CN102994439A - 一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明首先利用分子生物学技术删除了大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶I基因（aroK）、莽草酸激酶II基因（aroL），以及葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBC^Glc的基因（ptsG）和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因（ydiB），获得了大肠杆菌突变株CICIMB0013·SA4（△ aroK,△ aroL,△ ptsG,△ ydiB）。本发明还构建了含有莽草酸代谢途径中关键基因aroG*，ppsA，tktA的重组表达质粒pTHGAA，然后将重组表达质粒pTHGAA电转入重组菌CICIMB0013·SA4中，获得高效生产莽草酸的重组菌大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）。本发明的大肠杆菌重组菌能够实现发酵过程中莽草酸的高效累积。

Description

一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用，通过研究和改进莽草酸生产途径的相关基因和节点的影响，实现大肠杆菌细胞过量合成和积累莽草酸。属于微生物基因工程技术领域。

背景技术

莽草酸(Shikimic acid)是一种芳香族化合物，含有三个羟基、一个羧基和一个双键，具有手性异构体结构。不仅是手性药物（如抗病毒药）的原料，同时也是许多生物碱、芳香族氨基酸与吲哚衍生物的合成原料。更重要的是，它是神经氨酸酶抑制剂GS4104 (达菲)的关键原材料，可用于合成预防与治疗禽流感和甲型流感的药物。其理化性质如表1所示。

表1 莽草酸的理化性质

分子式	C7H10O5
		相对分子质量	174.115
名称	3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸
		状态	白色结晶粉末
熔点	185～187°C
		相对密度	1.64
水中溶解度	180 g/L，难溶于氯仿、苯和石油醚
		气味	味辛酸
旋光度	-180°

莽草酸具有众多重要的生理功能。它通过影响花生四烯酸代谢来抑制血小板聚集，从而可以抑制动、静脉血栓及脑血栓形成。莽草酸具有抗炎、镇痛作用，还可作为抗病毒和抗癌药物的中间体，有广泛的药用价值。莽草酸还是可以抑制H5N1型禽流感病毒的药物磷酸奥司米（达菲）的原料。

随着禽流感疫情在全球蔓延，莽草酸更加供不应求。虽然莽草酸途径在植物、微生物和寄生生物中广泛存在，但该途径的中间代谢物，如莽草酸、奎宁酸等的大量生产却并不十分容易。目前主要是从八角属植物果实中提取莽草酸，但提取工艺繁琐、且成本较高；瑞士罗氏制药公司拥有Tamiflu（达菲）的生产专利权，价格非常昂贵。

虽然罗氏公司和日本味之素已经发展出以生物工程手段生产莽草酸的方法，但从提纯、生物活性及成本角度考虑，抗病毒药物达菲的生产依然主要依赖中国广西地区种植的八角属植物。目前，莽草酸和八角都已经短缺，价格上涨好几倍，莽草酸每公斤在200~250美元之间，质量特别好的，价格高达每公斤50000美元。传统的提取法无法满足对莽草酸原料的需求，通过现代生物技术对莽草酸的理化性质及生物合成，开发高效的莽草酸生产途径成为国内外研究所追求的目标。

虽然莽草酸代谢途径在微生物和植物中广泛存在，但大肠杆菌以其基因工程操作和高密度培养技术成熟、培养周期短、成本较低的优势成为开发高产莽草酸工程菌的首选。如图1所示，大肠杆菌中莽草酸途径是芳香族氨基酸合成的共同途径，包含7步酶催化反应，最终生成分支酸。首先由糖酵解途径中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HMP途径的4-磷酸赤藓糖(E4P)缩合形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)起始，该反应由aroF 、 aroG 、 aroH基因编码的DAHP合成酶催化，这三个同工酶分别受到L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-色氨酸的反馈抑制。PEP来自糖酵解途径，由ppsA基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A催化丙酮酸转化得到。tktA基因编码的转酮酶A是磷酸戊糖途径中生成E4P的关键酶。DAHP经过一系列反应后生成代谢中间产物莽草酸，后者在莽草酸激酶的作用下生成莽草酸-3-磷酸（S3P），并最终合成3种芳香族氨基酸。通过利用微生物其莽草酸代谢途径进行改造，可获得目标产物莽草酸的有效累积，解决达菲制备原料不足的瓶颈。国外一些公司已开展相关研究，但实现产业化还需进一步优化其条件。

发明内容

本发明的目的是提供了一株利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其混合糖生长并产莽草酸的重组菌菌株。构建得到的菌株发酵方法可行，易于控制。并且利用该重组菌，莽草酸的产量和产率高，能够工业化规模应用。本发明的另一个目的在于提供所述莽草酸生产菌株的构建方法。

本发明的技术方案：莽草酸生产菌株的构建的如下：

本发明提供一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli） B0013 （SA4/pTHGAA），其保藏编号为CCTCC NO：M 2012402。

该重组菌株染色体DNA中有4个基因被删除，同时有1~3个基因过量表达；

删除的基因为：莽草酸激酶I基因aroK，莽草酸激酶II基因aroL，葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBC^Glc基因ptsG和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因ydiB；

过量表达的基因是：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroG*，转酮酶A基因tktA，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA中的1~3个。

本发明所述的大肠杆菌 B0013 (SA4/pTHGAA)的构建方法，

（1）利用同源重组原理，以野生型大肠杆菌B0013为出发菌株，依次敲除CICIM B0013染色体上莽草酸激酶I基因（aroK），莽草酸激酶II基因（aroL），葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBC^Glc基因（ptsG）和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因（ydiB）；利用dif-Xer同源重组系统（微生物学通报，2010, 37(6): 923−928）连续删除莽草酸激酶I基因（aroK），莽草酸激酶II基因（aroL），葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBCGlc基因（ptsG）和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因（ydiB），得到4个基因同时突变的菌株B0013 SA4。

（2）利用PCR技术分别扩增来源于CICIM B0013菌株的过量表达的基因是：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因（aroG *），转酮酶A基因（tktA），磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因（ppsA）后，得到利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其混合糖生长并高效产莽草酸重组菌菌株。大肠杆菌基因工程菌B0013 (SA4/pTHGAA）的代谢途径如图1所示。

（3）并连接表达载体，将aroG *，tktA和ppsA基因插入pTH18Kr载体中，获得过量表达这三个基因的重组质粒，命名为pTHGAA。

（4）将步骤（3）获得的重组质粒pTHGAA导入步骤（1）得到的B0013 SA4菌株中，获得阳性转化子，命名为大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）。

aroG *基因是解除了反馈抑制的突变基因，其突变位点在该基因编码蛋白的第146位氨基酸位点，Asp 146 Asn；即将该基因编码蛋白中146位的天冬氨酸密码子突变为天冬酰酸。大肠杆菌aroG *突变后的DNA序列为SEQ ID NO: 1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。

步骤（3）中过量表达基因所用表达载体是pTH18kr，但不仅限于该载体。

利用本发明所述的大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）发酵生产莽草酸的方法，具体步骤为：

从LB平板上挑取大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按4%的接种量接种于发酵培养基中，37℃培养，发酵过程中控制碳源浓度在10 g/L左右，发酵时间60 h。

发酵培养基组成为（g/ L）： Na₂HPO₄·H₂O 13， KH₂PO₄ 3，NaCl 0.5，NH₄Cl 0.1，MgSO₄ 1.2，L-苯丙氨酸 0.7，L-色氨酸0.35，L-酪氨酸0.7，柠檬酸铁铵0.3，一水合柠檬酸2.1，对羟基苯甲酸0.01，对氨基苯甲酸钾0.01，2,3-二羟基苯甲酸0.01，酵母抽提物15，蛋白胨20，碳源25，以纯净水配制。

所使用的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；发酵结束时莽草酸的含量达到约20g/L。

生物材料样品保藏：一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）B0013（SA4/pTHGAA），已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2012402，保藏日期2012年10月14日。

本发明的有益效果：本发明的大肠杆菌重组菌B0013（SA4/pTHGAA）能够实现发酵过程中莽草酸的高效累积。

附图说明

图1 大肠杆菌莽草酸代谢途径

图2敲除aroL、aroK、ptsG和ydiB基因的PCR鉴定电泳图谱

M：DL2000 DNA marker；泳道1：野生型CICIM B0013菌株aroL 基因的PCR产物（575bp）；泳道2：aroL ’ ::difGm的PCR 产物；泳道3：已敲除了基因aroL的PCR产物；泳道4：野生型CICIM B0013菌株aroL 基因的PCR产物（657bp）；泳道5：aroK ’ ::difGm的PCR产物；泳道6：已敲除了基因aroK的PCR产物（356bp）；泳道7：野生型CICIM B0013菌株ptsG 基因的PCR产物（1461bp）；泳道8：ptsG ’ ::difGm PCR产物；泳道9：已敲除了基因ptsG的PCR产物（706bp）；泳道10：野生型CICIM B0013菌株ydiB基因的PCR产物（660bp）；泳道11：ydiB ’ ::difGm PCR产物；泳道12：已敲除了基因ydiB的PCR产物（375bp）。

图3重组质粒pTHGAA的质粒图谱。

图4出发菌株B0013与构建的重组菌株B0013（SA4/pTHGAA）的莽草酸发酵过程趋势图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应指出，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

根据大肠杆菌中莽草酸的代谢途径，本发明首先构建了aroL、aroK、ptsG、ydiB四个基因均敲除的菌株CICIM B0013·SA4，使得莽草酸在代谢途径中获得积累；同时构建了含有莽草酸代谢途径中关键基因aroG*，ppsA，tktA的重组表达质粒pTHGAA，以实现莽草酸的过量表达，然后将重组表达质量pTHGAA转入SA4菌中，获得莽草酸生产菌株SA4/pTHGAA。

在一个具体的实施例中，本发明所构建的莽草酸生产菌株经发酵后能够有效实现目的产物莽草酸的积累，从而为莽草酸的产业化生产奠定了基础。

实施例1、突变株CICIM B0013·SA4的构建

1.1 突变株CICIM B0013·SA1（△ aroL）的构建

用以aroL基因上下游设计的引物aLup、aLdn扩增大肠杆菌染色体DNA上的aroL基因，片段大小为575 bp。PCR扩增体系为50μL（Taq酶1μL，Taq酶buffer 5μL，dNTPs 4μL，上下游引物各1μL，模板1μL，ddH₂O 17μL），条件为：94℃，5min；94℃，30s；52℃，1min；72℃，1min，30个循环。PCR产物克隆入pMD18-T-simple载体中，获得重组质粒pMD-aroL。以该重组质粒为模板，用引物Lverup、Lverdn进行反向PCR扩增。PCR扩增体系为50μL，条件为：94℃，5min；94℃，30s；58℃，1min；72℃，3.5min，30个循环。PCR产物与difGm片段连接得到重组质粒pMD-aroL’::difGm。以重组质粒pMD-aroL’::difGm为模板，用aLup、aLdn引物进行PCR扩增得到片段aroL’::difGm，即aroL基因的突变盒。

将出发菌株B0013电击转化导入pKD46质粒获得重组菌B0013/pKD46（基于Red重组系统和Xer重组系统的大肠杆菌多基因删除方法，微生物学通报，2010，37（6））。将aroL基因的突变盒电击转入出发菌B0013/pKD46的感受态细胞后立即加入含有1 mmol/L L-阿拉伯糖的液体LB培养基，30℃、100 r/min培养4-6 h，涂布于含有庆大霉素的抗性平板，长出来的菌落用引物YL、aLdn进行菌落PCR鉴定。PCR扩增体系为50μL（Taq酶1μL，Taq酶buffer 5μL，dNTPs 4μL，上下游引物各1μL，模板1μL，ddH₂O 17μL），条件为：94℃，5min；94℃，30s；52℃，1min；72℃，1.5min，30个循环。取鉴定正确的转化子接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，30℃、200r/min培养，并多次转接传代后，取一环菌液划线于含有氨苄青霉素的固体LB平板，30℃过夜培养，长出的单菌落分别点种于含庆大霉素抗生素的固体LB平板和含氨苄青霉素的固体LB平板，挑选出庆大霉素抗性丢失的转化子，并用上述引物进行进一步的菌落PCR验证，PCR片段大小正确即为获得aroL基因突变缺失并含有pKD46的突变株，命名为SA1/pKD46。

引物序列如下：

aLup：5′-GAATTCATTCTCATGACACCGGCTTT-3′

aLdn：5′-GAATTCACAATTGATCGTCTGTGCCA-3′

Lverup：5′-AAGATTTACGGCCAACCTTAA-3′

Lverdn：5′-CCGCGACCGTCATATTGAGC-3′

YL：5′-CGAAATTGTACTAGTTTGATGGTATG-3′

1.2突变株CICIM B0013·SA2（△ aroL，△ aroK）的构建

利用相似的策略，构建含有aroK基因突变盒的重组质粒pMD-aroK’::difGm，用aKup和aKdn引物含有的酶切位点EcoR I进行酶切验证，获得2.7 kb（pMD-T-simple载体）和1.3 kb（aroK’::difGm片段）左右的两条电泳条带。

用EcoR I酶切重组质粒pMD-aroK’::difGm，割胶回收片段aroK’::difGm（大小为1356 bp），并将其电转入宿主菌SA1/pKD46中，涂布于庆大霉素抗性平板，挑取长出的单菌落转接于无抗生素的LB平板上传代培养，挑取单菌落用引物YK、aKdn进行菌落PCR验证，没有突变成功的出发菌PCR产物为aroK基因（大小为657 bp）；突变盒成功整合到染色体上的转化子PCR产物为aroK’::difGm（大小为1356 bp）；丢掉庆大抗性标记基因的转化子PCR产物为aroK’::dif（大小为356 bp）（见图2）。表明aroK基因已经被成功敲除。引物序列如下。

aKup：5′-GAATTCCGCTTTGATCATCAGTACGA-3′

aKdn：5′-GAATTCCTTGCAGCGACCAGATATG-3′

Kverup：5′-GATAAACCCGCTTCGCTCAG-3′

Kverdn：5′-CGTAACCGTCTTTCCGCTCGTG-3′

YK：5′-GTTGCTTTCCAGCATGTGAAT-3′

1.3突变株CICIM B0013·SA3（△ aroL，△ aroK，△ ptsG）的构建

构建含有ptsG基因突变盒的重组质粒pMD-ptsG’::difGm。用内切酶EcoR I进行酶切验证，凝胶电泳获得两条明显条带，分别为2.7 kb（pMD-T-simple载体）和1.5 kb（ptsG’::difGm片段）。

以引物YG、pGdn进行菌落PCR验证，出发菌株SA2 PCR结果显示为1.4Kb（ptsG基因的大小）；ptsG突变盒整合到染色体上的转化子PCR结果大小为1.7 Kb（ptsG’::difGm的大小）；经dif重组而丢掉Gm基因的转化子PCR结果显示为0.7 Kb（ptsG’::dif的大小），可知染色体上被删除的基因区域大小为700 bp。鉴定电泳图谱见图2，表明ptsG基因已经被成功敲除。引物序列如下。

PGup：5′-CCGGAATTCTCGGTAAATCGCTGATGCTGCC-3′

PGdn：5′-CCGGAATTCCGGGTAATACATGCGTCGAGGTTAG-3′

PGverup：5′-TGCAGTACCAGTGGCGCAAC-3′

PGverdn：5′-TGTGGCTGTTCCCGATCGTC-3′

YG：5′-GTCAAAATGTGCAACTTCTCCAATG-3′

1.4突变株CICIM B0013·SA4（△ aroL，△ aroK，△ ptsG，△ ydiB）的构建

首先以yBup和yBdn为引物，PCR扩增大肠杆菌的ydiB基因，构建含有ydiB基因突变盒ydiB’::difGm的重组质粒pMD-ydiB’::difGm。用EcoR I对重组质粒pMD-ydiB’::difGm进行酶切验证，用EcoR Ⅰ酶切后出现两条条带，分别为分别为2.7 kb（pMD18-T-simple载体）和1.4 kb（ydiB’::difGm片段）。结果表明重组质粒pMD-ydiB’::difGm构建成功。

以引物YB、yBdn对在庆大霉素抗性筛选平板上长出的单菌落进行菌落PCR验证，出发菌株SA3菌落PCR结果显示为0.6 Kb（ydiB基因的大小）；ydiB突变盒片段ydiB’::difGm整合到染色体上的转化子PCR结果大小为1.3 Kb左右（ydiB’::difGm的大小）；经dif-dif重组而丢掉Gm基因的转化子PCR结果显示为0.3 Kb左右（ydiB’::dif的大小），可知大肠杆菌染色体上被删除的基因区域大小为300 bp。鉴定电泳图谱见图2，表明ydiB基因已经被成功敲除。引物序列如下。

yBup：5′-CTCGAATTCCTATCCTATCCGCCACAGT-3′

yBdn：5′-CTCGAATTCACGCATTCAGTGACCAGA-3′

yBverup：5′-CCGATTGTGTCGTCACGGT-3′

yBverdn：5′-CATCAACATATTCACACGCCAG-3′

YB：5′-ATGGATGTTACCGCAA-3′

实施例2、重组质粒pTHGAA的构建

2.1 重组质粒pTHG的克隆

以大肠杆菌CICIM B0013的基因组为模板，利用引物aoGm-up、aoGm-dn、aoG-up、aoG-dn进行重叠PCR，扩增定点突变的aroG*基因。引物序列如下：

aoGm-up：5′-gtgagtttctcaatatgatcaccc-3′

aoGm-dn：5′-tggggtgatcatattgagaaact-3′

aoG-up：5′-ccggaattcaggaggccatccatgaattatcagaacgac-3′

aoG-dn：5′-cggggtaccttacccgcgacgcgcttttact-3′

用引物aoG-up和aoGm-dn进行PCR扩增得到片段P1，用引物aoGm-up 和aoG-dn进行第二轮PCR扩增得到片段P2。PCR扩增体系为50μL（Taq酶1μL，Taq酶buffer 5μL，dNTPs 4μL，上下游引物各1μL，模板1μL，ddH₂O 17μL），PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s；56℃，1min；72℃，1min，30个循环，胶回收上述两个片段。再以P1、P2为模板，用引物aoG-up和aoG-dn进行第三轮PCR扩增得到aroG*基因，扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s；64℃，1min；72℃，1.5min，30个循环。

PCR结果中已经将aroG基因的146位氨基酸由Asp突变为Asn，克隆得到突变基因aroG*。然后将PCR片段用EcoR I和Kpn I双酶切后克隆至pTH18kr，得到重组质粒pTHG。

2.2 重组质粒pTHGA的克隆

以大肠杆菌CICIM B0013的基因组为模板，利用引物ppsA-up、ppsA-dn进行PCR扩增ppsA基因。引物序列如下：

ppsA-up：5′-cggggtaccaggaggccatccatgtccaacaatggctcgtcac-3′

ppsA-dn：5′-tgctctagattatttcttcagttcagccagg-3′

PCR扩增体系为50μL（Taq酶1μL，Taq酶buffer 5μL，dNTPs 4μL，上下游引物各1μL，模板1μL，ddH₂O 17μL），PCR扩增条件为：94℃，5min；94℃，30s；55℃，2.5min；72℃，1.5min，30个循环。

扩增得到的ppsA基因，用Kpn I和Xba I双酶切后克隆至质粒pTHG，得到重组质粒pTHGA。

2.3重组质粒pTHGAA的克隆

以大肠杆菌CICIM B0013的基因组为模板，利用引物tktA-up、tktA-dn进行PCR扩增tktA基因。引物序列如下：

tktA-up：5′-tgctctagaaggaggccatccatgtcctcacgtaaagagcttg-3′

tktA-dn：5′-acatgcatgcttacagcagttcttttgctttcgc-3′

PCR扩增体系为50μL（Taq酶1μL，Taq酶buffer 5μL，dNTPs 4μL，上下游引物各1μL，模板1μL，ddH₂O 17μL），PCR扩增条件为：94°C，5min；94°C，30s；64°C，1min；72°C，2min，30个循环。

扩增得到的tktA基因，用Xba I和Sph I双酶切后克隆至质粒pTHGA，得到重组质粒pTHGAA。其质粒图谱如图3所示。

实施例3、莽草酸表达菌株的获得

将实施例1获得的突变株CICIM B0013·SA4（△ aroL，△ aroK，△ ptsG，△ ydiB）作为宿主菌，用电击转化的方法将实施例2获得的重组表达质粒pTHGAA转化到其中，获得表达莽草酸的大肠杆菌宿主菌SA4/pTHGAA。

实施例4、莽草酸生产菌株表达莽草酸

分别挑取原始菌和大肠杆菌宿主菌SA4/pTHGAA单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按4%的接种量接种于500mL发酵培养基中，37℃培养，每隔一定时间取样测量菌体浓度。发酵48h，取1.5 mL的发酵上清液加入等体积的10%的三氯乙酸混合均匀，4℃放置2 h沉淀杂质蛋白。室温12000 r/min，离心8 min，上清液经0.45 μm的膜过滤后，用高效液相的方法测定发酵液中莽草酸的含量。

高效液相色谱分析条件：色谱柱为Aminex HPX-87H column (300×7.8 mm; 9 μm)，流动相为0.005 M硫酸，流速为0.6 mL/min，紫外检测波长为210 nm，柱温为50℃，进样量为20 μL，测量停留时间为20 min。

以发酵时间对菌体浓度作图，结果如图4所示。由图4结果可见，重组菌与原始菌相比，对数生长期延长，最终菌体浓度更高。高效液相测量后，出发菌株发酵48h后莽草酸含量为1.6mg/L，莽草酸生产菌株发酵48h后莽草酸含量为568 mg/L。

综上所述，本发明所构建的大肠杆菌重组菌CICIM B0013·SA4/pTHGAA能够实现发酵过程中莽草酸的有效积累，从而为莽草酸生产的工业化奠定了基础。

大肠杆菌AroG突变后的DNA序列与编码的氨基酸序列

<160> 2

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 1053

<212> DNA

<213>大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）

<400>1

atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60

gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120

aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180

tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240

gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300

acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360

gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420

gcaggtgagt ttctc aac at gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480

gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540

tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600

aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660

gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720

tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780

caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840

gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900

gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960

ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020

ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 350

<212>PRT

<213>大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）

<400>2

MET Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu

5 10 15

Leu Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Ala Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys

35 40 45

Ile Leu Lys Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro

50 55 60

Cys Ser Ile His Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg

65 70 75

Leu Leu Ala Leu Arg Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val

80 85 90

MET Arg Val Tyr Phe Glu Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys

95 100 105

Gly Leu Ile Asn Asp Pro His MET Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn

110 115 120

Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp

125 130 135

Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe Leu Asn MET Ile Thr Pro

140 145 150

Gln Tyr Leu Ala Asp Leu MET Ser Trp Gly Ala Ile Gly Ala Arg

155 160 165

Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala Ser Gly Leu Ser

170 175 180

Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr Ile Lys Val

185 190 195

Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys Phe Leu

200 205 210

Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser Gly

215 220 225

Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn

230 235 240

Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys

245 250 255

Ala Gly Leu Pro Ala Gln Val MET Ile Asp Phe Ser His Ala Asn

260 265 270

Ser Ser Lys Gln Phe Lys Lys Gln MET Asp Val Cys Ala Asp Val

275 280 285

Cys Gln Gln Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val MET

290 295 300

Val Glu Ser His Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly

305 310 315

Glu Pro Leu Ala Tyr Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly

320 325 330

Trp Glu Asp Thr Asp Ala Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val

335 340 345

Lys Ala Arg Arg Gly ***

350

Claims (5)

1.一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌株，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli）B0013（SA4/pTHGAA），该重组菌株染色体DNA中有4个基因被删除，同时有1~3个基因过量表达；

删除的基因为：莽草酸激酶I基因aroK，莽草酸激酶II基因aroL，葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBC^Glc基因ptsG和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因ydiB；

过量表达的基因是：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroG*，转酮酶A基因tktA，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA中的1~3个。

2.权利要求1所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于步骤如下：

（1）利用同源重组原理，以野生型大肠杆菌B0013为出发菌株，依次删除CICIM B0013染色体上aroK，aroL，ptsG和ydiB基因，获得菌株B0013 SA4；

（2）利用PCR技术分别扩增来源于CICIM B0013菌株的aroG*，tktA和ppsA基因片段；

（3）将aroG*，tktA和ppsA基因插入pTH18Kr载体中，构建过量表达这三个基因的表达载体的重组质粒，命名为pTHGAA；

（4）将步骤（3）获得的表达载体pTHGAA导入步骤（1）的B0013 SA4菌株中，筛选获得转化子，命名为大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）。

3.根据权利要求2所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于aroG*基因是解除了反馈抑制的突变基因，其突变位点在该基因编码蛋白的第146位氨基酸位点，Asp 146 Asn；即将该基因编码蛋白中146位的天冬氨酸密码子突变为天冬酰酸。

4.根据权利要求2所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于步骤（3）中过量表达基因所用表达载体是pTH18kr，但不仅限于该载体。

5.用权利要求1所述大肠杆菌重组菌株发酵生产莽草酸的方法，其特征在于：从LB平板上挑取大肠杆菌B0013（SA4/pTHGAA）单菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养过夜，然后按4%的接种量接种于发酵培养基中，37℃培养，发酵过程中控制碳源浓度在10 g/L，发酵时间60 h；

发酵培养基组成以g/ L计为：Na₂HPO₄·H₂O 13， KH₂PO₄ 3，NaCl 0.5，NH₄Cl 0.1，MgSO₄ 1.2，L-苯丙氨酸 0.7，L-色氨酸0.35，L-酪氨酸0.7，柠檬酸铁铵0.3，一水合柠檬酸2.1，对羟基苯甲酸0.01，对氨基苯甲酸钾0.01，2,3-二羟基苯甲酸0.01，酵母抽提物15，蛋白胨20，碳源25，以纯净水配制；

所使用的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；发酵结束时莽草酸的含量达到20g/L。

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