CN104630100A - 改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产r-乙偶姻的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产R-乙偶姻的应用。该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙偶姻脱氢酶系失活的克雷伯氏肺炎杆菌，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌还可以为乙偶姻脱氢酶系和乙偶姻还原酶基因budC均失活的克雷伯氏肺炎杆菌。通过将克雷伯氏肺炎杆菌中乙偶姻脱氢酶系的编码基因和调节基因中的一个或多个基因进行失活来获得所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。利用所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻，能够提高R-乙偶姻的产能，R-乙偶姻的发酵水平和原料转化率均得到提高。

Description

改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产R-乙偶姻的应用

技术领域

本发明属于菌株的基因工程改造技术领域，具体涉及改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产R-乙偶姻的应用。

背景技术

乙偶姻化学名称3-羟基-2-丁酮，在自然界中天然存在于多种加工食品和水果中。商品乙偶姻用于增加食品的风味，是一种重要的食用香料。另外，乙偶姻还广泛应用于功能材料、医药生产和化学合成等领域。目前，乙偶姻的合成方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法中使用的原料包括双乙酰(2,3-丁二酮)、2,3-丁二醇和乙醛等。利用双乙酰和2,3-丁二醇为原料可以通过酶催化方法生产乙偶姻。

多种微生物可以利用葡萄糖等碳源直接发酵合成乙偶姻，其中能够高水平合成乙偶姻的微生物主要是芽孢杆菌属、拟芽孢杆菌属和沙雷氏菌属的细菌。自然条件下很多微生物合成乙偶姻并分泌到胞外，分泌到胞外的乙偶姻主要作为一种能量存储物质，可以再次被细胞利用。在细菌中乙偶姻氧化分解是乙偶姻被菌体利用的一条途径。该途径由乙偶姻脱氢酶系催化，乙偶姻分解形成一份子乙醛和一份子乙酰辅酶A。乙偶姻脱氢酶系是由焦磷酸硫胺素依赖的乙偶姻脱氢酶、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶组成。其中乙偶姻脱氢酶α亚基由acoA基因编码，乙偶姻脱氢酶β亚基由acoB基因编码，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶由acoC基因编码，二氢硫辛酰胺脱氢酶由acoD基因编码。上述代谢途径中还具有调节基因，正调控上述结构基因的表达。所述调节基因为acoK基因。

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，可用于生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等。乙偶姻是合成2,3-丁二醇的前体物，乙偶姻在乙偶姻还原酶的催化下还原形成2,3-丁二醇。专利申请号为 201310346916的发明专利了公开了利用克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，乙偶姻还原酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌，可以利用多种碳源发酵合成高水平的R-乙偶姻，并具有很高的光学纯度。

发明内容

本发明的目的是，提供一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产R-乙偶姻的应用。旨在提高克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的产能。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙偶姻脱氢酶系失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

优选地，所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌采用乙偶姻还原酶基因budC已失活的克雷伯氏肺炎杆菌，使其乙偶姻脱氢酶系失活。

优选地，所述克雷伯氏肺炎杆菌采用保藏号为CGMCC 1.6366的菌株，其保藏地址为：为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏。所述保藏号为CGMCC 1.6366的菌株已经在授权发明专利ZL201310346916.8中公开，另外在公开文献(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中也已经公开该菌株。

本发明还提供了所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，该方法为：将克雷伯氏肺炎杆菌中乙偶姻脱氢酶系的编码基因和调节基因中的一个或多个基因进行失活来获得所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌；所述乙偶姻脱氢酶系由焦磷酸硫胺素依赖的乙偶姻脱氢酶、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶组成；其中乙偶姻脱氢酶α亚基由acoA基因编码，乙偶姻脱氢酶β亚基由acoB基因编码，二氢硫辛酰胺乙酰转移酶由acoC基因编码，二氢硫辛酰胺脱氢酶由acoD基因编码，其中的调节基因为acoK基因。

所述乙偶姻脱氢酶系的基因失活可通过诱变法、转座子插入、自杀性质 粒同源重组法或Red重组酶介导的同源重组法等，使得乙偶姻脱氢酶系的编码基因和调控基因中的一个、多个或全部发生改变而失去活性。其中优选方法为Red重组酶辅助的同源重组方法。

优选地，采用诱变法使乙偶姻脱氢酶系基因失活获取改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其具体方法包括如下步骤：

步骤1，诱变，对出发菌株进行诱变处理；

步骤2，初筛，将前述诱变处理的菌悬液涂布于初筛培养基进行培养，所述初筛培养基是以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中添加欠量有机碳源，所述欠量有机碳源为乙偶姻量的5％～50％，待长出菌落，挑选在培养基中生长较小的菌落，所述较小的菌落是指菌落直径小于平均菌落直径一半；

步骤3，复筛，将前述挑选的菌落接种到以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中，不生长的菌落即为所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。

优选地，采用转座子插入法使乙偶姻脱氢酶系基因失活获取改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其具体方法包括如下步骤：

步骤1，转座，对出发菌株进行转座处理；

步骤2，初筛，将前述转座处理的菌悬液涂布于初筛培养基进行培养，所述初筛培养基是以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中添加欠量有机碳源，所述欠量有机碳源为乙偶姻量的5％～50％，待长出菌落，挑选在培养基中生长较小的菌落，所述较小的菌落是指菌落直径小于平均菌落直径一半；

步骤3，复筛，将前述挑选的菌落接种到以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中，不生长的菌落即为所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。

本发明还提供所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产R-乙偶姻中的应用。

本发明还提供了所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，该方法为：将乙偶姻脱氢酶系失活的克雷伯氏肺炎杆菌或者乙偶姻脱氢酶系和乙偶姻还原酶基因budC均失活的克雷伯氏肺炎杆菌分别接种到发酵培养基中，进行好氧发酵培养。

优选地，所述好氧发酵培养的温度为20～37℃，发酵时间为12～36小时。

优选地，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.001g/L，微量元素溶液1mL/L培养基；其中，微量元素溶液的配方为：氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L，硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：改造后的克雷伯氏肺炎杆菌在发酵生产乙偶姻的过程中，合成的乙偶姻不能被菌株再次利用，同时R-乙偶姻的发酵水平和原料转化率得到提高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

以下实施例中所采用的克雷伯氏肺炎杆菌A、克雷伯氏肺炎杆菌C是发明人从土壤中筛选的菌株，经16s RNA基因序列测定鉴定为克雷伯氏肺炎杆菌，分别命名为克雷伯氏肺炎杆菌A、克雷伯氏肺炎杆菌C。筛选方法参见文献(Hao,J.et al.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of Microbiology and Biotechnology.2008.24,1731-1740)。实施例1

利用诱变方法消除克雷伯氏肺炎杆菌中乙偶姻脱氢酶系活性。

步骤如下：

1)将克雷伯氏肺炎杆菌A接种于装有3ml LB培养基的试管中，好氧培养过夜。

2)将过夜培养的菌体转接到装有50ml LB培养基的250ml锥形瓶中，培养4小时，离心收集菌体，悬浮于无菌水中。

3)将菌悬液置于诱变用的紫外灯下照射90秒。

4)将诱变过的细胞涂布于初筛固体培养基上，培养过夜。初筛固体培养基组分为：混旋乙偶姻4g/l，Na₂HPO₄6g/，KH₂PO₄3g/l，NH₄Cl 1g/l， NaCl 0.5g/l，MgSO₄.7H₂O 0.5g/l，GaCl₂.6H₂O 0.5g/l，琼脂粉15g/l，葡萄糖0.2g/l。

5)培养过夜的培养基中挑选直径小于平均菌落直径一半的较小菌落15株，接种到复筛固体培养基中过夜培养，3株不生长者为目的菌株。筛选的突变菌株分别命名为：突变菌1-1，突变菌1-2，突变菌1-3。复筛固体培养基组分不含葡萄糖，其他组分与初筛培养基相同。

实施例2

将克雷伯氏肺炎杆菌A中的乙偶姻还原酶进行失活，获得克雷伯氏肺炎杆菌B，然后再利用诱变方法消除克雷伯氏肺炎杆菌B中的乙偶姻脱氢酶系活性。其他操作过程与实施例1相同。其中，将克雷伯氏肺炎杆菌A中的乙偶姻还原酶进行失活的具体方法参见专利文献(郝健，等，利用克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，中国发明专利专利号201310346916)。

经过初筛获得20株小菌落，经过复筛获得4株目的菌株。筛选的突变菌株分别命名为：突变菌2-1，突变菌2-2，突变菌2-3，突变菌2-4。

实施例3

利用转座子插入方法消除克雷伯氏肺炎杆菌中乙偶姻脱氢酶系活性。

步骤如下：

1)制备转座体，并将转座体转入克雷伯氏肺炎杆菌C，按照(Wei Xiao-Xing et al.A mini-Mu transposon-based method for multiple DNA fragment integration into bacterial genomes.Applied Microbiology and Biotechnology(2010)87:1533–1541)所述具体方法操作。

2)将转化的细胞涂布于初筛固体培养基上，培养过夜。初筛固体培养基组分为：混旋乙偶姻4g/l，Na₂HPO₄6g/，KH₂PO₄3g/l，NH₄Cl 1g/l，NaCl0.5g/l，MgSO₄.7H₂O 0.5g/l，GaCl₂.6H₂O 0.5g/l，琼脂粉15g/l，甘油2g/l。

3)培养过夜的培养基中挑选小菌落25株，接种到实施例1所述复筛固体培养基中过夜培养，2株不生长者为目的菌株。筛选的突变菌株分别命名为：突变菌3-1，突变菌3-2。

实施例4

利用Red重组酶辅助的同源重组方法敲除克雷伯氏肺炎杆菌中aocK基因，来实现消除菌株乙偶姻脱氢酶系活性。本实施例中采用的克雷伯氏肺炎杆菌是保藏号为CGMCC 1.6366的菌株，具有氨苄青霉素抗性。

敲除克雷伯氏肺炎杆菌中aocK基因的具体步骤如下：

1)利用PCR扩增克雷伯氏肺炎杆菌乙偶姻脱氢酶系及调控基因序列(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)，通过TA克隆方法连接到克隆载体，并进行DNA序列测定。

根据克雷伯氏肺炎杆菌342(Genbank:NC_011283)基因组信息，设计乙偶姻脱氢酶系及调控基因PCR引物，上游引物aco-s：TTAATCCAGTAATTTCATCTCCAGCGCCCG(SEQ ID NO.1所示)，下游引物aco-a：TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.2所示)。

通过上述引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙偶姻氢酶系(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)基因片段，通过TA克隆方法连接到pMD-18T simple质粒(商业产品)上，命名为pMD18T-aco质粒，序列测定结果如SEQ ID NO.3所示。其中1-2766为acoK阅读框，3019-3978为acoA阅读框，3990-5009为acoB阅读框，5013-6548为acoC阅读框，6538-7935为acoD阅读框。

2)利用步骤1克隆到的基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

本步骤中的操作，采用在大肠杆中利用Red重组酶催化，具有短同源臂连接抗性盒的DNA片段与pMD18T-aco质粒进行同源重组，获得pMD18T-aco质粒上重组失活的acoK基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与acoK基因同源的序列，中间连接抗性盒。

本步骤操作原理和使用的质粒和菌株等材料可参见(Wei et.al.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具体步骤如下：

a.pMD18T-aco质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌DH5α-pIJ790 中，命名为DH5α-pMD18T-aco。

b.设计引物acoK-s1和acoK-a1，序列分别为：

CTCAGCCAGTAAAATGCAGGCTTGCGGCGCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.4所示)和GCTGCAGGCCCAGGACCAACTGGTGGAAATTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.5所示)。

利用引物acoK-s1和acoK-a1，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与acoK序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段A转化感受态DH5α-pMD18T-aco感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18T-aco上的acoK同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔacoK质粒。

d.利用引物aco-s(SEQ ID NO.1所示)和acoK-a2ATGAAGCCATTGGATTTAGAAGGTCGCCAA(SEQ ID NO.6所示)，以pMD18T-ΔacoK质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kb的DNA片段B。

DNA片段B两端分别具有acoK基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于进行CGMCC1.6366染色体上acoK基因重组的线性DNA片段。

3)利用转化将制备的DNA片段B转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段B与染色体上的乙偶姻脱氢酶酶系基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙偶姻脱氢酶酶系调控基因重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，获得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株。命名为CGMCC 1.6366-acoK^-。该菌株的乙偶姻脱氢酶系的调控基因通过同源重组而失活。

实施例5

利用Red重组酶辅助的同源重组方法敲除克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中的aocA基因，来实现消除菌株乙偶姻脱氢酶系活性。

1)制备两侧连有aocA基因同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

具体步骤如下：

a.设计引物acoA-s1和acoA-a1，序列分别为：

ATGCTCAGCAAACAGGCGTTATTGCAGGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.7所示)和TCAGTATGAGACATAAACGTCTGTCAGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.8所示)。

利用引物acoA-s1和acoA-a1，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A1。该片段的两端分别具有与acoA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

b.利用DNA片段A1转化实施例4中制备的感受态DH5α-pMD18T-aco感受态细胞。利用电击转化方法，转化电压为2000V，选择安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量为50mg/L。

DNA片段A1两侧的同源序列与质粒pMD18T-acoA上的同源部分发生重组，获得质粒，并命名为pMD18T-ΔacoA质粒。

c.利用引物acoA–s2GGCGATACGTTCACCCTGGGCGACCATCTG(SEQ ID NO.9所示)和acoA-a2GTCGTCGTCGCGAATTGACTGGATTAACAG(SEQ ID NO.10所示)，以pMD18T-ΔacoA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.4Kb的DNA片段B2。

DNA片段B2两端分别具有acoA基因外侧相邻序列，该序列作为同源臂。DNA片段B2中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B2用于进行CGMCC1.6366染色体上acoA基因重组的线性DNA片段。

2)将制备的DNA片段B2转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中，DNA片段B2与染色体上的乙偶姻脱氢酶系基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙偶姻脱氢酶酶系基因重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pDK6-red质粒转化到CGMCC 1.6366中，获得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，线性DNA片段B2电击转化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株。命名为CGMCC 1.6366-acoA^-。该菌株的乙偶姻脱氢酶系的acoA基因通过同源重组而失活。

实施例6

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在已经失活了乙偶姻还原酶的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366(Kp-budC^-)中失活aocK基因，来实现消除菌株乙偶姻脱氢酶系活性。

操作过程同实施例4，其中用于aocK基因敲除的目的菌株改为乙偶姻还原酶budC基因失活的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366。

通过基因敲除工作，获得乙偶姻脱氢酶系调控基因acoK和乙偶姻还原酶budC双突变的菌株，命名为Kp-budC^--acoK^-。

实施例7

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在已经失活了乙偶姻还原酶的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366(Kp-budC^-)中失活aocA基因，来实现消除菌株乙偶姻脱氢酶系活性。

操作过程同实施例5，其中用于敲除的目的菌株改为乙偶姻还原酶budC基因失活的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366。

通过基因敲除工作，获得乙偶姻脱氢酶系acoA基因和乙偶姻还原酶budC双突变的菌株，命名为Kp-budC^--acoA^-。

实施例8

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在已经失活了乙偶姻还原酶的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366(Kp-budC^-)中失活aocB基因，来实现消除菌株乙偶姻脱氢酶系活性。

操作过程同实施例7，其中引物acoB-s CATTACCGAGTCGGCCATCATCGGAATGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.11所示)和acoB-a ACCACCTCGACCGAGATCCCCTCTCTGGCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO.12所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoB-s2CGGTCAAACGTGCGCGAGAAGGCGGTGGCC(SEQ ID NO.13所示)和acoB-a2CGCCTACCTGAAGCGTCTCACCCTCTCGGG(SEQ ID NO.14所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通过基因敲除工作，获得乙偶姻脱氢酶系acoB基因和乙偶姻还原酶budC双突变的菌株，命名为Kp-budC^--acoB^-。

实施例9

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在已经失活了乙偶姻还原酶的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366(Kp-budC^-)中失活aocC基因，来实现消除菌株乙偶姻脱氢酶系活性。

操作过程同实施例7，其中引物acoC-s AGTCCGCGGCAGCGGGCGCG GGGATCGTATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.15所示)和acoC-a CCTTCACCAGCAGGTCATTAACCGAAATCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.16所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoC-s2ATGAGCGAAATCAAGACGCTTGAAATGCCA(SEQ ID NO.17所示)和acoC-a2GCACATCGTATTTATCGTGCATAGCTCGTC(SEQ ID NO.18所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通过基因敲除工作，获得乙偶姻脱氢酶系acoC基因和乙偶姻还原酶budC双突变的菌株，命名为Kp-budC^--acoC^-。

实施例10

利用Red重组酶辅助的同源重组方法在已经失活了乙偶姻还原酶的克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中失活aocD基因，来实现消除菌株乙偶姻脱氢酶系活性。利用工程菌株发酵生产乙偶姻。

操作过程同实施例7，其中引物acoD-s TTGCCCAGGTCGCTATTAA TCATCGGTTCAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.19所示)和acoD-a TTACTTGCGTCACCAGGGTCTGGGTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.20所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoD-s2ATGCACGATAAATACGATGTGCTGATCATC(SEQ ID NO.21 所示)和acoD-a2TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.22所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通过基因敲除工作，获得乙偶姻脱氢酶系acoD基因和乙偶姻还原酶budC双突变的菌株，命名为Kp-budC^--acoD^-。

实施例11

将实施例1-10中获得的乙偶姻脱氢酶系活性消除的菌株进行发酵实验。

将出发菌株和实施例1-10中获得的乙偶姻脱氢酶系活性消除的菌株分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml乙偶姻发酵培养基中，进行好氧发酵培养。培养温度37℃，摇床转速200转每分。

发酵培养基组分为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.001g/L，微量元素溶液1mL/L培养基，自来水配制后，并灭菌。其中，微量元素溶液的配方为：氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L，硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L。

培养过程取样测定R-乙偶姻含量，测定采用气相色谱法测定。

气相色谱测定发酵液中R-乙偶姻含量，采用日本岛津公司GC2012气相色谱仪，装备RESTEK公司手性色谱柱，进样口温度设定225℃，检测器采用FID(氢火焰)检测器，检测器温度设定225℃，柱温箱程序升温，初始50℃，以5℃每分钟速率升温到75℃，保留8分钟，以20℃每分钟速率升温到200℃，保留2分钟。测定结果参见表1。

表1，发酵培养12h、24h和36h的发酵液中R-乙偶姻含量

从以上测定结果可以看出，野生型克雷伯氏肺炎杆菌(包括克雷伯氏肺 炎杆菌A，克雷伯氏肺炎杆菌C和CGMCC 1.6366)在培养24h时合成的R-乙偶姻水平最高，培养36小时后测定发现R-乙偶姻被菌体耗尽。而乙偶姻脱氢酶系活性消除的菌株(包括突变菌1-1，突变菌1-2，突变菌1-3，突变菌3-1，突变菌3-2，CGMCC1.6366-acoK^-，CGMCC1.6366-acoK^-)，R-乙偶姻合成水平在12-36小时一直处于增加，并且36小时具有最高的R-乙偶姻浓度。

乙偶姻还原酶已经失活的克雷伯氏肺炎杆菌(包括克雷伯氏肺炎杆菌B和Kp-budC^-)在12小时合成高水平的R-乙偶姻，后R-乙偶姻浓度逐渐降低，到36小时完全耗尽。构建的消除乙偶姻脱氢酶系活性的菌株(包括突变菌2-1，突变菌2-2，突变菌2-3，突变菌2-4，Kp-budC^--acoK^-，Kp-budC^--acoA^-，Kp-budC^--acoB^-，Kp-budC^--acoC^-，Kp-budC^--acoD^-)在发酵培养12小时时相对于出发菌株具有更高的R-乙偶姻浓度，继续发酵培养，发酵液中乙偶姻含量保持仍然保持在高水平。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

<110>  中国科学院上海高等研究院

<120>  改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产R-乙偶姻的应用

<130>  2015

<160>  22   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg                                      30

 

<210>  2

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc                                      30

 

<210>  3

<211>  7935

<212>  DNA

<213>  克雷伯氏肺炎杆菌

<400>  3

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg actcatcgct tgagtgcggc tattcacttt     60

aagcttcgcg tagatgtttt tgatgtgcca tttgaccgtc tcggcagaaa tagctaggga    120

gcgggcgatt tctttgttca tctgaccttc agcgatcagc tgtaatatct gaaattctcg    180

ctcgctgagt tccccatgaa tatcggggct tccactattt agcggtgttc tgtctgcagg    240

cgcgcgcttg tctgcccagg gttcatggac tatcccttcc tctgtacaag ccgaagagaa    300

atcattcata ccgataagca aaggttgcaa ggtatcgcca gcgtcaagaa agaggccctt    360

gagatgctgt tgttcagcca gcagcagcac tggttgaaat gtcgtgcgcg cagcggcagt    420

tttgccgctg ttccacaagg ctaatgacca gagcgtacgc agacgcgctg cggttaacct    480

gtccccccgg ctttcctgat cggagaccat ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc    540

ctggcctctg gcgagaagaa gccggctgcg gctaagggat gcagacataa cgatggcgcg    600

ttggcaggga tgttcggcat ccattctgaa gctggcggcc atttgttcaa gctgccgttg    660

cagttgctct gcgccggtga aattgccgcg ctgcaggcgc accctcacct gctcggctaa    720

caacatggcc tggagccgtt gccagccgcg agacaccgca aggcgctgcg catgctccag    780

caatcgctcg gcctcatagg gcatatcgct atctaaggcc tgacgcgcga gataggtata    840

gcaacgactc agcgcgtcgg gtggactgaa ccggtcgatg aattcgagcc ggtcggctaa    900

cagatgctcg ggcgagtcac ccctctgaca ttcataggct atctccgcca gcagcggcgc    960

cagcgtcgcg ccactggtcg actgggtgcc ggtataacat tcagcctggc gcaacgtttt   1020

ctctgcgtac cacccggctt ttcccagatc gccctgacaa agatgacact gggcaatgat   1080

aaacgcgcga tataccgaga caaacagatt atctaaagga ctttccggag agggcatatg   1140

ctgttgaacc tccagcgcgt cgtgatagcg ctggttaaca acatggcaat agctgagaat   1200

attgcatatc agaccatcaa cccaggtgtc gccgcagggc acttcggcca gcaacggctg   1260

aacaatagcc agactctccg ggatgttttc agcaaaggct tcgcaaattg cccgcacaac   1320

gcgcaattta caccaggtgc tgcgggttaa atcatcacgg tgatgaagca ccatctgatc   1380

gaggttatca agcagctgcc tcgactcatc aaagtggaaa taatgcgcca gtgcccaggc   1440

caggttaatt tgcaggtcaa tgcgcgcagg atcggtgctg ggcggtaaat gatgcatcca   1500

tgagatcagg gtatcgatat ccccttcttc cgccagtgac tgagcgcttg cgccgtcctg   1560

cccggggcta tgcaccggct tgcctgcgct gagcgcatgg cgtaccgcct cagaccacag   1620

cttctgttcg acgaaccaat gactggctaa ttcatgtagc tgtttgcgat caatagcgtt   1680

gttctgctgc agcatggtcc gaagattttc ctgcaacaga ggatggtagc ggaaccagta   1740

gccttgttcg tcaagggctg acaaaaaaag gttgtgtcgc tcaatccatg ccagcatcgc   1800

tttactatca tcacgtccag tcactgcatt gcataattcg gcatttaacc gactgaggaa   1860

ggacgttttc accagaaaat caagaacctg ttccggcagc ggatccagta ccacctcttt   1920

cagatagcgg gcaatagacc gtgttcctcc atgcatattg cgcaacagat gctcgggatc   1980

atgctgtaat tctgcggaca atgaagcgat cttcatccct gcaatccagc cctctgtcac   2040

ggactgtagc cgctgtgcat ggtggttgct gaggggtagc gcaaccgtgc ggctaaaata   2100

gtgttttgtt tcttcgagcg tgaattgcag gtctcgatca tagatttcca ccagttggtc   2160

ctgggcctgc agctggctca gcgcaagatt cgggtggaaa cggctgccaa tgatcagatg   2220

caaagcggca ggcgcatgct tgagtaaata ccccagcgct tcatagaccc cacgatcgtt   2280

aatcacgtgg aagtcgtcga tgatcaggta tacgtcatgc gggcaatagt gtagctggtt   2340

aatgagcccg gccagcagtt gctcggagct ggagagcttc tgttcttcca tgtcacgcca   2400

gaaatcggcg tcccagtcag catagagtgg acgcaatgct tgcagcagat aaggaataaa   2460

ctgccatacg tcatcatcat cctcatcgag gctcagccag gcgatacgtt caccctgggc   2520

gaccatctgc tgatgccatt gcgccaacag cgtggttttg ccaaatccag cgccggcgca   2580

gacgacgccc aaccggcact gctgaacggg attgagaagc tgaagaagcc gggggcgctc   2640

cagcaattgt atcgaggagc gaggcgggac gaatttggtc aggattaacg gcaagcctcg   2700

cgtcagccgc aatggcccgg agaccagtga gggtgattgg cgaccttcta aatccaatgg   2760

cttcatccgt ggtgtctact cgctttgttt tttttcaatt gtacgccagc caccgggatg   2820

acatggggca ggcaaacttt atggctacac aaaatttaga aagtttgacc tcaagcatga   2880

aaacccccac ctaccccccc atgaaggtgg cttcgcactc tctctaaccg ctcgtagatt   2940

cattgcatgg gtgtggccag ggttattcgc cctgtctgtt ggccccgcct ggtgaccttt   3000

attgaggaga attaaacgat gctcagcaaa caggcgttat tgcaggctta ccgcaagatg   3060

cgggagatca ggacctttga agagcggttg catcaggaaa ataccagcgg tgatattccc   3120

ggcttcattc acctttatac cggtgaggag gccatcgcgg tgggggtctg cgaaaattta   3180

acgagcgcag attttattgg ttcaacacac cgtggacatg gccactgtat tgctaaaggg   3240

tgcgacattc acggcatgat ggccgaaata ttcggtaagg acagcgggtt atgtcgcggt   3300

aagggtgggt cgatgcacat tgccgatctg tcgaaaggaa tgctgggagc gaacgctatc   3360

gttgggggag cccctcccct ggccatcggc gccgcgctaa cggcaaagac gctaaaaacc   3420

ggcaacgtcg gtgtctcttt tacgggcgat gggggttcta atcagggcct ggtctttgaa   3480

gccatcaata tggccgtcgt gctccagctc ccagcggtct ttattttcga gaacaacggt   3540

tacggcgaag ggaccggtca tgactacgcc gtgggtgggc gtgatatcgc ccgacgcgcc   3600

gctggcttcg gcctgccggc agtgaccgtt gatggcaccg atttctttgc cgtttatgag   3660

gccacttcag aggcggtcaa acgtgcgcga gaaggcggtg gcccaagcgt cattgaggcc   3720

aaagccttcc gctggcacgg tcattttgag ggggatcccg cgctataccg cgcggaaggt   3780

gaagtgcaac gcctgcgtga acaacatgat ccgctgaaga ttttcaccgc taaggtcaaa   3840

cagcatatca ccccggaaga actggcagcg attgacgagg aagtcgaagc ccttgtcaac   3900

gatgcggtat tgaaggcccg cgccgctgcc tatccggctc cggaagacct gctgacagac   3960

gtttatgtct catactgagg gtgataacta tggcgattaa aacctatcgt gaagcggtca   4020

aggaagccct ggctcaggaa atggaacgcg atgaacgcgt ggtgctcatc ggtgaagatt   4080

tgcgtggcgg tcatggcgga aatgcgcccg aagaggcgaa gatagaagcc tttggcggtg   4140

tgctcggcgt cactaaaggg ctgtggacgc agttcggctc cgatcgggtg atcgacacgc   4200

ccattaccga gtcggccatc atcggaatgg cggccggcgc cgcagcgacg ggtctgcggc   4260

cggtcgcgga attgatgttc atggattttt ttggcgtgag tcacgatgcg ctgtacaacc   4320

aggcggctaa gttccgctac atgtttggtg gcaaagccag agccccgctg gtgatgcgag   4380

ggatgatcgg cgcggggttt tccgccgcgg cccagcattc acagtcaccc tataatatct   4440

ttgccaccac gccagggctg aaggtggtgg tgccctcgac gccttatgac gtcaaaggtc   4500

tgttaatcca gtcaattcgc gacgacgacc cggtggtttt ctgcgagcat aaaatgctgt   4560

acgacctcaa gggcgaggta ccggacgaga gctataccct cccgctaggt gtagccaact   4620

atacccgcga aggagaagac gtcaccatca ttgcgttgtc ggcaatggtg cataaagcca   4680

atcaggtggc ggacaaactg gccagagagg ggatctcggt cgaggtggtc gacccgcgga   4740

ccatttcgcc gctggatgag gaagggattc tggaatcggt ggcgtccacg gggcgggtag   4800

tgattgtcga cgaatccgcg gcacgcttcg gttttgcgca tgatgtcgcg gcgctgatcg   4860

cgtcccaggc attccatttc ctcaaagcgc ccgttctgct ggtgacgccg ccacacacgc   4920

cggtcccgtt ctcccctgct ctcgaaaaac tctggatccc tggcgtagaa cgtatcgaag   4980

cagccgtccg tcaagtgctg gaggattaac ctatgagcga aatcaagacg cttgaaatgc   5040

caaagtgggg gctttccatg gaagaaggct tgctcgctcg gtgggcaatc caggagggtg   5100

acagcttcac cccagggcag gaaatctgtg agattgaaac cagtaaaatc gtcaatgtgc   5160

tggaggcccc ctttgccggt acgttacgtc ggatactcgc ccgagagggt gagacgcttc   5220

aggtaggcgc cgtgctggcc ctggcggctg acgcttcggt cagcgatgct gacctggacg   5280

aattcgctgc cactctggct acggcgaaat ccgcagcccc tggcacggag gctgccgcgc   5340

cggacgtagc ggcacaggca ggcgctaagc caccttccgt tgtttcgccg ccatccaaca   5400

gccccgagcc ccccgttggg cagaccgaca tccccgtcag tctgcaaggc gtgaccgatg   5460

tgactcaggt taatgccacg ccccatgcgt tacgactctc tgcccgctgg ggtgtcgacc   5520

tgaaaaaagt ccgcggcagc gggcgcgggg atcgtatctc tgtttctgat ctggaaagcg   5580

cgatccttgc cgccggcggt cgcctggcct ccccgacgcc ccctgttcgt cgcagcaaag   5640

cgccccgctc gcatgccgat gacagccagg tatcggccac cccgctggcg cgccgtctgg   5700

ccggcaagct gggtatcaac ttgcatgact gccgaagcag cggttcacgc ggccgggtga   5760

gtcgcgatga tgtgctggcc gcggcgttgt tactcgacga gcacccgcag accagcccgg   5820

tacaggagag taccccggta ccctatgaaa gcatccccat gtccggtatg cggcgggcta   5880

tcgcctctcg cctgcaaacg tccaagcaac agtctcccca tttccgtttg agcgtcgatc   5940

tcgatctgga acgactgtta gcgctacgtc aggaaattaa ccgcgaagta cccggcgtca   6000

agatttcggt taatgacctg ctggtgaagg cctgcgccct ggcgctggtg gccgtgcctg   6060

acgtcaacat tcagtttgat gaagcgacac aaagtatccg ccgctttgcg gatgccgaca   6120

tttcagtggc cgttgcgctg cctgccgggc taattacccc tattgttcgc tcggcgaacc   6180

ggaaatcaat tagcgacata tcgaacgaaa ttcactcgct ggtgaccagg gccaaagcgg   6240

gcacgctgaa gccggaagag ttccaggggg ggacctttag cgtgtcaaat ctggggatgc   6300

ttggcgtccg gcagtttgac gccatcatca atccaccgca aagtgcaatc ctcgccattg   6360

gcgccggcga aatgcgggcg gtagtacgcg acgggcaaat cgtcgcgcgc cagcaaatga   6420

cggtatcgct atcctgcgat caccgggtta tcgatggcgc ggcaggtgcg gcttttctcc   6480

gggaactcag gcgactggct gaaaccccaa ccttgatgtt tatccaggag acgagctatg   6540

cacgataaat acgatgtgct gatcatcggc ggtggtcctg ggggatatgt ggccgccatc   6600

cgtgccggcc agctagggct tcgtaccgca ttagtggaga aacaacatct gggcggcatc   6660

tgcctgaact ggggatgcat tccaaccaag gcgctgttgc atggcgctga ggtcgcgcac   6720

agtatcaccc atgccagtca gctgggcatc agcgtgggtg aggtgaacat cgatctgcag   6780

aaactggtgc agtttagccg taccgtatcg caacagctca ccggcggggt ggcgtacctg   6840

ttgaagaaaa atggcgtgca ggtcattgat ggcaccgcgc ggctgcgcgg caaggggcaa   6900

ataacggtcg aggatgcccg aggggagacg cgcgattacc gggccgatca cgtgatcctg   6960

gccacgggcg cccgaccacg cgcattacca ggcatcgcgc cagatggcga atatatctgg   7020

acctatttcg aggcgctgcg gcctaagcta ttgcccaggt cgctattaat catcggttca   7080

ggggcgattg gcgtcgagtt cgccagcctt tataacgatc tgggctgtaa agtgacgctg   7140

gtcgagctgg cgtcgcagtt tttgccagtg gaagatgccg aggtgtctgc agcagtgcgt   7200

aagtcattcg aaaaacgcgg tattcaggtc catacccaga ccctggtgac gcaagtaaag   7260

ctcaccggga ccggggtgcg ctgcaccatg aaaaacaccg gcgccgaata ttctcaggac   7320

gtcgaacgtg tgctgctggc ggtcggcgta cagccgaata ttgaagatct ggggctggaa   7380

acgctgggcg tcgagttaga ccgcggtttt atcaagacgg acaccgcttg tcgtactaac   7440

gtattcgggc tgtatgccat cggcgatgta gccggcccgc cgtgcctggc gcacaaggcc   7500

agccacgaag gcgtgctctg cgttgagaca ctggctggtg tcgaaggcgc ccacccgctt   7560

gatcgcgact atgtgcccgg ttgcacgtat gcccggcccc aggttgccag tctgggcctg   7620

acggaatcga cggccctggc caggggacgg cccgtcagga tcggtaagtt ctcctggcag   7680

aataatggta aggcgctggc cagcggcgag acagagggtt ttgtgaagac gattttcgat   7740

gctgaaaccg gcgagttgct gggcgcgcat atggttggcg cacaggtcac ggaactgatc   7800

caggggtttg gcatcgcccg tcacctggag gccacagatg aaagtctcct gtcgatgatc   7860

ttcgcgcatc caacactttc cgaagcgatg catgaatcca tcctcgcggc ctgcgatcaa   7920

ccattgcatc aataa                                                    7935

 

<210>  4

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc attccgggga tccgtcgacc                50

 

<210>  5

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

gctgcaggcc caggaccaac tggtggaaat tgtaggctgg agctgcttc                 49

 

<210>  6

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

atgaagccat tggatttaga aggtcgccaa                                      30

 

<210>  7

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

atgctcagca aacaggcgtt attgcaggct attccgggga tccgtcgacc                50

 

<210>  8

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

tcagtatgag acataaacgt ctgtcagcag tgtaggctgg agctgcttc                 49

 

<210>  9

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

ggcgatacgt tcaccctggg cgaccatctg                                      30

 

<210>  10

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  10

gtcgtcgtcg cgaattgact ggattaacag                                      30

 

<210>  11

<211>  100

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

cattaccgag tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc cattaccgag     60

 

tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc                          100

 

<210>  12

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  12

accacctcga ccgagatccc ctctctggcc tgtaggctgg agctgcttc                 49

 

<210>  13

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

cggtcaaacg tgcgcgagaa ggcggtggcc                                      30

 

<210>  14

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

cgcctacctg aagcgtctca ccctctcggg                                      30

 

<210>  15

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

agtccgcggc agcgggcgcg gggatcgtat attccgggga tccgtcgacc                50

 

<210>  16

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

ccttcaccag caggtcatta accgaaatct tgtaggctgg agctgcttc                 49

 

<210>  17

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  17

atgagcgaaa tcaagacgct tgaaatgcca                                      30

 

<210>  18

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

gcacatcgta tttatcgtgc atagctcgtc                                      30

 

<210>  19

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  19

ttgcccaggt cgctattaat catcggttca attccgggga tccgtcgacc                50

 

<210>  20

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  20

ttacttgcgt caccagggtc tgggtatggt gtaggctgga gctgcttc                  48

 

<210>  21

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  21

atgcacgata aatacgatgt gctgatcatc                                      30

 

<210>  22

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  22

ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc                                      30

 

 

Claims (10)

1.一种改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙偶姻脱氢酶系失活的克雷伯氏肺炎杆菌。

2.如权利要求1所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌是以乙偶姻还原酶基因budC失活的克雷伯氏肺炎杆菌为出发菌株，使其乙偶姻脱氢酶系失活。

3.权利要求1或2所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，该方法为：将克雷伯氏肺炎杆菌中乙偶姻脱氢酶系的编码基因和调节基因中的一个或多个基因进行失活来获得所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌；所述乙偶姻脱氢酶系的编码基因包括：乙偶姻脱氢酶α亚基编码基因acoA、乙偶姻脱氢酶β亚基编码基因acoB、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶编码基因acoC、二氢硫辛酰胺脱氢酶编码基因acoD；所述调节基因为acoK基因。

4.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，其特征在于，所述对基因进行失活采用以下其中之一的方法：

诱变法；

转座子插入法；

自杀性质粒同源重组法；

Red重组酶介导的同源重组法。

5.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括如下步骤：

步骤1，诱变，对出发菌株进行诱变处理；

步骤2，初筛，将前述诱变处理的菌悬液涂布于初筛培养基进行培养，所述初筛培养基是以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中添加欠量有机碳源，所述欠量有机碳源为乙偶姻量的5％～50％，待长出菌落，挑选在培养基中生长较小的菌落，所述较小的菌落是指菌落直径小于平均菌落直径一半；

步骤3，复筛，将前述挑选的菌落接种到以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中，不生长的菌落即为所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。

6.如权利要求3所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括如下步骤：

步骤1，转座，对出发菌株进行转座处理；

步骤2，初筛，将前述转座处理的菌悬液涂布于初筛培养基进行培养，所述初筛培养基是以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中添加欠量有机碳源，所述欠量有机碳源为乙偶姻量的5％～50％，待长出菌落，挑选在培养基中生长较小的菌落，所述较小的菌落是指菌落直径小于平均菌落直径一半；

步骤3，复筛，将前述挑选的菌落接种到以乙偶姻为唯一碳源的基本培养基中，不生长的菌落即为所述改造的克雷伯氏肺炎杆菌。

7.权利要求1或2所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌在生产R-乙偶姻中的应用。

8.权利要求1或2所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，该方法为：将乙偶姻脱氢酶系失活的克雷伯氏肺炎杆菌或者乙偶姻脱氢酶系和乙偶姻还原酶基因budC均失活的克雷伯氏肺炎杆菌分别接种到发酵培养基中，进行好氧发酵培养。

9.如权利要求8所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，其特征在于：所述好氧发酵培养的温度为20～37℃，发酵时间为12～36小时。

10.如权利要求8所述的改造的克雷伯氏肺炎杆菌生产R-乙偶姻的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，硫酸铵2g/L，磷酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.001g/L，微量元素溶液1mL/L培养基；其中，微量元素溶液的配方为：氯化锌70mg/L，钼酸钠35mg/L，硼酸60mg/L，氯化钴200mg/L，硫酸铜29.28mg/L，氯化镍25mg/L。