CN108138125A - 用于生产香草醛的新细菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株，其具有整合在

Description

用于生产香草醛的新细菌菌株
技术领域
本发明涉及生产香草醛的领域。它尤其涉及衍生自拟无枝酸菌 (Amycolatopsis)Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株，其制备方法，及其整合盒。
背景技术
香草醛是组成香草提取物的主要成分之一，其是从兰花豆中获得的一种强大的天然香气。从香草豆中提取这种分子非常昂贵；产生的量有限，不能满足市场需求。已经在寻找获得香草醛的其他方法。
例如，可以用细菌通过生物转化反应从阿魏酸获得香草醛。在本申请中，我们只关心通过细菌的香草醛的阿魏酸生物转化途径。
通过细菌产生香草醛是通过以下三个步骤将阿魏酸脱乙酰进行：
1.活化阿魏酰-CoA中的阿魏酸，活化通过一种酶即阿魏酰-CoA 连接酶(下文称为FCS)催化；
2.将4-羟基-3-甲氧基苯基-P-羟基丙酰-CoA中的阿魏酰-CoA羟基化，羟基化通过一种酶即烯酰-CoA水合酶/醛缩酶(下文称为ECH) 催化；
3.将4-羟基-3-甲氧基苯基-β-羟基丙酰-CoA脱乙酰，获得香草醛，也通过ECH酶催化。
获得的香草醛随后可以通过一种酶即香草醛脱氢酶(下文称为 VDH)氧化为香草酸。然而，不期望将香草醛转化为香草酸，因为只有香草醛具有期望的香气特征。
根据酶的EC命名法(酶委员会编号)：
-FCS酶的编码为EC 6.2.1.34；
-ECH酶的编码为EC 4.2.1.101和EC 4.1.2.41；
-VDH酶的编码为EC 1.2.1.67。
EP 2 721 148 A1描述了不包含编码VDH的基因的拟无枝酸菌属的微生物，所述微生物能够从阿魏酸生产香草醛。
EP 1 611 244 A1描述了在纯化中不需要使用有机溶剂的香草醛生产方法来获得称为“天然”的香草醛，因为现在食品工业中认为它们是不需要的。在所述香草醛生产过程中，拟无枝酸菌菌株IMI390106 (也称为Zyl 926菌株或拟无枝酸菌Zyl 926菌株)将阿魏酸生物转化为香草醛。
由John Innes Foundation出版的书"Practical Streptomyces Genetics",2000,Kieser等，ISBN 0-7084-0623-8在第10章中描述了在特定位点用于DNA整合的大肠杆菌(Escherichia coli)和链霉菌 (Streptomyces)之间转移的方法。
然而，现有技术中用于生物转化反应的菌株不允许阿魏酸到香草醛的最佳转化。鉴于阿魏酸的成本，仍然需要新的细菌菌株来确保阿魏酸更好地转化为香草醛。
发明简述
因此，申请人通过原创的转化方法开发了新的细菌菌株，允许生物转化反应期间摩尔产量的提高。
因此，本发明提供衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株，其具有在噬菌体整合位点整合的至少一个额外拷贝的 FCS和ECH基因。
本发明还涉及通过种间转移获得衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株的方法。
本发明还涉及包含ECH基因和FCS的表达盒的整合盒。
本发明还涉及所述菌株在用于获得香草醛的方法中的用途。
本发明还涉及香草醛生产方法。
发明详述
本发明涉及特别可用于阿魏酸至香草醛的生物转化反应的拟无枝酸菌属的新细菌菌株。
经过深入研究，发明人开发了衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的新拟无枝酸菌菌株，其比现有技术具有提高的摩尔产量，通过在926 拟无枝酸菌Zyl菌株的基因组中过表达FCS和ECH基因用于阿魏酸至香草醛的生物转化反应。
生物转化的摩尔产量定义为获得的产物(在本申请中是香草醛) 的摩尔数除以所用底物(在本申请中是阿魏酸)的摩尔数的比例。当表示为百分比时，该比例乘以100。
“与现有技术相比摩尔产量提高”是指生物转化的摩尔产量大于或等于80％，优选大于或等于85％，更优选等于或大于90％。
拟无枝酸菌Zyl 926菌株于2003年3月2日以保藏号IMI390106 保藏于埃格姆的UK科学中心，CABI生物科学。
术语“Zyl 96菌株”、“926拟无枝酸菌Zyl菌株”、“拟无枝酸菌IMI390106菌株”、“以保藏号IMI390106保藏于CABI生物科学的拟无枝酸菌菌株”在本文中是同义词。
“衍生自菌株拟无枝酸菌Zyl 926的拟无枝酸菌菌株”是指通过用于整合至少一个额外拷贝的FCS和ECH基因的种间转移转化Zyl 926菌株后获得的所有菌株。
发明人进一步证明，本发明的新菌株还可以提高生物转化反应中几乎所有阿魏酸的生产率和消耗。
“消耗基本上所有的阿魏酸”是指至少98％的阿魏酸在生物转化反应中消耗，优选至少99％，甚至更优选100％。
因此，本发明涉及包含以下的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株：
-至少一个额外拷贝的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因，所述阿魏酰-CoA合成酶具有蛋白质序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO： 1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列；和
-至少一个额外拷贝的编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH基因，所述烯酰-CoA水合酶/醛缩酶具有蛋白质序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，
所述额外拷贝的基因FCS和ECH特异性整合至噬菌体的整合位点(也称为attB位点)。
Keravala等(Methods Mol Biol.2008)的文章提及噬菌体整合酶作为位点特异性染色体整合的介导物的用途。因此，它允许称为 attP和attB的两个att位点之间的单向重组。
“额外拷贝的基因”是指任何拷贝的整合至菌株基因组的目标基因以及初始存在于基因组中的多个拷贝的基因。
当两个序列之间的比对完美时，即当各序列的氨基酸或核酸之间分别具有完全对应时，蛋白序列或核酸彼此相同。
通过是否具有同一性，对各氨基酸或碱基序列给予得分0或1，从而计算序列同一性百分比。
术语“编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH基因”和“编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因”不应当做狭义解释，而是应当涵盖编码这些酶的功能性变体的序列。
通常，这些酶FCS和ECH的功能性变体的蛋白序列与蛋白序列 SEQ ID NO：1和SEQID NO：2具有至少80％，优选至少90％，更特别优选至少95％的同一性百分比。
有利地，本发明涉及拟无枝酸菌菌株，其中额外拷贝的FCS和 ECH基因位于与核糖体结合位点(称为RBS)相关的强ermE*启动子的控制下。
ermE*启动子是修饰的ermE启动子，以提供强的组成型表达。
ermE*启动子具有核酸序列SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6 具有至少90％、优选至少95％，更优选至少99％同一性的任何序列。
ermE*启动子的序列描述于Bibb等的文章(Mol Microbiol.1994 Nov；14(3):533-45)。
为了获得过表达FCS和ECH基因的本发明的新的原始菌株，经过大量研究和实验，发明人发现，种间转移方法能够获得其中整合了至少一个补充拷贝的ECH和FCS基因，并且这种基因整合方法的成功是基因座依赖性的转化体。
术语“基因座依赖性”是指补充拷贝的目标基因必须特异性整合至噬菌体整合位点。
因此，本发明涉及用于获得如上所述的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926 菌株的拟无枝酸菌菌株的方法，包括以下步骤：
a)通过PCR扩增从拟无枝酸菌菌株分离的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH，所述阿魏酰 -CoA合成酶具有序列SEQ ID NO：1或与SEQID NO：1具有至少 80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰 -CoA水合酶/醛缩酶具有序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列；
b)从pSET152质粒构建携带步骤a获得的核酸序列的载体，所述质粒具有：
i.编码噬菌体整合酶的int基因，其具有核苷酸序列SEQ ID NO：3或与SEQID NO：3具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，
ii.噬菌体连接位点(以下称为attP位点)，其具有核苷酸序列SEQ ID NO：4，和
iii.转移oriT的功能性起点，其具有核苷酸序列SEQ ID NO：5 或与SEQ ID NO：5具有至少90％、优选至少95％，更优选至少99％同一性的任何序列；
c)通过电穿孔用转移质粒和步骤b构建的载体转化ET12567大肠杆菌菌株，所述转移质粒包含编码转移机制的所有基因，其中使得转移oriT的起点是非功能性的；
d)通过在包含新霉素和β内酰胺的培养基中培养选择步骤c中转化的ET12567大肠杆菌菌株；
e)通过设置共培养，在步骤c和d中转化并选择的ET12567大肠杆菌菌株和菌株拟无枝酸菌Zyl 926之间种间转移；
f)通过在包含安普霉素的培养基上培养选择根据步骤e的无枝酸菌Zyl 926菌株，其具有至少一个额外拷贝的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和至少一个额外拷贝的编码烯酰-CoA水合酶的ECH基因，所述阿魏酰-CoA合成酶具有质序列SEQ ID NO：1或与SEQ IDNO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶具有序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列。
通过本领域技术人员已知的PCR技术从拟无枝酸菌菌株分离并扩增FCS和ECH基因。由于拟无枝酸菌基因组的特定特征，优选使用High-Fidelity PCR MasterMix和来自New England Biolab 的GC Buffer试剂盒中的GC Buffer。
使用的引物序列是以下序列：
-SEQ ID NO:7:Van-ECH-F:
5’GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3’
-SEQ ID NO:8:Van-ECH-R:
5’GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3’
优选从菌株拟无枝酸菌Zyl 926中分离FCS和ECH基因。
pSET152质粒具有安普霉素抗性。
根据步骤b)的载体构建通过将步骤a扩增的额外拷贝的FCS和 ECH基因克隆至pSET152质粒(Bierman等,Gene,116(1):43-49, 1992)来进行。用菌株Zyl 926的基因组DNA基质和Van-ECH-F引物(SEQ ID NO:7)和Van-ECH-R(SEQ ID NO:8)获得包含ECH和FCS 基因的PCR产物。通过HindIII(+Klenow)和XbaI消化获得待整合的片段。将HindIII(Klenow+)和XbaI片段克隆至pSET152的EcoRV 和XbaI位点。
Int基因是指编码噬菌体的整合酶的基因，所述整合酶具有蛋白质序列SEQID NO：3或与SEQ ID NO：3具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列。
存在于pSET152质粒中的噬菌体连接位点(也称为attP位点)具有序列SEQID NO：4。
SEQ ID NO：4是以下：
GCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGG
选择转化的ET12567大肠杆菌菌株的步骤c)是在以下基础上进行的：这些转化菌株获得新霉素和β内酰胺抗性。
共培养种间转移产物的步骤e)在本领域技术人员已知的常规条件下进行(参见以上，Bierman等，1992)，优选通过将之前转化的并且准备用于转化的步骤d获得的一部分ET12567大肠杆菌与之前为了萌发通过加热同步化(synchronized)的拟无枝酸菌Zyl 926细胞接触几小时来进行。
大肠杆菌ET12567菌株是ATCC BAA-525(MacNeil等,Gene 111. 61-68,1992)。
选择整合了至少一个拷贝的FCS和ECH基因的拟无枝酸菌Zyl 926菌株的步骤f)是在以下基础上进行的：这些菌株获得安普霉素抗性。
根据一个具体的实施方案，本发明更具体地涉及获得如上所述的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株的方法，在步骤b 和c之间包括额外扩增强ermE*启动子并将其克隆至步骤b构建的载体中的步骤b’，所述ermE*启动子与称为RBS的核糖体结合位点相关。
ermE*启动子具有序列SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6具有至少90％、优选至少95％，更优选至少99％同一性的任何序列。
根据一个具体的方案，本发明更具体地涉及获得如上所述的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株的方法，其中步骤c的偶联质粒是描述于由The John InnesFoundation出版的书"Practical Streptomyces Genetics",2000,Kieser等，ISBN 0-7084-0623-8的第10 章的pUZ8002质粒。
根据一个具体的方案，本发明更具体地涉及获得如上所述的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株的方法，其中步骤d的β内酰胺是氨苄西林。
本发明还提供可以通过如上所述的方法获得的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株。
本发明还特别涉及可以通过如上所述的方法获得的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株，其选自以保藏号I-4922保藏于CNCM的菌株、以保藏号I-4923保藏于CNCM的菌株和以保藏号 I-4924保藏于CNCM的菌株。
菌株I-4922、I-4923和I-4924是根据布达佩斯条约，于2014年 12月11日保藏于CNCM(国家微生物培养物中心，25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15,France)的拟无枝酸菌种的菌株。
本发明还涉及包含以下的整合盒：
i.包含编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH的表达盒，所述阿魏酰-CoA合成酶具有序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶/醛缩酶具有序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列；
ii.用于将所述盒整合至菌株拟无枝酸菌Zyl 926的基因组的手段，包括噬菌体的int基因和称为attP位点的噬菌体连接位点，所述int基因具有序列SEQ IDNO：3或与SEQ ID NO：3具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列；所述噬菌体连接位点具有序列SEQ ID NO：4；
iii.用于选择包含新霉素和β内酰胺的转化的大肠杆菌ET12567 菌株的手段；
iv.用于选择包含安普霉素抗性标志物的已经整合了所述整合盒的拟无枝酸菌Zyl 926菌株的手段。
整合盒是包含将一个或多个目标基因整合至生物(在本文中是菌株拟无枝酸菌Zyl 926)基因组的必要工具的遗传构建体。
根据本发明一个具体的实施方案，如上所述的表达盒中的编码阿魏酰-CoA合成酶和烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的基因位于强ermE*启动子的控制下，所述ermE*启动子具有序列SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6具有至少90％、优选至少95％，更优选至少99％同一性的任何序列，所述ermE*启动子与称为RBS的核糖体连接位点相关。
根据一个具体的实施方案，本发明更具体地涉及如上所述的整合盒，其中所述β内酰胺是氨苄西林。
本发明还涉及如上所述的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株在香草醛生产方法中的用途。
本发明还涉及用于生产香草醛的方法，包括以下步骤:
a.提供衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株，所述拟无枝酸菌Zyl926菌株以保藏号IMI390106于2003年3月2日保藏于CABI生物科学，所述拟无枝酸菌菌株包含至少一个额外拷贝的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的 ECH基因，所述阿魏酰-CoA合成酶具有序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶/醛缩酶具有序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述额外拷贝特异性整合至噬菌体整合位点；
b.培养从步骤b获得的新拟无枝酸菌菌株；
c.将阿魏酸与步骤b的拟无枝酸菌菌株的所述培养物接触，并孵育；
d.从培养基提取香草醛。
新衍生的拟无枝酸菌菌株的培养优选在包含细菌良好生长所需的所有营养物的培养基上进行，包括在发酵器中调节的温度和pH下的碳源。
碳源可以是例如甘油。
在37-41℃的温度下进行根据香草醛生产方法的步骤c的孵育，直至消耗基本上所有的阿魏酸。
根据本发明一个具体的实施方案，香草醛生产方法是EP 1 611 244 A1描述的方法。
因此，生物转化反应是在包含根据本发明的衍生自拟无枝酸菌 Zyl 926菌株的新拟无枝酸菌种的培养基中进行的香草醛生产过程。
根据本发明一个具体的实施方案，在香草醛生产方法的步骤a中所用的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株选自以保藏号I-4922保藏于CNCM的菌株、以保藏号I-4923保藏于CNCM的菌株和以保藏号I-4924保藏于CNCM的菌株。
本发明更具体地涉及如上所述的香草醛生产方法，其中摩尔产量大于或等于80％、优选大于或等于85％，更优选等于90％。
本发明更具体地涉及如上所述的香草醛生产方法，其中消耗至少 98％阿魏酸，优选至少99％，更优选100％。
因此，发明人使用本发明的新拟无枝酸菌菌株实施如上所述的香草醛生产方法，出乎意料地发现：
-在有机反应转化中几乎消耗了所有阿魏酸；
-生产率提高了；
-摩尔产量提高了；和
没有增加将香草醛转化为香草酸的香草醛脱氢酶的流量。
本发明还涉及如上所述的新拟无枝酸菌菌株，其中编码香草醛脱氢酶的基因vdh被移除。
本发明还涉及用于获得如上所述的新拟无枝酸菌菌株的方法，不包括移除编码香草醛脱氢酶的基因vdh的步骤。
具体实施方式
实施例1：在Zyl 926的 噬菌体整合位点克隆额外拷贝的ECH和FCS基因。
材料和方法
细菌菌株：-大肠杆菌ET12567；-拟无枝酸菌Zyl 926
质粒：-pSET152：携带氨苄西林抗性基因；
-pUZ8002：携带新霉素抗性基因。
a.扩增
使用“High-Fidelity PCR Master Mix和GC Buffer”试剂盒和GCBuffer从拟无枝酸菌Zyl 926菌株扩增ECH和FCS基因。
所用的引物是：
-SEQ ID NO:7:Van-ECH-F:
5’GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3’
-SEQ ID NO:8:Van-ECH-R:
5’GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3’
b.克隆
通过HindIII(+Klenow)和XbaI消化获得待整合的片段。
然后将HindIII(+Klenow)和XbaI片段克隆至pSET152的EcoRV 和XbaI位点。由此所得的质粒称为pLSF01a。
pSET152质粒具有噬菌体的整合系统，即
-编码噬菌体的整合酶的int基因；
-噬菌体的attP连接位点。
pSET152质粒还具有转移oriT的功能性起点，其允许调动并通过大肠杆菌菌株ET12567+pUZ8002将大肠杆菌转移至拟无枝酸菌。
b’.扩增并克隆ermE*启动子。
通过如Yu等(2000)(Proc Natl Acad Sci US A.2000 23May；97 (ll):5978-83)所述的短相同序列(PCR靶向)之间的体内重组添加 ermE*启动子和氯霉素抗性基因。
为此，用pOSV605质粒作为基质，并使用寡核苷酸LG001和 LG002作为引物，通过PCR获得与氯霉素抗性基因、ermE*启动子和 tipA基因的RBS对应的序列。所用引物的序列如下：
SEQ ID NO:9:LG001:
5’CAGCTATGACATGATTACGAATTCGATAGCTTAGCGATG CTCACGCAGTTA GACACTCAC 3’
SEQ ID NO:10:LG002:
5’GCTCCGTCCGGACCCGCCCGTTGCCGACCGCTGTGCTCAT ATGTCCGCTCCCTTCTCCCGCGAATTCACTAGTGATT 3’
这产生的片段在两端具有与pLSF01a质粒的两个相邻区域相同的序列：
-一个在ECH基因上游的载体部分中，
-另一个在ECH基因的5’端。
重组在菌株DY330(Yu等，2000)的体内发生，所述菌株DY330 包含用PCR产物转化后的pLSF01质粒。
基于获得的氯霉素抗性，选择已经整合了ermE*启动子的克隆。选择的克隆称为pLSF02质粒。
c.转化
通过电穿孔用来自步骤b和b’的pLSF02质粒转化包含pUZ8002 质粒的ET12567菌株，所述pLSF02质粒包含额外拷贝的ECH和FCS 基因，以及与RBS相关的强ermE*启动子。
d.选择转化体
在包含安普霉素的培养基上选择具有pLSF02质粒的转化体。
e.种间转移
通过在50℃加热10分钟，将拟无枝酸菌Zyl 926细胞同步化以萌发。
然后将转化体(大肠杆菌ET12567+pUZ8002+pLSF02)和由此制备的拟无枝酸菌Zyl926细胞接触，通过共培养数小时进行种间转移。
f.选择转化的Zyl 926菌株。
在包含安普霉素的培养基上选择已经整合了额外拷贝的ECH和 FCS基因的拟无枝酸菌Zyl 926菌株。
结果
最后一步选择了以保藏号I-4922、I-4923、I-4924保藏于CNCM的菌株，其已经在噬菌体整合位点整合了额外拷贝的ECH和 FCS基因。
实施例2：在Zyl 926的 噬菌体整合位点克隆额外拷贝的ECH和FCS基因。
材料和方法
细菌菌株：-大肠杆菌ET12567；-拟无枝酸菌Zyl 926
质粒：-pOSV408：携带卡那霉素抗性基因；
-pUZ8002：携带新霉素抗性基因。
a.扩增
使用“High-Fidelity PCR Master Mix和GC Buffer”试剂盒和GCBuffer从拟无枝酸菌Zyl 926菌株扩增ECH和FCS基因。
所用的引物是：
-SEQ ID NO:7:Van-ECH-F:
5’GAAGCTTGAGCGATGCATGAGCACAGC 3’
-SEQ ID NO:8:Van-ECH-R:
5’GTCTAGACTGGTTGCGCACTACTTCTC 3’
b.克隆
通过HindIII(+Klenow)和XbaI消化获得待整合的片段。
然后将HindIII(+Klenow)和XbaI片段克隆至pOSV408的EcoRV 和XbaI位点。由此所得的质粒称为pLSF01b。
pOSV408质粒(KanaR)具有噬菌体的整合系统，即
-编码噬菌体的整合酶的int基因；
-连接噬菌体的attP位点。
p OSV408质粒还具有转移oriT的功能性起点，其允许调动并通过大肠杆菌菌株ET12567+pUZ8002将大肠杆菌转移至拟无枝酸菌。
b’.扩增并克隆ermE*启动子。
通过如Yu等(2000)(Proc Natl Acad Sci US A.200023May；97 (ll):5978-83)所述的短相同序列(PCR靶向)之间的体内重组添加ermE*启动子和氯霉素抗性基因。
为此，用pOSV605质粒作为基质，并使用序列分别为SEQ IDNO： 9和SEQ ID NO：10的寡核苷酸LG001和LG002作为引物，通过 PCR获得与氯霉素抗性基因、ermE*启动子和tipA基因的RBS对应的序列。
这产生的片段在两端具有与pLSF01b质粒的两个相邻区域相同的序列：
-一个在ECH基因上游的载体部分中，
-另一个在ECH基因的5’端。
重组在菌株DY330(Yu等，2000)的体内发生，所述菌株DY330 包含用PCR产物转化后的pLSF01b质粒。
基于获得的氯霉素抗性，选择已经整合了ermE*启动子的克隆。选择的克隆称为pLSF07质粒。
c.转化
通过电穿孔用来自之前步骤的pLSF07质粒转化包含pUZ8002质粒的ET12567菌株，所述pLSF07质粒包含额外拷贝的ECH和FCS 基因，以及与RBS相关的强ermE*启动子。
d.选择转化体
在包含卡那霉素的培养基上选择已经整合了pLSF07质粒的转化体。
e.种间转移
通过在50℃加热10分钟，将拟无枝酸菌Zyl 926细胞同步化以萌发。
然后将转化体和由此制备的拟无枝酸菌Zyl 926细胞接触，通过共培养数小时进行种间转移。
f.选择转化的Zyl 926菌株。
在包含卡那霉素的培养基上选择已经整合了额外拷贝的ECH和 FCS基因的拟无枝酸菌Zyl 926菌株。
结果
最后一步用于选择以保藏号I-4925、I-4926、I-4927保藏于CNCM的菌株，其已经在噬菌体整合位点整合了额外拷贝的ECH和 FCS基因。
实施例3：通过拟无枝酸菌种菌株I-4922生产香草醛
材料和方法
细菌菌株：-CNCM I-4922；-Zyl 926.
本实施例中所用的香草醛生产方法是EP 1 611 244 A1中提及的方法。
使用以下等式计算最大生产率：
使用以下等式计算摩尔产量：
根据以下等式计算香草醛/阿魏酸的总体质量产量：
结果
下表1示出了用根据本发明的I-4922菌株和Zyl 926菌株进行的 EP 1 611 244的香草醛生产方法获得的结果。
表1
注意，密度接近1，单位g/kg等于g/L。
结论：
所得结果表明，基于现有技术的Zyl 926菌株，根据本发明的 I-4922菌体提供更大量的香草醛、提高的摩尔产量，并且消耗了基本上所有的阿魏酸。
实施例4：使用菌株I-4922和I-4926生产香草醛的比较
材料和方法
细菌菌株：-CNCM-I-4922
-CNCM-I-4926
-Zyl 926。
本实施例中所用的香草醛生产方法是EP 1 611 244 A1中提及的方法。
结果：
下表2示出了用菌株I-4922、I-4926和Zyl 926进行的EP 1 611 244的香草醛生产方法获得的结果。
表2
Zyl 926 I-4926 I-4922
初始阿魏酸浓度 25g/L 24.8g/Kg 25.5g/Kg
产生的香草醛 13.8g/L 14.4g/Kg 17.5g/Kg
结论
结果表明，与现有技术的Zyl 926菌株相比，在噬菌体整合位点整合了至少一个拷贝的ECH和FCS基因的根据本发明的 I-4922菌株能够产生更多的香草醛。
结果还表明，与现有技术的Zyl 926菌株相比，在噬菌体整合位点整合了至少一个额外拷贝的ECH和FCS基因的I-4926菌株不能提高香草醛的生产。
在Zyl 926菌株中，至少一个额外拷贝的ECH和FCS基因的整合是基因座依赖性的。

Claims (13)

1.衍生自以保藏号IMI390106于2003年3月2日保藏于CABI生物科学的拟无枝酸菌Zyl926菌株的拟无枝酸菌菌株，其特征在于，它包含至少一个额外拷贝的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和至少一个额外拷贝的编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH基因，所述阿魏酰-CoA合成酶具有蛋白质序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶/醛缩酶具有蛋白质序列SEQ IDNO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述额外拷贝的FCS和ECH基因特异性整合至噬菌体整合位点。
2.根据权利要求1所述的拟无枝酸菌菌株，其特征在于，所述额外拷贝的FCS和ECH基因位于与核糖体连接位点相关的强ermE*启动子的控制下。
3.获得衍生自以保藏号IMI390106于2003年3月2日保藏于CABI生物科学的拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌菌株的方法，所述拟无枝酸菌菌株包含至少一个额外拷贝的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和至少一个额外拷贝的编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH基因，所述阿魏酰-CoA合成酶具有蛋白质序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶/醛缩酶具有蛋白质序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述额外拷贝的FCS和ECH基因特异性整合至噬菌体整合位点，所述方法包括以下步骤：
a.PCR扩增从拟无枝酸菌菌株分离的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH，所述阿魏酰-CoA合成酶具有序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶/醛缩酶具有序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列；
b.从pSET152质粒构建携带步骤a获得的核酸序列的载体；
c.通过电穿孔用质粒和步骤b构建的载体转化ET12567大肠杆菌菌株，所述质粒包含编码转移机制的所有基因，其中使得转移oriT的起点是非功能性的；
d.通过在包含新霉素和β内酰胺的培养基中培养选择步骤c中转化的ET12567大肠杆菌菌株；
e.实施共培养，在步骤c和d中转化并选择的ET12567大肠杆菌菌株和以保藏号IMI390106于2003年3月2日保藏于CABI生物科学的拟无枝酸菌Zyl 926菌株之间种间转移；
f.通过在包含安普霉素的培养基上培养选择根据步骤e的无枝酸菌Zyl 926菌株，其具有至少一个额外拷贝的编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和至少一个额外拷贝的编码烯酰-CoA水合酶的ECH基因，所述阿魏酰-CoA合成酶具有质序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶具有序列SEQ ID NO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，它在步骤b和c之间包括额外扩增强ermE*启动子并将其克隆至步骤b构建的载体中的步骤b’，所述ermE*启动子具有序列SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6具有至少90％、优选至少95％，更优选至少99％同一性的任何序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤c中的偶联质粒是pUZ8002质粒。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述β内酰胺是氨苄西林。
7.可以通过根据权利要求3-6任一项所述的方法获得的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌种菌株。
8.根据权利要求1-2任一项或7所述的拟无枝酸菌种菌株，其选自以保藏号I-4922保藏于CNCM的菌株、以保藏号I-4923保藏于CNCM的菌株和以保藏号I-4924保藏于CNCM的菌株。
9.一种整合盒，其特征在于，它包含：
i.编码阿魏酰-CoA合成酶的FCS基因和编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ECH的表达盒，所述阿魏酰-CoA合成酶具有序列SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列，所述烯酰-CoA水合酶/醛缩酶具有序列SEQ IDNO：2或与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列；
ii.用于将所述盒整合至菌株拟无枝酸菌Zyl 926的基因组的手段，包括噬菌体的int基因和噬菌体的attP连接位点，所述int基因具有序列SEQ ID NO：3或与SEQID NO：3具有至少80％、优选至少90％，更优选至少95％同一性的任何序列；所述噬菌体的attP连接位点具有序列SEQ ID NO：4；
iii.用于选择包含新霉素和β内酰胺的转化的大肠杆菌ET12567菌株的手段；
iv.用于选择包含安普霉素抗性标志物的已经整合了所述整合盒的拟无枝酸菌Zyl926菌株的手段。
10.根据权利要求9所述的整合盒，其特征在于，所述表达盒中的编码阿魏酰-CoA合成酶和烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的FCS和ECH基因位于ermE*启动子的控制下，所述ermE*启动子具有序列SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：6具有至少90％、优选至少95％，更优选至少99％同一性的任何序列，所述ermE*启动子与核糖体连接位点相关。
11.根据权利要求9或10所述的整合盒，其特征在于，所述β内酰胺是氨苄西林。
12.根据权利要求1-2和/或7-8任一项所述的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌种菌株在生产香草醛的方法中的用途。
13.一种生产香草醛的方法，其特征在于，生物转化反应在包含根据权利要求1-2和/或7-8任一项所述的衍生自拟无枝酸菌Zyl 926菌株的拟无枝酸菌种菌株的培养基上进行。
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