CN108913642B - 大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产l-色氨酸与l-缬氨酸的用途 - Google Patents

大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产l-色氨酸与l-缬氨酸的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种同步高产L‑色氨酸与L‑缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其用途。所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再将Ptrc启动子控制的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点获得。利用该菌株进行摇瓶发酵可在22‑28h内积累L‑色氨酸达10‑14g/L，同时缬氨酸积累量达5‑7g/L，总产酸能力比色氨酸生产菌株提高了50％左右，同时菌体OD600相差不大，不存在生长问题，但单位菌体产酸能力明显提高了120％，大大提高了碳源和细胞的有效利用。

Description

大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸 的用途
技术领域
本发明涉及一株大肠杆菌基因工程菌以及利用其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途，属于微生物代谢调控和基因工程技术领域。
背景技术
L-色氨酸与L-缬氨酸，同属于八种必需氨基酸，因其营养价值，已被广泛用于饲料、食品和药品等领域。色氨酸与缬氨酸的生产方法包括化学合成法、酶反应法、发酵法等，但随着基因工程手段的逐渐完善，利用微生物直接发酵法来生产色氨酸或缬氨酸得到迅速发展，该方法以葡萄糖等低价原料为碳源经微生物发酵生产得到目的产物，生产成本较低，生产工艺相对简单可控。
最初诱变育种是氨基酸生产菌株获得的常规手段，随着基因组测序技术的兴起，人们将获得的生产菌株进行测序，得到氨基酸合成途径中已解除反馈抑制的关键酶的基因序列，这为后续代谢工程手段改造大肠杆菌生产氨基酸提供了基础。L-色氨酸的合成代谢途径长而复杂，涉及的前体物较多，很难在野生菌株中积累，色氨酸合成途径涉及到糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(HMP)，经代谢工程手段强化色氨酸合成途径仅是大肠杆菌生产L-色氨酸生产菌株构建的基础，寻找并实现EMP、TCA和HMP途径之间的动态平衡才可避免因能量失衡带来的各种问题。Lin Chen和An-Ping Zeng等人(Rationaldesign and metabolic analysis of Escherichia coli for effective production ofL-tryptophan at high concentration[J].Appl Microbiol Biotechnol,2017,101(2):559-568.)以大肠杆菌W3110为出发菌株，敲除或失活了aroF、aroG、mtr、tnaA、tnaB等基因，同时将带有点突变且解除了反馈抑制的基因aroG(S180F)和serA(H344A，N364A)组成受Ptac调控的操纵子整合至基因组，最后经发酵罐测试，色氨酸可积累27g/L左右，但在发酵时间达36h后，菌体的单位耗糖及产酸能力比原来降低70％左右，文中也并未对其原因进行分析。
相较于L-色氨酸，L-缬氨酸的合成途径相对简短直接，丙酮酸为缬氨酸合成的唯一前体物，经第一个关键酶乙酰乳酸合酶(AHAS)催化，进入缬氨酸合成途径，再经三步反应便得到L-缬氨酸。以大肠杆菌为出发菌株构建L-缬氨酸生产菌株，找到高酶活的可解除缬氨酸反馈抑制的AHAS，提高中间代谢物的传递效率是关键，韩国人Sang Yup Lee等人(Fed-Batch Culture of Escherichia coli for L-Valine Production Based on In SilicoFlux Response Analysis[J].Biotechnology&Bioengineering,2011,108(4):934.)通过对AHAS中的调节亚基(ilvH)引入特定的点突变，解除缬氨酸对AHAS的反馈抑制，缬氨酸产量明显提升，但是丙酮酸供应是进一步提高缬氨酸产量的瓶颈，因丙酮酸是胞内重要的中间代谢产物，其主要的代谢去向是经丙酮酸脱氢酶复合体催化为乙酰CoA，最终进入TCA循环，为细胞生长提供能量。合理分配丙酮酸的代谢流向，在提高缬氨酸产量的同时避免菌体因能量供应不足生长受阻是在构建缬氨酸生产菌株时需解决的问题。
大肠杆菌作为基因工程的重要宿主，其遗传背景清楚，基因操作系统完善，代谢改造大肠杆菌使其成为L-色氨酸生产菌株已成为主流趋势。目前研究L-色氨酸生产菌株代谢改造大部分都是增加PEP和E4P的供给，强化L-色氨酸的合成途径，但是，色氨酸途径的加强，PEP经羧化酶反应成草酰乙酸的代谢流势必会减弱，同时，L-色氨酸合成途径中，分支酸经酶催化为邻氨基苯甲酸会伴随有一分子丙酮酸生成，草酰乙酸供应不足，TCA循环受阻，丙酮酸因不能及时代谢而大量积累，容易造成多种副产物的产生，最终影响细胞生长及目的产物的积累。
发明内容
本发明目的是实现大肠杆菌发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸，经代谢工程手段对大肠杆菌L-色氨酸生产菌株中L-缬氨酸合成途径中相关基因进行改造，构建一株可同时生产L-色氨酸、L-缬氨酸的基因工程菌株，充分利用L-色氨酸生物合成途径中生成的丙酮酸来合成第二目的产物-L-缬氨酸，不仅在一定程度上解决了因丙酮酸过剩造成的多种副产物积累，同时大大提高了碳源利用率，最终利用其可以实现L-色氨酸和L-缬氨酸的不携带质粒、不添加抗生素、安全、快速、高效的生产，实现碳源的高效利用。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
采用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母缩写形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如trpE(S40F)，表示trpE基因所编码的氨基酸序列位置40的氨基酸由亲本的丝氨酸(S)替换成苯丙氨酸(F)。如serA(H344A,N364A)，表示位置344和位置364的氨基酸都发生了突变。
为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是提供一株同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，概述如下：首先是构建一株能快速高效生产L-色氨酸的基因工程菌E.coli TRP04，在大肠杆菌的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的来自嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)优化后的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再以E.coli TRP04为出发菌株，进一步将Ptrc强启动子控制的来自枯草芽孢杆菌的编码乙酰乳酸合酶的基因(alsS)整合至yghx假基因位点，最终得到菌株TV01。代谢简图见附图1。
所述大肠杆菌的出发菌株优选为E.coli W3110。
上述基因工程菌的构建步骤概述如下：
(1)采用大肠杆菌CRISPR/Cas基因编辑技术，以E.coli W3110为出发菌株，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入解反馈抑制的trpE(S40F)基因，强化色氨酸操纵子合成酶系的同时解除关键酶邻氨基苯甲酸合成酶的反馈抑制作用；
(2)将Ptrc启动子控制的解反馈抑制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点，强化关键酶3-脱氧阿拉伯糖庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的同时解除其反馈抑制作用；
(3)将Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点，增加前体物L-丝氨酸合成的同时解除其反馈抑制作用；
(4)将Plac启动子控制的优化后的glnA基因整合至ycjV假基因位点，增加前体物L-谷氨酰胺的供应；
(5)将Ptrc启动子控制的来自枯草芽孢杆菌的alsS基因整合至yghx假基因位点，强化缬氨酸合成途径，构建基因工程菌E.coli TV01。
所述trpE(S40F)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
所述aroG(S180F)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
所述serA(H344A,N364A)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
所述优化后的glnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
本发明的技术方案之二是利用上述基因工程菌株E.coli TV01发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸中的应用。
利用上述基因工程菌进行摇瓶发酵如下：
将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1mL60％(m/v)葡萄糖溶液)；发酵22-28h。
优选的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 2-6g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2g/L，Yeast Extract(酵母提取物)1-5g/L，柠檬酸1-4g/L，L-苯丙氨酸0.1-0.5g/L，L-酪氨酸0.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O 30-60mg/L，MnSO4·7H2O 1-5mg/L，，VH0.1-0.5mg/L，VB10.5-1.0mg/L，微量元素混合液1-3ml/L，苯酚红15-30g/L，余量为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽锅灭菌15min；
所述微量元素混合液组分为：Na2MoO4·2H2O 2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，H3BO3 0.125g/L。
利用该菌株进行摇瓶发酵可在22-28h内积累L-色氨酸达10-14g/L，同时缬氨酸积累量达5-7g/L，总产酸能力比色氨酸生产菌株E.coli TRP04的产酸能力(10-12g/L)提高了50％左右，同时菌体OD600与菌株E.coli TRP04相差不大，不存在生长问题，但单位菌体产酸能力明显提高了120％，大大提高了碳源和细胞的有效利用。发酵过程曲线见附图2与附图3。
有益效果：
本发明提供的L-色氨酸、L-缬氨酸共发酵基因工程菌株可同时积累两种氨基酸。色氨酸生物合成途径中分支酸经酶催化为对氨基苯甲酸时，伴随着一分子丙酮酸的生成，同时草酰乙酸供应不足，胞内丙酮酸的大量积累容易造成副产物乙酸的积累，进而引起发酵提前结束。丙酮酸为L-缬氨酸合成的直接前体物，在色氨酸生产菌中强化缬氨酸合成途径，可高效利用丙酮酸合成L-缬氨酸，不仅提高了总酸的产率，而且避免了因丙酮酸大量积累引起的不利于发酵过程顺利进行的因素。且该菌株遗传背景清晰，基因操作简单高效，方便对其进行进一步性状改良。本发明提供的经代谢工程改造在TRP04菌株中引入来自枯草芽孢杆菌的基因alsS不仅可以有效积累L-色氨酸，同时也可有效积累L-缬氨酸，摇瓶发酵22-28h内生产L-色氨酸达10-14g/L，缬氨酸积累量达5-7g/L，较色氨酸生产菌株E.coliTRP04的产酸能力提高至少50％，同时菌体OD600与菌株E.coli TRP04相差不大，不存在生长问题，但单位菌体产酸能力明显提高了120％，大大提高了碳源和细胞的有效利用。此外，至今尚未有利用大肠杆菌发酵同步生产色氨酸与缬氨酸的相关报道。
附图说明
图1：L-色氨酸与L-缬氨酸共发酵简图。
图2：菌株E.coli TV01与菌株E.coli TPR04发酵过程曲线
图3：菌体OD及单位细胞产酸图。
图4：Ptrc trpE(S40F)基因替换片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂；2：trpE(S40F)和下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段；5：原菌对照。
图5：Ptrc aroG(S180F)基因整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂；2：aroG(S180F)基因片段；3下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图6：Plac serA(H344A,N364A)基因整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNAmarker；1：上游同源臂；2：serA(H344A,N364A)基因片段；3下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图7：Plac glnA基因整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：glnA基因片段；3下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图8：Ptrc alsS基因整合片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：alsS基因片段；3下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图9：L-色氨酸浓度标准曲线。
图10：L-缬氨酸浓度标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指体积百分比；溶液的百分比“％(m/v)”指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1：构建L-色氨酸与L-缬氨酸同步发酵的大肠杆菌基因工程菌TV01
1.基因编辑的方法
本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9meditated genomeediting.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒分别为pREDCas9和pGRB，其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。
该方法的具体步骤如下：
1.1 pGRB质粒构建
构建质粒pGRB的目的是为了转录相应的gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段同源重组的方法构建pGRB质粒。
1.1.1靶序列设计
使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)
1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备
设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：
退火体系
Figure BDA0001745515590000061
1.1.3线性载体的制备
载体的线性化采用反向PCR扩增的方法。
1.1.4重组反应
重组体系如下表。所用重组酶均为
Figure BDA0001745515590000062
II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。
重组体系
Figure BDA0001745515590000063
1.1.5质粒的转化
取10μL反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。
1.1.6克隆鉴定
将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，测序验证。
1.2重组DNA片段的制备
用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件primer5，以待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500bp)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR的体系和方法如下表：
HS酶PCR扩增体系
Figure BDA0001745515590000071
Ex.taq酶PCR扩增体系
Figure BDA0001745515590000072
重叠PCR的体系如下表：
HS酶重叠PCR扩增体系
Figure BDA0001745515590000073
注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。
Ex.taq酶重叠PCR扩增体系
Figure BDA0001745515590000081
注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。
PCR反应条件：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
1.3质粒和重组DNA片段的转化
1.3.1pREDCas9的转化
利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至W3110的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。
1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备
32℃培养至OD600＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD600＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
1.3.3pGRB和重组DNA片段的转化
将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。
1.4质粒的消除
1.4.1 pGRB的消除
将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
1.4.2 pREDCas9质粒的消除
将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
2.L-色氨酸工程菌株E.coli TRP04的基因工程组合改造过程
2.1色氨酸操纵子启动子替换的同时引入trpE(S40F)突变
2.1.1构建含trpE(S40F)突变的T载体
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据trpE基因及其上下游序列设计trpE(S40F)突变上游同源臂引物(trpE(S40F)-1，trpE(S40F)-2)，和trpE(S40F)突变下游同源臂引物(trpE(S40F)-3，trpE(S40F)-4)，其中trpE(S40F)-2，trpE(S40F)-3同时含突变序列(TCC突变为TTT)且反向互补，并用Ex.taq酶PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过Ex.taq酶重叠PCR的方法获得含trpE(S40F)突变的片段(上游同源臂-下游同源臂)。将所获片段和T载体按摩尔比4:1混合(总量不超过100ng)，加入5μL的solution I连接酶，加水补至10μL体系，16℃连接1h后，按1.1.5所示方法操作挑选阳性转化子，提取质粒送测序确定成功构建T载-trpE(S40F)。
2.1.2改造色氨酸操纵子
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据trpE基因上游序列设计上游同源臂引物(trpE(S40F)-1，trpE(S40F)-5)；以T载-trpE(S40F)为模板，根据序列设计下游同源臂引物(trpE(S40F)-6、trpE(S40F)-4)，其中，trc启动子序列设计添加在引物trpE(S40F)-5和trpE(S40F)-6上，用HS酶PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过HS酶重叠PCR的方法获得Ptrc trpE(S40F)基因的替换片段(上游同源臂-Ptrc trpE(S40F)-下游同源臂)。构建pGRB-trpL(基因trpL位于色氨酸操纵子启动子上游，编码色氨酸操纵子前导肽)使用的含靶序列的DNA片段通过引物pGRB-trpL-F和pGRB-trpL-R的退火制得。制备E.coli W3110的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli TRP01。Ptrc trpE(S40F)基因替换片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中，上游同源臂的长度应为620bp，下游同源臂(包括trpE(S40F))的长度应为875bp，Ptrc trpE(S40F)基因替换片段的总长应为1570bp，PCR验证时，将鉴定引物(trpE(S40F)-7)设计在Ptrc启动子序列内部，阳性菌PCR扩增片段长度应为667bp，原菌PCR应无条带。
2.2 Ptrc aroG(S180F)基因整合至基因组tyrR位点
2.2.1构建含aroG(S180F)突变的T载体
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据aroG基因及其上下游序列设计aroG(S180F)突变上游同源臂引物(aroG(S180F)-1，aroG(S180F)-2)，和aroG(S180F)突变下游同源臂引物(aroG(S180F)-3，aroG(S180F)-4)，其中aroG(S180F)-2，aroG(S180F)-3同时含突变序列(TCT突变为TTT)且反向互补，并用Ex.taq酶PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过Ex.taq酶重叠PCR的方法获得含aroG(S180F)突变的片段(上游同源臂-下游同源臂)。将所获片段和T载体按摩尔比4:1混合(总量不超过100ng)，加入5μL的solution I连接酶，加水补至10μL体系，16℃连接1h后，按1.1.5所示方法操作挑选阳性转化子，提取质粒送测序确定成功构建T载-aroG(S180F)。
2.2.2 Ptrc aroG(S180F)基因的整合
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据tyrR基因的上下游序列设计上游同源臂引物(tyrR-1、tyrR-2)和下游同源臂引物(tyrR-3、tyrR-4)，以构建的T载-aroG(S180F)为模板，根据aroG基因的序列设计引物(aroG(S180F)-5，aroG(S180F)-6，其中，trc启动子序列设计添加在引物tyrR-2和aroG(S180F)-5上，用HS酶PCR扩增Ptrc aroG(S180F)基因片段。上述片段通过HS酶重叠PCR的方法获得Ptrc aroG(S180F)基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc aroG(S180F)-下游同源臂)。构建pGRB-tyrR使用的含靶序列的DNA片段通过引物pGRB-tyrR-F和pGRB-tyrR-R的退火制得。制备E.coli TRP01的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli TRP02。Ptrc aroG(S180F)基因整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中，上游同源臂的长度应为347bp，下游同源臂的长度应为507bp，Ptrc aroG(S180F)基因片段的长度应为1285bp，Ptrc aroG(S180F)基因整合片段的全部长度应为2139bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2139bp，原菌PCR扩增片段长度应为1493bp。
2.3 Plac serA(H344A,N364A)基因整合至基因组yjiV位点
2.3.1构建含serA(H344A,N364A)突变的T载体
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据serA基因及其上下游序列设计serA(H344A)突变上游同源臂引物(serA(H344A)-1，serA(H344A)-2)和serA(H344A)突变下游同源臂引物(serA(H344A)-3，serA(H344A)-4)，其中serA(H344A)-2，serA(H344A)-3同时含突变序列(CAC突变为GCC)且反向互补，并用Ex.taq酶PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过Ex.taq酶重叠PCR的方法获得含serA(H344A)突变的片段(上游同源臂-下游同源臂)。将所获片段和T载体按摩尔比4:1混合(总量不超过100ng)，加入5μL的solution I连接酶，加水补至10μL体系，16℃连接1h后，按1.1.5所示方法操作挑选阳性转化子，提取质粒送测序确定成功构建T载-serA(H344A)。
以T载-serA(H344A)为模板，根据serA基因及其上下游序列设计serA(N364A)突变上游同源臂引物(serA(H344A)-1，serA(N364A)-1)和serA(N364A)突变下游同源臂引物(serA(N364A)-2，serA(H344A)-4)，其中serA(N364A)-1，serA(N364A)-2同时含突变序列(AAC突变为GCC)且反向互补，并用Ex.taq酶PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过Ex.taq酶重叠PCR的方法获得含serA(H344A,N364A)突变的片段(上游同源臂-下游同源臂)。将所获片段和T载体按摩尔比4:1混合(总量不超过100ng)，加入5μL的solution I连接酶，加水补至10μL体系，16℃连接1h后，按1.1.5所示方法操作挑选阳性转化子，提取质粒送测序确定成功构建T载-serA(H344A,N364A)。
2.3.2 Plac serA(H344A,N364A)基因的整合
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据yjiV基因的上下游序列设计上游同源臂引物(yjiV-1、yjiV-2)和下游同源臂引物(yjiV-3、yjiV-4)；以T载-serA(H344A,N364A)为模板，根据其序列设计引物(serA(H344A,N364A)-1，serA(H344A,N364A)-2)，其中，lac启动子序列设计添加在引物yjiV-2和serA(H344A,N364A)-1上，用HS酶PCR扩增PlacserA(H344A,N364A)基因片段。上述片段通过HS酶重叠PCR的方法获得Plac serA(H344A,N364A)基因的整合片段(上游同源臂-Plac serA(H344A,N364A)-下游同源臂)。构建pGRB-yjiV使用的含靶序列的DNA片段通过引物pGRB-yjiV-F和pGRB-yjiV-R的退火制得。制备E.coli TRP02的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli TRP03。Plac serA(H344A,N364A)基因整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6。其中，上游同源臂的长度应为505bp，下游同源臂的长度应为581bp，Plac serA(H344A,N364A)基因片段的长度应为1379bp，Plac serA(H344A,N364A)基因整合片段的全部长度应为2503bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2503bp，原菌PCR扩增片段长度应为2252bp。
2.4引入来自嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的谷氨酰胺合成酶基因(glnA)
2.4.1glnA基因合成
根据NCBI中的GENBANK上公布的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)谷氨酰胺合成酶编码基因序列，用大肠杆菌中常用密码子软件对其进行密码子优化(密码子优化前后的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4所示)，使其可以在大肠杆菌中高效转录。将优化后序列送到金唯智公司进行合成，得到带有glnA基因的重组质粒pUC57glnA，其中酶切位点为Hind III和BamH I，其保存在大肠杆菌中。
2.4.2 Plac glnA整合至基因组ycjV假基因位点
以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据ycjV假基因的上下游序列设计上游同源臂引物(ycjV-1、ycjV-2)、下游同源臂引物(ycjV-3、ycjV-4)，以重组质粒pUC57glnA为模板，根据其序列设计Plac glnA片段引物(glnA-1，glnA-2)，并用HS酶PCR扩增其上下游同源臂片段和Plac glnA片段。上述片段通过HS酶重叠PCR的方法获得PlacglnA基因的整合片段(上游同源臂-Plac glnA-下游同源臂)。构建pGRB-ycjV使用的含靶序列的DNA片段通过引物pGRB-ycjV-F和pGRB-ycjV-R的退火制得。制备E.coli TRP03的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli TRP04。Plac glnA基因整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图7。其中，上游同源臂的长度应为452bp，下游同源臂的长度应为558bp，Ptrc glnA基因片段的长度应为1414bp，Plac glnA基因整合片段的全部长度应为2424bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2424bp，原菌PCR扩增片段长度应为1859bp。
3.强化缬氨酸合成途径构建基因工程菌E.coli TV01
3.1 Ptrc alsS基因整合至基因组yghx位点
以E.coli W3110(ATCC 7325)基因组为模板，根据yghx基因的上下游序列设计上游同源臂引物(yghx-1、yghx-2)和下游同源臂引物(yghx-5、yghx-6)，并用HS酶PCR扩增其上下游同源臂片段；以Bacillus subtilis 168(ATCC 23857)基因组为模板，根据其alsS基因(Gene ID:936852)设计引物yghx-3，yghx-4，用HS酶PCR扩增Ptrc alsS片段，其中，引物yghx-2与yghx-3包含Ptrc启动子部分，引物yghx-4与yghx-5包含终止子部分。上述片段通过HS酶重叠PCR的方法获得Ptrc alsS基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc alsS-下游同源臂)。构建pGRB-yghx使用的含靶序列的DNA片段通过引物pGRB-yghx-F和pGRB-yghx-R退火得到。制备E.coli TRP04的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli TV01。Ptrc alsS基因整合成功得到的阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图8，其中，Ptrc alsS基因整合片段的全部长度应为2985bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2985bp，原菌PCR扩增片段长度应为1765bp。
4.菌株改造过程中所涉及的引物如下表1所示：
Figure BDA0001745515590000121
Figure BDA0001745515590000131
Figure BDA0001745515590000141
实施例2：利用大肠杆菌基因工程菌TV01摇瓶发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸
利用大肠杆菌基因工程菌进行摇瓶发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的具体操作如下：
斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；
摇瓶种子培养：用接种环刮取二环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养8-10h；
摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1mL 60％(m/v)葡萄糖溶液)；发酵周期22-28h。
活化斜面培养基组分为：葡萄糖1-3g/L，Tryptone(胰蛋白胨)5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，Yeast Extract(酵母提取物)2-5g/L，NaCl 2-5g/L，琼脂15-30g/L，其余为水，pH7.0-7.2,121℃高压蒸汽锅灭菌20min；
种子培养基组分为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2g/L，Yeast Extract(酵母提取物)2-5g/L，柠檬酸1-5g/L，L-苯丙氨酸0.1-0.5g/L，L-酪氨酸0.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O 1-3mg/L，MnSO4·H2O 1-3mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB10.5-1.0mg/L，微量元素混合液1-3ml/L，苯酚红15-30g/L，其余为水，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽锅灭菌15min；
发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，Yeast Extract(酵母提取物)3g/L，柠檬酸2g/L，L-苯丙氨酸0.3g/L，L-酪氨酸0.3g/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，MnSO4·7H2O 3mg/L，，VH 0.3mg/L，VB1 0.8mg/L，微量元素混合液2ml/L，苯酚红20g/L，其余为水，pH 7.0，115℃高压蒸汽锅灭菌15min。
所述微量元素混合液组分为：Na2MoO4·2H2O 2.5g/L，AlCl3·6H2O 2.5g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75g/L，CaCl2·2H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5g/L，CuCl2·2H2O 0.25g/L，H3BO3 0.125g/L。
利用本发明基因工程菌E.coli TV01该菌株进行摇瓶发酵24h后积累L-色氨酸达14g/L，同时缬氨酸积累量达7g/L，总产酸能力相比同等条件下色氨酸生产菌E.coli TRP04的产酸能力(L-色氨酸产量12g/L)提高了75％左右，同时菌体OD600与菌株E.coli TRP04相差不大，单位菌体产酸能力明显提高。
发酵液中L-色氨酸浓度测定：收集发酵液1mL，13000rpm离心1min，收集上清液。使用去离子水将收集上清液稀释至一定倍数(稀释至0.1-0.5g/L)，经0.22μm微孔过滤后用液相检测L-色氨酸含量，其色谱条件为：色谱柱Agilent C18柱(250mm×460mm,5μm)，流动相为10％乙腈溶液，流速1.0mL/min，柱温40℃，检测波长278nm，进样量为20μL，出峰时间约为3.752min，根据其峰面积按绘制的标准曲线计算得到发酵液中L-色氨酸的浓度。
L-色氨酸标准曲线的绘制：分别取L-色氨酸浓度为0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L的溶液，按照上述色谱条件用液相测定得到相应浓度的L-色氨酸对应的峰面积，绘制得到L-色氨酸浓度与其峰面积的相关标准曲线如附图9所示。
发酵液中L-缬氨酸浓度测定：
收集发酵液1mL，13000rpm离心1min，收集上清液。并进行衍生操作，衍生操作流程如表2，最后经0.22μm微孔过滤后用液相检测L-缬氨酸含量，其色谱条件为：色谱柱AgilentC18柱(250mm×460mm,5μm)，流动相为50％乙腈溶液，50mmol/L乙酸钠，流速1.0mL/min，柱温33℃，检测波长360nm，进样量为20μL，出峰时间约为16..952min，根据其峰面积按绘制的标准曲线计算得到发酵液中L-缬氨酸的浓度；
表2：衍生操作流程
Figure BDA0001745515590000151
L-缬氨酸标准曲线的绘制：分别取L-缬氨酸浓度为0.05g/L，0.1g/L，0.5g/L和1g/L的溶液，按照上述色谱条件用液相测定得到相应浓度的L-缬氨酸对应的峰面积，绘制得到L-缬氨酸浓度与其峰面积的相关标准曲线如附图10所示。
虽然上述已公开了本发明较佳的实施方式，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途
<141> 2018-07-27
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1563
<212> DNA
<213> E. coli W3110
<400> 1
atgcaaacac aaaaaccgac tctcgaactg ctaacctgcg aaggcgctta tcgcgacaat 60
cccaccgcgc tttttcacca gttgtgtggg gatcgtccgg caacgctgct gctggaattt 120
gcagatatcg acagcaaaga tgatttaaaa agcctgctgc tggtagacag tgcgctgcgc 180
attacagctt taggtgacac tgtcacaatc caggcacttt ccggcaacgg cgaagccctc 240
ctggcactac tggataacgc cctgcctgcg ggtgtggaaa gtgaacaatc accaaactgc 300
cgtgtgctgc gcttcccccc tgtcagtcca ctgctggatg aagacgcccg cttatgctcc 360
ctttcggttt ttgacgcttt ccgtttattg cagaatctgt tgaatgtacc gaaggaagaa 420
cgagaagcca tgttcttcgg cggcctgttc tcttatgacc ttgtggcggg atttgaagat 480
ttaccgcaac tgtcagcgga aaataactgc cctgatttct gtttttatct cgctgaaacg 540
ctgatggtga ttgaccatca gaaaaaaagc acccgtattc aggccagcct gtttgctccg 600
aatgaagaag aaaaacaacg tctcactgct cgcctgaacg aactacgtca gcaactgacc 660
gaagccgcgc cgccgctgcc agtggtttcc gtgccgcata tgcgttgtga atgtaatcag 720
agcgatgaag agttcggtgg cgtagtgcgt ttgttgcaaa aagcgattcg cgctggagaa 780
attttccagg tggtgccatc tcgccgtttc tctctgccct gcccgtcacc gctggcggcc 840
tattacgtgc tgaaaaagag taatcccagc ccgtacatgt tttttatgca ggataatgat 900
ttcaccctat ttggcgcgtc gccggaaagc tcgctcaagt atgatgccac cagccgccag 960
attgagatct acccgattgc cggaacacgc ccacgcggtc gtcgcgccga tggttcactg 1020
gacagagatc tcgacagccg tattgaactg gaaatgcgta ccgatcataa agagctgtct 1080
gaacatctga tgctggttga tctcgcccgt aatgatctgg cacgcatttg cacccccggc 1140
agccgctacg tcgccgatct caccaaagtt gaccgttatt cctatgtgat gcacctcgtc 1200
tctcgcgtag tcggcgaact gcgtcacgat cttgacgccc tgcacgctta tcgcgcctgt 1260
atgaatatgg ggacgttaag cggtgcgccg aaagtacgcg ctatgcagtt aattgccgag 1320
gcggaaggtc gtcgccgcgg cagctacggc ggcgcggtag gttatttcac cgcgcatggc 1380
gatctcgaca cctgcattgt gatccgctcg gcgctggtgg aaaacggtat cgccaccgtg 1440
caagcgggtg ctggtgtagt ccttgattct gttccgcagt cggaagccga cgaaacccgt 1500
aacaaagccc gcgctgtact gcgcgctatt gccaccgcgc atcatgcaca ggagactttc 1560
tga 1563
<210> 2
<211> 1053
<212> DNA
<213> E. coli W3110
<400> 2
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggcttttt 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg ttcgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
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<210> 3
<211> 1233
<212> DNA
<213> E. coli W3110
<400> 3
atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60
caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120
gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180
tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240
tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300
gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360
ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420
aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480
catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540
gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600
ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660
atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720
ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780
gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840
ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900
caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960
acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacggtgg gcgtcgtctg 1020
atgcacatcg ccgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080
cagggcgtcg ccatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140
attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200
ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233
<210> 4
<211> 1338
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 4
atgtccaaac agtacaccgc cgaggagatt aagaccgaag tcgaggataa gaatgtgcgc 60
tttctccgcc tgtgctttac cgacatcaac ggcaccgaga aagcagtgga ggtccctacc 120
tcccagctgg acaaggtcct gaccaacgac atccgcttcg atggctcttc tatcgacggc 180
ttcgtgcgcc tcgaagagtc cgacatggtc ctgtacccag atttctccac ctggtccgtg 240
ctgccatggg gcgatgaaca cggcggtaag atcggccgcc tcatctgttc cgtgcacacc 300
accgacggca aggcattcgc aggtgatcca cgcaacaacc tcaaacgcgt gatcggcgaa 360
atggaaaacg ccggcttcga tgccttcgat attggtttcg agatggagtt tcacctgttc 420
aagctggacg acaacggcaa ctggactacc gaggtgccag atcacgcatc ctacttcgac 480
atgacctctg atgatgaagg cgcacgctgc cgccgtgaga tcgtggagac cctggaggat 540
atgggtttcg aagtggaagc cgcccaccat gaagtcggcg atggccagca ggaaatcgac 600
ttccgcttcg ataacgccct ggcaaccgcc gatcgctgcc agaccttcaa gatggtggcc 660
cgcactattg cacgcaagca tggcctcttc gcaaccttca tggccaagcc actggagggt 720
caggccggta acggcatgca caacaatatg tctctcttca agggtaagaa aaacgtgttc 780
tacgacaagg atggcgagtt ccacctgtcc gacaccgccc tgtactttct gaacggcatc 840
ctggagcacg cccgcgcaat tactgccatc ggcaacccaa ccgtaaacag ctacaagcgc 900
ctcatccctg gttacgaagc accatgctat atcgcctggg ccgcaaagaa ccgctctcca 960
ctcgtgcgta tcccatccgc aggcgaaatc aacacccgcc tggaaatgcg ctccgcagat 1020
ccaaccgcca atccatacct gctgctcgcc gcatgcctca cggcggggct gaacggtatt 1080
aaggagcaga aaatgcctat gaagccagtg gaggagaaca tcttcgagat gaccgaagag 1140
gaacgcgcca agaagggcat caagccactg cctactaccc tccacaatgc cgtcaaagcc 1200
ttcaaggagg acgatctcat caagtccgca ctgggtgatc acctgacccg ctcttttatc 1260
gagtccaagg agctggagtg gtccaaatac tcccagtccg tgtccgactg ggaacgccaa 1320
cgctacatga attggtaa 1338
<210> 5
<211> 1338
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 5
atgagtaaac aatacactgc agaagaaatt aaaacagaag ttgaagataa gaacgttaga 60
tttttacgtt tatgcttcac tgatattaac ggtactgaaa aggcagttga agtaccaact 120
agtcaattag ataaagtatt gaccaacgac attcgctttg acggatcatc aattgatgga 180
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ttaccatggg gtgatgaaca cggcggcaag atcggtcgtt tgatttgttc agttcacaca 300
actgatggta aagcttttgc aggtgatcca agaaataact tgaaacgagt tattggtgaa 360
atggaaaatg caggctttga tgcatttgac attggttttg aaatggaatt ccacctcttc 420
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cgcaccattg ctagaaaaca cggtttgttt gctacattta tggctaagcc tcttgaaggt 720
caagctggta acgggatgca caacaacatg tcactcttta agggtaagaa gaacgtattc 780
tacgacaaag atggtgaatt ccacctttca gatactgctc tttatttctt gaatggtatt 840
ttggaacatg ctcgtgcaat tactgcaatt ggtaacccaa ctgttaactc atacaagcgt 900
ttaattccag gttacgaagc accttgttac attgcttggg ctgctaagaa ccgttcacca 960
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gaaagagcaa agaagggtat taagccatta ccaactactc ttcacaacgc agttaaggca 1200
tttaaggaag atgatttaat taagagtgca ttaggtgatc acttaactcg cagctttatt 1260
gaatccaagg aattggaatg gtctaagtat tcacaatcag tttcagattg ggaacgtcaa 1320
cgttacatga actggtaa 1338

Claims (4)

1.一种同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌E. coli W3110的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再将Ptrc启动子控制的核苷酸序列如Gene ID: 936852所示的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点，获得基因工程菌。
2.权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌用于发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：
将菌种活化后制备种子液，按10-15%接种量接种到装有发酵培养基的500 mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1 mL60%（m/v）葡萄糖溶液；发酵周期22-28 h；
所述发酵培养基组成为：葡萄糖20-40 g/L，(NH4)2SO4 2-6 g/L，KH2PO4 1-5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2 g/L，酵母提取物1-5 g/L，柠檬酸1-4 g/L，L-苯丙氨酸0.1-0.5 g/L，L-酪氨酸0.1-0.5 g/L， FeSO4·7H2O 30-60 mg/L，MnSO4·7H2O 1-5 mg/L，VH 0.1-0.5 mg/L，VB10.5-1.0 mg/L，微量元素混合液1-3 ml/L，苯酚红15-30 g/L，余量为水，pH 7.0-7.2，115℃ 高压蒸汽锅灭菌15 min；所述微量元素混合液组分为：Na2MoO4·2H2O 2.5 g/L，AlCl3·6H2O 2.5 g/L，NiSO4·6H2O 2.5g/L，CoCl2·6H2O 1.75 g/L，CaCl2·2 H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 0.5 g/L，CuCl2·2 H2O 0.25 g/L，H3BO3 0.125g/L。
4.一种同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，步骤如下
（1）采用大肠杆菌CRISPR/Cas基因编辑技术，以E. coli W3110为出发菌株，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)基因，所述trpE(S40F)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；
（2）将Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点，所述aroG(S180F)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；
（3）将Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点，所述serA(H344A,N364A)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；
（4）将Plac启动子控制的嗜酸乳杆菌glnA基因整合至ycjV假基因位点，所述glnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；
（5）将Ptrc启动子控制的核苷酸序列如Gene ID: 936852所示的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点，获得基因工程菌。
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