CN102453691B - 高产l-色氨酸的大肠杆菌工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌，其是以大肠杆菌W3110为出发菌，采用tac启动子突变体串联基因组上表达trpEfbrDCBA基因，同时失活或敲除大肠杆菌W3110中的tnaA、trpR和tyrR基因，并突变tyrA和pheA基因，使其表达的酶活力弱化，并向改造后的菌株中转入含有串联表达来源于大肠杆菌K12的AroFfbr或AorGfbr、tktA和ppsA基因以及来源于枯草芽孢杆菌的SerA基因的低中拷贝质粒等系列技术组合筛选出工业化高产L-色氨酸、高葡萄糖转化率、生产发酵时间短的大肠杆菌工程菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物育种和微生物发酵领域，具体地说，涉及发酵高产L-色氨酸的大肠杆菌菌种的选育。
背景技术
L-色氨酸是唯一有吲哚支链的芳香族氨基酸，化学名称为2-氨基-3-吲哚基丙酸。L-色氨酸是人体和动物体中的必需限制性氨基酸之一，在体内合成极微，需从外界摄取。它对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用。目前被广泛地应用于医药、食品和饲料等领域。
传统色氨酸生产方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法。前三种方法分别存在着材料来源有限、需多步合成工艺及光学拆分难、周期长、底物价格昂贵等缺点，在工业生产中受到极大限制。L-色氨酸的微生物发酵法是色氨酸生产的主要方法，即以淀粉或淀粉糖为原料，由微生物在高浓度条件下发酵后制得。自然界分离得到的野生型菌株酶能力和产生代谢产物的能力一般很低，很少能适合于工业化生产。传统诱变育种操作简单，实用性强，可以较快实现提高L-色氨酸产量的目的，在早期色氨酸育种和抗代谢反馈抑制酶起重要作用(J Bact，1990，172，6581；JBC 1991(266)p8328；US 4371614，JP 57-071397)。但诱变育种有其局限性，如：方向难以掌握，突变体难以集中多个理想性状等，使得色氨酸产量难以提高。近年来，随着基因克隆技术的发展，特别是代谢工程的发展，为廉价高效的色氨酸生产开辟了新途径。
近年来，由于对色氨酸合成途径研究取得进展，基因工程(代谢工程)育种取得很大进展，并成功产业化。色氨酸基因工程(代谢工 程)育种主要集中在以下几个方面：芳香族氨基酸生物合成途径的第一步DAHP合成酶(AroF或AroG或AroH)抗反馈调控改造。最初的成功是通过缺失aroF/aroG和aroH基因而简化系统的调控(tyrR调控消除)，进而对受酪氨酸调节的酶编码基因aroF/AroG进行体外突变，增加了它对反馈抑制的不敏感性(JBC 1991(266)p 8328；Appl.Environ.Microbiol，Feb.1997，p.761；J.MOL 1965(44)p969；JP 57-071397；US 4560652；J Bact，Sept.1976，p.1085)。酪氨酸和苯丙氨酸分支途径分支酸变位酶tyrA和pheA的阻断或弱化(JBC 1972，247，p4447)；色氨酸酶(tnaA)基因的灭活，以防止所合成的色氨酸被降解(J.Bact，85，1965，p680)；邻氨基苯甲酸合成酶(trpE)对色氨酸基因的不敏感性减缓色氨酸途径的反馈抑制改造以及调控基因TrpR失活(EP 0293207；US 4371614；US 4588687；EP0338474)；突变色氨酰-tRNA合成酶基因trpS以破坏细胞的衰减控制等等(CN 1156180A)；以及上述几个方面的组合(US7638312B2；Appl.Environ.Microbiol.65，1999，p2497；EPAO401735)。上述方法只是在代谢通路方面采取了措施，按其所述方法构建的菌株在发酵放大过程中，菌株的生理生态控制不一定能按照设计目的获得高产、低能耗、高转化率生产L-色氨酸菌种。有的可能表达酶过量造成代谢负担，有的可能质粒拷贝数过高，消耗过多胞内资源；有的可能表达的蛋白之间不协调，造成胞内资源浪费，结果产量过低或糖酸转化不高；有的可能产量高，但发酵时间过长，能耗大不利于产业化。
发明内容
本发明的目的是基于节约细胞资源和能耗，并提高细胞葡萄糖转化率的原则，提供一种高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌。
为了实现本发明目的，本发明采用代谢工程育种方法建立系列菌株库，然后通过筛选的方法筛选得到高产、高转化效率、发酵时间短的高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌。该代谢工程育种的方法是以大肠杆菌W3110(ATCC 27325)为出发菌，采用组成型tac启动子或其突 变体替代色氨酸启动子，打破色氨酸合成的调控，同时敲除或失活大肠杆菌W3110中的色氨酸降解基因，并改变芳香族氨基酸合成分支酸途径和色氨酸合成相关代谢流。
本发明的代谢工程育种具体方法就是采用分子生物学技术敲除色氨酸降解的色氨酸酶(tnaA)基因、色氨酸操纵子中产生阻遏物基因trpR和调控蛋白的tyrR基因，突变酪氨酸和苯丙氨酸分支途径分支酸变位酶tyrA和pheA基因使之表达的酶活力弱化。整合基因组表达抗反馈trpEfbrDCBA；其启动子可以采用tac或tac-10区突变体。表达serA、AroFfbr或AorGfbr、tktA、ppsA基因，启动子可以采用组成型启动子tac或tac-10区突变体或trc；载体可以选择低、中拷贝质粒或直接整合到基因组中。
本发明的表达trpEfbrDCBA启动子可以为tac或其突变体，其突变体可以为trc，或者-10区突变为TATATT或TATGAT。
本发明的trpEfbr、AroFfbr或AorGfbr可来自于已经报道的突变体(JBC 1991(266)p 8328；Appl.Environ.Microbiol，1997，p.761；J.MOL 1965(44)p969；J Bact，Sept.1976，p.1085；胡昌云，AorG结构与功能研究，2003，复旦大学论文；FEMS，(2001)202 145-148；AEM 1979，p.181；J Bact，OCt.1971，p.400；China.123.J Ind Microbiol Biotechnol 04 May，2011；Appl.Environ.Microbiol，43，289，J Bact，1990，172，6581)，也可以采用诱变和体外突变的方法得到。
本发明所述突变tyrA和pheA基因突变弱化其酶活的方法可以采用细胞诱变或体外突变的方法得到，也可以采用(Bioorg.Med.Chem.(1996)4，1015-1020；Biochemistry(2007)46，6883-6891；Biochemistry(1998)37，15703-15712)报道的突变体，其tyrA突变可以为H131A或H153N或H189N或H197N或H239N或H245N或H257A或H265A或H347N，优选为H131A。pheA基因突变可以为：K39N或K39Q或K39R或Q88E或Q88R或L7C或L7M或D48Q或D48C或D48L或I81L或I81F或V35L，优选为D48Q。
根据上述方法，本发明进一步提供一种高产L-色氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌，其是以大肠杆菌W3110为出发菌，采用 tac启动子突变体串联基因组上表达trpEfbrDCBA基因，同时失活或敲除大肠杆菌W3110中的tnaA、trpR和tyrR基因，并突变tyrA和pheA基因，使其表达的酶活力弱化，并向改造后的菌株中转入含有串联表达来源于大肠杆菌K12的AroFfbr或AorGfbr、tktA和ppsA基因以及来源于枯草芽孢杆菌的SerA基因的低中拷贝质粒而构建得到的；其中，所述tac启动子突变体的碱基序列如Seq ID No.2-4所示，优选Seq ID No.3所示的碱基序列，其在基因组上的整合位点为trpL-trpE基因处，以Δtac-trpEfbr替换trpL-trpE基因。
前述的工程菌，所述串联表达来源于大肠杆菌K12的AroFfbr或AorGfbr、tktA和pppsA基因以及来源于枯草芽孢杆菌的SerA基因的低中拷贝质粒为pACYC184。
前述的工程菌，所述trpEfbr基因为抗反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。
前述的工程菌，所述AroFfbr基因为来源于大肠杆菌K12的磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶DAHP基因的抗反馈抑制突变基因，其编码的148位氨基酸残基位点脯氨酸(P)突变为亮氨酸(L)。
本发明还提供最优化的高产L-色氨酸的大肠杆菌W3110(Escherichia coli W3110)的工程菌XT0015，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，保藏日期2011年9月15日，保藏号为CCTCC M 2011316。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明通过基因工程(代谢工程)设计和分子生物学的手段，对大肠杆菌的色氨酸合成途径进行改造，得到了一种高产L-色氨酸、高葡萄糖转化率、生产发酵时间短的大肠杆菌工程菌。
(二)本发明通过弱化酪氨酸和苯丙氨酸合成途径，在发酵培养时不需要添加外源酪氨酸和苯丙氨酸，便于工业化控制。
(三)本发明通过弱化酪氨酸和苯丙氨酸合成途径，组成型表达trpEfbrDCBA、AroFfbr、SerA、tktA、ppsA等基因，使细胞合成代谢流主要流向色氨酸合成。
(四)本发明通过筛选不同启动能力的组成型启动子来表达trpEfbrDCBA、AroFfbr、SerA、tktA、ppsA等基因，以及采用整合、低中拷贝载体组合筛选方案，使细胞不必要多合成相关载体和蛋白，节 约细胞资源和能量，减少细胞负担，有利于提高细胞葡萄糖转化率。
(五)通过表达使用不同启动能力的组成型启动子和采用整合、低中拷贝载体组合方案，使得色氨酸代谢工程育种方案简单、易行、实用，便于获得高产、发酵时间短、高葡萄糖转化率的工程菌株。
(六)本发明构建的大肠杆菌工程菌XT0015，在30L发酵罐中发酵稳定，过程易控，发酵35小时发酵液色氨酸浓度可以达45g/L左右，葡萄糖转化率达18.5％。大大提高了色氨酸葡萄糖转化率和缩短发酵时间，有利于工业化。
附图说明
图1为本发明Red介导(pKD46)的kan-sacB反选系统基因敲除示意图。
图2为本发明trpEfbrDCBA基因整合表达示意图。
图3为本发明质粒结构示意图，(a)为质粒pTrcA，(b)为质粒pTrcAS，(c)为质粒pTrcASP，(d)为质粒pTrcASPT，(e)为质粒PACYCTrcASPT。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中未注明的具体的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》中所述的方法或厂商提供的方案进行。
以下实施例中，W3110购自ATCC(ATCC 27325)；质粒pKD 46购自CGSC公司；全基因合成、合成引物等购自invitrogen公司；PACYC184质粒、ptrc99a质粒、KOD聚合酶，dNTP，PCR产物纯化试剂盒，四环素，卡拉霉素，氨苄青霉素、胶回收纯化试剂盒、DNA抽提试剂盒、部分限制性内切酶、DH5α等购自上海悦克生物科技有限公司；Taq酶、T4连接酶、部分限制性内切酶、质粒PMDT-18、质粒PUC18购自Takara公司；同源重组-反筛选系统质粒pUC18-KS(pUC18 kanR sacB+，图1)是本实验室按照文献Jean M. R.等，2009，Counterselectable Markers：Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis，Infect Immun.1998，66(9)：4011-4017的方法构建。试剂除特殊要求外，均为国产试剂。电转参照《分子克隆：实验手册》中提供方法进行。
实施例1 高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌的构建
1、tnaA、trpR、tyrR基因敲除
采用Red介导的重组工程系统，以大肠杆菌W3110为出发菌，导入热敏型质粒pKD46，使用kan-sacB反选系统，敲除tnaA基因，其方法如图1所示，具体方法为：
1)tnaA基因敲除
所用引物和基因片段：
ptnapuc-1 5’-ATTGAGCCAGTAAAACGTACCACTCGCGCTTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG-3’
ptnapuc-2 5’-CGCCAGCATATCGGCATATTTGTAGGTTTCGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3’
ptnaA 5’-ATTGAGCCAGTAAAACGTACCACTCGCGCTGAAACCTACAAATATGCCGATATGCTGGCG-3’
以ptnapuc-1、ptnapuc-2为引物，以质粒pUC18-KS为模板的PCR产物电转入大肠杆菌W3110(pKD46)中，50mg/L卡拉霉素LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，tnaA::(kan，SacB))。在以ptnaA基因片段核苷酸KOD聚合酶补平互补链制成的双链产物电转入W3110(pKD46，tnaA::(kan，SacB))中，在5％蔗糖的100mg/L的氨苄青霉素LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，ΔtnaA)。
2)trpR基因敲除
所用引物和基因片段：
ptrprpuc-1 5’-ATGGCCCAACAATCACCCTATTCAGCAGCGATGGCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG-3’
ptrprpuc-2 5’-TCTTCCAGCCACTGGCGCAGCTCGACGGGCGCGGCGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3’
ptrpR 5’-CGGTCTGACCCGCGAATTACTCGATCTACTCGTGCGTACTTACGCGTTATGCGTGGCCGGGAAATGTGCG-3’
以ptrprpuc-1、ptrprpuc-2为引物，以质粒pUC18-KS为模板的PCR产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA)中，50mg/L卡拉霉素LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，ΔtnaA，trpR::(kan， SacB))。将以ptrpR基因片段KOD聚合酶补平互补链制成的双链产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA，trpR::(kan，SacB))中，在5％蔗糖的100mg/L的氨苄青霉素LB平板筛，30℃培养，选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR)。
3)tyrR基因敲除
所用引物和基因片段：
ptyrRpuc-1 5’-CGGTCTGACCCGCGAATTACTCGATCTACTCGTGCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG-3’
ptyrRpuc-2 5’-CGCACATTTCCCGGCCACGCATAACGCGTAAGTACGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3’
ptyrR 5’-CGGTCTGACCCGCGAATTACTCGATCTACTCGTGCCGCACATTTCCCGGCCACGCATAACGCGTAAGTAC-3’
以ptyrRpuc-1、ptyrRpuc-2为引物，以pUC18-KS为模板的PCR产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR)中，50mg/L卡拉霉素LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR::(kan，SacB))。将以ptyrR基因片段KOD聚合酶补平互补链制成的双链产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR::(kan，SacB))中，在5％蔗糖和100mg/L的氨苄青霉素的LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR)。
2、pheA和tyrA基因突变
1)pheA基因突变
所用引物：
Pphepuc-1：5’-AGCCAAACTGCTCTCGCATCGCCCGGTACGTTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG-3’
Pphepuc-2：5’-TCTTTCCAGCAAATCGCGTTCACGATCAATGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3’
全基因合成pheA部分基因，使48位点天冬氨酸Asp→谷氨酰胺Gln，其碱基由gat→caa，其序列如下：
ppheA：5’-GCCAAACTGCTCTCGCATCGCCCGGTACGTCAAATTGATCGTGAACGCGATTTGCTGGAAAGA-3’。
以Pphepuc-1、Pphepuc-2为引物，pUC18-KS为模板的PCR产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR)，50mg/L卡拉霉素LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，pheA::(kan，SacB))。将pheA部分基因突变体ppheA以KOD聚合酶补平互补链制成的双链产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA， ΔtrpR，ΔtyrR，pheA::(kan，SacB))中，在5％蔗糖和100mg/L的氨苄青霉素的LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到pheA基因添换位为pheA突变体的W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA)。
2)tyrA基因突变所用引物：
ptyrA-1：5’-CTCTCGGGTTATCAGGTGCGGATTCTGGAGCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG-3’
ptyrA-2：5’-TCGGCAACAATATCAGCCGCTCGATCCCAGTCGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC-3’
合成tyrA部分基因，将131位点组氨酸His突变为丙氨酸Ala，其碱基由cat→gcc，其序列如下：
ptyrA：5’-TCTCGGGTTATCAGGTGCGGATTCTGGAGCAAGCCGACTGGGATCGAGCGGCTGATATTGTTGCC-3’
以ptyrA-1，ptyrA-2为引物，pUC18-KS为模板的PCR产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA)中，50mg/L卡拉霉素LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，tyrA::(kan，SacB))。将合成tyrA部分基因突变体ptyrA以KOD聚合酶补平互补链制成的双链产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，tyrA::(kan，SacB))中，在5％蔗糖和100mg/L的氨苄青霉素的LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得到tyrA基因添换位为tyrA突变体的W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA)。
3、抗反馈trpEfbr基因
全基因合成Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2 trpE基因，其中trpE基因40位点丝氨酸Ser突变为苯丙氨酸phe，其碱基由于tcc→ttc得trpEfbr基因(见trpEfbr序列)，最后得DH5a/pUC18trpEfbr。
4、trpEfbrDCBA基因整合表达
1)启动子组合碱基
全基因合成下述启动子组合碱基：
Tac：GAGCTGTTGACAATTAATCATCCGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTAAGCTTAGGATCTAGAATTCTATG CAAACACCAAAACCCACGCTCGAAC(SEQ ID No.1)
Trc：GAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTAAGCTTAGGAT CTAGAATTCTATGCAAACACCAAAACCCACGCTCGAAC(SEQ ID No.2)
Tac1：GAGCTGTTGACAATTAATCATCCGCTCGTATATTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTAAGCTTAGGATCTAGAATTCTATGCAAACACCAAAACCCACGCTCGAAC(SEQ ID No.3)
Tac2：GAGCTGTTGACAATTAATCATCCGCTCGTATGATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTAAGCTTAGGATCTAGAATTCTATGCAAACACCAAAACCCACGCTCGAAC(SEQ ID No.4)
引物：
ptrpE1-1：5’-ATGCAAACACCAAAACCCACGCTCGAAC-3’
Primer 2-1：5’-GAGCTGTTGACAATTAATCATCCGCTCG-3’
ptrpE 2-2：5’-TCAGAAAGTCTCCTGTGCATGATGCG-3’
Primer 3-1：5’-ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTGGTGGGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGCTCG-3’
primerKS-1：5’-ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAAGGTTGGTGGTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACG-3’
anti primer KS-2：5’-TCAGAAGGTCTCCTGTGCATGATGCGCGGTGGCGATAGCGAGCGGATAACAATTTCACACAG-3’
使用引物ptrpE1-1、ptrpE 2-2，以全基因合成的质粒pUC18trpEfbr为模板，PCR出trpEfbr基因。以Primer 2-1和ptrpE 2-2为引物，以上述启动子组合碱基和trpEfbr基因为模板，crossover PCR连接启动子与trpEfbr基因，其crossover PCR产物为tac-trpEfbr，trc-trpEfbr，tac1-trpEfbr，tac2-trpEfbr系列集合。
以Primer 3-1、ptrpE 2-2为引物，tac-trpEfbr，trc-trpEfbr，tac1-trpEfbr，tac2-trpEfbr分别为模板，crossover PCR得到dL-tac-trpEfbr、dL-trc-trpEfbr、dL-tac1-trpEfbr、dL-tac2-trpEfbr系列集合。
以primer KS-1、anti primer KS-2为引物，pUC18-KS为模板的PCR产物电转入W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔtyrA，ΔpheA)中，50mg/L卡拉霉素LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆，得W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔtyrA，ΔpheA，trpLE::(kan，SacB))，然后再将上述的PCR产物dL-tac-trpEfbr，dL-trc-trpEfbr，dL-tac1-trpEfbr，dL-tac2-trpEfbr分别电转至上述得W3110(pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔtyrA，ΔpheA，trpLE::(kan，SacB))中，在5％蔗糖和100mg/L的氨苄青霉素的LB平板，30℃培养，筛选出阳性克隆去除TrpL基因部分序列并整合替换原trpE基因的trpEfbrDCBA整合表达的不同启动 子的(系列集合)的菌株(图2)：
W3110(tac-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)；
W3110(tac1-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)；
W3110(tac2-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)；
W3110(trc-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)。
5、pKD46质粒的消除
将上述的W3110(tac-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)、W3110(tac1-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)、W3110(tac2-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)和W3110(trc-trpEfbrDCBA，pKD46，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)的含有pKD46质粒的菌株于37℃传代，验证其氨苄抗性。如无氨苄抗性则表明pKD46质粒已消除。
6、串联表达AroFfbr、SerA、tktA、ppsA基因
AroFfbr、SerA、tktA、ppsA基因的表达可以选择高拷贝、中拷贝、低拷贝质粒，本实施例以PACYC184为例：
1)AroFfbr表达框的构建：
全基因合成大肠杆菌AroFfbr基因得质粒puc18-AroFfbr，其AroFfbr的基因由原来AroF基因(K-12 Gene Accession Number：ECK2598)的148位氨基酸残基位点脯氨酸pro突变为L-亮氨酸leu，其碱基由cca突变为ttg。
2)串联表达AroFfbr、SerA、tktA、ppsA基因质粒的构建
所用引物：(5’→3’)
Primer aorF1：ATCTTATCCCAAAAAGACGCGCTGAATAAC
Primer aorF2：GTTAGAGCTCTTAAGCCACGCGAGCCGTCAGCTGC
primer sera 1：ATAAGAGCTCAAGGAGATATACCATGTTTCGAGTATTGGTCTCAGAC
primer sera 2：CAGAAGGTACCTTATGGCAGATCAATGAGCTTCAC
primer tkt1：TCATGGATCCAAGGAGATATACCATGTCCTCACGTAAAGAGCTTGCC
primer tkt2：CTTATCTAGA AATTACAGCAGTTCTTTTGCTTTCGCAAC
primer ppsa1：GCTTGGTACCAAGGAGATATACCATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGC
primer pps2：ATAAGGATCCTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGCTTAACCA
primer Trcaspt 1：CAGCAGATCTTCGACTGCACGGTGCACCAATGCT
primer Trcaspt 1：TCTTCAGTACTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGG
primer acyc 1：GTCGAGATCTTGCGGCGAGCGGAAATGGCTTACGAACG
primer acyc 2：GCCAAGTACTGGTTTGCGCATTCACAGTTCTCCGCAAG
以puc18-AroFfbr为模板，Primer aorF1、Primer aorF2为引物的PCR产物经过Nco1和Sac1双酶切，用T4连接酶连接到相同酶切的质粒pTrc99A上；连接产物转化大肠杆菌DH5α后涂布100mg/L LB平板，37℃培养，得阳性克隆菌落pTrcA/DH5α(图3(a))。
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，primer sera 1、primer sera 2为引物的PCR产物序列的serA基因序列产物经过Sac1和kpn1双酶切连接，用T4连接酶到相同酶切的质粒pTrcA；连接产物转化大肠杆菌DH5α后涂布100mg/L LB平板，37℃培养，得阳性克隆菌落pTrcAS/DH5α(图3(b))；
以大肠杆菌DH5α基因组为模板，primer ppsa1、primer ppsa2为引物的PCR产物序列的ppsA基因序列产物经过kpn1和BamH1双酶切，用T4连接酶连接到相同酶切的质粒pTrcAS，连接产物转大肠杆菌DH5α后涂布100mg/L LB平板，37℃培养，得阳性克隆菌落pTrcASP/DH5α(图3(c))；
以大肠杆菌DH5α基因组为模板，primer tkt1、primer tkt2为引物的PCR产物的tktA基因序列产物经过BamH1和Xba1双酶切，用T4连接 酶连接到相同酶切的质粒pTrcASP得质粒，连接产物转大肠杆菌DH5α后涂布100mg/L LB平板，37℃培养，得阳性克隆菌落pTrcASPT/DH5α(图3(d))。
以质粒pTrcASPT为模板，primer Trcaspt 1、primer Trcaspt 2为引物的PCR产物经Bgl2和Sca1双酶切，用T4连接酶连接到相同酶切的以质粒PACYC184模板，primer acyc 1、primer acyc 2为引物的PCR产物，连接产物转化大肠杆菌DH5α后在含四环素20mg/L的LB培养基上于37℃培养，得阳性克隆菌落PACYCTrcASPT/Dh5α(图3(e))。
7、产L-色氨酸菌株的获得
将质粒PACYCTrcASPT电转于大肠杆菌，以上述四个菌株为例，获得四种产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌株，如：
W3110(AroFfbr、SerA、tktA、ppsA，tac-trpEfbrDCBA，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)；
W3110(AroFfbr、SerA、tktA、ppsA，tac1-trpEfbrDCBA，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)；
W3110(AroFfbr、SerA、tktA、ppsA，trc-trpEfbrDCBA，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)；
W3110(AroFfbr、SerA、tktA、ppsA，tac2-trpEfbrDCBA，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)。
其中，W3110(AroFfbr、SerA、tktA、ppsA，tac1-trpEfbrDCBA，ΔtnaA，ΔtrpR，ΔtyrR，ΔpheA，ΔtyrA，ΔTrpL)为大肠杆菌工程菌XT0015，保藏号为CCTCC M 2011316。
实施例2 高产L-色氨酸的大肠杆菌工程菌的发酵
以实施例1获得四种产L-色氨酸菌株为例。
(1)培养基：
摇瓶种子培养基(1L)：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加水配制；
一级种子培养基(1L)：葡萄糖10g，硫酸铵5g，MgSO4 1g，柠檬 酸三钠1g，磷酸二氢钾5g，酵母提取物5g，CaCl2 0.02g，FeSO4·7H2O 0.05g，微量元素1ml，pH 6.8；
其中微量元素溶液(1L)：Na2MoO4·2H2O 0.15g，H3PO3 1g，CoCl 0.5g，CuSO4 0.5g，MnCl 0.3g，ZnSO4 1.2g。
发酵培养基(1L)：葡萄糖20g，硫酸铵10g，MgSO4 2g，柠檬酸三钠1g，磷酸二氢钾10g，酵母提取物8g，CaCl2 0.2g，FeSO4·7H2O 0.1g，微量元素2ml，消泡剂5滴，pH 6.8。
(2)发酵培养液的色氨酸含量测定：
采用HPLC方法测定，具体参照2007版英国药典(Ph Eur monograph 1272)。
(3)培养与发酵
从斜面种子接种到含50ml摇瓶种子培养基的250ml三角瓶中，33℃，280rpm培养10-12小时后，按照10％接种量接种到含200ml一级种子培养基的2L三角瓶中(6瓶)，33℃，280rpm培养8-10小时后，转接到含15L发酵培养基的30L发酵罐中，35℃培养，发酵前期控制溶氧DO 30％，用氨水维持罐内pH 6.8，罐压0.05MPa。当发酵培养基中葡萄糖耗完后，进入补糖生产L-色氨酸阶段。向发酵罐中补糖是采用泵从700g/L葡萄糖溶液(已经灭菌)中泵入，发酵过程采用控制转速、通风量等结合方式来保证补糖-DO联动，控制DO 15％-30％，以减少代谢负产物。整个发酵(接种后)过程大约33-40小时，发酵结果见表1。
表1 实施例1各种启动子构建的四种菌株组合的色氨酸产量
| 启动子 | 发酵时间(小时) | 葡萄糖转化率(％) | 产量(g/L) |
| tac | 35 | 17.3 | 32.8 |
| tac1 | 35 | 18.5 | 45.5 |
| tac2 | 35 | 15.8 | 28.6 |
| trc | 35 | 16.5 | 18.0 |
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种高产L-色氨酸的大肠杆菌（Escherichia coli）工程菌，其特征在于，其是以大肠杆菌W3110为出发菌，将tac启动子突变体与trpEfbrDCBA基因串联后再插入到基因组上进行表达，同时失活或敲除大肠杆菌W3110中的tnaA、trpR和tyrR基因，并突变tyrA和pheA基因，使其表达的酶活力弱化，并向改造后的菌株中转入含有串联表达AroFfbr、tktA、ppsA以及来源于枯草芽孢杆菌的SerA基因的低中拷贝质粒而构建得到的；
其中，所述tac启动子突变体的碱基序列如SEQ ID No.3所示，其在基因组上的整合位点为trpL-trpE基因处，以串联的tac启动子突变体及trpEfbrDCBA基因替换trpL-trpE基因；
所述低中拷贝质粒的载体为pACYC184；
所述的突变tyrA基因是将tyrA基因编码的第131位氨基酸残基H突变为A；
所述的突变pheA基因是将pheA基因编码的第48位氨基酸残基D突变为Q；
所述trpEfbrDCBA基因为抗反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
所述AroFfbr基因为来源于大肠杆菌K12的磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚糖酸醛缩酶DAHP基因的抗反馈抑制突变基因，其编码的第148位氨基酸残基为亮氨酸(L)。
2.根据权利要求1所述的高产L-色氨酸的大肠杆菌（Escherichiacoli）工程菌，其为大肠杆菌工程菌XT0015，保藏号为CCTCC M2011316。
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