CN107619817A - 生产3‑脱氢莽草酸大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生产3‑脱氢莽草酸的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株WJ004，其通过下调3‑脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达或不表达而降低3‑脱氢莽草酸脱氢酶酶活。该菌株可以在葡萄糖无机盐培养基中正常生长，无需添加芳香族氨基酸及其衍生物等生长因子就能够生产3‑脱氢莽草酸，降低了培养基成本，从而降低3‑脱氢莽草酸的生产成本。且上述重组菌株均不含质粒，遗传性稳定。

Description

生产3-脱氢莽草酸大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产3-脱氢莽草酸重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate,DHS)是微生物及植物体内芳香族氨基酸生物合成代谢途径中的一种重要中间产物(图1)，对维系生物正常发育、完成代谢过程具有重要作用(Draths KM,Kambourakis S, Li K,et al.Chemicals and mate-rials fromrenewable resources.Washington DC:American Chemical Society,2001:133-146.)。DHS可被进一步催化形成抗流感药物达菲的前体物莽草酸、原儿茶酸 (Protocatechuate)、香草醛(Vanillin)、儿茶酚(Catechol)、没食子酸(Gallate)及已二酸(Adipate)等一系列重要化工产品(Li K,Frost JW.Synthesis of vanillin from glucose.Journal of theAmerican Chemical Society,1998,120:10545-10546；Draths KM,FrostJW.Environmentally compatible synthesis of catechol from D-glucose.Journal ofthe American Chemical Society,1995,117:2395-2400；Draths KM, FrostJW.Environmentally compatible synthesis of adipic acid from D-glucose.Journalof the American Chemical Society,1994,116:399-400)，甚至“阿司匹林”的前体物水杨酸(Salicylic acid) (Lin YH,Sun XX,Yuan QP,et al.Extending shikimate pathwayfor the production of muconic acid and its precursor salicylic acid inEscherichia coli.Metabolic Engineering,2014,23:62-69；Noda S,Shirai T,Oyama S,et al.Metabolic design of a platform Escherichia coli strain producingvarious chorismate derivatives.Metabolic Engineering,2016,33:119-129)。利用3-脱氢莽草酸合成这些化工产品可以避免有毒的苯和甲苯等原料的使用，减少对人体和环境影响。此外，3-脱氢莽草酸还是一种十分有效的抗氧化剂，其活性甚至优于没食子酸、丙基没食子酸(Propyl gallate)、BHQ(tertbutylhydroquinone)、丁羟甲苯(butylatedhydroxytoluene，BHT)、生育酚(α-tocopherol)等一些商品化的抗氧化剂，具有重要的应用价值。还有，DHS作为一种小分子手性化合物，还可以作为药物合成中非常有潜力的合成中间体(Richman JE,Chang YC,Kambourakis S,et al.Reaction of 3-dehydroshikimic acid with molecular-oxygen and hydrogen peroxide:products,mechanism,and associated antioxidant activity.Journal of the AmericanChemical Society,1996,118:11587-11591)。因此，研究3-脱氢莽草酸的生产具有重要的应用前景。

Li等以aroE基因突变的菌株Escherichia coli AB2834为出发菌株，通过紫外诱变筛选到aroF基因的突变子aroF^FBR，该基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶酪氨酸反馈抑制得到解除，突变菌株命名为E.coli AB2.24，之后通过同源重组在E.coliAB2.24染色体serA位点插入aroB基因，加快DAHP向3-脱氢奎尼酸(3-dehydroquinicacid,DHQ)转变的速率，同时在质粒pKL4.130B上携带一个serA 基因，使该菌能在不添加氯霉素的情况下仍能维持质粒稳定，该质粒还携带tktA和aroF^FBR基因，并在第一个aroF^FBR基因转录相反方向插入一个lac启动子驱动的另一个aroF^FBR基因。最终得到的大肠杆菌工程菌E. coli KL3/pKL4.130B能在适当的IPTG添加策略下以葡萄糖为原料发酵48h，上清液中积累69g/L的DHS，为目前报导的DHS产量最高的细胞工厂(Li K,MikolaMR,Draths KM,et al.Fed-batch fermentor synthesis of 3-dehydroshikimicacidusing recombinant Escherichia coli.Biotechnology&Bioengineering,1999, 64:61-73.)。Li等比较了大肠杆菌工程菌E.coli KL3/pKL4.79B在以己糖或戊糖为唯一碳源和己糖和戊糖糖为混合碳源的条件下，菌株的3-脱氢莽草酸生产能力。最后证明无论是单独以木糖、阿拉伯糖为唯一碳源或葡萄糖/木糖/阿拉伯糖3种糖为混合碳源，其发酵上清液中DHS产量均较单独以葡萄糖为碳源要高。当以葡萄糖：木糖：阿拉伯糖＝3:3:2为混合碳源时3-脱氢莽草酸含量最高，达53g/L(Li K and Frost JW.Microbial synthesis of 3-dehydroshikimicacid:Acomparative analysis of D-xylose,L-arabinose,and D-glucose carbon sources.Biotechnology Progress,1999,15:876-883；YiJ,Draths KM,LiK,et al.Altered glucose transport and shikimate pathway product yields inE.coli.Biotechnology Progress,2003, 19:1450-1459.)。Gosset等通过失活磷酸葡萄糖转移酶系统(PTS)系统，同时在质粒上表达来自于Zymommonas mobilis的glf基因编码的葡萄糖转运蛋白和glk基因编码的葡萄糖激酶，得到恢复快速生长能力的大肠杆菌工程菌株VH32，该菌株发酵48h可得到60g/L的3-脱氢莽草酸，摩尔转化率达到41％(GossetG.Improvement of Escherichia coli production strains by modification of thephosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system.Microbial Cell Factories,2005,4(1):14)。

上述研究构建的大肠杆菌工程菌株虽然可以生产3-脱氢莽草酸，但其产量还不能够满足市场需求，其产量有待提高。而且，目前构建的相关的工程菌株或者因含有重组质粒而造成遗传不稳定，或者在生产过程中需要在培养基中添加有机氮源或芳香族氨基酸及其衍生物以促进细胞生长，从而影响产业应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株或由其传代而产生的重组菌株，该菌株不含重组质粒，遗传性稳定。

本发明一方面提供生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株WJ004，其通过调节3- 脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达而改变3-脱氢莽草酸脱氢酶酶活。

示例性地，所述重组菌株WJ004通过下调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达或不表达而降低3-脱氢莽草酸酶酶活，进而提高3-脱氢莽草酸的产量。

示例性地，通过在3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)起始密码子上游插入合成调控元件P1而下调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达或不表达aroE，优选地，在aroE起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1。

示例性地，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一个具体实施例中，aroE的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG或GTG，其可与合成调控元件P1组合共同调控aroE的表达，改变3-脱氢莽草酸脱氢酶的酶活。

示例性地，重组菌株WJ004可以在葡萄糖无机盐培养基中正常生长，无需添加芳香族氨基酸及其衍生物等生长因子，降低了培养基成本，从而降低3-脱氢莽草酸的生产成本。

示例性地，重组菌株WJ004以大肠杆菌DSM1576为出发菌株。

本发明还提供了一种培养基或发酵液，该培养基或发酵液包含上述重组菌株WJ004或由其传代而产生的重组菌株。

示例性地，所述发酵液为上述重组菌株WJ004或由其传代而产生的重组菌株发酵后的发酵液。

示例性地，培养基或发酵液中不含有芳香族氨基酸及其衍生物等生长因子。

本发明还提供重组菌株WJ004的构建方法，其包括如下步骤：

通过同源重组方法，插入合成调控元件P1。优选地，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子上游插入合成调控元件P1；更优选地，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1；

优选地，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ004用稀有起始密码子TTG或GTG替换原始起始密码子ATG 来调控aroE的表达。其可与合成调控元件P1共同调控降低aroE的表达，进而提高3-脱氢莽草酸的产量。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ004的构建方法，具体包括如下步骤：

S41：设计引物41，以含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)的质粒为模板进行PCR扩增，得到扩增产物aroE1；扩增产物aroE1包含cat-sacB盒以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基序列和aroE起始密码子开始的40个碱基序列，并且aroE起始密码子的ATG被替换成TTG；

S42：将扩增产物aroE1导入含有pKD46的大肠杆菌DSM1576后进行同源重组形成大肠杆菌aroE1(含有pKD46)，实现在aroE起始密码子前插入cat-sacB盒；

S43：设计引物43，以人工合成的调控元件P1DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物aroE2；扩增产物aroE2包含合成调控元件P1以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基序列和aroE起始密码子开始的40个碱基序列，并且aroE起始密码子的ATG被替换成TTG；

S44：将扩增产物aroE2导入大肠杆菌aroE1进行同源重组，得到大肠杆菌aroE2，实现在aroE起始密码子前合成调控元件P1并且，并且aroE起始密码子的ATG被替换成TTG；

S45：去掉大肠杆菌aroE2中的pKD46质粒得到大肠杆菌WJ004。

优选地，在上述步骤S42与步骤S43之间增加步骤S423：设计引物42，DNA测序验证大肠杆菌aroE1；

和/或在上述步骤S44与步骤S45之间增加步骤S445:设计引物44，DNA测序验证大肠杆菌aroE2。

示例性地，引物41的序列为：

aroE1-up：GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATAGTGACGGAAGATCACTTC

aroE1-down：CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCAATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物42的序列为：

2-aroE-1-up：TTCAGAAATCCGCGATGCCCTGA

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

示例性地，引物43的序列为：

aroE-P1-s：GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATATTATCTCTGGCGGTGTTG

aroE-P1T-a：CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

示例性地，引物44的序列为：

w-promoter-s：TTATCTCTGGCGGTGTTG

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

示例性地，在本发明的具体实施例，步骤S41中并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat 和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)即可。

示例性地，cat-sacB盒的序列如SEQ ID NO:7所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

示例性地，步骤S42中，扩增产物aroE1通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌DSM1576。

示例性地，通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌DSM1576构建含有pKD46质粒的大肠杆菌 DSM1576。

示例性地，步骤S44中，扩增产物aroE2通过电转化法导入含有大肠杆菌aroE1中。

本发明还提供上述重组菌株WJ004或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

本发明还提供上述重组菌株WJ004或由其传代而产生的重组菌株发酵生产3-脱氢莽草酸的方法。

示例性地，将重组菌株WJ004与DSM1576以任意比例组合后进行发酵生产3-脱氢莽草酸。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株WJ004发酵生产3-脱氢莽草酸的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株WJ004接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于摇瓶发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，恒温震荡培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-100g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供了另外一种生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ006，其以大肠杆菌DSM1576或上述重组菌株WJ004为出发菌株进行构建。

示例性地，重组菌株WJ006以上述重组菌株WJ004为出发菌株进行构建。

重组菌株WJ006的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶不受芳香族氨基酸的反馈抑制。

优选地，重组菌株WJ006通过3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(aroF)的突变而不受芳香族氨基酸的反馈抑制。

示例性地，基因aroF中第443位的碱基C突变为T形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶突变基因aroF*。

示例性地，突变基因aroF*的基因序列如SEQ ID NO:5所示。

重组菌株WJ006上调3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶的表达。

优选地，重组菌株WJ006通过在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因的起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4而上调该酶的表达；

示例性地，重组菌株WJ006在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因的起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4；

优选地，重组菌株WJ006插入合成调控元件P2；

示例性地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2 所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种培养基或发酵液，该培养基或发酵液包含上述重组菌株WJ006或由其传代而产生的重组菌株。

示例性地，所述发酵液为上述重组菌株WJ006或由其传代而产生的重组菌株发酵后的发酵液。

本发明还提供上述重组菌株WJ006的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，将3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF中第443位的碱基C突变为T 形成突变基因aroF*。

在本发明的一个具体实施方式中，在重组菌株WJ006的突变基因aroF*起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4，其与突变基因aroF*共同提高3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸的表达，进而提高3- 脱氢莽草酸的产量。

优选地，在aroF*起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4。

示例性地，在aroF*起始密码子ATG上游插入合成调控元件P2。

示例性地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2 所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，以大肠杆菌WJ004为出发菌株，重组菌株WJ006的构建方法，具体包括如下步骤：

S61：设计引物61，以大肠杆菌DSM1576基因组DNA为模板PCR扩增aroF基因序列，得到扩增产物aroF；

S62：将扩增产物aroF克隆到pEASY-Blunt载体上，得到重组质粒pEASY-aroF；

S63：设计引物62，以pEASY-aroF为模板，反向扩增，反向扩增的DNA片段自连后形成重组质粒 pEASY-aroF*；该质粒上的aroF基因被点突变后变成了aroF*，即aroF基因第443位的碱基C被改为T；

S64：设计引物63，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)的质粒为模板进行进行PCR扩增，得到扩增产物aroF1。扩增产物aroF1包含cat-sacB盒以及两端分别是aroF起始密码子上游的40个碱基和aroF终止密码子下游的40个碱基；

S65：将扩增产物aroF1导入含有pKD46的大肠杆菌WJ004后进行同源重组形成大肠杆菌aroF1(含有 pKD46)，实现在aroF基因片段被cat-sacB盒替换；

S66：设计引物65，以步骤S63中构建的重组质粒pEASY-aroF*DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物aroF2；扩增产物aroF2包含突变序列aroF*以及两端分别是aroF起始密码子上游40个碱基和aroF终止密码子下游40个碱基。

S67：将扩增产物aroF2导入大肠杆菌aroF1进行同源重组，得到大肠杆菌aroF2，实现aroF*替换原始的aroF；

S68：设计引物67，以cat-sacB盒为模板进行扩增，得到扩增产物aroF3，扩增产物aroF3包括cat-sacB 盒以及两端分别是aroF起始密码子上游40个碱基和aroF起始密码子开始的40个碱基；

S69：将扩增产物aroF3导入大肠杆菌aroF2进行同源重组得到大肠杆菌aroF3(含有pKD46)，实现在 aroF*起始密码子前插入cat-sacB盒；

S610：设计引物69，以人工合成的调控元件P2的DNA为模板进行扩增，得到扩增产物aroF4，扩增产物 aroF4包含合成调控元件P2以及两端分别是aroF起始密码子上游40个碱基和aroF起始密码子开始的40个碱基；

S611：将扩增产物aroF4导入大肠杆菌aroF3进行同源重组得到大肠杆菌aroF4，实现在aroF起始密码子前合成调控元件P2；

S612：去掉大肠杆菌aroF4中的pKD46质粒得到重组大肠杆菌WJ006。

优选地，上述重组大肠杆菌WJ006的构建过程中，对每一步获得的重组大肠杆菌(例如，大肠杆菌aroF1、大肠杆菌aroF2、大肠杆菌aroF3及大肠杆菌aroF4等)进行DNA测序验证。

示例性地，引物61的序列为：

aroF-F：ATGCAAAAAGACGCGCTGAA

aroF-R：TTAAGCCACGCGAGCCGTCAG

示例性地，引物62的序列为：

aroF-Fm：GGCGACGGAAGCGTTAGATCTGAATAGCCCGCAATACCTGGG

aroF-Rm：AGTGGCAGTCCCATATTCACCAGCTCAAGC

示例性地，引物63的序列为：

aroF1-up：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCGTGACGGAAGATCACTTC

aroF1-down：ATCGCGTAATGCGGTCAATTCAGCAACCATAATAAACCTCATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物65的序列为：

aroF2-up：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCGATGCAAAAAGACGCGCTGAATAAC

aroF2-down：ATCGCGTAATGCGGTCAATTCAGCAACCATAATAAACCTCTTAAGCCACGCGAGCCGTCAGC

示例性地，引物67的序列为：

aroF1-up：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCGTGACGGAAGATCACTTC

aroF3-down：CGTCGGTAATATGTACGTTATTCAGCGCGTCTTTTTGCATATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物69的序列为：

aroF-P2-up：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCTTATCTCTGGCGGTGTTGAC

aroF-P2-down：CGTCGGTAATATGTACGTTATTCAGCGCGTCTTTTTGCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

示例性地，在本发明的具体实施例中，并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)即可。

示例性地，cat-sacB盒的序列如SEQ ID NO:7所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

本发明还提供上述重组菌株WJ006或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

本发明还提供上述重组菌株WJ006或由其传代而产生的重组菌株发酵生产3-脱氢莽草酸的方法。

示例性地，将重组菌株WJ006，或重组菌株WJ006与重组菌株WJ004以任意比例组合，或者重组菌株WJ006 与DSM1576以任意比例组合，或者重组菌株WJ006、重组菌株WJ004与DSM1576以任意比例组合后进行发酵生产3-脱氢莽草酸。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株WJ006发酵生产3-脱氢莽草酸的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株WJ006接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于摇瓶发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，恒温震荡培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-50g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供了另外一种生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ0012，其以大肠杆菌DSM1576或上述重组菌株WJ004或上述重组菌株WJ006为出发菌株进行构建。

示例性地，重组菌株WJ0012以上述重组菌株WJ006为出发菌株进行构建。

重组菌株WJ0012通过上调转酮醇酶(tktA)的表达，进而提高3-脱氢莽草酸的产量。

示例性地，重组菌株WJ0012通过在转酮醇酶基因(tktA)起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或 P3和/或P4而上调转酮醇酶(tktA)的表达；

示例性地，重组菌株WJ0012通过在转酮醇酶基因(tktA)起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/ 或P3和/或P4而上调转酮醇酶(tktA)的表达。

示例性地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2 所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ012在tktA起始密码子ATG上游插入合成调控元件P4。

本发明还提供了一种培养基或发酵液，该培养基或发酵液包含上述重组菌株WJ012或由其传代而产生的重组菌株。

示例性地，所述发酵液为上述重组菌株WJ012或由其传代而产生的重组菌株发酵后的发酵液。

本发明还提供上述重组菌株WJ012的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，在转酮醇酶基因(tktA)起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4来调控tktA的表达；

示例性地，在转酮醇酶tktA起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4来调控tktA的表达；

在本发明的一个具体实施方式中，在tktA起始密码子ATG上游插入合成调控元件P4；

示例性地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3 所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，以大肠杆菌WJ006为出发菌株，重组菌株WJ012的构建方法，具体包括如下步骤：

S121：设计引物121，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)的质粒为模板进行进行PCR扩增，得到扩增产物tktA1。扩增产物tktA1包含cat-sacB盒以及两端分别是tktA1起始密码子上游40个碱基和tktA1起始密码子开始的40个碱基；

S122：将扩增产物tktA1导入含有pKD46的大肠杆菌WJ006进行同源重组得到大肠杆菌tktA1(含有 pKD46)，实现在tktA1起始密码子前插入cat-sacB盒；

S123：设计引物123，以人工合成的调控元件P4的DNA为模板进行扩增，得到扩增产物tktA2，扩增产物tktA2包含合成调控元件P4以及两端分别是tktA起始密码子上游40个碱基和tktA起始密码子开始的40 个碱基；

S124：将扩增产物tktA2导入大肠杆菌tktA1进行同源重组得到大肠杆菌tktA2，实现在tktA起始密码子前合成调控元件P4；

S125：去掉大肠杆菌tktA2中的pKD46质粒得到重组大肠杆菌WJ012。

上述重组大肠杆菌WJ012的构建过程中，可任优选地，对每一步获得的重组大肠杆菌(例如，大肠杆菌 tktA1、大肠杆菌tktA2)进行DNA测序验证。

示例性地，引物121的序列为：

tktA1-up：GCCCAAAACGCGCTGTCGTCAAGTCGTTAAGGGCGTGCCCTTCATCATGTGACGGAAGATCACTTC

tktA1-down：CATGCTCAGCGCACGAATAGCATTGGCAAGCTCTTTACGTGAGGACATATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物123的序列为：

tktA-P4-up：GCCCAAAAC-GCGCTGTCGTCAAGTCGTTAAGGGCGTGCCCTTCATCATTTATCTCTGGCGGTGTTG

tktA-P4-down：CATGCTCAGCGCACGAATAGCATTGGCAAGCTCTTTACGTGAG-GACATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

示例性地，在本发明的具体实施例中，并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)即可。

示例性地，cat-sacB盒的序列如SEQ ID NO:7所示，合成调控元件P1的序列如SEQID NO:1所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

本发明还提供上述重组菌株WJ012或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

本发明还提供上述重组菌株WJ012或由其传代而产生的重组菌发酵生产3-脱氢莽草酸的方法。

示例性地，将重组菌株WJ012、重组菌株WJ006、重组菌株WJ004、DSM1576组成的组，以任意的单菌株，或两种菌株以任意比例组合，或两种以上的菌株以任意比例组合进行发酵。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株WJ012发酵生产3-脱氢莽草酸的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株WJ012接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于摇瓶发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，恒温震荡培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-50g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供了另外一种生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ038，其以大肠杆菌DSM1576，或上述重组菌株WJ004，或上述重组菌株WJ006，或上述重组菌株WJ012为出发菌株进行构建。

示例性地，重组菌株WJ038以上述重组菌株WJ012为出发菌株进行构建。

重组菌株WJ038通过调控半乳糖MFS转运蛋白(galP)和/或葡萄糖激酶(glk)和/或磷酸烯醇式丙酮酸 -糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)的表达而提高3-脱氢莽草酸的产量。

示例性地，重组菌株WJ038上调半乳糖MFS转运蛋白(galP)的表达。

示例性地，重组菌株WJ038通过在半乳糖MFS转运蛋白(galP)起始密码子上游插入合成调控元件P1和 /或P3和/或P4上调galP的表达。

优选地，重组菌株WJ038插入合成调控元件P1。

示例性地，重组菌株WJ038上调葡萄糖激酶(glk)的表达。

示例性地，重组菌株WJ038通过在葡萄糖激酶(glk)起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/ 或P4上调glk的表达。

示例性地，重组菌株WJ038插入合成调控元件P4。

示例性地，重组菌株WJ038下调磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)的表达。

示例性地，重组菌株WJ038不表达磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)。

示例性地，重组菌株WJ038通过敲除ptsI基因下调ptsⅠ的表达或不表达ptsⅠ。

示例性地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3 所示，所述调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ038通过上调半乳糖MFS转运蛋白(galP)、上调葡萄糖激酶(glk)和下调磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)共同调控，从而提高3-脱氢莽草酸的产量。

本发明还提供了一种培养基或发酵液，该培养基或发酵液包含上述重组菌株WJ038或由其传代而产生的重组菌株。

示例性地，所述发酵液为上述重组菌株WJ038或由其传代而产生的重组菌株发酵后的发酵液。

本发明还提供上述重组菌株WJ038的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，在半乳糖MFS转运蛋白galP起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或 P4来调控半乳糖MFS转运蛋白galP的表达；

优选地，在半乳糖MFS转运蛋白galP起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在半乳糖MFS转运蛋白galP起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1。

通过同源重组方法，在葡萄糖激酶(glk)起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4来调控葡萄糖激酶基因(glk)的表达；

优选地，在葡萄糖激酶基因(glk)起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在葡萄糖激酶基因(glk)起始密码子ATG上游插入合成调控元件P4。

通过同源重组方法，敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I基因(ptsI)；

示例性地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3 所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，以大肠杆菌WJ012为出发菌株，重组菌株WJ038通过上调半乳糖MFS 转运蛋白(galP)、上调葡萄糖激酶(glk)和下调磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)共同调控，从而提高3-脱氢莽草酸的产量。具体地，重组菌株WJ038的构建方法包括如下步骤：

S381：设计引物381，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)的质粒为模板进行PCR扩增得到扩增产物galP1。扩增产物galP1包含cat-sacB盒以及两端分别是galP起始密码子上游40个碱基和galP起始密码子开始的40个碱基；

S382：将扩增产物galP1导入含有pKD46的大肠杆菌WJ012后进行同源重组形成大肠杆菌galP1(含有 pKD46)，实现在galP起始密码子前插入cat-sacB盒；

S383：设计引物383，以人工合成的调控元件P1的DNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物galP2。扩增产物galP2包含合成调控元件P1以及两端分别是galP起始密码子上游40个碱基和galP起始密码子开始的40个碱基；

S384：将扩增产物galP2导入大肠杆菌galP1后进行同源重组，得到大肠杆菌galP2(含有pKD46)，实现在galP起始密码子前合成调控元件P1；

S385：设计引物385，以cat-sacB盒为模板进行扩增，得到扩增产物glk1，扩增产物glk1包括cat-sacB 盒以及两端分别是glk1起始密码子上游40个碱基和glk1起始密码子开始的40个碱基；

S386：将扩增产物glk1导入含有pKD46的大肠杆菌galP2后进行同源重组形成大肠杆菌glk1(含有 pKD46)，实现在glk起始密码子前插入cat-sacB盒；

S387：设计引物387，以人工合成的调控元件P4的DNA为模板进行扩增，得到扩增产物glk2，扩增产物 glk2包含合成调控元件P4以及两端分别是glk起始密码子上游40个碱基和glk起始密码子开始的40个碱基；

S388：将扩增产物glk2导入含有pKD46的大肠杆菌glk1后进行同源重组形成大肠杆菌glk2(含有pKD46)，实现在glk起始密码子前合成调控元件P4；

S389：设计引物389，以cat-sacB盒为模板进行扩增，得到扩增产物ptsI1，扩增产物ptsI1包括cat-sacB 盒以及两端分别是ptsI1起始密码子上游40个碱基和ptsI1终止密码子下游的40个碱基；

S3810：将扩增产物ptsI1导入大肠杆菌glk2进行同源重组得到大肠杆菌ptsI1(含有pKD46)，实现用 cat-sacB盒替换ptsI基因；

S3811：将人工合成的DNA片段ptsI2导入大肠杆菌ptsI1进行同源重组得到大肠杆菌ptsI2(含有pKD46)；

S3812：去掉大肠杆菌ptsI2中的pKD46质粒得到重组大肠杆菌WJ038。

优选地，上述重组大肠杆菌WJ038的构建过程中，对每一步获得的重组大肠杆菌(例如，大肠杆菌galP1、大肠杆菌galP2、大肠杆菌glk1、大肠杆菌glk2、大肠杆菌ptsI1及大肠杆菌ptsI2等)进行DNA测序验证。

示例性地，引物381的序列为：

galP1-up：GTACTCACCTATCTTAATTCACAATAAAAAATAACCATATGTGACGGAAGATCACTTC

galP1-down：TTGCCTTGTTTGACCGCCCCTGTTTTTTAGCGTCAGGCATATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物383的序列为：

galP-P1-up：GTACTCACCTATCTTAATTCACAATAAAAAATAACCATATTTATCTCTGGCGGTGTTG

galP-P1-down：TTGCCTTGTTTGACCGCCCCTGTTTTTTAGCGTCAGGCATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

示例性地，引物385的序列为：

glk1-up：CCCAGGTATTTACAGTGTGAGAAAGAATTATTTTGACTTTGTGACGGAAGATCACTTC

glk1-down：TGGTGCCGCCCACATCACCGACTAATGCATACTTTGTCATATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物387的序列为：

glk-P4-up：CCCAGGTATTTACAGTGTGAGAAAGAATTATTTTGACTTTTTATCTCTGGCGGTGTTG

glk-P4-down：TGGTGCCGCCCACATCACCGACTAATGCATACTTTGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

示例性地，引物389的序列为：

ptsI1-up：CCGGGTTCTTTTAAAAATCAGTCACAAGTAAGGTAGGGTTGTGACGGAAGATCACTTC

ptsI1-down：GATCTTCTCCTAAGCAGTAAATTGGGCCGCATCTCGTGGAATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，人工合成的DNA片段ptsI2的序列如SEQ ID NO:8所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

本发明还提供上述重组菌株WJ038或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

本发明还提供上述重组菌株WJ038或由其传代而产生的重组菌发酵生产3-脱氢莽草酸的方法。

示例性地，将重组菌株WJ038、重组菌株WJ012、重组菌株WJ006、重组菌株WJ004、DSM1576组成的组，以任意的单菌株，或两种菌株以任意比例组合，或两种以上的菌株以任意比例组合进行发酵。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株WJ012发酵生产3-脱氢莽草酸的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株WJ038接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于摇瓶发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，恒温震荡培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-50g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供了另外一种生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ048，其以大肠杆菌DSM1576，或上述重组菌株WJ004，或上述重组菌株WJ006，或上述重组菌株WJ012，或上述重组菌株WJ038为出发菌株进行构建。

示例性地，重组菌株WJ048以上述重组菌株WJ038为出发菌株进行构建。

重组菌株WJ048通过调控丙酮酸激酶的表达而提高3-脱氢莽草酸的产量。

示例性地，重组菌株WJ048下调丙酮酸激酶的表达或不表达。

示例性地，重组菌株WJ048通过在丙酮酸激酶pykA和/或丙酮酸激酶pykF起始密码子上游插入合成调控元件P1下调丙酮酸激酶的表达或不表达。

优选地，重组菌株WJ048在丙酮酸激酶pykA和/或丙酮酸激酶pykF起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1。

示例性地，所述调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ048将pykA和/或pykF的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG或GTG来调控丙酮酸激酶的表达。其可与合成调控元件P1共同调控丙酮酸激酶的表达或不表达，进而提高3-脱氢莽草酸的产量。

本发明还提供一种培养基或发酵液，该培养基或发酵液包括重组菌株WJ048或由其传代而产生的重组菌株。

示例性地，所述发酵液为上述重组菌株WJ048或由其传代而产生的重组菌株发酵后的发酵液。

本发明还提供重组菌株WJ048的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，插入合成调控元件P1；

优选地，在丙酮酸激酶pykF和/或pykA起始密码子上游插入合成调控元件P1；

优选地，在丙酮酸激酶pykF和/或pykA起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1；

优选地，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ048用稀有起始密码子TTG或GTG替换原始起始密码子ATG 来调控丙酮酸激酶的表达，其与合成调控元件P1共同调控丙酮酸激酶的表达，进而提高3-脱氢莽草酸的产量。

在本发明的一个具体实施方式中，以大肠杆菌WJ038为出发菌株，重组菌株WJ048的构建方法，具体包括如下步骤：

S481：设计引物481，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)的质粒为模板进行进行PCR扩增，得到扩增产物pykA1。扩增产物pykA1包含cat-sacB盒以及两端分别是pykA1起始密码子上游40个碱基和pykA1起始密码子开始的40个碱基；

S482：将扩增产物pykA1导入含有pKD46的大肠杆菌WJ038进行同源重组得到大肠杆菌pykA1(含有 pKD46)，实现在pykA1起始密码子前插入cat-sacB盒；

S483：设计引物483，以人工合成的调控元件P1的DNA为模板进行扩增，得到扩增产物pykA2，扩增产物pykA2包含合成调控元件P1以及两端分别是pykA起始密码子上游40个碱基和tktA起始密码子开始的40 个碱基；

S484：将扩增产物pykA2导入大肠杆菌pykA1进行同源重组得到大肠杆菌pykA2，实现在pykA起始密码子前合成调控元件P1，并且起始密码子的ATG被替换成TTG；

S485：去掉大肠杆菌pykA2中的pKD46质粒得到重组大肠杆菌WJ048。

上述重组大肠杆菌WJ048的构建过程中，可任优选地，对每一步获得的重组大肠杆菌(例如，大肠杆菌 pykA1、大肠杆菌pykA2)进行DNA测序验证。

示例性地，引物481的序列为：

pykA1-up：CATTCGGATTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGGTGACGGAAGATCACTTC

pykA1-down：AACGTGGTAACGATTTTTGTTCTGCGAAGCCTTCTGGACAATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物483的序列为：

pykA-P1-s：CATTCGGATTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGTTATCTCTGGCGGTGTTG

pykA-P1T-a：AACGTGGTAACGATTTTTGTTCTGCGAAGCCTTCTGGACATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

示例性地，在本发明的具体实施例中，并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)即可。

示例性地，cat-sacB盒的序列如SEQ ID NO:7所示，合成调控元件P1的序列如SEQID NO:1所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

本发明还提供上述重组菌株WJ048或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

本发明还提供上述重组菌株WJ048或由其传代而产生的重组菌发酵生产3-脱氢莽草酸的方法。

示例性地，将重组菌株WJ048、重组菌株WJ038、重组菌株WJ012、重组菌株WJ006、重组菌株WJ004、 DSM1576组成的组，以任意的单菌株，或任意的两种菌株以任意比例组合，或任意的两种以上的菌株以任意比例组合进行发酵。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株WJ048发酵生产3-脱氢莽草酸的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株WJ048接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于摇瓶发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，恒温震荡培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-50g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供了另外一种生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ060，其以上述大肠杆菌重组菌株 WJ048，或上述大肠杆菌DSM1576，或上述重组菌株WJ004，或上述重组菌株WJ006，或上述重组菌株WJ012，或上述重组菌株WJ038为出发菌株进行构建。

示例性地，重组菌株WJ060以上述重组菌株WJ048为出发菌株进行构建。

重组菌株WJ060通过调控磷酸葡萄糖异构酶(pgi)的表达而提高3-脱氢莽草酸的产量。

示例性地，重组菌株WJ060下调磷酸葡萄糖异构酶(pgi)的表达或不表达。

示例性地，重组菌株WJ060通过在pgi起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4下调磷酸葡萄糖异构酶(pgi)的表达或不表达；

优选地，重组菌株WJ060通过在pgi起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4。

优选地，重组菌株WJ060插入合成调控元件为P1；

示例性地，所述调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3 所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ060将pgi的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG 或GTG来调控磷酸葡萄糖异构酶(pgi)的表达。其可与合成调控元件P1共同调控磷酸葡萄糖异构酶(pgi) 的表达或不表达，进而提高3-脱氢莽草酸的产量。

示例性地，重组菌株WJ060的保藏号为CGMCC No.14602，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2017年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，邮编100101)。

本发明还提供培养基或发酵液，该培养基或发酵液包括重组菌株WJ060或由其传代而产生的重组菌株。

示例性地，所述发酵液为上述重组菌株WJ060或由其传代而产生的重组菌株发酵后的发酵液。

本发明还提供上述重组菌株WJ060的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4。

优选地，在葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4。

示例性地，在葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi起始密码子ATG上游起始密码子上游插入合成调控元件P1 和/或P3和/或P4。

优选地，在葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi起始密码子ATG上游起始密码子上游插入合成调控元件P1；

示例性地，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3 所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一个具体实施方式中，重组菌株WJ060用稀有起始密码子TTG或GTG替换原始起始密码子ATG 来调控pgi的表达，其与合成调控元件P1共同调控的pgi表达，进而提高3-脱氢莽草酸的产量。

在本发明的一个具体实施方式中，以大肠杆菌WJ048为出发菌株，重组菌株WJ060的构建方法具体包括如下步骤：

S601：设计引601，以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)的质粒为模板进行PCR扩增，得到扩增产物pgi1。扩增产物pgi1包含cat-sacB盒以及两端分别是pgi1起始密码子上游40个碱基和pgi1起始密码子开始的40个碱基；

S602：将扩增产物pgi1导入含有pKD46的大肠杆菌WJ048进行同源重组得到大肠杆菌pgi1，实现在pgi1 起始密码子前插入cat-sacB盒；

S603：设计引物603，以人工合成的调控元件P1的DNA为模板进行扩增，得到扩增产物pgi2，扩增产物 pgi2包含合成调控元件P1以及两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基和pgi起始密码子开始的40个碱基；

S604：将扩增产物pgi2导入大肠杆菌pgi1进行同源重组得到大肠杆菌pgi2，实现在pgi起始密码子前合成调控元件P1，并且起始密码子的ATG被替换成TTG；

S605：去掉大肠杆菌pgi2中的pKD46质粒得到重组大肠杆菌WJ060。

上述重组大肠杆菌WJ060的构建过程中，可任优选地，对每一步获得的重组大肠杆菌(例如，大肠杆菌pgi1、大肠杆菌pgi2)进行DNA测序验证。

示例性地，引物601的序列为：

pgi1-up：ACTGGCGCTACAATCTTCCAAAGTCACAATTCTCAAAATCGTGACGGAAGATCACTTC

pgi1-down：GCCTGCCAGGCAGCGGTCTGCGTTGGATTGATGTTTTTCAATCAAAGGGAAAACTGTCC

示例性地，引物603的序列为：

pgi-P1-s：ACTGGCGC-TAC-AATCTTCCAAAGTCACAATTCTCAAAATCTTATCTCTGGCGGTGTTG

pgi-P1T-a：GCCTGCCAGGCAGCGGTCTGCGTT-GGATTGATGTTTTTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

示例性地，在本发明的具体实施例中，并不限定质粒的种类，其只要含有氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒)即可。

示例性地，cat-sacB盒的序列如SEQ ID NO:7所示，合成调控元件P1的序列如SEQID NO:1所示。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有cat-sacB盒的pEASY-cat-sacB质粒为模板。

示例性地，本发明的实施例中，质粒或扩增产物转化或导入细菌中时可选择目前常规的转化法，例如电转化法，化学转化法等。

本发明还提供上述重组菌株WJ060或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

本发明还提供上述重组菌株WJ060或由其传代而产生的重组菌发酵生产3-脱氢莽草酸的方法。

示例性地，将上述重组菌株WJ060、上述重组菌株WJ048、上述重组菌株WJ038、上述重组菌株WJ012、上述重组菌株WJ006、上述重组菌株WJ004、DSM1576组成的组，以任意的单菌株，或任意的两种菌株以任意比例组合，或任意的两种以上的菌株以任意比例组合进行发酵。

在本发明的一个具体实施例中，重组菌株WJ060发酵生产3-脱氢莽草酸的方法具体包括：

(1)种子培养：配制种子培养基，灭菌冷却。将重组菌株WJ060接种到种子培养基中培养形成种子培养液，用于摇瓶发酵培养基接种；

(2)发酵培养：配制发酵培养基，灭菌冷却。将种子培养液接种于发酵培养基中，恒温震荡培养，得到发酵液。

优选地，在发酵培养时，起始葡萄糖的浓度较高，约为20g/L-50g/L，发酵开始后，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度始终小于1g/L。

本发明还提供包含上述重组菌株WJ060、重组菌株WJ048、重组菌株WJ038、重组菌株WJ012、重组菌株 WJ006、重组菌株WJ004、DSM1576组成的组，或由其传代而产生的菌株的培养物或其加工物，例如发酵液，培养基，冻干粉，以及上述菌株与其他菌株混合培养的发酵液，培养基，冻干粉等。

本发明提供了一系列生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株，如重组菌株WJ004、重组菌株WJ006、重组菌株WJ012、重组菌株WJ038、重组菌株WJ048和重组菌株WJ060。上述重组菌株均可以在葡萄糖无机盐培养基中正常生长，无需添加芳香族氨基酸及其衍生物等生长因子就能够生产3-脱氢莽草酸，降低了培养基成本，从而降低3-脱氢莽草酸的生产成本。且上述重组菌株均不含质粒，遗传性稳定。

附图说明

图1大肠杆菌中3-脱氢莽草酸的生物合成途径(Glucose：葡萄糖；E4P：赤藓糖-4-磷酸；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；PYR：丙酮酸；DAHP：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸；DHS：3-脱氢莽草酸；Shikimate：莽草酸；Tyrosine：酪氨酸；Phenylaline：苯丙氨酸；Tryptophan：色氨酸；PykAF：丙酮酸激酶；TktA：转酮醇酶；GalP：半乳糖MFS转运蛋白；Glk：葡萄糖激酶；PtsI：磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I；Pgi：葡萄糖-6-磷酸异构酶；AroF：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶；AroE：3-脱氢莽草酸脱氢酶)；

图2为本发明实施例中含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的质粒pEASY-cat-sacB结构示意图；

图3为本发明实施例中含3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF的质粒pEASY-aroF(或 pEASY-aroF*，其中aroF基因第443位的碱基C被改为T)结构示意图；

图4为本发明实施例中野生型大肠杆菌DSM1576(WT)和大肠杆菌重组菌株WJ004、WJ006、WJ012、WJ038、 WJ048和WJ060发酵生产3-脱氢莽草酸比较结果图；

图5为本发明实施例中大肠杆菌重组菌株WJ060大规模发酵生产3-脱氢莽草酸过程图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1大肠杆菌重组菌株WJ004的构建

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒 pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物41aroE1-up/aroE1-down扩增第一步同源重组的片段aroE1。引物41的序列为：

aroE1-up(正向引物)：GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATAGTGACGGAAGATCACTTC

aroE1-down(反向引物)：CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCAATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。

扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30 个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroE1产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基和aroE起始密码子开始的40个碱基。

将获得的aroE1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌DSM1576后进行同源重组，实现在aroE起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：其中大肠杆菌DSM1576和质粒pKD46为本所实验室保存(大肠杆菌DSM1576可参阅非专利文献GunsalusIC,Hand D B.The use of bacteria in the chemical determination of totalvitamin C.J Biol Chem 1941,141:853-858；pKD46质粒可参阅非专利文献Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(12):6640-6645)。

通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌DSM1576。

将aroE1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌DSM1576。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌 DSM1576的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroE1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、 100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上， 30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物42为：

2-aroE-1-up：TTCAGAAATCCGCGATGCCCTGA

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroE1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P1(如SEQ ID NO:1所示)的DNA为模板，使用引物43aroE-P1-s/aroE-P1T-a 扩增第二步同源重组的片段aroE2。引物43序列为：

aroE-P1-s(正向引物)：GATGCCCTGACGGGTGAACTGTTTCGACAGGGGTAACATATTATCTCTGGCGGTGTTG

aroE-P1T-a(反向引物)：CTGTGGGCTATCGGATTACCAAAAACAGCATAGGTTTCCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。

扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroE2产物包含合成调控元件P1以及两端分别是aroE起始密码子上游40个碱基和aroE起始密码子开始的40个碱基。

获得的aroE2这个扩增产物导入大肠杆菌aroE1后进行第二步同源重组，实现在aroE起始密码子前合成调控元件P1并且，并且起始密码子的ATG被替换成TTG。

第二步同源重组是将aroE2片段电转至大肠杆菌aroE1。电转条件为：首先准备大肠杆菌aroE1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroE2片段，冰上放置2分钟，转移至0.2em 的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株aroE2。

去掉重组菌株aroE2中的pKD46质粒。pKD46质粒是温敏型的，其通过提高生长温度到37℃，传代培养即可去除。也可采用其他常规的质粒去除方法，例如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、紫外线处理等。本实施例采用提高生长温度去除pKD46质粒。

取300μL重组菌株aroE2菌液(不含pKD46质粒)转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物44为：

w-promoter-s：TTATCTCTGGCGGTGTTG

2-aroE-T-down：CAGTTGCATACCATTCACGAGAG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ004，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例2大肠杆菌重组菌株WJ006的构建

以大肠杆菌DSM1576基因组DNA为模板，使用引物61 aroF-F/aroF-R扩增aroF基因。引物61序列为：

aroF-F(正向引物)：ATGCAAAAAGACGCGCTGAA

aroF-R(反向引物)：TTAAGCCACGCGAGCCGTCAG

扩增体系：5×TransStart^TM Taq Buffer 5μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)2μL、DNA模板1μL (20-50ng)、正向引物(10μmol/L)1μL、反向引物(10μmol/L)1μL、100％DMSO 1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的aroF基因片段克隆到pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上，得到重组质粒pEASY-aroF(如图3所示)。

以pEASY-aroF为模板，使用引物62aroF-Fm/aroF-Rm反向扩增，引物62序列为：

aroF-Fm(正向引物)：GGCGACGGAAGCGTTAGATCTGAATAGCCCGCAATACCTGGG

aroF-Rm(反向引物)：AGTGGCAGTCCCATATTCACCAGCTCAAGC

扩增体系：5×TransStart^TM Taq Buffer 5μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)2μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)1μL、反向引物(10μmol/L)1μL、100％DMSO 1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase (2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性 20秒、55℃退火30秒、72℃延伸6分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。反向扩增获得DNA 片段自连后形成重组质粒pEASY-aroF*。该质粒上aroF基因利用overlap extension PCR得到含有点突变序列的aroF*，即原始的aroF基因第443位的碱基C被改为T。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒 pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物63aroF1-up/aroF1-down扩增第一步同源重组的片段aroF1。引物63序列为：

aroF1-up(正向引物)：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCGTGACGGAAGATCACTTC

aroF1-down(反向引物)：ATCGCGTAATGCGGTCAATTCAGCAACCATAATAAACCTCATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroF1产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是aroF起始密码子上游40个碱基和aroF终止密码子下游40个碱基。

获得的aroF1这个扩增产物导入含有pKD46的大肠杆菌WJ004后进行同源重组，实现在aroF基因片段被 cat-sacB盒替换。具体过程如下：

首选通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌WJ004，然后将aroF1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌WJ004。

电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌WJ004的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroF1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用Mi croPulser(Bio-Rad 公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合 5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落 PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物64为：

aroF-1-up(正向引物)：TATCGTTACGTCATCCTCGCTG

aroF-T-down(反向引物)：CATAAATAGGCAGTCCAAAGCGGC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroF1(含pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以上述构建的pEASY-aroF*质粒DNA为模板，使用引物65aroF2-up/aroF2-down扩增第二步同源重组的片段aroF2。引物65序列为：

aroF2-up(正向引物)：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCGATGCAAAAAGACGCGCTGAATAAC

aroF2-down(反向引物)：ATCGCGTAATGCGGTCAATTCAGCAACCATAATAAACCTCTTAAGCCACGCGAGCCGTCAGC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸1.5分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1 个循环)。扩增后的aroF2产物包含合aroF*(如SEQ ID NO:5所示)以及两端分别是aroF起始密码子上游 40个碱基和aroF终止密码子下游40个碱基。

将获得的aroF2这个扩增产物导入大肠杆菌aroF1后进行第二步同源重组，实现在aroF*替换原始的 aroF。

第二步同源重组是将aroF2片段电转至大肠杆菌aroF1。电转条件为：首先准备大肠杆菌aroF1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroF2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em 的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取300μL孵育后的菌液转接到30mL含氨苄青霉素的10％蔗糖、不含氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄青霉素的10％蔗糖、不含氯化钠LB平板。待长出菌落后再在氯霉素、氨苄平板上对应点板划线培养，挑取10-20个左右只在氨苄平板生长而氯霉素平板不长的单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物66为：

aroF-1-up(正向引物)：TATCGTTACGTCATCCTCGCTG

aroF-T-down(反向引物)：CATAAATAGGCAGTCCAAAGCGGC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroF2(含pKD46)，作为下一步在aroF*起始密码子前插入合成调控元件P2的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物67aroF1-up/aroF3-down扩增第一步同源重组的片段aroF3。引物67序列为：

aroF1-up(正向引物)：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCGTGACGGAAGATCACTTC

aroF3-down(反向引物)：CGTCGGTAATATGTACGTTATTCAGCGCGTCTTTTTGCATATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroF3产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是aroF起始密码子上游40个碱基和aroF起始密码子开始的40个碱基。获得的aroF3这个扩增产物导入大肠杆菌aroF2后进行同源重组，实现在aroF*起始密码子前插入cat-sacB盒。

将aroF3片段电转至大肠杆菌aroF2。电转条件为：首先准备大肠杆菌aroF2的电转化感受态细胞；将 50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroF3片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物68为：

aroF-1-up(正向引物)：TATCGTTACGTCATCCTCGCTG

aroF-T-down(反向引物)：CATAAATAGGCAGTCCAAAGCGGC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌aroF3(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P2(如SEQ ID NO:2所示)DNA为模板，使用引物69aroE-P1-s/aroE-P1T-a扩增第二步同源重组的片段aroF4。引物69序列为：

aroF-P2-up(正向引物)：GGATCAACTATCGCAAACGAGCATAAACAGGATCGCCATCTTATCTCTGGCGGTGTTGAC

aroF-P2-down(反向引物)：CGTCGGTAATATGTACGTTATTCAGCGCGTCTTTTTGCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的aroF4产物包含合成调控元件P2以及两端分别是aroF起始密码子上游40个碱基和aroF起始密码子开始的40个碱基。

将获得的aroF4这个扩增产物导入大肠杆菌aroF3后进行第二步同源重组，实现在aroF起始密码子前合成调控元件P2。

第二步同源重组是将aroF4片段电转至大肠杆菌aroF3。电转条件为：首先准备大肠杆菌aroF3的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroF3片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em 的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌重组菌株aroF4。

去掉重组菌株aroF4中的pKD46质粒。

取300μL重组菌株aroF4菌液(不含pKD46质粒)转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物610为：

w-promoter-s(正向引物)：TTATCTCTGGCGGTGTTG

aroF-T-down(反向引物)：CATAAATAGGCAGTCCAAAGCGGC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ006，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例3大肠杆菌重组菌株WJ012的构建

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物121tktA1-up/tktA1-down扩增第一步同源重组的片段tktA1。引物121序列为：

tktA1-up(正向引物)：GCCCAAAACGCGCTGTCGTCAAGTCGTTAAGGGCGTGCCCTTCATCATGTGACGGAAGATCACTTC

tktA1-down(反向引物)：CATGCTCAGCGCACGAATAGCATTGGCAAGCTCTTTACGTGAGGACATATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的tktA1产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是tktA起始密码子上游40个碱基和 tktA起始密码子开始的40个碱基。

将获得的tktA1这个扩增产物导入含有pKD46的大肠杆菌WJ006后进行同源重组，实现在tktA起始密码子前插入cat-sacB盒。

首先通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌WJ006，然后将tktA1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌WJ006。

电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌WJ006的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng tktA1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad 公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合 5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落 PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物122为：

tktA-1-up(正向引物)：ACATGCGAGCATGATCCAG

tktA-T-down(反向引物)：CGCAAACGGACATATCAAG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌tktA1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P4(如SEQ ID NO:4所示)DNA为模板，使用引物123tktA-P4-up/tktA-P4-down 扩增第二步同源重组的片段tktA2。引物123序列为：

tktA-P4-up(正向引物)：GCCCAAAAC-GCGCTGTCGTCAAGTCGTTAAGGGCGTGCCCTTCATCATTTATCTCTGGCGGTGTTG

tktA-P4-down(反向引物)：CATGCTCAGCGCACGAATAGCATTGGCAAGCTCTTTACGTGAG-GACATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

扩增体系：5×TransStart^TM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的tktA2产物包含合成调控元件P4以及两端分别是tktA起始密码子上游40个碱基和tktA起始密码子开始的40个碱基。

将获得的tktA2这个扩增产物导入大肠杆菌tktA1后进行第二步同源重组，实现在tktA起始密码子前合成调控元件P4。

第二步同源重组是将tktA2片段电转至大肠杆菌tktA1。电转条件为：首先准备大肠杆菌tktA1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng tktA2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em 的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌重组菌株tktA2。

去掉重组菌株tktA2中的pKD46质粒。

取300μL重组菌株tktA2菌液转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm 过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物124为：

w-promoter-s(正向引物)：TTATCTCTGGCGGTGTTG

tktA-T-down(反向引物)：CGCAAACGGACATATCAAG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ012，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例4大肠杆菌重组菌株WJ038的构建

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒 pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物381galP1-up/galP1-down扩增第一步同源重组的片段tktA1。引物381序列为：

galP1-up(正向引物)：GTACTCACCTATCTTAATTCACAATAAAAAATAACCATATGTGACGGAAGATCACTTC

galP1-down(反向引物)：TTGCCTTGTTTGACCGCCCCTGTTTTTTAGCGTCAGGCATATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的galP1产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是galP起始密码子上游40个碱基和 galP起始密码子开始的40个碱基。

将获得的galP1这个扩增产物导入含有pKD46的大肠杆菌WJ012后进行同源重组，实现在galP起始密码子前插入cat-sacB盒。首选通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌WJ012，然后将galP1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌WJ012。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌WJ012的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng galP1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30C、100rpm转速的摇床中孵育2 小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物382为：

galp-1-up(正向引物)：CGTCGTACTCACCTATCT

galp-T-down(反向引物)：CCCCACATTTGCTCGGTA

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌galP1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P1(如SEQ ID NO:1所示)DNA为模板，使用引物383galP-P1-up/galP-P1-down 扩增第二步同源重组的片段galP2。引物383序列为：

galP-P1-up(正向引物)：GTACTCACCTATCTTAATTCACAATAAAAAATAACCATATTTATCTCTGGCGGTGTTG

galP-P1-down(反向引物)：TTGCCTTGTTTGACCGCCCCTGTTTTTTAGCGTCAGGCATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的galP2产物包含合成调控元件P1以及两端分别是galP起始密码子上游40个碱基和galP起始密码子开始的40个碱基。

将获得的galP2这个扩增产物导入大肠杆菌galP1后进行第二步同源重组，实现在galP起始密码子前合成调控元件P1。

第二步同源重组是将galP2片段电转至大肠杆菌galP1。电转条件为：首先准备大肠杆菌galP1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng galP2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em 的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时。取300μL孵育后的菌液转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃， 250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物384为：

w-promoter-s(正向引物)：TTATCTCTGGCGGTGTTG

galp-T-down(反向引物)：CCCCACATTTGCTCGGTA

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌galP2(含有pKD46)，作为下一步glk改造的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒 pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物385glk1-up/glk1-down扩增第一步同源重组的片段tktA1。引物385序列为：

glk1-up(正向引物)：CCCAGGTATTTACAGTGTGAGAAAGAATTATTTTGACTTTGTGACGGAAGATCACTTC

glk1-down(反向引物)：TGGTGCCGCCCACATCACCGACTAATGCATACTTTGTCATATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的glk1产物包含cat-sacB盒(如图2所示)以及两端分别是glk起始密码子上游40个碱基和 glk起始密码子开始的40个碱基。

获得的glk1这个扩增产物导入大肠杆菌galP2后进行同源重组，实现在glk起始密码子前插入cat-sacB 盒。将glk1片段电转至大肠杆菌galP2。电转条件为：首先准备大肠杆菌galP2的电转化感受态细胞；将50 μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng glk1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物386为：

glk-1-up(正向引物)：ATTTACAGGGAGCCTGCC

glk-T-down(反向引物)：AGATTGAGCGCCAGATTG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌glk1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P4(如SEQ ID NO:4所示)DNA为模板，使用引物387glk-P4-up/glk-P4-down 扩增第二步同源重组的片段glk2。引物387序列为：

glk-P4-up(正向引物)：CCCAGGTATTTACAGTGTGAGAAAGAATTATTTTGACTTTTTATCTCTGGCGGTGTTG

glk-P4-down(反向引物)：TGGTGCCGCCCACATCACCGACTAATGCATACTTTGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAA

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的glk2产物包含合成调控元件P4以及两端分别是glk起始密码子上游40个碱基和glk起始密码子开始的40个碱基。

将获得的glk2这个扩增产物导入大肠杆菌glk1后进行第二步同源重组，实现在glk起始密码子前合成调控元件P4。

第二步同源重组是将glk2片段电转至大肠杆菌glk1。电转条件为：首先准备大肠杆菌glk1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng glk2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad 电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时。取300μL孵育后的菌液转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm 过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物388为：

w-promoter-s(正向引物)：TTATCTCTGGCGGTGTTG

glk-T-down(反向引物)：AGATTGAGCGCCAGATTG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌glk2(含有pKD46)，作为下一步无痕敲除ptsI的出发菌。

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒 pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物389ptsI1-up/ptsI1-down扩增第一步同源重组的片段ptsI1。引物389序列为：

ptsI1-up(正向引物)：CCGGGTTCTTTTAAAAATCAGTCACAAGTAAGGTAGGGTTGTGACGGAAGATCACTTC

ptsI1-down(反向引物)：GATCTTCTCCTAAGCAGTAAATTGGGCCGCATCTCGTGGAATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的ptsI1产物包含cat-sacB盒(图2)以及两端分别是ptsI起始密码子上游40个碱基和ptsI 终止密码子下游的40个碱基。

获得的ptsI1这个扩增产物导入大肠杆菌glk2后进行同源重组，实现用cat-sacB盒替换ptsI基因。将 ptsI1片段电转至大肠杆菌glk2。电转条件为：首先准备大肠杆菌glk2的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ptsI1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取 200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物3810为：

ptsI-1-up(正向引物)：AGCGGTTGAACATCTGGT

ptsI-T-down(反向引物)：CTTGTCGTCGGAAACCAG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌ptsI1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

用人工合成的DNA片段ptsI2(如SEQ ID NO:8所示)作为第二步同源重组的片段。第二步同源重组是将ptsI2片段电转至大肠杆菌ptsI1。电转条件为：首先准备大肠杆菌ptsI1的电转化感受态细胞；将50μL 感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ptsI2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用 MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌ptsI2。

去掉大肠杆菌ptsI2中的pKD46质粒。

取300μL大肠杆菌ptsI2(不含pKD46质粒)菌液转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物3811为：

ptsI-F(正向引物)：TGGCATTGATTCAGCCTG

ptsI-R(反向引物)：TCACTGCGGCAAGAATTA

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ038，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例5大肠杆菌重组菌株WJ048的构建

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒 pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物481pykA1-up/pykA1-down扩增第一步同源重组的片段pykA1。引物481序列为：

pykA1-up(正向引物)：CATTCGGATTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGGTGACGGAAGATCACTTC

pykA1-down(反向引物)：AACGTGGTAACGATTTTTGTTCTGCGAAGCCTTCTGGACAATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的pykA1产物包含cat-sacB盒(图2)以及两端分别是pykA起始密码子上游40个碱基和pykA 起始密码子开始的40个碱基。

将获得的pykA1这个扩增产物导入含有pKD46的大肠杆菌WJ038后进行同源重组，实现在pykA起始密码子前插入cat-sacB盒。首选通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌WJ038，然后将aroE1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌WJ038。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌WJ038的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pykA1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育 2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取5-10个单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物482为：

pykA-1-up(正向引物)：ACCAGGTGTTGCTTGAACATG

pykA-T-down(反向引物)：ATGTGGCGTTTTCGCCGCATC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌pykA1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P1(如SEQ ID NO:1所示)DNA为模板，使用引物483pykA-P1-s/pykA-P1T-a扩增第二步同源重组的片段pykA2。引物483序列为：

pykA-P1-s(正向引物)：CATTCGGATTTCATGTTCAAGCAACACCTGGTTGTTTCAGTTATCTCTGGCGGTGTTG

pykA-P1T-a(反向引物)：AACGTGGTAACGATTTTTGTTCTGCGAAGCCTTCTGGACATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的pykA2产物包含合成调控元件P1以及两端分别是pykA起始密码子上游40个碱基和pykA起始密码子开始的40个碱基。

将获得的pykA2这个扩增产物导入大肠杆菌pykA1后进行第二步同源重组，实现在pykA起始密码子前合成调控元件P1并且，并且起始密码子的ATG被替换成TTG。

第二步同源重组是将pykA2片段电转至大肠杆菌pykA1。电转条件为：首先准备大肠杆菌pykA1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pykA2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em 的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37C、200rpm转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌pykA2。

将大肠杆菌pykA2去掉pKD46质粒。

取300μL大肠杆菌pykA2(不含pKD46质粒)菌液转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物484为：

w-promoter-s(正向引物)：TTATCTCTGGCGGTGTTG

pykA-T-down(反向引物)：ATGTGGCGTTTTCGCCGCATC

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ048，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种构建的出发菌。

实施例6大肠杆菌重组菌株WJ060的构建

以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，如SEQ IDNO:7所示)的质粒 pEASY-cat-sacB(如图2所示)为模板，使用引物601pgi1-up/pgi1-down扩增第一步同源重组的片段pgi1。引物601序列为：

pgi1-up(正向引物)：ACTGGCGCTACAATCTTCCAAAGTCACAATTCTCAAAATCGTGACGGAAGATCACTTC

pgi1-down(反向引物)：GCCTGCCAGGCAGCGGTCTGCGTTGGATTGATGTTTTTCAATCAAAGGGAAAACTGTCC

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的pgi1产物包含cat-sacB盒(参见图2所示)以及两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基和 pgi起始密码子开始的40个碱基。

将获得的pgi1这个扩增产物导入含有pKD46的大肠杆菌WJ048后进行同源重组，实现在pgi起始密码子前插入cat-sacB盒。首选通过氯化钙转化法将pKD46质粒转化至大肠杆菌WJ048，然后将pgi1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌WJ048。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌WJ048的电转化感受态细胞；将50L感受态细胞置于冰上，加入50-100ngpgi1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mLLB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物602为：

pgi-1-up(正向引物)：CGCTACAATCTTCCAAAGTCAC

pgi-T-down(反向引物)：CGGCATCAGGCATGAACGATG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌pgi1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。

以人工合成的调控元件P1(人SEQ ID NO:1所示)DNA为模板，使用引物603pgi-P1-s/pgi-P1T-a扩增第二步同源重组的片段pgi2。引物603序列为：

pgi-P1-s(正向引物)：ACTGGCGC-TAC-AATCTTCCAAAGTCACAATTCTCAAAATCTTATCTCTGGCGGTGTTG

pgi-P1T-a(反向引物)：GCCTGCCAGGCAGCGGTCTGCGTT-GGATTGATGTTTTTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC

扩增体系：5×TransStart^TMFastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1 μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStart^TM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。

扩增后的pgi2产物包含合成调控元件P1以及两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基和pgi起始密码子开始的40个碱基。

将获得的pgi2这个扩增产物导入大肠杆菌pgi1后进行第二步同源重组，实现在pgi起始密码子前合成调控元件P1并且，并且起始密码子的ATG被替换成TTG。

第二步同源重组是将pgi2片段电转至大肠杆菌pgi1。电转条件为：首先准备大肠杆菌pgi1的电转化感受态细胞；将50L感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pgi2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad 电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在37℃、200rpm转速的摇床中孵育2小时得到大肠杆菌pgi2。

将大肠杆菌pgi2去掉pKD46质粒。

取300μL大肠杆菌pgi2(不含pKD46质粒)菌液转接到30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中37℃，250rpm过夜培养，后划线于含10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，37℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物604为：

w-promoter-s(正向引物)：TTATCTCTGGCGGTGTTG

pgi-T-down(反向引物)：CGGCATCAGGCATGAACGATG

挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ060，用于3-脱氢莽草酸生产测试。

该大肠杆菌重组菌株WJ060已于2017年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.14602，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。

实施例7大肠杆菌DSM1576(WT)、重组菌株WJ004、WJ006、WJ012、WJ038、WJ048和WJ060发酵生产 3-脱氢莽草酸

本发明中所提及种子培养基或发酵培养基中的各成分及各成分的含量、发酵温度、发酵体系的pH值、发酵时间、接种量均可依据需要进行相应的调整。例如：

起始葡萄糖含量为20g/L-100g/L，具体地可为20g/L或30g/L或40g/L或50g/L或60g/L或70g/L或80g/L或90g/L或 100g/L等(发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L-600g/L的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/L)；

酵母提取物的含量为0-2g/L，具体可为0g/L或0.5g/L或1g/L或2g/L等；

柠檬酸的含量为1g/L-5g/L，具体可为1g/L或2g/L或3g/L或5g/L等；KH₂PO₄的含量为2.5g/L-10g/L，具体可为 2.5g/L或5g/L或7.5g/L或10g/L等；

(NH₄)₂SO₄的含量为0.8g/L-2.4g/L，具体可为0.8g/L或1.2g/L或1.6g/L或2.0g/L或2.4g/L等；

MgSO₄·7H₂O的含量为1g/L-4g/L，具体可为1g/L或2g/L或3g/L或4g/L等；

FeSO₄·7H₂O的含量为50mg/L-100mg/L，具体可为50mg/L或75mg/L或100mg/L等；

MnSO₄·H₂O的含量为2.5mg/L-7.5mg/L，具体可为2.5mg/L或5mg/L或7.5mg/L等；

Na₂SO₄的含量为10mg/L-50mg/L，具体可为10mg/L或20mg/L或30mg/L或40mg/L或50mg/L等；

ZnSO₄的含量为2mg/L-10mg/L，具体可为2mg/L或4mg/L或6mg/L或8mg/L或10mg/L等；

CoCl₂·6H₂O的含量为1mg/L-6mg/L，具体可为1mg/L或2mg/L或4mg/L或6mg/L等；

CuSO₄·5H₂O的含量为0.2mg/L-1mg/L，具体可为0.2mg/L或0.4mg/L或0.6mg/L或0.8mg/L或1mg/L等；

发酵的温度为25℃-42℃，具体可为25℃或30℃或37℃或40℃或42℃等；

发酵的体系的pH值为6.0-8.0，具体可为6.0或7.0或8.0等；

发酵的时间为24小时-96小时，具体可为24小时或36小时或48小时或60小时或72小时或84小时或96小时等；

接种量的体积百分比为0.05％-15％，具体可为或0.05％或2％或5％或10％或15％等。

下面示例性地介绍发酵过程。

种子培养基为含0.5％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

摇瓶发酵培养基为NBS培养基，由以下成分组成：

葡萄糖20g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 6.5g/L，(NH₄)₂HPO₄ 3.5g/L，MgSO₄0.120g/L，CaCl₂ 11mg/L，Thiamine HCl(盐酸硫胺素)5mg/L，FeCl₃·6H₂O 0.16mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.2mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.015mg/L，Na₂MoO4·2H₂O 0.02mg/L， ZnCl₂ 0.02mg/L，H₃BO₃ 0.005mg/L。

野生型大肠杆菌DSM1576(WT)和大肠杆菌重组菌株WJ004、WJ006、WJ012、WJ038、WJ048和WJ060发酵生产3- 脱氢莽草酸，包括如下步骤：

(1)种子培养：15mL试管中种子培养基为3mL，121℃灭菌15分钟。冷却后分别将野生型大肠杆菌DSM1576(WT) 和大肠杆菌重组菌株WJ004、WJ006、WJ012、WJ038、WJ048和WJ060单菌落接种到3mL种子培养基，在30℃，250rpm 摇床过夜培养16小时，用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养：取200μL上述种子菌液，接种于发酵培养基中，37℃，250rpm摇床培养24小时，得到发酵液。

分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行分析测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Bio-Rad)公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱(300mm×7.8mm，9μm)；流动相为 5mM硫酸，流速0.6mL/min，柱温63℃，检测波长210nm。3-脱氢莽草酸标准品购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为05616-100MG。

结果：野生型大肠杆菌DSM1576(WT)和大肠杆菌重组菌株WJ004、WJ006、WJ012、WJ038、WJ048和WJ060发酵 24小时后，发酵液中的3-脱氢莽草酸浓度如图4所示。根据图4结果表明，随着菌种的改造进行，大肠杆菌基本上从不产3-脱氢莽草酸(野生型大肠杆菌DSM1576，WT)逐步提高了生产能力。最后大肠杆菌重组菌株WJ060在无补料的条件下可以生产3.35g/L的3-脱氢莽草酸，糖酸摩尔转化率达到34.7％。

实施例8重组菌株WJ060扩大发酵生产3-脱氢莽草酸

一级种子培养基为含0.5％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：

葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

二级种子培养基为含2％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：

葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

初始发酵罐培养基由以下成分组成：

大量元素：起始葡萄糖20g/L、柠檬酸2g/L、KH₂PO₄ 7.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 1.6g/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L；和

微量元素：FeSO₄·7H₂O 75mg/L、MnSO₄·H₂O 4.5mg/L、Na₂SO₄ 20mg/L、ZnSO₄ 6mg/L、CoCl₂·6H₂O 4mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.6mg/L。

大肠杆菌重组菌株WJ060扩大发酵生产3-脱氢莽草酸，包括如下步骤：

(1)一级种子培养：15mL试管中一级种子培养基为3mL，121℃灭菌15分钟。冷却后将基因工程大肠杆菌WJ060 单菌落接种到3mL种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于二级种子培养基接种。

(2)二级种子培养：1L摇瓶中二级种子培养基为200mL，121℃灭菌15分钟。冷却后将2mL一级种子培养液接种到200mL二级种子培养基，在37℃，250rpm摇床培养24小时，用于发酵罐培养基接种。

(3)发酵罐补料发酵生产：取200mL上述二级种子菌液，接种于装有2L初始发酵罐培养基的5L Biotech-5BG发酵罐中(上海保兴生物设备工程有限公司)，在37℃，pH6.5(通过浓氨水调控pH)，溶氧20％的条件下发酵。发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/L。定时取样分析发酵生产情况。

分析方法：与实施例7中的分析方法相同。

结果：大肠杆菌重组菌株WJ060扩大发酵结果如图5所示。根据图5结果表明，补料发酵条件下发酵52h 后，发酵液中积累的3-脱氢莽草酸达到最高浓度，为94.4g/L，糖酸摩尔转化率为32.65％，发酵液基本没有乙酸等副产物的积累，发酵液中残留的葡萄糖浓度为0.75g/L。

本实施例提供的保藏号为CGMCC NO.14602的大肠杆菌重组菌株WJ060是一种新型的可用于生产3-脱氢莽草酸的微生物菌株。该菌株不含有质粒，遗传稳定性高；发酵过程简单，发酵时间短，生产的3-脱氢莽草酸的产率高，可达94.4g/L，糖酸摩尔转化率为32.65％，发酵过程中葡萄糖含量只需控制在1g/L以下，大大降低了3-脱氢莽草酸的生产成本，且发酵液中基本没有乙酸等副产物的积累，其在大规模工业生产中具有很大的发展潜力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 生产3-脱氢莽草酸大肠杆菌重组菌株及其构建方法与应用

<160> 82

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cttttggtgc 60

gtcagtcagt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 2

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc tgaggtggct 60

tattattcgt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 3

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc actggctcgt 60

aatttattgt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 4

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cgtattgtta 60

gcatgtacgt ttaaaccagg aaacagct 88

<210> 5

<211> 1071

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

atgcaaaaag acgcgctgaa taacgtacat attaccgacg aacaggtttt aatgactccg 60

gaacaactga aggccgcttt tccattgagc ctgcaacaag aagcccagat tgctgactcg 120

cgtaaaagca tttcagatat tatcgccggg cgcgatcctc gtctgctggt agtatgtggt 180

ccttgttcca ttcatgatcc ggaaactgct ctggaatatg ctcgtcgatt taaagccctt 240

gccgcagagg tcagcgatag cctctatctg gtaatgcgcg tctattttga aaaaccccgt 300

accactgtcg gctggaaagg gttaattaac gatccccata tggatggctc ttttgatgta 360

gaagccgggc tgcagatcgc gcgtaaattg ctgcttgagc tggtgaatat gggactgcca 420

ctggcgacgg aagcgttaga tctgaatagc ccgcaatacc tgggcgatct gtttagctgg 480

tcagcaattg gtgctcgtac aacggaatcg caaactcacc gtgaaatggc ctccgggctt 540

tccatgccgg ttggttttaa aaacggcacc gacggcagtc tggcaacagc aattaacgct 600

atgcgcgccg ccgcccagcc gcaccgtttt gttggcatta accaggcagg gcaggttgcg 660

ttgctacaaa ctcaggggaa tccggacggc catgtgatcc tgcgcggtgg taaagcgccg 720

aactatagcc ctgcggatgt tgcgcaatgt gaaaaagaga tggaacaggc gggactgcgc 780

ccgtctctga tggtagattg cagccacggt aattccaata aagattatcg ccgtcagcct 840

gcggtggcag aatccgtggt tgctcaaatc aaagatggca atcgctcaat tattggtctg 900

atgatcgaaa gtaatatcca cgagggcaat cagtcttccg agcaaccgcg cagtgaaatg 960

aaatacggtg tatccgtaac cgatgcctgc attagctggg aaatgaccga tgccttgctg 1020

cgtgaaattc atcaggatct gaacgggcag ctgacggctc gcgtggctta a 1071

<210> 6

<211> 1071

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

atgcaaaaag acgcgctgaa taacgtacat attaccgacg aacaggtttt aatgactccg 60

gaacaactga aggccgcttt tccattgagc ctgcaacaag aagcccagat tgctgactcg 120

cgtaaaagca tttcagatat tatcgccggg cgcgatcctc gtctgctggt agtatgtggt 180

ccttgttcca ttcatgatcc ggaaactgct ctggaatatg ctcgtcgatt taaagccctt 240

gccgcagagg tcagcgatag cctctatctg gtaatgcgcg tctattttga aaaaccccgt 300

accactgtcg gctggaaagg gttaattaac gatccccata tggatggctc ttttgatgta 360

gaagccgggc tgcagatcgc gcgtaaattg ctgcttgagc tggtgaatat gggactgcca 420

ctggcgacgg aagcgttaga tccgaatagc ccgcaatacc tgggcgatct gtttagctgg 480

tcagcaattg gtgctcgtac aacggaatcg caaactcacc gtgaaatggc ctccgggctt 540

tccatgccgg ttggttttaa aaacggcacc gacggcagtc tggcaacagc aattaacgct 600

atgcgcgccg ccgcccagcc gcaccgtttt gttggcatta accaggcagg gcaggttgcg 660

ttgctacaaa ctcaggggaa tccggacggc catgtgatcc tgcgcggtgg taaagcgccg 720

aactatagcc ctgcggatgt tgcgcaatgt gaaaaagaga tggaacaggc gggactgcgc 780

ccgtctctga tggtagattg cagccacggt aattccaata aagattatcg ccgtcagcct 840

gcggtggcag aatccgtggt tgctcaaatc aaagatggca atcgctcaat tattggtctg 900

atgatcgaaa gtaatatcca cgagggcaat cagtcttccg agcaaccgcg cagtgaaatg 960

aaatacggtg tatccgtaac cgatgcctgc attagctggg aaatgaccga tgccttgctg 1020

cgtgaaattc atcaggatct gaacgggcag ctgacggctc gcgtggctta a 1071

<210> 7

<211> 2932

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgacggaag atcacttcgc agaataaata aatcctggtg tccctgttga taccgggaag 60

ccctgggcca acttttggcg aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt 120

caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga 180

gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa 240

tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag 300

accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt 360

tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga attccgtatg 420

gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc 480

catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag 540

tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct 600

aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt 660

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tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt 780

tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg 840

cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt tattggtgcc cttaaacgcc tggtgctacg 900

cctgaataag tgataataag cggatgaatg gcagaaattc gaaagcaaat tcgacccggt 960

cgtcggttca gggcagggtc gttaaatagc cgctagatct aagtaaatcg cgcgggtttg 1020

ttactgataa agcaggcaag acctaaaatg tgtaaagggc aaagtgtata ctttggcgtc 1080

accccttaca tattttaggt ctttttttat tgtgcgtaac taacttgcca tcttcaaaca 1140

ggagggctgg aagaagcaga ccgctaacac agtacataaa aaaggagaca tgaacgatga 1200

acatcaaaaa gtttgcaaaa caagcaacag tattaacctt tactaccgca ctgctggcag 1260

gaggcgcaac tcaagcgttt gcgaaagaaa cgaaccaaaa gccatataag gaaacatacg 1320

gcatttccca tattacacgc catgatatgc tgcaaatccc tgaacagcaa aaaaatgaaa 1380

aatatcaagt tcctgaattc gattcgtcca caattaaaaa tatctcttct gcaaaaggcc 1440

tggacgtttg ggacagctgg ccattacaaa acgctgacgg cactgtcgca aactatcacg 1500

gctaccacat cgtctttgca ttagccggag atcctaaaaa tgcggatgac acatcgattt 1560

acatgttcta tcaaaaagtc ggcgaaactt ctattgacag ctggaaaaac gctggccgcg 1620

tctttaaaga cagcgacaaa ttcgatgcaa atgattctat cctaaaagac caaacacaag 1680

aatggtcagg ttcagccaca tttacatctg acggaaaaat ccgtttattc tacactgatt 1740

tctccggtaa acattacggc aaacaaacac tgacaactgc acaagttaac gtatcagcat 1800

cagacagctc tttgaacatc aacggtgtag aggattataa atcaatcttt gacggtgacg 1860

gaaaaacgta tcaaaatgta cagcagttca tcgatgaagg caactacagc tcaggcgaca 1920

accatacgct gagagatcct cactacgtag aagataaagg ccacaaatac ttagtatttg 1980

aagcaaacac tggaactgaa gatggctacc aaggcgaaga atctttattt aacaaagcat 2040

actatggcaa aagcacatca ttcttccgtc aagaaagtca aaaacttctg caaagcgata 2100

aaaaacgcac ggctgagtta gcaaacggcg ctctcggtat gattgagcta aacgatgatt 2160

acacactgaa aaaagtgatg aaaccgctga ttgcatctaa cacagtaaca gatgaaattg 2220

aacgcgcgaa cgtctttaaa atgaacggca aatggtacct gttcactgac tcccgcggat 2280

caaaaatgac gattgacggc attacgtcta acgatattta catgcttggt tatgtttcta 2340

attctttaac tggcccatac aagccgctga acaaaactgg ccttgtgtta aaaatggatc 2400

ttgatcctaa cgatgtaacc tttacttact cacacttcgc tgtacctcaa gcgaaaggaa 2460

acaatgtcgt gattacaagc tatatgacaa acagaggatt ctacgcagac aaacaatcaa 2520

cgtttgcgcc aagcttcctg ctgaacatca aaggcaagaa aacatctgtt gtcaaagaca 2580

gcatccttga acaaggacaa ttaacagtta acaaataaaa acgcaaaaga aaatgccgat 2640

attgactacc ggaagcagtg tgaccgtgtg cttctcaaat gcctgattca ggctgtctat 2700

gtgtgactgt tgagctgtaa caagttgtct caggtgttca atttcatgtt ctagttgctt 2760

tgttttactg gtttcacctg ttctattagg tgttacatgc tgttcatctg ttacattgtc 2820

gatctgttca tggtgaacag ctttaaatgc accaaaaact cgtaaaagct ctgatgtatc 2880

tatctttttt acaccgtttt catctgtgca tatggacagt tttccctttg at 2932

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acaaacccat gatcttctcc taagcagtaa attgggccgc atctcgtgga aaccctacct 60

tacttgtgac tgatttttaa aagaacccgg gaaattactc 100

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgccctga cgggtgaact gtttcgacag gggtaacata gtgacggaag atcacttc 58

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgtgggcta tcggattacc aaaaacagca taggtttcca atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcagaaatc cgcgatgccc tga 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagttgcata ccattcacga gag 23

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatgccctga cgggtgaact gtttcgacag gggtaacata ttatctctgg cggtgttg 58

<210> 14

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgtgggcta tcggattacc aaaaacagca taggtttcca tagctgtttc ctggtttaaa 60

c 61

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cagttgcata ccattcacga gag 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgcaaaaag acgcgctgaa 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttaagccacg cgagccgtca g 21

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcgacggaa gcgttagatc tgaatagccc gcaatacctg gg 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agtggcagtc ccatattcac cagctcaagc 30

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggatcaacta tcgcaaacga gcataaacag gatcgccatc gtgacggaag atcacttc 58

<210> 22

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atcgcgtaat gcggtcaatt cagcaaccat aataaacctc atcaaaggga aaactgtcc 59

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tatcgttacg tcatcctcgc tg 22

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cataaatagg cagtccaaag cggc 24

<210> 25

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggatcaacta tcgcaaacga gcataaacag gatcgccatc gatgcaaaaa gacgcgctga 60

ataac 65

<210> 26

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atcgcgtaat gcggtcaatt cagcaaccat aataaacctc ttaagccacg cgagccgtca 60

gc 62

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tatcgttacg tcatcctcgc tg 22

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cataaatagg cagtccaaag cggc 24

<210> 29

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggatcaacta tcgcaaacga gcataaacag gatcgccatc gtgacggaag atcacttc 58

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgtcggtaat atgtacgtta ttcagcgcgt ctttttgcat atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tatcgttacg tcatcctcgc tg 22

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cataaatagg cagtccaaag cggc 24

<210> 33

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ggatcaacta tcgcaaacga gcataaacag gatcgccatc ttatctctgg cggtgttgac 60

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgtcggtaat atgtacgtta ttcagcgcgt ctttttgcat agctgtttcc tggtttaaac 60

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cataaatagg cagtccaaag cggc 24

<210> 37

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gcccaaaacg cgctgtcgtc aagtcgttaa gggcgtgccc ttcatcatgt gacggaagat 60

cacttc 66

<210> 38

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

catgctcagc gcacgaatag cattggcaag ctctttacgt gaggacatat caaagggaaa 60

actgtcc 67

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

acatgcgagc atgatccag 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cgcaaacgga catatcaag 19

<210> 41

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcccaaaacg cgctgtcgtc aagtcgttaa gggcgtgccc ttcatcattt atctctggcg 60

gtgttg 66

<210> 42

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

catgctcagc gcacgaatag cattggcaag ctctttacgt gaggacatag ctgtttcctg 60

gtttaa 66

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cgcaaacgga catatcaag 19

<210> 45

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gtactcacct atcttaattc acaataaaaa ataaccatat gtgacggaag atcacttc 58

<210> 46

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ttgccttgtt tgaccgcccc tgttttttag cgtcaggcat atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cgtcgtactc acctatct 18

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ccccacattt gctcggta 18

<210> 49

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gtactcacct atcttaattc acaataaaaa ataaccatat ttatctctgg cggtgttg 58

<210> 50

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ttgccttgtt tgaccgcccc tgttttttag cgtcaggcat agctgtttcc tggtttaa 58

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ccccacattt gctcggta 18

<210> 53

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

cccaggtatt tacagtgtga gaaagaatta ttttgacttt gtgacggaag atcacttc 58

<210> 54

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tggtgccgcc cacatcaccg actaatgcat actttgtcat atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

atttacaggg agcctgcc 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

agattgagcg ccagattg 18

<210> 57

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cccaggtatt tacagtgtga gaaagaatta ttttgacttt ttatctctgg cggtgttg 58

<210> 58

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

tggtgccgcc cacatcaccg actaatgcat actttgtcat agctgtttcc tggtttaa 58

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

agattgagcg ccagattg 18

<210> 61

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

ccgggttctt ttaaaaatca gtcacaagta aggtagggtt gtgacggaag atcacttc 58

<210> 62

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

gatcttctcc taagcagtaa attgggccgc atctcgtgga atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 63

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

agcggttgaa catctggt 18

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

cttgtcgtcg gaaaccag 18

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

tggcattgat tcagcctg 18

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

tcactgcggc aagaatta 18

<210> 67

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

cattcggatt tcatgttcaa gcaacacctg gttgtttcag gtgacggaag atcacttc 58

<210> 68

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

aacgtggtaa cgatttttgt tctgcgaagc cttctggaca atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

accaggtgtt gcttgaacat g 21

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

atgtggcgtt ttcgccgcat c 21

<210> 71

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

cattcggatt tcatgttcaa gcaacacctg gttgtttcag ttatctctgg cggtgttg 58

<210> 72

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

aacgtggtaa cgatttttgt tctgcgaagc cttctggaca tagctgtttc ctggtttaaa 60

c 61

<210> 73

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

atgtggcgtt ttcgccgcat c 21

<210> 75

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

actggcgcta caatcttcca aagtcacaat tctcaaaatc gtgacggaag atcacttc 58

<210> 76

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

gcctgccagg cagcggtctg cgttggattg atgtttttca atcaaaggga aaactgtcc 59

<210> 77

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

cgctacaatc ttccaaagtc ac 22

<210> 78

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

cggcatcagg catgaacgat g 21

<210> 79

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

actggcgcta caatcttcca aagtcacaat tctcaaaatc ttatctctgg cggtgttg 58

<210> 80

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

gcctgccagg cagcggtctg cgttggattg atgtttttca tagctgtttc ctggtttaaa 60

c 61

<210> 81

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

ttatctctgg cggtgttg 18

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

cggcatcagg catgaacgat g 21

Claims (27)

1.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌(Escherichia coli)重组菌株WJ004，其通过下调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达或不表达而降低3-脱氢莽草酸酶酶活。

2.如权利要求1所述的重组菌株WJ004，其通过在aroE起始密码子上游插入合成调控元件P1而下调3-脱氢酶莽草酸脱氢酶(aroE)的表达或不表达aroE；

优选地，在aroE起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1；

优选地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；以及任选地，

所述aroE的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG或GTG。

3.如权利要求1或2所述的重组菌株WJ004，其以大肠杆菌DSM1576为出发菌株。

4.权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，插入合成调控元件P1；

优选地，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子上游插入合成调控元件P1；

优选地，在3-脱氢莽草酸脱氢酶aroE起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1；

优选地，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；以及任选地，

用稀有起始密码子TTG或GTG替换原始起始密码子ATG来调控aroE的表达。

5.权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004或由其传代而产生的重组菌或权利要求4所构建的重组菌株WJ004或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

6.发酵生产3-脱氢莽草酸的方法，包括利用重组菌株WJ004(优选权利要求1-3中任一项所述的或权利要求4所构建的)进行发酵。

7.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ006，其以大肠杆菌DSM1576或权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004为出发菌株，所述重组菌株WJ006的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroF中第443位的碱基C突变为T形成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶突变基因aroF*；优选地，所述突变基因aroF*的基因序列如SEQ ID NO:5所示；以及任选地，

在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因的起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4而上调该酶的表达；

优选地，在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因的起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4；

优选地，插入合成调控元件P2；

更优选地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

8.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ012，其以大肠杆菌DSM1576或权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004或权利要求7所述的重组菌株WJ006为出发菌株，优选地，以权利要求7所述的重组菌株WJ006为出发菌株，所述重组菌株WJ0012，通过在转酮醇酶基因(tktA)起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4而上调转酮醇酶(tktA)的表达；

优选地，通过在转酮醇酶基因(tktA)起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4而上调转酮醇酶(tktA)的表达；

更优选地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

更优选地，插入合成调控元件P4。

9.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ038，其以大肠杆菌DSM1576，或权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004，或权利要求7所述的重组菌株WJ006，或权利要求8所述的重组菌株WJ012为出发菌株，优选地，以权利要求8所述的重组菌株WJ012为出发菌株。

10.如权利要求9所述的重组菌株WJ038，其上调半乳糖MFS转运蛋白(galP)的表达和/或上调葡萄糖激酶(glk)的表达和/或下调磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)的表达。

11.如权利要求10所述的重组菌株WJ038，其上调半乳糖MFS转运蛋白(galP)的表达和/或上调葡萄糖激酶(glk)的表达和/或不表达磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶Ⅰ(ptsⅠ)。

12.如权利要求9-11中任一项所述的重组菌株WJ038，通过在galP起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4上调galP的表达，优选地，插入合成调控元件P1；以及任选的，

通过在glk起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4上调glk的表达，优选地，插入合成调控元件P4；以及任选的，

通过敲除ptsI基因下调ptsⅠ的表达或不表达ptsⅠ；

优选地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示，所述调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

13.重组菌株WJ038(权利要求9-12中任一项所述)的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，在半乳糖MFS转运蛋白galP起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4来调控半乳糖MFS转运蛋白galP的表达；

优选地，在半乳糖MFS转运蛋白galP起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在半乳糖MFS转运蛋白galP起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1；以及任选地，

通过同源重组方法，在葡萄糖激酶(glk)起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P2和/或P4来调控葡萄糖激酶基因(glk)的表达；

优选地，在葡萄糖激酶基因(glk)起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在葡萄糖激酶基因(glk)起始密码子ATG上游插入合成调控元件P4；以及任选地，

通过同源重组方法，敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶的酶I基因(ptsI)；

优选地，所述合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示。

14.权利要求9-12中任一项所述的重组菌株WJ038或由其传代而产生的重组菌或权利要求13所构建的重组菌株WJ038或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

15.发酵生产3-脱氢莽草酸的方法，包括利用重组菌株WJ038(优选权利要求9-12中任一项所述的或权利要求13所构建的)进行发酵。

16.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ048，其以大肠杆菌DSM1576或权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004，或权利要求7所述的重组菌株WJ006，或权利要求8所述的重组菌株WJ012，或权利要求9-12中任一项所述的重组菌株WJ038为出发菌株，优选地，以权利要求9-12中任一项所述的重组菌株WJ038为出发菌株。

17.如权利要求16所述的重组菌株WJ048，其下调丙酮酸激酶的表达或不表达；

优选地，其通过在丙酮酸激酶pykA和/或丙酮酸激酶pykF起始密码子上游插入合成调控元件P1下调丙酮酸激酶的表达或不表达；

优选地，在丙酮酸激酶pykA和/或丙酮酸激酶pykF起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1；

优选地，所述调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；以及任选地，

重组菌株WJ048含有的pykA和/或pykF的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG或GTG。

18.权利要求16或17所述的重组菌株WJ048的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，插入合成调控元件P1；

优选地，在丙酮酸激酶pykF和/或pykA起始密码子上游插入合成调控元件P1；

优选地，在丙酮酸激酶pykF和/或pykA起始密码子ATG上游插入合成调控元件P1；

优选地，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；以及任选地，

用稀有起始密码子TTG或GTG替换原始起始密码子ATG来调控丙酮酸激酶的表达。

19.权利要求16或17所述的重组菌株WJ048或由其传代而产生的重组菌或权利要求18所构建的重组菌株WJ048或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

20.发酵生产3-脱氢莽草酸的方法，包括利用重组菌株WJ048(优选权利要求16或17所述的或权利要求18所构建的)进行发酵。

21.生产3-脱氢莽草酸的大肠杆菌重组菌株WJ060，其以大肠杆菌DSM1576或权利要求1-3中任一项所述的重组菌株WJ004或权利要求7所述的重组菌株WJ006或权利要求8所述的重组菌株WJ012，或权利要求9-12中任一项所述的重组菌株WJ038，或以权利要求16或17所述的重组菌株WJ048为出发菌株，优选地，以权利要求16或17所述的重组菌株WJ048为出发菌株。

22.如权利要求21所述的重组菌株WJ060，其下调磷酸葡萄糖异构酶(pgi)的表达或不表达；

优选地，其通过在pgi起始密码子上游(优选地，在起始密码子ATG上游)插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4下调磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)的表达或不表达；

优选地，所述调控元件为P1；

优选地，所述调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；

以及任选地，所述重组菌株WJ060含有的pgi基因的原始起始密码子ATG替换为稀有密码子TTG或GTG。

23.如权利要求21或22所述的重组菌株WJ060，其保藏号为CGMCC No.14602。

24.权利要求21-23中任一项所述的重组菌株WJ060的构建方法，包括如下步骤：

通过同源重组方法，插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi起始密码子上游起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi起始密码子ATG上游起始密码子上游插入合成调控元件P1和/或P3和/或P4；

优选地，在葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi起始密码子ATG上游起始密码子上游插入合成调控元件P1；

优选地，合成调控元件P1的序列如SEQ ID NO:1所示；所述合成调控元件P3的序列如SEQ ID NO:3所示；所述合成调控元件P4的序列如SEQ ID NO:4所示；以及任选地，

用稀有起始密码子TTG或GTG替换原始起始密码子ATG来调控pgi的表达。

25.权利要求21-23中任一项所述的重组菌株WJ060或由其传代而产生的重组菌或权利要求24所构建的重组菌株WJ060或由其传代而产生的重组菌在生产3-脱氢莽草酸中的应用。

26.发酵生产3-脱氢莽草酸的方法，包括利用重组菌株WJ060(优选权利要求21-23中任一项所述的或权利要求24所构建的)进行发酵。

27.重组菌株WJ060，其保藏号为CGMCC No.14602。