성했다.
구축물 pFL904 는 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 균주 (pUB307) 에 도입하고, 이로부터 콘쥬게이션에 의하여 미크로모노스포라 종 ML1 균주에 도입했다. 상호콘쥬게이션 클론은 25 ㎍/ml 의 아프라마이신을 이용하여 선별하고, 그의 염색체 DNA 로부터 PSV2 영역이 실제로 차단되었음을 서던 혼성화로 밝혀냈다. 이 경우에 사용한 프로브는 PSV2 밴드였다.
돌연변이체 미크로모노스포라 종 ΔPSV2 을 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양하고, 후속하여 그의 균사는 아세토니트릴을 이용하여 추출하고, HPLC-MS (실시예 5) 로 분석하여, 상기 균주가 티오코랄린을 생산하지 않는다는 결과를 도출했다.
실시예 8. PSV3 영역에서의 유전자 차단
PSV3 영역은 플라스미드 pBPSV3 로부터 1.4 kb EcoRI 밴드로서 수득하고, 플라스미드 pOJ260 의 EcoRI 부위에 클로닝하여, pFL905 을 생성했다.
구축물 pFL905 는 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주에 도입하고, 거기에서 콘쥬게이션에 의해 미크로모노스포라 종 ML1 균주로 도입했다. 트랜스콘쥬게이트성 클론을 25 ㎍/ml 의 아프라마이신을 사용하여 선별하고, 그의 염색체 DNA 로부터 PSV3 영역이 실제로 차단되었음을 서던 혼성화에 의해 밝혀냈다. 상기 경우 사용된 프로브는 PSV3 밴드였다.
돌연변이체 미크로모노스포라 종 ΔPSV3 은 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양하고, 후속하여 그의 균사는 아세토니트릴로 추출하고 HPLC-MS (실시예 5) 로 분석하여, 티오코랄린 생산체임을 증명했다.
실시예 9. PSV4 영역에서의 유전자 차단
PSV4 영역은 플라스미드 pGPSV4 로부터 1.2 kb EcoRI 밴드로서 수득하고, 플라스미드 pOJ260 의 EcoRI 부위에 클로닝하여, pFL906 을 생성했다.
구축물 pFL906 을 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주에 도입하고, 거기에서 콘쥬게이션에 의해 미크로모노스포라 종 ML1 균주로 도입했다. 트랜스콘쥬게이트성 클론은 25 ㎍/ml 의 아프라마이신으로 선별하고, 그의 염색체 DNA 로부터 PSV4 영역이 실제로 차단되었음을 서던 혼성화로 밝혀냈다. 상기 경우 사용된 프로브는 PSV4 밴드였다.
돌연변이체 미크로모노스포라 종 ΔPSV4 는 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양하고, 후속하여 그의 균사를 아세토니트릴로 추출하고 HPLC-MS (실시예 5) 로 분석하여, 티오코랄린 생산체임을 증명했다.
실시예 10. PSV5 영역에서의 유전자 차단
PSV5 영역은 플라스미드 pGPSV5 로부터 1.1 kb EcoRI 밴드로서 수득하고, 플라스미드 pOJ260 의 EcoRI 부위에 클로닝하여, pFL940 를 생성했다.
구축물 pFL940 을 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주에 도입하고, 거기에서 콘쥬게이션에 의해 미크로모노스포라 종 ML1 균주로 도입했다. 트랜스콘쥬게이트성 클론은 25 ㎍/ml 의 아프라마이신으로 선별하고, 그의 염색체 DNA 로부터 PSV5 영역이 실제로 차단되었음을 서던 혼성화로 밝혔다. 상기 경우 사용된 프로브는 PSV5 밴드였다.
돌연변이체 미크로모노스포라 종 ΔPSV5 은 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양했고, 후속하여 그의 균사는 아세토니트릴로 추출하고 HPLC 로 분석하여, 상기 균주가 티오코랄린을 생산하지 않음을 증명했다.
실시예 11. PSV6 영역에서의 유전자 차단
PSV6 영역은 플라스미드 pGPSV6 로부터 1.1 kb EcoRI 밴드로서 수득하고, 플라스미드 pOJ260 의 EcoRI 부위로 클로닝하여, pFL941 를 형성했다.
구축물 pFL941 은 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주에 도입하고, 그로부터 콘쥬게이션에 의해 미크로모노스포라 종 ML1 균주에 도입했다. 트랜스콘쥬게이트성 클론을 25 ㎍/ml 의 아프라마이신을 이용하여 선별하고, 그의 염색체 DNA 로부터 PSV6 영역이 차단되었다는 것은 서던 혼성화로 밝혀냈다. 상기 경우 사용한 프로브는 PSV6 밴드였다.
돌연변이체 미크로모노스포라 종 ΔPSV6 은 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양했고, 후속하여 그의 균사는 아세토니트릴로 추출하고, HPLC 로 분석하여 티오코랄린 생산체라는 것을 증명했다.
단계 3.
티오코랄린
생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열의 수득 및 분석
오직 아데닐화 도메인 PSV2 및 PSV5 의 증폭된 영역에 있어서만이 그의 유전자 차단으로 티오코랄린을 생산하지 않는 표현형을 제공하게 된다는 상기 결과를 토대로, 2 가지의 중복 코스미드, cosV33-D12 (아데닐화 도메인의 영역 PSV2 를 포함) 및 pCT2c (아데닐화 도메인 영역 PSV2 및 PSV5 를 포함) 를 선택하여 서열분석했다. 상기 코스미드로부터 수득된 64,650 bp 의 분석은 36 개의 온전한 ORF 및 2 개의 불완전한 ORF 이 존재함을 보여줬고, 그의 구성은 도 1 에 나타냈다. 상이한 유전자로부터 도출된 생성물의 데이터베이스에 존재하는 단백질 서열의 비교로 이들 대부분의 기능을 유추하게 되었다 (표 1).
실시예 12. 코스미드 cosV33-D12 및 pCT2c 의 삽입체의 뉴클레오티드 서열의 결정 및 분석
두 코스미드를 일반적인 방법으로 서열분석하고, University of Wisconsin 의 Genetics Computer Group 에서의 프로그램 패키지 GCG 를 서열의 컴퓨터 분석에 이용했다 (Devereux et al. 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).
이에 64,650 개 뉴클레오티드의 서열을 수득했고, 그의 컴퓨터 분석은 38 개의 ORF [36 개의 온전한 ORF 및 2 개의 불완전한 ORF] 이 존재함을 나타냈고, 그의 구성은 도 1 에 있다. 상기 ORF 의 유전자 발현 생성물은 BLAST 프로그램 (Altschul et al. 1997, Nucleic Acid Res. 25, 3389-3402) 을 이용하여 데이터베이스 내에 존재하는 공지된 기능을 가진 단백질과 비교함으로써, 이들 ORF 대부분에 대한 추정되는 기능들을 정리했다 (표 1).
동정된 단백질들 중 일부는 예를 들어, 동정된 NRPS 중 일부인, Tio12, Tio17, Tio18, Tio19, Tio20, Tio21, Tio22, Tio27 및 Tio28 과 같이 티오코랄린 펩티드 구조의 형성에 관여한다. Tio5, Tio6 및 Tio23 과 같이, 내성 프로세스에 관련될 수 있는 몇가지 단백질도 있다. 상기 서열 영역에서 동정된 가능한 티오코랄린 경로 조절자들은 Tio3, Tio4, Tio7, Tio24, Tio25 이다. 최종적으로, Tio8, Tio9, Tio10 및 Tio11 과 같이 개시 유닛 3-히드록시-퀴날데이트의 생성에 관련된 몇가지가 있다.
차단되는 경우 티오코랄린을 생산하지 않는 표현형을 양산하게 되는 유전자들은 도 1 에 별표로 표시되어 있다 (tio20, tio27 및 tio28).
실시예 13. tio28 에서의 유전자 차단
티오코랄린 생합성에서 Tio28 단백질의 관여 또는 비관여를 증명하기 위한 목적으로, tio28 유전자, 및 구체적으로는 그것이 가진 아데닐화 도메인들 중 단 하나의 의 유전자 차단에 의한 불활성화를 수행했다.
상기 아데닐화 도메인 (FL-T-102up 및 FL-T-102rp) 내부의 2 가지의 개시자 올리고뉴클레오티드를 고안하고, tio28 에서의 1,428 염기쌍 구역의 증폭에 이용했다. 상기 개시자 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다:
FL-T-102up: 5'-ACCTGAGGTACTGGGCGCAGC-3' (21 뉴클레오티드)
FL-T-102rp: 5'- CCGATCACCACCACCGTGGC-3' (20 뉴클레오티드)
사용한 PCR 프로그램은 하기와 같다: 2 분 동안 94℃, 30 싸이클 (30 초 동안 94℃, 60 초 동안 53℃, 90 초 동안 68℃), 5 분 동안 68℃, 및 15 분 동안 4℃. PCR 반응 혼합물은 하기를 함유했다: 1 ㎕ 의, 코스미드 pCT2c 유래의 템플레이트 DNA, 1 ㎕ 의, 농도가 30 pmol/l 인 각각의 올리고뉴클레오티드, 7.5 ㎕ 의 2 mM dNTP 용액 (dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP), 1 ㎕ 의 50 mM MgSO4, 5 ㎕ 의, Pfx 용 반응 완충액 (Invitrogene), 5 ㎕ 의, Pfx 용 인핸서 용액 (Invitrogene), 28 ㎕ 의 증류수 및 0.5 ㎕ 의 Pfx 폴리머라아제 (Invitrogene).
PSV7 로 명명한, 수득된 PCR 생성물을 플라스미드 pOJ260 의 EcoRV 부위로 클로닝하여 pFL971 를 생성했다.
구축물 pFL971 을 콘쥬게이트성 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주에 도입하고, 그로부터 콘쥬게이션에 의해 미크로모노스포라 종 ML1 균주에 도입했다. 트랜스콘쥬게이트성 클론은 25 ㎍/ml 의 아프라마이신을 사용하여 선별하고, 그의 염색체 DNA 로부터 PSV7 영역이 실제로 차단되었음을 서던 혼성화로 증명했다. 상기 경우 사용된 프로브는 PCR 생성물 PSV7 였다.
돌연변이체 미크로모노스포라 종 ΔPSV7 은 티오코랄린 생산 배지 MT4 에서 배양하고, 후속하여 그의 균사는 아세토니트릴로 추출하고 HPLC-MS (실시예 5) 로 분석하여, 상기 균주가 티오코랄린을 생산하지 않는다는 결과를 제공했다.
단계 4. 다른
방선균에서의
티오코랄린의
이종적
발현
티오코랄린 생합성에서 동정된 유전자의 개입을 밝혀내기 위해, 각종 스트렙토마이세스 종들에서의 티오코랄린 유전자 클러스터의 이종성 발현을 검정했다. 서열 식별 번호: 1 의 위치 1,393 (MseI 제한 부위) 및 위치 54,301 (AclI 제한 부위) 사이에 포함된 DNA 영역을, 에셰리키아 콜라이에서 복제성인 플라스미드 및 후속적으로 에셰리키아 콜라이에서 복제성이며 스트렙토마이세스에 통합성인 플라스미드에 클로닝하기 위한 DNA 절편으로 선택했다. 상기 DNA 영역은 양끝이 모두 포함된 온전한, tio3 및 tio28 사이에 위치한 모든 ORF 를 포함한다 (도 1). 상기 DNA 영역의 선택은 Tio3 및 Tio28 단백질이 2 차 대사 단백질과 유사성을 보이는 서열분석된 영역 내에서 가장 중요한 단백질이라는 사실 때문이었다.
그의 큰 크기로 인해, 상기 DNA 영역은 3 가지 상이한 코스미드 (cosV33-D12, cosV19-B4 및 pCT2c) 로부터 수득한 3 개의 독립적인 DNA 절편을 합하는 단계에서 수득했다:
- 절편 A (20.2 kb): MseI (서열 식별 번호: 1 의 위치 1,393) - NsiI (서열 식별 번호: 1 의 위치 21,585);
- 절편 B (19 kb): NsiI (서열 식별 번호: 1 의 위치 21,585) - EcoRI (서열 식별 번호: 1 의 위치 40,636); 및
- 절편 C (13.7 kb): EcoRI (서열 식별 번호: 1 의 위치 40,636) - AclI (서열 식별 번호: 1 의 위치 54,301).
서브클로닝을 쉽게 하기 위해, 온전한 DNA 절편을 우선 에셰리키아 콜라이 pOJ260 (실시예 14) 에서 복제성인 플라스미드에 서브클로닝했다. 삽입체를 빼 내고, 에리트로마이신 내성 프로모터 (ermEp) (pARP) [실시예 16] 를 포함하거나 또는 상기 프로모터가 없는 (pAR15AT) [실시예 15], 에셰리키아 콜라이에서 복제성이며/스트렙토마이세스에 통합성인 벡터에 서브클로닝했다. 선별된 DNA 영역을 스트렙토마이세스 pAR15AT 에 통합성인 상기 플라스미드에 양 방향으로 (실시예 17) 및 pARP (실시예 18) 에 클로닝했다. 최종적으로, 상기 구축물은 유전자간 콘쥬게이션으로 몇가지 스트렙토마이세트에 도입했다 (실시예 19).
실시예 14. 선별된 DNA 영역의 에셰리키아 콜라이 플라스미드 pOJ260 으로의 클로닝
제한 부위 EcoRI (서열 식별 번호: 1 의 위치 40,636) 및 AclI (서열 식별 번호: 1 의 위치 54,301) 사이에 위치한 DNA 영역은 일반적인 과정 (Sambrook et al. 2001) 으로 코스미드 pCT2c (도 2) 로부터 수득했다. 상기 DNA 절편을 에셰리키아 콜라이 플라스미드 pUK21 (Vieira et al. 1991, Gene 100, 189-194) 의 특정 제한 부위 EcoRI 및 ClaI 에 클로닝하여, 구축물 pFL1023 (도 3) 을 생성했다.
제한 부위 NsiI (서열 식별 번호: 1 의 위치 21,585) 및 EcoRI (서열 식별 번호: 1 의 위치 40,636) 사이에 위치하는 DNA 영역은 일반적인 과정 (Sambrook et al. 2001) 으로 코스미드 cosV19-B4 로부터 수득했다. 상기 DNA 절편은 에셰리키아 콜라이 플라스미드 pGEM-11Zf (Promega) 의 특정 제한 부위 NsiI 및 EcoRI 으로 클로닝하여, 구축물 pFL1022 (도 3) 를 생성했다.
이어서, 상기 두 DNA 절편을 연결했다. 이를 위해, pFL1022 에 존재하는 제한 부위 NsiI (서열 식별 번호: 1 의 위치 21,585) 및 EcoRI (서열 식별 번호: 1 의 위치 40,636) 사이에 위치하는 DNA 절편을 제한효소 HindIII (NsiI 제한 부위의 바로 앞의 다중 클로닝 부위에 위치) 및 EcoRI 을 사용한 제한효소 절단으로 빼 냈다. 이어서, 상기 절편을 구축물 pFL1023 에 존재하는 특정 제한 부위 HindIII 및 EcoRI 에 클로닝하여, 플라스미드 pFL1024 (도 3) 를 생성했다.
pFL1024 에 클로닝된 전체 영역은 SpeI 밴드 (pUK21 의 다중 클로닝 부위의 양끝에 존재하는 상기 2 개의 제한 부위 덕분에) 로서 빼 내고, 플라스미드 pOJ260 의 특정 SpeI 부위에 클로닝하여, 플라스미드 pFL1036 (도 3) 를 생성했다.
최종적으로, 제한효소 절단 부위 MseI (서열 식별 번호:1 의 위치 1,393) 및 NsiI (서열 식별 번호:1 의 위치 21,585) 사이에 위치한 절편을 코스미드 cosV33-D12 로부터 수득하고, 이를 각각 pFL1036 의 NdeI 및 NsiI 부위에 도입하여, pOJ260 (Bierman et al. 1992, Gene 116, 43-49) 내에 서열 식별 번호: 1 의 위치 1,393 (MseI 제한 부위) 및 54,301 (AclI 제한 부위) 사이, 즉 양끝을 모두 포함하여 온전한 ORF tio3 에서 tio28 까지를 포함하는 구축물 pFL1041 (도 4) 를 생성했다. 더욱이, pFL1041 에서, 상기 영역은 2 개의 SpeI 제한 부위와 인접해 있다. pFL1041 은 에셰리키아 콜라이에서 플라스미드 복제성이다.
실시예 15. 스트렙토마이세스 pAR15AT 에 통합성인 플라스미드의 구축
플라스미드 pACYC184 (Rose 1988, Nucleic Acids Res. 16, 355) 의 복제 기원, ori p15A 은 SgrAI-XbaI 절편으로서 수득했고, 에셰리키아 콜라이 DNA 폴리머라아제의 Klenow 절편으로 처리했다. 상기 복제 기원을 플라스미드 pUKA 의 SmaI 부위에 클로닝하고, 이에 따라 플라스미드 pUO15A (도 5) 를 수득했다. pUKA 는, PstI-AccI 제한 부위로 클로닝되고 코스미드 pKC505 (Richardson at al. 1987, Gene 61, 231-241) 로부터 PstI-EcoRI 밴드로서 수득된 아프라마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 pUK21 (Vieira et al. 1991, Gene 100, 189-194) 의 유도체이다.
아프라마이신 내성 유전자 aac (3)IV 다음에 ori p15A 를 포함하는 DNA 절편은 pUO15A 상에서의 BglII-XhoI 제한효소 절단으로써 수득되었다. 상기 절편은 동일한 제한효소를 이용하여 플라스미드 pOJ436 에 클로닝되어 (Bierman et al. 1992, Gene 116, 43-49), pOJ15A (도 5) 를 제공했다.
콘쥬게이션 기원 oriT 를 포함하는 플라스미드 pOJ260 유래의 DraI-BglII 절편 (Klenow 로 처리함) 은 pOJ15A 의 PvuII 제한 부위에 클로닝했다. 이에 따라 플라스미드 pAR15AT 를 최종적으로 수득했다 (도 5).
실시예 16. 스트렙토마이세스 pARP 에 통합성인 플라스미드의 구축
플라스미드 pGB15 (Blanco et al. 2001, Chem. Biol. 8, 253-263) 로부터 Klenow 를 사용하여 처리된 EcoRI-HindIII DNA 절편으로서의, 엘로라마이신 생합성 경로 유래의 elmGT 글리코실트랜스퍼라아제 유전자를, pSL1180 (Amersham Pharmacia) 의 Ecl136II 제한 부위에 클로닝했다. 이에 따라, 구축물 pSLelmGTa (도 6) 를 수득하여, elmGT 유전자는 구성적 ermE 에리트로마이신 내성 유전자 프로모터 (P ermE ) 의 제어 하에 있게 되었다.
P ermE -elmGT 를 포함하는 pSLelmGTa 로부터 수득된 SpeI-NheI 절편은, 실시예 15 에 기재된 플라스미드 pAR15AT 의 XbaI 부위로 클로닝하여, 구축물 pAR15ATG* (도 6) 을 수득했다.
플라스미드 pAR15ATG* 상의 XbaI 제한효소 절단 및 후속된 재-라이게이션으로써 elmGT 유전자를 제거하고, P ermE 프로모터는 유지하여, 플라스미드 pARP (도 6) 를 제공했다.
실시예 17. 양 방향에서의, 스트렙토마이세스 pAR15AT 에 통합성인 플라스미드로의 선별된 DNA 영역의 클로닝
서열 식별 번호: 1 의 위치 1,393 (MseI 제한 부위) 및 54,301 (AclI 제한 부위) 사이에 포함된 영역을 포함하는 pFL1041 (도 4) 유래의 SpeI DNA 절편을, 양 방향에서, 플라스미드 pAR15AT (도 5) 의 XbaI 제한 부위로 클로닝했다. 이에 따라, 에셰리키아 콜라이에서 복제성이며, 스트렙토마이세스에 통합성이고, pFL1048 및 pFL1048r (도 7) 로 명명한, 아프라마이신 내성 유전자를 가진 2 개의 신규한 플라스미드는, φC31 파아지의 attP 영역을 이용한 계를 이용하여 생성되었다.
실시예 18. ErmE 유전자 프로모터 다음의, 선별된 DNA 영역의 스트렙토마이세스 pARP 에 통합성인 플라스미드로의 클로닝
유사한 방식으로, 서열 식별 번호:1 의 위치 1,393 (MseI 제한 부위) 내지 54,301 (AclI 제한 부위) 사이에 포함된 영역을 포함하는 pFL1041 (도 4) 유래의 SpeI DNA 절편은 플라스미드 pARP (도 6) 의 XbaI 제한 부위에 클로닝했다. 이에 pFL1049 (도 7) 이 생성되었으며, 여기서 tio3 (서열 식별 번호:4) 에 해당하는 ORF 는 pARP 에 존재하는 연속적 프로모터 P ermE 의 제어 하에 있다. 상기 플라스미드는 아프라마이신 내성 유전자를 갖고, φC31 파아지의 attP 영역을 이용한 계를 이용하여 에셰리키아 콜라이에서 복제성이며, 스트렙토마이세스에서 통합성이다.
실시예 19. 상이한 스트렙토마이세트에서의 티오코랄린 생합성 경로의 이종성 발현
플라스미드 pFL1048 (도 7) 는 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주 (Kieser et al. 2000) 에서 콘쥬게이션에 의해 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) TK21 (Kieser et al. 2000) 및 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) J1074 종 (Chater et al. 1980, J. Gene. Microbiol. 116, 323-334) 에 도입되었다.
플라스미드 pFL1049 (도 7) 는 에셰리키아 콜라이 ET12567 (pUB307) 균주로부터 콘쥬게이션에 의해 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor) M145 (Redenbach et al., 1996, Mol. Microbiol., 21, 77-96), 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) TK21, 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) J1074 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 (Streptomyces avermitilis) ATCC 31267 종으로 도입되었다.
최종적으로, 플라스미드 pFL1048r (도 7) 는 에셰리키아 콜라이 ET12567 균주 (pUB307) 로부터의 콘쥬게이션에 의해 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans) TK21 종에 도입되었다.
제품 배지 R5A (Fernandez et al. 1998, J. Bacteriol. 180, 4929-4937)에서의 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus. pFL1049) 클론의 배양 결과는 도 8A 에 나타낸다. 도 8B 는 상기 염색체에서 체류 시간이 27 분인 정점의 흡수 스펙트럼을 보여주며, 그의 질량 스펙트럼 (도 8C) 은 이들 모두 정제된 티오코랄린의 것과 상동임을 보여준다.
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<221> CDS
<222> (1517)..(2131)
<223> Open Reading Phase of tio3
<220>
<221> CDS
<222> (2154)..(2822)
<223> Open Reading Phase of tio4
<220>
<221> CDS
<222> (2970)..(3791)
<223> Open Reading Phase of tio5
<220>
<221> CDS
<222> (3794)..(4777c)
<223> Open Reading Phase of tio6
<220>
<221> CDS
<222> (4904)..(5611)
<223> Open Reading Phase of tio7
<220>
<221> CDS
<222> (5701)..(6426c)
<223> Open Reading Phase of tio8
<220>
<221> CDS
<222> (6426)..(7688c)
<223> Open Reading Phase of tio9
<220>
<221> CDS
<222> (7733)..(8524c)
<223> Open Reading Phase of tio10
<220>
<221> CDS
<222> (8791)..(10002)
<223> Open Reading Phase of tio11
<220>
<221> CDS
<222> (10002)..(11590c)
<223> Open Reading Phase of tio12
<220>
<221> CDS
<222> (11847)..(13634)
<223> Open Reading Phase of tio13
<220>
<221> CDS
<222> (13734)..(15005c)
<223> Open Reading Phase of tio14
<220>
<221> CDS
<222> (15005)..(16354c)
<223> Open Reading Phase of tio15
<220>
<221> CDS
<222> (16441)..(18744c)
<223> Open Reading Phase of tio16
<220>
<221> CDS
<222> (18774)..(19055c)
<223> Open Reading Phase of tio17
<220>
<221> CDS
<222> (19260)..(20036)
<223> Open Reading Phase of tio18
<220>
<221> CDS
<222> (20146)..(20880c)
<223> Open Reading Phase of tio19
<220>
<221> CDS
<222> (21188)..(28969)
<223> Open Reading Phase of tio20
<220>
<221> CDS
<222> (28979)..(38398)
<223> Open Reading Phase of tio21
<220>
<221> CDS
<222> (38449)..(38661)
<223> Open Reading Phase of tio22
<220>
<221> CDS
<222> (38642)..(41263)
<223> Open Reading Phase of tio23
<220>
<221> CDS
<222> (41835)..(42368)
<223> Open Reading Phase of tio24
<220>
<221> CDS
<222> (42395)..(43255c)
<223> Open Reading Phase of tio25
<220>
<221> CDS
<222> (43340)..(43741c)
<223> Open Reading Phase of tio26
<220>
<221> CDS
<222> (44152)..(49563)
<223> Open Reading Phase of tio27
<220>
<221> CDS
<222> (49635)..(53669)
<223> Open Reading Phase of tio28
<220>
<221> CDS
<222> (53749)..(55305c)
<223> Open Reading Phase of orf29
<220>
<221> CDS
<222> (55384)..(57222c)
<223> Open Reading Phase of orf30
<220>
<221> CDS
<222> (57895)..(58467c)
<223> Open Reading Phase of orf31
<220>
<221> CDS
<222> (58535)..(59206c)
<223> Open Reading Phase of orf32
<220>
<221> CDS
<222> (59298)..(59564c)
<223> Open Reading Phase of orf33
<220>
<221> CDS
<222> (59611)..(60114c)
<223> Open Reading Phase of orf34
<220>
<221> CDS
<222> (60202)..(60888)
<223> Open Reading Phase of orf35
<220>
<221> CDS
<222> (60960)..(62240)
<223> Open Reading Phase of orf36
<220>
<221> CDS
<222> (62300)..(62833)
<223> Open Reading Phase of orf37
<220>
<221> CDS
<222> (62925)..(64650)
<223> Open Reading Phase of orf38
<400> 1
gatccccagc cgcgaatggc agccacacag ctgcggcccc ggggccaaag gaccacgcga 60
gtacctgtgg gcctggatca ccaccgccac cagcgcaggt gagcaccggt ggctgctgat 120
gcgccgcaac cgcagcaccg gtgagctggc cttctacctg tgctggtcac cccgcccggc 180
gccgctgcac accctcgtga ccgtcgctgg ttcccgctgg agcatcgagg agctgttcca 240
gtccggcaaa ggccaggtcg gcctggacca ctaccaggtc cgcggctgga ccggctggca 300
ccgccacgtc accctggcca tgctcgccct ggccgtcctg accatcctcg ccgctcggca 360
gcccgacccc gacccggaga tcatcgcgct gaccgtcgcc gaaatccgcg ggctcctcaa 420
cgccttcgtc ctcgccgtga cgctcccacc cgcgcacacc ctgcactggt cgacctggcg 480
acgaacatcc caagcccgcg cccgacgagc ccactaccag cgcagacagg cgaagtgacg 540
ttggagtact agccattgag ccgataattc agcgcacgac ttgccggaat cggtagggat 600
ggtgtggcga ccatggccgc gatcgatgcc tgggcgcgtc ggcccggtcg acgccgagtc 660
gggcgacgcg ctggcgggtg aaggtggccg cccgtcgaac tttacgactt gaataccagt 720
atcggtgaag aggccgaaga ccgatatctg ccattacgta ccgatcatgt tgcaggaatg 780
cccggaacct ttcggatgtc aggctgccag ttggcaagcg ggtgggtgcc ctctcccgca 840
gggcttcgcg tagtcgcctg aacgtcttcc gacctcgcgt tcgtggtgtc gcggacctga 900
ttggagggtg atttagcacg ggtgtggtcc atcggtgatc tgcagttgct gagacaacat 960
gagacggaga aggaccacac cctcgcatgt catcgtcgct gatcgacgta acccgtcagc 1020
atgccccgcc ccgcccgact caccgactgc tggccgcgag gcgcttggag gccctggcgc 1080
gggttcccga tccgcgtgac ccgtgccaac cgccgcccac acgacctcat cgccaccgtg 1140
aacagcagct accccactat gcaatgaccc tgctctgtcc cgtcgacggg acagagcgcc 1200
cgccgccgga ggaagaaacc tgttgccgtc gcgggatgct gattatattc agcctcatga 1260
ccctgctcat gaagcggcgg gcttcggtcg cgatgcgttt gttccgccga tatctcacta 1320
aacgccggga ctggacagtg tgaacatcat tgcacttcta gctggttgac aacgtatcta 1380
cggtcgccat ggttaattgt ggttgacggc gcgtgtcgcg actgcggagc gccatgtcgt 1440
cgaatctcgg ccagccgtcg ccgtgacatt tgtcaaccag ctccgatgaa ttctgtgcac 1500
tctgggggag ttgctgatgt cggtttcggg aagccgccgg agcgaaggct cctaccgtcg 1560
ttcgggtggt tgtgcccagg gccgctcgcc ccggccagcc agggaagacg tcaagttcgt 1620
ccgttggccg gccgagcggc acctacgcga cctgtgccgt caggagcgga tcccgtgcct 1680
cctggtggtc gagggcggag cagagccgcc ggtctgcagt gatccgcgtg aggactgggt 1740
tcgtacgccg atctcgccat ccgaccttga cgctcgggtg accgctctcc ggcaacgttc 1800
tcacgaccgg cgtacgcctg ttctcgaccc ggccgggacg ttgtcgttca ggactgcgtc 1860
cgtcgtcatg tccagtacgc acctcgaact catggatctg ttcgtcgaac gcttcggcca 1920
ggtggtctac cgctgggagt tgatgaccat cctcacgaag cgcgactcga catcaacgcg 1980
aaacgccctc gatctgcaca tcatgagaat gaggaagcgg atcgcgccgc tcgatctgga 2040
tatagttact gcctggggcc gtggctacgc gctggaagaa aagtcctcat gggccgcggt 2100
ggccagcaag cccgcggctg tcgatcattg ctgacatcgc cggccgatgg ctactcagtt 2160
tcgtcgtggg tagtcttgtc gagggtctct gctgcggccc ggtcgagggt ggagacgatc 2220
cactgatcga gttcgacgct tgattggtgc gcggcctggc gccatcgggt aaggcgtcgg 2280
tcgggtatgg gaatgcgggg catcagtgcg gtcttgatgg tttctgttgt gcggtcggag 2340
cgggtcgctt tgatggccgc gcggagttgt ttgaccgacc acatctgggt ttcggcttcg 2400
tcgagccaac ggtcctgatc gtcgggagac attgcggcta cttcggcgtg gtgttggaaa 2460
ctgaggccgc ttcgacggcg ggccagtggg aagcggccgg cgacccaggc gtagttgcgt 2520
agggtctggt agtccagtcc tacagcctgg acgacgtgcc gatagcggtc ggcgtattgt 2580
tccttgccgt acaccagcca gtcgcccagg caccaggacg aggagtcgac gataccggag 2640
agttgggcgc cggttcgctc ccagtgttcg aagctcattc gttcgggcaa ccgtagaccg 2700
accctggtca gcatcacctg ggccggctct gctgggcgtt gcttcggaac gccagccgtt 2760
gctgcaggga ccacccggag cgctgctacg gcgttgcgtg acgatcggct acccgcgctc 2820
atcccactca acctccccga cagtcggata actcgctatc tctgctctct ttttccgtct 2880
cgcgccgtgc atgtgtgatc ggcgcgcgcg ggatgccacc cgtaaggccg cccttccgac 2940
aaaggcggcc ttgcgggtgt ttccggttac ctcgaccgca ggctgtactt acgggtcgcc 3000
agcggagcga agatggtgat cagcaggacc gaccaggcaa ccgtcagcag cacatccagc 3060
cccggcggat tgccgttgaa caggtcgcgc agcgcgttga ccgtcgcggt catgggactg 3120
gcatcggcgt acacccgcag ccaggtcggc atcgactcgg taggtacgaa cgccgacgag 3180
atcagactga acgggaagat ccagatcagg ccggccgact gcgccgcctc cgggttgggc 3240
accgagaggc cgatcatggc gccgacccag gtgagcgcgt agccgaacag caacagcagc 3300
gcgagtccgc cgagggcaga caggaccccg ccctggaagc ggaagccgat cagcagaccc 3360
atgagcacca cgaccagcat cgacacgacg ttgcgaagga tctccgacag cgtacgcccg 3420
acgaggaccg cggaccggct catcggcatc gagcggaacc ggtccatcag gccgcggtcc 3480
atgtcggtgg agatgccgat cgtggtgccg gcgaccgaac cgaacaacac catctgcacc 3540
aggatgccgg gcagcaggaa ctgggggtag ttcccgccct cgacattgat cgccccgccg 3600
aagacgtagg cgaacagcag gatgaacatg acgggctgaa ccagcgagaa catcaccagt 3660
tcggggctgc gcgtcaggtg ccgcagattg cgcagcgcca tctgccaggc gtcggacagc 3720
caccaggaca ggccggtctg ctgctgtgcg gcggcggcat cgagccgcgg tttcagggac 3780
gtggagacca tcaccgctta ccacccttct tcttgctgtt cacgtcttcg gacgcccggg 3840
ccgtggcggt gtgcccggtg agggcgagga acacgtcatc gagcgtgggc cggcggacgg 3900
ccacgtcggc gattgcgatg ccggaatcgc gcagcggatt gagtagctcg ttgagcgtca 3960
taccctcggg gaggggcgcg tgcacctgca tgccctccgg atcgccgacc ggctcggtcc 4020
ccaacctctc gcgcaggatc tgggtggtct tctcgaccgc ggcggcgtcg atgagagtca 4080
cgtcagccca cgcctggccg acctccgcct tgagttcgtc cggcgcgccg ctggcgatca 4140
ccttgccgct gtcgatcacg gacagcgagt cggcgaggtg gtcggcctcc tcgaggtact 4200
gggtcgtgag cagaaccgtg gtgccctcct cgaccaactc gttgacgatg cgccacacgt 4260
ccatgcgact gcgcggatcg agggcggcgg taggttcgtc gaggaagatg agctggggcc 4320
ggctcatcag ggtggcggcg atgtccagcc ggcggcgcat accgcccgag tacgtcttcg 4380
cctgccggcc ggccgcctcg gtcaggtcga agcgctccag cagttcggtc gcccgcacct 4440
tgatgtccgg cgtggacatc cggaacagct tgccgaccat gtgcaggttc tcccgcccgg 4500
tcagcatgtc gtcgacggtg gtgtactgac cggtcaggcc gatgatggag cgcacctgta 4560
gcgcgttgcg ccgcacgtcg aagccgaata tctcggcctt cccctcatcc ggcctgagaa 4620
gggtggtcag aacccgaacg gtggtggtct tgcccgcacc gttaggtccg agcagaccgt 4680
gcaccttacc ctccggcacg gtgagttcga ggtgatcgag agcggtcacc gagccgaatc 4740
tcttgcacag tccagctact tcaatcgctg ctggcatctc caggattcct ctcaaagggg 4800
ccaacgaagg tcggcgtgct gatcctggaa tctacccctg aacttccctt agaagctttg 4860
accgcagaat gagcggcagc gagtcgctat agtctcaaac gtgatgtatt tccgtccggc 4920
tgatctcgcc catgagcacg gcctttcccc gcaatcggta cgcaactacg agcgtgatgg 4980
tctcatcccg cccgctcggc gtacggagag cggctaccgg cggtacaccg agaagcacgc 5040
cgcagcgcta cgggcgtacc gcgccctcat cccggcgcac gggtacgccg aaagcggcgc 5100
gatcatgcgg gacatcactg ccggacggtt gaacgaggca ttgacaacca tcgaccgcag 5160
tcacgccgaa ctgctgcgag accgcggcac cctggacgct gtcgccgagg tcctgactca 5220
cctgacggga cgctcgaccg gcacctggcg tgccccgaag agcattcagc cctacagcat 5280
cggggagttg gcgcaccggc tcggcgtcaa tgtggcgacc atccggaaat gggagacgtc 5340
gggcgtgctc gcgcccgtcc gccggccgga gaccgggcac cggatgtacg acgccagcga 5400
cgtccgcgac gcggaactgg cgcacttcct gcggcgcggt cgctatccgc tcgagctgat 5460
agccaccgtg gtgcagcagg tccgggcggc cggagacacc caggcgttgg ccgcggccct 5520
cgcggactgg cggcagcgcg tcaccacgcg cggcctggcc atgctgaacg ccgccgcaca 5580
actcgccagc tacctggcga tggaggagaa ctgatccggg gcccgacgcc cccgtgaccc 5640
gctgcgccgg gactgttccg ggcgggtggg gccgtaccga ctccacccac cccgatctca 5700
ctgcgtgtgg gcagtcggct gctcccacac caacgcgtcg tggacctgcg cccgaagctg 5760
ccgcagctgg gcgaagggca gggtgatccg gcgggccaga tagtcgacgc cggtgctgcc 5820
gccggtgccg ttgcgattgc ccaccatctt cgagaccagc gccaggtggg tcatcttcca 5880
ccgccagtag ccgttggcca cgtcgagcag gctgtcggcg atgcggttga gcacgccggc 5940
gccggggccc cgtgcgcaga cctcggcgac gctgatgccg ttgtgctcgg tcagccgctc 6000
gaaggcccgg tagaggcggc cctcctgacg ctcgccgccg agcagccgcg cgagcaggcg 6060
gaactgcgcc gactgcgcac cgctcgcccc gtcgaggaac gggcggaatt cggcgaagtg 6120
acgcagcggc aaccgttcca gcgcgaccac ctgctcgtgc agtacccgga gcagctcagc 6180
ggtgcgctgg agaaattcca gcgccagctc ctcgtcctcg ggtccgtagg gcggcgtcat 6240
cgcgtccgcc gcggcgtcga ggtcgtacgt cacctgcttg agccacagct cgcaggcttg 6300
atgggtgacg atgaagaagt gctcagccag taccacggac cggctcgcgg tgtccggggc 6360
gcgggtctcc tgcagggaca gcagcgtgtc gacctgcagg tagtccgcgt aggtcagggt 6420
cgtcatcggg cggtcccggg gcgttctcgt gcgaactcca gcagctcgcg tacgccgctg 6480
cgcagcaccg acggcgctac gcacatggcg atccggatga ggtgacgcga ccagggcgcc 6540
ggttcgacgg tgatgacccg gccccgggcg tccaggcggg gcatcagcgc gaacccggtg 6600
ccgggaacca ccgcgacgtt ccgggtctcc agcagcccgg tggcgaactc ttcggcggtc 6660
aggccggtcg gcgcgacgtc gagcactgcg taccagccac cggcgggcag ttcgggcagc 6720
aggccggcgt cgcgtacggc gggcagcacc gcatcgcggt tgctgagcac catggcacgg 6780
ttctcgcgta ccacgtgtcc cagccgcagc gcctccagcc ccgcgtattg caccggggtc 6840
gacatcgcga tgaggttggc ctcctgcacg atccggaagg cgtgcgcggt ccggtcgttg 6900
gcggtgctga cgtaccccaa tcggtagccg gtcatcgcca ggctcttcga gaaggagtag 6960
gagctgtgca cgatccgctc ggagaccggc acatcccact ccagtgacgc ggtcgagacg 7020
tgttcgtcgt cgaagacgaa gtgctcgtac gcctcgtcgc tgatgacctg ccagccccgg 7080
gcgcgcgcca tgtcgatcag cgtgctcagg gtcgccgtgt cgaggacggc cccggtcggg 7140
ttggcgggtg agttgatcaa cagcactctg gtgttcgcgg tcgaggccgc cagcaccgac 7200
tcggggtccg tccggtagtc gcgtcccagc gggtagaaca ccggacggag accggcgagc 7260
agcacctgct gcaggtggat gggccagtgc agctccggca gcaggatctc cgcgtcgggt 7320
tcggccacgg cctgcatcag cgcggccagg ccctgacagg agccgggggt gacgaagagc 7380
cgggacacat cggtgtccac gccgttctgg tcagcgagct tctccaccag acgctcgcgg 7440
agctccagca gcccctcgac cgccgtgtag tcggtgcgcc ctgcggtcac cgcctccgcc 7500
agcgcctgcg cgacctcggg tggcggggtg aagtagggct cgccgacatg cagcttggtc 7560
accggaacac cgctgatgcg ctcgcgctcg ccggcatcgc ggaagacgcg atgcagctcc 7620
gacgacggaa tcgtcgacgc gaccgaggga ccgtcgagca ggttgggata ggggcttggc 7680
aggggcatct aatctccgtt tcgatcgtga cggcggtacg gggagggcat caggaggtgc 7740
gaccgccgtc gacgggaatc agcgctccgg tgatccagcc ggaaaactcc gggtcgagca 7800
ggccgcacac ccacccggcg atctcggcgg gctggccgaa ccggcccaaa ggggtcgccg 7860
cgagcagcga cgaccgcagc aacgcggact tcacggagtc caggcccatg tcgtcccaca 7920
tcggtgtgtc cacgggtccg ggtaggacgg cgttgaccct gacgtccggg gccagttccc 7980
gggccagcga tcgggtcaga ctgttcagcg cggccttgct ggcgccgtag aaggaccgcc 8040
ccggcatggc cagcacggca ccgacggacg acacgttcac caccgcgccc cgatgctcac 8100
gcaggtgggg tagggccgcg cggatcaggg cggccggtgc gcggacgttg gtggcgagca 8160
gccggtcgaa gtcctcgtcc gacgccgtgt cgagcgtcgc gaagcgggcc agcccggcgt 8220
tgttgaccag accgtgcacc gtaccgaagc gggtggtcgc ggcggcgacg acgtgttccg 8280
ccgcgcccgg ctcggtgatg tcggcggcga cggtcgcgac ctgcccgcca ccgtctccgg 8340
tcagctcccg caacgccgcc tcgcgacgcc cgaccgcgac cacgttcgcg tcgcgggcca 8400
gcagtcgttc gccgatcgcc cgtcccagtc ccgtgccggc cccggtgacg atcaccgtac 8460
gaccggcgag gccgtcgccc cgctcagcca cggcgggcca tgcctcggct tcggttgggg 8520
acaccgacgg cgtggctggc tgggacggcc ggccgccgag gtgtgcacgg ccgatatccg 8580
cgtccggtaa cgcgatgagc ggttgtgacc atggcctccg cctcgaccag actggtgttc 8640
gagctccaat ctcccgcctg ggaggcggat cggcatccat tccgacagaa ctgagccaga 8700
tgcgcccgcg gccctaccga ggcttgtgac gatgcgggca gttacgactt cgccgccgga 8760
tctccggatc ccgtacggaa ggttctgtcg atgagttcgc ccacggccag caccagcgcg 8820
ctcgacctca ccgacccgac gacgttcgtg cgccacgaca cgcacgtgtt ctgggccgag 8880
gtgcgtgacc acaatcccgt ctactggtac cagggccgcg aggaccgccc cggcttctgg 8940
gtggtatcgc gatatgtcga cgtggtcgcg tcctacaccg acgctgcgag gttgagctcg 9000
gcgcgcggca ccgtgctgga cgtgctgctc cggggcgagg actccgccgg cgggcggatg 9060
ctcgcggtca ccgatcggcc gcgccaccgt gaactgcgca acgtcatgct ccgcgcgttc 9120
tccccccggg tgctcggccg ggtcgtcgag caggtccatc gacgcgccga cgagctgatc 9180
cggcgggtca ccggtaccgg cgccttcgac ttcgccaccg aggtggccga gagcattccg 9240
atgggcacga tctgcgacct gctgtcgatc ccaccggcgg accggccgga cctgttgcgg 9300
tggaacaaga acgccctctc ctccgacgag gccgacgcca acctgtatgc cgcgctggag 9360
gcccgcaacc agatcctgct ctatttcatg gatctggccg agcagcggcg ggccagtccg 9420
ggcgacgacg tgatcagcat gatcgccact gccaccgtcg gcggcgagcc gctctccatc 9480
gacgacgtcg cgctcaactg ctacagcttg atcctcggcg gtgacgagtc ctcacggatg 9540
tcggcgatct gcgcggtcaa ggcgttcgcg gacttccccg accagtggcg ggccgtacgc 9600
gacggtgacg ttgcgatcga caccgcggtc gaggaggtgt tgcggtggtc cacgccggcc 9660
atgcacttcg cccgtaccgc caccacggac ttcgagctgc ggggccagca ggtgcgggcc 9720
ggagacatcg tcaccctgtg gaacctctcg gccaacttcg acgagcggga gttcgaccgg 9780
ccctaccggt tcgaggtggg gcgtaccccg aacaagcacc tgtcgttcgg ccatggcccg 9840
catttctgcc tcggcgccta ccttggccgc gccgagctgc aggcgttgct caccgcgctg 9900
gtcggaaccg tttcgcgcat cgagtccgcc gggtcgcccc ggcgcgtcta ctcgaacttc 9960
ctcaacggcc acagctcgct gcccgtcgcc ttcacgggtc gctgacccgg ccaggccctc 10020
accccgatgt gcgcagggtg accttgtcga ccttgccgac ggcggtgcgg gggaactcct 10080
cgatcggcac cacccgatcc ggaatcttgt aggtggccag accgcgctcg cggaggaagg 10140
acttgacagc cgccggactg atcggctcgt cccggaggat gacgaaggcg acggtcttct 10200
cgcccagcac cgggtcggcc acgccgacca ccgccgcgtc gcggatcgcg gcgtgggcga 10260
gaaggtgctc ctcgatctcc tcggcgggta ccttctcccc gccgcggttg atgatgtcct 10320
tgatccgccc gaccaccacg atgctgccgt ccggccgccg gcggaccatg tcgccggtgc 10380
ggaagtagcc gtcgggggtg aacgagcgcc ggttctgttc ctcggcccgg tagtagccgc 10440
ggatcgtgta gggaccccgc accagcagct cgccctcggc gccatcgggt acgggtcgac 10500
cgtcggtgtc gacaacgagg atctcgtcgt gcgcggccag cggacgtccc tcggtggcga 10560
gaacgacctc ctccggatcg tccaggcgcg tgtaggtcag cagcccttcc ccgacgccga 10620
accactgtgt cagcacggca ccgaggctgg tccggacctc ggcggcgcgg gcggggtcga 10680
acttggagct gcccacctgg agcatgaggt tggggaaccg gacgtccgac ttgcgggcgg 10740
cgtcgagcca cagccgcacc acgggcggca cgagcgtcgt gagcgtcacc cgctcccgct 10800
ccaacagctc gaacacctcg tccggccgga cgctggaggt gagcactgcg gtgccgccga 10860
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ccgccaggta cacgtcctcc gcgccgaacc gcagcgcatc agccgtggcg cgcatgttgt 10980
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gcgacctcgc gggcgcccgc ctggccgcct tcgtcagcac cgtggccggc accggggttt 13200
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cggtgcaggt gttacagcgg ctcccggtca ccgccaacgg caagatcgac cgggcggcgt 13320
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ggcgatgatc cggcggacgg gtgtcaccac cgtgcacgtc gtcccgtccg tgctcgccga 23340
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cgcgttcctc gagatcgaag cagttctgac cgcccacccg ggagtggacc aggccgccgt 23880
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gcacggcggt cgcctccggt tggcccggat cccgaacgcc aggctggtga gcgaggcggt 37020
ccagtgcggc gtgcccacca acgtaggcgg cacgcccctg gacccgcacg agttggcgag 37080
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gcccgttgtt ccgggcccgg ctggtccggc tcggtcccac cgagcacgct ctcgccgtcg 50160
cggcgcacca catcgtggtc gacggctggt cgatgggcct gatcctgcgg gagctggccg 50220
ccgcgtacga cgccgaccgg cacggcacgc gagcgcggct ggacccgccc gccctccagt 50280
acccggactt cgcccgctgg cagcatcagc agctggccac cgccgaactg gacaaccacc 50340
tgaggtactg ggcgcagcgg ctggccgacc tgcccaccct ggaactgccg gccgaccgac 50400
cccggccgac caccgcgtcg ttccggggtg cgctgctgga gcaaccactg gatccgcagc 50460
tgcacgccgg ggtgcaggcg ttggccaagg agaccggcgc gagcccgttc atggtgctgg 50520
tggcggcctt cgcggccatg ctcgcccgct acaccggcac cgacgacctg gccgtcggca 50580
ccaccttcag cgggcgcagt cgtccggagc tggagagtgt ggtcgggttc ttcgccaaca 50640
tgggggtgct gcgtctggac acctcgggcg accccagttt cgccaccctg gtcgaccggg 50700
cccgggacac ctgcctgggc gcgtgggagc accaggacgc cccgttcgag cgggtggtgc 50760
agcgactcgc cccaccccgc gacccgggcc gcaacccgct gttccaggtg gccgtgcagc 50820
tgctggacgg ctccacctgg ggcggaccga cgctgcccgg caccgacagc accccggtcg 50880
acctgcggct ggaccggtcc cgcttcgaca tgatggtcag cctcgtcgac cacggcgacc 50940
ggtactcggt gctcaccgag tactccaccg acctgttcga cgcccggcgg gtacgcgcca 51000
tgctcgacca cgtcgcccgg ctgctcgacg cgggcctggc cgacccggct acgacgctgt 51060
cgcggttgcc gatgctcgac cccgccgaac gcgagcgggt cctggccctc ggcgcgggtg 51120
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ccggtggggt gtacgtgccg ctggacaccg ccgccccgcc gaaccggctg cgccggatcc 51420
tgaccaactg tgccgcccgg ctcgtgctca cccgcaccga gcacgccgcc ggggtgccgg 51480
agggcccgtg gcggaccctc ctgctcgaca ccggcgacct ggactccgcc gccgggctcg 51540
ccccggaacc gtccaccggc ccggacgacc tggcgtacgt gctgcacacc tcgggcacga 51600
cgggtgaccc gaagggtgtc cagctgccgc accggggttt cgtcacctac ctggactgga 51660
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tcggcaagga ccggctgctc tcgccgggcg gtctcgccga ggtcctggcg gccgaacgga 51840
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tcgacgcgtt gcgggaggtg ctggtcggtg gcgaggtctg ccccgccgac ctggtggccc 51960
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ccctgccgtt gaccaccagc ggcaaggtca accggcgggc gctgccggca ccggaggcgg 52620
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cggtgtcgct caagcagttc tacgccaccc cgaccgtccg ggcggtggcc cggttcgtcg 52860
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ccgacctggc cgggctctcc gcggcaccgg caccgccgct ggacgccgag gtggtcgacg 53340
cggccgaccc gatcgcggcg ctcaccgggt tcctggtccg gcacggactg atcccgtcgg 53400
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acggctcggg tcgttctcgg cggtcgccag gtagacgccg ccgacgacga ccacgctcac 54060
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tcggcgtcgg cttctacgcc gcgttcatgg tcgccgagcg ggtcgagctg gtcacccgac 63360
gggccggcga gaccggtggt acccgctggg agtccaccgg cgagggcacc tacaccatca 63420
ccgagctgga cgacgccccc cagggcacgg cggtgaccct gcacctcaag cccgccgacg 63480
ccgaggacaa cctgcacgac tacaccgccg aatggacgat ccgggggatc gtcaagcggt 63540
actccgactt catcgcccac ccgatccgga tgaccgtcga gcggcccggc accgacgacg 63600
cccccgccac caccgaggcg gtgacgctca actcgatgaa ggcgctgtgg gcccgcccgc 63660
gcggtgaggt cgagcccgcc gagtaccacg agttctacaa gcacgtcagc cacgactggg 63720
cggacccgct ggagaccatc cacatgcggg gggaggggac cttcgagtac gaggcgctgc 63780
tgttcatccc cacccacgcg ccgctggacc tgttctcccc ccagggccgc cgaggggtgc 63840
agctctacgt caagcgcgtg ttcatcatgg acgactgcga cgcgctgatg cccaactacc 63900
tgcggttcgt caagggtgtg gtggacgccc acgacctgtc gctgaacatc tcccgggaga 63960
tcctccagca ggaccgccag atccgcgccg tccgccgtcg cctggtcaag aagatcctcg 64020
ccacggtcaa ggatctcaag accggccagc cggagcgcta ccgcaccttc tggaccgagt 64080
tcgggacggt ggtcaaggaa ggtctgctgg aggacaccga caaccgggac accctgctgg 64140
agatcctctc ggtggcctcc accaacgacc cggccgagca gaccgacctg gccggctacg 64200
tggaacgcat gcgcgagggc cagcaggaca tctactacgc caccggcgag aaccggagca 64260
ccatcgagaa ctccccgcac attgaggcgt tccgcgccaa gggctacgag gtgctgctgc 64320
taaccgaccc ggtcgacgag gtttgggtgg agcgggtcgg cagctacgcg ggcaagacgc 64380
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tgttggccga caacgtcaag gaggtccggc tgtcgtcgcg gctgaccacc tcgccggcct 64560
gcgtggtcgg cgacgcgcac gacctcacgc ccaccctgga gaagatgtac cgcgcgatgg 64620
ggcaggaggt gccgaaggtc aagcggatcc 64650
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF1 Protein
<400> 2
Ile Pro Ser Arg Glu Trp Gln Pro His Ser Cys Gly Pro Gly Ala Lys
1 5 10 15
Gly Pro Arg Glu Tyr Leu Trp Ala Trp Ile Thr Thr Ala Thr Ser Ala
20 25 30
Gly Glu His Arg Trp Leu Leu Met Arg Arg Asn Arg Ser Thr Gly Glu
35 40 45
Leu Ala Phe Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Arg Pro Ala Pro Leu His Thr
50 55 60
Leu Val Thr Val Ala Gly Ser Arg Trp Ser Ile Glu Glu Leu Phe Gln
65 70 75 80
Ser Gly Lys Gly Gln Val Gly Leu Asp His Tyr Gln Val Arg Gly Trp
85 90 95
Thr Gly Trp His Arg His Val Thr Leu Ala Met Leu Ala Leu Ala Val
100 105 110
Leu Thr Ile Leu Ala Ala Arg Gln Pro Asp Pro Asp Pro Glu Ile Ile
115 120 125
Ala Leu Thr Val Ala Glu Ile Arg Gly Leu Leu Asn Ala Phe Val Leu
130 135 140
Ala Val Thr Leu Pro Pro Ala His Thr Leu His Trp Ser Thr Trp Arg
145 150 155 160
Arg Thr Ser Gln Ala Arg Ala Arg Arg Ala His Tyr Gln Arg Arg Gln
165 170 175
Ala Lys
<210> 3
<211> 46
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF2 Protein
<400> 3
Met Arg Ser Cys Gly Arg Arg Leu Ala Arg Val Thr Arg Ile Gly Asn
5 10 15
Pro Arg Gln Gly Leu Gln Ala Pro Arg Gly Gln Gln Ser Val Ser Arg
20 25 30
Ala Gly Arg Gly Met Leu Thr Gly Tyr Val Asp Gln Arg Arg
35 40 45
<210> 4
<211> 205
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio3 Protein
<400> 4
Met Ser Val Ser Gly Ser Arg Arg Ser Glu Gly Ser Tyr Arg Arg Ser
5 10 15
Gly Gly Cys Ala Gln Gly Arg Ser Pro Arg Pro Ala Arg Glu Asp Val
20 25 30
Lys Phe Val Arg Trp Pro Ala Glu Arg His Leu Arg Asp Leu Cys Arg
35 40 45
Gln Glu Arg Ile Pro Cys Leu Leu Val Val Glu Gly Gly Ala Glu Pro
50 55 60
Pro Val Cys Ser Asp Pro Arg Glu Asp Trp Val Arg Thr Pro Ile Ser
65 70 75 80
Pro Ser Asp Leu Asp Ala Arg Val Thr Ala Leu Arg Gln Arg Ser His
85 90 95
Asp Arg Arg Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala Gly Thr Leu Ser Phe Arg
100 105 110
Thr Ala Ser Val Val Met Ser Ser Thr His Leu Glu Leu Met Asp Leu
115 120 125
Phe Val Glu Arg Phe Gly Gln Val Val Tyr Arg Trp Glu Leu Met Thr
130 135 140
Ile Leu Thr Lys Arg Asp Ser Thr Ser Thr Arg Asn Ala Leu Asp Leu
145 150 155 160
His Ile Met Arg Met Arg Lys Arg Ile Ala Pro Leu Asp Leu Asp Ile
165 170 175
Val Thr Ala Trp Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Glu Glu Lys Ser Ser Trp
180 185 190
Ala Ala Val Ala Ser Lys Pro Ala Ala Val Asp His Cys
195 200 205
<210> 5
<211> 223
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio4 Protein
<400> 5
Met Ser Ala Gly Ser Arg Ser Ser Arg Asn Ala Val Ala Ala Leu Arg
5 10 15
Val Val Pro Ala Ala Thr Ala Gly Val Pro Lys Gln Arg Pro Ala Glu
20 25 30
Pro Ala Gln Val Met Leu Thr Arg Val Gly Leu Arg Leu Pro Glu Arg
35 40 45
Met Ser Phe Glu His Trp Glu Arg Thr Gly Ala Gln Leu Ser Gly Ile
50 55 60
Val Asp Ser Ser Ser Trp Cys Leu Gly Asp Trp Leu Val Tyr Gly Lys
65 70 75 80
Glu Gln Tyr Ala Asp Arg Tyr Arg His Val Val Gln Ala Val Gly Leu
85 90 95
Asp Tyr Gln Thr Leu Arg Asn Tyr Ala Trp Val Ala Gly Arg Phe Pro
100 105 110
Leu Ala Arg Arg Arg Ser Gly Leu Ser Phe Gln His His Ala Glu Val
115 120 125
Ala Ala Met Ser Pro Asp Asp Gln Asp Arg Trp Leu Asp Glu Ala Glu
130 135 140
Thr Gln Met Trp Ser Val Lys Gln Leu Arg Ala Ala Ile Lys Ala Thr
145 150 155 160
Arg Ser Asp Arg Thr Thr Glu Thr Ile Lys Thr Ala Leu Met Pro Arg
165 170 175
Ile Pro Ile Pro Asp Arg Arg Leu Thr Arg Trp Arg Gln Ala Ala His
180 185 190
Gln Ser Ser Val Glu Leu Asp Gln Trp Ile Val Ser Thr Leu Asp Arg
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<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio5 Protein
<400> 6
Met Val Ser Thr Ser Leu Lys Pro Arg Leu Asp Ala Ala Ala Ala Gln
5 10 15
Gln Gln Thr Gly Leu Ser Trp Trp Leu Ser Asp Ala Trp Gln Met Ala
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Leu Arg Asn Leu Arg His Leu Thr Arg Ser Pro Glu Leu Val Met Phe
35 40 45
Ser Leu Val Gln Pro Val Met Phe Ile Leu Leu Phe Ala Tyr Val Phe
50 55 60
Gly Gly Ala Ile Asn Val Glu Gly Gly Asn Tyr Pro Gln Phe Leu Leu
65 70 75 80
Pro Gly Ile Leu Val Gln Met Val Leu Phe Gly Ser Val Ala Gly Thr
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Thr Ile Gly Ile Ser Thr Asp Met Asp Arg Gly Leu Met Asp Arg Phe
100 105 110
Arg Ser Met Pro Met Ser Arg Ser Ala Val Leu Val Gly Arg Thr Leu
115 120 125
Ser Glu Ile Leu Arg Asn Val Val Ser Met Leu Val Val Val Leu Met
130 135 140
Gly Leu Leu Ile Gly Phe Arg Phe Gln Gly Gly Val Leu Ser Ala Leu
145 150 155 160
Gly Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr Ala Leu Thr Trp Val
165 170 175
Gly Ala Met Ile Gly Leu Ser Val Pro Asn Pro Glu Ala Ala Gln Ser
180 185 190
Ala Gly Leu Ile Trp Ile Phe Pro Phe Ser Leu Ile Ser Ser Ala Phe
195 200 205
Val Pro Thr Glu Ser Met Pro Thr Trp Leu Arg Val Tyr Ala Asp Ala
210 215 220
Ser Pro Met Thr Ala Thr Val Asn Ala Leu Arg Asp Leu Phe Asn Gly
225 230 235 240
Asn Pro Pro Gly Leu Asp Val Leu Leu Thr Val Ala Trp Ser Val Leu
245 250 255
Leu Ile Thr Ile Phe Ala Pro Leu Ala Thr Arg Lys Tyr Ser Leu Arg
260 265 270
Ser Arg
<210> 7
<211> 328
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio6 Protein
<400> 7
Met Pro Ala Ala Ile Glu Val Ala Gly Leu Cys Lys Arg Phe Gly Ser
5 10 15
Val Thr Ala Leu Asp His Leu Glu Leu Thr Val Pro Glu Gly Lys Val
20 25 30
His Gly Leu Leu Gly Pro Asn Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Val Arg
35 40 45
Val Leu Thr Thr Leu Leu Arg Pro Asp Glu Gly Lys Ala Glu Ile Phe
50 55 60
Gly Phe Asp Val Arg Arg Asn Ala Leu Gln Val Arg Ser Ile Ile Gly
65 70 75 80
Leu Thr Gly Gln Tyr Thr Thr Val Asp Asp Met Leu Thr Gly Arg Glu
85 90 95
Asn Leu His Met Val Gly Lys Leu Phe Arg Met Ser Thr Pro Asp Ile
100 105 110
Lys Val Arg Ala Thr Glu Leu Leu Glu Arg Phe Asp Leu Thr Glu Ala
115 120 125
Ala Gly Arg Gln Ala Lys Thr Tyr Ser Gly Gly Met Arg Arg Arg Leu
130 135 140
Asp Ile Ala Ala Thr Leu Met Ser Arg Pro Gln Leu Ile Phe Leu Asp
145 150 155 160
Glu Pro Thr Ala Ala Leu Asp Pro Arg Ser Arg Met Asp Val Trp Arg
165 170 175
Ile Val Asn Glu Leu Val Glu Glu Gly Thr Thr Val Leu Leu Thr Thr
180 185 190
Gln Tyr Leu Glu Glu Ala Asp His Leu Ala Asp Ser Leu Ser Val Ile
195 200 205
Asp Ser Gly Lys Val Ile Ala Ser Gly Ala Pro Asp Glu Leu Lys Ala
210 215 220
Glu Val Gly Gln Ala Trp Ala Asp Val Thr Leu Ile Asp Ala Ala Ala
225 230 235 240
Val Glu Lys Thr Thr Gln Ile Leu Arg Glu Arg Leu Gly Thr Glu Pro
245 250 255
Val Gly Asp Pro Glu Gly Met Gln Val His Ala Pro Leu Pro Glu Gly
260 265 270
Met Thr Leu Asn Glu Leu Leu Asn Pro Leu Arg Asp Ser Gly Ile Ala
275 280 285
Ile Ala Asp Val Ala Val Arg Arg Pro Thr Leu Asp Asp Val Phe Leu
290 295 300
Ala Leu Thr Gly His Thr Ala Thr Ala Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn
305 310 315 320
Ser Lys Lys Lys Gly Gly Lys Arg
325
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<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio7 Protein
<400> 8
Met Tyr Phe Arg Pro Ala Asp Leu Ala His Glu His Gly Leu Ser Pro
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Gln Ser Val Arg Asn Tyr Glu Arg Asp Gly Leu Ile Pro Pro Ala Arg
20 25 30
Arg Thr Glu Ser Gly Tyr Arg Arg Tyr Thr Glu Lys His Ala Ala Ala
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Leu Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Ile Pro Ala His Gly Tyr Ala Glu Ser
50 55 60
Gly Ala Ile Met Arg Asp Ile Thr Ala Gly Arg Leu Asn Glu Ala Leu
65 70 75 80
Thr Thr Ile Asp Arg Ser His Ala Glu Leu Leu Arg Asp Arg Gly Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Val Ala Glu Val Leu Thr His Leu Thr Gly Arg Ser Thr
100 105 110
Gly Thr Trp Arg Ala Pro Lys Ser Ile Gln Pro Tyr Ser Ile Gly Glu
115 120 125
Leu Ala His Arg Leu Gly Val Asn Val Ala Thr Ile Arg Lys Trp Glu
130 135 140
Thr Ser Gly Val Leu Ala Pro Val Arg Arg Pro Glu Thr Gly His Arg
145 150 155 160
Met Tyr Asp Ala Ser Asp Val Arg Asp Ala Glu Leu Ala His Phe Leu
165 170 175
Arg Arg Gly Arg Tyr Pro Leu Glu Leu Ile Ala Thr Val Val Gln Gln
180 185 190
Val Arg Ala Ala Gly Asp Thr Gln Ala Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp
195 200 205
Trp Arg Gln Arg Val Thr Thr Arg Gly Leu Ala Met Leu Asn Ala Ala
210 215 220
Ala Gln Leu Ala Ser Tyr Leu Ala Met Glu Glu Asn
225 230 235
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<211> 242
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio8 Protein
<400> 9
Met Thr Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Tyr Leu Gln Val Asp Thr Leu Leu
5 10 15
Ser Leu Gln Glu Thr Arg Ala Pro Asp Thr Ala Ser Arg Ser Val Val
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Leu Ala Glu His Phe Phe Ile Val Thr His Gln Ala Cys Glu Leu Trp
35 40 45
Leu Lys Gln Val Thr Tyr Asp Leu Asp Ala Ala Ala Asp Ala Met Thr
50 55 60
Pro Pro Tyr Gly Pro Glu Asp Glu Glu Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gln
65 70 75 80
Arg Thr Ala Glu Leu Leu Arg Val Leu His Glu Gln Val Val Ala Leu
85 90 95
Glu Arg Leu Pro Leu Arg His Phe Ala Glu Phe Arg Pro Phe Leu Asp
100 105 110
Gly Ala Ser Gly Ala Gln Ser Ala Gln Phe Arg Leu Leu Ala Arg Leu
115 120 125
Leu Gly Gly Glu Arg Gln Glu Gly Arg Leu Tyr Arg Ala Phe Glu Arg
130 135 140
Leu Thr Glu His Asn Gly Ile Ser Val Ala Glu Val Cys Ala Arg Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Gly Val Leu Asn Arg Ile Ala Asp Ser Leu Leu Asp Val
165 170 175
Ala Asn Gly Tyr Trp Arg Trp Lys Met Thr His Leu Ala Leu Val Ser
180 185 190
Lys Met Val Gly Asn Arg Asn Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Val Asp
195 200 205
Tyr Leu Ala Arg Arg Ile Thr Leu Pro Phe Ala Gln Leu Arg Gln Leu
210 215 220
Arg Ala Gln Val His Asp Ala Leu Val Trp Glu Gln Pro Thr Ala His
225 230 235 240
Thr Gln
<210> 10
<211> 421
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio9 Protein
<400> 10
Met Pro Leu Pro Ser Pro Tyr Pro Asn Leu Leu Asp Gly Pro Ser Val
5 10 15
Ala Ser Thr Ile Pro Ser Ser Glu Leu His Arg Val Phe Arg Asp Ala
20 25 30
Gly Glu Arg Glu Arg Ile Ser Gly Val Pro Val Thr Lys Leu His Val
35 40 45
Gly Glu Pro Tyr Phe Thr Pro Pro Pro Glu Val Ala Gln Ala Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Val Thr Ala Gly Arg Thr Asp Tyr Thr Ala Val Glu Gly Leu
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Glu Arg Leu Val Glu Lys Leu Ala Asp Gln Asn Gly
85 90 95
Val Asp Thr Asp Val Ser Arg Leu Phe Val Thr Pro Gly Ser Cys Gln
100 105 110
Gly Leu Ala Ala Leu Met Gln Ala Val Ala Glu Pro Asp Ala Glu Ile
115 120 125
Leu Leu Pro Glu Leu His Trp Pro Ile His Leu Gln Gln Val Leu Leu
130 135 140
Ala Gly Leu Arg Pro Val Phe Tyr Pro Leu Gly Arg Asp Tyr Arg Thr
145 150 155 160
Asp Pro Glu Ser Val Leu Ala Ala Ser Thr Ala Asn Thr Arg Val Leu
165 170 175
Leu Ile Asn Ser Pro Ala Asn Pro Thr Gly Ala Val Leu Asp Thr Ala
180 185 190
Thr Leu Ser Thr Leu Ile Asp Met Ala Arg Ala Arg Gly Trp Gln Val
195 200 205
Ile Ser Asp Glu Ala Tyr Glu His Phe Val Phe Asp Asp Glu His Val
210 215 220
Ser Thr Ala Ser Leu Glu Trp Asp Val Pro Val Ser Glu Arg Ile Val
225 230 235 240
His Ser Ser Tyr Ser Phe Ser Lys Ser Leu Ala Met Thr Gly Tyr Arg
245 250 255
Leu Gly Tyr Val Ser Thr Ala Asn Asp Arg Thr Ala His Ala Phe Arg
260 265 270
Ile Val Gln Glu Ala Asn Leu Ile Ala Met Ser Thr Pro Val Gln Tyr
275 280 285
Ala Gly Leu Glu Ala Leu Arg Leu Gly His Val Val Arg Glu Asn Arg
290 295 300
Ala Met Val Leu Ser Asn Arg Asp Ala Val Leu Pro Ala Val Arg Asp
305 310 315 320
Ala Gly Leu Leu Pro Glu Leu Pro Ala Gly Gly Trp Tyr Ala Val Leu
325 330 335
Asp Val Ala Pro Thr Gly Leu Thr Ala Glu Glu Phe Ala Thr Gly Leu
340 345 350
Leu Glu Thr Arg Asn Val Ala Val Val Pro Gly Thr Gly Phe Ala Leu
355 360 365
Met Pro Arg Leu Asp Ala Arg Gly Arg Val Ile Thr Val Glu Pro Ala
370 375 380
Pro Trp Ser Arg His Leu Ile Arg Ile Ala Met Cys Val Ala Pro Ser
385 390 395 400
Val Leu Arg Ser Gly Val Arg Glu Leu Leu Glu Phe Ala Arg Glu Arg
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Pro Gly Thr Ala Arg
420
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<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio10 Protein
<400> 11
Val Ser Pro Thr Glu Ala Glu Ala Trp Pro Ala Val Ala Glu Arg Gly
5 10 15
Asp Gly Leu Ala Gly Arg Thr Val Ile Val Thr Gly Ala Gly Thr Gly
20 25 30
Leu Gly Arg Ala Ile Gly Glu Arg Leu Leu Ala Arg Asp Ala Asn Val
35 40 45
Val Ala Val Gly Arg Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu Thr Gly Asp
50 55 60
Gly Gly Gly Gln Val Ala Thr Val Ala Ala Asp Ile Thr Glu Pro Gly
65 70 75 80
Ala Ala Glu His Val Val Ala Ala Ala Thr Thr Arg Phe Gly Thr Val
85 90 95
His Gly Leu Val Asn Asn Ala Gly Leu Ala Arg Phe Ala Thr Leu Asp
100 105 110
Thr Ala Ser Asp Glu Asp Phe Asp Arg Leu Leu Ala Thr Asn Val Arg
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Leu Ile Arg Ala Ala Leu Pro His Leu Arg Glu His
130 135 140
Arg Gly Ala Val Val Asn Val Ser Ser Val Gly Ala Val Leu Ala Met
145 150 155 160
Pro Gly Arg Ser Phe Tyr Gly Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Leu
165 170 175
Thr Arg Ser Leu Ala Arg Glu Leu Ala Pro Asp Val Arg Val Asn Ala
180 185 190
Val Leu Pro Gly Pro Val Asp Thr Pro Met Trp Asp Asp Met Gly Leu
195 200 205
Asp Ser Val Lys Ser Ala Leu Leu Arg Ser Ser Leu Leu Ala Ala Thr
210 215 220
Pro Leu Gly Arg Phe Gly Gln Pro Ala Glu Ile Ala Gly Trp Val Cys
225 230 235 240
Gly Leu Leu Asp Pro Glu Phe Ser Gly Trp Ile Thr Gly Ala Leu Ile
245 250 255
Pro Val Asp Gly Gly Arg Thr Ser
260
<210> 12
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<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio11 Protein
<400> 12
Met Ser Ser Pro Thr Ala Ser Thr Ser Ala Leu Asp Leu Thr Asp Pro
5 10 15
Thr Thr Phe Val Arg His Asp Thr His Val Phe Trp Ala Glu Val Arg
20 25 30
Asp His Asn Pro Val Tyr Trp Tyr Gln Gly Arg Glu Asp Arg Pro Gly
35 40 45
Phe Trp Val Val Ser Arg Tyr Val Asp Val Val Ala Ser Tyr Thr Asp
50 55 60
Ala Ala Arg Leu Ser Ser Ala Arg Gly Thr Val Leu Asp Val Leu Leu
65 70 75 80
Arg Gly Glu Asp Ser Ala Gly Gly Arg Met Leu Ala Val Thr Asp Arg
85 90 95
Pro Arg His Arg Glu Leu Arg Asn Val Met Leu Arg Ala Phe Ser Pro
100 105 110
Arg Val Leu Gly Arg Val Val Glu Gln Val His Arg Arg Ala Asp Glu
115 120 125
Leu Ile Arg Arg Val Thr Gly Thr Gly Ala Phe Asp Phe Ala Thr Glu
130 135 140
Val Ala Glu Ser Ile Pro Met Gly Thr Ile Cys Asp Leu Leu Ser Ile
145 150 155 160
Pro Pro Ala Asp Arg Pro Asp Leu Leu Arg Trp Asn Lys Asn Ala Leu
165 170 175
Ser Ser Asp Glu Ala Asp Ala Asn Leu Tyr Ala Ala Leu Glu Ala Arg
180 185 190
Asn Gln Ile Leu Leu Tyr Phe Met Asp Leu Ala Glu Gln Arg Arg Ala
195 200 205
Ser Pro Gly Asp Asp Val Ile Ser Met Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly
210 215 220
Gly Glu Pro Leu Ser Ile Asp Asp Val Ala Leu Asn Cys Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Ile Leu Gly Gly Asp Glu Ser Ser Arg Met Ser Ala Ile Cys Ala Val
245 250 255
Lys Ala Phe Ala Asp Phe Pro Asp Gln Trp Arg Ala Val Arg Asp Gly
260 265 270
Asp Val Ala Ile Asp Thr Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Trp Ser Thr
275 280 285
Pro Ala Met His Phe Ala Arg Thr Ala Thr Thr Asp Phe Glu Leu Arg
290 295 300
Gly Gln Gln Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Thr Leu Trp Asn Leu Ser
305 310 315 320
Ala Asn Phe Asp Glu Arg Glu Phe Asp Arg Pro Tyr Arg Phe Glu Val
325 330 335
Gly Arg Thr Pro Asn Lys His Leu Ser Phe Gly His Gly Pro His Phe
340 345 350
Cys Leu Gly Ala Tyr Leu Gly Arg Ala Glu Leu Gln Ala Leu Leu Thr
355 360 365
Ala Leu Val Gly Thr Val Ser Arg Ile Glu Ser Ala Gly Ser Pro Arg
370 375 380
Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Asn Gly His Ser Ser Leu Pro Val Ala
385 390 395 400
Phe Thr Gly Arg
<210> 13
<211> 523
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio12 Protein
<400> 13
Val Pro Trp Pro Glu Glu Leu Ala Ala Leu Tyr Arg Arg Glu Gly Tyr
5 10 15
Trp Gln Gly Arg Pro Leu Gly Asp Leu Leu Thr Glu Ala Cys Ala Arg
20 25 30
His Ala Asp Lys Thr Ala Leu Val Cys Gly Glu Arg Arg Met Thr Tyr
35 40 45
Ala Glu Leu Ser Arg Ala Ser Ala Asp Val Ala Gly Gly Leu Leu Asp
50 55 60
Val Gly Ile Glu Pro Leu Asp Arg Val Val Val Gln Leu Pro Asn Val
65 70 75 80
Pro Glu Phe Val Val Val Val Tyr Ala Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile
85 90 95
Pro Val Met Ala Leu Pro Gly His Arg Lys Val Glu Leu Thr His Leu
100 105 110
Cys Ala His Ser Gln Ala Val Ala Leu Val Val Val Asp Gln Val Lys
115 120 125
Gly Phe Asp His Arg Ala Leu Ala Arg Glu Val Arg Ala Glu Val Pro
130 135 140
Ala Leu Lys His Val Val Val Ala Gly Asp Ala Glu Glu Phe Thr Ala
145 150 155 160
Leu Ala Asp Leu Tyr Arg Arg Gly Arg Asp Leu Pro Ala Val Asp Pro
165 170 175
Ser Glu Pro Ala Leu Phe Leu Leu Ser Gly Gly Thr Thr Gly Leu Pro
180 185 190
Lys Leu Ile Pro Arg Thr His Asp Asp Tyr Ala Tyr Asn Met Arg Ala
195 200 205
Thr Ala Asp Ala Leu Arg Phe Gly Ala Glu Asp Val Tyr Leu Ala Val
210 215 220
Asn Pro Ile Gly His Asn Ser Ala Leu Gly Cys Pro Gly Val Leu Gly
225 230 235 240
Ala Leu Leu Val Gly Gly Thr Ala Val Leu Thr Ser Ser Val Arg Pro
245 250 255
Asp Glu Val Phe Glu Leu Leu Glu Arg Glu Arg Val Thr Leu Thr Thr
260 265 270
Leu Val Pro Pro Val Val Arg Leu Trp Leu Asp Ala Ala Arg Lys Ser
275 280 285
Asp Val Arg Phe Pro Asn Leu Met Leu Gln Val Gly Ser Ser Lys Phe
290 295 300
Asp Pro Ala Arg Ala Ala Glu Val Arg Thr Ser Leu Gly Ala Val Leu
305 310 315 320
Thr Gln Trp Phe Gly Val Gly Glu Gly Leu Leu Thr Tyr Thr Arg Leu
325 330 335
Asp Asp Pro Glu Glu Val Val Leu Ala Thr Glu Gly Arg Pro Leu Ala
340 345 350
Ala His Asp Glu Ile Leu Val Val Asp Thr Asp Gly Arg Pro Val Pro
355 360 365
Asp Gly Ala Glu Gly Glu Leu Leu Val Arg Gly Pro Tyr Thr Ile Arg
370 375 380
Gly Tyr Tyr Arg Ala Glu Glu Gln Asn Arg Arg Ser Phe Thr Pro Asp
385 390 395 400
Gly Tyr Phe Arg Thr Gly Asp Met Val Arg Arg Arg Pro Asp Gly Ser
405 410 415
Ile Val Val Val Gly Arg Ile Lys Asp Ile Ile Asn Arg Gly Gly Glu
420 425 430
Lys Val Pro Ala Glu Glu Ile Glu Glu His Leu Leu Ala His Ala Ala
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Ile Arg Asp Ala Ala Val Val Gly Val Ala Asp Pro Val Leu Gly Glu
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Ala Val Lys Ser Phe Leu Arg Glu Arg Gly Leu Ala Thr Tyr Lys Ile
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435 440 445
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275 280 285
Arg Arg Gly Asp Ile Lys Gln Ala Cys Gly Leu Tyr Ser Asn Ala Leu
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Pro Leu Val Ile Glu Val Pro Ala Ala Gly Asp Phe Val Asp Leu Ala
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720 725 730
His Phe Val Ala Cys Pro Phe Gly Pro Ala Gly Thr Arg Met Tyr Arg
735 740 745
Thr Gly Asp Leu Ala Arg Trp Thr Asp Asp Gly Glu Leu Glu His Ala
750 755 760
Gly Ser Ala Asp Gln Arg Val Arg Ile Arg Gly Phe Trp Ala Ala Phe
765 770 775 780
Leu Glu Ile Glu Ala Val Leu Thr Ala His Pro Gly Val Asp Gln Ala
785 790 795
Ala Val Ile Ala Arg Pro Asp Gly Pro Asp Arg Ala Ala Gln Leu Ile
800 805 810
Ala Tyr Val Val Pro Ala Thr Gly Gly Arg Met Gly Ala Ala Gly Leu
815 820 825
Asp Val Asp Phe Ser Ala Gly Leu Asp Val Val Glu Leu Arg Arg Phe
830 835 840
Val Ala Ala Arg Leu Pro Glu His Leu Val Pro Ala Thr Ile Val Val
845 850 855 860
Leu Asp Arg Leu Pro Leu Thr Ala Glu Gly Lys Arg Asp His Ala Ala
865 870 875
Leu Pro Glu Pro Gln Ala Thr Arg Arg Ala His Arg Val Ala Arg Thr
880 885 890
Ala Glu Glu Arg Leu Leu Ala Asp Ala Phe Ala Glu Val Leu Gly Ala
895 900 905
Gly Arg Ile Gly Leu Asp Asp Asp Phe Phe Ala Leu Gly Gly Asp Ser
910 915 920
Ile Ser Ala Met Arg Val Val Ala Leu Ala Arg Ala Gly Gly Leu Ala
925 930 935 940
Leu Thr Ala Arg Thr Val Phe Glu Cys Arg Thr Val Ala Ala Leu Ala
945 950 955
Ala Val Ala Ala Pro Ala Asp Glu Pro Ala Val Ala Ala Ala Ala Glu
960 965 970
Gly Asp Gly Gly Arg Asp Asp Ala Gly Pro Ile Pro Leu Pro Pro Met
975 980 985
Ala Arg Leu Phe Ala Glu Arg Gly Pro Gly Leu Asp Arg Leu Ala Gln
990 995 1000
Trp Leu Val Leu Thr Leu Pro Ala Glu Met Ser Pro Asp Leu Leu Thr
1005 1110 1115 1120
Gly Ala Val Arg Ala Val Leu Asp Arg His Asp Val Leu Arg Ser Arg
1125 1130 1135
Leu Ala Asp Gly Gln Leu Leu Ile Gln Pro Pro Gly Ser Val Asp Val
1140 1145 1150
Asp Lys Leu Ile Arg Gln Val Pro Cys Ser Gly Asp Trp Ser Gly Pro
1155 1160 1665
Ser Trp Pro Ala Leu Leu Ala Asp Glu Ala Ala Lys Ala Val Gly Gln
1170 1175 1180
Leu Ser Ala Ser Ala Gly Gln Val Ile Arg Met Val Trp Phe Ala Pro
1185 1190 1195 1200
Pro Gly Gly Ala Pro Gly Arg Leu Leu Ile Ala Ala His His Leu Val
1205 1210 1215
Val Asp Gly Met Ser Trp Arg Val Leu Val Pro Asp Leu Ala Glu Ala
1220 1225 1230
Ala Ala Gln Ile Arg Ser Gly Arg Thr Pro Ala Leu Ala Pro Val Gly
1235 1240 1245
Thr Ser Leu Arg Ser Trp Leu Asp Glu Leu Ala Ala Glu Ala Val Arg
1250 1255 1260
Pro Glu Arg Val Ala Glu Leu Glu Leu Trp Arg Gly Ile Leu Ala Pro
1265 1270 1275 1280
Ser Gly Asp Pro Leu Gly Ala Arg Pro Leu Asp Pro Ala Val Asp Leu
1285 1290 1295
Thr Arg Thr Ala Gln Thr Leu Arg Val Glu Val Pro Ala Glu Leu Ser
1300 1305 1310
Arg Ala Leu Leu Thr Ser Val Pro Ala Thr Phe Arg Cys Gly Val Asp
1315 1320 1325
Asp Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Arg Arg His
1330 1335 1340
Asn Ser Ala Gly Val Val Arg Leu Glu Gly His Gly Arg Gln Glu Glu
1345 1350 1355 1360
Leu Val Pro Gly Thr Asp Leu Thr Arg Thr Val Gly Trp Phe Thr Thr
1365 1370 1375
Val His Pro Val Arg Phe Asp Leu Ser Gly Leu Asp Leu Thr Asp Ala
1380 1385 1390
Ile Asn Gly Gly Pro Ala Ala Ala Glu Ala Leu Arg Arg Val Lys Glu
1395 1400 1405
Ser Arg Arg Val Leu Pro Asp Arg Gly Ile Gly Tyr Ser Leu Leu Arg
1410 1415 1420
Tyr Leu Asn Gln Ala Thr Gly Ala Met Leu Arg Asp Leu Pro Ala Asp
1425 1430 1435 1440
Glu Val Gly Phe Asn Tyr Leu Gly Arg Phe Ser Phe Asp Arg Ser Arg
1445 1450 1455
Thr Gly Arg Glu Met Ala Trp Thr Ser Ala Pro Glu Ser Ala Ala Leu
1460 1465 1470
Val Ala Ala Pro Asp Pro Asp Met Pro Leu Ile Ser Ala Leu Glu Leu
1475 1480 1485
Asn Ser Leu Val Val Asp Thr Asp His Gly Glu Gln Leu Gln Ala Leu
1490 1495 1500
Phe Thr Phe Ala Thr Gly Val Leu Ala Thr Asp Glu Val Arg His Leu
1505 1510 1515 1520
Ala Asp Asp Trp Gln Ala Ala Leu Arg Gly Ile Arg Ala Gln Ala Ala
1525 1530 1535
Thr Gly Ala Ser Gly Leu Thr Pro Ser Asp Val Pro Leu Val Arg Val
1540 1545 1550
Arg Gln Gln Asp Leu Asp Asp Trp Gln Ser Arg Phe Gly Arg Val Asp
1555 1560 1565
Asp Val Trp Pro Leu Thr Pro Leu Gln His Gly Leu Leu Tyr His Ser
1570 1575 1580
Leu Leu Gly Asp Ser Ala Ala Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Phe Val Leu
1585 1590 1595 1600
Arg Ile Asn Gly Pro Val Asp Pro Ala Arg Leu Arg Gly Ala Ala Gln
1605 1610 1615
Thr Leu Leu Asn Arg His Pro Asn Leu Arg Val Ala Phe Leu Thr Lys
1620 1625 1630
Ser Thr Gly Glu Pro Val Gln Val Val Val Asp Gly Val Glu Val Pro
1635 1640 1645
Phe Ala His Val Asp Leu Ala Gly Gln Pro Gln Ala Glu Glu Arg Leu
1650 1655 1660
Ala Arg Ile Leu Ala Glu Glu Arg Glu Ala Gln Phe Arg His Asp Ser
1665 1670 1675 1680
Ala Pro Leu Leu Arg Phe Ser Leu Ile Thr Leu Thr Pro Thr Gln Ala
1685 1690 1695
Glu Leu Ala Leu Thr Ala His His Val Leu Phe Asp Gly Trp Ser Leu
1700 1705 1710
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1715 1720 1725
Ala Leu Glu Leu Val Glu His Gly Tyr Arg Glu Phe Leu Arg Trp His
1730 1735 1740
Ser Arg Gln Asn Ala Asp Glu Ala Leu Ala Ala Trp Thr Glu Glu Leu
1745 1750 1755 1760
Ala Asp Ala Thr Gln Pro Thr Leu Leu Ala Ser Gly Phe Ala Pro Ala
1765 1770 1775
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1780 1785 1790
Thr Arg Gln Glu Ala Ala Ser Ala Val Arg Arg Ala Ala Asp Cys Gly
1795 1800 1805
Ile Thr Pro Asn Val Leu Val Gln Gly Ala Trp Ala Val Val Leu Ala
1810 1815 1820
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1825 1830 1835 1840
Arg Pro Pro Glu Leu Pro Gly Ala His Thr Val Val Gly Met Phe Thr
1845 1850 1855
Asn Thr Val Pro Val Arg Val Arg Cys Ala Pro Ala Asp Ser Leu Glu
1860 1865 1870
Gly Met Leu Gln Ala Val Gln Asp Ala Gln Ala Arg Thr Leu Asp His
1875 1880 1885
Tyr His Val Gly Leu Gly Asp Ile Gln Arg Ala Thr Gly Leu Thr Thr
1890 1895 1900
Leu Phe Asp Thr Ile Val Ile Phe Glu Ser Phe Pro Val Asp Arg Ala
1905 1910 1915 1920
Ala Leu Ser Lys Ala Ser Ala Ser Ala Glu Leu Thr Val Thr Gly Ile
1925 1930 1935
Arg Pro Phe Ala Pro Thr His Tyr Pro Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala
1940 1945 1950
Asp Pro Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gln Tyr His Pro Asp Ala Leu Ala
1955 1960 1965
Pro Ser Thr Val Gln Ala Ile Ala Asp Arg Phe Ala Arg Val Leu Arg
1970 1975 1980
Gln Phe Ala Ala Asp Pro Arg Thr Arg Ile Ala Ala Ile Asp Val Leu
1985 1990 1995 2000
Ser Glu Ala Glu Arg Gln Leu Val Val His Asp Trp Asn Ala Thr Ala
2005 2010 2015
Leu Glu Val Pro Pro Glu Phe Val Pro Glu Gln Phe Ala Arg Gln Ala
2020 2025 2030
Ala Ala Thr Pro Asp Ala Val Ala Val Val Val Gly Glu Gln His Leu
2035 2040 2045
Thr Tyr Ala Glu Leu Ser Glu Arg Ala Asn Arg Met Ala His Trp Leu
2050 2055 2060
Ile Ala Gln Gly Ile Gly Ala Glu Ser Arg Val Val Val Leu Leu Pro
2065 2070 2075 2080
Arg Ser Ala Asp Leu Val Ala Ala Leu Leu Ala Val Trp Gln Ala Gly
2085 2090 2095
Gly Cys Tyr Val Pro Val Asp Pro Asp Tyr Pro Ala Ala Arg Val Arg
2100 2105 2110
Ser Val Ile Asp Asp Cys Ala Ala Thr Leu Val Leu Asp Glu Asn Leu
2115 2120 2125
Leu Asp Arg Thr Asp Leu Ser Arg Tyr Pro Ala His Ala Pro Ala Ile
2130 2135 2140
Ala Val Ala Pro Gly Gln Ala Ala Tyr Thr Ile Tyr Thr Ser Gly Ser
2145 2150 2155 2160
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2165 2170 2175
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2180 2185 2190
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2195 2200 2205
Phe Leu Pro Leu Thr Thr Gly Ala Arg Val Val Leu Ala Asn Arg Glu
2210 2215 2220
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2225 2230 2235 2240
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2245 2250 2255
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2275 2280 2285
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2325 2330 2335
Gly Val Gly Gly Asp Leu Trp Ile Ala Gly Asp Gly Leu Ala Arg Gly
2340 2345 2350
Tyr His Arg Gln Pro Gly Leu Thr Ala Ser Arg Phe Val Ala Asn Pro
2355 2360 2365
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2370 2375 2380
Trp Ser Glu Ser Gly Arg Ile Glu Phe Leu Gly Arg Ala Asp Phe Gln
2385 2390 2395 2400
Ile Lys Leu Arg Gly Phe Arg Ile Glu Pro Gly Asp Val Glu His Ala
2405 2410 2415
Leu Thr Arg His Pro Ala Val Arg Glu Ala Val Val Thr Ile Arg Glu
2420 2425 2430
Asp Gln Pro Asp Asp Lys Arg Leu Val Gly Tyr Val Val Val Ala Glu
2435 2440 2445
Asp Ala Glu Thr Pro Pro Thr Arg Glu Leu Gln Gln Phe Val Arg Glu
2450 2455 2460
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2465 2470 2475 2480
Ile Pro Leu Thr Ala Asn Gly Lys Leu Asp Arg Ser Arg Leu Pro Arg
2485 2490 2495
Pro Glu Ala Ser Ser Thr Lys Tyr Arg Ala Pro Glu Ser Ala Arg Glu
2500 2505 2510
Val Ala Leu Cys Gly Ile Phe Ala Glu Val Leu Gly Ala Glu Arg Val
2515 2520 2525
Gly Val Asp Asp Asp Phe Phe Ala Leu Gly Gly His Ser Leu Leu Ala
2530 2535 2540
Thr Arg Leu Ala Ala Arg Leu Arg Ser Asp Leu Gly Val Glu Val Pro
2545 2550 2555 2560
Ile Arg Thr Ile Phe Ala Ala Pro Thr Val Ala Glu Leu Ala Arg Arg
2565 2570 2575
Trp Ser Gly Leu Ser Thr Ser Val Arg Lys Pro Leu Arg Arg Met Thr
2580 2585 2590
Glu Arg
<210> 22
<211> 3140
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio21 Protein
<400> 22
Met Ala Pro Val Ser Tyr Ala Gln Gln Arg Met Trp Phe Ile Asn Arg
1 5 10 15
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20 25 30
Arg Gly Gln Ile Asp Arg Asp Glu Leu Arg Ala Ala Phe Met Asp Val
35 50 55
Leu Ser Arg His Glu Ile Leu Arg Thr Val Tyr Asp Glu Leu Asp Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Asp Trp Gly Trp Val Ser Pro Gln Gln Val Asp Ser Ile Val Ala
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ile His His Ile Ala Gly Asp Gly Gly Ser Leu Gly Pro Phe Thr Arg
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Leu Arg Tyr Trp Arg Gln Glu Leu Asp Gly Val Ser Arg Pro Val Ala
195 200 205
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210 215 220
Asn His Gly Phe Glu Ile Pro Ala Ala Leu Phe Glu Lys Val Glu Arg
225 230 235 240
Leu Ala Gln Ser Tyr Asn Val Thr Val Pro Met Val Phe Gln Thr Ala
245 250 255
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Gly Ser Pro Ile Ala Gly Arg Thr Asp Gln Ala Leu Glu Asn Leu Val
275 280 285
Gly Phe Phe Val Asn Thr Trp Val Leu Arg Val Gly Val Cys Thr Gly
290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
Gly Gly Thr Met Thr Tyr Arg Glu Leu Asn Arg Gln Ala Asn Arg Ile
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Leu Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Leu Pro Ile Gly Ser Thr Leu Pro Ser
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565 570 575
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580 585 590
Leu Asp Val Gly Arg Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Asp Gly Glu Ile
595 600 605
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610 615 620
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Pro Val His Asn Leu Leu Asn Trp Cys Tyr Arg Thr Phe Asp Phe Gly
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Val Phe Asp Ile Phe Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Gly Phe Tyr Ile
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785 790 795 800
Asn Ala Arg Tyr Tyr Val Leu Asp Glu Lys Leu Glu Pro Cys Ala Val
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Arg Asp Ser Val Gly Asp Leu Arg Leu Val Ser Tyr Val Leu Pro Asp
915 920 925
Leu Asp Thr Val Glu Ser Val Val Ala Ala Asp Glu Gln Val Arg Glu
930 935 940
Trp Gln Glu Ile Tyr Asp Gln Gly Tyr Leu Glu Val Thr Asp Gln Asp
945 950 955 960
Phe Gly Asp Asp Phe Asn Leu Trp Val Ser Ser Tyr Thr Gly Glu Pro
965 970 975
Ile Pro Val Gly Gln Met Arg Glu Trp Gln Asp Ala Ala Val Asp Arg
980 985 990
Ile Leu Ser Phe Thr Pro Arg Arg Val Leu Glu Val Gly Ala Gly Thr
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Gly Leu Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Ser Val Glu Ala Tyr Trp Ala
1010 1015 1020
Thr Asp Phe Ser Glu Pro Val Ile Glu Arg Leu Gly Arg Gln Val Thr
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1045 1050 1055
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1060 1065 1070
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1075 1080 1085
Gly Val Trp Ala Met Leu Glu Pro Gly Gly Arg Leu Val Leu Gly Asp
1090 1095 1100
Ile Arg Arg Ala Arg Ser Leu Arg Ala Phe Gln Val Ala Val Gln Gln
1105 1110 1115 1120
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1125 1130 1135
Gln Gly Leu Leu Leu Glu Lys Glu Leu Val Ile Asp Pro Glu Trp Phe
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1540 1545 1550
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1555 1560 1565
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1570 1575 1580
Phe Arg Val Gly Glu His Asp Ala Val Leu Leu Leu Pro Leu His His
1585 1590 1595 1600
Ile Ala Ala Asp Gly Trp Ser Leu Gly Pro Leu Ala Glu Asp Leu Thr
1605 1610 1615
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1620 1625 1630
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1635 1640 1645
Gly Gly Asp Asp Pro His Ser Leu Tyr Arg Arg Gln Leu Asp Tyr Trp
1650 1655 1660
Thr Gly Gln Leu Ala Gly Leu Pro Glu Ser Leu Gln Leu Pro Thr Asp
1665 1670 1675 1680
Arg Ala Arg Pro Ala Val Ala Ser Phe Ala Gly Glu Val Leu Pro Val
1685 1690 1695
Glu Leu Asp Glu Ser Leu Thr Glu Asp Leu Arg Lys Leu Ala Leu Arg
1700 1705 1710
Thr Gly Thr Thr Val Ser Met Val Leu Gln Ala Gly Leu Ala Gly Leu
1715 1720 1725
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1940 1945 1950
Leu Val Ala Ala Asp Gly Glu Glu Ser Trp Thr Tyr Gly Glu Leu Asp
1955 1960 1965
Arg Trp Ala Asn Arg Ile Ala His His Leu His Ala Arg Gly Val Gly
1970 1975 1980
Arg Gln His Arg Val Ala Leu Val Met Glu Arg Ser Pro Leu Leu Val
1985 1990 1995 2000
Ala Ala Val Leu Gly Thr Leu Lys Ala Gly Ala Cys Tyr Val Pro Val
2005 2010 2015
Glu Pro Thr Trp Pro Arg Ala Arg Ile Asp Leu Val Leu Ala Asp Leu
2020 2025 2030
Asp Pro Ala Leu Val Ile Asp Glu Arg Leu Ala Glu Glu Asp Leu Thr
2035 2040 2045
Gly Tyr Pro Thr Arg Pro Leu Asp Thr Ala Asp Val Gly Gly Glu His
2050 2055 2060
Leu Ala Tyr Leu Met Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys Gly
2065 2070 2075 2080
Val Glu Val Ser His Arg Asn Val Leu Ser Leu Ala Leu Asp Pro Cys
2085 2090 2095
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2100 2105 2110
Phe Asp Ala Ser Thr Tyr Glu Met Trp Val Pro Leu Leu His Gly Gly
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Ala Ala Val Val Ala Pro Pro Gly Lys Leu Asp Ala Ala Arg Leu Ala
2130 2135 2140
Thr Leu Ile Ala Glu Arg Gly Val Thr Ala Leu Trp Leu Pro Ala Gly
2145 2150 2155 2160
Leu Phe Asp Leu Ile Thr Gln His His Pro Lys Ser Phe Val Gln Val
2165 2170 2175
Arg Glu Val Trp Ala Gly Gly Asp Val Leu Ser Pro Ala Ala Val Arg
2180 2185 2190
Arg Leu Val Arg Asp Asp Gly Thr Leu Thr Val Val Asn Gly Tyr Gly
2195 2200 2205
Pro Thr Glu Thr Thr Thr Phe Ala Ala Arg Tyr Arg Met Ser Ala Pro
2210 2215 2220
Ala Arg Cys Lys Asp Pro Leu Pro Ile Gly Glu Pro Met Ala Gly Ser
2225 2230 2235 2240
Arg Leu Tyr Ala Leu Asp Asp Arg Leu Arg Gln Val Pro Gln Gly Val
2245 2250 2255
Ile Gly Glu Leu Tyr Val Gly Gly Asp Gly Val Ala Arg Gly Tyr Ala
2260 2265 2270
Asn His Pro Pro Leu Thr Ser Glu Arg Phe Val Ala Asp Pro Phe Gly
2275 2280 2285
Arg Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly Asp Leu Val Arg Trp Asn
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Ile Arg Gly Phe Arg Val Glu Pro Gly Glu Ile Arg Ala Ala Leu Arg
2325 2330 2335
Lys Arg Asp Gly Val Ala Gln Ala Val Val Val Pro Arg Thr Asp Arg
2340 2345 2350
Leu Gly Glu Arg Arg Leu Val Ala Tyr Val Val Pro Glu Val Pro Ala
2355 2360 2365
Gly Ala Asp Glu Asp Ser Thr Glu His Val Glu Lys Trp Arg Ala Ile
2370 2375 2380
Tyr Asp Ser Met Tyr Asp Glu Thr Glu Ala Asp Ala Thr Glu Ile Gly
2385 2390 2395 2400
Asn Asp Phe Thr Gly Trp Lys Ser Ser Tyr Thr Arg Asp Asn Ile Pro
2405 2410 2415
Leu Ser Glu Met Arg Arg Trp Arg Asp Ser Val Val Glu Glu Val Arg
2420 2425 2403
Gly Leu Arg Ala Arg Arg Ile Leu Glu Ile Gly Val Gly Ser Gly Leu
2435 2440 2445
Leu Leu Gly Pro Leu Ala Pro Glu Ala Glu Ala Tyr Trp Gly Thr Asp
2450 2455 2460
Phe Ser Leu Pro Val Ile Glu Arg Leu Glu Val Gln Val Gly Thr Asp
2465 2470 2475 2480
Pro Cys Leu Lys Glu Lys Val Ser Leu Arg Cys Gln His Ala Asp Val
2485 2490 2495
Ala Asp Gly Leu Pro Val Lys Tyr Phe Asp Thr Val Ile Leu Asn Ser
2500 2505 2510
Val Val Gln Tyr Phe Pro Asp Ala Ala Tyr Leu Ser Arg Val Leu Asp
2515 2520 2525
Val Ala Leu Asp Arg Leu Ala Pro Gly Gly Arg Ile Leu Val Gly Asp
2530 2535 2540
Val Arg Asn Tyr Gly Thr Leu Arg Glu Phe Leu Thr Ala Val His His
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Ala Gln His Pro Gln Asp Ser Ala Ser Ala Val Arg Ala Ala Val Glu
2565 2570 2575
Arg Ala Val Leu Ala Glu Lys Glu Leu Val Ile Asp Pro Asp Phe Phe
2580 2585 2590
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2595 2600 2605
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2645 2650 2655
Thr Ala Leu Ala Arg His Gly Gly Arg Leu Arg Leu Ala Arg Ile Pro
2660 2665 2670
Asn Ala Arg Leu Val Ser Glu Ala Val Gln Cys Gly Val Pro Thr Asn
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Pro Ala Ala Ala Arg Arg Val Ser Arg Leu Pro Ser Trp Leu Arg Glu
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Glu Leu Ala Ala Glu Leu Pro Glu His Leu Val Pro Gly Asp Ile Val
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Arg Leu Pro Glu Val Glu Gln Ala Asp Arg Glu Tyr Gly Ser Pro Arg
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2835 2840 2845
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Pro Phe Ser Val Val Leu Pro Ile Arg Thr Asp Gly Asp Arg Ala Pro
2900 2905 2910
Ile Trp Leu Val Pro Pro Gly Gly Gly Leu Ser Trp Ala Tyr Leu Gly
2915 2920 2925
Phe Ala Gln His Leu Asp Arg Ser Arg Pro Ile Tyr Gly Leu Gln Ala
2930 2935 2940
Arg Gly Phe Val Gly Asp Pro Arg Ala Thr Ser Ile Glu Ser Met Val
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Arg Glu Ala Met Ser Ala Ala
65 70
<210> 24
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<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio23 Protein
<400> 24
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1 5 10 15
Arg Val Arg Leu Arg Ala His Asp Phe Glu Leu Pro Arg Arg Arg Trp
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340 345 350
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485 490 495
Leu Leu Leu Arg Leu Arg Asp Lys Gly Asn Thr Val Leu Val Val Glu
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Val Val Glu Gly Gly Ala Gln Pro Pro Ile Ser Asn Asp Pro Val Glu
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Asp Trp Val Arg Pro Pro Val Ser Arg Asn Asp Leu Glu Ala Arg Val
50 55 60
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Leu Asn Arg Asn Ser Leu Asp Leu His Ile Met Arg Leu Arg Arg Arg
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Leu Leu Pro Ile Asp Leu Ala Ile Arg Thr Val Trp Gly Arg Gly Tyr
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Met Leu Ala Tyr Ala Ala Ser Ala Glu Ala Ile Ile Arg Asn Ala Ser
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Gly Met
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65 70 75 80
Arg Arg Leu Ala Glu Leu Glu Arg Ala Cys Asp Leu Leu Gly Val Ala
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Gly Ala Val Ala Met Thr
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<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> Tio27 Protein
<400> 28
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1 5 10 15
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Asp Arg Arg Ala Gly Val Leu Ala His Arg Phe Arg Ala Leu Gly Val
145 150 155 160
Gly Arg Asp Asp Ile Val Ala Leu Leu Leu Glu Arg Gly Phe Asp Leu
165 170 175
Ile Val Gly Met Val Ala Ala Gln Lys Ala Gly Gly Ala Phe Val Val
180 185 190
Met Asp Pro Gly His Pro Val Arg Arg Ile Glu Phe Ile Leu Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Ala Lys Ala Val Val Thr Arg Ser Ala Leu Ala Asp Arg Leu
210 215 220
Pro Glu Gly Ala Ala Ala Thr Pro Val Leu Val Asp Thr Glu Trp Asp
225 230 235 240
Glu Leu Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Leu Asp Glu Leu Ala
245 250 255
Asp Glu Asn Ser Leu Ala Tyr Val Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly
260 265 270
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275 280 285
Leu Trp Leu Gly Asn Ile Phe Asp Phe Gly Pro Gly Asp Arg Leu Leu
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Gln His Met Ala Pro Ile Phe Asp Phe Ala Glu Gly Glu Ile Phe Thr
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340 345 350
Tyr Ile Gly Gly Pro Pro Ala Ile Leu Gly Arg Ile Pro Pro Gly Ser
355 360 365
Tyr Pro Asp Leu Lys Tyr Met Ile Ala Gly Gly Glu Ala Val Thr Gly
370 375 380
Asp Leu Ile Asn Arg Trp Asn Thr Pro Gly Arg Arg Phe Ile Asn Gly
385 390 395 400
Tyr Gly Pro Thr Glu Ala Ala Val Gly Cys Ile Phe Tyr Glu Cys Glu
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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740 745 750
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755 760 765
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Pro Ser Met Pro Met Ala Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Val Thr Val
210 215 220
<210> 34
<211> 89
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF33 Protein
<400> 34
Met Thr Ser Ala Gly Ile Val Thr Ala Leu Ala Val Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Ala Leu Gly Arg Leu Val Leu Pro Gly Arg Pro Ala Ala Pro Leu
20 25 30
Trp Leu Thr Met Thr Ile Gly Ala Val Ala Ser Leu Leu Gly Ala Ile
35 40 45
Thr Ala Trp Leu Ala Gly Val Gln Gly Phe Ser Ile Leu Gly Leu Val
50 55 60
Val Gln Ala Gly Leu Ala Ala Val Ala Val Val Ile Val Val Ala Thr
65 70 75 80
Thr Gly Lys Glu Arg Ser Asp Ser Leu
85
<210> 35
<211> 168
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF34 Protein
<400> 35
Val Ala Ala Asn Pro Ala Gly Gln Gly Glu Ser His Ser Glu Thr Ala
1 5 10 15
Gly Glu Gly Ala Leu Ala Val Thr Ala Pro Arg Arg Pro Glu Cys Ser
20 25 30
Val Pro Leu Val Glu Val Ser Ile Thr Glu Phe Asp Leu Ser Cys Leu
35 40 45
Pro Glu Thr Gly Ala Val Leu Asp Gln Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly
50 55 60
Gln Val Val Ile Asp Leu Ala Gly Cys Arg His Ile Asp Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ile Gly Leu Leu Leu Asp Val His Arg Arg Met Val Arg Ala Gly Gly
85 90 95
Val Leu Ala Val Arg Asn Pro Asn Pro Arg Ile Thr Arg Ile Leu Gln
100 105 110
Thr Ala Arg Leu Asp Gln Ile Leu Pro Val His Thr Asp Ala Ala Ser
115 120 125
Ala Pro Val Thr Glu Ala Val Thr Ala Ala Pro Gly Val Pro Pro Ala
130 135 140
Asp Gly Thr Pro Ala Pro Gly Thr Val Pro Arg Ala Ala Ala Tyr Gly
145 150 155 160
Arg Ala Ala Val Thr Val Arg Thr
165
<210> 36
<211> 229
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF35 Protein
<400> 36
Met Thr Ala Val Leu Val Ile Glu Asp Asp Asp Arg Ile Arg Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Leu Glu Asp Glu Gly Tyr Glu Ala Arg Gly Ala Ala
20 25 30
Thr Ala Glu Glu Gly Leu Arg Thr Gln Arg Arg Asp Pro Ala Asp Tyr
35 40 45
Val Leu Val Asp Leu Met Leu Pro Gly Ile Asp Gly Phe Glu Gly Ile
50 55 60
Arg Gln Leu Arg Arg Asp Asp Asp Val Pro Ile Val Val Val Ser Ala
65 70 75 80
Arg Asp Asp Thr His Asp Ile Val Ala Ala Leu Glu Ala Gly Ala Asp
85 90 95
Asp Tyr Val Val Lys Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Thr Ala Arg Leu
100 105 110
Arg Ala Leu Arg Arg Arg Gly Arg Thr Thr Thr Ala Ser Asp Gly Pro
115 120 125
Gln Pro Val Pro Val Leu Ala Phe Gly Asp Leu Glu Val Ser Pro Glu
130 135 140
Ala Gly Glu Val Arg Arg Ala Gly Glu Pro Val Ala Val Thr Arg Thr
145 150 155 160
Glu Phe Arg Leu Leu Cys Glu Leu Ala Glu His Ala Gly Arg Val Leu
165 170 175
Ser Arg Gln Gln Leu Leu Ser Arg Val Trp Gly Tyr Asp Ser Gly Asp
180 185 190
Glu Arg Leu Val Asp Val His Val Gly Arg Leu Arg Gln Lys Ile Glu
195 200 205
Ala Asp Pro Ala Asn Pro Arg His Leu Val Thr Leu Arg Gly Leu Gly
210 215 220
Tyr Lys Leu Gln Arg
225
<210> 37
<211> 427
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF36 Protein
<400> 37
Met Ala Leu Val Ser Tyr Glu Leu Thr Arg Arg Thr Leu Leu Asp Glu
1 5 10 15
Arg Glu Arg Thr Val Leu Arg Ala Ala Tyr Tyr Asp Ala Ala Val Val
20 25 30
Arg Ala Gly Leu Asp Thr Asp Asn Pro Asp Val Ala Glu Ala Leu Arg
35 40 45
Ala Leu Asp Thr Gly Thr Gly Arg Arg Pro Leu Val Leu Leu Asp Gly
50 55 60
Glu Trp Tyr Ala Arg Ser Ala Asp Asn Gly Leu Thr Thr Ile Val Pro
65 70 75 80
Ala Arg Leu Gln Asp Leu Val Ala Ala Gly Glu Pro Ala Val Gln Arg
85 90 95
Val Arg Val Asn Asp Thr Pro Val Met Leu Val Gly Val Pro Leu Ser
100 105 110
Glu Ser Thr Ala Phe Tyr Glu Ile Ala Ser Leu Arg Glu Leu Glu Gln
115 120 125
Thr Phe Gln Val Leu Ala Leu Ala Leu Thr Ala Val Ala Ile Met Ile
130 135 140
Ala Gly Ser Gly Ala Ala Leu Gly Trp Tyr Ala Thr Arg His Gly Leu
145 150 155 160
Arg Pro Leu Thr Ala Val Ala Asp Ala Ala Glu Arg Ile Ala Ala Gly
165 170 175
Asp Phe Thr Thr Arg Leu Ala Pro Asp Thr Asp Pro Asp Leu Thr Arg
180 185 190
Leu Ser Thr Ser Phe Asn Arg Met Val Asp Glu Leu Ala Gly Arg Ile
195 200 205
Asp Arg Asp Arg Arg Phe Ala Ala Asp Val Ser His Glu Leu Arg Ser
210 215 220
Pro Leu Gln Thr Leu Ala Ala Ala Ala Ser Val Leu Ser Arg Arg Arg
225 230 235 240
Glu Asn Gln Asp Glu Arg Thr Ala Thr Ala Ala Arg Leu Val Ala Asp
245 250 255
Glu Ile Asp Arg Phe Gln Gln Leu Val Asn Asp Leu Leu Asp Leu Ala
260 265 270
Arg Gly Asp Gln Pro Val His Arg Glu Ser Val Asp Leu Pro Glu Leu
275 280 285
Ala Arg Gln Ala Cys Arg Asp Arg Asp Leu Pro Glu Ser Met Val Gln
290 295 300
Leu Ala Thr Gly Thr Pro Pro Gly Trp Arg Val Asp Arg Arg Arg Val
305 310 315 320
Ala Gln Val Leu Ala Asn Leu Leu Asp Asn Ala Glu Arg Tyr Gly Ala
325 330 335
Gly Pro Val Ala Val Arg Leu Ser His Asp Ala Asp Thr Gly Val Ile
340 345 350
Glu Val Asp Asp Glu Gly Pro Gly Val Pro Met Glu Asp Arg Glu Ala
355 360 365
Ile Phe Asp Arg Phe Val Arg Gly Arg Ala Ala Asn Tyr Arg Gly Gly
370 375 380
Gly Asp Gly Thr Gly Leu Gly Leu Ala Leu Val Ala Gln His Ala Ala
385 390 395 400
Ala His Gly Gly Asp Ala Ser Val Ser Asp Arg Pro Glu Gly Gly Ala
405 410 415
Arg Phe Arg Val Thr Leu Pro Gly Ser Leu Ser
420 425
<210> 38
<211> 178
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF37 Protein
<400> 38
Val Phe Ala Leu Leu Gly Ala Cys Gly Val Pro Ala Glu Asp Arg Pro
1 5 10 15
Arg Ala Val Thr Pro Pro Pro Val Pro Phe Pro Ala Thr Ala Ser Ala
20 25 30
Ala Pro Thr Ala Ala Glu Thr Gly Ala Val Thr Glu Val Leu Tyr Phe
35 40 45
Ala Arg Asp Glu Arg Leu Val Pro Val Ile Arg Arg Ala Asp Gln Val
50 55 60
Pro Ala Leu Asp Ala Gln Leu Arg Ala Leu Leu Ala Gly Pro Thr Pro
65 70 75 80
Thr Glu Arg Asp Asp Gly Leu Thr Ser Ala Leu Pro Gly Ala Phe Thr
85 90 95
Ser Ala Val Val Glu Leu Val Asp Gly Leu Ala Arg Val Thr Val Gly
100 105 110
Leu Thr Ala Val Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Arg Leu Ala Tyr Gly
115 120 125
Gln Ile Val Cys Thr Leu Thr Ala Arg Thr Asp Val Thr Ala Val Leu
130 135 140
Phe Leu Glu Gly Gly Thr Pro Leu Ser Val Pro Arg Ala Asp Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Pro Leu Thr Ala Ala Asp Tyr Ala Val Leu Ile Asn
165 170 175
Pro Arg
<210> 39
<211> 574
<212> PRT
<213> Micromonospora sp., ML1 strain
<220>
<223> ORF38 Protein
<400> 39
Val Asn Asp Arg Ala Glu Thr Leu Glu Phe Gln Ala Glu Ala Arg Gln
1 5 10 15
Leu Leu Arg Leu Met Val His Ser Ile Tyr Ser Asn Lys Asp Val Phe
20 25 30
Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Leu Arg
35 40 45
Leu Ala Ser Met Val Asp Lys Asp Leu Ala Val Asp Thr Gly Asp Leu
50 55 60
His Ile Ala Ile Glu Val Asp Arg Asp Ala Arg Thr Leu Thr Val Arg
65 70 75 80
Asp Asn Gly Ile Gly Met Ser Arg Asp Glu Val Val Ser Val Ile Gly
85 90 95
Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ala Glu Leu Leu Arg Gln Leu Arg Glu
100 105 110
Ala Lys Asp Ala Gly Ala Ser Gln Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly Val
115 120 125
Gly Phe Tyr Ala Ala Phe Met Val Ala Glu Arg Val Glu Leu Val Thr
130 135 140
Arg Arg Ala Gly Glu Thr Gly Gly Thr Arg Trp Glu Ser Thr Gly Glu
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Leu Asp Asp Ala Pro Gln Gly Thr Ala
165 170 175
Val Thr Leu His Leu Lys Pro Ala Asp Ala Glu Asp Asn Leu His Asp
180 185 190
Tyr Thr Ala Glu Trp Thr Ile Arg Gly Ile Val Lys Arg Tyr Ser Asp
195 200 205
Phe Ile Ala His Pro Ile Arg Met Thr Val Glu Arg Pro Gly Thr Asp
210 215 220
Asp Ala Pro Ala Thr Thr Glu Ala Val Thr Leu Asn Ser Met Lys Ala
225 230 235 240
Leu Trp Ala Arg Pro Arg Gly Glu Val Glu Pro Ala Glu Tyr His Glu
245 250 255
Phe Tyr Lys His Val Ser His Asp Trp Ala Asp Pro Leu Glu Thr Ile
260 265 270
His Met Arg Gly Glu Gly Thr Phe Glu Tyr Glu Ala Leu Leu Phe Ile
275 280 285
Pro Thr His Ala Pro Leu Asp Leu Phe Ser Pro Gln Gly Arg Arg Gly
290 295 300
Val Gln Leu Tyr Val Lys Arg Val Phe Ile Met Asp Asp Cys Asp Ala
305 310 315 320
Leu Met Pro Asn Tyr Leu Arg Phe Val Lys Gly Val Val Asp Ala His
325 330 335
Asp Leu Ser Leu Asn Ile Ser Arg Glu Ile Leu Gln Gln Asp Arg Gln
340 345 350
Ile Arg Ala Val Arg Arg Arg Leu Val Lys Lys Ile Leu Ala Thr Val
355 360 365
Lys Asp Leu Lys Thr Gly Gln Pro Glu Arg Tyr Arg Thr Phe Trp Thr
370 375 380
Glu Phe Gly Thr Val Val Lys Glu Gly Leu Leu Glu Asp Thr Asp Asn
385 390 395 400
Arg Asp Thr Leu Leu Glu Ile Leu Ser Val Ala Ser Thr Asn Asp Pro
405 410 415
Ala Glu Gln Thr Asp Leu Ala Gly Tyr Val Glu Arg Met Arg Glu Gly
420 425 430
Gln Gln Asp Ile Tyr Tyr Ala Thr Gly Glu Asn Arg Ser Thr Ile Glu
435 440 445
Asn Ser Pro His Ile Glu Ala Phe Arg Ala Lys Gly Tyr Glu Val Leu
450 455 460
Leu Leu Thr Asp Pro Val Asp Glu Val Trp Val Glu Arg Val Gly Ser
465 470 475 480
Tyr Ala Gly Lys Thr Leu Arg Ser Val Ala Lys Gly Gln Val Asp Leu
485 490 495
Asp Thr Glu Gln Glu Arg Thr Glu Ala Glu Ala Glu Arg Glu Arg Gln
500 505 510
Arg Thr Glu Tyr Ala Asp Leu Leu Gly Trp Met Gly Glu Val Leu Ala
515 520 525
Asp Asn Val Lys Glu Val Arg Leu Ser Ser Arg Leu Thr Thr Ser Pro
530 535 540
Ala Cys Val Val Gly Asp Ala His Asp Leu Thr Pro Thr Leu Glu Lys
545 550 555 560
Met Tyr Arg Ala Met Gly Gln Glu Val Pro Lys Val Lys Arg
565 570
Claims (26)
- 하나 이상의 생합성적 티오코랄린(thiocoraline) 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 모든 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 서열 식별 번호: 1 에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 가닥을 포함하는 핵산 분자.
- 제 3 항의 핵산 분자와 혼성화하며, 하나 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 5 항에 있어서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 분자:- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 2-535 (orf1) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 993-1130c (orf2) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 1517-2131 (tio3) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 2154-2822c (tio4)를 포함하는 핵산 분자 ;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 2970-3791c (tio5) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 3794-4777c (tio6) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 4904-5611 (tio7) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 5701-6426c (tio8) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 6426-7688c (tio9) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 7733-8524c (tio10) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 8791-10002 (tio11) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 10002-11590c (tio12) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 11847-13634 (tio13) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 13734-15005c (tio14) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 15005-16354c (tio15) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 16441-18744c (tio16) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 18774-19055c (tio17) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 19260-20036 (tio18) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 20146-20880c (tio19) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 21188-28969 (tio20) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 28979-38398 (tio21) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 38449-38661 (tio22) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 38642-41263 (tio23) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 41835-42368 (tio24) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 42395-43255c (tio25) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 43340-43741c (tio26) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 44152-49563 (tio27) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 49635-53669 (tio28) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 53749-55305c (orf29) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 55384-57222c (orf30) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 57895-58467c (orf31) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 58535-59206c (orf32) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 59298-59564c (orf33) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 59611-60114c (orf34) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 60202-60888 (orf35) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 60960-62240 (orf36) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 62300-62833 (orf37) 를 포함하는 핵산 분자;- 서열 식별 번호: 1 의 뉴클레오티드 62925-64650 (orf38) 를 포함하는 핵산 분자; 또는생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 이들의 절편.
- 제 1 항에 있어서, 2 개 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 7 항에 있어서, orf1, orf2, tio3, tio4, tio5, tio6, tio7, tio8, tio9, tio10, tio11, tio12, tio13, tio14, tio15, tio16, tio17, tio18, tio19, tio20 , tio21 , tio22 , tio23 , tio24 , tio25 , tio26 , tio27, tio28 , orf29 , orf30 , orf31, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38 로서 식별되는 유전자 및 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 이들의 절편으로부터 선택되는 2 개 이상의 유전자를 포함하는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 생합성적 티오코랄린 생산 경로 단백질 또는 그의 생물학적 활성 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체로서, 상기 단백질이 ORF1 (서열 식별 번호: 2), ORF2 (서열 식별 번호: 3), Tio3 (서열 식별 번호: 4), Tio4 (서열 식별 번호: 5), Tio5 (서열 식별 번호: 6), Tio6 (서열 식별 번호: 7), Tio7 (서열 식별 번호: 8), Tio8 (서열 식별 번호: 9), Tio9 (서열 식별 번호: 10), Tio10 (서열 식별 번호: 11), Tio11 (서열 식별 번호: 12), Tio12 (서열 식별 번호: 13), Tio13 (서열 식별 번호: 14), Tio14 (서열 식별 번호: 15), Tio15 (서열 식별 번호: 16), Tio16 (서열 식별 번호: 17), Tio17 (서열 식별 번호: 18), Tio18 (서열 식별 번호: 19), Tio19 (서열 식별 번호: 20), Tio20 (서열 식별 번호: 21), Tio21 (서열 식별 번호: 22), Tio22 (서열 식별 번호: 23), Tio23 (서열 식별 번호: 24), Tio24 (서열 식별 번호: 25), Tio25 (서열 식별 번호: 26), Tio26 (서열 식별 번호: 27), Tio27 (서열 식별 번호: 28), Tio28 (서열 식별 번호: 29), ORF29 (서열 식별 번호: 30), ORF30 (서열 식별 번호: 31), ORF31 (서열 식별 번호: 32), ORF32 (서열 식별 번호: 33), ORF33 (서열 식별 번호: 34), ORF34 (서열 식별 번호: 35), ORF35 (서열 식별 번호: 36), ORF36 (서열 식별 번호: 37), ORF37 (서열 식별 번호: 38), ORF38 (서열 식별 번호: 39) 로 식별되는 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, orf1, orf2, tio3, tio4, tio5, tio6, tio7, tio8, tio9, tio10, tio11, tio12, tio13, tio14, tio15, tio16, tio17, tio18, tio19, tio20 , tio21 , tio22 , tio23 , tio24, tio25 , tio26 , tio27 , tio28 , orf29 , orf30 , orf31, orf32, orf33, orf34, orf35, orf36, orf37, orf38 및 이들의 조합, 또는 이들의 상응하는 영역, 돌연변이체 또는 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 orf를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제 1 항에 있어서, 미크로모노스포라 종 (Micromonospora sp.) 으로부터 분리된 핵산 분자.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 그의 절편을 포함하는 프로브.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 12 항의 조성물을 포함하는 벡터.
- 본 발명의 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포.
- 제 15 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 바람직하게는 박테리아인 숙주 세포.
- 제 16 항에 있어서, 상기 박테리아가 그람-양성 (Gram-positive) 박테리아, 바람직하게는 방선균 (actinomycete) 또는 스트렙토마이세트 (streptomycete) 인 숙주 세포.
- 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질.
- 제 18 항에 있어서, ORF1 (서열 식별 번호: 2), ORF2 (서열 식별 번호: 3), Tio3 (서열 식별 번호: 4), Tio4 (서열 식별 번호: 5), Tio5 (서열 식별 번호: 6), Tio6 (서열 식별 번호: 7), Tio7 (서열 식별 번호: 8), Tio8 (서열 식별 번호: 9), Tio9 (서열 식별 번호: 10), Tio10 (서열 식별 번호: 11), Tio11 (서열 식별 번호: 12), Tio12 (서열 식별 번호: 13), Tio13 (서열 식별 번호: 14), Tio14 (서열 식별 번호: 15), Tio15 (서열 식별 번호: 16), Tio16 (서열 식별 번호: 17), Tio17 (서열 식별 번호: 18), Tio18 (서열 식별 번호: 19), Tio19 (서열 식별 번호: 20), Tio20 (서열 식별 번호: 21), Tio21 (서열 식별 번호: 22), Tio22 (서열 식별 번호: 23), Tio23 (서열 식별 번호: 24), Tio24 (서열 식별 번호: 25), Tio25 (서열 식별 번호: 26), Tio26 (서열 식별 번호: 27), Tio27 (서열 식별 번호: 28), Tio28 (서열 식별 번호: 29), ORF29 (서열 식별 번호: 30), ORF30 (서열 식별 번호: 31), ORF31 (서열 식별 번호: 32), ORF32 (서열 식별 번호: 33), ORF33 (서열 식별 번호: 34), ORF34 (서열 식별 번호: 35), ORF35 (서열 식별 번호: 36), ORF36 (서열 식별 번호: 37), ORF37 (서열 식별 번호: 38), ORF38 (서열 식별 번호: 39) 로 식 별되는 단백질 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질, 또는 그의 생물학적 활성 절편.
- 적합한 조건 하에서 티오코랄린-생산 유기체를 배양하는 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린의 생합성에 수반되는 하나 이상의 상기 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 제 18 항 또는 제 19 항의 티오코랄린 생합성에 수반되는 단백질을 제조하는 방법.
- 티오코랄린 화합물 생산에 적합한 조건 하에 티오코랄린-생산 유기체를 배양하여 티오코랄린의 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는 유전자의 카피수를 증가시키는 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린을 분리하는 단계를 포함하는, 티오코랄린의 제조 방법.
- 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이, 티오코랄린의 생합성에 수반되는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 조작 또는 치환으로 또는 상기 유전자의 발현 조절 이행능력이 있는 서열의 조작으로 조절되는 티오코랄린-생산 유기체를, 티오코랄린 화합물 생산에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린을 분리하는 단계를 포함하는 티오코랄린의 제조 방법.
- 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 티오코랄린-생산 유기체가 방선균, 바람직하게는 미크로모노스포라 종인 방법.
- 티오코랄린 화합물 제조에 적합한 조건 하에서, 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 원하는 경우 티오코랄린을 분리하는 단계를 포함하는 티오코랄린의 제조 방법.
- 제 24 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 방선균 또는 스트렙토세트인 방법.
- 하기 단계를 포함하며, 미크로모노스포라 종 ML1 유래의 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자를 이용하는, 또다른 방선균에서의 상기 티오코랄린 화합물의 제조 방법:(1) 티오코랄린 생합성 경로의 특이적인 유전자에 타격을 받은 돌연변이체를 수득하는 단계;(2) 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터를 포함하는 미크로모노스포라 종 ML1 염색체 영역을 분리하는 단계;(3) 티오코랄린의 생합성 이행능력이 있는 유전자 클러스터의 뉴클레오티드 서열을 수득하고 분석하는 단계; 및(4) 다른 방선균에서 티오코랄린을 이종적으로 생산하는 단계.
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