CN109456987A

CN109456987A - 高产l-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用

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Publication number: CN109456987A
Application number: CN201811256143.3A
Authority: CN
Inventors: 谢希贤; 崔毅; 刘晓倩; 马跃超; 徐庆阳; 马倩; 陈宁; 李燕军
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN109456987B

Abstract

本发明涉及一种高产L‑亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用，⑴将leuA突变基因整合至cgl1135假基因位点，leuA突变基因见序列1；⑵将ilvBN突变基因整合至cgl1890假基因位点，ilvBN突变基因件序列2；⑶P_{CP_2928}特异性启动子替换柠檬酸合酶原始启动子，P_{CP_2928}特异性启动子序列见序列3。采用本发明所提供的技术方案在摇瓶发酵30h可生产L‑亮氨酸32g/L，在5L发酵罐发酵50h左右可生产亮氨酸60g/L，最大生产强度可达1.5g/(L×h)，糖酸转化率为30％，是目前报道的发酵法生产L‑亮氨酸的最高水平。

Description

高产L-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物领域、分子生物学领域，其中涉及L-亮氨酸和L-缬氨酸合成途径中的相关基因及其应用。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，是一种放线菌目的革兰氏阳性菌，细胞呈短棒状八字排列。谷氨酸棒状杆菌在氨基酸发酵领域有着举足轻重的地位，至今已经被安全应用了近60年。目前，包括L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬氨酸等大多数氨基酸都开始运用谷氨酸棒状杆菌发酵进行生产。

L-亮氨酸(L-leucine)与L-异亮氨酸(L-isoleucine)、L-缬氨酸 (L-valine)的分子结构中含有一个甲基侧链，而被称为支链氨基酸 (branched chain amino acids，BCAAs)。L-亮氨酸作为人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八种必需氨基酸之一，其应用领域正在逐渐扩大。目前，主要在医药、食品、化工、农药、化妆品、饮料业等领域取得了大规模的应用。亮氨酸具有十分重要的实用价值，市场对亮氨酸的需求量大，迫切需要成本低且能够大规模生产的亮氨酸生产工艺。

L-亮氨酸的生物合成途径所属的分支链氨基酸(L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸)合成途径，一直是科研人员研究的热点。L-亮氨酸可以通过蛋白质水解提取法和酶催化法获得，但由于提取工艺复杂，污染严重以及与异构体拆分困难等缺点，而通过微生物发酵法生产L- 亮氨酸，具有生长周期短、易控制、产率高、污染小等优点，是大规模工业化生产L-亮氨酸的理想方法。因此，目前生产L-亮氨酸的方法主要为微生物发酵法，使用的菌株以谷氨酸棒状杆菌为主。目前，L- 亮氨酸高产菌株的选育多采用诱变结合结构类似物抗性平板筛选的方法。Tsuchida通过诱变乳糖发酵短杆菌2256，选育出一株蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型突变菌株No.218(Met^-Ile^-2-TA^r)，能够积累L-亮氨酸 28g/L。但诱变育种选育L-亮氨酸产生菌的方法存在许多负向突变，并且遗传背景不清晰，导致对环境胁迫应对能力低，营养需求增高，生产易波动等问题，限制了菌株的工业化应用。

随着基因工程育种技术的不断发展，特别是基因编辑技术的改良大大提高了细胞工厂的构建效率，研究人员越来越青睐于对野生菌的染色体直接进行定向修饰从而获得各种生物制品的发酵菌株。张伟国等采用基因工程育种方法，优化改善C.glutamicum ATCC13032L-亮氨酸合成途径中的分支链转氨酶活性，L-亮氨酸积累量为18g/L。 Michael Vogt通过引入异丙基苹果酸合酶突变基因leuA，乙酰羟酸合酶突变基因ilvBN，同时敲除阻遏亮氨酸操纵子表达的LtbR及转录调控因子IolR。最终经50h分批补料发酵，可积累L-亮氨酸24g/L。虽然目前通过基因工程改造可获得谷棒杆菌亮氨酸产生菌，但是产酸水平较低，并且发酵产酸周期较长，生产效率较低，目前还达不到亮氨酸的工业化生产要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于发现并提供了L-亮氨酸合成途径中关键酶编码基因leuA突变基因序列、L-缬氨酸合成途径中关键酶编码突变基因ilvBN，该基因与谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032 相比，均存在多处碱基突变，并可有效解除L-亮氨酸和L-缬氨酸合成途径中存在的反馈效应。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种L-亮氨酸合成途径中异丙基苹果酸合酶编码突变基因，基因序列见序列表SEQ ID NO.1所示。

一种L-亮氨酸合成途径中乙酰羟酸合酶编码突变基因，基因序列见序列表SEQ IDNO.2所示。

一种L-亮氨酸合成途径中柠檬酸合成酶特异性启动子Pcp_2928 序列，基因序列见序列表SEQ ID NO.3所示。

一株高产L-亮氨酸的基因工程菌，包括权利要求1所述的异丙基苹果酸合酶编码突变基因，包括权利要求2所述的乙酰羟酸合酶编码突变基因，包括权利要求3所述的柠檬酸合成酶特异性启动子 Pcp_2928。

一株高产L-亮氨酸的基因工程菌构建方法，步骤如下，

⑴将leuA突变基因整合至cgl1135假基因位点，leuA突变基因见 SEQ ID NO.1；

⑵将ilvBN突变基因整合至cgl1890假基因位点，ilvBN突变基因见SEQ ID NO.2；

⑶Pcp_2928特异性启动子替换柠檬酸合酶原始启动子，Pcp_2928 特异性启动子序列见SEQ ID NO.3。

一种L-亮氨酸的发酵方法，采用上述基因工程菌，按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在32℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80g/L的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期50h。

本发明的有益效果：

本发明提供的菌株具有更好的生长性状，L-亮氨酸的生产效率更高，更重要的是该菌遗传背景清晰，基因操作简单高效，方便对其进行进一步的性状改良。

本发明所使用的产亮氨酸菌种构建方法是一种定向的理性的菌种构建方法，相比传统诱变方法更为高效便捷，可操作性强；本发明提供的亮氨酸发酵工艺廉价高效，周期短，生产强度更高。

采用本发明所提供的技术方案在摇瓶发酵30h可生产L-亮氨酸 32g/L，在5L发酵罐发酵50h左右可生产亮氨酸60g/L，最大生产强度可达1.5g/(L×h)，糖酸转化率为30％，是目前报道的发酵法生产 L-亮氨酸的最高水平。

本发明所要解决的另一技术问题在于引入了L-缬氨酸生产菌XV 上的ilvBN突变基因、L-亮氨酸生产菌CP上的leuA突变基因，且均由谷氨酸棒状杆菌中常用的强组成型启动子Ptuf启动。同时整合过表达了L-亮氨酸生产菌CP上的特异性启动子Pcp_2928，使得柠檬酸合成酶在菌体对数生长期有较高转录量，酶活力较高，而在稳定期的转录强度降低，使得用于TCA循环的丙酮酸减少，节约了L-亮氨酸合成的前体物，提高了L-亮氨酸的产量。经30h摇瓶发酵，L-亮氨酸积累量达到32g/L，经50h发酵罐分批补料发酵，L-亮氨酸积累量达到60g/L，为目前报道的利用发酵法生产L-亮氨酸最高水平。

附图说明

图1为Ptuf-leuA*整合片段的构建及验证电泳图，M：Marker，1：上游同源臂，2：PTuf，3：leuA突变片段，4：下游同源臂，5：重叠片段，6：阴性转化子，7：阳性转化子。

图2为Ptuf-ilvBN*整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker，1：上游同源臂，2：Ptuf，3：ilvBN突变片段，4：下游同源臂，5：重叠片段，6：阴性转化子，7：阳性转化子。

图3为Ptuf-Pcp_2928整合片段的构建及验证电泳图。M：Marker， 1：上游同源臂，2：Pcp_2928片段，3：下游同源臂，4：重叠片段， 5：阴性转化子，6：阳性转化子。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式限制本发明。

本发明发现并提供了leuA突变基因、ilvBN突变基因，同时整合过表达来源于L-亮氨酸生产菌CP中的柠檬酸合成酶特异性启动子 Pcp_2928。最后经30h摇瓶发酵，L-亮氨酸积累量达到32g/L。在5 L发酵罐发酵50h可生产L-亮氨酸60g/L，最大生产强度可达1.5 g/(L×h)，糖酸转化率为30％，是目前报道的发酵法生产L-亮氨酸最高水平。

实施例1

构建L-亮氨酸高效生产菌株AL03，具体方法如下：

1异丙基苹果酸合酶编码突变基因leuA*的整合：

(1)将leuA突变基因整合至cgl1135假基因位点。通过对异丙基苹果酸合酶编码基因leuA进行定点突变，并通过PCR得到该突变基因 leuA*；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，扩增cgl1135上下游同源臂片段及谷氨酸棒杆菌强启动子Ptuf。PCR反应条件(宝生物 PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min 延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。PCR扩增体系见表 2所示；引物序列如表1所示，具有序列表<400>1所示序列。

(2)利用重叠PCR将上游同源臂UP-leuA*、谷氨酸棒杆菌强启动子P_tuf-leuA*、目的片段leuA*、下游同源臂DOWN-leuA*连接，重叠PCR体系见表3所示。并利用EcoRI、XmaI双酶切将pK18mobsacB 载体线性化，将重叠基因片段利用II One StepCloning Kit(Vazyme)同源重组的方法连接至经EcoRI、XmaI双酶切的线性化质粒中，形成含目的基因的整合过表达质粒pK18mobsacB-leuA*；同源重组连接反应体系见表4所示；反应条件为：在37℃下水浴孵育30min；连接反应结束后，取15μL加入到100μL的E.coli DH5α感受态中，在42℃下水浴孵育1min，冰浴3min，加入900μL SOC 液体培养基，于37℃200rpm条件下培养1h，8000rpm，2min离心，吸掉900μL上清，重悬菌体涂布于含卡那霉素(25μg/mL)的 LB固体培养基；利用PCR鉴定阳性转化子，并提取质粒利用双酶切进行验证。鉴定引物序列如表1所示。

SOC液体培养基组成成分见表5所示；

LB固体培养基组成成分见表6所示。

leuA定点突变位点：Gly(G)92Asp(D)，Arg(R)494His(H)，Gly(G) 526Asp(D)。

(3)将构建成功的表达载体pk18mobsacB-leuA电转化(2500v) 入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032野生菌株中，将菌体涂布于含卡那霉素(10μg/mL)的BHI平板上，于32℃培养24-30h。待长出转化子后，挑取单菌落分别对点含卡那霉素和15％蔗糖的平板，32℃培养 16-20h。挑选表型正确(在卡那霉素平板生长良好而在蔗糖平板生长受到明显抑制)的菌落，以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032基因组作为阴性对照。利用鉴定引物进行菌落PCR鉴定，保存正确发生单交换的菌株。将单交换菌株接种到含卡那霉素的摇管中培养，分别在 2h和4h涂布于蔗糖平板。32℃培养24h左右，将长出的单菌落分别对点蔗糖和卡那霉素平板，32℃培养12-16h，挑选表型正确(在蔗糖平板生长良好而在卡那霉素平板生长受到明显抑制)的菌，以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032基因组作为阴性对照，利用鉴定引物进行菌落PCR和测序验证，得到基因组整合菌株AL01。鉴定引物序列如表1所示。具有序列表<400>1所示序列。

2、乙酰羟酸合酶编码突变基因ilvBN*的整合

(1)将ilvBN突变基因整合至cgl1890假基因位点。对乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN进行定点突变，并通过PCR得到突变基因ilvBN*；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，扩增cgl1890上下游同源臂片段及谷氨酸棒杆菌强启动子PTuf。PCR扩增条件及方法同“1”中所示方法。PCR扩增体系见表2所示，引物序列如表1所示。具有序列表<400>2所示序列。

(2)利用重叠PCR将上游同源臂UP-ilvBN*、P_tuf-ilvBN*、ilvBN*、下游同源臂DOWN-ilvBN*连接，重叠PCR体系见表3所示。并利用 EcoRI、HindIII双酶切将pK18mobsacB载体线性化，将重叠基因片段利用II One Step Cloning Kit(Vazyme)同源重组的方法连接至经EcoRI、HindIII双酶切的线性化质粒中，形成含目的基因的整合过表达质粒pK18mobsacB-ilvBN*；同源重组连接反应体系见表4所示；质粒构建方法同“1”中所示方法，利用PCR鉴定阳性转化子，并提取质粒利用双酶切进行验证。最终成功获得pK18mobsacB-ilvBN*重组质粒。鉴定引物序列如表1所示。

SOC液体培养基组成成分见表5所示；

LB固体培养基组成成分见表6所示。

(3)将构建成功的表达载体pK18mobsacB-ilvBN*电转化入上述“1”所构建的菌株中，筛选方法同“1”中所示方法。最终获得 AL02菌株。使ilvBN定点突变基因在L-亮氨酸生产菌株AL01中进行表达。鉴定引物序列如表1所示。具有序列表<400>2所示序列。

乙酰羟酸合酶编码基因定点突变位点：A138V，G235S。

3、Pcp_2928特异性启动子替换柠檬酸合酶原始启动子

(1)谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为碳源，葡萄糖经过EMP途径至丙酮酸，之后乙酰羟酸合酶催化两分子丙酮酸合成乙酰羟酸，进入L- 亮氨酸合成途径，但大部分的丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA进入了 TCA循环。为节省亮氨酸前体物丙酮酸，通过将Pcp_2928替换柠檬酸合酶编码基因gltA的原始启动子，使得柠檬酸合酶在对数生长期有较高转录量，活力较高，而在稳定期的转录强度降低，用于TCA 循环的丙酮酸减少，以达到节约L-亮氨酸合成的前体物，提高L-亮氨酸产量的目的。

本实验将Pcp_2928特异性启动子整合至柠檬酸合酶原始启动子位点。以L-亮氨酸生产菌株CP基因组为模板，通过PCR得到特异性启动子基因序列Pcp_2928；以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组为模板，扩增gltA启动子上下游同源臂片段。PCR扩增体系见表1所示，引物序列如表2所示。具有序列表<400>3所示序列。

(2)利用重叠PCR将上游同源臂UP-Pcp_2928、Pcp_2928、下游同源臂DOWN-Pcp_2928连接，重叠PCR体系见表3所示。并利用EcoRI、HindIII双酶切将pK18mobsacB载体线性化，将重叠基因片段利用II One Step Cloning Kit(Vazyme)同源重组的方法连接至经EcoRI、HindIII双酶切的线性化质粒中，形成含目的基因的整合过表达质粒pK18mobsacB-Pcp_2928；同源重组连接反应体系见表4所示；质粒构建方法同“1”中所示方法，利用PCR鉴定阳性转化子，并提取质粒利用双酶切进行验证。最终成功获得pK18mobsacB-Pcp_2928重组质粒。鉴定引物序列如表1所示。

SOC液体培养基组成成分见表5所示；

LB固体培养基组成成分见表6所示。

(2)将构建成功的表达载体pK18mobsacB-Pcp_2928电转化入上述“2”所构建的菌株中，筛选方法同“1”中所示方法。获得AL03 菌株。使来源于L-亮氨酸高产菌株中的Pcp_2928特异性启动子在L- 亮氨酸生产菌株AL02中进行表达。鉴定引物序列如表1所示。具有序列表<400>3所示序列。

引入了L-亮氨酸高产菌株CP中的特异性启动子Pcp_2928。该启动子属于组成型启动子，是谷氨酸棒状杆菌中转录强度随生长时期变化的启动子。通过利用该启动子，可实现对柠檬酸合酶编码基因gltA 转录量的控制，使其在细菌的不同生长时期表现出不同的转录水平，使gltA基因在细菌不同生长时期差异表达，从而达到柠檬酸合酶编码基因gltA转录强度在细菌生长对数期和稳定期先强后弱的预期，实现对目标RNA的可控表达。

本特异性启动子基因序列以L-亮氨酸高产菌株谷氨酸棒杆菌CP 基因组为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增并分析了该特异性启动子基因序列，报道了该特异性启动子所导致的基因酶活变化。由于该启动子在谷氨酸棒状杆菌中转录强度随生长时期变化而变化，将该启动子替换柠檬酸合酶编码基因gltA原始启动子，使得柠檬酸合酶在菌体对数生长期有较高转录量，酶活力较高，而在稳定期的转录强度降低，酶活力大幅度下降，使得用于TCA循环的丙酮酸减少，节约了L-亮氨酸合成的前体物，提高了L-亮氨酸的产量。

柠檬酸合成酶特异性启动子片段以亮氨酸生产菌CP基因组为模板，通过PCR的方式获得，可重复得到，使用该特异性启动子可使柠檬酸合成酶编码基因在谷氨酸棒状杆菌不同生长时期有不同的转录水平。导入CP_2928的启动子菌体生长前期是野生菌活性强度的 1.1倍，菌体生长后期是野生菌活性强度的33％。

实施例2

一种利用基因工程菌AL03菌株发酵生产L-亮氨酸的方法如下：

(1)摇瓶发酵

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，32℃培养24h，并传代一次；

摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL 种子培养基的500mL三角瓶中，十二层纱布封口，32℃，200rpm 培养7-10h；

摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500 mL三角瓶中(终体积为30mL)，十二层纱布封口，32℃，200r/min 振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v) 葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24-30h；

斜面培养基组成为：葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，MgSO₄0.5g/L，KH₂PO₄2.5/L，V_H 0.67 mg/L，琼脂21-25g/L，其余为去离子水，pH7.0-7.2；

种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，玉米浆10g/L，酵母粉5g/L，豆浓20ml/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.6g/L， FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B110mg/L，V_H 0.1mg/L，苯酚红20ml/L，消泡剂两滴，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基组成为：葡萄糖40g/L，玉米浆15g/L，豆浓30ml/L， (NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，FeSO₄·7H₂O 10 mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B120mg/L，谷氨酸10g/L，苯酚红20 ml/L，消泡剂两滴，其余为水，pH 7.0-7.2；

摇瓶发酵24-30h后L-亮氨酸的产量可达32g/L。

(2)发酵罐发酵：

斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，32℃培养24h，转接茄形瓶继续培养12h；

种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在32℃，溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；

发酵培养：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在32℃，溶氧在 25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期 50h；

种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，玉米浆20g/L，酵母粉5g/L，豆浓20ml/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，KH₂PO₄1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L， FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B110mg/L，V_H 0.1mg/L，消泡剂两滴，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基组成为：葡萄糖60g/L，玉米浆16g/L，豆浓25ml/L， (NH₄)₂SO₄15g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 10 mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，V_B120mg/L，谷氨酸10g/L，消泡剂两滴，其余为水，pH 7.0-7.2；

5L发酵罐发酵50h后L-亮氨酸的产量可达60g/L。

上述参照具体实施方式对L-亮氨酸合成途径中相关基因及其应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

表1 菌株构建过程中所涉及的所有引物

表2 PCR扩增体系

表3 重叠PCR扩增体系

注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。

表4 重组体系

表5 SOC液体培养基

表6 LB固体培养基

leuA突变基因具有序列表<400>1所示序列，其序列为：

<400>1

ATGCCAGTTAACCGCTACATGCCTTTCGAGGTTGAGGTAGAAGATATTT CTCTGCCGGACCGCACTTGGCCAGATAAAAAAATCACCGTTGCACCTCAGT GGTGTGCTGTTGACCTGCGTGACGGCAACCAGGCTCTGATTGATCCGATGT CTCCTGAGCGTAAGCGCCGCATGTTTGAGCTGCTGGTTCAGATGGGCTTCA AAGAAATCGAGGTCGGTTTCCCTTCAGCTTCCCAGACTGATTTTGATTTCGT TCGTGAGATCATCGAAAAGGACATGATCCCTGACGATGTCACCATTCAGGT TCTGGTTCAGGCTCGTGAGCACCTGATTCGCCGTACTTTTGAAGCTTGCGA AGGCGCAAAAAACGTTATCGTGCACTTCTACAACTCCACCTCCATCCTGCA GCGCAACGTGGTGTTCCGCATGGACAAGGTGCAGGTGAAGAAGCTGGCTA CCGATGCCGCTGAACTAATCAAGACCATCGCTCAGGATTACCCAGACACCA ACTGGCGCTGGCAGTACTCCCCTGAGTCCTTCACCGGCACTGAGGTTGAGT ACGCCAAGGAAGTTGTGGACGCAGTTGTTGAGGTCATGGATCCAACTCCT GAGAACCCAATGATCATCAACCTGCCTTCCACCGTTGAGATGATCACCCCT AACGTTTACGCAGACTCCATTGAATGGATGCACCGCAATCTAAACCGTCGT GATTCCATTATCCTGTCCCTGCACCCGCACAATGACCGTGGCACCGGCGTT GGCGCAGCTGAGCTGGGCTACATGGCTGGCGCTGACCGCATCGAAGGCTGCCTGTTCGGCAACGGCGAGCGCACCGGCAACGTCTGCCTGGTCACCCTGG CACTGAACATGCTGACCCAGGGCGTTGACCCTCAGCTGGACTTCACCGATA TACGCCAGATCCGCAGCACCGTTGAATACTGCAACCAGCTGCGCGTTCCTG AGCGCCACCCATACGGCGGTGACCTGGTCTTCACCGCTTTCTCCGGTTCCC ACCAGGACGCTGTGAACAAGGGTCTGGACGCCATGGCTGCCAAGGTTCAG CCAGGTGCTAGCTCCACTGAAGTTTCTTGGGAGCAGCTGCGCGACACCGA ATGGGAGGTTCCTTACCTGCCTATCGATCCAAAGGATGTCGGTCGCGACTA CGAGGCTGTTATCCGCGTGAACTCCCAGTCCGGCAAGGGCGGCGTTGCTTA CATCATGAAGACCGATCACGGTCTGCAGATCCCTCGCTCCATGCAGGTTGA GTTCTCCACCGTTGTCCAGAACGTCACCGACGCTGAGGGCGGCGAGGTCA ACTCCAAGGCAATGTGGGATATCTTCGCCACCGAGTACCTGGAGCGCACCG CACCAGTTGAGCAGATCGCGCTGCGCGTCGAGAACGCTCAGACCGAAAAC GAGGATGCATCCATCACCGCCGAGCTCATCCACAACGGCAAGGACGTCAC CGTCGATGGCCACGGCAACGGCCCACTGGCCGCTTACGCCAACGCGCTGG AGAAGCTGGGCATCGACGTTGAGATCCAGGAATACAACCAGCACGCCCGC ACCTCGGACGACGATGCAGAAGCAGCCGCCTACGTGCTGGCTGAGGTCAA CGGCCGCAAGGTCTGGGGCGTCGGCATCGCTGGCTCCATCACCTACGCTTC GCTGAAGGCAGTGACCTCCGCCGTAAACCGCGCGCTGGACGTCAACCACG AGGCAGTCCTGGCTGGCGGCGTTTAA

ilvBN突变基因具有序列表<400>2所示序列，其序列为：

<400>2

GTGAATGTGGCAGCTTCTCAACAGCCCACTCCCGCCACGGTTGCAAG CCGTGGTCGATCCGCCGCCCCTGAGCGGATGACAGGTGCAAAGGCAATTG TTCGATCGCTCGAGGAGCTTAACGCCGACATCGTGTTCGGTATTCCTGGTG GTGCGGTGCTACCGGTGTATGACCCGCTCTATTCCTCCACAAAGGTGCGCC ACGTCTTGGTGCGCCACGAGCAGGGCGCAGGCCACGCAGCAACCGGCTAC GCGCAGGTTACTGGACGCGTTGGCGTCTGCATTGCAACCTCTGGCCCAGGA GCAACCAACTTGGTTACCCCAATCGCTGATGCAAACTTGGACTCCGTTCCC ATGGTTGCCATCACCGGCCAGGTCGGAAGTGGCCTGCTGGGTACCGACGCT TTCCAGGAAGTCGATATCCGCGGCATCACCATGCCAGTGACCAAGCACAAC TTCATGGTCACCAACCCTAACGACATTCCACAGGCATTGGCTGAGGCATTC CACCTCGCGATTACTGGTCGCCCTGGCCCTGTTCTGGTGGATATTCCTAAGG ATGTCCAGAACGCTGAATTGGATTTCGTCTGGCCACCAAAGATCGACCTGC CAGGCTACCGCCCAGTTTCAACACCACATGCTCGCCAGATCGAGCAGGCA GTCAAGCTGATCGGTGAGGCCAAGAAGCCCGTCCTTTACGTTGGTAGTGGC GTAATCAAGGCTGACGCACACGAAGAGCTTCGTGCGTTCGCTGAGTACAC CGGCATCCCAGTTGTCACCACCTTGATGGCTTTGGGTACTTTCCCAGAGTCT CACGAGCTGCACATGGGTATGCCAGGCATGCATGGCACTGTGTCCGCTGTT GGTGCACTGCAGCGCAGCGACCTGCTGATTGCTATCGGCTCCCGCTTTGAT GACCGCGTCACCGGTGACGTTGACACCTTCGCGCCTGACGCCAAGATCATTCACGCCGACATTGATCCTGCCGAAATCGGCAAGATCAAGCAGGTTGAGGTT CCAATCGTGGGCGATGCCCGCGAAGTTCTTGCTCGTCTGCTGGAAACCACC AAGGCAAGCAAGGCAGAGACCGAGGACATCTCCGAGTGGGTTGACTACCT CAAGGGCCTCAAGGCACGTTTCCCGCGTGGCTACGACGAGCAGCCAGGCG ATCTGCTGGCACCACAGTTTGTCATTGAAACCCTGTCCAAGGAAGTTGGCC CCGACGCAATTTACTGCGCCGGCGTTGGCCAGCACCAAATGTGGGCAGCTC AGTTCGTTGACTTTGAAAAGCCACGCACCTGGCTCAACTCCGGTGGACTG GGCACCATGGGCTACGCAGTTCCTGCGGCCCTTGGAGCAAAGGCTGGCGC ACCTGACAAGGAAGTCTGGGCTATCGACGGCGACGGCTGTTTCCAGATGA CCAACCAGGAACTCACCACCGCCGCAGTTGAAGGTTTCCCCATTAAGATCG CACTAATCAACAACGGAAACCTGGGCATGGTTCGCCAATGGCAGACCCTAT TCTATGAAGGACGGTACTCAAATACTAAACTTCGTAACCAGGGCGAGTACA TGCCCGACTTTGTTACCCTTTCTGAGGGACTTGGCTGTGTTGCCATCCGCGT CACCAAAGCGGAGGAAGTACTGCCAGCCATCCAAAAGGCTCGAGAGATCA ACGACCGCCCAGTAGTCATCGACTTCATCGTCGGTGAAGACGCACAGGTAT GGCCAATGGTGTCTGCTGGATCATCCAACTCCGATATCCAGTACGCACTCG GATTGCGCCCATTCTTTGATGGTGATGAATCTGCAGCAGAAGATCCTGCCG ACATTCACGAAGCCGTCAGCGACATTGATGCCGCCGTTGAATCGACCGAGG CATAAATGGCTAATTCTGACGTCACCCGCCACATCCTGTCCGTACTCGTTCA GGACGTAGACGGAATCATTTCCCGCGTATCAGGTATGTTCACCCGACGCGC ATTCAACCTCGTGTCCCTCGTGTCTGCAAAGACCGAAACACACGGCATCAA CCGCATCACGGTTGTTGTCGACGCCGACGAGCTCAACATTGAGCAGATCACCAAGCAGCTCAACAAGCTGATCCCCGTGCTCAAAGTCGTGCGACTTGATG AAGAGACCACTATCGCCCGCGCAATCATGCTGGTTAAGGTCTCTGCGGACA GCACCAACCGTCCGCAGATCGTCGACGCCGCGAACATCTTCCGCGCCCGAGTCGTCGACGTGGCTCCAGACTCTGTGGTTATTGAATCCACAGGCACCCCA GGCAAGCTCCGCGCACTGCTTGACGTGATGGAACCATTCGGAATCCGCGA ACTGATCCAATCCGGACAGATTGCACTCAACCGCGGTCCGAAGACCATGGC TCCGGCCAAGATCTAA

柠檬酸合成酶特异性启动子Pcp_2928序列，具有序列表<400>3 所示序列。

<400>3

AGGATGAGGAAAAATCCGATGTTGAGTACCCACGGTGCACAGATTTCA CTAACGATTCTGGCCGCAAGCTCACTGAGACTTCTTTTGTTTTGGTCAGTTG TCACGATCTCCAACCATATAGTGTCCGATTTCCCCTCTCCCGTTGACTGTGG TTCAACCACAGGATCCATCCAGTTTTCCGTCATAGGGGGTACTTTCCCAAA GTTATGTTTTGCCAATTCATTCGATAGATCCTCGCAAAAAGTGCACAATACC CACTTTGCAAGAATTACAAACGGGGGCACCCTCAATGACTTGAAACACTTT ATTGAGTAGAAAGTGAGTCACGACACTTTTTAAAGGAGGATGCT

leuA原始基因具有序列表<400>4所示序列，其序列为：

<400>4

ATGCCAGTTAACCGCTACATGCCTTTCGAGGTTGAGGTAGAAGATATTT CTCTGCCGGACCGCACTTGGCCAGATAAAAAAATCACCGTTGCACCTCAGT GGTGTGCTGTTGACCTGCGTGACGGCAACCAGGCTCTGATTGATCCGATGT CTCCTGAGCGTAAGCGCCGCATGTTTGAGCTGCTGGTTCAGATGGGCTTCA AAGAAATCGAGGTCGGTTTCCCTTCAGCTTCCCAGACTGATTTTGATTTCGT TCGTGAGATCATCGAAAAGGGCATGATCCCTGACGATGTCACCATTCAGGT TCTGGTTCAGGCTCGTGAGCACCTGATTCGCCGTACTTTTGAAGCTTGCGA AGGCGCAAAAAACGTTATCGTGCACTTCTACAACTCCACCTCCATCCTGCA GCGCAACGTGGTGTTCCGCATGGACAAGGTGCAGGTGAAGAAGCTGGCTA CCGATGCCGCTGAACTAATCAAGACCATCGCTCAGGATTACCCAGACACCA ACTGGCGCTGGCAGTACTCCCCTGAGTCCTTCACCGGCACTGAGGTTGAGT ACGCCAAGGAAGTTGTGGACGCAGTTGTTGAGGTCATGGATCCAACTCCT GAGAACCCAATGATCATCAACCTGCCTTCCACCGTTGAGATGATCACCCCT AACGTTTACGCAGACTCCATTGAATGGATGCACCGCAATCTAAACCGTCGT GATTCCATTATCCTGTCCCTGCACCCGCACAATGACCGTGGCACCGGCGTT GGCGCAGCTGAGCTGGGCTACATGGCTGGCGCTGACCGCATCGAAGGCTGCCTGTTCGGCAACGGCGAGCGCACCGGCAACGTCTGCCTGGTCACCCTGG CACTGAACATGCTGACCCAGGGCGTTGACCCTCAGCTGGACTTCACCGATA TACGCCAGATCCGCAGCACCGTTGAATACTGCAACCAGCTGCGCGTTCCTG AGCGCCACCCATACGGCGGTGACCTGGTCTTCACCGCTTTCTCCGGTTCCC ACCAGGACGCTGTGAACAAGGGTCTGGACGCCATGGCTGCCAAGGTTCAG CCAGGTGCTAGCTCCACTGAAGTTTCTTGGGAGCAGCTGCGCGACACCGA ATGGGAGGTTCCTTACCTGCCTATCGATCCAAAGGATGTCGGTCGCGACTA CGAGGCTGTTATCCGCGTGAACTCCCAGTCCGGCAAGGGCGGCGTTGCTTA CATCATGAAGACCGATCACGGTCTGCAGATCCCTCGCTCCATGCAGGTTGA GTTCTCCACCGTTGTCCAGAACGTCACCGACGCTGAGGGCGGCGAGGTCA ACTCCAAGGCAATGTGGGATATCTTCGCCACCGAGTACCTGGAGCGCACCG CACCAGTTGAGCAGATCGCGCTGCGCGTCGAGAACGCTCAGACCGAAAAC GAGGATGCATCCATCACCGCCGAGCTCATCCACAACGGCAAGGACGTCAC CGTCGATGGCCGCGGCAACGGCCCACTGGCCGCTTACGCCAACGCGCTGG AGAAGCTGGGCATCGACGTTGAGATCCAGGAATACAACCAGCACGCCCGC ACCTCGGGCGACGATGCAGAAGCAGCCGCCTACGTGCTGGCTGAGGTCAA CGGCCGCAAGGTCTGGGGCGTCGGCATCGCTGGCTCCATCACCTACGCTTC GCTGAAGGCAGTGACCTCCGCCGTAAACCGCGCGCTGGACGTCAACCACG AGGCAGTCCTGGCTGGCGGCGTTTAA

ilvBN原始基因具有序列表<400>5所示序列，其序列为：

<400>5

GTGAATGTGGCAGCTTCTCAACAGCCCACTCCCGCCACGGTTGCAAG CCGTGGTCGATCCGCCGCCCCTGAGCGGATGACAGGTGCAAAGGCAATTG TTCGATCGCTCGAGGAGCTTAACGCCGACATCGTGTTCGGTATTCCTGGTG GTGCGGTGCTACCGGTGTATGACCCGCTCTATTCCTCCACAAAGGTGCGCC ACGTCTTGGTGCGCCACGAGCAGGGCGCAGGCCACGCAGCAACCGGCTAC GCGCAGGTTACTGGACGCGTTGGCGTCTGCATTGCAACCTCTGGCCCAGGA GCAACCAACTTGGTTACCCCAATCGCTGATGCAAACTTGGACTCCGTTCCC ATGGTTGCCATCACCGGCCAGGTCGGAAGTGGCCTGCTGGGTACCGACGCT TTCCAGGAAGCCGATATCCGCGGCATCACCATGCCAGTGACCAAGCACAAC TTCATGGTCACCAACCCTAACGACATTCCACAGGCATTGGCTGAGGCATTC CACCTCGCGATTACTGGTCGCCCTGGCCCTGTTCTGGTGGATATTCCTAAGG ATGTCCAGAACGCTGAATTGGATTTCGTCTGGCCACCAAAGATCGACCTGC CAGGCTACCGCCCAGTTTCAACACCACATGCTCGCCAGATCGAGCAGGCA GTCAAGCTGATCGGTGAGGCCAAGAAGCCCGTCCTTTACGTTGGTGGTGG CGTAATCAAGGCTGACGCACACGAAGAGCTTCGTGCGTTCGCTGAGTACA CCGGCATCCCAGTTGTCACCACCTTGATGGCTTTGGGTACTTTCCCAGAGT CTCACGAGCTGCACATGGGTATGCCAGGCATGCATGGCACTGTGTCCGCTG TTGGTGCACTGCAGCGCAGCGACCTGCTGATTGCTATCGGCTCCCGCTTTG ATGACCGCGTCACCGGTGACGTTGACACCTTCGCGCCTGACGCCAAGATCATTCACGCCGACATTGATCCTGCCGAAATCGGCAAGATCAAGCAGGTTGAGG TTCCAATCGTGGGCGATGCCCGCGAAGTTCTTGCTCGTCTGCTGGAAACCA CCAAGGCAAGCAAGGCAGAGACCGAGGACATCTCCGAGTGGGTTGACTAC CTCAAGGGCCTCAAGGCACGTTTCCCGCGTGGCTACGACGAGCAGCCAGG CGATCTGCTGGCACCACAGTTTGTCATTGAAACCCTGTCCAAGGAAGTTGG CCCCGACGCAATTTACTGCGCCGGCGTTGGCCAGCACCAAATGTGGGCAG CTCAGTTCGTTGACTTTGAAAAGCCACGCACCTGGCTCAACTCCGGTGGA CTGGGCACCATGGGCTACGCAGTTCCTGCGGCCCTTGGAGCAAAGGCTGG CGCACCTGACAAGGAAGTCTGGGCTATCGACGGCGACGGCTGTTTCCAGA TGACCAACCAGGAACTCACCACCGCCGCAGTTGAAGGTTTCCCCATTAAGA TCGCACTAATCAACAACGGAAACCTGGGCATGGTTCGCCAATGGCAGACC CTATTCTATGAAGGACGGTACTCAAATACTAAACTTCGTAACCAGGGCGAGT ACATGCCCGACTTTGTTACCCTTTCTGAGGGACTTGGCTGTGTTGCCATCCG CGTCACCAAAGCGGAGGAAGTACTGCCAGCCATCCAAAAGGCTCGAGAGA TCAACGACCGCCCAGTAGTCATCGACTTCATCGTCGGTGAAGACGCACAG GTATGGCCAATGGTGTCTGCTGGATCATCCAACTCCGATATCCAGTACGCAC TCGGATTGCGCCCATTCTTTGATGGTGATGAATCTGCAGCAGAAGATCCTGC CGACATTCACGAAGCCGTCAGCGACATTGATGCCGCCGTTGAATCGACCGA GGCATAAATGGCTAATTCTGACGTCACCCGCCACATCCTGTCCGTACTCGTT CAGGACGTAGACGGAATCATTTCCCGCGTATCAGGTATGTTCACCCGACGC GCATTCAACCTCGTGTCCCTCGTGTCTGCAAAGACCGAAACACACGGCATC AACCGCATCACGGTTGTTGTCGACGCCGACGAGCTCAACATTGAGCAGATCACCAAGCAGCTCAACAAGCTGATCCCCGTGCTCAAAGTCGTGCGACTTGA TGAAGAGACCACTATCGCCCGCGCAATCATGCTGGTTAAGGTCTCTGCGGA CAGCACCAACCGTCCGCAGATCGTCGACGCCGCGAACATCTTCCGCGCCCGAGTCGTCGACGTGGCTCCAGACTCTGTGGTTATTGAATCCACAGGCACCC CAGGCAAGCTCCGCGCACTGCTTGACGTGATGGAACCATTCGGAATCCGC GAACTGATCCAATCCGGACAGATTGCACTCAACCGCGGTCCGAAGACCATGGCTCCGGCCAAGATCTAA。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 高产L-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1746

<212> DNA

<213> leuA突变基因(Unknown)

<400> 1

atgccagtta accgctacat gcctttcgag gttgaggtag aagatatttc tctgccggac 60

cgcacttggc cagataaaaa aatcaccgtt gcacctcagt ggtgtgctgt tgacctgcgt 120

gacggcaacc aggctctgat tgatccgatg tctcctgagc gtaagcgccg catgtttgag 180

ctgctggttc agatgggctt caaagaaatc gaggtcggtt tcccttcagc ttcccagact 240

gattttgatt tcgttcgtga gatcatcgaa aaggacatga tccctgacga tgtcaccatt 300

caggttctgg ttcaggctcg tgagcacctg attcgccgta cttttgaagc ttgcgaaggc 360

gcaaaaaacg ttatcgtgca cttctacaac tccacctcca tcctgcagcg caacgtggtg 420

ttccgcatgg acaaggtgca ggtgaagaag ctggctaccg atgccgctga actaatcaag 480

accatcgctc aggattaccc agacaccaac tggcgctggc agtactcccc tgagtccttc 540

accggcactg aggttgagta cgccaaggaa gttgtggacg cagttgttga ggtcatggat 600

ccaactcctg agaacccaat gatcatcaac ctgccttcca ccgttgagat gatcacccct 660

aacgtttacg cagactccat tgaatggatg caccgcaatc taaaccgtcg tgattccatt 720

atcctgtccc tgcacccgca caatgaccgt ggcaccggcg ttggcgcagc tgagctgggc 780

tacatggctg gcgctgaccg catcgaaggc tgcctgttcg gcaacggcga gcgcaccggc 840

aacgtctgcc tggtcaccct ggcactgaac atgctgaccc agggcgttga ccctcagctg 900

gacttcaccg atatacgcca gatccgcagc accgttgaat actgcaacca gctgcgcgtt 960

cctgagcgcc acccatacgg cggtgacctg gtcttcaccg ctttctccgg ttcccaccag 1020

gacgctgtga acaagggtct ggacgccatg gctgccaagg ttcagccagg tgctagctcc 1080

actgaagttt cttgggagca gctgcgcgac accgaatggg aggttcctta cctgcctatc 1140

gatccaaagg atgtcggtcg cgactacgag gctgttatcc gcgtgaactc ccagtccggc 1200

aagggcggcg ttgcttacat catgaagacc gatcacggtc tgcagatccc tcgctccatg 1260

caggttgagt tctccaccgt tgtccagaac gtcaccgacg ctgagggcgg cgaggtcaac 1320

tccaaggcaa tgtgggatat cttcgccacc gagtacctgg agcgcaccgc accagttgag 1380

cagatcgcgc tgcgcgtcga gaacgctcag accgaaaacg aggatgcatc catcaccgcc 1440

gagctcatcc acaacggcaa ggacgtcacc gtcgatggcc acggcaacgg cccactggcc 1500

gcttacgcca acgcgctgga gaagctgggc atcgacgttg agatccagga atacaaccag 1560

cacgcccgca cctcggacga cgatgcagaa gcagccgcct acgtgctggc tgaggtcaac 1620

ggccgcaagg tctggggcgt cggcatcgct ggctccatca cctacgcttc gctgaaggca 1680

gtgacctccg ccgtaaaccg cgcgctggac gtcaaccacg aggcagtcct ggctggcggc 1740

gtttaa 1746

<210> 2

<211> 2400

<212> DNA

<213> ilvBN突变基因(Unknown)

<400> 2

gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60

gccgcccctg agcggatgac aggtgcaaag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120

gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180

tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240

accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300

gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360

atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgacg ctttccagga agtcgatatc 420

cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480

ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540

gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600

gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660

aagctgatcg gtgaggccaa gaagcccgtc ctttacgttg gtagtggcgt aatcaaggct 720

gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780

ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840

catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900

tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960

attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020

gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080

gagaccgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140

cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200

tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260

gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320

accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380

gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440

gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500

cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560

ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620

gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680

ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740

ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800

gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860

gttgaatcga ccgaggcata aatggctaat tctgacgtca cccgccacat cctgtccgta 1920

ctcgttcagg acgtagacgg aatcatttcc cgcgtatcag gtatgttcac ccgacgcgca 1980

ttcaacctcg tgtccctcgt gtctgcaaag accgaaacac acggcatcaa ccgcatcacg 2040

gttgttgtcg acgccgacga gctcaacatt gagcagatca ccaagcagct caacaagctg 2100

atccccgtgc tcaaagtcgt gcgacttgat gaagagacca ctatcgcccg cgcaatcatg 2160

ctggttaagg tctctgcgga cagcaccaac cgtccgcaga tcgtcgacgc cgcgaacatc 2220

ttccgcgccc gagtcgtcga cgtggctcca gactctgtgg ttattgaatc cacaggcacc 2280

ccaggcaagc tccgcgcact gcttgacgtg atggaaccat tcggaatccg cgaactgatc 2340

caatccggac agattgcact caaccgcggt ccgaagacca tggctccggc caagatctaa 2400

<210> 3

<211> 350

<212> DNA

<213> 柠檬酸合成酶特异性启动子Pcp_2928序列(Unknown)

<400> 3

aggatgagga aaaatccgat gttgagtacc cacggtgcac agatttcact aacgattctg 60

gccgcaagct cactgagact tcttttgttt tggtcagttg tcacgatctc caaccatata 120

gtgtccgatt tcccctctcc cgttgactgt ggttcaacca caggatccat ccagttttcc 180

gtcatagggg gtactttccc aaagttatgt tttgccaatt cattcgatag atcctcgcaa 240

aaagtgcaca atacccactt tgcaagaatt acaaacgggg gcaccctcaa tgacttgaaa 300

cactttattg agtagaaagt gagtcacgac actttttaaa ggaggatgct 350

<210> 4

<211> 1746

<212> DNA

<213> leuA原始基因具有序列表(Unknown)

<400> 4

atgccagtta accgctacat gcctttcgag gttgaggtag aagatatttc tctgccggac 60

cgcacttggc cagataaaaa aatcaccgtt gcacctcagt ggtgtgctgt tgacctgcgt 120

gacggcaacc aggctctgat tgatccgatg tctcctgagc gtaagcgccg catgtttgag 180

ctgctggttc agatgggctt caaagaaatc gaggtcggtt tcccttcagc ttcccagact 240

gattttgatt tcgttcgtga gatcatcgaa aagggcatga tccctgacga tgtcaccatt 300

caggttctgg ttcaggctcg tgagcacctg attcgccgta cttttgaagc ttgcgaaggc 360

gcaaaaaacg ttatcgtgca cttctacaac tccacctcca tcctgcagcg caacgtggtg 420

ttccgcatgg acaaggtgca ggtgaagaag ctggctaccg atgccgctga actaatcaag 480

accatcgctc aggattaccc agacaccaac tggcgctggc agtactcccc tgagtccttc 540

accggcactg aggttgagta cgccaaggaa gttgtggacg cagttgttga ggtcatggat 600

ccaactcctg agaacccaat gatcatcaac ctgccttcca ccgttgagat gatcacccct 660

aacgtttacg cagactccat tgaatggatg caccgcaatc taaaccgtcg tgattccatt 720

atcctgtccc tgcacccgca caatgaccgt ggcaccggcg ttggcgcagc tgagctgggc 780

tacatggctg gcgctgaccg catcgaaggc tgcctgttcg gcaacggcga gcgcaccggc 840

aacgtctgcc tggtcaccct ggcactgaac atgctgaccc agggcgttga ccctcagctg 900

gacttcaccg atatacgcca gatccgcagc accgttgaat actgcaacca gctgcgcgtt 960

cctgagcgcc acccatacgg cggtgacctg gtcttcaccg ctttctccgg ttcccaccag 1020

gacgctgtga acaagggtct ggacgccatg gctgccaagg ttcagccagg tgctagctcc 1080

actgaagttt cttgggagca gctgcgcgac accgaatggg aggttcctta cctgcctatc 1140

gatccaaagg atgtcggtcg cgactacgag gctgttatcc gcgtgaactc ccagtccggc 1200

aagggcggcg ttgcttacat catgaagacc gatcacggtc tgcagatccc tcgctccatg 1260

caggttgagt tctccaccgt tgtccagaac gtcaccgacg ctgagggcgg cgaggtcaac 1320

tccaaggcaa tgtgggatat cttcgccacc gagtacctgg agcgcaccgc accagttgag 1380

cagatcgcgc tgcgcgtcga gaacgctcag accgaaaacg aggatgcatc catcaccgcc 1440

gagctcatcc acaacggcaa ggacgtcacc gtcgatggcc gcggcaacgg cccactggcc 1500

gcttacgcca acgcgctgga gaagctgggc atcgacgttg agatccagga atacaaccag 1560

cacgcccgca cctcgggcga cgatgcagaa gcagccgcct acgtgctggc tgaggtcaac 1620

ggccgcaagg tctggggcgt cggcatcgct ggctccatca cctacgcttc gctgaaggca 1680

gtgacctccg ccgtaaaccg cgcgctggac gtcaaccacg aggcagtcct ggctggcggc 1740

gtttaa 1746

<210> 5

<211> 2400

<212> DNA

<213> ilvBN原始基因具有序列表(Unknown)

<400> 5

gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60

gccgcccctg agcggatgac aggtgcaaag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120

gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180

tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240

accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300

gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360

atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgacg ctttccagga agccgatatc 420

cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480

ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540

gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600

gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660

aagctgatcg gtgaggccaa gaagcccgtc ctttacgttg gtggtggcgt aatcaaggct 720

gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780

ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840

catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900

tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960

attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020

gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080

gagaccgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140

cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200

tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260

gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320

accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380

gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440

gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500

cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560

ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620

gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680

ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740

ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800

gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860

gttgaatcga ccgaggcata aatggctaat tctgacgtca cccgccacat cctgtccgta 1920

ctcgttcagg acgtagacgg aatcatttcc cgcgtatcag gtatgttcac ccgacgcgca 1980

ttcaacctcg tgtccctcgt gtctgcaaag accgaaacac acggcatcaa ccgcatcacg 2040

gttgttgtcg acgccgacga gctcaacatt gagcagatca ccaagcagct caacaagctg 2100

atccccgtgc tcaaagtcgt gcgacttgat gaagagacca ctatcgcccg cgcaatcatg 2160

ctggttaagg tctctgcgga cagcaccaac cgtccgcaga tcgtcgacgc cgcgaacatc 2220

ttccgcgccc gagtcgtcga cgtggctcca gactctgtgg ttattgaatc cacaggcacc 2280

ccaggcaagc tccgcgcact gcttgacgtg atggaaccat tcggaatccg cgaactgatc 2340

caatccggac agattgcact caaccgcggt ccgaagacca tggctccggc caagatctaa 2400

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> UP-leuA*-F(Unknown)

<400> 6

ctatgacatg attacgaatt cgttgcctca gatgcgttgg g 41

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> UP-leuA*-R(Unknown)

<400> 7

tttccttcgg atctaaacga tctcgtcact atcaagtcca gcc 43

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> Ptuf-leuA*-F(Unknown)

<400> 8

ggctggactt gatagtgacg agatcgttta gatccgaagg aaa 43

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> Ptuf-leuA*-R(Unknown)

<400> 9

attgaggagc cacgctgctg gacttcgtgg tggctacga 39

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> leuA*-F(Unknown)

<400> 10

tcgtagccac cacgaagtcc agcagcgtgg ctcctcaat 39

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> leuA*-R(Unknown)

<400> 11

cgtcgtcatc ttcttcagag tcatggtttg tagagcctag gggga 45

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> DOWN-leuA*-F(Unknown)

<400> 12

tccccctagg ctctacaaac catgactctg aagaagatga cgacg 45

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> DOWN-leuA*-R(Unknown)

<400> 13

cgactctaga ggatccccgg gtcaccatcc gcatcaccag 40

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> JD(leuA*)-U(F)(Unknown)

<400> 14

cggttactgg ttcggcttca 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> JD(leuA*)-D(F)(Unknown)

<400> 15

gtgacctccg ccgtaaacc 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> JD(leuA*)-D(R)(Unknown)

<400> 16

caaaagcgtc ttccccacc 19

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> UP-ilvBN*-F(Unknown)

<400> 17

ctatgacatg attacgaatt cgagcaagtc aacgatagta aagataatg 49

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> UP-ilvBN*-R(Unknown)

<400> 18

cgatattaaa cagcgctacg aagaaagatc gtttagatcc gaaggaaa 48

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> Ptuf-ilvBN*-F(Unknown)

<400> 19

cgatattaaa cagcgctacg aagaaagatc gtttagatcc gaaggaaa 48

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> Ptuf- ilvBN*-R(Unknown)

<400> 20

gttgagaagc tgccacattc actcctcctg gacttcgtgg tg 42

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> ilvBN*-F(Unknown)

<400> 21

caccacgaag tccaggagga gtgaatgtgg cagcttctca ac 42

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> ilvBN*-R(Unknown)

<400> 22

aactcggtgg ggaaacctct tagatcttgg ccggagcc 38

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> DOWN- ilvBN*-F(Unknown)

<400> 23

ggctccggcc aagatctaag aggtttcccc accgagtt 38

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> DOWN- ilvBN*-R(Unknown)

<400> 24

acgacggcca gtgccaagct tgaactaccg tccctttttg tcact 45

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> JD(ilvBN*)-U(F)(Unknown)

<400> 25

gaaatcactg atgagtagtt t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> JD(ilvBN*)-U(R)(Unknown)

<400> 26

gctaccccac ttaccctacg c 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> JD(ilvBN*)-D(F)(Unknown)

<400> 27

gaaatcactg atgagtagtt t 21

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> JD(ilvBN*)-D(F)(Unknown)

<400> 28

ctcaacaagc tgatccccgt gct 23

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> UP-PCP_2928-F(Unknown)

<400> 29

ctatgacatg attacgaatt ccggattgaa cccacgacgt 40

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213> UP-PCP_2928-R(Unknown)

<400> 30

acatcggatt tttcctcatc ctcaaggatg ggtgccgagt ag 42

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> PCP_2928-F(Unknown)

<400> 31

ctactcggca cccatccttg aggatgagga aaaatccgat gt 42

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> PCP_2928-R(Unknown)

<400> 32

ccacgatatc cctttcaaac atagcatcct cctttaaaaa gtgtcg 46

<210> 33

<211> 46

<212> DNA

<213> DOWN-PCP_2928-F(Unknown)

<400> 33

cgacactttt taaaggagga tgctatgttt gaaagggata tcgtgg 46

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> DOWN-PCP_2928-R(Unknown)

<400> 34

acgacggcca gtgccaagct tgtcctcgtc cagaagggtg tg 42

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> JD(PCP_2928)-U(F)(Unknown)

<400> 35

gaggttgcgt tatagggtgg c 21

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> JD(PCP_2928)-U(R)(Unknown)

<400> 36

ctatgacgga aaactggatg gat 23

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> JD(PCP_2928)-D(F)(Unknown)

<400> 37

tcccctctcc cgttgactg 19

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> JD(PCP_2928)-D(R)(Unknown)

<400> 38

cagccagcat tggaaccttt 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> JD-pK18mobsacB-F(Unknown)

<400> 39

cacgacaggt ttcccgactg g 21

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> JD-pK18mobsacB-R(Unknown)

<400> 40

ctgttgggaa gggcgatcgg 20

Claims

1.一种L-亮氨酸合成途径中异丙基苹果酸合酶编码突变基因，其特征在于：基因序列见序列表SEQ ID NO.1所示。

2.一种L-亮氨酸合成途径中乙酰羟酸合酶编码突变基因，其特征在于：基因序列见序列表SEQ ID NO.2所示。

3.一种L-亮氨酸合成途径中柠檬酸合成酶特异性启动子Pcp_2928序列，其特征在于：基因序列见序列表SEQ ID NO.3所示。

4.一株高产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于：包括权利要求1所述的异丙基苹果酸合酶编码突变基因，包括权利要求2所述的乙酰羟酸合酶编码突变基因，包括权利要求3所述的柠檬酸合成酶特异性启动子Pcp_2928。

5.一株高产L-亮氨酸的基因工程菌构建方法，其特征在于：步骤如下，

⑴将leuA突变基因整合至cgl1135假基因位点，leuA突变基因见SEQ ID NO.1；

⑶Pcp_2928特异性启动子替换柠檬酸合酶原始启动子，Pcp_2928特异性启动子序列见SEQ ID NO.3。

6.一种L-亮氨酸的发酵方法，其特征在于：采用权利要求4所述的基因工程菌，按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在32℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80g/L的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5g/L；发酵周期50h。