ES2948134T3 - Nuevas cepas bacterianas para la producción de vainillina - Google Patents

Nuevas cepas bacterianas para la producción de vainillina Download PDF

Info

Publication number
ES2948134T3
ES2948134T3 ES16785206T ES16785206T ES2948134T3 ES 2948134 T3 ES2948134 T3 ES 2948134T3 ES 16785206 T ES16785206 T ES 16785206T ES 16785206 T ES16785206 T ES 16785206T ES 2948134 T3 ES2948134 T3 ES 2948134T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amycolatopsis
strain
zyl
vanillin
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16785206T
Other languages
English (en)
Inventor
Mylène DARRICAU
Thomas Desfougeres
Jean-Luc Pernodet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lesaffre et Cie SA
Original Assignee
Lesaffre et Cie SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lesaffre et Cie SA filed Critical Lesaffre et Cie SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2948134T3 publication Critical patent/ES2948134T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C47/00—Compounds having —CHO groups
    • C07C47/52—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings
    • C07C47/575—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C47/58—Vanillin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02041—Vanillin synthase (4.1.2.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01101—Trans-feruloyl-CoA hydratase (4.2.1.101)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01034—Trans-feruloyl-CoA synthase (6.2.1.34)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La invención se refiere a una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 que tiene al menos una copia adicional de los genes fcs y ech que codifican feruloil-CoA-sintetasa y enoil-CoA hidratasa/aldolasa integrados en el sitio de integración del fago φ C31. La invención también se refiere al método para producir dichas cepas, al casete de integración de los genes fcs y ech, al uso de dichas cepas en un método para producir vainillina y a un método para producir vainillina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas cepas bacterianas para la producción de vainillina
Sector de la técnica
La presente invención se refiere al campo de la producción de la vainillina. Se refiere en particular a una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926.
Estado de la técnica
La vainillina es uno de los componentes principales del extracto de vainilla, que es un poderoso aromatizante natural que se obtiene de la vaina de una orquídea. La extracción de esta molécula de las vainas de vainilla es muy costosa, las cantidades producidas son limitadas y no cubren la demanda del mercado. Por lo tanto, se han buscado otras formas de obtener vainillina.
Por ejemplo, es posible obtener vainillina a partir de ácido ferúlico mediante una reacción de bioconversión utilizando bacterias. En la presente solicitud de patente sólo estamos interesados en la forma de bioconversión del ácido ferúlico en vainillina por las bacterias.
La vainillina es producida por bacterias mediante la desacetilación del ácido ferúlico a través de las 3 etapas siguientes:
1. activación del ácido ferúlico en feruloil-CoA, siendo la activación catalizada por una enzima, la feruloil-CoA sintetasa, en adelante FCS;
2. hidroxilación de la feruloil-CoA en 4-hidroxi-3-metoxifenil-p-hidroxipropionil-CoA, siendo la hidroxilación catalizada por una enzima, la enoil-CoA-hidratasa/aldolasa, en adelante ECH;
3. desacetilación de 4-hidroxi-3-metoxifenil-p-hidroxipropionil-CoA que permite la producción de vainillina, también catalizada por la enzima ECH.
La vainillina obtenida puede ser oxidada a continuación en ácido vanílico por una enzima, la vainillina deshidrogenasa, en adelante VDH. Sin embargo, no se desea la conversión de vainillina en ácido vanílico porque sólo la vainillina tiene las características aromáticas deseadas.
Según la nomenclatura CE de enzimas (Enzyme Commission number, número de la Comisión de enzimas):
- la enzima FCS tiene el código EC 6.2.1.34,
- la enzima ECH tiene los códigos EC 4.2.1.101 y EC 4.1.2.41,
- la enzima VDH tiene el código EC 1.2.1.67.
El documento EP 2 721 148 A1, equivalente a WO 2012/172108 A1, describe un microorganismo del género Amycolatopsis sin incluir el gen que codifica la vdh, permitiendo dicho microorganismo producir vainillina a partir de ácido ferúlico.
El documento EP 1611 244 A1 describe un procedimiento para producir vainillina que no utiliza disolventes orgánicos porque ahora se consideran indeseables en la industria agroalimentaria, durante la purificación para obtener una vainillina llamada "natural". Durante dicho procedimiento de producción de vainillina, la biotransformación del ácido ferúlico en vainillina se lleva a cabo por la cepa Amycolatopsis IMI390106, también llamada cepa Zyl 926 o cepa Amycolatopsis Zyl 926.
El libro "Practical Streptomyces Genetics", 2000, Kieser, et al. publicado por The John Innes Foundation, ISBN 0-7084­ 0623-8, en su capítulo 10, describe un método de conjugación entre Escherichia coli y Streptomyces que permite la integración del ADN en sitios específicos.
Sin embargo, las cepas del estado de la técnica utilizadas durante la reacción de bioconversión no permiten una conversión óptima del ácido ferúlico en vainillina. Dado el coste del ácido ferúlico, todavía existe la necesidad de nuevas cepas de bacterias que proporcionen una mejor conversión del ácido ferúlico en vainillina.
Objeto de la invención
El solicitante ha desarrollado por tanto nuevas cepas de bacterias según lo reivindicado, gracias a un procedimiento de transformación original, permitiendo tener un rendimiento molar mejorado durante la reacción de bioconversión. El objeto de la invención es una cepa Amycolatopsis sp. depositada ante la CNCM bajo el número I-4922, I-4923 o I-4924 el 11 de diciembre de 2014.
La invención también se refiere al uso de una cepa Amycolatopsis sp. tal como se definió anteriormente en un procedimiento de obtención de la vainillina.
La invención tiene también por objeto un procedimiento de producción de la vainillina, caracterizándose dicho procedimiento por que la reacción de bioconversión se lleva a cabo en un medio que comprende una cepa Amycolatopsis sp. tal como se define arriba.
Descripción detallada de la invención
En la presente solicitud se describe una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926, que posee al menos una copia suplementaria de los genes fcs y ech integrada en el sitio de integración del fago 9C31.
También se describe un procedimiento para obtener una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 por conjugación interespecífica.
También se describe un casete de integración que comprende el casete de expresión de los genes ech y fcs.
La presente invención se refiere a nuevas cepas de bacterias del género Amycolatopsis tal como se reivindican para su uso en la reacción de bioconversión de ácido ferúlico en vainillina.
Los inventores han desarrollado, después de largas investigaciones, nuevas cepas Amycolatopsis tal como se reivindican derivadas de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 que permiten tener un rendimiento molar mejorado en comparación con el estado de la técnica, durante la reacción de bioconversión de ácido ferúlico en vainillina gracias a la sobreexpresión de los genes fcs y ech en el genoma de la cepa Amycolatopsis Zyl 926.
Un rendimiento de bioconversión molar se define como la relación entre el número de moles de producto obtenido, en nuestro caso la vainillina, dividido por el número de moles de sustrato utilizado, en nuestro caso el ácido ferúlico. Cuando se expresa como un porcentaje, esta relación se multiplica por 100.
Por "rendimiento molar mejorado en comparación con el estado de la técnica", se entiende un rendimiento de bioconversión molar superior o igual al 80 %, preferentemente superior o igual al 85 % y aún más preferentemente igual al 90 %.
La cepa Amycolatopsis Zyl 926 ha sido depositada en CABI Bioscience, UK science centre en Egham, bajo el número IMI 390106 el 2 de marzo de 2003.
Las expresiones "cepa Zyl 926", "cepa Amycolatopsis Zyl 926", "cepa Amycolatopsis IMI 390106", "cepa Amycolatopsis depositada en CABI Bioscience bajo el número IMI 390106" son sinónimos en el presente documento.
Por "cepa(s) Amycolatopsis derivada(s) de la cepa Amycolatopsis Zyl 926", se entiende todas las cepas obtenidas después de la transformación de la cepa Zyl 926 por conjugación interespecífica que permite la integración de al menos una copia suplementaria de los genes fcs y ech.
Los inventores han demostrado además que las nuevas cepas Amycolatopsis tal como se reivindican también permiten mejorar la productividad y el consumo de la casi totalidad del ácido ferúlico durante la reacción de bioconversión. Por "consumo de la casi totalidad del ácido ferúlico", se entiende que al menos el 98 % del ácido ferúlico se consume durante la reacción de bioconversión, preferentemente al menos el 99 %, y aún más preferentemente el 100 %. En la presente solicitud se describe una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 que incluye: - al menos una copia suplementaria del gen fcs que codifica la feruloil-coA-sintetasa que tiene como secuencia la secuencia proteica SEQ ID NO: 1 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 1, y
- al menos una copia suplementaria del gen ech que codifica la enoil-coA-hidratasa/aldolasa que tiene como secuencia la secuencia proteica SEQ ID NO: 2 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 2,
dichas copias suplementarias de los genes fcs y ech integrándose específicamente en el sitio de integración del fago cpC31, también llamado sitio attB.
El artículo de Keravala et al. (Methods Mol Biol. 2008) menciona el uso de la integrasa del fago 9C31 como mediador para la integración cromosómica específica del sitio. Por lo tanto, permite realizar una recombinación unidireccional entre dos sitios att llamados attP y attB.
Por "copia suplementaria del gen", se entiende cualquier copia de un gen de interés integrado en el genoma de una cepa además de las copias del gen de interés inicialmente presentes en el genoma.
Se dice que una secuencia proteica o nucleica es idéntica a otra cuando el alineamiento entre las dos secuencias es perfecto, es decir, cuando existe una correspondencia perfecta respectivamente entre los aminoácidos o ácidos nucleicos de cada secuencia.
El porcentaje de identidad de secuencia se calcula dando una puntuación de 0 o 1 para cada aminoácido o base de la secuencia dependiendo de si hay identidad o no.
Las expresiones "gen ech que codifica la enoil-coA-hidratasa/aldolasa" y "gen fcs que codifica la feruloil-coA-sintetasa" no deben interpretarse estrictamente, sino que también deben abarcar las secuencias que codifican las variantes funcionales de estas enzimas. Normalmente, las variantes funcionales de estas enzimas FCS y ECH tienen una secuencia proteica con un porcentaje de identidad de al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 % y más particularmente preferentemente al menos el 95 % con las secuencias proteicas SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
De forma ventajosa, las copias suplementarias de los genes fcs y ech de la cepa Amycolatopsis se colocan bajo la dependencia del promotor fuerte ermE* asociado con un sitio de asociación del ribosoma, llamado RBS.
El promotor ermE* corresponde al promotor ermE modificado para darle una expresión fuerte y constitutiva.
El promotor ermE* tiene como secuencia la secuencia nucleica SEQ ID NO: 6 o cualquier secuencia al menos el 90 % idéntica, preferentemente al menos el 95 % y aún más preferentemente al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 6.
La secuencia del promotor ermE* es la descrita en el artículo de Bibb et al. (Mol Microbiol. 1994 Nov; 14(3):533-45)
Para obtener nuevas cepas originales tal como se reivindican, que sobreexpresan los genes ech y fcs, los inventores han demostrado después de una extensa investigación y experimentación que el método de conjugación interespecífica permite obtener transformantes que tienen integrada al menos una copia suplementaria de los genes ech y fcs y que el éxito de este método de integración de genes era dependiente del locus.
Por "dependiente del locus", se entiende el hecho de que las copias suplementarias de los genes de interés deben integrarse específicamente al nivel del sitio de integración del fago 9C31.
También se describe en la presente solicitud un procedimiento para obtener una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 tal como se describe anteriormente, que comprende las siguientes etapas:
a. amplificación por PCR de los genes fcs que codifican la feruloil-coA-sintetasa que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 1 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 1 y ech que codifica la enoil-coA-hidratasa/aldolasa que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 2 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 2, aislados de una cepa Amycolatopsis;
b. construcción de un vector que lleva las secuencias de ácido nucleico obtenidas en la etapa a., a partir del plásmido pSET152 que posee:
i. el gen int que codifica la integrasa del fago 9C31 que tiene como secuencia la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 3 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % de la secuencia SEQ ID NO: 3, el sitio de fijación del fago 9C31, a continuación el sitio attP que tiene como secuencia la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 4, y
iii. el origen de la conjugacion oriT funcional que tiene como secuencia la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 5 o cualquier secuencia al menos el 90 % idéntica, preferentemente al menos el 95 % y aún más preferentemente al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 5;
c. transformación por electroporación de la cepa Escherichia coli ET12567 con un plásmido de conjugación que comprende todos los genes que codifican la maquinaria de conjugación cuyo origen de conjugación oriT se vuelve no funcional, y el vector construido en la etapa b.;
d. selección de las cepas Escherichia coli ET12567 transformadas en la etapa c. por cultivo en un medio que contiene neomicina y una beta-lactamina;
e. conjugación interespecífica entre las cepas Escherichia coli ET12567 transformadas y seleccionadas en las etapas
c. y d. y la cepa Amycolatopsis Zyl 926, por puesta en cocultivo;
f. selección de las cepas Amycolatopsis Zyl 926 que han integrado al menos una copia suplementaria del gen fcs que codifica la feruloil-coA-sintetasa que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 1 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 1 y al menos una copia suplementaria del gen ech que codifica la enoil-coA-hidratasa que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 2 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 2 según la etapa e., por cultivo en un medio que contiene apramicina.
Los genes fcs y ech fueron aislados y amplificados a partir de una cepa Amycolatopsis mediante una técnica de PCR que es una técnica conocida por los expertos en la materia. Debido a las peculiaridades propias del genoma de Amycolatopsis, se utilizó preferentemente el kit "Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer" de New England Biolabs con el tampón GC Buffer.
Las secuencias de los cebadores utilizados son las siguientes secuencias:
- SEQ ID NO: 7: Van-ECH-F: 5' GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3'
- SEQ ID NO: 8: Van-ECH-R: 5' GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3'
Preferentemente los genes fcs y ech fueron aislados de la cepa Amycolatopsis Zyl 926.
El plásmido pSET152 es portador de la resistencia a la apramicina.
La construcción del vector según la etapa b. se realiza mediante la clonación de las copias suplementarias de los genes fcs y ech amplificados en la etapa a. en el plásmido pSET152 (Bierman et al., Gene, 116 (1): 43-49, 1992). El producto de PCR que contiene los genes ech y fcs se obtuvo utilizando como matriz el ADN genómico de la cepa Zyl926 y los cebadores Van-ECH-F (SEQ ID NO: 7) y Van-ECH-R (SEQ ID NO: 8). El fragmento por integrar se obtuvo por digestión con HindIII (+ Klenow) y XbaI. Los fragmentos HindIII (+ Klenow) y XbaI se clonaron en los sitios EcoRV y XbaI de pSET152.
Por gen int, se entiende el gen que codifica la integrasa del fago 9C31 que tiene como secuencia la secuencia proteica SEQ ID NO: 3 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % de la secuencia SEQ ID NO: 3.
El sitio de fijación del fago cpC31, también llamado sitio attP, presente en el plásmido pSET152, tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 4.
La secuencia SEQ ID NO: 4 es como sigue:
GCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGG
La selección de cepas Escherichia coli ET 12567 transformadas en la etapa c se realiza basándose en la adquisición por parte de estas cepas transformadas de la resistencia a la neomicina y a una beta-lactamina.
La puesta en cocultivo, para llevar a cabo la conjugación interespecífica de la etapa e., se lleva a cabo en condiciones convencionales conocidas por los expertos en la materia (Bierman et al., 1992 cf. supra) y preferentemente poniendo en contacto durante varias horas por una parte las Escherichia coli ET12567 obtenidas en la etapa d. previamente transformadas y convertidas en competentes para la transformación, y por otra parte células de Amycolatopsis Zyl 926 previamente sincronizadas para germinación por calentamiento.
La cepa Escherichia coli ET12567 es la cepa ATCC BAA-525 (MacNeil et al., Gen 111: 61-68, 1992).
La selección según la etapa f. de las cepas Amycolatopsis Zyl 926 que han integrado al menos una copia suplementaria de los genes fcs y ech se lleva a cabo basándose en la adquisición por parte de estas cepas de la resistencia a la apramicina.
Según una realización particular, el procedimiento para obtener una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 tal como se describe anteriormente, incluye una etapa adicional b'., entre las etapas b. y c., de amplificación y de clonación del promotor fuerte ermE* en el vector construido en la etapa b., dicho promotor ermE* que está asociado con un sitio de asociación del ribosoma, llamado RBS.
El promotor ermE* tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 6 o cualquier secuencia al menos el 90 % idéntica, preferentemente al menos el 95 % y aún más preferentemente al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 6.
Según una realización particular del procedimiento para la obtención de una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 tal como se describe anteriormente, el plásmido de conjugación de la etapa c. es el plásmido pUZ8002 descrito en el libro "Practical Streptomyces Genetics", 2000, Kieser, et al., capítulo 10, publicado por The John Innes Foundation, ISBN 0-7084-0623-8.
Según una realización particular del procedimiento para la obtención de una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 tal como se describe anteriormente, la beta-lactamina de la etapa d. es la ampicilina.
También se describe en la presente solicitud una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 susceptible de obtenerse por el procedimiento tal como se define anteriormente.
La presente invención se refiere particularmente a una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926, susceptible de obtenerse por el procedimiento tal como se define anteriormente, que se elige de la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-4922, la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-4923, y la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-4924.
Las cepas I-4922, I-4923 e I-4924 son cepas Amycolatopsis sp. depositadas en virtud del Tratado de Budapest el 11 de diciembre de 2014 ante la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos), 25 rue du Docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia.
También se describe en la presente solicitud un casete de integración que comprende:
i. un casete de expresión de los genes fcs que codifican la feruloil-coA-sintetasa que tienen como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 1 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 1 y ech que codifica la enoil-coA-hidratasa/aldolasa que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 2 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 2;
ii. medios que permiten la integración del casete en el genoma de la cepa Amycolatopsis Zyl 926, incluyendo el gen int del fago 9C31 que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 3 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % de la secuencia SEQ ID NO: 3 y el sitio de fijación del fago 9C31, sitio llamado attP que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 4;
iii. medios de selección de cepas Escherichia coli ET12567 transformadas que incluye neomicina y una betalactamina;
iv. medios de selección de cepas Amycolatopsis Zyl926 que han integrado dicho casete de integración, que comprenden un marcador de resistencia a la apramicina.
Un casete de integración es una construcción genética que comprende las herramientas necesarias para la integración de uno o más genes de interés en el genoma de un organismo, en este caso la cepa Amycolatopsis Zyl 926.
Según una realización particular, los genes que codifican la feruloil-coA-sintetasa y la enoil-coA-hidratasa/aldolasa del casete de expresión descrito anteriormente se colocan bajo el control del promotor fuerte ermE* que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 6 o cualquier secuencia al menos el 90 % idéntica, preferentemente al menos el 95 % y aún más preferentemente al menos el 99 % a la secuencia SEQ ID NO: 6 dicho promotor ermE* que está asociado con un sitio de asociación del ribosoma, también llamado RBS.
De acuerdo con una realización particular del casete de integración como se ha descrito anteriormente, la betalactamina es la ampicilina.
La invención también se refiere al uso de nuevas cepas Amycolatopsis sp. derivadas de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 como se describe anteriormente, en un procedimiento de producción de vainillina.
También se describe en la presente solicitud un procedimiento para la producción de vainillina que comprende las siguientes etapas:
a. disponer de una cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 depositada ante CABI Bioscience bajo el número IMI 390106 el 2 de marzo de 2003, que comprende al menos una copia suplementaria de los genes fcs que codifican la feruloil-coA-sintetasa que tienen como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 1 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 1. y ech que codifica Enoil-coA-Hidratasa/Aldolasa que tiene como secuencia la secuencia SEQ ID NO: 2 o cualquier secuencia al menos el 80 % idéntica, preferentemente al menos el 90 %, y aún más preferentemente al menos el 95 % a la secuencia SEQ ID NO: 2 y de la cual dichas copias suplementarias se integran específicamente en el sitio de integración del fago 9C31;
b. cultivar la nueva cepa Amycolatopsis derivada de la etapa a.;
c. poner en contacto el ácido ferúlico con dicho cultivo de la cepa Amycolatopsis de la etapa b. e incubar; d. extraer la vainillina del medio de cultivo.
La puesta en cultivo de nuevas cepas Amycolatopsis derivadas se realiza preferentemente en medios que contienen todos los nutrientes necesarios para el buen crecimiento de la bacteria, específicamente una fuente de carbono, a temperatura y pH regulados en fermentadores.
Una fuente de carbono puede ser, por ejemplo, glicerol.
La incubación según la etapa c. del procedimiento de producción de vainillina se lleva a cabo hasta consumir casi todo el ácido ferúlico y a una temperatura entre 37 °C y 41 °C.
Según una realización particular, el procedimiento de producción de vainillina es el procedimiento descrito en la solicitud EP 1611 244 A1.
Por lo tanto, la reacción de bioconversión durante el procedimiento de producción de vainillina se lleva a cabo en un medio que comprende una nueva cepa Amycolatopsis sp. derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 según la invención.
Según una segunda realización de la invención, la cepa Amycolatopsis derivada de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 implementada en el procedimiento de producción de vainilla en la etapa a., se selecciona entre la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-4922, la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-4923, y la cepa depositada en la CNCM bajo el número I-4924.
El procedimiento de producción de vainillina tal como se describe anteriormente tiene un rendimiento molar superior o igual al 80 %, preferentemente superior o igual al 85 % y aún más preferentemente igual al 90 %.
En el procedimiento de producción de vainillina tal como se describe anteriormente, se consume al menos el 98 % del ácido ferúlico, preferentemente al menos el 99 %, y aún más preferentemente el 100 %.
Los inventores que implementan dicho procedimiento para producir vainillina tal como se describe anteriormente con las nuevas cepas Amycolatopsis como se reivindican han observado sorprendentemente que:
- la casi totalidad del ácido ferúlico se consume durante la reacción de bioconversión;
- se mejora la productividad;
- se mejora el rendimiento molar;
y esto sin que aumente el flujo de vainillina deshidrogenasa que transforma la vainillina en ácido vanílico.
También se describe en la presente solicitud una nueva cepa Amycolatopsis tal como se describe anteriormente cuyo gen vdh que codifica la vainillina deshidrogenasa no se elimina. También se describe en la presente solicitud un procedimiento para obtener una nueva cepa Amycolatopsis tal como se describe anteriormente sin etapa de eliminación de los genes vdh que codifican la vainillina deshidrogenasa.
Ejemplos
EJEMPLO 1: Clonación de copias suplementarias de los genes ech y fcs en Zyl 926 en el sitio de integración del fago qC31
Material y método
Cepas bacterianas:
- Escherichia coli ET12567
- Amycolatopsis Zyl 926
Plásmidos:
- p SET 152: portador de un gen de resistencia a la ampicilina
- pUZ8002: portador de un gen de resistencia a la neomicina
a. amplificación
Los genes ech y fcs fueron amplificados a partir de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 con el kit "Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer"con tampón GC Buffer.
Los cebadores usados son los siguientes:
- SEQ ID NO: 7: Van-ECH-F: 5' GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3'
- SEQ ID NO: 8: Van-ECH-R: 5' GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3'
b. clonación
El fragmento por integrar se obtiene por digestión con HindlII (+ Klenow) y Xbal.
A continuación, el fragmento HindIII (+ Klenow) y Xbal se clona en los sitios EcoRV y Xbal de pSET152. El plásmido obtenido de este modo se denomina μLSF01a.
El plásmido pSET152 tiene el sistema de integración del fago 9C31, a saber:
- el gen int que codifica la integrasa del fago 9C31;
- el sitio attP de fijación del fago 9C31;
El plásmido pSET152 también tiene el origen de conjugación oriT funcional que permite su movilización y su transferencia de E. colia Amycolatopsis por la cepa E. coli ET12567 pUZ8002.
b'. amplificación y clonación del promotor ermE*
La adición del promotor ermE* y del gen de resistencia al cloranfenicol se realizó por recombinación in vivo entre secuencias idénticas cortas (focalización de PCR) como lo describe Yu et al. (2000) (Proc Natl Acad Sci USA. 23 de Mayo de 2000; 97(11):5978-83).
Para ello, una secuencia correspondiente al gen de resistencia al cloranfenicol, al promotor emE* y al RBS del gen tipA se obtuvo mediante PCR utilizando como matriz el plásmido pOSV605 y como cebadores los oligonucleótidos LG001 y LG002, las secuencias de los cebadores utilizadas son las siguientes:
- SEQ ID NO: 9: LG001:
5 ’ CAGCTATGACATGATTACGAATTCGATAGCTTAGCGATGCTCACGCAGUA
GACACTCAC 3’
- SEQ ID N0: 10: LG002:
5 ’ GCTCCGTCCGGACCCGCCCGTTGCCGACCGCTGTGCTCATATGTCCGCTC
CCTTCTCCCGCGAATTCACTAGTGATT 3’
Esto permitió obtener un fragmento que tiene en cada extremo secuencias idénticas a las de dos regiones cercanas en el plásmido μLSF01a:
- una en la parte del vector aguas arriba del gen ech,
- la otra en el extremo 5' del gen ech.
Ha tenido lugar la recombinación in vivo en la cepa DY330 (Yu et al. 2000) que contiene el plásmido μLSF01, después de la transformación con el producto de PCR.
Los clones que tenían integrado el promotor ermE* se seleccionaron basándose en la adquisición de la resistencia al cloranfenicol. Los clones seleccionados se denominan plásmidos μLSF02.
c. transformación
La cepa ET12567 que contiene el plásmido pUZ8002 se transforma por electroporación con el plásmido μLSF02 de las etapas b. y b'., incluyendo las copias suplementarias de los genes ech y fcs y el promotor fuerte ermE* asociado con el RBS.
d. selección de transformantes
La selección de los transformantes que poseen el plásmido μLSF02 se realiza en un medio que contiene apramicina. e. conjugación interespecífica
Las células de Amycolatopsis Zyl 926 se sincronizan para la germinación calentando a 50 °C durante 10 minutos. Los ransformantes (E. coli ET12567 pUZ8002 μLSF02) y las células de Amycolatopsis Zyl 926 preparadas de este modo se ponen en contacto mediante un cocultivo durante varias horas para llevar a cabo la conjugación interespecífica.
f. selección de las cepas Zyl 926 transformadas
La selección de las cepas Amycolatopsis Zyl 926 que tienen copias suplementarias integradas de los genes ech y fcs se lleva a cabo en un medio que contiene apramicina.
Resultados
Esta última etapa permitió en particular seleccionar las cepas depositadas en la CNCM bajo los números I-4922, I-4923 e I-4924 habiendo integrado las copias suplementarias de los genes ech y fcs en el sitio de integración del fago 9C31.
EJEMPLO 2: Clonación de copias suplementarias de los genes ech y fcs en Zyl 926 en el sitio de integración del fago 9BT 1
Material y método
Cepas bacterianas:
- Escherichia coli ET12567
- Amycolatopsis Zyl 926
Plásmidos:
- pOSV408: portador de un gen de resistencia a la kanamicina
- pUZ8002: portador de un gen de resistencia a la neomicina
a. amplificación
Los genes ech y fcs fueron amplificados a partir de la cepa Amycolatopsis Zyl 926 con el kit "Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer"con tampón GC Buffer.
Los cebadores utilizados son:
- SEQ ID NO: 7: Van-ECH-F: 5' GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3'
- SEQ ID NO: 8: Van-ECH-R: 5' GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3'
b. clonación
El fragmento por integrar se obtiene por digestión con HindlII (+ Klenow) y Xbal.
A continuación, el fragmento HindlII (+ Klenow) y Xbal se clona en los sitios EcoRV y Xbal de pOSV408. El plásmido obtenido de este modo se llama μLSF01b
El plásmido pOSV408 (KanaR) tiene el sistema de integración del fago 9BT1, a saber:
- el gen int que codifica la integrasa del fago 9BT1;
- el sitio attP de fijación del fago 9BT1;
El plásmido pOSV408 también tiene el origen de conjugación oriT funcional que permite su movilización y su transferencia de E. coli a Amycolatopsis por la cepa E. coli ET12567 pUZ8002.
b'. amplificación y clonación del promotor ermE*
La adición del promotor ermE* y del gen de resistencia al cloranfenicol se realizó por recombinación in vivo entre secuencias idénticas cortas (focalización de PCR) como lo describe Yu et al. (2000) (Proc Natl Acad Sci USA. 23 de Mayo de 2000; 97(11):5978-83).
Para ello, una secuencia correspondiente al gen de resistencia al cloranfenicol, al promotor ermE* y al RBS del gen tipA se obtuvo mediante PCR utilizando como matriz el plásmido pOSV605 y como cebadores los oligonucleótidos LG001 y LG002 teniendo respectivamente por secuencias las secuencias Se Q ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
Esto permitió obtener un fragmento que tiene en cada extremo secuencias idénticas a las de dos regiones cercanas en el plásmido μLSF01b:
- una en la parte del vector aguas arriba del gen ech,
- la otra en el extremo 5' del gen ech.
Ha tenido lugar la recombinación in vivo en la cepa DY330 (Yu et al. 2000) que contiene el plásmido μLSF01b, después de la transformación con el producto de PCR.
Los clones que tenían integrado el promotor ermE* se seleccionaron basándose en la adquisición de la resistencia al cloranfenicol. Los clones seleccionados se denominan plásmidos μLSF07.
c. transformación
La cepa ET12567 que contiene el plásmido pUZ8002 se transforma mediante electroporación con el plásmido μLSF07 procedente de las etapas anteriores, incluyendo las copias suplementarias de los genes ech y fcs y el promotor fuerte ermE* asociado con el RBS.
d. selección de transformantes
La selección de los transformantes que tienen integrado el plásmido μLSF07 se realiza en un medio que comprende kanamicina.
e. Conjugación interespecífica
Las células de Amycolatopsis Zyl 926 se sincronizan para la germinación calentando a 50 °C durante 10 minutos. Los transformantes y las células de Amycolatopsis Zyl 926 preparadas de este modo se ponen en contacto mediante un cocultivo durante varias horas para llevar a cabo la conjugación interespecífica.
f. Selección de las cepas Zyl 926 transformadas
La selección de las cepas Amycolatopsis Zyl 926 que han integrado copias suplementarias de los genes ech y fcs se lleva a cabo en un medio que contiene kanamicina.
Resultados
Esta última etapa permitió seleccionar las cepas depositadas en la CNCM el 11 de diciembre de 2014 bajo los números I-4925, I-4926 e I-4927 que han integrado las copias suplementarias de los genes ech y fcs en el sitio de integración del fago 9BT1.
EJEMPLO 3: Producción de vainillina por la cepa Amycolatopsis sp. I-4922
Material y método
Cepas bacterianas:
- CNCM-I-4922
- Zyl 926
El procedimiento para producir vainillina implementado en este ejemplo es el procedimiento citado en la solicitud EP 1 611 244 A1.
La productividad máxima se calcula según la siguiente ecuación:
Figure imgf000010_0001
El rendimiento molar se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:
Figure imgf000010_0002
El rendimiento en masa global de vainillina/ácido ferúlico se calcula según la siguiente ecuación:
Figure imgf000010_0003
Resultados
Los resultados obtenidos utilizando el procedimiento de producción de vainillina de la solicitud EP 1611 244 con la cepa según la invención I-4922 y la cepa Zyl 926 se presentan en la tabla 1 siguiente.
T l 1
Figure imgf000011_0001
Conclusión
Los resultados obtenidos muestran que la cepa según la invención I-4922 permite obtener una mayor cantidad de vainillina, un rendimiento molar mejorado, y el consumo de la casi totalidad del ácido ferúlico en comparación con la cepa Zyl 926 del estado de la técnica.
EJEMPLO 4: Comparación de la producción de vainillina utilizando las cepas I-4922 e I-4926
Material y método
Cepas bacterianas:
- CNCM-I-4922 (^C31)
- CNCM-I-4926 (9BT1)
- Zyl 926
El procedimiento para producir vainillina implementado en este ejemplo es el procedimiento citado en la solicitud EP 1 611 244 A1.
Resultados
Los resultados obtenidos mediante el procedimiento de producción de vainillina de la solicitud EP 1611 244 con las cepas I-4922, I-4926 y Zyl 926 se presentan en la Tabla 2 a continuación.
T l 2
Figure imgf000011_0002
Conclusión
Los resultados muestran que la cepa según la invención I-4922 que ha integrado al menos una copia suplementaria de los genes ech y fcs en el sitio de integración del fago 9C31 permite producir más vainillina en comparación con la cepa del estado de la técnica Zyl 926.
Los resultados también muestran que la cepa I-4926 que ha integrado al menos una copia suplementaria de los genes ech y fcs en el sitio de integración del fago 9BT1 no mejora la producción de vainillina en comparación con la cepa del estado de la técnica Zyl 926.
La integración de al menos una copia suplementaria de los genes ech y fcs según la invención en la cepa Zyl 926 es por lo tanto dependiente del locus.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Cepa Amycolatopsis sp. depositada ante la CNCM bajo el número I-4922, I-4923 o I-4924 el 11 de diciembre de 2014.
2. Uso en un procedimiento para la producción de vainillina a partir de una cepa Amycolatopsis sp. según la reivindicación 1.
3. Procedimiento de producción de vainillina caracterizado por que la reacción de bioconversión se lleva a cabo en un medio que comprende una cepa Amycolatopsis sp. según la reivindicación 1.
ES16785206T 2015-09-29 2016-09-22 Nuevas cepas bacterianas para la producción de vainillina Active ES2948134T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1559142A FR3041655B1 (fr) 2015-09-29 2015-09-29 Nouvelles souches bacteriennes pour la production de vanilline
PCT/FR2016/052403 WO2017055712A1 (fr) 2015-09-29 2016-09-22 Nouvelles souches bacteriennes pour la production de vanilline

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2948134T3 true ES2948134T3 (es) 2023-08-31

Family

ID=54545340

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16785206T Active ES2948134T3 (es) 2015-09-29 2016-09-22 Nuevas cepas bacterianas para la producción de vainillina

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10450591B2 (es)
EP (1) EP3356514B9 (es)
CN (1) CN108138125B (es)
ES (1) ES2948134T3 (es)
FR (1) FR3041655B1 (es)
PL (1) PL3356514T3 (es)
WO (1) WO2017055712A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755422B (zh) * 2021-10-09 2023-03-24 陕西海斯夫生物工程有限公司 一种高产香兰素的重组拟无枝酸菌、其构建方法与应用
CN117417952B (zh) * 2023-10-20 2024-05-24 陕西海斯夫生物工程有限公司 一种提高香兰素产量的重组拟无枝酸菌、其构建方法及应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19850242A1 (de) * 1998-10-31 2000-05-04 Haarmann & Reimer Gmbh Konstruktion von Produktionsstämmen für die Herstellung von substituierten Phenolen durch gezielte Inaktivierung von Genen des Eugenol- und Ferulasäure-Katabolismus
DE19960106A1 (de) * 1999-12-14 2001-06-21 Haarmann & Reimer Gmbh Enzyme und Gene für die Herstellung von Vanillin
CA2400087A1 (en) * 2000-02-18 2001-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Altered recombinases for genome modification
GB0307232D0 (en) 2003-03-28 2003-04-30 Zylepsis Ltd Production of vanillin
FR2912758B1 (fr) * 2007-02-21 2009-05-15 Mane Fils Sa V Systeme de production de molecules aromatiques chez streptomyces.
KR100918121B1 (ko) * 2008-01-14 2009-09-22 경상대학교산학협력단 아세틸-ＣｏＡ 소비를 증가시키는 대장균 균주 및 상기균주 및 흡착제 수지를 이용한 바닐린 생산 방법
WO2012172108A1 (en) * 2011-06-17 2012-12-20 Symrise Ag Microorganisms and methods for producing substituted phenols
CN102321563B (zh) * 2011-10-24 2013-04-03 江南大学 一株拟无枝酸菌及利用其全细胞转化制备香草醛的方法
JP6509215B2 (ja) * 2013-07-22 2019-05-08 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ フェルラ酸からのバニリンの迅速かつ高収率な製造のためのシュードモナス・プチダｋｔ２４４０の遺伝子操作
JP6596009B2 (ja) * 2013-11-04 2019-10-23 ビージーエヌ テック エルエルシー 植物デヒドロゲナーゼを用いるオイゲノールからのフェルラ酸の微生物発酵を介してバニリンを製造する方法

Also Published As

Publication number Publication date
FR3041655A1 (fr) 2017-03-31
WO2017055712A1 (fr) 2017-04-06
US10450591B2 (en) 2019-10-22
CN108138125A (zh) 2018-06-08
EP3356514B9 (fr) 2023-10-04
EP3356514A1 (fr) 2018-08-08
CN108138125B (zh) 2021-09-28
FR3041655B1 (fr) 2017-11-24
US20180320204A1 (en) 2018-11-08
EP3356514B1 (fr) 2023-06-07
EP3356514C0 (fr) 2023-06-07
PL3356514T3 (pl) 2023-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108753636B (zh) 一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法
US11946067B2 (en) Optimized genetic tool for modifying Clostridium bacteria
FI120353B (fi) Jyvästen muodossa olevia polyhydroksialkanoaatteja tuottavia transgeenisiä Arabidopsis thaliana -kasveja
KR20190058413A (ko) 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
WO2001007633A1 (en) Novel system for the sequential, directional cloning of multiple dna sequences
Chiba et al. Construction of a pair of practical Nocardia-Escherichia coli shuttle vectors
Peralta et al. Engineering the nifH promoter region and abolishing poly-β-hydroxybutyrate accumulation in Rhizobium etli enhance nitrogen fixation in symbiosis with Phaseolus vulgaris
EP3164485A1 (en) Microorganisms and methods for producing vanillin
CN112795527A (zh) 二氢蝶呤醛缩酶基因的用途
ES2948134T3 (es) Nuevas cepas bacterianas para la producción de vainillina
US7354751B2 (en) Alcohol dehydrogenase gene of acetic acid bacterium
Little et al. The butanol producing microbe Clostridium beijerinckii NCIMB 14988 manipulated using forward and reverse genetic tools
JP2010017131A (ja) モーレラ属細菌及びプライマー
CN116286574B (zh) 精准调控Bacillus subtilis内源多基因表达的CRISPRa方法及其应用
CN110283797B (zh) 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法
ES2718331T3 (es) Nuevo elemento integrador y conjugador de actinomiceto de Actinoplanes sp. SE50/110 como plásmido para la transformación genética de actinobacterias relacionadas
CN116103327A (zh) 一种少孢节丛孢菌的遗传转化筛选体系的建立方法
US9745566B2 (en) Recombinant microorganisms and methods of use thereof
US20230109758A1 (en) Genetically modified clostridium bacteria, preparation and uses of same
US9340809B2 (en) Microbial conversion of sugar acids and means therein
ES2543167T3 (es) Microorganismos con mayor actividad de sacarosa mutasa
CN114480464B (zh) 一种副溶血弧菌CRISPRi的双质粒构建方法
CN117106836B (zh) 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用
US20210261911A1 (en) Microorganisms engineered for muconate production
CN101892228A (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用