ES2718331T3 - Nuevo elemento integrador y conjugador de actinomiceto de Actinoplanes sp. SE50/110 como plásmido para la transformación genética de actinobacterias relacionadas - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Nuevo elemento integrador y conjugador de actinomiceto de Actinoplanes sp. SE50/110 como plásmido para la transformación genética de actinobacterias relacionadas
El organismo procariótico Actinoplanes sp. SE50/110 produce el inhibidor de la alfa-glucosidasa acarbosa, que se utiliza en todo el mundo en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. Basándose en el hecho de que la prevalencia de diabetes tipo 2 está aumentando rápidamente en todo el mundo, se espera en el futuro una demanda creciente de acarbosa. Con el fin de cumplir con estas expectativas, deben llevarse a cabo manipulaciones genéticas de la cepa y sus derivados con el objetivo de aumentar los rendimientos de acarbosa. Sin embargo, no existen actualmente herramientas para la manipulación genética de esta cepa, lo que dificulta el proceso de mejora de la cepa.
La presente invención se refiere a una secuencia de ADN innata dentro de la secuencia completa del genoma de Actinoplanes sp. SE50/110 que se asemeja a la estructura de un elemento integrador y conjugador de actinomiceto (AICE). Se utilizaron AICE relacionados para establecer herramientas de manipulación genética para otras bacterias en el pasado. En el presente documento, los presentes inventores describen las características únicas del AICE específico descubiertas en Actinoplanes sp. SE50/110, que son claramente diferentes de cualquier otro AICE conocido en su totalidad, pero comparte partes menores con similitud de secuencia variable con otros AICE caracterizados de otras especies.
Actinoplanes sp. SE50/110 es una bacteria Gram positiva, aeróbica, con un genoma de alto contenido en G+C de aproximadamente 9,25 MB de tamaño (Schwientek y col., 2012). El organismo médicamente importante es el productor natural de una variedad de sustancias químicamente relacionadas, que se descubrió que inhiben alfaglucosidasas humanas (Caspary y Graf, 1979), lo que las hace especialmente adecuadas para aplicaciones farmacéuticas (Frommery col., 1975, 1977 a, 1977 b, 1979). En particular, el pseudotetrasacárido acarbosa, que se sintetiza por medio de enzimas codificadas por el bien caracterizado grupo de genes de acarbosa (Wehmeier y Piepersberg, 2004) se utiliza en todo el mundo en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 (no insulinodependiente).
La diabetes mellitus tipo 2 es una enfermedad crónica con más de 250 millones de personas afectadas en todo el mundo. Manejada inadecuadamente o no tratada, puede dar lugar a casos graves de insuficiencia renal, ceguera, cicatrización lenta de heridas y arteriopatías, incluyendo aterosclerosis arterial coronaria (IDF, 2009). Como la incidencia de la diabetes tipo 2 está aumentando rápidamente en todo el mundo, debe anticiparse una demanda creciente de medicamentos para la diabetes como acarbosa. El pseudotetrasacárido acarbosa se produce actualmente mediante fermentación industrial de cepas de rendimiento optimizado, que se basan en la bacteria de tipo silvestre Actinoplanes sp. SE50/110 (ATCC 31044; CBS 674.73). El documento WO2012016960 desvela la secuencia completa del genoma de Actinoplanes sp. SE50/110. Aunque la optimización de la cepa clásica a través de mutagénesis convencional fue una manera muy exitosa de aumentar la producción de acarbosa en el pasado, esta estrategia parece haber alcanzado sus límites por el momento. Con el fin de aumentar adicionalmente la eficacia de producción, deben aplicarse procedimientos de ingeniería genética dirigidos, lo que requieren un sistema de transformación funcional para Actinoplanes sp. SE50/110. Los experimentos anteriores revelaron que Actinoplanes sp. SE50/110 y Actinoplanes friuliensis (y probablemente la mayoría de los otros Actinoplanes sp.) no permiten procedimientos de transformación convencionales como la electroporación o la transformación mediada por PEG, a pesar de que se han hecho serios esfuerzos (Heinzelmann y col., 2003). En este contexto, se ha identificado un elemento integrador y conjugador de actinomiceto (AICE) en el genoma de Actinoplanes sp. SE50/110 (GenBank: CP003170) que puede utilizarse para este fin como se ha demostrado previamente para especies relacionadas (Hostedy col., 2005.).
Los AICE son una clase de elementos genéticos móviles que poseen una organización estructural altamente conservada con módulos funcionales para escisión/integración, replicación, transferencia por conjugación y regulación (te Poele, Bolhuis, y col., 2008). Siendo capaces de replicarse de forma autónoma, también se dice que median en la adquisición de módulos adicionales que codifican funciones, tales como características de resistencia y metabólicas, que confieren una ventaja selectiva para el hospedador en ciertas condiciones ambientales (Burrus y Waldor, 2004). Se identificó un nuevo AICE, denominado pACPL, en la secuencia del genoma completo de Actinoplanes sp. SE50/110 (Fig. 1). Su tamaño de 13,6 kb y la organización génica estructural concuerdan bien con otros AICE conocidos de especies estrechamente relacionadas como Micromonospora rosario, Salinispora tropica o Streptomyces coelicolor (te Poele, Bolhuis, y col., 2008).
La mayoría de los AICE conocidos subsisten en su genoma hospedador mediante la integración en el extremo 3' de un gen de ARNt por recombinación específica de sitio entre dos secuencias cortas idénticas (segmentos de identidad att) dentro de los sitios de unión localizados en el genoma (attB) y el AICE (attP), respectivamente (te Poele, Bolhuis, y col., 2008). En pACPL, los segmentos de identidad att son de 43 nt en tamaño y attB se solapa con el extremo 3' de un gen de ARNt de prolina. Adenás, el segmento de identidad en attP está flanqueado por dos repeticiones de 21 nt que contienen dos emparejamientos erróneos: GTCACCCAGTTAGT(T/C)AC(C/T)CAG. Estas muestran altas similitudes con los sitios tipo brazo identificados en el AICE pSAM2 de Strepomyces ambofaciens. Con respecto a pSAM2, se demostró que la integrasa se une a estas repeticiones y que son esenciales para la recombinación eficaz (Raynal y col., 2002).
Además del sitio de integración genómico de ARNt de prolina, se demostró que pACPL subsiste en al menos doce copias (Fig. 2) como un elemento extracromosómico en una célula promedio de Actinoplanes sp. SE50/110 (Schwienteky col., 2012). pACPL hospeda 22 secuencias codificantes de proteínas.
El elemento integrador y conjugador de actinomiceto de la presente invención se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID 1, y
b) un polinucleótido que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de SEQ ID 1.
Los preferidos son los AICE que tienen al menos el 95 % de identidad con la secuencia de SEQ ID 1. Más preferidos son los AICE que tienen al menos el 98 % de identidad con la secuencia de SEQ ID 1.
Descripción detallada de las 22 secuencias codificantes de proteína de pACPL
El gen int (marca de locus genómico: ACPL_6310) codifica la integrasa del AICE con una longitud de 388 aminoácidos. Su secuencia muestra el 74 % de similitud con una integrasa (GenBank: EFL40120.1) de Streptomyces griseoflavus Tu4000 dentro de los primeros 383 aminoácidos. El dominio de integrasa de la proteína se localiza desde el aminoácido 182 al 365 y presenta una elevada similitud (e-valor2,90e-21) con el motivo de firma Int/Topo IB (dominio conservado: cd01182). La integrasa es responsable de la integración en un gen de ARNt por recombinación específica de sitio que se produce entre los dos sitios de unión similares attB en el cromosoma y attP en el AICE (te Poele, Bolhuis, y col., 2008).
El gen xis (marca de locus genómico: ACPL_6309) codifica la escisionasa del AICE con una longitud de 68 aminoácidos. Presenta la mayor similitud con la proteína hipotética Sros_7036 (GenBank: ACZ89735.1) de Streptosporangium roseum DSM 43021. La proteína contiene un motivo hélice-giro-hélice (pfam12728) moderadamente conservado (e-valor: 1,31e-07) entre los aminoácidos 9-55. Xis es necesario en combinación con Int para mediar la escisión del AICE del cromosoma en preparación para la amplificación y la transferencia a otros hospedadores (te Poele, Bolhuis, y col., 2008).
El gen repSA (marca de locus genómico: ACPL_6308) codifica la proteína de iniciación de replicación del AICE con una longitud de 598 aminoácidos. Tiene la mayor similitud con una proteína de iniciación de replicación de un plásmido putativo (GenBank: ADL48867.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029. La proteína se asemeja a la bien caracterizada proteína RepSA de Streptomyces ambofaciens que se ha descubierto que aplica un mecanismo de replicación en círculo rodante (Hagége y col., 1993).
El gen aicel (marca de locus genómico: ACPL_6307) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 97 aminoácidos. Presenta el 69 % de similitud en los primeros 80 aminoácidos con respecto a la proteína hipotética Micau_5360 (GenBank: ADL48866.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029.
El gen spdA (marca de locus genómico: ACPL_6306) codifica una proteína de difusión putativa del AICE con una longitud de 107 aminoácidos. SpdA presenta el 54 % de similitud con una proteína de difusión (GenBank: ABD10289.1) de Frankia sp. CcI3. Las proteínas de difusión están implicadas en la formación de pústulas, lo que refleja un retraso temporal del crecimiento de las células del receptor que se encuentran en proceso de adquisición de un AICE a partir de una célula donadora. De este modo, las proteínas de difusión ayudan en la difusión intramicelial (Kataoka y col.l, 1994; Grohmann y col., 2003; te Poele, Bolhuis, y col., 2008).
El gen spdB (marca de locus genómico: ACPL_6305) codifica una proteína de difusión putativa del AICE con una longitud de 169 aminoácidos. SpdB presenta el 84 % de similitud entre los aminoácidos 40-131 con respecto a una proteína de difusión (GenBank: AAX38998.1) de Micromonospora rosaria. Las proteínas de difusión están implicadas en la formación de pústulas, lo que refleja un retraso temporal del crecimiento de las células del receptor que se encuentran en proceso de adquisición de un AICE a partir de una célula donadora. De este modo, las proteínas de propagación ayudan en la difusión intramicelial (Kataoka y col., 1994; Grohmann y col., 2003; te Poele, Bolhuis y col., 2008). Se ha descubierto un péptido señal para SpdB, su sitio de escisión se predice en la posición 18. Además, se descubrieron tres hélices transmembrana en las posiciones i53-70o75-97i109-131o.
El gen aice2 (marca de locus genómico: ACPL_6304) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 96 aminoácidos. Presenta el 57 % de similitud entre los aminoácidos 12 - 89 con respecto a la proteína hipotética Micau_5358 (GenBank: ADL48864.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029.
El gen aice3 (marca de locus genómico: ACPL_6303) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 61 aminoácidos. No presenta similitud significativa con ninguna de las proteínas en bases de datos públicas.
El gen aice4 (marca de locus genómico: ACPL_6302) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 138 aminoácidos. Presenta el 69 % de similitud en los últimos 113 aminoácidos con respecto a la proteína hipotética Micau_5357 (GenBank: ADL48863.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029.
El gen aice5 (marca de locus genómico: ACPL_6301) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 108 aminoácidos. Presenta el 79 % de similitud con respecto a la secuencia de aminoácidos completa de la proteína hipotética Micau_5356 (GenBank: ADL48862.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029. Esta proteína tiene una coincidencia con pfam baja (e-valor 0,0022) para factores sigma con función extracitoplásmica (ECF). Estos factores sigma pueden unirse a la ARN polimerasa con el fin de estimular la transcripción de genes específicos. Se cree que se activan al recibir un estímulo del medio ambiente y son a menudo cotranscritos con uno o más reguladores negativos (Helmann, 2002).
El gen aice6 (marca de locus genómico: ACPL_6300) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 149 aminoácidos. Presenta el 50 % de similitud con la secuencia de aminoácidos completa de la proteína hipotética VAB18032_01645 (GenBank: AEB47413.1) de Verrucosispora maris AB-18-032.
El gen aice7 (marca de locus genómico: ACPL_6299) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 66 aminoácidos. No presenta similitud con ninguna de las proteínas en bases de datos públicas. Aice7 contiene una única hélice transmembrana que abarca desde el aminoácido 9 al 31.
El gen tra (marca de locus genómico: ACPL_6298) codifica la proteína principal de transferencia del AICE con una longitud de 293 aminoácidos. Presenta el 74 % de similitud a lo largo de la mayor parte con respecto a una proteína de división celular (GenBank: ADL48859.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029. Tra contiene un dominio con similitud significativa (e-valor 3,1e-14) con respecto al dominio FtsK/SpoIIIE entre los aminoácidos 29 - 187, que se encuentra en todos los AICE y genes de transferasa de Streptomyces (te Poele, Bolhuis, y col., 2008). Varios experimentos han proporcionado evidencias de que los homólogos de Tra son responsables de la translocación de a Dn de doble cadena a las cepas receptoras. La translocación se produce en las puntas de las hifas del micelio de apareamiento (Possoz y col., 2001; Reuthery col., 2006).
El gen aice8 (marca de locus genómico: ACPL_6297) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 124 aminoácidos. Presena el 44 % de similitud entre los aminoácidos 44 - 116 con respecto a la secuencia de la proteína FadE6 (GenBank: EGT86701.1) de Mycobacterium colombiense CECT 3035. Si bien la proteína completa FadE6 tiene 733 aminoácidos que se asemejan a una acil-CoA deshidrogenasa, es poco probable que Aice8 tenga una función similar ya que no contiene los dominios catalíticos de FadE6 y es de solo 124 aminoácidos de longitud.
El gen aice9 (marca de locus genómico: ACPL_6296) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 320 aminoácidos. Presenta el 68 % de similitud a lo largo de la mayor parte de la secuencia con respecto a la proteína hipotética Micau_5352 (GenBank: ADL48858.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029. Esta proteína contiene cuatro hélices transmembrana en las posiciones i32-51o57-79i88-110o115-134i.
El gen aice10 (marca de locus genómico: ACPL_6295) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 69 aminoácidos. No presenta similitud significativa con ninguna de las proteínas en bases de datos públicas.
El gen pra (marca de locus genómico: ACPL_6294) es probable que codifique el activador de los genes repSA, xis e int. Presenta una longitud de 105 aminoácidos y presenta el 90 % de similitud a lo largo de la secuencia completa con respecto a la proteína hipotética Micau_5352 (GenBank: ADL48857.1) de Micromonospora aurantiaca ATCC 27029. Se cree que Pra, que regula la transferencia y la replicación del AICE, es reprimido por el regulador transcripcional Korsa en el AICE pSAM2 de Streptomyces ambofaciens (Sezonov y col., 2000). Al reprimir Pra, el AICE permanece en su forma integrada en el cromosoma.
El gen reg (marca de locus genómico: ACPL_6293) codifica una proteína reguladora del AICE con una longitud de 444 aminoácidos. Presenta el 50 % de similitud a lo largo de la secuencia completa con respecto a un regulador putativo (GenBank: CCB75999.1) de Streptomyces cattleya NRRL 8057. Reg contiene un dominio de hélice-girohélice, que abarca los aminoácidos 4 - 72. Aunque la similitud de secuencia entre Reg y Korsa de pSAM2 es muy baja, la localización de reg entre los genes pra y nud puede ser una indicación de que Reg se asemeje a un homólogo de KorSA, el cual se encuentra frecuentemente en esta organización genética (te Poele, Bolhuis, y col., 2008).
El gen nud (marca de locus genómico: ACPL_6292) codifica una proteína que contiene un dominio de hidrolasa NUDIX entre los aminoácidos 29 - 144. Presenta un tamaño de 172 aminoácidos y presenta el 72 % de similitud a lo largo de la secuencia para una proteína hipotética (GenBank: EFL09132.1) de Streptomyces sp. AA4 y diversas hidrolasas NUDIX de especies estrechamente relacionadas. Nud presenta el 42 % de similitud entre los aminoácidos 21 - 108 con respecto a la proteína Pif de pSAM2. Pif también contiene un dominio de hidrolasa NUDIX, y se demostró que está involucrado en la señalización intercelular, que se cree que inhibe la replicación y la transferencia del AICE con el fin de evitar la transferencia redundante entre células que albergan pSAM2 (Possoz y col., 2003; te Poele, Bolhuis, y col., 2008). Por lo tanto, es probable que Pra, Reg y Nud en pACPL se asemejen a un mecanismo regulador similar al que Pra, Korsa y Pif realizan para pSAM2.
El gen mdp (marca de locus genómico: ACPL_6291) codifica una fosfohidrolasa dependiente de metal con una longitud de 80 aminoácidos. Presenta el 66 % de similitud a lo largo de su secuencia con respecto a una fosfohidrolasa dependiente de metal (GenBank: ABD10513.1) de Frankia sp. CcI3. Los genes que codifican mdp se encuentran con frecuencia en un grupo con homólogos de pra, reg y nud en otros AICE (te Poele, Bolhuis, y col., 2008). Las fosfohidrolasas dependientes de metal pueden estar implicadas en la transducción de señales o el metabolismo de ácidos nucleicos (te Poele, Samborskyy, y col., 2008).
El gen a ice ll (marca de locus genómico: ACPL_6290) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 256 aminoácidos. No presenta similitud significativa con ninguna de las proteínas en bases de datos públicas.
El gen aice12 (marca de locus genómico: ACPL_6289) codifica una proteína con función desconocida con una longitud de 93 aminoácidos. No presenta similitud significativa con ninguna de las proteínas en bases de datos públicas.
Referencias
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Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un elemento integrador y conjugador de actinomiceto que se selecciona del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y
b) un polinucleótido que consisten una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1.
2. El elemento integrador y conjugador de actinomiceto de la reivindicación 1 que consiste en una secuencia que tiene al menos el 95 % de identidad con la secuencia de la SEQ ID NO: 1.
ES12794734T 2011-12-08 2012-12-04 Nuevo elemento integrador y conjugador de actinomiceto de Actinoplanes sp. SE50/110 como plásmido para la transformación genética de actinobacterias relacionadas Active ES2718331T3 (es)

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