CN116751730A - 一种合成香兰素的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成香兰素的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中敲除编码莽草酸脱氢酶的基因aroE和3个编码醛酮还原酶AKRs的基因dkgA、dkgB和yeaE，3个编码乙醇脱氢酶ADHs的基因yqhD、yahK和yjgB，并异源表达脱氢莽草酸脱水酶DSD、甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR，获得能够合成香兰素的重组大肠杆菌K2。所述重组大肠杆菌能够通过基于廉价小分子葡萄糖作为前体合成香兰素，在化妆品、纺织品、食品领域具有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成香兰素的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。
背景技术
香兰素也叫香草醛、甲基原儿茶醛，化学名称为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)，是全球使用最广泛的香料之一。香兰素主要从芸香科植物香荚兰豆(Vanilla planifolia)中提取，具有抗氧化、抗菌、抗炎等效果，广泛应用于食品、化妆品和医药领域，另外，香兰素也被应用于农药行业。目前，市场上的香兰素主要来源于化学合成，其市场份额占比达90％，与植物提取香兰素(2018年6月为515美元/千克)相比，化学合成香兰素的生产成本更低(约12美元/千克)。然而，化学合成香兰素香型较为单一，缺乏天然香兰素的复合香气，且无法应用于食品领域。随着食品与化妆品领域对天然香兰素的需求日益增加，亟需开发合成天然香兰素的其他途径。
生物合成香兰素主要通过植物合成、酶催化与微生物合成实现。植物合成方式是在植物组织细胞中进行香兰素的合成，基于大部分植物中已经存在的香兰素合成途径，对其关键基因进行强化即可实现香兰素的积累，其主要限制因素为香兰素产量偏低和植物生长周期较长。酶催化合成香兰素主要利用香兰素形成过程中的关键酶，通过添加前体的方式催化获得香兰素。微生物合成香兰素则利用了真菌、细菌、酵母与基因工程重组菌进行香兰素的合成，根据所用菌株的特性可以将不同来源的底物转化为香兰素，甚至包括富含阿魏酸、木质素、葡萄糖等的农副产品。微生物利用农副产品生产香兰素已成为热门，对农副产品的利用使得可持续发展成为可能。同时，衍生出来的还有微生物从头合成的新思路，即以葡萄糖、氨基酸等广泛存在且廉价的易得的小分子物质为底物，通过重构微生物的代谢网络，使整个微生物服务于目标产物的合成，从而获得的产物成本低、安全性高，也能更好地被应用于食品、医药等领域。
大肠杆菌是合成各类化合物的常用微生物细胞工厂，属于革兰氏阴性兼性厌氧菌，具有生长周期短，易培养、遗传背景简单且清晰等特点，其代谢途径可塑性强，在过去的报导中已被广泛深入地研究。相比谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母，采用大肠杆菌进行香兰素的生物合成具有操作工艺简单、周期短和成本低廉等优势。在欧盟立法(Europeanlegislation(EC Directives88/838))将活细胞或其成分(包括酶)以生物合成形式获得的产物纳入“天然产物(natural products)”一类后，以大肠杆菌为宿主的酶催化合成香兰素成为生物合成香兰素的主要获取途径。但是，现有技术中大肠杆菌以从头合成香兰素的效率不高，限制了其工业化应用的潜力。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在提高大肠杆菌的香兰素合成效率，以期通过更短的发酵周期实现香兰素的高效合成。
本发明提供了一种合成香兰素的重组大肠杆菌，表达了来源于柄孢壳菌(Podospora pauciseta)的脱氢莽草酸脱水酶DSD、来源于钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)的甲氧基转移酶LiOMT和来源于诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的羧酸还原酶NiCAR，并敲除了莽草酸脱氢酶基因aroE，醛酮还原酶AKRs基因dkgA、dkgB、yeaE，乙醇脱氢酶ADHs基因yqhD、yahK、yjgB中的一个或多个基因。
在一种实施方式中，所述脱氢莽草酸脱水酶DSD具有NCBI登录号：CAD60599所示的氨基酸序列，编码DSD的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述甲氧基转移酶LiOMT具有NCBI登录号：NC_004342.2所示的氨基酸序列，编码LiOMT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述羧酸还原酶NiCAR具有NCBI登录号：AY495697所示的氨基酸序列，编码NiCAR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，重组大肠杆菌工程菌敲除了编码莽草酸脱氢酶的基因aroE(Gene ID:947776)，敲除了3个编码醛酮还原酶AKRs的基因dkgA(Gene ID:947495)、dkgB(Gene ID:944901)和yeaE(Gene ID:946302)，并敲除了3个编码乙醇脱氢酶ADHs的基因yqhD(Gene ID:947493)、yahK(Gene ID:944975)和yjgB(Gene ID:948802)。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株。
在一种实施方式中，表达载体pETDuet-1的PT7启动子被替换为组成型启动子PrpsU。
在一种实施方式中，表达载体pCDM4的PT7启动子被替换为Ptrc启动子。
在一种实施方式中，以pETDuet-1为表达载体表达所述脱氢莽草酸脱水酶DSD。
在一种实施方式中，以pCDM4为表达载体表达所述甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以表达载体pETDuet-1表达脱氢莽草酸脱水酶DSD，并以表达载体pCDM4表达甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR。
本发明还提供了一种生产香兰素的方法，以所述重组大肠杆菌为发酵菌株，以葡萄糖为底物，发酵生产香兰素。
在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、柠檬酸、CaCl2、FeSO4、维生素B1、胰蛋白胨、酵母粉、Al2(SO4)3、CoSO4、CuSO4、H3BO3、MnSO4、Na2MoO4、NiSO4、ZnSO4。
在一种实施方式中，发酵至少20小时。
在一种实施方式中，所述发酵是将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中培养至OD600＝0.8～1.0后，将温度控制在30℃，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。
在一种实施方式中，所述诱导是用终浓度为0.4～0.6mM IPTG诱导16～24h。
在一种实施方式中，所述诱导是用终浓度为0.4～0.6mM IPTG诱导20h。
本发明还保护所述重组菌，或生产香兰素的方法，或利用大肠杆菌合成香兰素的方法在制备含有香兰素的产品中的应用。
有益效果：
本发明应用CRISPR-Cas9技术敲除编码莽草酸脱氢酶的基因aroE，获得可以从头合成脱氢莽草酸的重组大肠杆菌K12RE。在此基础上，基于大肠杆菌内源性ADHs和AKRs具有将醛类转化为醇类的作用，应用CRISPR-Cas9技术将影响香兰素积累的3个ADHs和3个AKRs敲除，获得可以提高醛类积累量的重组大肠杆菌K12R。同时，基于香兰素的合成途径，构建了重组载体pETDuet-DSD和pCDM4-OR1～pCDM4-OR6，分别在重组大肠杆菌K12RE和重组大肠杆菌K12R中表达重组质粒pETDuet-DSD和pCDM4-OR1～pCDM4-OR6中的任一质粒，获得重组大肠杆菌KE1～KE6和KR1～KR6。经摇瓶发酵和高效液相色谱检测后，重组大肠杆菌中均检测到香兰素，且大肠杆菌KR系列菌株发酵得到香兰素明显高于KE系列菌株。通过LCMS分析也进一步验证了该化合物为香兰素。本发明构建了可以以葡萄糖为底物从头合成香兰素的重组大肠杆菌工程菌，其中菌株KR1摇瓶发酵20h香兰素的产量为63mg/L。
附图说明
图1为重组载体pETDuet-DSD质粒图。
图2为重组载体pCDM4-OR1质粒图。
图3为重组大肠杆菌K1和K2以及香兰素标准品的高效液相色谱(HPLC)图以及对应的LCMS图：图A为香兰素标准品的LCMS图；图B为K1发酵液的对应LCMS图；图C为K2发酵液的对应LCMS图；图D为香兰素标准品、K1发酵液和K2发酵液的HPLC图。
图4为大肠杆菌合成香兰素的合成途径图。
图5为LiOMT与NiCAR按不同表达顺序和插入不同表达元件的构建示意图。
图6为菌株KR1～KR6发酵产香兰素情况。
图7为菌株KE1～KE6发酵产香兰素情况。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂，以配制LB固体培养基。
发酵培养基：葡萄糖35g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，NaCl1g/L，柠檬酸1.5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeSO4·7H2O 0.1125g/L，维生素B10.075g/L，胰蛋白胨4g/L，酵母粉2g/L，Al2(SO4)3·18H2O 2.0g/L，CoSO4·7H2O 0.75g/L，CuSO4·5H2O2.5g/L，H3BO3 0.5g/L，MnSO4·H2O 24g/L，Na2MoO4·2H2O 3.0g/L，NiSO4·6H2O2.5g/L，ZnSO4·7H2O 15g/L。
(二)香兰素的HPLC检测
利用C18色谱柱(250×4.6mm，5μm，Waters，USA)在40℃检测条件用Waters ArcHPLC系统，配置检测器2480进行检测。设置流动相A为含有1‰(v/v)三氟乙酸的纯水，流动相B为含有1‰(v/v)三氟乙酸的乙腈。流速为1mL·min-1，检测波长为250nm，10％B为初始浓度，洗脱梯度为0-10min 40％B；10-20min，线性洗脱至60％B，20-23min 60％B；23-25min，线性洗脱至10％B；25-27min 10％B。
(三)大肠杆菌电转化法
电转化感受态的制备：将大肠杆菌细胞在LB平板划线，37℃过夜培养，挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养10～12h，转接于50mL的LB液体培养基中，37℃220rpm振荡培养1.5～2h左右至OD600值为0.6～0.8之间；
收集菌液于冰上预冷5min，以4500×g离心5min收集菌体，加入25mL预冷的10％甘油重悬菌体，以4500×g离心5min收集菌体，重复上述步骤一次，加入5mL的10％甘油重悬菌体，取100μL的重悬液分装至1.5mL离心管，放冰上待用；
电转化：载体冰上融化，向重悬液中加入不低于600ng载体吹吸混匀，冰上静置10～15min；设置电压1800V，吸取混有载体的重悬液加入电转杯中，电击后迅速加入1mL LB液体培养基吹吸混匀，将电转后的菌液移入1.5mL离心管中，30℃孵育1.5～2h，孵育后的菌液6000×g离心2min，弃900μl上清，剩余液体吹吸混匀后涂布带有相应抗性的LB平板，37℃过夜培养。
(四)Gibson组装方法：反应体系如下，DNA片段加入50ng，载体加入100ng，Gibsonmix加入5μl，加入无菌超纯水至体系10μl。反应条件如下，50℃反应60min，反应结束后立即置于冰上。取10μl转化至大肠杆菌感受态JM109。
(五)Primer Star MasterMix购自Takara公司。
表1涉及基因敲除的同源臂序列
实施例1：香兰素合成关键基因的合成
委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行香兰素合成途径中关键基因的合成。来源于柄孢壳菌Podospora pauciseta的脱氢莽草酸脱水酶DSD(NCBI登录号为CAD60599)，按照大肠杆菌的密码子进行优化合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；来源于钩端螺旋体Leptospira interrogans的编码甲氧基转移酶LiOMT(NCBI登录号为NC_004342.2)，按照大肠杆菌的密码子进行优化合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；来源于诺卡氏菌Nocardiaiowensis的羧酸还原酶NiCAR(NCBI登录号为AY495697)，按照大肠杆菌的密码子进行优化合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2：香兰素合成途径相关基因表达载体启动子替换
以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株，该菌株缺少编码T7噬菌体RNA聚合酶的λ噬菌体DE3区，因此无法使用载体pETDuet-1上的噬菌体T7启动子(PT7)进行目的基因的诱导表达。因此将载体pETDuet-1上的启动子PT7替换为来源于大肠杆菌的组成型启动子PrpsU(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，以不包含PT7序列的载体pETDuet-1为模板，设计引物对F1/R1，以该引物对进行PCR，用Primer Star MasterMix高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，5min；扩增阶段28个循环，按照95℃，10s，55℃，10s，72℃，4min进行；延伸72℃，5min，将PCR产物进行纯化，得到不含PT7序列的线性化载体pETDuet-1；以大肠杆菌的组成型启动子PrpsU序列为模板，设计引物对F2/R2，以该引物对进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将不含PT7序列的线性化载体pETDuet-1和启动子PrpsU序列重组得到重组载体，将重组载体转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的重组载体pETDuet-PrpsU。
同样地，为了控制目的基因的表达，将载体pCDM4上的启动子PT7替换为同样可以使用IPTG进行表达调控的诱导型启动子Ptrc(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)。诱导型启动子Ptrc序列长度仅有30bp，因此以不包含PT7序列的载体pCDM4为模板，设计引物对F3/R3，该引物对分别延长35bp将Ptrc序列当作同源臂区域，以该引物对进行PCR扩增并纯化产物，得到不含PT7序列的线性化载体pCDM4。通过Gibson组装的方法将不含PT7序列的线性化载体pCDM4自连重组得到重组载体，将重组载体转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的重组载体pCDM4-Ptrc。
表2引物序列
实施例3：香兰素合成途径相关基因表达载体pETDuet-DSD的构建
以DSD合成序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为模板，设计引物对F4/R4，以该引物对进行PCR扩增，用Primer Star MasterMix高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，5min；扩增阶段28个循环，按照95℃，10s，55℃，10s，72℃，1min进行；延伸72℃，1min，将PCR产物进行纯化，得到片段DSD；以实施例2构建的载体pETDuet-PrpsU为模板，用引物对F5/R5进行PCR扩增，并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段DSD和载体pETDuet-PrpsU重组得到重组载体，将重组载体转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的重组载体pETDuet-DSD。
表3引物序列
实施例4：香兰素合成途径相关基因表达载体pCDM4-OR1～pCDM4-OR6的构建
在已知的香兰素合成途径中(如图4)，LiOMT与NiCAR两个酶没有相对明确的反应顺序，因此将两个酶以不同的表达顺序串联在表达载体上。同时为了排除表达元件对两个酶表达效果的影响，分别构建不同顺序下串联的两个酶基因中间含有不同表达元件的表达载体(如图5)，得到重组载体pCDM4-OR1～pCDM4-OR6，其中包括以下3种结构：两个基因仅通过RBS(SEQ ID NO.6所示)连接；表达顺序在第二位的基因前添加启动子Ptrc；两个基因分别以完整的表达框(各自含有启动子和终止子)连接。
首先分别构建重组载体pCDM4-O和重组载体pCDM4-R：以LiOMT合成序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为模板，设计引物对F6/R6，以该引物对进行PCR扩增并纯化产物，得到片段LiOMT；以载体pCDM4-Ptrc为模板，设计引物对F7/R7，以该引物对进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段LiOMT和载体pCDM4-Ptrc重组构建得到重组载体，将重组载体转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的重组载体pCDM4-O。同样地，以NiCAR合成序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)为模板，设计引物对F8/R8，以该引物对进行PCR扩增并纯化产物，得到片段NiCAR；以实施例2构建的载体pCDM4-Ptrc为模板，以引物对F7/R7进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段NiCAR和载体pCDM4-Ptrc重组构建得到重组载体，将重组载体转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的重组载体pCDM4-R。
以重组载体pCDM4-O为骨架分别构建重组载体pCDM4-OR1～pCDM4-OR3：以重组载体pCDM4-R上的带有RBS的NiCAR序列为模板，以物对F9/R9进行PCR扩增并纯化产物，得到片段RBS-NiCAR；以载体pCDM4-O为模板，以引物对F10/R10进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段RBS-NiCAR和载体pCDM4-O重组构建得到重组载体pCDM4-OR1。同样地，以重组载体pCDM4-R上的带有Ptrc-RBS的NiCAR序列为模板，以引物对F11/R11进行PCR扩增并纯化产物，得到片段Ptrc-NiCAR；以载体pCDM4-O为模板，以引物对F10/R10进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段Ptrc-NiCAR和载体pCDM4-O重组构建得到重组载体pCDM4-OR2。最后以重组载体pCDM4-R上的NiCAR表达框序列为模板，以引物对F12/R12进行PCR扩增并纯化产物，得到片段Ptrc-NiCAR-T7；以载体pCDM4-O为模板，以引物对F13/R13进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段Ptrc-NiCAR-T7和载体pCDM4-O重组构建得到重组载体pCDM4-OR3。以上构建的重组载体转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的重组载体pCDM4-OR1～pCDM4-OR3。
以重组载体pCDM4-R为骨架分别构建重组载体pCDM4-OR4～pCDM4-OR6。以重组载体pCDM4-O上的带有RBS的LiOMT序列为模板，以物对F14/R14进行PCR扩增并纯化产物，得到片段RBS-LiOMT；以载体pCDM4-R为模板，以引物对F15/R15进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段RBS-LiOMT和载体pCDM4-R重组构建得到重组载体pCDM4-OR4。同样地，以重组载体pCDM4-O上的带有Ptrc-RBS的LiOMT序列为模板，以引物对F16/R16进行PCR扩增并纯化产物，得到片段Ptrc-LiOMT；以载体pCDM4-R为模板，以引物对F15/R15进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段Ptrc-LiOMT和载体pCDM4-R重组构建得到重组载体pCDM4-OR5。最后以重组载体pCDM4-O上的LiOMT表达框序列为模板，以引物对F17/R17进行PCR扩增并纯化产物，得到片段Ptrc-LiOMT-T7；以载体pCDM4-R为模板，以引物对F18/R18进行PCR扩增并纯化产物。通过Gibson组装的方法将片段Ptrc-LiOMT-T7和载体pCDM4-R重组构建得到重组载体pCDM4-OR6。以上构建的重组载体转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的重组载体pCDM4-OR4～pCDM4-OR6。
表4引物序列
实施例5：敲除aroE的大肠杆菌K12RE的构建
将pCas质粒转入原始大肠杆菌K-12MG1655，构建菌株K12(pCas)。
根据aroE上下游500bp基因序列分别设计其上游同源臂Eup(核苷酸序列如表1所示)和下游同源臂Edown(核苷酸序列如表1所示)，基于序列Eup和Edown分别设计引物对F19/R19和F20/R20，以大肠杆菌K12 MG1655基因组为模板，用引物对F19/R19和F20/R20进行PCR扩增并纯化产物，得到片段Eup和Edown；使用融合PCR技术将片段Eup和Edown连接，得到aroE基因上下游同源臂。
使用Benchling在线工具设计用于敲除aroE基因的p-Target引物对F21/R21，以p-Target质粒为模板，用引物对F21/R21进行PCR扩增并纯化产物，将纯化产物转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的质粒pE。
将上述得到的aroE基因上下游同源臂以及质粒pE电转化入K12(pCas)感受态细胞，得到敲除aroE的大肠杆菌K12RE。
表5引物序列
实施例6：敲除醛酮还原酶AKRs和乙醇脱氢酶ADHs
将pCas质粒转入实施例5构建的大肠杆菌K12RE，构建菌株K12RE(pCas)。
根据dkgA上下游500bp基因序列分别设计其上游同源臂Aup(核苷酸序列如表1所示)和下游同源臂Adown(核苷酸序列如表1所示)，基于序列Aup和Adown分别设计引物对F22/R22和F23/R23，以大肠杆菌K12 MG1655基因组为模板，用引物对F22/R22和F23/R23进行PCR扩增并纯化产物，得到片段Aup和Adown；使用融合PCR技术将片段Aup和Adown连接，得到dkgA基因上下游同源臂。
使用Benchling在线工具设计用于敲除dkgA基因的p-Target引物对F24/R24，以p-Target质粒为模板，用引物对F24/R24进行PCR扩增并纯化产物，将纯化产物转化大肠杆菌JM109，提取质粒并测序验证，得到正确的质粒pA。
将上述得到的dkgA基因上下游同源臂以及质粒pA电转化K12RE(pCas)感受态细胞，得到敲除aroE和dkgA的大肠杆菌K12RA(pCas)，在此基础上不消除pCas质粒，继续用于其他基因的敲除。
基于上述方法分别构建用于敲除dkgB(同源臂dkgB-up，dkgB-down如表1所示，设计引物对F25/R25和F26/R26)、yeaE(同源臂yeaE-up，yeaE-down如表1所示，设计引物对F27/R27和F28/R28)、yqhD(同源臂yqhD-up，yqhD-down如表1所示，设计引物对F29/R29和F30/R30)、yahK(同源臂yahK-up，yahK-down如表1所示，设计引物对F31/R31和F32/R32)和yjgB(同源臂yjgB-up，yjgB-down如表1所示，设计引物对F33/R33和F34/R34)的同源臂和p-Target质粒(设计引物对F35/R35～F39/R39)；用得到的基因敲除工具在大肠杆菌K12RA(pCas)中依次敲除相关基因，最终得到敲除上面所述所有7个基因的大肠杆菌K12R。
表6引物序列
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实施例7：大肠杆菌从头合成香兰素
将实施例3构建的重组载体pETDuet-DSD分别和实施例4构建的重组载体pCDM4-OR1～pCDM4-OR6用电转化法转化至实施例6构建的菌株K12R中，分别获得重组菌株KR1～KR6，所得菌株在LB平板上37℃过夜培养，至长出单菌落；挑取单菌落于液体LB培养基中，于37℃、220rpm培养10-12h作为种子液；将种子液以2％接种量转接至25mL发酵培养基装液量的250mL摇瓶中，37℃、220rpm培养3.5～4h至OD600＝0.8～1.0，加入0.5mM IPTG开始诱导，于30℃、220rpm培养20h后取样；发酵液加入等体积乙腈后震荡混匀，12000×g离心5min收集上清；上清液用0.22μm滤膜过滤至液相小瓶，HPLC检测发酵液中的香兰素含量。如表7和图6所示，发酵至20h，含有重组载体pCDM4-OR1的重组大肠杆菌KR1发酵液中检测到63mg/L香兰素。
表7菌株KR1～KR6发酵产香兰素情况
| 菌株 | 香兰素产量(mg/L) |
| KR1 | 63 |
| KR2 | 42 |
| KR3 | 24 |
| KR4 | 35 |
| KR5 | 12 |
| KR6 | 13 |
注：表7中的数据经过四舍五入取整处理。
对比例：
将实施例3构建的重组载体pETDuet-DSD分别和实施例4构建的重组载体pCDM4-OR1～pCDM4-OR6用电转化法转化至实施例5构建的菌株K12RE中，分别获得重组菌株KE1～KE6。按照实施例7的方法进行发酵，检测发酵20h的香兰素产量，结果显示如表8所示。
表8菌株KE1～KE6发酵产香兰素情况
注：表8中的数据经过四舍五入取整处理。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种合成香兰素的重组大肠杆菌，其特征在于，表达了来源于柄孢壳菌(Podosporapauciseta)的脱氢莽草酸脱水酶DSD、来源于钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的甲氧基转移酶LiOMT和来源于诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的羧酸还原酶NiCAR，并敲除了莽草酸脱氢酶基因aroE，醛酮还原酶AKRs基因dkgA、dkgB、yeaE，乙醇脱氢酶ADHs基因yqhD、yahK、yjgB中的一个或多个基因。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pETDuet-1为表达载体表达所述脱氢莽草酸脱水酶DSD。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pCDM4为表达载体表达所述甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR。
4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，表达载体pETDuet-1的PT7启动子被替换为组成型启动子PrpsU。
5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，表达载体pCDM4的PT7启动子被替换为Ptrc启动子。
6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株。
7.一种生产香兰素的方法，其特征在于，以权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌为发酵菌株，以葡萄糖为底物，发酵生产香兰素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在发酵培养基中培养至OD600＝0.8～1.0，用终浓度0.4～0.6mM的IPTG诱导。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、柠檬酸、CaCl2、FeSO4、维生素B1、胰蛋白胨、酵母粉、Al2(SO4)3、CoSO4、CuSO4、H3BO3、MnSO4、Na2MoO4、NiSO4、ZnSO4。
10.权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌，或权利要求7～9任一所述的方法在制备含有香兰素的产品中的应用。
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