CN114517175B - 基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因工程菌及其应用。所述基因工程菌为过表达聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomyces narbonensis subsp.josamyceticus);所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因包括:如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第9474‑10607位和/或如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第65176‑66387位。本发明还公开了所述基因工程菌的应用。本发明通过导入与交沙霉素生物合成途径中与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的表达载体,实现了交沙霉素产量的提高(可达23%),并获得了提高交沙霉素产量的基因工程菌。

Description

基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域,具体涉及一种基因工程菌及其应用,特别是一种产交沙霉素的基因工程菌及其应用。
背景技术
大环内酯类抗生素是目前临床上应用十分广泛的一类天然抗生素,这类抗生素的临床应用价值始于1952年红霉素的发现,之后研究人员又陆续发现了麦迪霉素、交沙霉素、罗红霉素、阿奇霉素等多种此类的抗生素。它们的抗菌活性逐渐加强,不良反应也更少。到现在为止,大环内酯类抗生素已有20多种在临床上使用,并且取得了良好的治疗效果。十四元环的大环内酯类抗生素最先被应用于临床,随着缺点的逐渐暴露,临床效果也显著降低。而十六元环的大环内酯类抗生素无诱导耐药性,胃肠道反应小,药物间相互作用少,特别是对一些耐药菌有较好的抗菌活性,交沙霉素作为十六元环抗生素可以作为红霉素的替代药物,弥补其在临床上的应用的不足。
交沙霉素的分子式为C42H69NO15,分子量为828,结构式如下图所示。交沙霉素最早是由日本山之内制药株式会发现的,由那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomycesnarbonensis var.Josamyceticus)经过发酵产生。其抗菌谱与红霉素相似,相比于其他同类抗生素毒副作用较小,无诱导耐药性,与青霉素、链霉素、四环素、氯霉素无交叉耐药性。
交沙霉素的抗菌作用机制与其他同类抗生素相似。都是通过与细菌核糖体上50S大亚基的特殊位点以及核糖体蛋白质的一定部位结合,来从空间上阻碍蛋白质的合成,达到使细菌细胞死亡的目的。交沙霉素对G+菌及部分G-菌都有很高的抗菌活性,常见的菌种有金黄色葡萄球菌、双球菌脑膜炎、溶血性链球菌、淋球菌、支原体、衣原体等。对螺旋体、立克次体及大型病毒也有效。
交沙霉素目前只能通过发酵或者化学合成的方法产生,其生物合成受聚酮合酶基因控制。但是由于交沙霉素的生物合成途径不清楚,难以进行分子水平的研究。为了开拓新的提高交沙霉素产量的方法,确定其生物合成途径尤为重要。并且,现今国内菌种的生产水平不足以在工业上大量生产,这给交沙霉素的产业应用带来了很大的阻碍。因此,必须寻找新的方法以提高其生产水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中缺少交沙霉素高产菌株的不足,提供一种基因工程菌及其应用,特别是一种产交沙霉素的基因工程菌及其应用。所述基因工程菌过表达与交沙霉素生物合成途径中与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因,增加交沙霉素的产量。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的第一方面提供一种生产交沙霉素的基因工程菌,所述基因工程菌为过表达聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomycesnarbonensis subsp.josamyceticus);
所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因包括:如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第9474-10607位和/或如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第65176-66387位。
在本发明一较佳实施方案中,所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第9474-10607位所示。
在本发明另一较佳实施方案中,所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第65176-66387位所示。
较佳地,所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因还包括:如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第16425-17633位和第64467-65132位。
更佳地,所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因还包括:如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第1-1125位、第1118-1447位、第1444-2328位以及第18055-19116位。
在本发明一具体实施方案中,所述基因工程菌含有包含32个基因开放阅读框(ORF)的生物合成基因簇,具体如下:1)聚酮合酶基因ORF18-24;
2)与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因ORF1-3、9、16-17、28-29;
3)与糖基合成相关基因ORF5-6、11-13、15、31和36,共8个基因;
4)与糖基转移相关基因ORF4、14、25-27;
5)与抗性相关基因ORF30;
6)与生物合成调控相关基因ORF7-8、33。较佳地:所述ORF18的核苷酸序列如SEQID NO:1中第19380-32426位所示;所述ORF19的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第32476-38571位所示;所述ORF20的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第38698-43422位所示;所述ORF21的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第43419-50345位所示;所述ORF22的核苷酸序列如SEQ IDNO:1中第50404-55056位所示;所述ORF23的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第55107-56834位所示;所述ORF24的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第56828-60940位所示;
所述ORF1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1-1125位所示;所述ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1118-1447位所示;所述ORF3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1444-2328位所示;所述ORF9的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第9474-10607位所示;所述ORF16的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第16425-17633位所示;所述ORF17的核苷酸序列如SEQ IDNO:1中第18055-19116位所示;所述ORF28的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第64467-65132位所示;所述ORF29的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第65176-66387位所示;
所述ORF5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第3984-4595位所示;所述ORF6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第4648-5730位所示;所述ORF11的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第11246-12676位所示;所述ORF12的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第12758-13789位所示;所述ORF13的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第13773-14651位所示;所述ORF15的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第15835-16434位所示;所述ORF31的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第68653-69633位所示;所述ORF36的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第72469-73032位所示;
所述ORF4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第2555-3874位所示;所述ORF14的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第14678-15838位所示;所述ORF25的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第60940-61653位所示;所述ORF26的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第61818-63041位所示;所述ORF27的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第63120-64394位所示;
所述ORF30的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第66563-68221位所示;
所述ORF7的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第5902-7854位所示;所述ORF8的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第7908-9080位所示;所述ORF33的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第70070-70618位所示。
较佳地,所述那波链霉菌交沙霉素变种的保藏编号为ATCC17835。
本发明的第二方面提供一种交沙霉素的生物合成基因簇,包括32个基因开放阅读框(ORF),具体为:
1)聚酮合酶基因ORF18-24,共7个基因;
2)与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因ORF1-3、9、16-17、28-29,共8个基因;
3)与糖基合成相关基因ORF5-6、11-13、15、31和36,共8个基因;
4)与糖基转移相关基因ORF4、14、25-27,共5个基因;
5)与抗性相关基因ORF30-31,共2个基因;
6)与生物合成调控相关基因ORF7-8、33,共3个基因;
其中,ORF18-24合成交沙霉素的大环内酯骨架;ORF1-3、9、16-17和28-29合成交沙霉素延长单位及后修饰;ORF5-6、11-13、15和31参与糖基的合成;ORF4、14和25-27转移糖基侧链;ORF30负责将合成的交沙霉素分泌至胞外。较佳地:
所述ORF18的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第19380-32426位所示;所述ORF19的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第32476-38571位所示;所述ORF20的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第38698-43422位所示;所述ORF21的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第43419-50345位所示;所述ORF22的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第50404-55056位所示;所述ORF23的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第55107-56834位所示;所述ORF24的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第56828-60940位所示;
所述ORF1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1-1125位所示;所述ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1118-1447位所示;所述ORF3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第1444-2328位所示;所述ORF9的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第9474-10607位所示;所述ORF16的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第16425-17633位所示;所述ORF17的核苷酸序列如SEQ IDNO:1中第18055-19116位所示;所述ORF28的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第64467-65132位所示;所述ORF29的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第65176-66387位所示;
所述ORF5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第3984-4595位所示;所述ORF6的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第4648-5730位所示;所述ORF11的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第11246-12676位所示;所述ORF12的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第12758-13789位所示;所述ORF13的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第13773-14651位所示;所述ORF15的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第15835-16434位所示;所述ORF31的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第68653-69633位所示;所述ORF36的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第72469-73032位所示;
所述ORF4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第2555-3874位所示;所述ORF14的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第14678-15838位所示;所述ORF25的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第60940-61653位所示;所述ORF26的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第61818-63041位所示;所述ORF27的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第63120-64394位所示;
所述ORF30的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第66563-68221位所示;
所述ORF7的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第5902-7854位所示;所述ORF8的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第7908-9080位所示;所述ORF33的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第70070-70618位所示。
本发明的第三方面提供一种制备交沙霉素的方法,包括将如第一方面所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养。
所述发酵培养基可为本领域常规,较佳地,所述发酵培养基包括:80g/L的豆油、20g/L的淀粉、10g/L的棉籽饼粉、0.0015g/L的硫酸锰和3g/L的碳酸钙;所述发酵培养基的pH为7.0~7.2。
本发明的第四方面提供如第一方面所述的基因工程菌在制备交沙霉素中的应用。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
(1)本发明通过在交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomycesnarbonensis subsp.josamyceticus)中导入与交沙霉素生物合成途径中与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的表达载体,实现了交沙霉素产量的提高(可达23%),并获得了提高交沙霉素产量的基因工程菌。
(2)本发明通过对交沙霉素产生菌的基因组分析,获得了交沙霉素生物合成基因簇,并通过正调控基因或限速基因的过表达和敲除验证,绘制了交沙霉素的生物合成途径;对于在分子水平上改造交沙霉素的合成途径(例如中断不必要的次级代谢过程),提高交沙霉素的产量具有积极意义。
附图说明
图1为本发明交沙霉素生物合成路线示意图。
图2为实施例3中ORF9过表达重组质粒构建示意图。
图3为实施例3中ORF29过表达重组质粒构建示意图。
图4为交沙霉素液相图谱;
其中:箭头所示为交沙霉素的产物峰位置;
A为JOS-2-40菌株发酵提取物;B为JOS-ORF9菌株发酵提取物;C为JOS-ORF29菌株发酵提取物;D为JOS-ΔORF19菌株发酵提取物;E为JOS-ΔORF20菌株发酵提取物;F为JOS-ΔORF24菌株发酵提取物。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例中所使用的培养基
TSB培养基:配制时称取3g TSB培养基粉末(美国BD公司,Lot:8053765),用蒸馏水定容至100ml,pH 7.0,按25ml/250ml分装至摇瓶中,121℃灭菌30min。
LB培养基(g/L):NaCl 10,胰蛋白胨10,酵母提取物5,121℃灭菌30min。
MS培养基(g/L):黄豆饼粉20,甘露醇20,琼脂20,121℃灭菌30min。
斜面培养基(g/L):酵母提取物4,麦芽浸粉10,葡萄糖4,琼脂20,121℃灭菌30min。
种子培养基(g/L):葡萄糖10,玉米淀粉10,黄豆饼粉15,MgSO4·7H2O 2,K2HPO4 1,CaCO3 3,pH 7.0-7.2,121℃灭菌30min。
发酵培养基(g/L):豆油80,淀粉20,棉籽饼粉10,MnSO4 0.0015,CaCO3 3,pH 7.0-7.2,121℃灭菌30min。
实施例中所使用的试剂配方
1M Tris-HCl:称取Tris(生工生物工程股份有限公司,Lot:D505BA0021)121.2g,HCl 35ml,加入约600ml蒸馏水,用HCl将pH调至8.0,蒸馏水定容至1000ml,121℃灭菌30min,室温保存。
0.5M EDTA:称取18.7g EDTA-Na2-2H2O(生工生物工程股份有限公司,Lot:D503BA0009),加入约80ml蒸馏水,用NaOH将pH调至8.0,蒸馏水定容至100ml,121℃灭菌30min,室温保存。
TE缓冲液:量取5ml 1M Tris-HCl(pH 8.0)和1ml 0.5M EDTA(pH 8.0),加入约400ml蒸馏水均匀混合,将溶液定容到500ml,121℃灭菌30min,室温保存。
2%CTAB溶液:称取CTAB(生工生物工程股份有限公司,Lot:E718BA0018)4g,NaCl(国药集团化学试剂有限公司)16.364g,量取20ml 1M Tris-HCl,8ml 0.5M EDTA,加入约70ml蒸馏水,再定容至200ml,121℃灭菌30min,室温保存。
实施例1交沙霉素产生菌总DNA提取
本实施例使用菌株ATCC17835,为使用方便,称为JOS-2-40。本实施例的操作为本领域常规,具体包括:
(1)将菌株JOS-2-40接种于25ml TSB培养基中,28℃摇床培养40h,以10%移种量移种于25ml TSB培养基,28℃摇床培养12h。
(2)取2ml培养液12000rpm离心去上清收集菌体,沉淀物重悬于TE缓冲液中,加溶菌酶(生工生物工程股份有限公司,Lot:BCBM4658V),37℃培养30min。
(3)加入30μL 10%(w/w)SDS(生工生物工程股份有限公司,Lot:EA10BA0024)和3μL蛋白酶K(生工生物工程股份有限公司,Lot:F423BAD026),混匀,37℃培养1h。
(4)加入100μL 5M NaCl,混匀,再加入80μL 2%CTAB溶液,混匀,65℃保温10min。
(5)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24/1)混匀,12000rpm离心4-5min,将上清转移到一个新Ep管中。
(6)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25/24/1)混匀,12000rpm离心4-5min,将上清转移到一个新Ep管中。
(7)加入0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀至DNA沉淀下来,将沉淀转移到新的Ep管中,用70%(v/v)乙醇洗两次,100%(v/v)乙醇洗一次,离心,弃上清,室温干燥。
(8)将DNA溶解于dd H2O中,-20℃保存提取的总DNA。
实施例2交沙霉素生物合成基因簇和生物合成途径分析
本实施例对实施例1中提取的总DNA进行测序,确定了整个基因组的碱基序列。对全基因组采用antiSMASH version 5.0.0进行分析,得到了预测的交沙霉素的生物基因合成簇。接下来对所述生物基因合成簇中的基因进行BLAST分析,对簇上的几个关键基因进行过表达与敲除实验,确定其在交沙霉素合成过程中的重要作用,并绘制了交沙霉素的生物合成途径。
所述交沙霉素的生物基因合成簇全簇共有38个基因开放阅读框(ORF),核苷酸序列全长73893bp,控制聚酮合酶基因的阅读框有7个(ORF18-24),包括8个模块,37个结构域,与聚酮合成延长单位及修饰相关的ORF有8个(ORF1-3、9、16-17、28-29),与糖基合成相关的ORF有8个(ORF5-6、11-13、15、31和36),与糖基转移相关的ORF有5个(ORF4、14、25-27),与抗性相关的ORF有1个(ORF30),与调控可能相关的ORF有3个(ORF7-8、33)。未知功能基因有6个(ORF10、32、34、35、37、38)。这些核苷酸序列的具体信息如表1所示,各基因功能如表2所示,聚酮合酶各结构域以及氨基酸的位置如表3所示。
表1交沙霉素基因合成簇中各个基因的位置、大小及方向
表2交沙霉素基因合成簇中各基因功能
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表3聚酮合酶基因各结构域及其氨基酸的位置
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交沙霉素的生物合成途径如图1所示,主要包括以下几个阶段:首先是丙二酰基-CoA、甲基丙二酰基-CoA、乙基丙二酰基-CoA和甲氧基丙二酰基-CoA等聚酮前体物质的合成,涉及ORF1-3、16;然后各前体物质经过PKS催化逐步合成聚酮链,聚酮链经过环化得到一个大环内酯的基本骨架,涉及ORF18-24;再通过添加核苷二磷酸活化葡萄糖,经过脱氧化,还原甲基化等合成糖基侧链,涉及ORF5-6、11-15、25-27、31和36;最后通过各种修饰反应包括酰化、甲基化、氧化、还原、特异性糖加成等得到交沙霉素,涉及ORF4、9、17和28-29。
实施例3制备合成交沙霉素的基因工程菌
选取实施例2中基因簇上两个酰基转移酶基因ORF9和ORF29进行过表达,获得交沙霉素突变菌株,并通过实验证明这两个基因的过表达可以提高菌株生产交沙霉素的能力,说明这两个基因在交沙霉素的合成中起到了重要的作用。具体如下:
根据上述编码基因,以及上下游序列设计引物,并在其中插入酶切位点。引物序列如表4所示:
表4基因过表达实验所设计使用的引物序列
如图2所示,根据本领域常规技术,利用设计好的引物经PCR从基因组上扩增ORF9和ORF29两个基因,将扩增的基因片段经同源重组与链霉菌整合型载体pSET152连接,构建成为重组质粒,将重组质粒转化进入大肠杆菌甲基化缺陷型菌株ET12567/pUZ8002中,再经过接合转移转化进入交沙霉素产生菌中,经抗性筛选获得基因过表达的工程菌JOS-ORF9和JOS-ORF29,选择阳性的接合子进行发酵验证。
工程菌JOS-ORF9、JOS-ORF29与出发菌株JOS-2-40的发酵产物经HPLC检测后验证的结果如表5所示,相比于出发菌株JOS-2-40,ORF9基因过表达的工程菌发酵产物中交沙霉素的产量提高了23%、ORF29基因过表达工程菌的发酵产物中交沙霉素的产量提高了15%,表明这两个酰基转移酶的过表达可提高交沙霉素的产量。
表5交沙霉素基因过表达发酵单位对比
实施例4通过基因阻断验证基因功能
选取实施例2中基因簇上聚酮合酶的几个基因ORF19、20、24进行基因阻断实验,获得突变菌株,并通过实验证明这些突变菌株可使交沙霉素的产量发生变化,或者不再产生交沙霉素,说明这些基因是交沙霉素合成过程中的必须基因。具体如下:
根据上述编码基因,以及上下游序列设计引物,并在其中插入酶切位点。引物序列如表6所示:
表6基因阻断实验所设计使用的引物序列
根据本领域常规技术,利用设计好的引物经PCR从基因组上扩增相应的同源片段,采用相应的酶切位点,并插入筛选标记抗性基因,连接到链霉菌温敏型质粒载体pKC1139上,获得含有同源基因的重组质粒,经接合转移转入交沙霉素产生菌中,培养后单菌落分离获得含同源片段双交换的基因阻断菌株JOS-ΔORF19、JOS-ΔORF20和JOS-ΔORF24。
发酵实验及对产物的HPLC检测发现,聚酮合酶基因被破坏后,菌株不再生产交沙霉素,说明本发明提供的交沙霉素基因合成簇参与交沙霉素的合成。
效果实施例1交沙霉素产生菌JOS-2-40基因突变菌株发酵及产物活性检测
对实施例3和4中的JOS-2-40基因突变菌株JOS-ORF9、JOS-ORF29、JOS-ΔORF19、JOS-ΔORF20和JOS-ΔORF24进行发酵及产物活性检测,采用本领域常规技术,具体包括:
将单菌挑至斜面培养基,28℃培养7d,挖块接种于装量为25ml培养基的250ml的锥形种子瓶中,28℃培养2d,以10%(v/v)接种量转接至装量为25ml培养基的250ml的锥形发酵瓶中,28℃培养7d,得到发酵液。
样品的处理:取200μl发酵液,加入800μl甲醇,超声震荡30min,12000r/min离心5min,取上清液用0.22μm滤膜过滤,得到的样品通过HPLC进行检测。
HPLC条件:色谱柱为反相柱(填料为Hypersil ODS C18,4.6mm×150mm);柱温为30℃;检测波长:232nm;流速:1ml/min;进样量:20μl;流动相:甲醇:0.02mol/L KH2PO4(pH 3)=60:40。
以交沙霉素标准品(上海源叶生物科技有限公司,货号:S24061)作为对照,对突变株发酵产物进行验证,结果如图4所示。
由图4可知,聚酮合酶基因(ORF19、20和24)被破坏后,菌株不再生产交沙霉素;相比于出发菌株JOS-2-40,ORF9基因过表达的工程菌发酵产物中交沙霉素的产量提高了23%、ORF29基因过表达工程菌的发酵产物中交沙霉素的产量提高了15%。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海医药工业研究院
中国医药工业研究总院
<120> 基因工程菌及其应用
<130> P20016256C
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 73893
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 交沙霉素生物合成基因簇
<400> 1
tcatcccgcg gtcgccaacg cgtgctggga cagcatcagt tcgcagatct cgctgctgcc 60
ctcgatgatc tccatgagct tggcgtcgcg gagcgcccgc gccaccgtgt ggccgtcgcg 120
ggagcccgcg gaggccagca cctgcaccgc cctggccgcg ccgcgcgcgg cgccggtggc 180
ggcgacgtgc ttggcgagga cggcggcggt caccatgtcc gggctgccct cgtcccacag 240
gtcgctggcg tgctcgcacg cccggcgggc gctctgctcg gcgacgaaca gctcggcgag 300
gtgccgggcc acgagctggt gctcggccag ccggacgccg aactgctcgc gcgccttcgc 360
gtgccgggcg gcggcggtca ggcagccgcg caggatgccc gtacagcccc aggccacgga 420
catccgcccg tagccgagcg ccgtggtgac gagcagggcc ggggtgcggt ccaccccctg 480
gagcagggcg tcggcgggca gccggacccc gtccaggcgg atgtcggcgt ggccggccgc 540
gcggcagccg agcgggtcgt cgatccgctc cacgcgcacg ccgggggccg acgccgggac 600
caccacggcg cccgcgccgt cgtccgtgcg gccgaagacc acgagcaggt ccgcgtacgc 660
ggcgttggtg gtccacacct tggcaccgtc gacgacgacc tcgtcgccgt cgcgggtgat 720
gcgcgtccgc agggcggaca ggtcgctgcc cgctccggcc tcgctgaagg cgacggcggc 780
cagttccccg ccggtgagcc gggggacgag cgccgcctgc tgcccggggc cggccagccg 840
gcgcagcgtc caggcggcca tgccctgcga ggtcatcacg ctgcgcaggg agctgcacag 900
cgtgcccacg tgggcggtga gttcaccgtt gcgcctgctg gagaaggcca ggccgccgtg 960
ggccgccggc gcctgggcgc acagcaggcc cttggcgccg aggccccgga gggtgtcgag 1020
cggtatccgg cccgtacggt cccactccgc ggcccggtcc ccgaccagtt cggtgaacag 1080
ctcctcgggc cacaggtccg tcccgccggc cgtcgcctca ctcaccggcc gtggtcccgg 1140
ccgcggcggc ggcccgcgcc ccgcccagct tgtggacgag ccggaccatg gcgtccaccg 1200
tgcggaagtt gtcgagcatc aggtcggcgc cgctgatggt gacgccgtag gtcttctcca 1260
ggtgcacgac gagctgcatg gcgaacagcg acgacatccc gccgacggcg aacaggtcct 1320
ggtcgcgctc ccacgtcgtc ctcgtgcggg cggcgaggaa gccgagcagc tcgtcggcga 1380
tgtcgccgcc ggccgcgtcc ggtcccgtcc cggtggcgga gcccgcctgg tcggaggtct 1440
tggtcatggc gtgatctcct cgtattcgta gaatccccgg ccgctcttgc ggccgagctc 1500
gccccgccgg accttgtcca gcagcagttc gctcgggcgg aaggcctcgt cgccggtcct 1560
ctcgtgcagc acccggagcg agtcggcgag gttgtccagg ccgatcaggt ccgcggtggc 1620
cagcgggccg gtgcggtggc cgatgcagtg gcgcatcagg gcgtccaccg tctccggcgc 1680
ggcccgcccc tcgcgcacca cctcgatcgc gtcgttgagc atccggtgca gcaggcggct 1740
ggtgacgaag cccggcccgt cgcccacgac gatgccctcg cgccccagcc cggcgagcag 1800
ttcccggacg gccgtggccg cgccggcgcc gctgcgcggg ccgaggatca cctccaccgt 1860
ccggatcagg tacgccgggt tcatgaagtg caccccgacg aggtcctcgg ggtgcgggac 1920
ggcgtcggcc atctcctcga tgggcacccc cgaggtgttg ctcaccagaa gggtgccggg 1980
gcgcaccgcc gccgcgagtt ccgcgagcac cgcggccttc tccttggggt cctcggtgac 2040
cgcctcgatc acggcggccg ccccggcggc ggcgtccggc gtccccgcgg tggtcagctc 2100
gccgagccgg ccgcccgcgg gcagcgcgcc catcatccgg gccgtgcgca ggtgcagtgc 2160
gatccgctcg ggggcggtgg cgcacgcctc gggggagtgg tcgatcagtc cgaccgggtg 2220
gccgtggccg acggcgagcg cggcgatggc cgtgcccatg acgccggcgc ccaccacgac 2280
gagcgggtcc tttgcggtgt tgtcggtgtt gtcggtgttg tcggtcaccg gacctccctg 2340
ttccccgggg cgccgacgaa aaagggggga cgcctccggc aagtgccctc tcccgggcgc 2400
cattcacagc aacaattcgg gattctctcc cggggcattc gcgtgatcca tgaatccgga 2460
agggactgtg tcatctcacg gcgagggccg tgccggagcc cgcgggaatg gattacgagc 2520
aggtcgtacg ggatttgcgc ggcggccggg aactatgtca tctcacgctt gccctattcc 2580
cgggccgccg cttagcgtgc gcccctccga ccccgcctgg gcgtcattca cgtggaccgc 2640
accctatgaa gggtttcgca tggctcatat cgcattcttc atcctgcctg tcgccgggca 2700
tgtgaatccg acgctgggcg tggccgagga gctggtcgcc cgcgggcacc gggtgaccta 2760
cgccctgccc gaggggatcg cggaccgcgc cgtgcgggtg ggagccgacg tcgtcacgta 2820
cccgctggac aaggagcggt tcctcgcgca gatggtgccc cggcaggacg ccgacgccta 2880
tacggacgag ggtgagttcc tccgggtgct ggagtggctg ctggacatga cccgcgcgac 2940
gctgccgctg ctggagccgc acttcgccgc ggaccgcccc gacgtgatcg tcaacgaccc 3000
gtcctcgctg tggacgggcc ggctgctcgc cgaccgctgg gacatccccg tcatccgcag 3060
cacgccgacc tacgcggcga acgagcactg gtcgctgcat ccgcccgtcg actcggccga 3120
gccgccggac gaccccgaac tgcacgagct gctggcgcgg atcgggcggc tgctggagga 3180
ggagggcgcc aagggtgacc tcgccgcctt caccgaggtg ctccacggcg ggcccgccct 3240
gctctacatg ccgcgctcct tccagtacgc gggcgacacc ttcgacgacc ggcaccactt 3300
cgtcggcccg tgctcgccca aggccgcctt ccacggcacc tgggagccgc cgctcgacgg 3360
caagccgctg gtcatggtga gcctgggcac gctctacaac gagcggccgg agttcttccg 3420
cacctgcgtc gaggcgttcc gcgacgagcc gtggaacatc gtcctggtgc tcggcggcgg 3480
cctcaccccc gagcagctcg gcccggtgcc cggcaacgtc caggtgcacg acttcgtccc 3540
gcacggcgac gtgctgccgc acgcctccct cgtggtgaac cacggcggga tgagcacggc 3600
catggacgcc ttctcgcacg gcgtcccggt ggtggcggtg cccgtgatgc ccgagccgcg 3660
ggccacggcg cgccggatca ccgaactcgg gctcggcgcg atgctgctga cctccgaggt 3720
gacggccggg accctgcggg acaccgcgcg ccgcgtgctg gccgaccccg gcgtccacga 3780
ccggctgcgc gcgatggggg agcggatccg ggaggccggc ggcccggccg cggcggccac 3840
ggccgtcgag gggctgctcc cggccgggac ctgagggacg gaccgggcgg gacggcggcg 3900
cgcccgcccc ctcgcccggt ctccccttcg cacgtccctc cccgccgccc gcccactccg 3960
accaccggga tgacacacgc atcatgcgca tcaccgaaac ggccgtccgc gacgcgtacc 4020
gcatcgaccc ggaaccgatc cccgaccacc gggggcgctt ctacgagggg ctccgccaca 4080
gcgcgctgcg ggcggccacc ggtcacgcct tccaggtcag gcaggtcaac ttcaccgtct 4140
ccgggcgcaa tgtgctgcgc ggcatccacg gcaccacgat gccgcccggc caggggaaga 4200
tcgtcacctg cgtgcggggc gccgtgcgca ccatggtcgt cgacctcagg ctgggctcgc 4260
cgaccttcgg gcaccacgac accctccggc aggacccggg ctcgggcacc gccgtgtacc 4320
tccccgacgg cctcggcctc ggctacgtcg cgctcgccga cgacacctgc gtgaactacc 4380
tgtgcacgga ggagtacgcg cacggcacca tcatcgacgt cgacgccctc gaccccgccc 4440
tggcactgcc ctgggacctc gcggaacccc ccgtgcggtc ggccagggac gcggccgccc 4500
ccaccctcgc cgccgccgcg gccgccgggc tgctgcccac gtacgaggag tgcctgcggg 4560
cgtaccggag ggatccggcg cctccctccc gctgagcgcg gacggaccca ccgaaggctc 4620
gtacggaccc gaccggaggc gaaggatttg agacaccgga cccggcccgc cgccatgctg 4680
gaggccgagg gcgtctccct gtgcgcggag gggctgaccc gggagccgga gtgccccggg 4740
cggctggcgg agctgatggc cgagaccggc ctgtgcggcg cctcctcgcg gctcgcggcc 4800
gtcaccgagg gcgtccgcag gggcggcgcc taccgggagc acctggccga cctggcggtg 4860
cgccaggtgc ccgtcggcga ggccgtgcgc ggcctgctga gccgggacgc gcgagccgcc 4920
tgcgactcgc tgctggcgct ccaccgggac agcggcggcc gcagcggctg ggtgttcgtg 4980
cccctggacc cgtacgcggg cggccggcgc gcggtggcgg aggccgcggc cacgcgctgg 5040
gcggtcgacc gccccaacct ggtgctcggc acccatctcg cggccggcgg ggcggggctg 5100
atcagtgatc tgctggcccg gggcatcggc gtcgacgtgc ggtcggtgtt ctcgcccgag 5160
cagttcgaca cggtcttcgg gatgtacctc accggcctgg agcgggcccg ggacgcgggg 5220
cacgacctca ccgggatcca ctgcgccgtc tccttcccgc tgcgcgtgct ggacgagacg 5280
atcgccgccc ggatcggcgc cgcggcccgg cggcgggact gggcggtggc ggtcgcccgg 5340
ctggcgcacc accgccgcga ggagctgatg gccggcaccc gctggcgcgc cctgaccagg 5400
gccggggcca ggccgctgca cttcgtgtgg tcctcctacg gcgcgccggt gccggagggc 5460
gtgcggtaca tcgaggagct ggtggcctgg aacagcgtct cctcggcggg gctcgacgtg 5520
ctgcgcgcgc tgggcagccg cgcggcgctg cgcggcgaca ccgtcagcgg catggaggcg 5580
gcctcccggg acgtgctggc cgcgctcggc cgcgcggggg tcgacatccg ggccgtgggc 5640
gcggagttgc aggagacaca gctcgcggcc gcccgcgccg aatggacaga gctgcacagg 5700
acggtcgagg ccgccctgaa gtacgtctga cggatttttc cggcgagccg cgcggagcga 5760
aggcgggcga aagggaaacg ggtccgcgaa acggttgcca acggctcgtg tgcggtggca 5820
aattgtgctg gacgcgtcca ccggaggtgt aataacctgt tctttaattc gtaaagtctc 5880
gagacggggg cactctacgg catgagcggc ctggattctc gtgacgaggc ggacggggaa 5940
aaacaggcgg aggacgctct cgccttcctc gaattcgtcg cccgtaccgc cccgagaggc 6000
gaatacgacc ggctcatggc gcgggccgag cgcgagggcg ccagcgagac gcggatgcgc 6060
cgcctggagc ggttcaaccg gctcgccctc accgcccagt cgatgatcga gtaccgccgt 6120
gaccgcgagg ccgagctcgc cgccctcgtc gacgccgcgc acgaattcgt cggcgcccgg 6180
aacgaccggg aactcctcga ttccgtcacc cgccgcgccc ggctgctcct caaactggac 6240
gtcgcctaca tcagcctgca caaggacggc gaggacgaca cggtcgtgca gagcgccgac 6300
ggcgccgccg acgccctcac cgtgggcttc cgggtcccct ccggcggcgg cctgggcagc 6360
atggtgcgcg cccgccgcgc ccccttctgg acctccgact acctggccga ccccagcatc 6420
ccgcacgacg acgcgatcga cgacctcgtc cgcgccgagg gcttacgcgc catcctgggc 6480
gccccgttac gggtgggcga ggaccacatg ggcgtcctct acgccgccga ccgccagatc 6540
cgccacctca cccccaacga ggtgacgctc ctctgctcgc tcgccgacct cgccgccgcc 6600
tccctggagc gcatacgcca gatcgaccgg ctccgcgagg acaacggccg gctgcgcgag 6660
gaggcgtggg aggcccgtac ggccctcgcc gacacccgga gggcggcgga gctccagtcc 6720
cacctgctcg ccctcgtgct caacggccgg gggctcgacg ccctgttgtc gaccgccgcc 6780
gaggccctcg gcggcggggc gggcgtctgc ggccccctcg gggagaccct cgccgagcac 6840
ggacggctgc gccggctcgc ccgcgccgac gtgcgctccg cctgccgcac cgccgccgac 6900
accggccggc ccgtccccgt gcagtccgga ttctgggtgg tcccgctcca accgggcgcc 6960
cgggacgccg ggttcctgct cgcggacctc ggccgcgagt ccggccacgg cgccgtcccg 7020
atgctcctcg tcgtctcccg ggcctgcgcc ctgcacctgc ggatgcagcg cagcgacgcc 7080
cccaaggacc gcggctgcca ggagttcttc gacgacctgg tcggcgcgcc gcgctcgccc 7140
gaactccagc gcgagcgcgc cctgatgttc tccctgcgct tccgccgccc gcatgtcgtc 7200
ctggtcgcct ccggccccaa gcgcctcggc cccctcttcg aggcccacgc cgcggcctac 7260
gcccaggagc gcgacggact gtgcagcgtg cgcgacggct ccgtcgccct gctgatcccc 7320
ggtgacgacc ccgtcgccgc gggacagacc gccaccgagg agctctccac actgctgggg 7380
cacccggtga ccgtcggcgc cgccggaccc gccaccaccg tcgacgccat cggcgacgcc 7440
caccgcgagg ccgcgcagtg cctggagacg ctccgcgccc tgggtggtga cggcggcacc 7500
gcctgcgcct ccgacctggg gttcctcggc atgctcctgg ccgaggagaa cgacatcccg 7560
ggctacatcg accagaccat cggccccgtc gtcgactacg acacccaccg cttcaccgac 7620
ctcatcccca ccctgcgggt gtatctggag gccggccgga gccccacccg tgccgcggag 7680
accctgcgcg tccaccccaa caccgtgtcg cgccggctgg agcgcatcac ccagctcctc 7740
ggcgaggagt ggcagaatcc cgagcgggtg ctcgacatcc agctcgccct gcggctctac 7800
caggtgcgct ccgcgctgtc ctcgcgccgc gccttccggg cgctgcccga ctgacccggg 7860
ccggccccgg cccggggtgc ccgcaccccg ggcgccccgg ccgggcgtca gacggcgacc 7920
ggcgcccgga ggcaccccgc gccctgcgac agccgcagcg cgtgcgcgat cgacgccagc 7980
gtcacatgcc ggtgccaccc ctggaacgaa cgcccctcga agtcacgcat ccccaccccc 8040
acgctcaccg ccccgaaatc ggcgtccacc cggtcggtca gcatggccag ccgcagcagc 8100
gggccccgcc cccaggaggt gaggtcggtc agccacaggt ccgcggggcg gcggcggttg 8160
gcccgccaca cccccatcag cagcagcgtc cgctgcggca gcagaccggg cagcaccacg 8220
ggcagcggcg tgacgaaact gaccgaacca tggcactcca ccgggtggct cagccgcttc 8280
acctgttcca tcagcgcctg cgcgggggac gtcgcgggcc gcctgtcgac ctgcacccgg 8340
ccggcggccg gcgccagcgg cagctccgcc cccacccgca gcatgaacgg caggcccgcc 8400
gaggtcagcg tgcgcaccag cgacagcggc gcggccgccc gtgcgtccat caccaccggc 8460
cgggccaccg tacgggtctc ctgtgcgatc tccgccacca ggtggacgag ttcctcctcc 8520
tcgccccgcg tgccgagcgg tcggcccgga tcgccgtccg gtcccccgcc cagcgtcaga 8580
tgccaactca cggggaccga cagcgcgtcg gacgccagcc ataaaccgtg gctgcgctgg 8640
caggtcatca cccgtcccag gtccgggacg aaccgccgcc gcacaccgac cgagttcgcc 8700
ccggtcttgg acaccaccat cggccgcacc acccaggcgt ccgggcgcag gaagtcgtcc 8760
gcgtaacggg ccagcgccgc gcggaccggc cgccagtccc aggtcgacgc ggccacgaag 8820
tggtgcaggc tctgcgccgc ggccccctcg cccacgaagc tggccaggtt gcgggcggtc 8880
ttgcggccgc tggcggtgag cagcccgcgg acgtactgct cacccctcct gcgctggtcg 8940
gcgcggcgca gcgagcccag cagctccgca caggttccgg tgacgagcga atcgaagtcc 9000
gggtccccga cgggaccggc cggggaaaac gagggttcag ggtcgaacgg agcagtgatc 9060
atcgagatcc cccacagcac tgtgaatttc ccggtaatga gctgtggagc agccttgcgg 9120
aattccgggt gcgctcccag ataagcggat cacactcttc ctgccccttc cggccacgac 9180
cgaccgttcg gcccgacggc ccctccggcg gcccggaagg cggtgacgag cccaccggtt 9240
ccggcccgga gccggtgatg atccaccaca tcgcgctgcg ccgtgccaca ccggcgccac 9300
gttcggtgat atcgggcggt gcgcgggaac ggcccggcgg ataccgccgc cactgtgtca 9360
gctatgcctt gtcggccccg gcacccatgg cctagaaatc cccgaccatc cacgcttcgc 9420
ccgtcccgag gaatcccatg cccttgccga aacacctgcc gtcactcggt gggatgcgtt 9480
tcatcgcggc cctcacggtg ttcaccgcgc atatcgccgc gcagcccatc ttccggaact 9540
ccgagatcaa tacgaaggcg caggtcccgc tgaacgtgct gggcccgtac gcggtctcgt 9600
tcttcttcat gctcagcggc ttcgtcctca cctgggccgg cctgcccgac aaatccctga 9660
ccgccttctg gcggcgccgg gtgacccgcg cgttctcgct gcacctgccc atgctcctgg 9720
tgacgctcgc gatcgtgctg tggctccagg aaccgagcat gggccggtcc gtgtgggacg 9780
ggttcctgac caatctcttc ctcgtgcagg cgtggttccc ggacttccac gaatacgcca 9840
gcatgaatcc ggtggcctgg tcgctctccg ccgagatgct gttctacgcc gcgttcccgt 9900
tcctgttccg cgcgctctcc aaggtgcgcg tcgaaaggct ggggaaatgg gcggtctgcc 9960
tggccgtcgc cgtggtggcg gtgccgtccg ccgccctgct gatgccctcg gacccggcgc 10020
tgccctggga cgccgggatg ccggagatgc agtactggtt catctacgtg ttcccgccgg 10080
tccggctcat ggagttcacg ctcggcatcg tcatggcgct gatcgtgcgg aacgggcgct 10140
ggtcggggcc gaagcccccg gtctgcgccc tggtgttcgg cgcgctgtac gcggtctcgt 10200
tcgcgctgcc ggactggctg ggccgcagcc tggcggtccc ggcggtcgcc ctgctgctcg 10260
gctcgctcgc cgcgggcgac gtgcgcggcg cccgctcgcc gctggcctcg aagacgatgg 10320
tgctgctggg cgaactcacc ttcgccttct acctcgtcca ctacctcgtc atccagtacg 10380
ggcaccgctt cctcggcggc gagctgagct actaccgcca gtgggacacc ccggccgcca 10440
ccggcctcac ggtgctcgcc ttcgcgctga gcctcggcct cgccgcgctc ctgcacttct 10500
tcgtggagaa gcccgtcatg cggaccatcg gccggccgcg gcggcccgcc cggcccgccg 10560
ccgaccccgc cccgcggtcc ggcccgacgg cgcccgccgc gaagtagcgg aggcggacgg 10620
gggccgggaa gacggacgtg gggggcgcgc cggacggcgc gccccccacg ggtcgttccc 10680
ccgccgctac ggcgggttca gctgttgagg aaggtgttcg accccgcgat gatcttccag 10740
ccgtcgtcct cccgggagat gacgtacagc ggggcgccct tggggccctc gacgggctca 10800
ccggcccgcg tgaccggggt ctgcacgacg ttcacggcga tgacgtcggg ccggacgggc 10860
agcagcccgg tcacctcgta gcggacgaac tgctcggcca gcaccggcag cacgcgccgc 10920
gcggcctcgg cgatggcctc ccggccccgg ctgacgtgac ccatcgcgtt ggtccaggag 10980
gcgctccgcg cgtactgctc gcccagggcg tcggcgtcgt gggcgttgaa ggcgtcctcc 11040
agcgcctgca cgaccccgcg cacggccttc tcgacctcgg gggtgagcac actctccgcg 11100
ctgccggtaa ctgacatgag gaccaccgct ctccatcgac cgatacattc cgccgacccc 11160
gctcccggtt ccggcaccgc ccattcgaca acctcgacca agatcgaggt caaggggatg 11220
tgaccgaacc gtcagtaggc ggttctcagt acgcggcgtg cgcgcaggcg atcagggtgc 11280
ggagctccac attgaggtag tggccgtgcg cgagcagctc cgtgagctgc ccgaacgtcg 11340
cccaacggaa gcccggcggg cagtccacgg gcagctccgg gccggcctcg atcaccaggt 11400
agcgggtccg cgcgtggtag aagcggccgc cctcctccga ctggaccgcg tcgtagcgga 11460
tccggtccgg gccgctggcg cgcacgtagt ccaggtacgg gacagcggcg gcgccgggac 11520
cggccgtacg gtgctggacg gtcgggccga actccgccac gttcagcgtc ccgacgtccg 11580
agcgcgccgc caccagggcg tgcagcaccc cgccgatccg ccgcacggcc agcgcggcca 11640
gcccctgcga gcagggccgc agcagcggct gcgtccacga cgccacctcg cgccgctccg 11700
cggtgacccc caccgccatg atctcgaagc gccggccgct gcggtgccgg atcgcgctcc 11760
cgtcccgccg ccacccgtcc tcgtacgcgc gctccagcgg gacgctctgc tggcgcagca 11820
cccgcagcgc ctggacgtcg gtgaggcagc tggtgaccgc gtgcaggtcg tgccgcggcg 11880
tggggtcccc gtagaaggac cgccgcagcg cggccccgaa gccctcgccg tcgtcaccgg 11940
gcgcggcgtg cgcggtcggc aggcaggcca gcacggaccg ggtgtccatg ttgacgaggt 12000
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cgctcaccgc cggcatcgca cgcgaactca ccgtacgagg agcggacgtc cacaccctcg 25200
tgcttcccgc gggcgccgac cgggacacgg ccgtccggct gctgcgggaa gccggtgacc 25260
cggccgcgcg atgcgcgcgc gtcctgtggc aggccccggc cgatcccggc ccggccgacg 25320
cggtggcgct cctccaggcc ttgggcgagg ccgggcccgg tgccgccccg ctgtggatcg 25380
ccacgcgcgg cgcggtggcc gtcggtccgg gtgagtcgcc gtcgcccgcc ggcgcgcaga 25440
tctgggggct gggccaggtc gcggcggtcg agctcggcca ccgctggggt ggtcttgtgg 25500
acctgcccgc cgaacccgcc gccgccctcc gcgccctcgg cggggtggtc ctcacggaca 25560
cgcgggcgag cgcccacgcc cccgagaacc agatcgcggt acgcgcctcc ggcgtccacg 25620
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ccgtcctgat caccggcggc accggcgcgc tcggcgccca ggtggcgcgc aggctcgcgc 25740
gcgccggggg accgcacctg ctgctgaccg gccgccgggg cccggacgcc cccggagcgg 25800
cccggctggc cgaggaactg accgcgctcg gcgccggcgt caccgtggcc gcctgcgacg 25860
tcgccgaccg ggcggagctc gccgcactcc tcgccggcat ccccggcgac cggccgctga 25920
ccgccgtgct gcacgctgcc ggtgtcctcg ccgacggtgt catagacggg ctcacccccg 25980
ggcggatcga cgccgtcctc cgggcgaagc tcaccgccgc cacccacctg gacgacctca 26040
ccgccgggct cgccctcgac gccttcgtgc tcttctcctc ggtcgtcggg gtgtggggca 26100
acggcggcca ggccccgtac gcggcggcca acgccgccct cgacgccctc gcgcaccggc 26160
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tcgccggggt ggactggacc gccttcgccg gaccgtcggc cccccggggg gcctgggcgc 26400
tgttcgacgg ggtcccggcg gtccgcgccg cccgttccgc cgccctggag acggcccgta 26460
tggctcccgg caccgccccg gccggtgaac gcgcccggct gtcggggagc ctcccggaga 26520
aggaacgccg gcgggaactg ctcgacctgg tgcgtacgga ggccgccctg gtgctccggc 26580
gccgctcggc ggcctcggtc gacccgcggg ccgcgttcaa ggccagtgga ttcgactcgc 26640
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cgccggacgc cctctgggac ctgctcgcca ccgggaccga cgcgatctcc cccttcccgg 26940
ccggccgcgg ctgggacctc gacgggctct acgacccgga cccggacgcg ccggggaaga 27000
cctacgtgcg ccagggcgga ttcctgcacg acgcgggtga cttcgacccc gagttcttcg 27060
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cctgggaggt cctggaggac gccgggatcg tgccggagac gctgcgcggc acccgcaccg 27180
gagtcttcgc cggcatctcc cagcaggact acgccgggcg gatgcacgac tccgccgaca 27240
agtacggcgg ccacatgctc accgggaccc tggccagcgt gatctcgggc cgggtcgcct 27300
acacgctggg gcttcagggt ccggcgttga cggtggacac ggcgtgttcg tcgtcgttgg 27360
tggcgttgca tctggcggtg cagtcgttgc ggcggggtga gtgtgatctg gcgttggtgg 27420
gtggggtgac ggttttggcg tcgccgacgg tgttcgtgga gttttcgcgg cagcgtgggt 27480
tggcggtgga tggtcggtgc aaggcgttcg cggagggtgc tgacggtacg gcgtggtccg 27540
agggggccgg ggtgctgttg gtggagcgtt tgtcggatgc gcggcgtaat ggtcaccggg 27600
ttctcgcggt cgtacgggga tcggcggtga accaggacgg tgccagcaac ggcctgaccg 27660
ctcccagtgg gccggcgcag cagcgggtga tccgtgaggc gctggccgat gcgggtgtgt 27720
ccgcgggtga ggtcgatgcg gtggaggcgc acggtacggg tacggcgttg ggtgatccga 27780
tcgaggcggg ggcgttgctg gcgacgtacg ggcgggagcg cccgggtgag ccgttgtggc 27840
tgggctcgct gaagtcgaac atcgggcatg cccaggccgc cgcgggtgtg gccggtgtga 27900
tcaagatggt gcaggccatg cggcacgcgc agttgccccg gacgctgcac gtggacgccc 27960
cgtcgtcccg cgtggattgg tccacaggct cgctgcgcct gctgaccgag tcccgggcgt 28020
gggaggcgcg ggcggaccgg ccgcgtcggg cgggtgtctc cgcgttcggt gtcagcggga 28080
cgaacgccca cgtcatcgtc gaggaaccgc cggccgaagc ggagacggcg cccgcgaccg 28140
agcccacgcc cggggcctct ccggtcctgt cgtggccggt gtcggcgcgc acggaaccgg 28200
cgctgcgggc ccaggcggcc cggctgcgcg accacttggc gcacatggac gacgccgacc 28260
cccgggacat cggccactcg ctggccgtca cacgtgcgtc gttcggtgag cgggcggtgg 28320
tgctggggcg tgacggtggg gagttgctgg cggggctgga tgtgctggct gccggtggtg 28380
agatgcctgg tgcggtggtg cgggggactg cggtgcgggg gagtcgtgtc gctgtgctgt 28440
tcacgggtca gggtgcgcag cgggcgggga tggggcggga gttgtatgcc tcggatccgg 28500
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ccgatgtggt cttgggtcat tccgtggggg agattgccgc tgcttgtgtg gcgggtgtgt 28740
tctcggtggc ggacgcggcg cggttggtgg tggcacgtgg ccggttgatg ggtgcgctgc 28800
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ccgtctccca cgccttccac tcggcgctga tggaccccat gctggagaag ttccggcagg 29040
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aggcaccgct cctcgtgccg accctccgcc gcgaccatcc agagccggag gccctggccg 29340
ccgccctcgc cactctccac acccgggtcg ccgagctcga cggtgccgcc gtgtacgggc 29400
acgccgacgg ccggcgcgta ccgctgccga cgtacgcctt ccagcgccgc acctactggg 29460
cgtccggttc ggcccccggc cacggcaccg ccgccgcggc ccacttcggg ctggtctgga 29520
aggaccaccc cttcctcacc ggcgagaccc cgatagcggg ctccggtgcg acgctcttca 29580
ccggaaggct gtcgctcgcc gaccacccct ggctggccga ccacgccgtg tccggctcgg 29640
tgctgctccc cgggacggcc ttcgccgatc tgctgctgcg cgtcgccgaa gaggtgggcg 29700
cgggcgcggt cgaggagttc gacctccgcg cgcccttggc ccttccggag cgcggtgcca 29760
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ccgcgcgtcc ggagcacccg ggcccgtacg gcgaggagcc ggagtggacc gagcacgccg 29880
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ggccgccgcc gcgcgccgag aaggccgacg tggacgagct gtacgagggc ttcgcggcag 30000
gcggttacgg ctacgggccg gcgttcaccg gactgacggg ggtgtggcgc cgggggaccg 30060
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ccggttccga caccctgcgc gtccggctgg ccccggcgcg ggacggcggc gccttctcgg 30300
tgcatgccgc cgacacgacc ggtgcgcccg tcctcgccct ggacgcgctc accctgcgcc 30360
cggtcgccct gggcccggac gaggcaggac ccgccccgat gtaccgggtc gactggcgtc 30420
ccgtgccgtc gccggggccc ggtgcccccg cgacggcccg cacctggccg gtcgtaggag 30480
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cgtacctccg ccgcggcctg tccctcgtgc aggagtgggc cggggacgaa cgcctggcgg 30720
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acctcgcggg cgccgccttc tgggggctgc tgcgctccgc ccaggcggag tacccggacc 30840
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ccgcctgcga cctggcggac cccgccgacg tcgggaagac ggtcgccgcc gtcccgcccg 31260
agcacccgct caccgccgtc gtgcacaccg ccggcgtcct cgacgacggc gcgctcgccg 31320
gtctgacccc cgagcggatc gacaccgtcc tgcggtccaa ggccgacgcc gtccgcaacc 31380
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gactgctcgg ccgcccgggg caggcgtcct acgcggcggc caacggcgtc ctcgacgcgt 31500
tcgcccggac ccggcgggcg gccggactcc cggcggtgtc cctggcctgg gggctgtggg 31560
acgaacggga cggcatggcc ggaggactgg acgacgtggc ccgccaccgg ctgcgccgcg 31620
agggcatcgc gcccatgccg cccgcgcagg gcctcggact gctcgaccgg gccctggccg 31680
cgcaccggga cggcgacggc cccgccgtcc tcgtaccgct gctgctcgac aggcccgcgc 31740
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tccgcaaccg gctcggccgc ctcgtcggcc tcaggctgcc gaccacgctc gccttcgacc 32100
gccccacgcc gaaggagatg gcggagtggc tcgacggcga actgccccgg ccggccgccg 32160
gcgcatccgt caccgacgcg cccgacaccg ggtccgtgct ggacggcatc gagcaactgg 32220
cgcggaccgt ggccctgatg gacgcggacg acggcctgcg caccgacgtc cgcgagcggc 32280
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tcgccttcct ggacgagcag ctgtgaccgc cccgtggacg accgacgacc gcacgccgag 32460
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tacctggtga acggcagcgc gggcagcatc gcctccggcc gggtcgccta cacgctgggg 33060
cttcagggtc cggcgttgac ggtggacacg gcgtgttcgt cgtcgttggt ggcgttgcat 33120
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ggtcggtgca aggcgttcgc ggagggtgct gacggtacgg cgtggtccga gggggccggg 33300
gtgctgttgg tggagcgttt gtcggatgcg cggcgtaatg gtcaccgggt tctcgcggtc 33360
gtacggggca ccgccgtcaa ccaggacggt gccagcaacg gcctcacggc gcccagtggg 33420
cccgcccagc agaaggtcat ccaggacgct ctggccgatg cgggtgtgtc cgcgggtgag 33480
gtcgatgtgg tggaggcgca cggtacgggc acggcgttgg gtgatccgat cgaggcgggg 33540
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ccgggagcgg ccttgctgga ggccgtgctc cggatcggtg cgcgcgccgg cctgccgcgg 35460
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ctgctgctcg acctggtgcg caccgaggtg gccgccgtgc tcgggcacgg cgaccggggc 38100
gcggtgggcg ccgggcggtc cctcaaggaa gccgggttcg actccctcac cgccgtggac 38160
ctccgcaacc ggctcggcgc gcgcaccggc ctccggctgc ccgcgaccct cgtcttcgac 38220
cacccgaccc cgctggccct cgccgaactc ctgcgcgccg gcctggacga ggcggccgcg 38280
gccgaggccg ccgccggccc ggatcccacc ggcccggccg acgacctcgc caccgccctc 38340
gaccggctgg aacgcagcct cacggccgcc cccggcgacg ccgccggccg ggcccgcgcc 38400
gccgaacggc tgcgcggcct gctcgccggg ctcaccgcgg atccgtccct cccgtccgcc 38460
cggcccgcgc cgggcgcccc ggccgccccc gacggcgaac tcgtcgccga ccggctccgg 38520
tccgcctccg acgacgagct cttcgacttg ttcgacagcg acttccggtg agccgccgcc 38580
accgggccgc tgctgcccca ccccggatca cccgcaccac gtgaaccacg tgcaccaccc 38640
ggccccggcc ggtcccgccc agccctgatc accacgagaa cgacccagag gagaaccgtg 38700
tccgcaacca acgaggagaa gctgcgggag tacctccggc gcgcgatggc cgacctgcac 38760
agcacccgcg agcggctgcg cgaggccgag tcggccgacg gggagccggt cgcgatcgtg 38820
ggtatggcct gccggtaccc cggcggggtg gccggccccg aggacctgtg ggacctggtc 38880
gccgcgggca ccgacgcgat ctccccgttc cccaccgacc ggggctggga cgccgacggg 38940
ctctacgacc cggacccggg cgtacccggc aagagttacg tgcgtcaggg cggattcctg 39000
cacgaggccg ccgagttcga ccccggcttc ttcggcatgt ccccgcgcga ggccgccgcg 39060
accgaccccc agcagcggct gctcctggag acgtcctggg aggcgctgga gcgggccggg 39120
atcgtgccgg agacgctgcg cggcacccgc accggcgtgt tcaccggcgt gatgtaccac 39180
gactacggca gccaccaggt cggcagcgcc gccgacccca gcggtcagct cggcctcggc 39240
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atcaccgtgg acacggcctg ctcctcctcc ctggtgaccc tgcacctcgc cgtccagtcg 39360
ctgcgccgcg gcgagtgcga tctcgccctc gccggcggtg tcacggtcat ggcgtcgccg 39420
acggtgttcg tggagttctc gcggcagcgc ggcctggccg ccgacggccg gtgcaaggcc 39480
ttcgccgagg gcgctgacgg caccgcgtgg tccgaggggg ccggtgtgct gctggtcgag 39540
cggctctcgg acgcgcgccg caacggccac cgggtcctcg cggtcgtccg gggcaccgcc 39600
gtcaaccagg acggcgccag caacggcctg acggcgccca gcggcccggc gcagcggaag 39660
gtcatccagg acgcgctggc cgacgccgga ctgaccccgg ccgacgtcga cgccgtcgag 39720
gcgcacggca ccggcacccc gctcggcgac ccgatcgagg ccggggcgct cctggccacg 39780
tacggccggg accggggcgg ggacccgctg tggctcggct cgctgaagtc gaacatcggc 39840
cacacccagg ccgccgccgg cgccgccggc gtcatcaaga tggtgcaggc catgcggcac 39900
ggcctgctgc cccgcaccct gcacgtcgac gccccgtccg ccaaggtgga ctgggactcg 39960
ggcgccgtac ggctgctgac ggaggatcag ccgtgggcgg agcgggcgga ccggccgcgc 40020
cgggccgcgg tctcggcgtt cggcgtcagc gggacgaacg cccacgtcgt catcgaggaa 40080
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gaggccccgt ccgtcgtcgc gtggcccctc tccgccgcca cggcccccgc cctccgggcg 40200
caggccgccc gcctccgcgc ccatctccgg cgcgcgcccg gcaccccgcc cgccgacatc 40260
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gggagccacg gcgcccccgt ggacgccctc gccgccctgg cggccgggga gatcaccccg 40380
gacgccgtca ccggcaccgc cgccgacgtc cgccgggtcg ccttcgtcta ccccggccag 40440
ggctcccagt gggccggcat gggagccgaa ctcctcgaca ccgtccccgc cttcgcggcc 40500
gagctggaac gctgcgcggc cgccctcgcc ccctacgtgg actggtcgct caccgacgtc 40560
ctgcggggcg ttcccggcgc gcccggcctc gaccgcgtcg acgtcgtgca gcccgcgacc 40620
ttcgccgtca tggtcgcgct caccgcactc tggcgctccc tcggagtcga acctgccgcc 40680
gtcgtcggcc actcccaggg cgagatcgcc gccgcctgcg tcgccggcgc gctctccctg 40740
gacgacgccg cccgcgtggt ggccctgcgc tcccggatca tcgcccgcga gctcgcgggc 40800
cgcggcggca tggcctccgt ggcgctcccc gcggccgacg tcgaagcacg gctggccgcc 40860
ggcgccgccg agctcgccgg tgtcgagatc gccgccgtca acggcccgga gtcgaccgtc 40920
gtctgcggcg agcccgacgc cctggacgcg ctcctgcgca ccctggaggc cgaaggggcc 40980
cgggtccgcc gcatcgacgt cgactacgcc tcgcactccc actatgtcga gcggatccag 41040
gacgaggtcc tggccgcgct cgcgcccgta cggccgcgcc gcgccggcat ccccttctac 41100
tccaccgtcg acgcggcact cgccgacacg gccgcgctcg acgccgcgta ctggtaccgc 41160
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gacgcgttcg tggagtgctc accgcacccc gtgctcacgg tcgggatccg ccggaccgtg 41280
gagagcccgg tgcccggaac cgaggtcagt gccgttgacg gcccctccgt accggccgtc 41340
ggctccctgc gccgcggcga gggcgggctg cggcgcttcc tgacctccgc ggcggaggcc 41400
caggtcgcgg gcgttcccgt cgactggtcc gtgctccacc ccggcgggcg cgtcgtggac 41460
ctgccgacgt acgccttcca gcgcgagcgc tactgggtcg ccccggcgga ccacgaccgt 41520
gccccggaca ccgccccggc ctccgacgga tccgacgccc ccgggtccgt cccggcctcc 41580
gacgccctca cgtccacggg gcggtccgtc cccgccgacg agcagctcgg ctaccacgtc 41640
gcctggaagg gcctgcgccc cgccaccggc ggctggcgcc cggggctccg cctcctggtc 41700
gtaccggccg gtgacgccca cgcggcggtc gccgacgccg tggaggaggc cgtcgcctcc 41760
ttcggcggca ccgtccgccg cgtcaccgtc gacgccgccc gcgtcacccg cgacgacctg 41820
cgcaccctgc tcgaacccgc cgtcaacggc gacaccgccg tgaccggcgc cgtgtccctg 41880
ctcggcctgt gcgcggacgc ccaccccggc caccccgccg tgtccaccgg cgtcgccgcg 41940
accctcgccc tggtccaggc gctggccggc ctcggcggca cggcaccgct gtggaccgtc 42000
acccggggcg cggtcgccac cgcgcccggc gaggtgccgt ccaccgccgg cgcccagctc 42060
tggggcctcg gccgggtggc cgccctcgaa ctgcccgagc ggtggggcgg cctcgtcgac 42120
ctgccggagc gccccgacgc ccgggtctac gaccggctcg ccggcgtcct cgccgacccc 42180
gggaccgagg accagatcgc catcaggacg tccggcgtct tcggccgccg cgtcctgcgc 42240
accccggacg gcccggaccg gcccgcctgg cgcgcccgtg gcaccgtcct cgtcaccggc 42300
gacctcacga cggtgcccgg tccgctcgtc cgcgcgctgc tggaggacgg cgccgaacgc 42360
gtggtcctcg ccggcccgga ggccggtacg gaagccctcg cggcggccgg gctcgccggt 42420
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ctcgacacgt acgcgcccac cgtcgtcatg cacgccccgc ctctcgtgtc cctggcgccc 42540
ctcaccgcca cgacggtggc cgacatcgcc acggcggtgg ccgccaagac gacggcggcg 42600
gggcacttgg tcgagttgct ggccggggcg gccggggcgg ccggagtcgc cggagctgcg 42660
ggagtcgccg taggccctgg agcccccgga gcccccggag ccgccggaac cacgggggcc 42720
acggaagacg cccgggtcgc tgaagccgct gaagccgctg gaacccccgt agcccctgaa 42780
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ggaacccccg tagccatcga ccccacccgc accgaagaca cccccaccct ccaggccctc 42900
gtcctcttct cctccgtctc cggcgtctgg ggcggcgcct cccagggccg ctacgccgcc 42960
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tccgtcgcct ggagcccctg ggcgggcgcc gcgcacgccg agggcaccga cgccgcgttc 43080
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cgctggagcg cggcagcgcc accggcgcgg tcgccgacgt cgactgggac cgcttcgccg 43200
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aactgtccgc gcagtccggg cacaagcggc acgccaccct gctgcggctg gtccgtaccc 43380
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cgggcctgac cctgcccgcc tccctggtct tcgaccactc caacccggcc gccctcgccc 43560
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cggcccgcgc cgacgagccc gtcgccatca tcggcatggc ctgccggctg cccggcggcg 43680
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tggagacggc ctgggagtcc ttcgagcggg ccggcatcga cccggtggag ctgcgcggca 43980
gccgcaccgg cgtgttcgtc ggcaccaacg ggcagcacta cgtgccgctg ctccaggacg 44040
gcgacgacag cttcgacggg tacatcgcca ccggcaactc ggccagcgtg atgtcgggcc 44100
ggctctcgta cgtcttcggc ctcgaaggcc ccgccgtcac cgtggacacg gcgtgctcgg 44160
cctcgctcgc cgccctgcac ctggccgtgc agtcgctgcg ccgcggcgag tgcgacatgg 44220
cgctggtcag cggtgccacg gtgatgtcca caccggagat gctcgtcgag ttcggccgcc 44280
agcgcgcgat ctcgccggac ggccgctcca aggcgttcgc cgaggccgcc gacggcgtcg 44340
gcctggccga gggcgccggc atgctcctcg tcgagcggct gtccgaggcc caggagaagg 44400
gccacccggt gctcgccgtc gtccgcggca ccgccgtcaa ccaggacggc gccagcaacg 44460
gcctgaccgc gcccagcggc cccgcccagc agaaggtcat ccgggaggcg ctggccgacg 44520
ccggcctgac gccggacgag gtcgacgccg tcgaggcgca cggcaccggc accgccctcg 44580
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cgctgtggct cgggtccgtg aagtcgaaca tcggccacac ccaggccgcc gccggggtcg 44700
ccggcgtcat caagatggtc ctcgccatgc ggcacggcct cctgccccgg acgctgcacg 44760
tcgacgcgcc ctcgtcccgc gtggactggg ccgcgggcgc cgtcgagctg ctgacggagg 44820
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ccttcgccga cctcgcgctg tgggccggcc gccaggcggg caccggccgg atcgaggaac 46560
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tcggcgcccc gggcgcggac ggcgcccgcc gcttcaccgt gcacggccgc gccgagggcg 46680
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ccgggttcgc ccccggcgac cgcgtactcg gcatgtggga cggcggcttc ggcccggtgt 48240
gcgtggccga ccaccggctc ctcgcccccg taccggacgg ctggacgttc gccacggccg 48300
cgtccgtgcc cgccgtgttc ctcagcgcct actacggcct cgtcaccctg gccggcctgc 48360
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cagcagaagg tcatccggga cgccctggcg gacgccgggc tgacgccggg tgaggtcgac 51420
gccgtcgagg cgcacggcac cgggacgccg ctgggcgacc ccatcgaggc cggggcgctg 51480
ctcgccacct acgggcggga gcgcgacggc gaaccgctct ggctgggctc cctcaagtcc 51540
aacatcgggc acgcccaggc cgccgcgggc gtcgccggcg tcatcaagat ggtgcaggcg 51600
ctgcggcacg ggctgctgcc ccgcaccctg cacgtcgacg ccccctcgtc gcacatcgac 51660
tgggacgcgg gcgcggtcgc gctcctcacc gaggcccgtc cgtggcccgc ccgggaggac 51720
cggccgcgcc gcgccgccgt ctcgtccttc ggcgtcagcg gcaccaacgc ccacgtcatc 51780
ctggaacagg ccccgcctgt cccacccgtg gagcccgtag cgccctcgga gccctccgcg 51840
accgtcctcc cgctgtccgc ggacggcgtg gaacccctgc gcgagcaggc ccgtcggctc 51900
gccgcgcacc tcaccgccga cccggaactc acccccgccg acgccgcctg gtcgacggcc 51960
accacccgcg ccgcgctccc gcaccgggcc gcggtcctgg ccgacgaccg cgaggcgctg 52020
atcgcccggc tcggagccgt cgccgagggc cgtgcggaca aggacgtcac cctcggagag 52080
gcgggcagcg atcgcccgcc cgtcttcgtc ttccccggcc agggctccca gtggcccggc 52140
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accgccctcg cgccctacct cgactgggac gtcctcgacg tcctccgggg cgcccccggc 52260
gccccgccga ccgaccgcgc ggacgtcgtg cagcccgtcc tgttcaccat gatggtgtcc 52320
ctcgccgccc tgtgggaggc gcacggggta cggcccgccg cggtcgtcgg gcactcccag 52380
ggcgaggtcg ccgccgccta cgcggccggc gccctgtccc tggacgacgc cgcccgggtg 52440
atcgccgaac gcagcaggct ctgggggcgg ctggccggca acggcggcat gctctcggtc 52500
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gccggccact cgccccaggt cgaggagttc cgtaccgaac tcctgggcac cctcgcgggc 52740
gtccggccca cctccgcgcg gctgccgttc ttctccaccg tcaccgccgc cgagcacgcc 52800
cccgaggaac tcgacgccgc ctactggtac cgcaacatgc gcgaacccgt cgagttcgcc 52860
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ccgctgctcg gctcggcgat cgacgaggtc gccgacgacg agggcgtccg cgccaccgcc 52980
ctgaacaccc tctaccggga ctccggcgac ctcgcccggt tccgcgcctc cgtgggcgcc 53040
gccttcgcgc acggcgtccg cgtcgactgg gcccccctgt tcgagggcac cggggcccgc 53100
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gcccgccgcg ccgcgcccgc ggccgcctcg cccgccgcgg gctggcgcta ccgcgtggcc 53220
tggaccgcgc tcgacaccac cggcaccacc ccgcccaccg gccgctggct gctcgtggac 53280
accccggcca ccgagtcggg cgcggccgac gccgccgcgg ccgccctcgg cgcggccggg 53340
gcgacggtcc tgcggcacac gctggacccg gcgggcgcgg accgcgcagg actcgccgcg 53400
cgcctcgccg gagccgccga cgggctgacc ggcgtgctgc tgctgcccgt cggcgccgcc 53460
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ccgggcgagt ccccctcacc gacggccgcc cgcctgtggg gattcggccg ggtcgcggcc 53640
ctggaggagc ccacccggtg gggcggcctc gtggacctgc ccgccgagcc cgccgagcgg 53700
gactgggagc ggctggccgg gctgctctcc ggggcgaccg gcgaggacca gatcgccctg 53760
cgcgcctcgg gcgcgtacgg ctgccgcatg ctgcccgccc gcgacggcgc gggagccgcc 53820
cgccgcacct ggcggccgcg cagcagcgtc ctgatcaccg gcggcaccgg ggggatcggc 53880
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gtgggtgcgg atctgctgga cgagttgacg gcggatgccg atctggacgc gttcgtgctg 54240
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gcccacctcg acgccctcgc ccagcgccgc cgcgcccagg gccgcccggc cacctccgtc 54360
gcctgggggc tctggggcgg cggcgggatg ggcgcggacg acggcgtcac cgacttctac 54420
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ctcgacctcg acgacacctg cgtcaccgtc gccgacctcg actgggagca cttcgtcacc 54540
ggcttcaccg ccttccgccc cagcccgctg atctccgaca tccccgaggt acgcgccctg 54600
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ccctgcacct cgccgtccag tcactgcgcc ggggcgagtg tgacctcgcc ctggccgggg 55800
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cgccgtcaac ggacccggct cggtcgtcct ctccggcgac gaacaggccg tcctggacgc 57600
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cgccctgacc ggcacggccg aggagtgcct ggcggacgcg gaggacaccg cgaccgcccc 57960
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cctttcccgt acggcgccgg gaccggctac tcgcgcttgc gcgccagcgt gaccccgtcg 64500
gccacggtca gcagggagat gtccacgcgc gcgtcgtccc gcagccgttc gttgagcgcg 64560
cgcacggcct cggtgtccgg gtcctggcac tccggatcgg ccacccggcc gaagaacagc 64620
gtgttgtcga ccgccaccag accaccgggg cgcagcagcg cgagcgactc ctcgtagtag 64680
tgcgggtacc cggtcttgtc ggcatcgacg aacaccaggt cgaacgtgcc gtcgcccccg 64740
gcggcccgca gcccggccag ggtctccacg gcgtcaccga cgcgcagctc gatccggccg 64800
gccaccccgg cccgctccca gaacggagcg cccacacccg gccacttgtc actgatgtcg 64860
caggtgacca gccggccgcc gggcggcagc gcccgggcca cgcacagcgt gctgtacccg 64920
gtgaacgtcc cgatctccag cacccggcgc gcgccggtga gccggacgag cagcgcgagg 64980
aactgcgcct cctcgggcat gatctgcatg gcgcgcccgc cgggcaggcg cgcggtcagc 65040
tcgtacagct cgcgcaggag cgcgtcgtcg cgcagggaga cgctccgggc gtactccagc 65100
agggcggggc tgagagcggt ctggtctgcc acgctcacgg tcctttcgga gggcttcgag 65160
ggcagcgtgc ggttgtcagg cgcgcgccgg gtccgggtcc gccgccgggt ccggggcggt 65220
gcccggggcc gggacgggcg ccggggccgg cgcggtgccg tccggccggg cggcgggacg 65280
gcggcgcccg cccagcaggc gcatggcggg cttctccacg aaggtgtgca gcagggccgc 65340
ggcgcaggtg gcgacggcca cccccagcag ggccacgccg atcgcgcccg gggtgtccca 65400
ctgcttggcg tagcccaggt cgccgccgag cagccggtgc ccgtagcgga tgacgatgaa 65460
gtggatcagg tagaaggcga acgaccactc gcccagccgg accagcaccg cggaccgcag 65520
cccccaggtg cgcaggcccc gcacgtcggc gtcggccgcc gcggtgatca gcagagtggc 65580
cgggacgacg gtcgccgcct ggagggtgaa catcgagggc acggcctggg tgagggcgaa 65640
gccgccggcg agcagcagcg cggacagcca caccccgggg ccgcgccaca ggcccttgcc 65700
caggatgagc gccatcacga cgccgaggac gaactccagg gcgcggacag gcgggaacca 65760
gtagacgaac cacagctcgt tcagcggcat gcccggggcg acctcggcgc tccccgggag 65820
gagtgcggcg acgaacggca cgcagacgac cgccgcggcg agcccgccgg cccaccacca 65880
cagccgcttc cccggcaccc gccggaacag ccggaaccac agcgggaagg agaggtagaa 65940
ggccatctcg caggagagcg accaactcgg cgtgttgaaa ccggagatca cggacggctc 66000
gggcagccag gactgcaaca gcagcagatc gggcaccagc ccgtcccaca ccgagccgcc 66060
cggcaggacc ggctccgaga ggccgaggat gatggcgccc gcgacgcaca gggtgacgaa 66120
gtgcagcggg tagatcttgg cgaaccggcg ccgccagaag accgggacgg agtcctcgtc 66180
ccgtgccgac caggtcagga cgaagccgct cagcacgaag aagaacgaca cggcgatcga 66240
gccgagcggg gtgaacttcg ccagctcggc accgagcttc tggtcggcga agatgccctg 66300
ctggcagatg tggcaggcaa ataccgccaa cgccgcgaac cagcgcagtc cggtcagcga 66360
gggcaggcgg gcgacgcgag ggagcatcgg gttctcgttc cttgggatca gggcaggagg 66420
tgacgtccgg atcgctggag atcaggcggg cccatcctgt ggcaggccgg atcacgcgga 66480
cacgagaaga tgacacagtc ggaggggcgg atccggtacg gatccgcccc tccggccacc 66540
gcccgcgagg ggcgcggtgg tgtcaggccg cgctgaactc ggcgatgcgg ccctcgtcga 66600
gcatcagctg cgcgccgtcg aaccgggacc gcatcagacg gtcgtgcgtc acgaccacca 66660
cggcgccctg atagtccgtc agcgccgcct ccagctcctc gacgagcgcc ggggagaggt 66720
ggttggtggg ctcgtccagc agcagcaggt ccaccggctc ggtcaccagg cgcgccagct 66780
cgatccggcg ccgctgcccg taggagagct cacccacccg ctgccgcagg tcgtccgggc 66840
tgaacaggcc gagggacagc agcgcctcga cgtgctcgtc gggcgagccg acccgcccct 66900
gcgcgaacgc ctgggccacg gtgagccggg ccggccacgg gggctgctcc tgccgcaggt 66960
gccccacctt gccggacacc cgcaccgagc cgctgtccgg ggtcagctcc ccggccagca 67020
cccgcaggag cgtggtcttg cccgccccgt tgggcccggt gatcagcagc cgctcgccgg 67080
gccggacggt cagcgagtcg acgccgagcc ggccctcgac ccgcaccccg gacagctcgg 67140
ccaccagccg ctccgcctcc tccgcggccg cggtggagat ctgcgctgtg aaggacagcg 67200
gatcggccgg cggcgcgacc gggttctcgg tcagccgctc gatccgctcc ttggcgttgc 67260
ggatccgcac catcgcgccg tgcccgcggc cgcgggtccg gaacgcgccg tgcccgaaga 67320
ccgcgaacgg catcttgcgg gggatggcgt cgagccgggt gacgttggac gtgaccagct 67380
cgcggttgcg gtccagctcg gcgcgccact cctcgtactc ccgcagccgc cgctggcgct 67440
cggtggcctt ggcggtcaga tagccgtcgt agccgttgcc gtagcgggtg accgagccgg 67500
agtcgacctc caggacggtg gtggtgagcc ggtcgaggaa catccggtcg tgggtgacgg 67560
cgatgaccgt gccgcggtgc ccgcgcagat gcttctccag ccagccgacg gcctggtcgt 67620
ccaggtcgtt ggtgggctcg tcgagcagca gcagctcggg cgccgacgcc agcgtcccgg 67680
ccagggccag gcgcgaccgc tcgccgccgg acagggtgcc cagcttccgg tcgcggtcca 67740
gtccgggcag gccgagcccg tgcagggcga tgtccacccg ggagtcggcc tcgtagccgc 67800
cccgggcctg gtaccgctcg accagggcgg cgtaggtctc caggagcgcc gtcagttccg 67860
cgtccgggcc cgcctggtag gggcgttcgg ccagctcggc ctcggcccgg cgcatgcccg 67920
tctcgatctc gcggagctcg gccagcgcca ggtcgacggc gtcctggacg gtggcctccg 67980
gcggcagctc cagcgtctgc ggcagatagc cgatgccgcc gggggccacc accgtcagcg 68040
cgccgttgtc ggcccgctcg cggccggcga tcagccggag cagggtggac ttgccggagc 68100
cgttgtcgcc gatgacgccg accttctcgc ccggcttgac ggtgaaaccg acccggtcga 68160
gtacgacgcg gtcctggtag cgcttggtga tgtcgtgcag ggctagttgc gcggttcgca 68220
cgcgggggcc tccttttcgc agccgggaat ggggtcgttt ccgcgcactg ggcggtcctg 68280
cggtgcgtga gggcacggcg ggagggccgg agcggcatat gacgcgctac gcgacgtcgc 68340
tgcggcgttt tcgataagtg cacggaggga tacggcggcg gagtcgagct ctacgcggcc 68400
gtatcttcgg ctgtcacagg gatcccatgg agccgagtct agaggatcaa aaaacttttc 68460
ggcaagggcc tttcggggga acctcgaaga tccccgaaac catgatcgcg caatcccgga 68520
gcgcgccggg cccggaaatc cgccgggaac ggaggacttc accggcttgt ccggaaattc 68580
accggacagg ggcggaacat tgaccggaaa tccggtccgg cgcccggccg gctgccggaa 68640
ccttcgcgtc cgatgatggc tgatttccgt tgcctgcact gtcaattgat ggaccttcgg 68700
atcatggaaa ggtacgttcc cggggtgagc tcgaaaccgc tggtgccccc gagatccgcc 68760
cccgggcccg ccgcgtcgcg caatgccgcg cgcagggagt ggggccagaa tttcttccgg 68820
tccgcagccg ccgcccgcag gttctccgac cagctggacg attcgtactt cccgaccggt 68880
ttcacggccg ggacgctcac ggtcgagata ggcgcgggct ccggccgggt gaccaaggcg 68940
ctggccgcgg ccgggcgtcc attactcgcg gtcgagatcg acacccattg ggcgcgccgg 69000
ctcgccgcgg aatcgctccc ggacgtcacc gtggtcaacg aggactttct gaccttacgg 69060
ctgccgcggc agcccgtccg tttgataggc aatctgcctt tcgtgtccgg caccggaatt 69120
ctgaggcgct gcctcgacct cgggcctgat ctgatgcgcg ggggagtctt cctgctccag 69180
cgcgagtacg tgggcaagcg caccggggcc tggggaggca acctcttcaa cgcccagtgg 69240
gagccctggt acaccttcgg cgaaggactc gccttccccc gccacgagtt cagccccgta 69300
ccgcgggccg acacctcgac cctgctcgtg gcgccccgcc gccggccgtc cgtgccgtgg 69360
tccgaacggg ccgcctacca gcgattcgtc caggagttct tcgacaccgg ccggatgacc 69420
gtcggtgacg cggcgcagaa ggtgctgcgc cgcggccacg cccggttcgt gcgcggcgcc 69480
ggggtggcgc ccgccgaccg gctcaaggac ctcacggccc gggagtgggc cgcgctgtac 69540
cgcgcggacc gggccggccg tgaggaccgg gaaggcggtc ccgtccggcc cgcccggacc 69600
ccccggcccg gccggcggcc gtccggccgc tgacgccgca gggggtgaac cggccgcgca 69660
cgagcgctcc gcacgcggcc ggccctctca tggaagggtc ctcacgacgc gggggattca 69720
tcggtggacc gcgcttcctt gagcttgcgg agcagctccc gcttctgttc catcgggtcg 69780
acgccgctct tgggaacccc acccttcttg ccgccgcgca tcgcgctgcg ggagaggttg 69840
gcgcgggtgc cgccgacgcc cagcatgttt cctgacccct tgcccatcag ggttctcctt 69900
ccgtcggtaa gccgaggcgt tccgtcccgg catgtccatg agtctggacg atacgtatcg 69960
tcttgtcaag acgatacgta tcggttcgcc gaggtctagg ctacgcggca tgtcctccaa 70020
ctgcgcacct tccgccacgc ggctccgccg ccggtcccat cacgcgatca tgggagccac 70080
cctcgaactc gtcagcgagg tcgggtaccc gaagctgacg atcgaggcca tcgccgcccg 70140
cgccggtgtc ggcaagcaga ccgtctaccg ctggtggccg tcgaaggccg cgatcctccg 70200
ggacgccgtc gtgcacctct gccaggacgc caccggggtc acccgcggca tccccgacac 70260
cggggacctc gccgccgacc tcaaggccgt gctccgcgcc accgccgaca ccatgagcca 70320
cccccggtac gacctgcccg cccgcgccct cgcggccgcc ggcatcgccg acgcgaccct 70380
cggcgcggaa ctggtcagct gcatcctgga gccccaactc cggctgtacg tcgagcgctt 70440
ggccgccgcg cagcgggacg ggcaggtcga ggcgggtatc gacctccgcg tcgccctgga 70500
gctcctcacc ggccccctcg ccttccgctg gctgatgggc gacgccccgc tcacccacgc 70560
gtacaccgac gcgctcgtcg gcctcgtcct gcgcggactg gcgccgcggt cctcctgacc 70620
gccggccggc caggccctcc cggggcccgt cgaggggtcg tcgcccggcc cgcggtccgg 70680
cccggagccc cggcccgtgg accggtccgc cgggtccgga cggtgtgtca ttcggcccag 70740
cggggcgttt gtccctagga ttgtgggatg tacatagcca ccacgttccc cggaggggtg 70800
atccggtgaa caggtccgag gccaccgatg agcagtggga gggcctggcc gaggtcgtgc 70860
cgctgcgcgg ccacgcctgg ccgtcctggc ccaaccaccg ggccctgccc gaggaggagc 70920
cggagccgaa ccggcgtcag ctcgtcgtgc tgcgcgtcca ggtgttcgcc gacgcccggg 70980
aggtcgccga gcacctgatc gcccgcgtcc cggtgctgct cgacctcacc agcgccgaca 71040
ccgacgtcgc caagcggatc ctggacttct ccagcggcgt cgtcttcggc ctgggcagcg 71100
gcatgcaccg ggtcgacacc aatgtcttcc tgctcgcccc cgagggcacg gaggtggcct 71160
cggggtaccc cgatcgtagg aagagtgatc aggtaaaacg gtttggctga ccggccggca 71220
catacggtcc gggcatggac gtacgccgtg cccgaccgcc gcttccggcc gctgccccgc 71280
cgcaccggcc cgcggtgacc gaactgcgcc tctccgcctt ccggacccac cggaacgctg 71340
tcttccggct cgggccgctg acactcttcc gggggccgag cggcagcggc aagtccagcg 71400
ccctccaggc gtacgaggcc ctcgcccggc tcgcgggcgg cgacaccctg gaggaggccc 71460
tcgcctccgt gcccggcggc gccgccacgt gcgtgccgca ccgggcccgg ccggacgccc 71520
aggggcggcg ggggttccgg atcggctgca ccgtcgaggg gccggcgggc ccggtcctgc 71580
tcgacatcgc cgtccaggcc gaaccggaac tccgcatggt cggcgagcgg ctgaccggcg 71640
ggggacgcac cttgctctcc acggccctgc gcgaccccgg gctgcgccgg gtcgaggccg 71700
cctggcacac ggccgggacc gtccccgtca cgcgcgcgcc cctgccggac gaccggctcg 71760
gcacggcgct gctgcccctg cgggtcgcgg gcaagacggc cggtcagcgg ctggtcctcg 71820
acgccgccga gcaggtcgtg gtggcgctgc gctccgtctt cgtctgcgac ccccgcccgg 71880
agctgatgcg cgctccggtc gccgcgcgtg acgggttgct gcgcggcgcg tgtgacaacg 71940
ttgccgcggt tctcgcccgt acccgccacg agtgcgccac ccggcacgcc gccctggtga 72000
ccgcggtggg agcgggctgc cgcggcccgg tggaggagct gtcggcgcag gccctggaag 72060
gcggtctcgt gcgggcggtc ctgggccggg cggcgggcgc cgggacgccg ctggagcggc 72120
tgggcgacgg cgagctgcgc tatctggccc tgtgcctggt gctcatgacg gggccggggg 72180
tgctggacat ggacccggtc gcggaggtgc tgcccgcgcg gcaggcgctc acggtgctgg 72240
cggacggcct cgaccggtgc ctggacccgg ggcagacgcg cgagctgctg acggtggcac 72300
ggcagatgtg cgagcggggg catgtgcgct tggtgggaac ggtgcggggt ggtgcggggg 72360
agtccgaggg ggacgcctgg agtgatgctc agggggcggg ggagccgggg gtgtcggtgg 72420
tagacctggg gtgtgagcga aacgcggaaa gagtatgagg aggggccggt ggggcttccg 72480
gtgggtgcgg ccaggtcgcg ggaggagtcc cgggtgaccc gggggccggt ggcggagggg 72540
gcggcggagg ccgcgggcgc ggtcggggag gtcggcgcgg ctggtgaagc cggtgctccg 72600
ggtgcttccg gcgggtcctt cgggggatcg ggcgagcgcc ctggcggccc cggcgagctg 72660
aaggccctcc agctccggct ggcggagttc gcggcggcgc gggactggca gccgttccac 72720
accccgaaga acctcgcggc ggcgctgagc gtcgaggccg ccgaactcgt ggagatcttc 72780
cagtggctga cgccggagca gtcggcgcgg gtgatggagg acccggagac cgctggccgg 72840
gtggaggacg aggtcgcgga cgtcctggcg tatctgctcc agttctgcca cgcgctgggt 72900
gtcgacgcgg cgtccgcgct ggcggcgaag atcgaccgta acgagcggcg gttcccccgg 72960
gccgaccgtc cggggcgacc gtccgggccg ggcggcggcg gggccggggc gaatcgaact 73020
gagccggagt gagccggagt gagccggtac cggagtgagt ggatccagat ctggcggttc 73080
gtcactctcc ggagtgattg agttctccac accgcatctg gtatccacag atttctgaat 73140
tcccctggcg tttccggcgg ttagccgtca cgctgagtag tgagaagcgg taagcagggc 73200
ggcagtgtcg gaaagtgggg gaccgcacat ggacgcaacg cggctcatcg gagccacccg 73260
gacggcattg gcgcaggcca gggcggtgca ggacatcgtc ggcgaggcat ggcagaccca 73320
ggccctggcg ggtgccatcg gaagtcatct cgcggtccac ggcccgttcg aggcgcgggc 73380
cgcggcgggc ggtctgagtg aggcaggcgc ccgcgcctcc ggcgcgctgc gtcagacgcc 73440
gcgcgccggg gcgatacggg cggcgcacct cagcgaggtg cgcgatccct gggtcgcgct 73500
ggcgggcctg tgcggcctgc tcggggaggt cggcatagcc ctggtgggcg tcgcctgctc 73560
gtcggacgag gacgccttgt actggcagtg catggaggcg atcgacgccg ctgacgagac 73620
gagcgaccgg gtgcgctggt tacagagacg gctcgccctg cgcgagcgcg agggaggcgc 73680
cgcgtgaggg gcggacgctc agccggcacc gcctccgccg ctgtgcgcgg agtgctcgcc 73740
gggcgactgg agatcggcgt cgagctgcga cagatcggcg ttcagcgcgg ccatcagctc 73800
ctccatctgc tgaagcaggc ccttgggcgc gccctgctgc gcgggagcgg cctgtgcggg 73860
caccgtttct tcgggcacgg cttcctgggt cat 73893
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF9上游引物
<400> 2
ccacaggagg acccatatgc ccttgccgaa acac 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF9下游引物
<400> 3
cgcgcggccg cggatcccta cttcgcggcg ggcg 34
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF29上游引物
<400> 4
tccacaggag gacccatatg ctccctcgcg tcgcc 35
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF29下游引物
<400> 5
cgcgcggccg cggatcctca ggcgcgcgcc ggg 33
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF19 Up-F引物
<400> 6
gtgccaagct tccgcgccgg acggcactgc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF19 Up-R引物
<400> 7
cccggtggcg gcggccgctg ccactcactc 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF19 Down-F引物
<400> 8
ggagtgagtg gcagcggccg ccgccaccgg g 31
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF19 Down-R引物
<400> 9
cgcggatcct ctagagacga cgtgggcgtt cg 32
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF20 Up-F引物
<400> 10
gccaagcttc tggtggcccg gcacggcgt 29
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF20 Up-R引物
<400> 11
gacccagagg agaaccacag cgggcgtgcc t 31
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF20 Down-F引物
<400> 12
aggcacgccc gctgtggttc tcctctgggt 30
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF20 Down-R引物
<400> 13
ctctagacgg gcggctcctc gacgacgacg tgg 33
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF24 Up-F引物
<400> 14
gccaagcttc ggctgggacg aggccgccgt 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF24 Up-R引物
<400> 15
tcgttggcgt acaccagggc aggggcgccc 30
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF24 Down-F引物
<400> 16
tgggcgcccc tgccctggtg tacgccaacg a 31
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF24 Down-R引物
<400> 17
tcctctagac gggcgacggc gagcgtctg 29

Claims (6)

1.一种生产交沙霉素的基因工程菌,其特征是,所述基因工程菌为过表达聚酮合成延长单位及修饰相关的基因的那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomyces narbonensissubsp. josamyceticus);所述那波链霉菌交沙霉素变种为ATCC17835;
所述聚酮合成延长单位及修饰相关的基因为如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的第9474-10607位或如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的第65176-66387位。
2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征是,所述基因工程菌含有包含32个基因开放阅读框(ORF)的生物合成基因簇,具体如下:1)聚酮合酶基因ORF18-24;
2)与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因ORF1-3、9、16-17、28-29;
3)与糖基合成相关基因ORF5-6、11-13、15、31和36;
4)与糖基转移相关基因ORF4、14、25-27;
5)与抗性相关基因ORF30;
6)与生物合成调控相关基因ORF7-8、33。
3. 如权利要求2所述的基因工程菌,其特征是,所述ORF18的核苷酸序列如SEQ ID NO:1中第19380-32426位所示;所述ORF19的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第32476-38571位所示;所述ORF20的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第38698-43422位所示;所述ORF21的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第43419-50345位所示;所述ORF22的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第50404-55056位所示;所述ORF23的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第55107-56834位所示;所述ORF24的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第56828-60940位所示;
所述ORF1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第1-1125位所示;所述ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第1118-1447位所示;所述ORF3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第1444-2328位所示;所述ORF9的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第9474-10607位所示;所述ORF16的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第16425-17633位所示;所述ORF17的核苷酸序列如SEQ IDNO: 1中第18055-19116位所示;所述ORF28的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第64467-65132位所示;所述ORF29的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第65176-66387位所示;
所述ORF5的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第3984-4595位所示;所述ORF6的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第4648-5730位所示;所述ORF11的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第11246-12676位所示;所述ORF12的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第12758-13789位所示;所述ORF13的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第13773-14651位所示;所述ORF15的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第15835-16434位所示;所述ORF31的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第68653-69633位所示;所述ORF36的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第72469-73032位所示;
所述ORF4的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第2555-3874位所示;所述ORF14的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第14678-15838位所示;所述ORF25的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第60940-61653位所示;所述ORF26的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第61818-63041位所示;所述ORF27的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第63120-64394位所示;
所述ORF30的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第66563-68221位所示;
所述ORF7的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第5902-7854位所示;所述ORF8的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第7908-9080位所示;所述ORF33的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第70070-70618位所示。
4.一种制备交沙霉素的方法,其特征是,包括将如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养。
5. 如权利要求4所述的方法,其特征是,所述发酵培养基包括:80 g/L的豆油、20 g/L的淀粉、10 g/L的棉籽饼粉、0.0015 g/L的硫酸锰和3 g/L的碳酸钙;所述发酵培养基的pH为7.0-7.2。
6.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌在制备交沙霉素中的应用。
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