CN107540682B - 曲张链丝菌素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了曲张链丝菌素衍生物及其制备方法与应用,属于生物医药领域。该新型曲张链丝菌素衍生物1‑4是本发明以链霉菌XW‑1(Streptomyces spectabilis XW‑1,保藏编号为CCTCC NO:M2017417)作为出发菌株,分别对该菌株曲张链丝菌素生物合成基因簇中后修饰系统的P450基因(stvP4和stvP5)单一的失活或缺失。对这两个突变株发酵产物粗提物分离纯化,即得新型曲张链丝菌衍生物1‑4。本发明的新型曲张链丝菌素衍生物具有良好的抗菌效果,为抗生素耐药性问题提供了新的解决手段,为曲张链丝菌素类抗生素的结构改造提供了依据。
Description
技术领域
本发明涉及曲张链丝菌素制备领域,具体涉及新型曲张链丝菌素类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
二十世纪60年代以来,抗生素耐药性对公众健康逐渐构成严重威胁,可造成许多难以治疗的人类感染甚至死亡。特别地,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)现在被认为是导致人类重大疾病和死亡的“超级细菌”,由于其毒力大、分布广泛(如社区和医院环境),可造成巨大的经济损失。因此,迫切需要开发新的药物来对抗这些病原体。天然产物已被证明是发现抗MRSA抗生素(如万古霉素和达托霉素)的重要资源;另一方面,工程化生物合成可以补充这一传统的耗时耗力的药物发现过程,通过在生产菌株中对其生物合成途径的直接遗传修饰或通过在异源宿主中的实现组合生物合成,可以获得新颖的“非天然”的天然产物。这一类方法代表着创制药物分子多样性的有吸引力的方法。
曲张链丝菌素(Streptovaricins)与利福霉素同属较早发现的安莎霉素类抗生素,它们对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌,特别是结核分枝杆菌具有广泛的抗菌活性。从结构上看,曲张链丝菌素与其他安莎霉素抗生素的区别在于主要在于“安莎桥”不同程度的氧化,例如,C-20位和C-28位的羟基化,Me-24的氧化和C-21位的脱氢。特别地,C-6和C-11通过亚甲基双氧桥(Methylenedioxybridge,MDB)连接以形成特征性的“萘并二恶英”结构。基于已报道的安莎霉素一般的生物合成途径推测,曲张链丝菌素的生物合成由I型模块化聚酮化合物合成酶(Polyketide synthase,PKS)催化完成,其生物合成途径始于一个特殊的起始单元,3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxy benzoic acid,AHBA),随后经过多个聚酮链延长步骤,最终延伸链被酰胺合酶环化并从PKS上释放,并进一步进行PKS后修饰从而形成成熟的曲张链丝菌素类抗生素。
根据报道,曲张链丝菌素单体化合物之间的抑菌程度是不同的,且曲张链丝菌素生物合成目前仅通过用同位素喂养标记等实验证实其结构上的芳香发色团来自AHBA,且C-3位甲基、C-24位的羧甲基以及MDB结构单元中的亚甲基均来源于甲硫氨酸。然而迄今为止,曲张链丝菌素生物合成基因簇尚未见报道,其后修饰反应包括羟基化、甲基化、乙酰化和氧化还原等步骤仍不清楚;另一方面,基于化学合成或半合成、组合生物合成改造或代谢工程等方法创制具有新活性的曲张链丝菌素类衍生物尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于曲张链丝菌素(Streptovaricins)结构改造的新型曲张链丝菌素类衍生物及其制备方法和他们在制备抗菌药物中的应用。
曲张链丝菌素产生菌为从武汉大学校园土壤中分离纯化出的链霉菌XW-1(Streptomyces spectabilis XW-1),已于2017年7月7日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2017417。本发明通过操纵链霉菌XW-1曲张链丝菌素生物合成后修饰系统中的P450基因stvP4和stvP5,获得2个单基因敲除突变株。从这2个突变株的发酵液中分离到4个不完全修饰的曲张链丝菌素衍生物。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
第一方面,本发明涉及一种曲张链丝菌素衍生物,其结构式如式1-4中的任意一种所示:
第二方面,本发明涉及一种上述的曲张链丝菌素衍生物的制备方法,包括如下步骤:
A、以曲张链丝菌素原始产生菌链霉菌XW-1为出发菌(保藏编号为CCTCC NO:M2017417)克隆得到曲张链丝菌素生物合成基因簇,该基因簇中包含5个参与曲张链丝菌素生物合成后修饰过程中的P450基因,该5个P450基因由stvP1、stvP2、stvP3、stvP4、stvP5基因组成,分别位于SEQ ID NO:1的第13481-14773位碱基处、第15800-17005位碱基处、第18765-19958位碱基处、第83977-85221位碱基处及第87228-88481位碱基处;
B、对所述曲张链丝菌素生物合成后修饰系统的P450基因中的stvP4或stvP5基因进行选择性单基因失活,获得stvP4基因失活突变株ΔstvP4或stvP5基因失活突变株ΔstvP5;
C、对所述突变菌株ΔstvP4进行发酵,其发酵产物进行提取,经分离纯化,制得如上述式1和式2所示的曲张链丝菌素衍生物;
或对所述突变菌株ΔstvP5进行发酵,其发酵产物进行提取,经分离纯化,制得如上述式3和式4所示的曲张链丝菌素衍生物。
优选地,步骤B中,所述的选择性失活是同框敲除,以曲张链丝菌素野生型产生链霉菌XW-1(保藏编号为CCTCC NO:M2017417)的染色体DNA为模板,以stvP4-L-F和stvP4-L-R为引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示,在stvP4基因上游扩增出1990bp片段作为stvP4同框敲除同源左臂stvP4-L;以stvP4-R-F和stvP4-R-R为引物,其核苷酸序列如SEQID NO:4-5所示,在stvP4基因下游扩增出1989bp片段作为stvP4同框敲除同源右臂stvP4-R;
或以曲张链丝菌素野生型产生链霉菌XW-1(其保藏编号为CCTCC NO:M2017417)的染色体DNA为模板,以stvP5-L-F和stvP5-L-R为引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6-7所示,在stvP5基因上游扩增出2098bp片段作为stvP5同框敲除同源左臂stvP5-L;以stvP5-R-F和stvP5-R-R为引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:8-9所示,在stvP5基因下游扩增出1928bp片段作为stvP5同框敲除同源右臂stvP5-R。
优选地,步骤C中,所述对突变菌株ΔstvP4或ΔstvP5的发酵产物的提取具体为:发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,收集乙酸乙酯相;用旋转蒸发仪将乙酸乙酯相浓缩至干,随后用0.05倍的甲醇再次溶解,溶解物中即含有曲张链丝菌素衍生物。
优选地,步骤C中,所述对突变菌株ΔstvP4或ΔstvP5的发酵产物提取后的纯化具体为:将提取后的发酵产物溶于甲醇中后过有机系滤膜,过滤后取溶液,进样,通过HPLC制备各目标产物,色谱条件为:A相为水;B相为乙腈;流速3mL/min,洗脱程序为0-20min,35-65%B;20-28min,65-95%B;28-30min,95%B;目标化合物出峰时间为12~24min处,色谱柱为Agilent公司的ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱(5μm,9.4×250mm)。
第三方面,本发明涉及一种产生上述新型曲张链丝菌素衍生物1和2的工程菌株,为失活或缺失stvP4基因的曲张链丝菌素产生菌链霉菌XW-1(保藏编号为CCTCC NO:M2017417)。
第四方面,本发明涉及一种产生上述新型曲张链丝菌素衍生物3和4的工程菌株,为失活或缺失stvP5基因的曲张链丝菌素产生菌链霉菌XW-1(保藏编号为CCTCC NO:M2017417)。
第五方面,本发明涉及新型曲张链丝菌素衍生物1-4在制备抗菌药物中的应用。
优选地,所述细菌为耐药性细菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明具有的有益效果为:本发明从链霉菌XW-1(保藏编号为CCTCC NO:M2017417)的突变株中分离了4种新的曲张链丝菌素衍生物,丰富了曲张链丝菌素衍生物结构的多样性;且失活或缺失stvP4或stvP5基因的曲张链丝菌素产生菌能够较大量产生这些新结构化合物(一般发酵产量约5~20mg/L),本发明的新型曲张链丝菌素衍生物具有良好的抗菌效果,为抗生素耐药性问题提供了新的解决手段,为曲张链丝菌素类抗生素的结构改造提供了依据。
附图说明
图1是新型曲张链丝菌素衍生物1-4化学结构图。
图2是pWHU2801质粒图谱、突变株ΔstvP4的敲除模型和Southern blot分子杂交验证结果图
a为pWHU2801质粒图谱、突变株ΔstvP4的敲除模型;b为Southern blot分子杂交验证结果。
图3是pWHU2802质粒图谱、突变株ΔstvP5的敲除模型和Southern blot分子杂交验证结果图。
a为pWHU2802质粒图谱、突变株ΔstvP5的敲除模型;b为Southern blot分子杂交验证结果。
图4是各突变株发酵产物的HPLC-UV 432nm检测结果图。
图5是化合物1-4的LC-ESI-HRMS结构鉴定结果图。
图6是化合物1的NMR结构鉴定结果图
a为1H-NMR;b为13C-NMR;c为1H-1H COSY;d为HSQC;e为HMBC。图7是化合物2的NMR结构鉴定结果图
a为1H-NMR;b为13C-NMR;c为1H-1H COSY;d为HSQC;e为HMBC。图8是化合物3的NMR结构鉴定结果图
a为1H-NMR;b为13C-NMR;c为1H-1H COSY;d为HSQC;e为HMBC。图9是化合物4的NMR结构鉴定结果图
a为1H-NMR;b为13C-NMR;c为1H-1H COSY;d为HSQC;e为HMBC。
具体实施方式
在本申请人同日提交的发明专利申请《曲张链丝菌素生物合成基因簇及其应用》中公开了负责曲张链丝菌素生物合成的基因簇,整个基因簇是包含41个基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1中第1-95304位所示,在负责曲张链丝菌素生物合成后修饰的基因中包含5个P450基因,依次是stvP1、stvP2、stvP3、stvP4、stvP5,这5个基因分别位于SEQ ID NO:1的第13481-14773位碱基处、第15800-17005位碱基处、第18765-19958位碱基处、第83977-85221位碱基处及第87228-88481位碱基处。
本发明通过操纵链霉菌XW-1(保藏编号为CCTCC NO:M2017417)曲张链丝菌素生物合成后修饰系统中的P450基因(stvP4和stvP5),从而获得一系列不完全修饰的曲张链丝菌素衍生物。这些新型曲张链丝菌素衍生物包括:28-去羟基曲张链丝菌素F(1),6-甲氧基-8-羟基-24-羧甲基-原曲张链丝菌素I(2),24-去羧甲基曲张链丝菌素G(3)和24-去羧甲基曲张链丝菌素C(4),其结构式如图1所示。
一、实验材料
1.菌株、质粒及引物如表1-3所示。
表1实施例中所主要使用菌株
注:链霉菌XW-1(Streptomyces spectabilis XW-1)已于2017年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,其保藏编号为CCTCC NO:M2017417(地址:中国.武汉.武汉大学),其状态为存活。
表2实施例中所使用主要质粒
参考文献:
1.Wardenburg JB,Schneewind O.2008.Vaccine protection againstStaphylococcus aureus pneumonia.Journal of Experimental Medicine 205:287-294.
2.Sun Y,He X,Liang J,Zhou X,Deng Z.2009.Analysis of functions inplasmid pHZ1358influencing its genetic and structural stability inStreptomyces lividans 1326.Appl Microbiol Biotechnol 82:303-310.
上述参考文献2中详细记载了相应菌株或质粒的构建方法,本领域技术人员根据所记载的构建方法能够重复得到相应菌株或质粒。
表3实施例中所使用引物及其序列
2.培养基
(1)2×TY液体培养基:酵母提取物10g,胰蛋白胨16g,氯化钠5g,Milli-Q纯水1L,115℃高温灭菌30min。
(2)2×TY固体培养基:酵母提取物10g,胰蛋白胨16g,氯化钠5g,琼脂粉20g,Milli-Q纯水1L,115℃高温灭菌30min。
(3)ABB13固体培养基:可溶性淀粉5g,大豆蛋白胨5g,碳酸钙3g,3-(N-吗啉)丙磺酸2.1g,盐酸硫胺0.01g,氧化亚铁0.012g,琼脂粉20g,Milli-Q纯水1L,氢氧化钾调节pH值至7.0,115℃高温灭菌30min。用前按1%的体积比加入过滤除菌后的1M氯化镁溶液。
(4)TSBY液体培养基:以蛋白酶酶解大豆肉汤30g,酵母提取物5g,蔗糖105g,溶解于去离子水中定容到1L,115℃高温蒸汽灭菌30min。
(5)SFM液体培养基:称取黄豆饼粉(Soya flour)20g溶解于1000mL去离子水中,115℃高温蒸汽灭菌30分钟后(煮沸后再煮3h),4~8层纱布过滤除去不溶物。加入甘露醇(Mannitol)20g,充分溶解后,用去离子水定容到1000mL,再次115℃高温蒸汽灭菌30min。
3.抗生素及其浓度如表4所示。
表4抗生素及其使用浓度
二、实验方法
1.大肠杆菌与链霉菌XW-1的培养
大肠杆菌的培养采用2×TY培养基,220rpm 37℃培养。野生型XW-1及其突变株的培养采用SFM培养基,220rpm 28℃培养7d。
2.大肠杆菌-链霉菌属间接合转移
取在ABB13固体培养基上生长3-4d的链霉菌XW-1约1cm2菌块于15mL TSBY液体培养基中28℃220rpm培养2d至生长对数期作为接合转移受体菌。将在37℃220rpm过夜培养后以1:100(v/v)比例转接后培养2.5-3h至生长对数期的大肠杆菌ET12567/pUZ8002作为接合转移供体菌。将生长至对数期的供体菌与受体菌以分别5000rpm×5min离心去除上清后收集菌体,并以2×TY液体培养基分别洗涤菌体2次后,去除大部分上清,供体菌留存约1mL上清液,受体菌留存约5mL上清液,分别尽量吸取上部幼嫩菌体100μL后混合,再涂布于含有1%氯化镁的ABB13平板上,吹干后倒置于28℃恒温培养箱中培养12h。再取1mL含阿泊拉霉素和萘啶酮酸的无菌水均匀地覆盖培养基表面,使平板上的抗生素终浓度达到阿泊拉霉素35μg/mL,奈啶酮酸30μg/mL,待培养基表面液体被吹干后将平板后封口,倒置于28℃恒温培养箱中培养。一般约6-7d后可见明显接合转移子。
3.链霉菌XW-1的发酵与发酵产物的提取与分离
(1)链霉菌XW-1的发酵培养:
取在ABB13固体培养基上培养3-4d的链霉菌约1cm2菌块接种于40mL TSBY液体培养基中,28℃200rpm培养3d,作为种子培养基。将种子培养基以1:20的比例转接至60mL发酵培养基中,28℃200rpm培养7d。
(2)链霉菌XW-1发酵产物的提取与分离:
发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,收集乙酸乙酯相;用旋转蒸发仪将乙酸乙酯相浓缩至干,随后用0.05倍的甲醇再次溶解,溶解物中即含有曲张链丝菌素衍生物。
4.曲张链丝菌素衍生物的纯化与制备
HPLC从发酵液提取产物中纯化曲张链丝菌素衍生物
将提取后的发酵产物溶于甲醇中后过有机系滤膜,过滤后取溶液进样,色谱条件为:A相为水;B相为乙腈;流速3mL/min,洗脱程序为0-20min,35-65%B;20-28min,65-95%B;28-30min,95%B。目标化合物出峰时间为12~24min处。色谱柱为Agilent公司的ZORBAXEclipse XDB-C18反相柱(5μm,9.4×250mm)。
5.曲张链丝菌素衍生物的LC-ESI-HRMS检测
将提取后的发酵产物溶于甲醇中后过有机系滤膜,过滤后取溶液进样,色谱条件为:A相为水;B相为乙腈;流速1mL/min,洗脱程序为0-20min,35-65%B;20-28min,65-95%B;28-30min,95%B;30-33min,95-35%B;33-38min,35%B。色谱柱为Dikma公司DiamonsilC18反相柱(5μm,4.6×250mm)。洗脱后的液体进过1:1分流后接入ESI-HRMS检测器,ESI选用正离子模式。经过优化后的离子源条件是:喷雾电压3.5kv,毛细管温度275℃,鞘气流速50L/h,辅助气流速10L/h,离子源温度为275℃,扫描范围m/z 300-1000,样品进样量为10μL。
6.生物学活性——最小抑菌浓度值(Minimal inhibitory concentration,MIC)的测定
本方法参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)的需氧菌的稀释法抗菌药物敏感性试验,批准标准-第九版(Methods forDilution Antimicrobial Susceptibility Test for Bacteria That GrowAerobiacally,Approved Standard-Ninth Edition)中微量肉汤稀释法。
(1)抗菌药物原液的配置:
取常用测定浓度上限10倍数值为抗菌原液浓度,即1280mg/L。原液配置好后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后,小量分装备用,剩余原液-20℃保存。
(2)测试菌的接种:
培养基的配置:菌株活化培养基选用哥伦比亚血平板。抑菌试验选取MH肉汤。
测试菌液的准备:将测试菌以平板划线法在哥伦比亚血平板上进行活化,37℃培养观察16-18h待单克隆菌株生长后,挑取几个单一菌落直接悬浮与MH培养基中至0.5麦氏比浊标准,再用肉汤以1:100稀释(含菌量约106CFU/mL)备用。比浊标准:0.048mol/L氯化钡0.5mL加0.18mol/L硫酸溶液99.5mL,混匀后用530nm波长调整期浊度,使吸收值为0.1,该浊度为0.5麦氏比浊标准,相当于5×(107-108CFU/mL)。
抗菌药物的稀释:将抗菌药物用MH肉汤以二倍稀释法将第2至第12个孔稀释成下列浓度:256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L,稀释方法见表5。
表5抗菌药物的稀释方法
测试菌的接种:取稀释好的测试菌液依次由抗菌药物低浓度至高浓度从第1至第11个孔中每孔接种100μL,则每孔最终接种菌量约为5×105CFU/mL,每排药物最终浓度为128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0mg/L物与菌液混匀后,加盖并用封口膜密封后置于37℃培养观察18-20h,操作步骤如表5。
(3)结果判断:
在黑色背景光源下观察肉汤出现浑浊,孔底出现沉淀为标准判断测试菌是否生长,无测试菌生长的所含最低抗菌药物浓度即为MIC值。为使结果更快速清晰,可在每孔中加入5g/L氯化三苯四氮唑(TTC)5μL,35℃孵育1-3h后呈红色的为有测试菌生长。
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
【实施例1】产生新型曲张链丝菌素衍生物(1和2)工程菌株的构建
产生新型曲张链丝菌素衍生物工程菌株为失活或缺失stvP4基因的曲张链丝菌素产生菌。
(1)stvP4同框敲除重组质粒pWHU2801(图2a)
1)以曲张链丝菌素野生型产生菌链霉菌XW-1(保藏标号为CCTCC NO:M2017417)的染色体DNA为模板,以stvP4-L-F和stvP4-L-R为引物,在stvP4基因上游扩增出1990bp片段作为stvP4同框敲除同源左臂stvP4-L。以stvP4-R-F和stvP4-R-R为引物,在stvP4基因下游扩增出1989bp片段作为stvP4同框敲除同源右臂stvP4-R。
2)将同源左臂stvP4-L直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP4-L,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点NdeI与PstI将其酶切回收。同样,将同源臂右臂stvP4-R直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP4-R,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点HindIII与PstI将其酶切回收。
3)将上述回收的两个片段同经过NdeI与HindIII酶切回收的载体pYH7进行三片段酶连,经过酶切验证后得到正确的重组质粒pWHU2801,用于基因stvP4的同框敲除。
(2)stvP4同框敲除菌株ΔstvP4的构建
将stvP4同框敲除重组质粒pWHU2801转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002,以阿泊拉霉素、卡那霉素及氯霉素作为抗性筛选标记进行筛选,将筛选到的经质粒提取及酶切验证正确的转化子ET12567/pUZ8002+pWHU2801作为接合转移供体菌,以曲张链丝菌素野生型产生菌XW-1作为接合转移受体菌,按照上述接合转移方法将pWHU2801导入其中。再利用阿泊拉霉素为筛选标记,筛选到具有阿泊拉霉素抗性的接合转移子后将其进行松弛培养(松弛培养:在含有1%MgCl2的培养平板上划单克隆培养),将松弛培养获得的单克隆经在含有阿泊拉霉素和非抗平板上进行影印培养,筛选到对阿泊拉霉素敏感的菌株,这些菌株为可能的双交换突变株或野生型菌株。利用验证引物CK-stvP4-F和CK-stvP4-R,以其基因组DNA为模板进行PCR筛选和验证,理论阳性扩增条带为1001bp。经PCR筛选和验证正确的菌株为双交换突变株即stvP4同框敲除菌株ΔstvP4,进一步通过Southern blot分子杂交证实突变株ΔstvP4构建成功(图2b)。
将突变株ΔstvP4与野生型XW-1对照组一起进行发酵,并对其发酵产物进行HPLC-UV分析检测,结果如图4所示。结果显示突变株ΔstvP4产生了新型曲张链丝菌素衍生物1和2,而对照组野生型XW-1不能被检测到这些新化合物。
【实施例2】产生新型曲张链丝菌素衍生物(3和4)工程菌株的构建
产生新型曲张链丝菌素衍生物工程菌株为失活或缺失stvP5基因的曲张链丝菌素产生菌。
(1)stvP5同框敲除重组质粒pWHU2802(图3a)
1)以曲张链丝菌素野生型产生菌链霉菌XW-1(保藏编号为CCTCC M2017417)的染色体DNA为模板,以stvP5-L-F和stvP5-L-R为引物,在stvP5基因上游扩增出2098bp片段作为stvP5同框敲除同源左臂stvP5-L。以stvP5-R-F和stvP5-R-R为引物,在stvP5基因下游扩增出1928bp片段作为stvP5同框敲除同源右臂stvP5-R。
2)将同源左臂stvP5-L直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP5-L,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点NdeI与PstI将其酶切回收。同样,将同源臂右臂stvP5-R直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP5-R,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点HindIII与PstI将其酶切回收。
3)将上述回收的两个片段同经过NdeI与HindIII酶切回收的载体pYH7进行三片段酶连,经过酶切验证后得到正确的重组质粒pWHU2802,用于基因stvP5的同框敲除。(图3a)。
(2)stvP5同框敲除菌株ΔstvP5的构建
将stvP5同框敲除重组质粒pWHU2802转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002,以阿泊拉霉素、卡那霉素及氯霉素作为抗性筛选标记进行筛选,将筛选到的经质粒提取及酶切验证正确的转化子ET12567/pUZ8002+pWHU2802作为接合转移供体菌,以曲张链丝菌素野生型产生菌XW-1作为接合转移受体菌,按照上述接合转移方法将pWHU2802导入其中。再利用阿泊拉霉素为筛选标记,筛选到具有阿泊拉霉素抗性的接合转移子后将其进行松弛培养(松弛培养:在含有1%MgCl2的培养平板上划单克隆培养),将松弛培养获得的单克隆经在含有阿泊拉霉素和非抗平板上进行影印培养,筛选到对阿泊拉霉素敏感的菌株,这些菌株为可能的双交换突变株或野生型菌株。利用验证引物CK-stvP5-F和CK-stvP5-R,以其基因组DNA为模板进行PCR筛选和验证,理论阳性扩增条带为1006bp。经PCR筛选和验证正确的菌株为双交换突变株即stvP5同框敲除菌株ΔstvP5,进一步通过Southern blot分子杂交证实突变株ΔstvP5构建成功(图3b)。
将突变株ΔstvP4与野生型XW-1对照组一起进行发酵,并对其发酵产物进行HPLC-UV分析检测,结果如图4所示。结果显示突变株ΔstvP5产生了新型曲张链丝菌素衍生物3和4,而对照组野生型XW-1不能被检测到这些新化合物。
【实施例3】菌株发酵产物的HPLC-UV分析
将上述构建的各高产菌株及对照组野生型XW-1一起进行50mL小规模平行发酵与产物提取,并对其发酵产物进行HPLC-UV检测,对各突变株中曲张链丝菌素系列产物的离子峰进行了抽提,结果如图4所示。
突变株ΔstvP4按预期积累了曲张链丝菌素D,其产量相较于野生型XW-1提高了约100倍,同时突变株ΔstvP4积累了两个明显的曲张链丝菌素生物合成中间体或旁路代谢产物(1和2);突变株ΔstvP5仍然能够产生原曲张链丝菌素I,且同时积累了两个明显的曲张链丝菌素生物合成中间体或旁路代谢产物(3和4)(图4)。
【实施例4】新型曲张链丝菌素(化合物1-4)的制备与生物学活性测定
(1)突变株的大量发酵与产物粗提取
将突变株ΔstvP4或ΔstvP5按如下方法进行大量发酵与产物粗提取:
将在50mL×4TSBY培养基中28℃培养2d的种子发酵培养基以1:10(v/v)的比例转接至250mL×8的SFM高产培养基中28℃发酵7d。将发酵完成的发酵液以等体积的乙酸乙酯萃取3遍,保留乙酸乙酯相。将乙酸乙酯相分离出来后经过旋转蒸发仪浓缩至干,然后重新用色谱级的甲醇溶解至10mL得到发酵提取浓缩液。
通过HPLC从发酵浓缩液中制备各目标产物,将这些产物进行了LC-ESI-HRMS及1H、13C、1H-1H COSY、HSQC和HMBC核磁共振分析检测(图5-图9),经结构鉴定,上述各组分产物结构均与图1中结构相符,其LC-ESI-HRMS如图5所示,1H、13C NMR检测波谱数据见表6。
表6化合物1-4的1H和13C NMR波谱数据(600M,D2O,ppm)
(2)生物活性测定
选取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213、ATCC25904、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC43300、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离菌株USA300 LAC和USA400MW2作为测试对象,对新型曲张链丝菌素(化合物1-4),以万古霉素作为阳性对照进行最小抑菌浓度(MIC)测试,测试结果如表7所示。
表7微量肉汤稀释法MIC值测试结果
表中所述化合物2,3和4对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 43300,以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床分离菌株USA300LAC和USA 400 MW2均表现出较强的抑制活性,其最小抑菌浓度(MIC)值可低至2μg/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 曲张链丝菌素衍生物及其制备方法和应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 95304
<212> DNA
<213> Streptomyces spectabilis
<400> 1
gtcaccaacg gcgcccgcct ggagacgtac accatcgagg gcgagcgcgg cagcggcgtc 60
atcgggatca acggcgcggc cgcgcacctc gtgcaccccg gcgataaggt gatcgtcatc 120
agctacgccc aggtcgacga cgccgaggcc cgcaccctgc ggccgcgggt cgtgcacgtc 180
gacgagggca accgcgtcgt ggccctcggt gacgacgccg ccgcaccggt gccgggcgcc 240
gccgacatgg cgcgctcccc gcaggcggcg gcgcgcgcct agcggcacca cgcgacagcg 300
gcacggccat acggcgcccg gccggggcgc ggcgaggagc ggcgacgatg agtgacaccg 360
cggcggccgg gcggccgttc ggcatccggg acgacagggc gcgcggcgtc ctgctcgccg 420
aggaggacgg gcagaccgtc ggccggatcg tctacttcac cctggccgcg ccggagcccg 480
ccctcgtgcc cgtgcacacc gaggtgccgc ccgcccacga gggccgcggc atcgcgagcg 540
ccctggccac ggagctgtac gcgctcgcgg cccgcgagga ccgcgcggtc gtgccgctgt 600
gcccgtacgt cgccaagtgg gcggagcgcc accaggtccc ggcgccctcc gccgcgctcg 660
tcgaggccgc gctcgccaag gtcgaggacg acccgtcgac gtggtgaccc tcgcgctcct 720
gcacacctcg cccgtccacg tgccggtctt cgacgcgctc cgggaccagg accagccggg 780
cctggcactg tgccacctcg tgcacgaggg gctgctcgac cgcgcccgcg acgaagggcc 840
cgacgccgtc gcggacgagc tcgggcagat cctggaacgg gccgtggccg acggcgcggg 900
cgccgtgctg tgcacctgct cgacgatcgg cggcgtcgcc gaggcccgcg ccgccgcgct 960
cggcgtgccc gtgctgcgcg tcgaccggcc catggcggcc gccgccgtca ccgagggccc 1020
ggcggtcacg gtcctcgcca cggtcaccag caccctcgcg cccaccgccg ccctcctggc 1080
ggaggaggcc gagcgggccg ggcgcaggat cgacgtgcgc accgtcgtgg tggacggcgc 1140
gtgggagcgc ttcgaggcgg gggaccggga cgggtatctg cggctgatcg ccgccgccgt 1200
cgagcgggcc gacgccgacg gcgccgatgc cgtcgtgctc gcccaggcct cgatggcgga 1260
cgccgccgcc cgctgtgccg tgcgggtgcc ggtcctcgcg agcccgcgca cgggtctgcg 1320
cgccgccgcc ctgtgcgtgc cgcgcggctc ctagcgcgcc gcgcgccccg tcgggaggag 1380
tggactcggc gcgcgtgggc acgcgagccg ggagagagtg ggggacggcg gcctccgcgg 1440
cgccgcgcgc ggccgtcccg ccggaaggtg ccggccgcct ccacccaccc ctgggaggaa 1500
gcatgaccaa cccgttcccc gaccccgtcc agcccggccc cactccgggc ccccgcccgg 1560
agccgccgcc ggggcccccg ccaggaccgg ggcccgcccc gggcccggtg cccgtgccgc 1620
agcccccgcc gtccccggtg cccaagccgc cgggcccgga ccccgtaccg gatccggacc 1680
cgacgcccga gccgatgagc taggcccgct ccgcgcgagg gctacgcctc gacctccgag 1740
cggtcgccgc cccacagcgt gtggaacgaa ccctcgcggt ccgtacggcg gtaggtgtgc 1800
gcgccgaagt agtcccgctg cccctgcgtg agcgcggcgg gcagccgctc cgcgcgcagc 1860
gcgtcgtagt aggcgagggc cgcggcgaag cccggcgcgg gcacgccctg ctgggtcgcg 1920
gcgacgagca cggcgcgcca gtcgtcctgc gccgcgccga tctcgcgcgc gaagccctcg 1980
tcggcgagga ggctcggcag gtcggcgcgc gcgtcgtacg cggcgcggat gcggtcgagg 2040
aacgccgccc ggatgatgca gccgccgcgc cagatcgagg cgaccgcgcc caggtcgatg 2100
tcccagccgt actccgcgct gcccgccgcg atctcgtgga agccctgcgt gtacgacacg 2160
atcttcgagg cgtacagcgc ctgctcgacg cggtcggcga aggccgccgc cgcctccttg 2220
gacagcggtt ccgcgaccgg gcccgccagg tcgcgcgagg cggcgcgcag ctccgtgtgc 2280
cccgagacgg aacgggcgaa caccgcctcc gcgatgcccg acaccggcac gcccaggtca 2340
agggcgatct gcacggtcca gcggccggtg cccttctgct cggcccggtc cgccacgacg 2400
tccacgaacg gcttgccggt cgcggcgtcc acgtgcgcca ggacctcggc ggtgatctcg 2460
atcagatagg agtcgagccg cccccggttc caggtgcgga agatgtcggc gatctcggcg 2520
ggggagtagc ccgccacctc gcggagcagc tggtacgcct cggcgatcag ctgcatgtcc 2580
gcgtactcga tgccgttgtg caccatcttc acgaagtggc ccgcgccgtc cgggccgatg 2640
tgcgccgtgc aggggctgcc gtcggcggcc ttcgcggaga tcttctccag catcggaccg 2700
agcgccgcgt acgactccgc ggagccgccg ggcatgatgc tcgggccgtt gagcgcgccc 2760
tcctcgccgc cggagacgcc ggtgccgacg aagtggatgc cgagctcgcg cagttcgcgc 2820
tcgcggcgcc gggtgtccgc gaagtgcgcg ttgccgccgt ccacgatcat gtcgcccggt 2880
tcgaggagcg gtgcgaactc cttgatgacg gcgtccgtcg gctcgcccgc cttcaccatg 2940
acgacgaggc ggcgcggccg ctcgagggcc gccacgaagt ccttcgcggt ctccgtgtag 3000
acgaactccc cctcgtcgcc gaactcgtcg acgagcgcgc gggccttggc cgcggtgcgg 3060
ttgtgcacgg cgaccgtgaa gccgttgcgg gcgaagttcc gggcgaggtt gcgccccatc 3120
accgcgagac ccgtgacgcc gatctgcgct gaactgctca tgtgctagct cctgggttcc 3180
tggaaatccg acgtaccgcg accgcccggc acaccgcctg acctgccggg cacgtcatgg 3240
gtgacgcatg tgtcgtaggt aacgcgtctg cccgtcagta tcactccgcg gcgtaccgtg 3300
accttggaca ccgtgcccga aggaggagcc gcccgtgccg catttcgacc tgccgctcga 3360
ccaactgcgc cagtaccacc cggacctgcc ggaacccgag gacttcgacg ccttctggga 3420
gaagaccctc gcggccgcgc gggagcacga cctggacgtc cggttcgagc ccgtggacgt 3480
gccgctcgcc tcggtcgacg tcttcgacgt gaccttcgcg ggcttcggcg gtcaccccgt 3540
caagggctgg ctgctgctcc cggccggggc gcgcgagccg ctgcccgccg tggtcgagta 3600
catcgggtac ggcggcgggc gcggcctgcc gcacgagcga ctgctgtggt cggcggccgg 3660
gttcgcgcac ttcatcatgg acacgcgcgg gcagggcagc ggcggctcgg taggcgacac 3720
ccccgacccc gtgggcagcg cgccggcgta ccccggcttc ctgacgcgcg gggtcgagga 3780
cccgcacgag tactactacc gccgcgtctt cacggacgcc gtgcgcgccg tcgaggcggt 3840
gcgcgcgcat ccgctggtgg acgccgcgcg cgtggccgcg gtcggcgaca gccagggcgg 3900
cggcatcacg ctcgccgtcg gcgggctcgt gccggacctc gccgcgatct ccccgaacgt 3960
gccgttcctg tgcgacttcc cgcgcgcggc gacgctcacc gcccggcccc cgtaccggga 4020
gatcggactg tacctggggg cgcgcagggg gcgcgaggac cgggtgttcc gcaccctctc 4080
gtacttcgac ggcgtgcact tcgcggcgcg cggccgggcg cccgcgctgt tctcggccgc 4140
tctggaggac gagacgtgcc cgccgtcgac ggtcttcgcc gccttcaacg cctacgcggg 4200
cagcgagcgg tccatggagg tctaccgctt caacgaccac gagggcgggg gcgtcttcct 4260
ccaggatgtg caactccggt ggcttccggg gcatttgagg aactgaccag ttcaacgccc 4320
tctgcgcgcc ctcctcttgt cacagtgacg gccgaccggc tagcttgcgg ccttgtcctg 4380
tggctgacgt gtgaccttgc gtacaacgcg tgtctgaggg ggctctcatg gccttacgag 4440
gccggcatcg ccggtaccag ccgagccgga tcaaccgtgc ctcgctcacc gtcacggcgg 4500
gcggcgcggg cctcgcgctg cccctggtgt ccgcgggcac gggccacgcg gcggacgtcg 4560
acacctggaa caaggtggcc gcctgcgagt ccacgaacaa ctggagcatc aacaccggca 4620
acggcttcta cggcggactg cagttcaccc agtccacctg ggaggcctac ggcggcacgg 4680
cgtacgcgcc gcgcgccgac ctcgccacca aggaccagca gatcgccgtc gccgagaagg 4740
tcctcgacgg gcagggcccc ggcgcctggc ccgtgtgctc ggtgcgggcg ggcctgaccc 4800
ggggcggcga caccccggac atcaagcccg ccacggcacc ccagaagcgc acgggcacgg 4860
cgaacgacgc cagggcggag ggcggccgca cggcaccgag gccgccgcag cgcaccgtca 4920
aggacgtcaa gccggagtcc accccgcagt ccgccgcggg caccgcccgc atgtacacgg 4980
tggtgcgcgg cgacaccctc tccggcatcg ccgacgagcg ccgggtgcgg ggcggctggc 5040
cgcagctgta ccagaacaac cgccgtgcca tcggcgacga tccggacctc atcaccccgg 5100
gccagcggct ctcgctgcgc ggcgcggacg gcaaggagaa gcggcccgcc cggccgcccg 5160
agcgcaggaa gccggagggc acggagcgcc cggacaagcg gccggtgcgc gcgcccgaga 5220
agcagcgctc gcatccgcag gccaagccgc aggagcgcaa gcaggccaag ccgcaggagc 5280
ggaagcaggc caggcccgcc ccgaagcgcg acacggcacc ggcgggacag cggaaggcga 5340
aaccggccgc acaggcgcag tcgggcgcca ccgcgcccgt cgccgcctcg atcggcacgc 5400
cctaccgcgc ctccggcagc tcctggtcga agggctacca cacgggcgtc gacttccccg 5460
tgcccacggg caccgcggtg aaggccgtcg ccgcgggcac ggtcgtcgag tccggctggg 5520
gcggctcgta cggctaccag gtcgtgatcc gccacgccga cggcaggtac tcgcagtacg 5580
gccacatgtc ggcgctctcg gtgaaggccg ggcagaaggt cgtcccgggc cagcgcatcg 5640
gccgctccgg atcgaccggc aacagctcgg gcccgcatct gcacttcgag atccgcacgg 5700
gccccggctt cggctcggac gtcgacccgc tggcctatct gcgggcgcgc ggcgtccgca 5760
tctgaggcgc ccgcgccgcg gacacacgcg tacgggcccc gggtctcggt gagagacccg 5820
gggcccgtac gtacgcgtgc cgtccgtctt ccgctacgcg cgtgccgccc tggcgtccgc 5880
acgcgggaac gtctgcagga ccggttgcat cggcacgccc gcgagcccgg cgaggccctc 5940
gggcaggaac gactgctccg gcgcggcctg ttcgcccggc cgcgaccgcg tgcccgcgtc 6000
ggcgccgggg cgctcgtcgt ggtccggcac gcgctgctcg gtgaccgtgg ccgtctcctc 6060
cgacgcggcg gaggcggggg agacggcagc accgggagag acaggggaga tgggggagac 6120
gggagaggtg ggtgaggcgg tcgagggcgt ggggacggag cgggccaccg gctcggcggc 6180
gggccggtcg tcgcggggcg cggccggtgc ggcgtcgtcc cgggccgcgg ccgaggccgc 6240
ctccgccccg atgcgctccg tggtcagcag gataagcccg cccgcggcga ccacgccgca 6300
ggtcagcgcc accgccgtgc ccacggctcc gtagcggaag gattctccga acagggtgag 6360
gccgaccgcg gccgctatca ccgggttcac caccgtcacc gtggacagcg gcgccgcgag 6420
gcccgcgccc cggtaggagg cctgggacag caggagtccg gcgaccgcga gcaccgcgat 6480
caccgcgagg ctcggcacct gccgggtcag cggctcgtgg gcgtcccagt ccaccgcgac 6540
cgtcttcgtg aagaccgagg agatgccgaa ggcgatgccc gccgccgtgg cgagcagcac 6600
gctgcgcacc gccgggtgcc ggtgcgccgc gtgcgcgagc agcatcaggc agaccacggc 6660
cccgcccgtg ccgagcgcga gcatgacgcg ctcggtgtcg gccagggacc gggagtcggc 6720
ggcctgcgtc agcgagagca ggcccgccag gcccagggtg gccatgaggg cgccgcgcca 6780
ggcggtggca ccggccttgc ggcgcacgaa catcgccgcc atcggcaggg cgaacacgat 6840
cgtcagggcg cccaggggct gcaccaggct cagcggcccg taggcgagcg ccacgacgtg 6900
cagcagcccg ccgaggccgt tcaggaccac cgcgacccac cacacgccgc ggcgcagcgg 6960
cgcgtactgg tactgcgagg ccgtcgccgc cacctgctcc tggaggatcg ccccgcccgc 7020
gtacgccacg gcggagacga gggagagcag gacggacagc gcgagggcgc tcatgaggcg 7080
ctccaccggt gagggcaacg ccggtcggcc cggtacgtgt cgtgcccgta cgtccggtac 7140
gaacggtgcg gcgtgcggtc ggcttccatg ttcaccacaa tgtcgcgcga agcgcggcaa 7200
gtcgtcgtcc ctgagcagtc aatccgtcct actaccgatg gagtacgacc tcccgtatgt 7260
cctccccagg tctggttacc cacgaggtcg ggggcttctg atgtactgct gcggtgacag 7320
ctcgcagccc tgacatcgcc tgggacgtgg tcggatccgt cggcggcttc ttcgccctgc 7380
ggacggggga gccgccgggt cggacactcc ccatggtcgc acgcgtgtac gagatcggca 7440
gggtggtcac ggagggtgac ccgctgtcct tccgcgtcac caaggtcgcc gcccggctcg 7500
ccgctcccga gccgcgcgtc gcggcctcca tcgcccacct cggcctcgcc gcccgcctgt 7560
ggtccctcgc gctcggcccg gccgccctgt acgggcgcgt gcccgacctc gacccgcggc 7620
ggctgcgctg ggacgccgac ggcagctcgc cggacgacct gtggctcagc ggcgaccgca 7680
ccttccccgc cgacgccgcg cgcatccggg aagtcgtcct ggaaggtcac ctcgcgccgc 7740
tcgcggccgc cctgcgcgcc cgctaccgga tctcccccgc cctcctgcgc ggcaacgcgg 7800
gctcggccct cgcgggcgcc gcccgcgaac tgcacgcctg ggcggagcgc accggccgcc 7860
ccgaggcggg acggcgggca ctcgccctcg ccaccgaact cttcaccgcg ccggagctgc 7920
gcggcaccgg caccctggac ggcaccgcgt tccggcggcg cagctgctgc ctgtactacc 7980
gctgtccgaa cggcggcctg tgcggcgact gttgcttcga ccggccgccg cagcggtctt 8040
ccctcgaagc gcccgctggg tgaccatgag ggggccggcc gacgacgggg ggctccgctc 8100
gtgaaagtgg gactgctcac ccgcgagtac ccgccggacg tctacggcgg cgcgggcgtc 8160
cacgtcgagt tcctcgcccg cgagctgcgc gccctgaccg acctcgacgt ccactgctgg 8220
ggcaccgaca ccgaccgcgt ggccgccgcc gacgcggcgg tgcgccaccg cgcgtggagc 8280
gccctcgaca ccgccaatga cgcgctgcgc accctgtccg tcgacctcgc catggcggcc 8340
gcgctcgacg gccgcgacct cgtgcacacc cacacctggt acgccaacct cgccggccac 8400
gtcggcaagc ttctgcacgg catcccgcac gtcatgacct cgcactccct ggagccgctg 8460
cgcccctgga aggccgagca actgggcggc ggctacgccg tgtcgagctg ggccgagcgc 8520
accgccgtcg aggccgccga cgccgtcatc gccgtctccg gcgccatgcg cgaggacatc 8580
ctcgcctgct atccggccgt cgaccccgcg aaggtgcgcg tcgtccacaa cggcatcgac 8640
accgagctgt accgcccgga cccgggcacc agcgccctcg tccggcacgg cgtcgacccc 8700
acccgcccgt acgtgctgtt cgtcggccgc atcacccggc agaagggcgt gccccacctg 8760
ctgcgcgcgg cccggtgcct ggagcccggc gtccagctgg tgctgtgcgc gggcgcgccc 8820
gacaccccgg agatcgaccg ggagttccgc gccctgttcg aagagctgag ccgcgcccgc 8880
gccggcgtcc actggatccc gcgcatgctg ccgcgccccg aggtcgtgca actcctcagc 8940
cacgcggcgg tgttcgcgtg cccctcggtg tacgagccgc tcggcatcgt caatctggag 9000
gccatggcct gcggcacggc cgtcgtcgcc tcgcgcgtcg gcggcatccc ggaggtcgtg 9060
gcggacggca cgaccggact cctcgtgccc tacgaccggc acgacgagga gcgcttcgag 9120
cacgacctcg gtctgctcct gaaccacctg gccgccgatc cgcgccgggc ggcggccatg 9180
ggcgcggccg gacgctaccg ggccaggcgc gagttcggct ggggcacggt ggcccggcgc 9240
acggtcgagg tgtacgagga cgtactgggc gtgctcaagg caacgtaagc gggcacacgg 9300
acactcgggg gcgtccgcac gcccccgcca cccggccgag gaacggtccg ggcccacagg 9360
gcggtagagg gggcggcgat gcgcggcgga ccttcggtgc tggggatcgt cctggcgggc 9420
ggcgcgggca agcggctgct gccgctcacc gccgaccgcg cgaaaccggc ggtgaccttc 9480
ggcggcacct accgcctcgt cgacttcgtg ctctccaacc tcgtcaacgg cgacgtcctg 9540
cgcatctgcg tcctcacgca gtacaagtcg cactccctgg accggcacgt gtccaccacc 9600
tggcgcatgt cgagcctgct cggcaactac gtcacgccgg tgcccgccca gcagcgcctc 9660
gggccgcgct ggtacctggg cagcgcggac gcgatcctgc agtccctgaa cctcgtccac 9720
gacgaacagc cccactacgt cgcggtgttc ggcgccgacc acgtgtaccg catggacccc 9780
cggcagatgc tggagcagca cgtcgagtcc ggcgcgggcg tcaccgtcgc cgggatccgc 9840
gtgccgcgcg cggacgcccg gcagttcggc gtcatcaccc cggcgcgcga cggcacgctc 9900
gtggagcgct tcctggagaa gccgcaggac ccgccggggc tgccgggcgc cccgcaccag 9960
gtgtacgcct ccatgggcaa ctacatcttc accaccaagg ccctcgtgga cgccctgcgg 10020
caggacgccg atgacgagga ctcggcgcac gacatgggcg gctccatcct gccgatgctc 10080
accgagcgcg gcctggccca ggtgtacgac ttcgacggca accacgtgcc gggggagacc 10140
gcacgggacc acggctactg gcgcgacgtc ggcacgctcg acgcgtacta cgaggcgcac 10200
atggacctga tctccgacca gcccgtgttc aacctcgaca accgctgctg gcccatctac 10260
acccaccccg gccagctccc gcccgccaag ttctgcgcgg gcggcatcgc cggggagtcg 10320
atcgtcagtc ccggctgcgt catccgcggc caggtcacgc ggtccgtgct ctcgcccggc 10380
gtcaccgtcg aggagggcgc ggtcgtccag ggttcggtcc tccacgacaa cgtgcgcgtg 10440
ggccggggcg cggtggtgcg cggcgccgtc ctggacaaga acgtggacgt cccgcccggc 10500
gccacgatcg gcgtgaaccc ggagcgggac gccgagctgt acacggtctc gcgggccggg 10560
gtcatcgccc tcggcaaggg gcagtgcgta ccggagtgac cggagcggcc ggggcgacca 10620
gagcggtcgg ggcggccggg gcgcggggac ggcccggcgg agactaccca cgctggtgat 10680
ggttccggcg ggcggtgagg gcgagactga gcgcacttca gacccgcagt gcgtcggcag 10740
ccgtgccggg agcgacgtcg ccggcctgct cgccacggca gcactccact cgaaggacct 10800
cacttgacgg aaacaagagc tggggattcc gcgcggccgc tggaggtggc cctgatcggc 10860
gccggactga tcgcgcggct gcacctcgac gcctggatca gcacgggggc gtccgtgcgc 10920
gtccactcca aggacggccg cgcccccgac ctggcacgcg cctgcggcgc gcgggccgtc 10980
gacaccctcg acgaggcgct ggacggcgcg gacgtcgtgg acatctgctc cccgacgagc 11040
agccaccacg agatcgccat ggccgccgtc gcggcgggcg tcggcatcgt gtgcgagaag 11100
ccgctggccg ccgacgtgac ggaggccgag gagatcgtca ccgcggcgga gcgggccggg 11160
gtgcggctct gcccgaccca caacgcccgc ttcgccccgg cgttcgcccg gctccacgac 11220
ttggtcgcgg cgggcggaat cggcgcgggc gcggtcgcca cgttcgacgt cgccggatac 11280
cacccgcggc cctggaccgg ccgcgcctcc gcgcggtcgg gaggcatcct gaccgaccag 11340
atgctgcacg gcgtcgacat cgcctactgg atcttcgggg acgtcgtccg cgtgcacgcc 11400
cactaccagg ggcagctcac cgccccggcc cccgagggcg ccttcgcggt cggcaccgcc 11460
gtcctcaccc acgccgacgg cgcgctcagc cggatcgtga gccgctggac ggcgacgccg 11520
gacccgccca tccgcgtcgc ctaccacgtc tcgggcacgg gcggcacggt gctccacgac 11580
tccgaatggc cccaggagat caaggtgttc ggcggcgcgg gcggggcctt cgccccgcac 11640
ggggaatcgc cgttcctcgc cgagatccgc gagttctccc gggcgttcca gggcggccca 11700
gagccccgcc tcggcccccg cgacgcgctg gccgccgtcc gcatcaccca ggccgccgcc 11760
gagtccgcga gcacgggccg ggccgtggaa ctgcccgtga agggggccgc atgaaggtcg 11820
cagtgctctc gctcgcccac gaacgcgccg cggcgtacgc ccggctgctg cgcgccatgc 11880
caggcgtcga cctgctcgtc gcggaccccg aaggagcgcc ggacgagcag ggccgggggc 11940
aggccgcggc ccggcggctc gacgcggcgt acgcgggcag ttgggacaag gcgttcgcgc 12000
tgcgccccga cgccgtcgtc gtcacgagcg aggtcgcccg ccgccgtgaa ctggtcgagc 12060
gcgccgccga gatcggcgcc cacgtcctgt gcgagcggcc gcaggcggac acggaggcgg 12120
acgccgatgc catggtgcgc gcctgcgagg acgccggggt gcggctgacc ctcgcggcac 12180
cggcctgctt cagcccggcg ctcgccgccg tgcgcgcaca gctcgccgac ggcgcggcca 12240
tcggcccgct caccaccgtc cacggcacgt actacggccc cggcgaccgg gcggccggcg 12300
gagcgctgcg cacccacgcg cccgtcctgc tcgacctggt ggacaccgtg ctcgacggcg 12360
cacccgcggc gcaggtctac gcccagtcga acagcgtcct cagcggcgac ccggacgtcg 12420
agagcgcggc cctgctcacc ctgcgcttcg ccgacgggac ggtcgcggcc ctcgactgcg 12480
gctggagccc gccggggaac caccgagcag ccgcgggacc caccctgacc ttcgtcggcg 12540
agcggggaag cgtcgagttc accgctcgcc cgaagctgct cggcggattc gactccggca 12600
cggcccgcga gcggtggacc acggccgtga gcgacccgta cgcggtcgtg ctcgacgcct 12660
tcgtcgcctc ggtcgcaacc ggccgcggga ccgggcccga cggcgcgacc ggcgtgcgta 12720
ccctccgggt gatcagggca gcctacgagt cggcacgcac cggtgagccc gttgacgtgg 12780
ccgtaccgca gcccgtacgg ccgtagcgga cccgctcggt ccatcctcat cggaggggtg 12840
cgcggcgcac gcgcccgcac ccctccgccg cgacagggag agacgcgcat gacaaggatc 12900
gggatcatcc tcggcaccac ccgccccggc cgcgtcggac cccaggtcgc ccagtgggtc 12960
gagaaggcag cccggacgcg cggcgacgcg gacttcgaac tcgtcgacct cgccgacttc 13020
gacctgccgc tcttcgacga gccgcgctcc ccgcgcatgg gcgcctatga gcacgcccac 13080
acccgcgcct ggagcgccaa gatcgccgaa ctcgacggct tcgtgttcgt cacccccgag 13140
tacaactggt cgatcccggc cgcgctcaag aacgccatcg acttcgtcta caacgagtgg 13200
aacaacaaag cggcggcctt cgtcggctac ggagcaagcg ccaacggcgt ccgggccgtc 13260
gagcacctgc gcgccatcgc cgcagcggtc cagctctcgc ccgtgtacac acaggtcaac 13320
ctgtcgctcc tgaccgactt cgagcagtac gagaccttca cccccgccga gcgccacgac 13380
gccgcgctcc agcggatgct cagcgaactg atcacccgga cccatacgct cgcgcccctt 13440
cgccgggcgt gaaccaccgc acgtgcaagg aggaccaccg atgagcctgc cgaccgcggc 13500
tcccgccacc gggcccacgc cgccggacga caccaccccc tcggtctacc gattgccttt 13560
tccgcccggg ttcaccgagc gcagcggctg ccccttcgac ccgcccccca tgctccgcga 13620
ccaccacgac cagggcgagg tgcgcgagat cgccctgacc gacggcggca ccggctggct 13680
cgtcaccggg tacgaggagg gccgcacgct gctcagcgac ccccggctca gctccgaccg 13740
gctgcgcaac ccgctggtcg tgaagctgcc ggcggagctg cgcgcccagc tcatggccga 13800
cgaggcggtc gcgggcaact tcatcgccat ggacccgccc gaccacaccc gctaccgcaa 13860
gatgctgacc cggcagttca cgctgcgccg ggtgcggcag ctggagccgc ggatcctgga 13920
gatcgtcacc gagcgcatcg acgccatgct cgcccgcggc aacagcgccg acctcgtcaa 13980
ggacttcggc ctcgcggtgc cgtccctggt gatctgcgaa ctgctcgggg tggcctacga 14040
ggagcgcggg gagttccagg cccgcaccga ggaactgctc aacctggaca tcccgttcga 14100
gaagcagctg gccgccctcg acgagctgcg gaagttcatc ctcggccagg tgcggcgcaa 14160
gcgcgcgacc cccaccgacg acatgctgtc cgacctcatc cgctccgaca ccgaaccgcc 14220
gctcaccgac gaggaagtcg tcggcatggc caacctgctg ctcgtcggcg gccacgagac 14280
gaccgcgaac atgctgtccc tcggcacctt cgccctcctg gagcaccccg agcagttcag 14340
ggccctgcgc gaccgccccg aactcatgga cggggcggtc gaggagctgc tgcgctatct 14400
gtccatcgtc caccacggcc tgctgcgcac caccaccgag gacgtcgaga tcgcggggcg 14460
gaccattccc gcggagtccc tggtcatcat ctcggtgtcc gaggcgaacc gggatccgcg 14520
ccactacgac agcccggccg ccctcgacgt gagccgcccg cgcaggaccc acctcgcctt 14580
cgggcacggc atccaccagt gcatcggcca gcagctcgcc cgcagcgaga tgaccatcgc 14640
cttccccgaa ctgctgcggc ggctgcccgg cctccgcctc gccgtcccgg ccgacgaggt 14700
gccgctgcgc gagaagatgg ccgtgtacgg cctgcacagc ctgccggtga cctgggacgc 14760
gcccgacgcg taggcgtctc gcacgcgtcg tcctaccgcg tacggctctc ccgtgcaccg 14820
ctctcccgta cgccctcccc tccgtacgcc cttccccgcc ctcccgcacg gaatagggcg 14880
tacggaaatg ccgtacaaac acgcgccgtg caaaagcgga attccgcggc ggccgcgcgc 14940
ggccggaatt ccggtgaatt ccggagcgcc ggggaaaatt accaggttga ggggtgctcc 15000
taggggccgc cgctgcctca ccctgggaga cgtcaccagc caatcgtcga cgacagggac 15060
ggaccgggat gaccgacgac aacgcatacc agcacttcga cgcgaccacc ctggactacg 15120
aacgcgcgta tcggaccagc tccctggtgg agggcgtggt gctggagcgg atgccctggg 15180
acatcggcgg accgcagccg gtcctggtcg aactggaaag ggcgggccgg gtgtccggcg 15240
acgtcctcga catcggcagc ggcgtgggtg acaacgcgat ccacctggcc cggtgcggct 15300
atcgcgtgac cggcctcgac gtcgcgccca ccgccgtgga gaaggcgcgc gcccgggccg 15360
cggagaaggg cgccgacgtc accttcgccg tcggcaacgc gacgagcctg gacggctacg 15420
agaaccagtt cgacacggtg accagcagcc tcgtcttcca ctgcttcggg ccgaagcagc 15480
gccgcgcgta cgcggacgcc atcgcacggg tcctgcggcc cggcgggcgg ctgctccagt 15540
ggtgctcccg cggcgccgct gccggtcccg agccgatcac cgaggagacc atcagggacg 15600
ccttcagcgg ccccggctgg tccatcacca cgctccgcgc gcagcacctg acgacgaccg 15660
tcctggacga gcccctgcgc aaggactacg agggagggca gctcgacacc gacgacagcg 15720
gggccacgct gctgccgatc tggctcctcg aggcggcgcg cgactgagcg cccccggacc 15780
cgcgcacgag ggtgccgaca tgaccgagac gcccgccacg ccgacgggcc tgcccaccgc 15840
ccgcgcggcc ggctgcccgt tcgacccgcc ccccggcctc gccgcgctgc gcgaccgggc 15900
cccgctgacc cgcatggagt tcccgaacgg ccacgtcggc tggctggcca cgggccatgc 15960
ggtggtgcgt gccgtgctcg ccgacccgcg cttcagccac cgcaacgaca ggaggcactg 16020
gcccctggcc gacatcggcc gggggttccc gccgctgccc ggcgacatgc tccacatcga 16080
cccgccggac cacacgcgct accggaagct gctcgccggc aagttcacca tgcgccggat 16140
gcgccggctc accggcagcg cccaggagat cgtcgcgggc aagctggacg ccatggagcg 16200
gcacggcggc ccgctggacc tgctggagtt cttcgcccgc cccgtgccga cgctgatggt 16260
ctgcgccctg ctcggcgtgc cgctccagga ccgcgccacc ttccacccgc cggtccgcgg 16320
gaccgacgac gccgcagccg tggaggcgga cgtcgccgcg tacgtcgaga tgacgtacgc 16380
cgacatgcag gagtacttcc ggaagctggt ggcggccaag cgtgccgcgc ccgccgacga 16440
cctgctgagc gatctgacca cgtccgacct caccgaggac gaactggtgg gcctgtgcgc 16500
cgtcatgatg cacgcgggcg tcgactcgac ctcgaacatg ctggccctgg gcacgtgggc 16560
gctcctggag cgcccggacc aactggcggc cctgcgcgag cggccggacc tcgccgaccg 16620
tgccgtcgag gagctgatgc gctacatgag cgtcgtgcac accggctccc gcgcggcgct 16680
ggaggacgtc gaactggccg gggaggtcgt cagggccggt gagtcggtgg cgttctcggt 16740
gcaggccgcc aaccgcgacc cggcccgctt cgccgacccg gacacgctcg acatccggcg 16800
cggtgccgtg gggcacctgg ggttcgggta cggcgtgcac cagtgcctgg ggatgcagtt 16860
ggcgcgcgtc gagatgcgcg tggccttccc ggccctgttc gcgcggttcc ccgccctgcg 16920
cctcgcggtg cccgccgggg acgtaccgat gcgggacgac ctggtcatcc cttacggggt 16980
gcaccggctg ccggtcacct ggtaggtgac gggccgccgc gtgacgctgc cggagcccct 17040
ggcatcgggg ctccggcagc gtcgtgttcg tgtgtgtggt ggtgtgtggg gggcgtgggt 17100
ggtggtcagg cctgcgacgt caggcggttc agcacctgcc gcaggcagtc cagacgcctc 17160
ggcagctccg cgtccccctc gggccacgcc aggtcgatcc ctatgcggcg gtcgaaggtg 17220
gtggccacat agccgccgat ggccgcgaac tcgccggggg ccaccttcct gcgcgaggag 17280
gagtggaagt tggtgaggag caggccgtcc ggcgtccgca gggtcggcac gacgccccag 17340
ttcgacacgc tcaccacggc gggagccggg cccgcggcgc gcggcttcgc gtgcggcgcg 17400
ggctgggtga ccatgtccag gaggctgcgc tggatggagc cgtcggcgag gcccgcccgc 17460
agccgctcgc cgagcgccct gccgatggcg acggcgctgg gttcgacgtc gtcggcggcc 17520
ttgaacaggc cgcccccgac gacgttcgtc ccctcggtcg ggccgatcgg gggagtgagg 17580
cggttgcgca ggttcaccgt gtaccggaac agcagctcgg acaccggcag gccccggacc 17640
tcggcctcga cgaggaggac ggcgcccgag aggaggccgt tgagcgtcac ctgctcgcgg 17700
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cggactatcg ggatccgtgc ggaggcgggc agttcggtca cggtcttcaa cggcgccgac 17820
gcgccgcctt cgccggacgc ggcccggtgg atgccgcgct cggcgagaag gtcctcgagg 17880
gaccgcgggt acggccggcg cggcaggtcg acggacgcgc cccggaccac gtcggcgtag 17940
caggcccaca gggccgagag cagctcgatg gagtggtggg cgtcggcgat gctgtgatgg 18000
gtcagcaggg tcacgctcgc ctcgctgccg tcgcgcacca cgttgagcgc gctcagcatc 18060
cggtactcgt ccaactccac gccggtcagc gggtggtcgg ggtcgcccgc gcagatctgg 18120
acctcgggcg gggcgccgga ctccacgaag gcgagcccgc cgtcgtcggc cacgagccgg 18180
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ttctcggtgg gtgtcagcgc acgctgaatt gcagctgtcg tcatgaatga atggcccttc 18360
cgccgacgcc cggcatgtcc gaagcctgat catttttgcc cacggggtac ggcggggcca 18420
tcaccaacgt gagtagtctc cgtaaggccg cggcccgtcc cgctcgtcga cgggcgtccc 18480
gccgcccccg cactccccgg ccgccggaac cgtttcccca cccctatgac caacgggcgc 18540
tagccgtcgc cgacttggcc accccggccc taccaggttg ggggattccg cgccgacacc 18600
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tgcgtgccga gcggccgctg gcgcgcatga cctacccgga cgggcacgag ggctggatcg 18900
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agcagatcga cgtgatgcgc gcgcacgggt cgcccgccga cctggtggag accttcgcca 19200
ggccgctcgt cctgagggtg ctctccgaac tggtcgggct gccctacgac gagcgcgagc 19260
actacgagca cgcgccgacg ctcctgcacg acccggacgc gaatccgcag gaagtggccg 19320
ccgctttcga gaaggcgggt gccttcttcg tcgaagtcat cgagcgcaag cggaagaatc 19380
ccggggacga cctcctcagc cgcctcacag cggacggtca gctgaccacg gaagagctgt 19440
gcaacatcgt cgtcctgctg ttgttcgcgg ggtacgagac cacggagagc gcgctgtccg 19500
tcggcgtctt cgcgctcctc caccacgcgg aacaactggc ggtgctccgc gcggatccgg 19560
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ccgtgaccgt ttcgctgccc gcggccaacc gcgaccccgc gaaattcacc tgccccgaaa 19740
aactggacat cggccgcgac accgccgggc acgtggcgtt cggctacgga atccaccagt 19800
gtctgggcca gaacctggcc cgcgtcgaac tgcgcgccgg aatcgcggct ctcctcgggg 19860
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ccgtcttcgc cgtgaagggc ctgcccgtct cctggtgagt ccccttctcc ctttctccct 19980
ccgaaaggaa ccgcggcatc gtgcgcaccg acctcatcaa gccgctgccc gtcgccctcc 20040
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acctcgcggt cgtccgcgcc ggcggcatcg gcgtgccggt caatccggcc tcggcccttg 20280
ccgaactgga gtacgtactg gccgacagcg gcgccacggc ggtcatgacc gacgccgcgc 20340
aggcggcgcg cctggggcgc tcggccgccg tggaccccgc caccacgctg ctggtgaccg 20400
gcgaggcccc cgaggtgccg ggagcgcacg cgtacgacac actcgccgtc accgagccgc 20460
ccgtgcccgc ccgggacgac ctcggcctcg acgacgtggc ctggatgttc tacacctccg 20520
ggacgaccgg caggcccaag ggcgtcctgt cgacgcagcg caactgcctg tggtccgtgg 20580
cctcctgcta cgtgccgata ccgggcctca cggaccggga ccgggtgctc tggccgctcc 20640
cgctgttcca cagcctctcc cacatcgcgt gcgtcctgtc cgtcaccgtg gtcggcgcca 20700
ccgcccggat catggacggc agctccgcgg acgacgtgat cgaggcgctc cgcgagggcg 20760
gcgcgacgtt tctcgccggg gtgcccacca cgtaccacca cctggtgacg gccgcccggc 20820
agaacggctt ctccgcgccc gccctgcgga tcggcctcgt cggcggcgcg gtcaccgggc 20880
ccggcctgcg ccgggacttc gaggacacct tcggcgtgcc gctggtcgac gcctacggct 20940
ccaccgagac ctgcggggcc atcaccatca acccgcccga cggcgcccgc gtcgacggct 21000
cctgcggcct gcccgtgccg ggcgtcggcg tccgcgtcgt cgaccccggc accggcctcg 21060
acgtccccgc cgggcaggag ggcgaggtgt gggtcagcgg gccgaacgtc atggtcggct 21120
accacaacag ccccgaggcc accgccgagg cactgcgcga cggctggtac cggaccggcg 21180
acctggcccg gcgcgacgac gcgggctact tcaccatccg cggccggatc aaggaactcg 21240
tcatccgggg cggcgagaac atccaccccg aggagatcga ggcggtcctg cgcaccgtcg 21300
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tcgtggaggc cagcgcccac ccggtcctgg tgcagcccgt caccgaggcc gtcgacggca 34680
cggacgccga agcagtggtg accgggtcgc tgcgccgcga ggacggcggc ctgcgacggc 34740
tcctcacgtc ggcggccgag ctcttcgtgc gcggagtcgc cgtcgactgg gccggtgtgc 34800
tgcccgccgg agccctggcc cggcccgcgc gcgcggacct gcccacgtac gccttcgacc 34860
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gctcggactc cgccttctgg tccgccgtcg agcaagccga cacggactcg ctcggcgccc 34980
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tcgcggggcg ggaggacgac ctcaggcggg tcctggcgtc cgtgccgctc acccggttca 36900
aggaggccgg ggtgctcgac gccctcctcg gcctcgccga gaccgagacc gggaccgggg 36960
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ccgctggccc gcttccgggc ggccggactg atggacgccc tggtcgagct ggccgccctc 47760
gccgacggcg caccgcacac ccgcacgacc gacgagaaca gcgaggccga ggggggcgac 47820
gagaagcggg cgatcgccga gctggacgtc gacgacctcg tgcacctggc gctcggcgac 47880
tgaggacctt tcgaaaccgc tggctgattg gggaattcaa gtgagcgcgt catatgaaac 47940
agtcgtccag gcgctacgga agtcgctgga agaagtcggc tcgctgaagc agcagaaccg 48000
ccgtctccgc gacgcttccc gcgagcccgt ggcgatcgtc ggcatggcgt gccggttgcc 48060
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gtcgggcttc cccgaggacc gcggctggga cctggagggc ctcttcgccc cggaccccga 48180
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ctcgggccgg gtgtcgtacg tgctcggttt cgagggcccg gcggtcacgg tggacacggc 48540
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ctcgcggcag cggggcctgg ccgccgacgg ccggtgcaag gcgttctcgt cgtcggcgga 48720
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ggtcgccccg gaagtggaag gcttcgcggg cacggggctc gcgggcagcg tggcgtcggg 53760
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gggcctcgcc gagggcgtcg gcgtcgtact ccttgagcgc ctctcggcgg cgcgggagca 54060
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cgtggccagt gtcatcaaga tggtgcaggc gctgcgccac ggcgtcatgc cgcccaccct 54420
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cgtggagtcg ggagcggcgg cggccccggc agcggcggtg ctggacgccg tcggcggcga 73740
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gagcgccgcg cctgcggccg tccgccactg gtagccgttg gccggttcgg tgatccggcc 86700
gaggtccggg ccgatgccgg tggcggccag gagccgggcg gtctccccgt cgaagctggt 86760
ggcgcgcggc agcggatacg gcctgcggcg gcgctccagg acggtcacgc gcagtccgcg 86820
ctgggcgagc agcaccgaaa gcgcggcgcc gaccggtccg ttgcccacga cgacgacatc 86880
cgcgtccgtg gggtccgcgg gcacttccaa aaggggtgtc aaggaaaacc tcacagatgc 86940
gcaccgtttg acgaaatgaa ttccatcgtg ccgaaaagcg ccgacagttg caggaaatcg 87000
ctggcaccgt attccgcagt acgaaacgtg tcaagaagcg gaaaacctta ccaggttgag 87060
ggatgccccg ccggtcattt ccgccctatc ctgccgagga gtcgtgcctc ataaccgtaa 87120
gagcaccggc acttcacgcc gcacggccgc aggaacgtcg gaattcccgt ccgccggtcc 87180
cattcagctc cgcacgcgcg acatccttga cgccgaaggg gagacctatg acagccaccg 87240
ccgagaacgc gaccgagccg gtcgacctgc tctcgccgga cctgatcgcc gacccgttcg 87300
ccgcgtacgc gcggatgcgt gagcaggcgc cgaccctgac cggttcgatc atgggcgggc 87360
gcccgatgtg gctggtcacc cgctacgagg acgtccgcaa ggtgctcacc gacccgcggt 87420
tccacaacaa cccggcatcg gtgccggacg ccccggacac ccggacgacg atcatgcgcc 87480
agctcaacct gccgaccgac ctggtcgact acctcgaaga caagctcatg cagatcgacg 87540
gcgccgacca ccgccggctg cgcggcctgg tctccaaggc gttcacggca cggcgggtgg 87600
cccgcctccg cccccgggtc gaggagatca ccacgacgct gctcgacggg atggcgcagg 87660
cgggccgcga cggcacgccc gtcgacctgt tgaccgcgtt ctgctatccg ctgccgttca 87720
ccgtgatctg cgagctggtc gggatcgacg aggccgaccg cgcgccctgg ttcgagtggg 87780
ggcactgcct gtcctcgccc acggagcacc gcgagcgcct cccgcaggtc atgcgcgagt 87840
gcgtcgacca catgctggag gcgatcgagc ggcgccgcgc cgagccgcgc gacgacctga 87900
tctccgcgct cgtccaggtc caggaggacg acggcgaccg gctctccgag cgggagatgg 87960
tcaccctggt cttcaccctg gtgatcaccg gacacgagac gacgacgcac ctgctcgcca 88020
actcggtgct cgccctcctg gagaacccgg accaactggc cctcgtacgc gccgatccgt 88080
cccggtggcc gcaggcggtg aacgagctca tgcgcctggg gcccacgcag tggggcctgc 88140
cccggcaccc gtcggaggac gtcgaagtcg gcggcgtgac gatccccgcg ggcgccaccg 88200
tcatgccgct gatcctgccc gcgaacaccg atccgcgccg gtacgacgac cccgagcgcc 88260
tcgacatcgg ccgcgagacc gggcagagcc acctcggctt cgggcagggg gcgcactact 88320
gcctcggcgc gccgctggcg ctccaggagg cggaggtggc gctgcacgcg ctgttcgagc 88380
ggttccccgg tctgtccctc gcggtgccgc gcgaggaggt cgtctggacg ctgcgccccg 88440
gcgtcacccg tgtcgagaag cttccgctgc gcctcgtctg agcacacagg acgccgtacc 88500
ccctcgcccg ctgctgccaa gggcgagggg gtacggcgtg tgctgcgggg gatcagagcg 88560
cgtcgacggc gtacggcacg gccagggtcg gctcaggcga ccttcgtcgc gcacaggatg 88620
ccgtgggcga tcagggcccc cggcatggtg gtgaggtcct gggcgaccgt cctggtgacc 88680
cggaacccgg cttcctccag ccacttccgg tacgtcgaca gcttctgcgg cccgccctgc 88740
cccatggtgc aggcgaggaa gtaggcgggg aagatgtcga cgccggcgct gctgggctcc 88800
gtgatgtcct cggggtagac cggcaccagg atgttgacct tcccgccgac gtcgagggcc 88860
tcgctcacgc cgttgaggat cgtgcgcacg tcgtccttgt cgaacatgtc gaggaagtgc 88920
ttgatcagga cgacgtcgaa ccctttgggg acgctcttga agacgtcgcc gccgatgaag 88980
gagcagtgct ccgccacgcc ctcggcccgg aagttctcca ggcactcggc ttccttctcg 89040
ggcaggtcga acgtcgtcac gcgcaggccg ggcgaggcct tgaggcggtg ggtcaggatc 89100
gcgccgagcc cggtgttccc ggccaggtcg agcacccgcg agcccggcgg gatgtggatg 89160
ttgcggaaga accaggggtc catgtgggcg gtgacgtcgt ccatcatcgt cgcccaggac 89220
tcgcgcaggt ccttgtgctc ggccacggcc tcgtacaggt tcccctcgaa tccgtacagc 89280
ttgtccaggc cgacgatgct gccggtcctg acgctgtcgg tgaggtagaa caactgccgg 89340
agcatgacca ccttgatcat gttcaggacg gggagcaccc gctggagatc ggcgtcggac 89400
acgcccgcga acgcgtcgag ggagtagccg ccggaggcct tgtcgaaggc gacgaagccc 89460
tccttgaccg gcaggtgcag gagttgctcc acggcgtccg gcttggcgct gacggcctcg 89520
ccgagctggg ccgcggtcag accgggccgc ttccgcagcg cgtcgacgat gccgagctcg 89580
aaacaggaca gcaggatcat gaaccgcgag ggccccacca tgtactcgcg cagacgcgtg 89640
aacgtggcca ctgcattcat cgcactcatt ccttcgggtc ggctgatcgg ctgccacaac 89700
gtcccgctcc ggcacggcgg cttccgtgcc ccgcactcac tccggtcgcc gggcgacgat 89760
cctggcgtgg tggagaccgg ccttgcccgc ggcgaaggcc gcccgcagca cctcgtccac 89820
gaactcgtcg acgcgctcgc cgagggcgtc ggcctgcgtg gcgaagccca tcagcttgta 89880
ccgcctgcgc atctcggcca gctccgcgtc ggacggcagg gatccgttcc cgcccaggga 89940
gtgcacgatc gccgggtcgt agtcgaccag ttcgagaccg gcgtcccgga gcaccgccgc 90000
cacctcgtcg gccgggtagt cccgcatcgc gggcggcgcc gacgccagca gatcccgcca 90060
cttcgcgctg cccgagacct cgcgcacgat cccgaacatc cccgcgccgt cgccgcgcgg 90120
ctgggcgccg gaccactgga gtacgaggtg gccgcccggg cgcagcgcgc gggccatccg 90180
gcgcagcggc tcctcggcct cggccagcca gtgcagcacc caggaggagt ggatcaggtc 90240
gaactggccc tgtggcagct ccaggcgctc ggccgggcag acatcggccc gcacggagag 90300
ccccgcgcac cgctgccgcg tggcctccac catggacggc gaggcgtcgc tggcccatac 90360
gtcgaagccc cgctccgcga cggcccgcgc gacctctccg gtgccgcacc cgatctcggc 90420
gaaggagccg cccttctcca gggcgccgcc cgcgagttcg agagcggcca gggccgtctt 90480
gatgtgtggc gcgttgacct gcgcgtagtc ctcggccagc caggcgttga ctgcggtcat 90540
cgacgaagtc ctctctctgc cgggaagacc gcggcggccg gagcgcgagc cgtacggcac 90600
gccgctctcg tgcgacaccg cggtcacgag tgcccgggac accggaaggg atgaggcgcc 90660
gtcagagttg agtaccgatg cggtactggg ggccgttgtc ggcccgccgc ggcccctgcc 90720
cttccgtagc ctagggcggc cccgagcggc ttggcacccc tcgatctgat agggcgtcgg 90780
ccggtcagtc ggccagggag agggcctggc ccgggcagtt gtcgacggcc tcgtgggccc 90840
ttcgcaccag gagttcgccc tcgggctcgg cgttcaggac gacgaccgtg ccctcgtcct 90900
cgctctggtc gaacaggccc ggttcggtga acacgcactg gccggagccg acgcatttgt 90960
cggcgtccgc gatgatcttc atggtgatgc ctcctccttg cgaaacccgt cgtgcacggg 91020
ggaaagagcc acccgtcgtg cacgctgaaa gagccgcccg gaaggccgcg tcgggcaccg 91080
ctgaattccg tcggcgccaa cggtgttggc gagtggcgcc gacgggatcg gacgcgcgcc 91140
gcggcacggt gaattgctcc gcggaagtgc cccgatgatc gtgcggaaat gtgcgtggaa 91200
atccgtgagg acctctgtcc gcacgtcgtg cgggatatcg cggggcactt cctggtatcc 91260
gggatgtccg gccgggtaac gttaccaccg gacgtcggac gacggtgccg ggctcagtag 91320
tcggcgctcg aaatccggct ccacgtacgc gtgagttcga cgcgcgaggc cacgttcatc 91380
ttgcggaaga tcttcttgag gtggaaagcc accgtgtgcc cggagatgaa aagccgctca 91440
ccgacctggg agttcgtgaa gccctggctc accagctcgg ccacggccac ctccgaattg 91500
gtgagagagc cgaccttcac gctgtcgtgg gcggcgtact gcggatagcg gccgcgccgc 91560
actcccagtg acctgagcct gctcacgacc cggcgggcat cgcgcggggc cgaggacttc 91620
gagtatccgt ccaccgcccg ttcgaggacg tccaccgccc ggtcgcggtc ctgccgggtg 91680
tccgcgagca gctttccggc gtcttcgtag gcggacgcgc ccgcccacag atcccggtgt 91740
gcctcggccg cggcgatcag gaattccgga ttctcggcca ccagcccgtc ggcgtgcgtt 91800
cccgccgcct ccacggaacg gatcccgcgg ttgcgcgcgg cgagttcgga cgcctcggcc 91860
gccacccgct tggcgaggac ctcgtcgccc agcttccgcg cggcccggac gagccaggcg 91920
gcggcggccg gctgcgcggc aaggagctcc aggatgagct ggtcgtcggt gatgatgccg 91980
acgacgaggt gggcggcgct cggcgcaccg ccctgcacct ccaggagctg ggccgccgcc 92040
caggcgcact ggctggggcg gtggatcgtc tgcccgagga gggcgtcgtc ccggagctga 92100
ttggcgaagt ccgagctcac gctcatgttg ccctgcctga gggcgctgag cgccatcacg 92160
gcgtgcgcct cggggagcag acaggtgagg cccagctgct gtgcctcgcg cacccccttc 92220
tccgccaggt cgacagcggt gtcgatgtcc ccctgggtga aggcgagttc cgccgcgcac 92280
gtcagcgagg ccgcgaccag accgccggac gtcgtggtgc cggccgtcag ctcctccacg 92340
ccggcgagta cgcgtgctcc ggccgccggt tcgcggattc tcaccaggag ggcggagtgc 92400
cagatcctgg cgaggcccac acatttcccc gagcactccg gttgtgtttt cccggctctt 92460
tccgcaaggc gcaggccttc tgtgagatcg ccgcgcgacc aggcggaaaa ggagagtgtg 92520
gcaagccgaa cggtttcgca ggagctgttc tcgcaggccc ccatgacgta cagggaaggc 92580
ggcagctgca ggcggaacgg tgaatcgagc atcacatctc ctgtcggtgg atcatcacta 92640
acgcctggtg gtccgcgcgc ggttccggca gcgccgaccg tgggaagtgt gcacaggaac 92700
ggttgcagtt atggcggaca ggtgcgcaag ggggcgcgcg ccaccactat gtgacgcctc 92760
gtcgactacc gcgtggcgcc ggcttcgccg accgaaggcg ggcagacatg ccgcaggggc 92820
ggcacgagtc ggtgccgacg agggggaact ggctggaggg gggtgggggc tcaagttgca 92880
tctgacatgt tccgatgatc caacgttaag ccccggaagt gcaggagcac ttcagcggag 92940
atgaagcata atttcaaagc tgcggcaggg cctcagaggt gtcgcttgcg atttgaccga 93000
ttttgcagcg atcttcccgg gggcagcttt cctgtggcca attccttact gtggccagtt 93060
tcttacctta gccgcagcgc ggggacttac gggcgagtaa ccctcgcatt cgcgcctgct 93120
tcgtcaactc cggcgcgccg tggggcggtc ggggcgcgcg gggatagggg cttacggggt 93180
ctttgcagga tgatcttggt gtggcacggt gggtgcctgc gcgatcacgt ccgggtgtgc 93240
cgcccgggcg gaagtgggct ggtggggcgc gcagttcggc ccggccggat cgacgggtga 93300
gtcaggtgcg gaccttgcgg cagccatgtg cggagtgacc gtccgggacg gggtggacct 93360
tgtgcgtgaa gtggcccgcg gagcggcccg gggagcggcg tccggcggtg gcgcgaaagg 93420
cctcggtgct caccgggaac ccggtcgggg ccggcggcaa caacgccacc gcccgtatcc 93480
agggtgtcct gcgtgccgac ggcgacaact gccccgcgac gcccgcaagt tcactcaagc 93540
aaaattcaag ccggaactac agctaccgtt tcggagcaat agcagccggg taggtcttca 93600
ggtcggatca atagggggcg ggtagttcgg atcgaggcaa gaggagccgg gtaggtcatc 93660
agtatttctg gagggaagcg ttttgggaaa gccatccaca cgcgttctgc tggtaagcaa 93720
tgatgcgcgt ctgagcactg ccctgcacca cccaccgctc cccgcgaagt acttcgtcat 93780
ctcggtgccg accagcacgc aggccctgga gaacttcggc gatttcgacc tcttgctgct 93840
cgactcctcc acacccggta tggacagcca cgaggtgtgc aaaagaatcc gcaaccaggc 93900
gtcggtgccc atcatcattc tcggcccctg cgtgaatgag atcgaccggg tactggcgct 93960
gaacgccggg gcggactact gcgtggtgaa atcggactcg ctccacgagt tgcaggcgag 94020
catggacgcc gtcatgcggc gctcgtcccc ctgtccgacc ggtcagaatg ctccggggtc 94080
agccgctcag ggcggcgaga tcctggtcgc cgggccgctg cggctgaatc cgcgcaaccg 94140
ggacgtgacc ttggcgggac ggccggtcag gctgaccccc aaggagttcg atctgctcgc 94200
catgctgatg gaggatccgg acaccctgca cacccgcaag gccatcatcg cgcgggtgtg 94260
gaacgagcac tggttcggct cgactcggac cctggacgtc catatcgggg cgctgcgtca 94320
gaaactcggt tcctacgaat ggatcgagac caaacgcggg atcggattcc ggctcggcac 94380
ggtgccggtg cccggtgccc gggactcgcc gtagccgtgg gcatcacggc cgcgtctgcc 94440
cgccgacctt gccgttcgag ccgcgcgggc tccgcggggc cgccgcggtg aggtgcaaca 94500
gggcgcgggc ggccaggcga tagccgaagg ccccaagacc gaccacgact ccgctcgcca 94560
acggagcgat caccgactcg tggcggaatt gctcgcgggc ccacacgtta ctgagatgca 94620
cttcgaccca cggcggcgca tagctcgcca gcgcgtcgcg cagactccat cccgcaatca 94680
tgagggcgcc cggattgacg atggcgccga ccgtgctctc gccgtgccgg tgaatcgcgc 94740
cgacgagatc cccttccgaa tcgtgctgga cggagaggac ttcccatccc cgggcccgca 94800
cttcatcggc gaccgctgcc tcgatgtcgg cgagcgtatc ggtgccgtat atctcgggct 94860
cacgtcggcc cagaacgccc aggttgggtc cgttgaggag cagcacgaca ctcaagggga 94920
acctcgctat tccttgggaa ggcggacggt cggcggaccg gggaccgctc cccataatcg 94980
gcgatcccgg gcaccgcaca ccatcatcag aattgatagt tccggtggcg cgcgggagcg 95040
gccgacgtgc tgcgcggcag ggcggacaac aggtctacca gcatgggtag acctgggtgt 95100
cgaggcgatt gcggacgccc gcgcgtatac cactccgcgt atccgccgcg tacgctggcg 95160
gcaactcctt gacggagcgg gggagacggg ggaacggggg ttgatggctt tcggccgagc 95220
gatccggtgc gacggtccgc accagtgcgg ctgcacggca caggacggca cggaacagaa 95280
cggcacggcg cggtgcggca ccgc 95304
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgcatatgg agctgaatgg gacc 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcctgcagt gaccggccac cgacc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttctgcagg gtggctgtca tgggg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gggaagcttc gacggacacg ctcac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgtcccgcaa gggcgcgtgg accgg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgggctcgtc gccgaccacg tcacg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agacatatga cttcgtcgat gaccg 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cttctgcagc gcctcgtctg agcac 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gttctgcagg gtggctgtca taggt 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtcaagcttg tcgtcgagca gctcc 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acgtcttcaa gagcgtcccc aaagg 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggcggtctcc ccgtcgaagc tggtg 25
Claims (5)
1.一种曲张链丝菌素衍生物,其特征在于,其结构式如式3-4中的任意一种所示:
2.一种权利要求1所述的曲张链丝菌素衍生物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
A、以曲张链丝菌素原始产生菌链霉菌XW-1为出发菌克隆得到曲张链丝菌素生物合成基因簇,该基因簇中包含5个参与曲张链丝菌素生物合成后修饰过程中的P450基因,该5个P450基因由stvP1、stvP2、stvP3、stvP4、stvP5基因组成,分别位于SEQ ID NO:1的第13481-14773位碱基处、第15800-17005位碱基处、第18765-19958位碱基处、第83977-85221位碱基处及第87228-88481位碱基处;其中,所述链霉菌XW-1的保藏编号为CCTCC NO:M2017417;
B、对所述曲张链丝菌素生物合成后修饰系统中的P450基因,单独的对stvP5进行选择性失活,获得stvP5基因失活突变株ΔstvP5;
(1)stvP5同框敲除重组质粒pWHU2802:
1)以曲张链丝菌素野生型产生菌链霉菌XW-1的染色体DNA为模板,以stvP5-L-F和stvP5-L-R为引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:8-9所示,在stvP5基因上游扩增出2098bp片段作为stvP5同框敲除同源左臂stvP5-L;以stvP5-R-F和stvP5-R-R为引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:10-11所示,在stvP5基因下游扩增出1928bp片段作为stvP5同框敲除同源右臂stvP5-R;
2)将同源左臂stvP5-L直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP5-L,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点NdeI与PstI将其酶切回收;同样,将同源臂右臂stvP5-R直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP5-R,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点HindIII与PstI将其酶切回收;
3)将上述回收的两个片段同经过NdeI与HindIII酶切回收的载体pYH7进行三片段酶连,经过酶切验证后得到正确的重组质粒pWHU2802,用于基因stvP5的同框敲除;
(2)stvP5同框敲除菌株ΔstvP5的构建:
将stvP5同框敲除重组质粒pWHU2802转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002,以阿泊拉霉素、卡那霉素及氯霉素作为抗性筛选标记进行筛选,将筛选到的经质粒提取及酶切验证正确的转化子ET12567/pUZ8002+pWHU2802作为接合转移供体菌,以曲张链丝菌素野生型产生菌XW-1作为接合转移受体菌,按照上述接合转移方法将pWHU2802导入其中;再利用阿泊拉霉素为筛选标记,筛选到具有阿泊拉霉素抗性的接合转移子后将其进行松弛培养,将松弛培养获得的单克隆经在含有阿泊拉霉素和非抗平板上进行影印培养,筛选到对阿泊拉霉素敏感的菌株,这些菌株为可能的双交换突变株或野生型菌株;利用验证引物CK-stvP5-F和CK-stvP5-R,以其基因组DNA为模板进行PCR筛选和验证,理论阳性扩增条带为1006bp;经PCR筛选和验证正确的菌株为双交换突变株,即stvP5同框敲除菌株ΔstvP5,进一步通过Southern blot分子杂交证实突变株ΔstvP5构建成功;所述松弛培养为在含有1%MgCl2的培养平板上划单克隆培养;
C、对所述突变菌株ΔstvP5进行发酵,其发酵产物进行提取,经分离纯化,制得如上述式3和式4所示的曲张链丝菌素衍生物;
所述对突变菌株ΔstvP5的发酵产物的提取具体为:发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,收集乙酸乙酯相;用旋转蒸发仪将乙酸乙酯相浓缩至干,随后用0.05倍体积甲醇再次溶解,溶解物中即含有曲张链丝菌素衍生物;
所述对突变菌株ΔstvP5的发酵产物提取后的纯化具体为:将提取后的发酵产物溶于甲醇中后过有机系滤膜,过滤后取溶液,进样,通过HPLC制备各目标产物,色谱条件为:A相为水;B相为乙腈;流速3mL/min,洗脱程序为0-20min,35-65%B;20-28min,65-95%B;28-30min,95%B;目标化合物出峰时间为12~24min处;色谱柱为Agilent公司的ZORBAXEclipse XDB-C18反相柱,所述反相柱为5μm,9.4×250mm。
3.一种产生权利要求1所述的曲张链丝菌素衍生物3和4的工程菌株,为失活stvP5基因的曲张链丝菌素产生菌链霉菌XW-1,链霉菌XW-1的保藏编号为CCTCC NO:M2017417;所述失活stvP5基因的方法为:
对所述曲张链丝菌素生物合成后修饰系统中的P450基因,单独的对stvP5进行选择性失活,获得stvP5基因失活突变株ΔstvP5;
(1)stvP5同框敲除重组质粒pWHU2802:
1)以曲张链丝菌素野生型产生菌链霉菌XW-1的染色体DNA为模板,以stvP5-L-F和stvP5-L-R为引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:8-9所示,在stvP5基因上游扩增出2098bp片段作为stvP5同框敲除同源左臂stvP5-L;以stvP5-R-F和stvP5-R-R为引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:10-11所示,在stvP5基因下游扩增出1928bp片段作为stvP5同框敲除同源右臂stvP5-R;
2)将同源左臂stvP5-L直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP5-L,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点NdeI与PstI将其酶切回收;同样,将同源臂右臂stvP5-R直接连接到pEASY载体上,得到重组质粒pEASY-stvP5-R,经酶切验证和测序验证正确后利用事先克隆进同源臂两端的酶切位点HindIII与PstI将其酶切回收;
3)将上述回收的两个片段同经过NdeI与HindIII酶切回收的载体pYH7进行三片段酶连,经过酶切验证后得到正确的重组质粒pWHU2802,用于基因stvP5的同框敲除;
(2)stvP5同框敲除菌株ΔstvP5的构建:
将stvP5同框敲除重组质粒pWHU2802转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002,以阿泊拉霉素、卡那霉素及氯霉素作为抗性筛选标记进行筛选,将筛选到的经质粒提取及酶切验证正确的转化子ET12567/pUZ8002+pWHU2802作为接合转移供体菌,以曲张链丝菌素野生型产生菌XW-1作为接合转移受体菌,按照上述接合转移方法将pWHU2802导入其中;再利用阿泊拉霉素为筛选标记,筛选到具有阿泊拉霉素抗性的接合转移子后将其进行松弛培养,将松弛培养获得的单克隆经在含有阿泊拉霉素和非抗平板上进行影印培养,筛选到对阿泊拉霉素敏感的菌株,这些菌株为可能的双交换突变株或野生型菌株;利用验证引物CK-stvP5-F和CK-stvP5-R,以其基因组DNA为模板进行PCR筛选和验证,理论阳性扩增条带为1006bp;经PCR筛选和验证正确的菌株为双交换突变株,即stvP5同框敲除菌株ΔstvP5,进一步通过Southern blot分子杂交证实突变株ΔstvP5构建成功;所述松弛培养为在含有1%MgCl2的培养平板上划单克隆培养。
4.权利要求1所述的曲张链丝菌素衍生物3-4在制备抗菌药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述抗菌药物为抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。
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