CN113249281B

CN113249281B - 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN113249281B
Application number: CN202010082993.7A
Authority: CN
Inventors: 赵广; 孙慎美; 咸漠; 刘敏
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2020-02-07
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2040-02-07
Also published as: CN113249281A

Abstract

本发明涉及一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为提高间苯三酚生物合成效率，本发明提供了一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌,以大肠杆菌为出发菌株，过表达突变了两个关键位点的乙醇脱氢酶基因adhE(A267T,E568K)(267位的丙氨酸突变为苏氨酸，568位的谷氨酸突变为赖氨酸)，聚酮合酶基因phlD。本发明首次实现以乙醇为碳源，经乙酰辅酶A转化形成间苯三酚的生物合成路径，为乙醇的生物利用以及间苯三酚的微生物合成提供了新的技术方法。

Description

一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

间苯三酚及其衍生物是生物系统中广泛存在的一类次级代谢产物，广泛存在于多种植物与微生物中。间苯三酚作为重要的精细化学品之一，其及其衍生产品广泛应用于不同领域具有很高的商业价值。间苯三酚广泛应用于医药行业，其既是合成癌症治疗药物黄酮类化合物的中间体，自身又可作为一种药物作用于平滑肌，解除解痉症状其优点在于不会产生一系列抗胆碱样以及其他心血管方面的副作用。同时还常用产妇阵痛，能显著缓解产妇的不适感。间苯三酚可增加了过氧化氢酶活性及其蛋白的表达，具备抗氧化抗炎的效果，能用于水果防腐等方面。此外间苯三酚是化工生产的重要原料，能充作多种物系，如戊二醛溶液、合成橡胶、复合改性双元燃料火箭推进剂(CMDB)的稳定剂；也能用于新型酞类燃料的合成；它也可广泛用于轮胎增粘剂以及偶氮复合油墨等原料简。间苯三酚也常应用于农业生产，酰基化间苯三酚通常具有良好的生物活性，例如2，4-二乙酰基间苯三酚能够防治多种植物病害，能够很好地抑制真菌以及线虫。

上世纪50年代开始，人们在探索间苯三酚合成工艺的进程中发明了几种有明显优势的化学合成方法，包括三硝基甲苯(TNT)法、异丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。间苯三酚作为一种药物中间体要求有较高的纯度，在化学合成方法中，因氧化及酸分解过程中产生大量的副产物，使得最终产品的分离提纯比较困难，这些副产物与间苯三酚性质相似，加之间苯三酚的易氧化性和较差的热稳定性，因此用简单的物理方法很难得到高纯度产品。作为一种精细的化工用品，在工业生产和医药生产中的广泛应用与间苯三酚的合成困难形成鲜明对比，尤其是间苯三酚在医药产业中的应用对其纯度有更高的要求。

鉴于化学法生产间苯三酚存在安全隐患、污染大、质量以及纯度低等问题，研究者开始转向用微生物生产间苯三酚。生物合成主要是通过构建基因工程大肠杆菌，异源表达合成间苯三酚的基因，发酵产生间苯三酚。通过基因工程手段不断优化工程菌株，增强大肠杆菌对间苯三酚的抗性作用，同时还要对间苯三酚的发酵工艺进行优化，提高间苯三酚的合成浓度和产率。

发明内容

为提高间苯三酚生物合成效率，本发明提供了一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌，所述重组菌过表达突变的乙醇脱氢酶基因adhE和聚酮合酶基因phlD，宿主菌为大肠杆菌。

优选地，所述乙醇脱氢酶基因phlD来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，Genbank登录号为945837；所述突变的乙醇脱氢酶基因adhE其编码的氨基酸第267位由丙氨酸突变为苏氨酸，记为A267T，第568位由谷氨酸突变为赖氨酸，记为E568K；所述聚酮合酶基因phlD来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，Genbank登录号为3480329。

本发明的另一目的是提供一种上述重组菌的构建方法，步骤如下：

1)克隆获得乙醇脱氢酶基因adhE，将267位的丙氨酸突变为苏氨酸，568位的谷氨酸突变为赖氨酸，得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE；克隆获得聚酮合酶基因phlD；

2)将步骤1)得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE连接到质粒载体，获得重组质粒I；

3)将步骤1)所得的聚酮合酶基因phlD连接到质粒载体，获得重组质粒II；

4)将步骤2)所得的重组质粒I和步骤3)所得的重组质粒II同时导入到宿主细胞，获得重组菌。

优选地，步骤2)所述质粒载体，为质粒pACYCDuet-1。

优选地，步骤3)所述质粒载体，为质粒pET28a。

优选地，步骤4)所述宿主细胞，为大肠杆菌细胞。

更优选地，上述重组菌的构建方法具体步骤如下：

1)以大肠杆菌基因组DNA为模板，设计引物克隆乙醇脱氢酶基因adhE；以荧光假单胞菌基因组为模板，设计引物克隆聚酮合酶基因phlD。

2)将步骤1)所得的乙醇脱氢酶基因adhE连接到质粒pACYCDuet-1，获得重组质粒pACYCDuet-adhE，以重组质粒pACYCDuet-adhE作为模板，利用定点突变试剂盒突变adhE两个关键位点A267T和E568K，获得带有突变位点的重组质粒记为：pACYCDuet-adhE(A267T,E568K)。

3)将步骤1)所得的聚酮合酶基因phlD连接到质粒载体pET28a，获得重组质粒pET28a-phlD。

4)将步骤2)所得的重组质粒pACYCDuet-adhE(A267T,E568K)和步骤3)所得的重组质粒pET28a-phlD同时导入受体细胞E.coli W3110，获得重组菌ZG-3433。

优选地，步骤1)中克隆乙醇脱氢酶基因adhE所用引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示；步骤2)中将第267位的丙氨酸突变为苏氨酸所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示；将第568位的谷氨酸突变为赖氨酸所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示；步骤1)中克隆聚酮合酶基因phlD所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8。

本发明另外一个目的在于提供上述重组菌在发酵生产间苯三酚中的应用。

进一步限定，所述生产间苯三酚步骤如下：

1)活化上述构建的重组菌，获得活化重组菌；

2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有卡那霉素和氯霉素的柠檬酸铁铵液体培养基中进行发酵培养。

更进一步地限定，步骤2)所述的发酵培养，是按2％的接种量接种，在37℃，180rpm的条件下培养至OD600达到0.6时，加入100μM异丙基硫代半乳糖苷诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养48h后终止发酵。

进一步地限定，本发明所述重组载体导入宿主菌采用热激转化法。

有益效果

本发明以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，实现了以乙醇为底物，合成得到间苯三酚，为乙醇的生物利用以及间苯三酚的微生物合成提供了新的技术方法。

本发明通过在大肠杆菌中过表达大肠杆菌的乙醇脱氢酶基因adhE(A267T,E568K)；同时过表达荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的聚酮合酶基因phlD，首次实现以乙醇为碳源，经乙酰辅酶A转化形成间苯三酚的生物合成路径。

定义和缩写：

在本发明中使用下列的缩写或简称：

乙醇脱氢酶基因：adhE

聚酮合酶基因:phlD

大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)：E.coli

荧光假单胞菌：(Pseudomonas fluorescens)

“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。

“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

附图说明

图1为利用乙醇合成间苯三酚的代谢途径示意图；

图2为pACYCDuet-adhE(A267T,E568K)载体图谱；

图3为pET28a-phlD载体图谱；

图4为本发明重组菌的生长情况图，横坐标为时间(h)，纵坐标为OD600值；

图5为本发明重组菌的间苯三酚的生产情况图，横坐标为时间(h)，纵坐标为间苯三酚产量(g/L)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)种子液摇瓶培养基

LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。

2)发酵生产摇瓶培养基

柠檬酸铁铵培养基：9.8g/l K₂HPO₄·3H₂O，2.1g/l一水合柠檬酸，0.3g/l柠檬酸铁铵,3.0g/l硫酸铵,0.2g/l MgSO₄·7H₂O，1000×微量元素。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的卡那霉素和50mg/L的氯霉素。

E.coliW3110通过商业化途径购买，荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens(Zhang R,Liu W,Cao Y,et al.An in vitro synthetic biosystem based on acetatefor production of phloroglucinol[J].BMC Biotechnology,2017,17(1):66.)，公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。

实施例1.利用乙醇生产间苯三酚的重组菌的构建。

一、重组质粒pACYCDuet1-adhE(A267T,E568K)的构建

1)以E.coliW3110基因组DNA为模板，利用引物SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2克隆乙醇脱氢酶基因adhE(Gene ID:945837)，克隆获得的基因利用胶回收试剂盒回收目的片段；以荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.8所示的引物克隆获得聚酮合酶基因phlD。

2)将步骤1)克隆所得的乙醇脱氢酶基因adhE与载体pACYCDuet-1经BamHI和SacI双酶切后，利用胶回收试剂盒回收酶切后目的片段adhE和载体pACYCDuet-1，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet-1-adhE；利用质粒定点突变试剂盒，利用引物SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4进行定点突变得到重组质粒：pACYCDuet-adhE(A267T)；然后利用引物SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6进行定点突变得到重组质粒I：pACYCDuet-adhE(A267T，E568K)，该质粒中含有的突变后的乙醇脱氢酶基因adhE的核苷酸序列如SEQID NO.9所示。

二、重组质粒pET28a-phlD的构建

将步骤一中克隆所得的聚酮合酶基因phlD与载体pET28a经BamHI和HindIII双酶切后，利用胶回收试剂盒回收酶切后片段聚酮合酶基因phlD和载体pET28a，再进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒II：pET28a-phlD。

三、重组菌株构建

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株E.coliW3110感受态，将上述构建的重组质粒pACYCDuet-adhE(A267T,E568K)和pET28a-phlD通过热激法转化至宿主菌株E.coliW3110感受态细胞，得到重组菌，所述重组菌过表达突变的乙醇脱氢酶基因adhE和聚酮合酶基因phlD，编号记为ZG-3433。

对比例1.重复实施例1，与实施例的不同在于，本对比例中省略步骤一，将步骤二中制备获得的重组质粒pET28a-phlD与pACYCDuet1空载体通过热激法转化至宿主菌株E.coliW3110感受态细胞，得到重组菌，所述的重组菌过表达聚酮合酶基因phlD，编号记为ZG-3432。

实施例2.重组菌的摇瓶发酵试验。

本实施例共进行两组实验，以说明本发明的重要性

对照组：对比例1构建的重组菌ZG-3432，以葡萄糖和乙醇为混合碳源。

实验组：实施例1构建的重组菌ZG-3433，以葡萄糖和乙醇为混合碳源。

(1)利用种子培养基活化上述两种重组菌，使其浓度为OD＝5。

(2)将活化后的重组菌株ZG-3432和ZG-3433分别按1:50的比例(体积)接种到含有50mL的柠檬酸铁铵液体培养基的250mL摇瓶中(内含100mg/L的卡那霉素和50mg/L的氯霉素)，添加1g/L葡萄糖(启动细胞生长)和10g/L的乙醇。37℃、180rpm条件下振荡培养。OD600达到0.6左右时，加入100μM/LIPTG诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养48h至发酵结束。

培养过程定时用NH3·H₂O或KOH调节pH。诱导后每隔12h收集菌液1ml，检测细胞密度和间苯三酚的产量。通过肉桂醛显色法对间苯三酚含量进行检测，发现对照菌株ZG-3432无法利用乙醇作为碳源，间苯三酚的产量为0.061g/L；实验菌株ZG-3433利用乙醇为碳源的间苯三酚的产量为0.38g/L。由此表明，含有乙醇代谢途径和间苯三酚生产途径的重组大肠杆菌成功实现了乙醇向间苯三酚的转化。

本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；上述过量表达的2种基因共同克隆到大肠杆菌(E.coli)中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达突变的乙醇脱氢酶基因adhE和聚酮合酶基因phlD，宿主菌为大肠杆菌；所述乙醇脱氢酶基因adhE来源于大肠杆菌（Escherichia coli）,Genbank 登录号为945837；所述突变的乙醇脱氢酶基因adhE其编码的氨基酸第267位由丙氨酸突变为苏氨酸，记为A267T；第568位由谷氨酸突变为赖氨酸，记为E568K；所述聚酮合酶基因phlD来源于荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），Genbank 登录号为3480329。

2.权利要求1所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1）克隆获得乙醇脱氢酶基因adhE，将267位的丙氨酸突变为苏氨酸，568位的谷氨酸突变为赖氨酸，得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE；克隆获得聚酮合酶基因phlD；

2）将步骤1）得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE连接到质粒载体，获得重组质粒I；

3）将步骤1）所得的聚酮合酶基因phlD连接到质粒载体，获得重组质粒II；

4）将步骤2）所得的重组质粒I和步骤3）所得的重组质粒II同时导入到宿主细胞，获得重组菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2）所述质粒载体，为质粒pACYCDuet-1。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤3）所述质粒载体，为质粒pET28a。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）以大肠杆菌基因组DNA为模板，设计引物克隆乙醇脱氢酶基因adhE；以荧光假单胞菌基因组为模板，设计引物克隆聚酮合酶基因phlD；

2）将步骤1）所得的乙醇脱氢酶基因连接到质粒pACYCDuet-1，获得重组质粒pACYCDuet-adhE，以重组质粒pACYCDuet-adhE作为模板，利用定点突变试剂盒突变adhE两个关键位点A267T和E568K，获得带有突变位点的重组质粒记为：pACYCDuet-adhE（A267T,E568K）；

3）将步骤1）所得的聚酮合酶基因phlD连接到质粒载体pET28a，获得重组质粒pET28a-phlD；

4）将步骤2）所得的重组质粒pACYCDuet-adhE（A267T,E568K）和步骤3）所得的重组质粒pET28a-phlD同时导入受体细胞E.coli W3110，获得重组菌ZG-3433。

6.权利要求1所述重组菌在发酵生产间苯三酚中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生产间苯三酚步骤如下：

1）活化权利要求1所述的重组菌，获得活化重组菌；

2）将步骤1）所得的活化重组菌接种到含有卡那霉素和氯霉素的柠檬酸铁铵液体培养基中进行发酵培养。