CN115820517A - 一种提高生物合成甲基硒代半胱氨酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高生物合成甲基硒代半胱氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌为宿主，表达编码SMT蛋白的基因、编码SATp蛋白的基因和甲硫氨酸腺苷转移酶基因，强化了甲基硒代半胱氨酸在重组枯草芽孢杆菌中的胞内表达。采用该方法制备甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本，并且该方法不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高生物合成甲基硒代半胱氨酸产量的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
硒是人体必需的微量元素，通过形成以硒代半胱氨酸为活性中心的硒蛋白行使生理功能。甲基硒代半胱氨酸(SeMCys)可以作为硒源类补充剂，也被证明是最有效的抗癌硒化合物之一，对改善神经疾病和认知缺陷有潜在的作用。
目前SeMCys的制备方法主要是化学合成法，但是这些化学合成方法存在步骤复杂、工艺冗长、反应条件苛刻和环境不友好等问题。
甲基硒代半胱氨酸在黄芪属植物中能够被合成，在质体中积累，提升了植物的耐硒能力，双沟黄芪幼芽中积累量最高，为52.2μg/g鲜重。但是植物生长周期长，占用空间大，人力成本高，不利于大规模制备。
利用微生物合成甲基硒代半胱氨酸可以实现目的产物的大规模绿色生物制造。目前仅在一些天然蕈菌中能检测到甲基硒代半胱氨酸的合成，但均作为对检测方法的验证，没有公布确切含量。酵母是富硒能力很强的微生物，可在胞内积累硒代甲硫氨酸，利用酿酒酵母作为宿主，进行代谢改造，发酵过程优化后，胞内甲基硒代半胱氨酸含量仅为1.14μg/g干重。利用食品级的基因工程菌强化甲基硒代半胱氨酸的合成并提高产量，将有利于提升基因工程菌的工业化应用潜力。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，在基因组上硒代半胱氨酸甲基转移酶SMT基因和丝氨酸乙酰基转移酶SATp基因，克服多个质粒复制引起的代谢负担使菌体生物量明显降低的缺陷，并通过pHT01质粒诱导表达甲硫氨酸腺苷转移酶。
在一种实施方式中，所述甲硫氨酸腺苷转移酶为大肠杆菌来源的具有I303V,I65V,L186V,N104K四突变的MetK和酿酒酵母来源的SAM2。
在一种实施方式中，所述SMT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述SMT蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述SATp蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述SATp蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，大肠杆菌来源的甲硫氨酸腺苷转移酶I303V/I65V/L186V/N104K四突变体MetK的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；酿酒酵母来源的甲硫氨酸腺苷转移酶SAM2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中，编码大肠杆菌来源的甲硫氨酸腺苷转移酶I303V/I65V/L186V/N104K四突变体MetK的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码酿酒酵母来源的甲硫氨酸腺苷转移酶SAM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，将P43-SMT表达框和Pgrac-SATp表达框整合到枯草芽孢杆菌基因组AmyE位点上，再以pHT01质粒为载体，表达编码甲硫氨酸腺苷转移酶的基因。
本发明还提供了一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将编码SMT蛋白的基因和pP43NMK载体进行Gibson组装，得到载体pP43NMK-SMT；将SATp蛋白的基因和pHT01载体进行Gibson组装，得到载体pHT01-SATp；分别克隆AmyE上游片段LB和下游片段RB，并经过融合PCR连接为一个片段，构建到pMD19克隆载体上，得到pMD-LB-RB载体；分别扩增P43-SMT表达框片段和pMD-LB-RB载体成线性片段，并通过Gibson组装得到pMD-LB-SMT-RB载体；分别扩增Pgrac-SATp表达框片段和pMD-LB-SMT-RB载体成线性片段，并通过Gibson组装得到pMD-LB-SMT-SATp-RB载体；扩增LB-SMT-SATp-RB片段作为donor DNA；选择23bp的AmyE片段，连接到pcrF11载体上，构建导向RNA质粒；将含有重组酶的质粒pHT-XCR6先转化至枯草芽孢杆菌中，在转化子中将导向RNA质粒和LB-SMT-SATp-RB片段进行共转化，筛选基因组整合的转化子GBA；
(2)将编码甲硫氨酸腺苷转移酶的基因MetK和SAM2分别与载体pHT01进行Gibson组装，得到pHT01-MetK和pHT01-SAM2载体，将重组载体转入到步骤(1)获得的重组菌GBA中，得到重组枯草芽孢杆菌GBA-甲硫氨酸腺苷转移酶。
本发明还提供了所述重组枯草芽孢杆菌在生产甲基硒代半胱氨酸方面的应用。
在一种实施方式中，将所述重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵培养基中，于温度为30～38℃、转速为150～300rpm的条件下培养，收集表达的甲基硒代半胱氨酸的菌体。
在一种实施方式中，所述应用还包括破碎菌体，收集甲基硒代半胱氨酸。
在一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的种子液菌浓不低于OD 1.0。
在一种实施方式中，所述应用是将所述种子液接种至发酵培养基中，于33℃、250r/min培养OD600至0.6～0.8时加入1mM IPTG，诱导至OD600至1.8～2.0时添加6～12mg/L亚硒酸钠，继续发酵40h。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌或上述构建方法得到的重组枯草芽孢杆菌或上述制备甲基硒代半胱氨酸的方法在制备甲基硒代半胱氨酸或含甲基硒代半胱氨酸产品中的应用。
有益效果：
(1)本发明提升了甲基硒代半胱氨酸在重组枯草芽孢杆菌中的合成，采用该方法制备甲基硒代半胱氨酸，可大大的降低生产成本；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化SeMCys的生产。
(2)本发明通过表达甲硫氨酸腺苷转移酶提升了枯草芽孢杆菌的SAM合成，并利用强化硒代半胱氨酸合成的菌株来合成甲基硒代半胱氨酸，提高了胞内甲基硒代半胱氨酸的产量；本发明可使枯草芽孢杆菌发酵生产甲基硒代半胱氨酸的胞内产量达到27.9μg/g干重，远远高于现有报道的重组酿酒酵母的胞内积累甲基硒代半胱氨酸1.14μg/g干重。
(3)由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于食品安全级菌株，因此，利用以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为宿主获得的重组枯草芽孢杆菌生产得到的甲基硒代半胱氨酸可满足食品级生产的安全要求。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌中重构甲基硒代半胱氨酸合成途径。
具体实施方式
下述实施例中涉及的pP43NMK质粒和pHT01均购自普如汀生物技术(北京)有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。
种子培养基和发酵培养基均使用LB培养基，在OD600达到0.7时添加诱导剂IPTG，在OD600达到2.0时添加6mg/L亚硒酸钠。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
甲基硒代半胱氨酸含量检测：UPLC-MS法检测条件如下：
仪器：Waters XevoTQS-micro型超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪；色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18 Column，2.1×100mm 1.8μm、柱温40℃、样品室温度10℃、进样体积5μL、流速0.2mL/min、运行时间7min、流动相A为0.1％甲酸水溶液、流动相B为乙腈，流动相浓度梯度见表1。
表1流动相梯度表
实施例1：重组枯草芽孢杆菌GBA和GB的构建
(1)donor DNA和导向RNA载体的构建
化学合成编码SMT蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；在编码SMT蛋白的基因两端分别加上如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的pP43NMK同源序列，得到SMT片段；将pP43NMK经Kpn I和Sma I酶切回收，得到pP43NMK片段；将SMT片段与pP43NMK片段利用Gibson Asembly Master Mix进行组装得到SMT表达载体pP43NMK-SMT。
化学合成编码SATp蛋白的基因(SEQ ID NO.2所示)并在两端加上Bam HI和Sal I酶切位点得到SATp片段，将SATp片段与经Bam HI和Sal I酶切回收的pHT01载体片段利用T4连接酶进行连接，得到载体pHT01-SATp。
利用引物AmyL-F和引物AmyL-R，以枯草芽孢杆菌168菌体为模板，PCR克隆枯草芽孢杆菌AmyE上游片段LB(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)；利用引物AmyR-F和引物AmyR-R，以枯草芽孢杆菌菌体为模板，PCR克隆枯草芽孢杆菌AmyE下游片段RB(核苷酸序列如SEQID NO.12所示)；将LB片段和RB片段混合，利用引物LB-F和RB-R，经过融合PCR连接为一个片段LB-RB(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)，构建到pMD19克隆载体上，得到pMD-LB-RB载体。
AmyL-F：TTGCAAAACGATTCAAAACCTCTT；
AmyL-R：CATCATCGCTCATCCATGTCGACATCAGACCAGTTTTTAATTTGTG；
AmyR-F：CACAAATTAAAAACTGGTCTGATGTCGACATGGATGAGCGATGATG；
AmyR-R：AATGGGGAAGAGAACCGCTTAAG。
利用引物SMT-F2和引物SMT-R2，以构建的pP43NMK-SMT质粒为模板，扩增P43-SMT表达框片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)；利用Amy-F2和Amy-R2，以pMD-LB-RB载体为模板扩增载体成线性片段。将两个片段并通过Gibson组装得到pMD-LB-SMT-RB载体。
SMT-F2：CACAAATTAAAAACTGGTCTGATTGATAGGTGGTATGTTTTCG；
SMT-R2：CATCATCGCTCATCCATGTCGACTTATTTCGCTGAAAATGTC；
Amy-F2：GACATTTTCAGCGAAATAAGTCGACATGGATGAGCGATGATG；
Amy-R2：CGAAAACATACCACCTATCAATCAGACCAGTTTTTAATTTGTG。
利用引物SATp-F2和SATp-R2，以pHT01-SATp质粒为模板，扩增Pgrac-SATp表达框片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)；利用引物AMT-F3和Amy-R3，将构建的pMD-LB-SMT-RB载体扩增成线性片段，并通过Gibson组装将Pgrac-SATp表达框片段与pMD-LB-SMT-RB线性片段组装得到pMD-LB-SMT-SATp-RB载体。
SATp-F2：CACAAATTAAAAACTGGTCTGATTCACTGCCCGCTTTCCAGT；
SATp-R2：CGAAAACATACCACCTATCATTAGATGACGTAATCTGACCACTCG；
AMT-F3：CGAGTGGTCAGATTACGTCATCTAATGATAGGTGGTATGTTTTCG；
Amy-R3：ACTGGAAAGCGGGCAGTGAATCAGACCAGTTTTTAATTTGTG。
利用引物AmyL-F和AmyR-R，以pMD-LB-SMT-SATp-RB载体为模板，PCR扩增LB-SMT-SATp-RB片段作为donor DNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)。
导向RNA载体的构建：合成引物Amy-725-F和Amy-725-R，退火后的产物，与Eco31I酶切的pcrF11质粒，用T4 DNA连接酶行连接，得到导向RNA质粒。
Amy-725-F：AGATTCCGTATTGGAACTCTGCAG；
Amy-725-R：AATTCTGCAGAGTTCCAATACGGA。
(2)重组枯草芽孢杆菌GBA的构建
将含有重组酶的质粒pHT-XCR6(公开于公开号为“CN110951741B”的专利中)，先转化至枯草芽孢杆菌168中，在转化子中将步骤(1)构建的导向RNA质粒和LB-SMT-SATp-RB片段进行共转化，筛选基因组整合的转化子GBA。在含0.005％SDS的LB中培养GBA，并涂布无抗平板，将无抗平板上的菌，挑取单菌落至氯霉素抗性平板，筛选氯霉素抗性上不生长的菌落，为不带质粒的GBA。
(3)重组枯草芽孢杆菌GB的构建
利用引物AmyL-F和AmyR-R，以步骤(1)构建的载体pMD-LB-SMT-RB为模板，PCR扩增LB-SMT-RB片段作为donor DNA-2(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)。
将含有重组酶的质粒pHT-XCR6先转化至枯草芽孢杆菌168中，在转化子中将导向RNA质粒和LB-SMT-RB片段进行共转化，筛选基因组整合的转化子GB。在含0.005％SDS的LB中培养GB，并涂布无抗平板，将无抗平板上的菌，挑取单菌落至氯霉素抗性平板，筛选氯霉素抗性上不生长的菌落，为不带质粒的GB。
实施例2：甲硫氨酸腺苷转移酶表达载体的构建
化学合成编码甲硫氨酸腺苷转移酶的基因MetK(SEQ ID NO.3所示)和SAM2(SEQID NO.4所示)。MetK用引物MetK-F和MetK-R进行扩增，与经Bam HI酶切的载体pHT01进行Gibson组装，得到pHT01-MetK；SAM2用引物SAM2-F和SAM2-R进行扩增，与经Bam HI酶切的载体pHT01进行Gibson组装，得到pHT01-SAM2载体。
MetK-F：CCAATTAAAGGAGGAAGGATCCATGGCGAAACATCTGTTCAC；
MetK-R：CTCATTAGGCGGGCTGCCTTATTTCAGTCCTGCTGCGT；
SAM2-F：CCAATTAAAGGAGGAAGGATCCATGAGCAAGAGCAAGACGT；
SAM2-R：CTCATTAGGCGGGCTGCCTTAGAACTCCAGCTTCTTC。
实施例3：重组枯草芽孢杆菌GBA-甲硫氨酸腺苷转移酶的构建
分别将实施例2构建的表达载体pHT01-MetK和pHT01-SAM2分别转化到实施例1构建的重组枯草芽孢杆菌GBA中，分别得到重组枯草芽孢杆菌GBA-MetK和重组枯草芽孢杆菌GBA-SAM2重组枯草芽孢杆菌，分别将上述转化产物采用氯霉素抗性平板培养，在37℃倒置培养12h直至出现菌落，挑取单菌落培养保存，并提取基因组进行PCR鉴定，分别得到重组成功的重组枯草芽孢杆菌GBA-MetK和GBA-SAM2。
将pHT01-SAM2转化到实施例1构建的重组枯草芽孢杆菌GB中，最终得到重组成功的重组枯草芽孢杆菌GB-SAM2。
将pHT01-SATp转化到实施例1构建的重组枯草芽孢杆菌GB中，最终得到重组成功的重组枯草芽孢杆菌GB-SATp。
实施例4：重组枯草芽孢杆菌GBA-MetK和GBA-SAM2的验证
分别将实施例1～3构建的GB、GB-SAM2、GB-SATp、GBA、GBA-MetK和GBA-SAM2接种于LB培养基作为种子培养基，37℃下过夜培养，得到种子液；
分别将上述种子液以5％的接种量接种于LB发酵培养基，33℃、200r/min培养OD600至0.7时加入终浓度1mM IPTG诱导基因继续在相同条件下表达，OD600至2.0时添加6mg/L亚硒酸钠，继续发酵40h(总发酵时间46h)，得到发酵液。作为对照，另一组不添加IPTG，其它发酵条件完全一致。
分别将上述得到的发酵液离心，获得菌体，菌体用盐酸(pH2.5)溶解，转移至裂解介质B，并在FastPrep-24仪器上进行破壁，再经过离心，取上清，再经微孔滤膜过滤后，进行超滤，滤液用UPLC-MS法检测胞内甲基硒代半胱氨酸含量。
结果如表2所示，野生枯草芽孢杆菌菌株168中未检测到甲基硒代半胱氨酸的含量；重组枯草芽孢杆菌菌株GB、GB-SAM2、GB-SATp和GBA的甲基硒代半胱氨酸的含量极低，而重组枯草芽孢杆菌GBA-MetK和GBA-SAM2的甲基硒代半胱氨酸胞内产量得到提高，说明在同时增加前体硒代半胱氨酸和表达甲硫氨酸腺苷转移酶的基础上，极大促进了甲基硒代半胱氨酸的合成。
表2重组枯草芽孢杆菌甲基硒代半胱氨酸的胞内产量(μg/g干重)
对比例：
将实施例1构建的pP43NMK-SMT或pHT01-SATp转化至枯草芽孢杆菌168，在未添加诱导剂和亚硒酸盐的情况下，按照实施例4的方法培养获得的菌体生物量与枯草芽孢杆菌168相比，降幅约20％；当上述质粒共同转化至枯草芽孢杆菌168，在相同条件下培养，与单质粒转化子相比，菌体生物量下降50％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，在基因组上整合硒代半胱氨酸甲基转移酶基因和丝氨酸乙酰基转移酶基因，并通过质粒表达甲硫氨酸腺苷转移酶。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述硒代半胱氨酸甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述丝氨酸乙酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以启动子P43调控硒代半胱氨酸甲基转移酶的表达，以启动子Pgrac调控丝氨酸乙酰基转移酶的表达。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以pHT01质粒为载体表达甲硫氨酸腺苷转移酶。
5.一种构建权利要求4所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主，将P43-SMT表达框和Pgrac-SATp表达框整合到枯草芽孢杆菌基因组AmyE位点上，再以pHT01质粒为载体，表达编码甲硫氨酸腺苷转移酶的基因。
6.一种生产甲基硒代半胱氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于30～38℃、转速150～300rpm的条件下发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述重组枯草芽孢杆菌的种子液接种至发酵培养基中，于32～34℃培养OD600至0.6～0.8时加入IPTG，诱导至OD600达1.8～2.0时添加亚硒酸钠。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子液是将所述重组枯草芽孢杆菌在LB培养基中于30～37℃下培养≥8h。
9.根据权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括破碎菌体，收集甲基硒代半胱氨酸。
10.权利要求1～4任一所述重组枯草芽孢杆菌，或权利要求6～9任一所述方法在制备甲基硒代半胱氨酸或含甲基硒代半胱氨酸产品中的应用。
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