CN106414715B - L-赖氨酸生产率提高的微生物及用其生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种由于分泌蛋白失活而具有提高的L‑赖氨酸生产率的棒状杆菌属微生物及利用它进行的L‑赖氨酸生产方法。
Description
技术领域
本发明涉及具有提高的L-赖氨酸生产率的微生物及利用它进行的L-赖氨酸生产方法。
背景技术
在动物饲料、人类医药品及化妆品产业中使用L-赖氨酸，且通过利用棒状杆菌属菌株或埃希氏菌属菌株进行发酵而生产L-赖氨酸。近来，正在进行各种研究以开发高效生产菌株及发酵工程技术。
对生产啤酒和红酒的酵母进行用于调节发酵过程中所产生的气泡的各种研究的过程中，在最近的研究中发现了影响气泡的产生的基因(AWA1、FPG1、CFG1)(Shimoi H.等，2002，Appl.Environ.Microbiol.68:2018-25；Blasco L.等，Yeast.2011，28:437-51；Blasco L.等，J.Agric.Food Chem.2012，60:10796-07)。其中，推究出了如下事实：与亲本菌株相比，在这些基因遭失活的菌株中所产生的气泡显著减少，而与此相反地，在这些基因被过量表达的菌株中所产生的气泡有所增加。
在培养酵母时，通过如下的一系列过程产生气泡。首先，在发酵时所产生的微细气泡中掺杂有酵母甘露糖蛋白(mannoprotein)。此时，气泡内部被疏水性位点占据，气泡外部被亲水性位点占据。由于这种结果而导致培养液的粘性增加，不仅掺杂有多种蛋白质，而且还掺杂有细胞，从而产生气泡(Swart CW.等，FEMS Yeast Res.2012，12:867-69)。
在利用酵母的啤酒生产中需要产生适量的气泡，但在用于大量生产氨基酸等有用产物的微生物发酵中需要抑制气泡的产生。当在培养过程中产生过量气泡时，由于增加培养液的粘性而降低培养液内的传氧速率(Oxygen Transfer Rate，OTR)，严重时还有可能诱发菌体的溶解(lysis)。此外，从产业层面来看，用于抑制气泡产生的过量消泡剂的使用可能会成为提高制造成本的负担因素，且有可能带来阻碍菌体生长的负面影响。
鉴于此，本发明人以棒状杆菌属菌株为对象，筛选出影响过量气泡的产生的基因，并确认可通过从基因层面有效地控制气泡的产生而提高L-赖氨酸生产率，以致于完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种具有提高的L-赖氨酸生产率的棒状杆菌属微生物。
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述棒状杆菌属微生物来生产L-赖氨酸的方法。
技术方案
为了实现如上所述的目的，本发明的一方面提供一种选自由序列号1、7及13的氨基酸序列组成的组中的至少一个的分泌蛋白失活的棒状杆菌属微生物。
本发明的另一方面提供一种通过培养上述棒状杆菌属微生物而生产L-赖氨酸的方法。
发明效果
根据本发明的微生物为由于涉及气泡产生的分泌蛋白失活而具有提高的L-赖氨酸生产率的菌株。若利用该菌株，能够减少气泡的产生，因此在不进行工艺设备的增设或不投入附加的大量消泡剂的情况下，能够增加可培养的生产量。此外，从产业层面来看，有望实现生产的简便性及制造成本的降低等效果，从而能够有效地生产L-赖氨酸。
具体实施方式
下面，对本发明进行详细说明。
作为一方面，本发明提供一种选自由序列号1、7及13的氨基酸序列组成的组中的至少一个的分泌蛋白失活的棒状杆菌属微生物。
当用于生产L-赖氨酸的大量培养过程中产生过量气泡时，由于会增加培养液的粘性而降低培养液内的传氧速率(Oxygen Transfer Rate，OTR)，严重时还有可能诱发菌体的溶解(lysis)。即，从抑制气泡的产生的层面来看，认为使作为气泡产生的原因的分泌蛋白失活的方式对赖氨酸的生产有利。
因此，在本发明的一实施方式中，为了筛选作为赖氨酸生产中所不必要的气泡产生的原因的主要分泌蛋白以改善L-赖氨酸生产发酵工艺，培养谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(上述微生物曾以KFCC10881被公开之后，被重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构，并且授予的登记号为KCCM11016P；韩国授权专利第10-0159812号)之后，通过仅分离发酵过程中生成的气泡而确保了缩氨酸。通过对这样确保的缩氨酸进行分析而从中选择检测量相对最多的三种蛋白质，筛选出由编号为NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912(由NCBI(美国国家生物技术信息中心)针对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032所赋予的编号)的基因编码的缩氨酸。
在本发明中，由上述NCgl0336基因编码的缩氨酸为棒状杆菌属微生物内存在的酯酶。具体而言，上述缩氨酸可包含序列号1的氨基酸，且只要是作为本发明中公开的分泌蛋白而具有酯酶活性的蛋白质，对上述序列号1的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、优选为具有90％以上的同源性的氨基酸序列、更优选为具有95％以上的同源性的氨基酸序列、特别优选为具有97％以上的同源性的氨基酸序列也包含在本发明中。此外，由于微生物的物种或菌株的不同而在呈现上述活性的蛋白质的氨基酸序列之间有可能存在差异，因此并不限于此。只要是作为与上述序列具有同源性的序列而实质上具有与序列号1的氨基酸序列相同或相应的生物学活性的氨基酸序列，则即使是存在部分序列的缺失、变形、置换或附加的氨基酸序列也属于本发明的范围，这是显而易见的。
在本发明中，上述NCgl0336基因具有序列号2的核苷酸序列，且对上述序列号2的核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列、优选为具有90％以上的同源性的核苷酸序列、更优选为具有95％以上的同源性的核苷酸序列、特别优选为具有97％以上的同源性的核苷酸序列也包含在本发明中。此外，起因于基因密码的简并性(genetic codedegeneracy)，对相同氨基酸序列进行编码的上述序列的变异体也包含在本发明中。此外，对本发明的NCgl0336进行编码的多核苷酸在严格条件(stringent conditions)下可与序列号2的核苷酸序列或源于上述核苷酸序列的探针(probe)杂交，并且该多核苷酸可以是对正常发挥功能的NCgl0336进行编码的变异型。
在本发明中，由上述NCgl0717基因编码的缩氨酸为棒状杆菌属微生物内存在的酯酶。具体而言，上述缩氨酸可包含序列号7的氨基酸，且只要是作为本发明中公开的分泌蛋白而具有酯酶活性的蛋白质，对上述序列号7的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、优选为具有90％以上的同源性的氨基酸序列、更优选为具有95％以上的同源性的氨基酸序列、特别优选为具有97％以上的同源性的氨基酸序列也包含在本发明中。此外，由于微生物的物种或菌株的不同而在呈现上述活性的蛋白质的氨基酸序列之间有可能存在差异，因此并不限于此。只要是作为与上述序列具有同源性的序列而实质上具有与序列号7的氨基酸序列相同或相应的生物学活性的氨基酸序列，则即使是存在部分序列的缺失、变形、置换或附加的氨基酸序列也属于本发明的范围，这是显而易见的。
在本发明中，上述NCgl0717基因具有序列号8的核苷酸序列，且对上述序列号8的核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列，优选为具有90％以上的同源性的核苷酸序列、更优选为具有95％以上的同源性的核苷酸序列、特别优选为具有97％以上的同源性的核苷酸序列也包含在本发明中。此外，起因于基因密码的简并性(genetic codedegeneracy)，对相同氨基酸序列进行编码的上述序列的变异体也包含在本发明中。此外，对本发明的NCgl0717进行编码的多核苷酸在严格条件(stringent conditions)下可与序列号8的核苷酸序列或源于上述核苷酸序列的探针(probe)杂交，并且该多核苷酸可以是对正常发挥功能的NCgl0717进行编码的变异型。
在本发明中，由上述NCgl2912基因编码的缩氨酸为棒状杆菌属微生物内存在的酯酶。具体而言，上述缩氨酸可包含序列号13的氨基酸，且只要是作为本发明中公开的分泌蛋白而具有酯酶活性的蛋白质，对上述序列号13的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列、优选为具有90％以上的同源性的氨基酸序列、更优选为具有95％以上的同源性的氨基酸序列、特别优选为具有97％以上的同源性的氨基酸序列也包含在本发明中。此外，由于微生物的物种或菌株的不同而在呈现上述活性的蛋白质氨基酸序列之间有可能存在差异，因此并不限于此。只要是作为与上述序列具有同源性的序列而实质上具有与序列号13的氨基酸序列相同或相应的生物学活性的氨基酸序列，则即使是存在部分序列的缺失、变形、置换或附加的氨基酸序列也属于本发明的范围，这是显而易见的。
在本发明中，上述NCgl2912基因具有序列号14的核苷酸序列，且对上述序列号14的核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列、优选为具有90％以上的同源性的核苷酸序列、更优选为具有95％以上的同源性的核苷酸序列、特别优选为具有97％以上的同源性的核苷酸序列也包含在本发明中。此外，起因于基因密码的简并性(genetic codedegeneracy)，对相同氨基酸序列进行编码的上述序列的变异体也包含在本发明中。此外，对本发明的NCgl2912进行编码的多核苷酸在严格条件(stringent conditions)下可与序列号14的核苷酸序列或源于上述核苷酸序列的探针(probe)杂交，并且该多核苷酸可以是对正常发挥功能的NCgl2912进行编码的变异型。
本发明中的术语“同源性”是指与指定的氨基酸序列或碱基序列一致的程度，可用百分比来表示。在本明细中，具有与指定的氨基酸序列或碱基序列相同或类似的活性的其同源性序列用“％同源性”来表示。关于上述氨基酸序列的同源性，例如可使用文献记载的算法BLAST[参照：Karlin及Altschul，Pro.Natl.Acad.Sci.(美国国家科学院学报)USA，90，5873(1993)]或由Pearson发表的FASTA[参照：Methods Enzymol.(酶学方法)，183，63(1990)]来确定。基于该算法BLAST，还开发出了被称作BLASTN或BLASTX的程序[参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov]。
本发明中的术语“严格条件”是指能够进行多核苷酸之间的特异性杂交的条件。例如，在文献(J.Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南),2nd Edition(第二版),Cold Spring Harbor Laboratory press(美国冷泉港实验室),Cold Spring Harbor(冷泉港),New York(纽约),1989；F.M.Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术),John Wiley&Sons,Inc.(约翰·威利父子出版公司),New York(纽约))中具体记载了这种严格条件。
本发明中的术语“失活”可通过本领域众所周知的任意失活方法来实现。在本发明中，失活是指生成内源基因的表达与野生菌株相比减少至较低水准或完全不会表达的基因以及即使表达也没有其活性或具有减少的活性的基因，且可通过采用缺失、置换、插入以使基因的整体或部分碱基序列或者该基因的整体或部分表达调控序列变异而实现失活，或者通过它们的组合而实现失活。
具体而言，通过利用重组载体对棒状杆菌属微生物进行转化以使內源基因缺失或突变，从而可制造上述內源基因的活性失活的微生物，其中，上述重组载体包含内部丢失上述内源基因的开放阅读框的基因片段。可通过本领域众所周知的任意方法来向染色体内插入上述基因。
本说明书中的术语“內源”酶及活性是指微生物或细胞中本来存在的天然状态的酶及其活性。即，是指该酶及活性变异之前的酶及其活性。
本发明中的术语“重组载体”是指含有对目标蛋白质进行编码的多核苷酸碱基序列的DNA构建体，其中，上述多核苷酸碱基序列被连接至适当的调控序列上以能够发挥功能，从而在适当的宿主内表达目标蛋白质。上述调控序列包含能够开始转录的启动子、用于调节这种转录的任意操纵序列、对适当的mRNA核糖体结合位点进行编码的序列、以及调控转录及解读终止的序列。载体被转化到适当的宿主内之后，能够在不受宿主基因组的影响的情况下被复制或发挥其功能，并且也可以整合到基因组本身。只要本发明中所使用的载体能够在宿主中被复制就并不特别限定，且可利用本领域众所周知的任意载体。
在上述重组载体的制备中使用的载体可以是天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒及噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体可使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A及Charon21A等，作为质粒载体可使用pDZ载体、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及pET系等。可使用的载体并不特别限定，可使用公知的表达载体。
本发明中的术语“转化”是指通过将包含对目标蛋白质进行编码的多核苷酸的载体导入到宿主细胞内，从而在宿主细胞内能够使由上述多核苷酸所编码的蛋白质表达。只要导入的多核苷酸能够在宿主细胞内表达，就可被插入并位于宿主细胞染色体内或位于染色体外。此外，上述多核苷酸包含对目标蛋白质进行编码的DNA及RNA。只要上述多核苷酸能够被导入到宿主细胞内并表达，则可以以任何形态被导入。例如，上述多核苷酸可以以具备自行表达所需要的所有因素的多核苷酸结构体的形态，即表达盒(expression cassette)的形态被导入到宿主细胞内。上述表达盒通常包含被连接到上述基因的开放阅读框(openreading frame，以下简称“ORF”)上以能够发挥功能的启动子(promoter)、转录终止信号、核糖体结合点位以及翻译终止信号。上述表达盒可以是能够进行自我复制的表达载体的形态。此外，上述多核苷酸也可以以其自身形态被导入到宿主细胞内而在宿主细胞中与表达所需要的序列连接以能够发挥功能。
如果导入上述重组载体的亲本菌株为能够生产L-赖氨酸的微生物，则可无限制地使用，具体而言可使用棒状杆菌属或短杆菌属微生物，更具体而言可使用谷氨酸棒状杆菌微生物。
本发明中的术语“能够生产L-赖氨酸的微生物”可以是通过调控通常公知的基因以使得能够生产L-赖氨酸而获取的微生物，例如可以是通过插入选自由涉及L-赖氨酸生产的、棒状杆菌属微生物内存在的aspB(对天冬氨酸转氨酶进行编码的基因)、lysC(对天冬氨酸激酶进行编码的基因)，asd(对天冬氨酸盐半醛脱氢酶进行编码的基因)、dapA(对二氢吡啶二羧酸合成酶进行编码的基因)、dapB(对二氢吡啶二羧酸还原酶进行编码的基因)及lysA(对二氨基庚二酸脱羧酶进行编码的基因)组成的组中的基因中的一个或多个而获取的微生物，或者可以是对导入L-亮氨酸营养缺陷性的变异菌株进行N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理而获取的微生物。
更具体而言，在本发明中作为棒状杆菌属微生物，使用谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(上述微生物曾以KFCC10881被公开之后，被重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构，并且授予的登记号为KCCM11016P；韩国授权专利第10-0159812号)、谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国授权专利第10-0924065号)、谷氨酸棒状杆菌L-赖氨酸生产菌株KCCM11347P(上述微生物曾以KFCC10750被公开之后，被重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构，并且授予的登记号为KCCM11347；韩国授权专利第10-0073610号)及谷氨酸棒状杆菌CJ3P菌株(Binder等，Genome Biology(基因组生物学)2012，13:R40)，但并不限于此。
在本发明的优选实施方式中，根据本发明的经转化的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(KCCM11502P、KCCM11481P、KCCM11482P)。
作为另一方面，本发明还提供一种利用上述经转化的微生物生产L-赖氨酸的方法。更具体而言，提供一种生产L-赖氨酸的方法，其包括以下步骤：通过培养本发明的微生物而在培养物或细胞中生产L-赖氨酸；以及从上述培养物中回收L-赖氨酸。
在本发明的方法中，棒状杆菌属微生物的培养可使用本领域众所周知的任意培养条件及培养方法。
作为能够用于培养棒状杆菌属微生物的培养基，例如可使用在美国细菌学会的普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology by the AmericanSociety for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)中公开的培养基。
作为培养基中可使用的糖原，包括：诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等的糖和碳水化物；诸如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等的油和脂类；诸如软脂酸、硬脂酸、亚油酸等的脂肪酸；诸如甘油、乙醇等的醇类；以及诸如乙酸等的有机酸类。这些物质可单独或混合使用。
作为培养基中可使用的氮源，包含蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉及尿素或者如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵等的无机化合物。氮源也可以单独或混合使用。
作为培养基中可使用的磷源，包含磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。此外，培养基应包含诸如硫酸镁或硫酸铁等的生长所需要的金属盐。最后，在上述物质的基础上可使用如氨基酸及维生素等的必要生长物质。此外，可以在培养基中加入适当的前体。在培养过程中，上述原料可通过适当的方式分批或连续被加入到培养物中。
在上述微生物的培养中，可通过以适当方式使用诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨等的基础化合物或诸如磷酸或磺酸等的酸式化合物来调节培养物的PH。此外，可通过使用诸如聚乙二醇脂肪酸酯等的消泡剂来抑制气泡的生成。可通过向培养物内导入氧气或含氧气体(例如，空气)，使培养基保持有氧条件。培养物的温度通常为20℃至45℃，优选为25℃至45℃。培养时间可持续到直至获得所需的L-氨基酸的生成量为止，但优选为10至160小时。
在本发明的方法中，培养可通过诸如分批工艺、注入分批及反复注入分批工艺等的连续方式或分批方式来实现。这种培养方法在本领域中被广为人知，从而可使用任意方法。
下面，通过实施例对本发明进行更详细说明。但是，这些实施例用于示例性地说明本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。
[实施例]
实施例1：筛选与培养中的气泡产生有关的分泌蛋白
在本实施例中，以筛选作为气泡产生原因的分泌蛋白为目的，通过以下方法进行了实验。
首先，将谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P(上述微生物曾以KFCC10881被公开之后，被重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构，并且授予的登记号为KCCM11016P；韩国授权专利第10-0159812号)菌株在1L发酵槽中培养之后，仅分离发酵过程中生成的气泡，并将该气泡转移到15ml试验管中后进行浓缩。
为了对气泡浓缩样品中所包含的蛋白质进行鉴定，将包含界面活性剂的适量染色剂(loading dye)混合到样品中，之后使用8％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)，并通过考马斯蓝染色法(coomassie blue staining)对结束电泳后的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行染色。然后，切开已染色的蛋白条带(band)的位点且进行胰蛋白酶处理以确保缩氨酸，并通过LC-MS/MS方法来分析已确保的缩氨酸的氨基酸序列。
通过由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLAST检索，使用棒状杆菌属微生物中存在的基因来对分析完的缩氨酸进行鉴定。通过从已鉴定的缩氨酸中选择出检测量相对多的三种而最终筛选该蛋白质的基因，且筛选出的基因的NCBI编号为NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912。
实施例2：制备用于使分泌蛋白NCgl0336基因失活的重组质粒
为了在棒状杆菌染色体中制备能够使NCgl0336基因失活的重组质粒，根据已上报至美国国立卫生研究院基因银行(NIH Genbank)的碱基序列，确保NCgl0336的序列号1的氨基酸及序列号2的核苷酸序列。为了制备NCgl0336的内部丢失开放阅读框(open readingframe)的基因片段，以上述序列号2为基础分别制备序列号为3至6的引物。
序列号3：5'-atcctctagagtcgacGAAGCCTCTGCACCTCGCTG-3'
序列号4：5'-TATAGTTCGGTTCCGCGTCTCCAACGCATCCGGCC-3'
序列号5：5'-CGGAACCGAACTATACCACCGAGGGACGCATTCTC-3'
序列号6：5'-atgcctgcaggtcgacGCTCAAACGCACGAGCGAAG-3'
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，并将序列号3及序列号4、序列号5及序列号6用作引物，进行聚合酶链式反应(PCR)[Sambrook等，Molecular Cloning，aLaboratory Manual(分子克隆实验指南)(1989)，Cold Spring Harbor Laboratories(美国冷泉港实验室)]。PCR条件为反复进行如下过程30次：95℃下进行变性30秒钟；50℃下进行退火30秒钟；以及72℃下进行聚合反应1分钟。
其结果，获得了包含342bp和315bp的NCgl0336基因位点的两对DNA片段，即NCgl0336-A及NCgl0336-B。通过使用Infusion克隆试剂盒(Invitrogen)而将用PCR扩增的上述DNA片段接合到pDZ质粒(韩国授权专利第10-0924065号)之后，转化到大肠杆菌DH5α中，并涂抹到包含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR筛选出被转化为插入有目标基因的质粒的菌落之后，利用公知的质粒提取法来获取质粒，并将该质粒命名为pDZ-ΔNCgl0336。pDZ-ΔNCgl033中丢失了NCgl0336的基因503bp。
实施例3：制备用于使分泌蛋白NCgl0717基因失活的重组质粒
为了在棒状杆菌染色体中制备能够使NCgl0717基因失活的重组质粒，根据已上报至美国国立卫生研究院基因银行(NIH Genbank)的碱基序列，确保NCgl0717的序列号7的氨基酸及序列号8的核苷酸序列。为了制备NCgl0717的内部丢失开放阅读框(open readingframe)的基因片段，以上述序列号8为基础分别制备序列号为9至12的引物。
序列号9：5'-CCGGGGATCCTCTAGAGTTCGCGGATAAATGGG-3'
序列号10：5'-CACGTGAAATTCAGGTCGCGTGGTTCACCTCCGAAG-3'
序列号11：5'-CTTCGGAGGTGAACCACGCGACCTGAATTTCACGTG-3'
序列号12：5'-GCAGGTCGACTCTAGAGGTCCCATGATTGTTCTG-3'
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，并将序列号9及序列号10、序列号11及序列号12用作引物，进行PCR。PCR条件为反复进行如下过程30次：95℃下进行变性30秒钟；50℃下进行退火30秒钟；以及72℃下进行聚合反应1分钟。
其结果，获得了包含493bp和491bp的NCgl0717基因位点的两对DNA片段，即NCgl0717-A及NCgl0717-B。通过使用Infusion克隆试剂盒(Invitrogen)而将用PCR扩增的上述DNA片段接合到pDZ质粒之后，转化到大肠杆菌DH5α中，并涂抹到包含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR筛选出被转化为插入有目标基因的质粒的菌落之后，利用公知的质粒提取法来获取质粒，并将该质粒命名为pDZ-ΔNCgl0717。pDZ-ΔNCgl0717中丢失了NCgl0717的基因786bp。
实施例4：制备用于使分泌蛋白NCgl2912基因失活的重组质粒
为了在棒状杆菌染色体中制备能够使NCgl2912基因失活的重组质粒，根据已上报至美国国立卫生研究院基因银行(NIH Genbank)的碱基序列，确保NCgl2912的序列号13的氨基酸及序列号14的核苷酸序列。为了制备NCgl2912的内部丢失开放阅读框(openreading frame)的基因片段，以上述序列号14为基础分别制备序列号为15至18的引物。
序列号15：5'-CCGGGGATCCTCTAGAGCTGCAAGAAGTGCGAC-3'
序列号16：5'-CTCGTAGTCGCTAGCACCTATTACGGGAGGTC-3'
序列号17：5'-GACCTCCCGTAATAGGTGCTAGCGACTACGAG-3'
序列号18：5'-GCAGGTCGACTCTAGACCCGAGCTATCTAACAC-3'
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，并将序列号15及序列号16、序列号17及序列号18用作引物，进行PCR。PCR条件为反复进行如下过程30次：95℃下进行变性30秒钟；50℃下进行退火30秒钟；以及72℃下进行聚合反应1分钟。
其结果，获得了包含444bp和636bp的NCgl2912基因位点的两对DNA片段，即NCgl2912-A及NCgl2912-B。通过使用Infusion克隆试剂盒(Invitrogen)而将用PCR扩增的上述DNA片段接合到pDZ质粒之后，转化到大肠杆菌DH5α中，并涂抹到包含25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。通过PCR筛选出被转化为插入有目标基因的质粒的菌落之后，利用公知的质粒提取法来获取质粒，并将该质粒命名为pDZ-ΔNCgl2912。pDZ-ΔNCgl2912中丢失了NCgl2912的基因128bp。
实施例5：制备及评价源于赖氨酸生产菌株KCCM11016P的分泌蛋白基因失活的菌株
利用电脉冲法将由上述实施例2、3及4制备的三种重组质粒(pDZ-ΔNCgl0336、pDZ-ΔNCgl0717及pDZ-ΔNCgl2912)分别转化到谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P中，并利用PCR方法制备目标基因通过同源重组而在染色体中失活的菌株，而且分别命名为KCCM11016P-ΔNCgl0336、KCCM11016P-ΔNCgl0717、KCCM11016P-ΔNCgl2912。
将上述三种菌株和对照组接种到含有下述25ml种子培养基的250ml角挡板瓶(corner-baffle flask)中，并在30℃下以200rpm振荡培养20小时。然后，将1ml种子培养液接种到含有下述24ml生产培养基的250ml角挡板瓶中，并在37℃下以200rpm振荡培养96小时。上述种子培养基和生产培养基的组成分别如下所述。
<种子培养基(pH 7.0)>
葡萄糖20g、(NH4)2SO4 10g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺素HCl 1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺2000μg(以1升蒸馏水为基准)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、固体玉米浸出物(cornsteep solid)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、氯化硫胺1000μg、泛酸钙2000μg、烟酰胺3000μg、CaCO3 30g(以1升蒸馏水为基准)
在完成培养之后，通过将培养液转移到量筒而测定已生成的气泡的高度，并将利用HPLC(高效液相色谱)分析的L-赖氨酸浓度示出到下述表1中。表1的结果为反复进行三次实验的结果值，并用平均值来评价生产率。
[表1]
如表1所示，与亲本菌株KCCM11016P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因失活的菌株的赖氨酸生产率增加了约6％。与此同时，可知与亲本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因分别失活的菌株中产生的气泡减少了约6～15％左右。
因此，能够确认：在棒状杆菌属微生物中，通过使赖氨酸生产所不必要的主要分泌蛋白质失活，能够有效地控制在培养中所产生的气泡，由此能够提高L-赖氨酸生产率。
实施例6：制备及评价源于赖氨酸生产菌株KCCM10770P的分泌蛋白基因失活的菌株
为了在具有强化的赖氨酸生物合成途径的L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国申请授权专利第10-0924065号)中，比较分泌蛋白的失活效果是否与上述实施例5的实验结果类似，利用与上述实施例5相同的方法来制备三种分泌蛋白失活的菌株，并命名为KCCM10770P-ΔNCgl0336、KCCM10770P-ΔNCgl0717、KCCM10770P-ΔNCgl2912，并一同进行了L-赖氨酸生产率和气泡产生量的比较。
为了比较上述菌株的赖氨酸生产率，利用与实施例6相同的方法与各对照组一同培养之后，利用与实施例6相同的方法测定了完成培养后的气泡产生量，并将利用HPLC分析的L-赖氨酸浓度示出到下述表2中。表2的结果为反复进行三次实验的结果值，并用平均值来评价生产率。
[表2]
如表2所示，与亲本菌株KCCM10770P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2085、NCgl2912基因分别失活的菌株的赖氨酸生产率增加了约4％。与此同时，可知与亲本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717、NCgl2085、NCgl2912基因分别失活的菌株中产生的气泡减少了约4～18％左右。
因此，能够确认：在棒状杆菌谷氨酸棒杆菌KCCM10770P(韩国授权专利第10-0924065号)中，同样与上述实施例6类似地，通过使赖氨酸生产所不必要的主要分泌蛋白失活，能够有效地控制在培养中所产生的气泡，由此能够提高L-赖氨酸生产率。
实施例7：制备及评价源于L-赖氨酸生产菌株KCCM11347P的分泌蛋白基因失活的菌株
为了在通过人工突变法制备的谷氨酸棒状杆菌L-赖氨酸生产菌株KCCM11347P(上述微生物曾以KFCC10750公开之后，被重新保藏于布达佩斯条约下的国际保藏机构，并且授予的登记号为KCCM11347P；韩国授权专利第10-0073610号)中也确认分泌蛋白失活的效果，利用与上述实施例5、6相同的方法来制备三种分泌蛋白失活的菌株，并命名为KCCM11347P-ΔNCgl0336、KCCM11347P-ΔNCgl0717、KCCM11347P-ΔNCgl2912，并同时比较了L-赖氨酸生产率和气泡产生量。
为了比较上述菌株的赖氨酸生产率，利用与实施例5、6相同的方法与各对照组一同培养之后，利用与实施例5、6相同的方法测定了完成培养后的气泡产生量，并将利用HPLC分析的L-赖氨酸浓度示出到下述表3中。表3的结果为反复进行三次实验的结果值，并用平均值来评价生产率。
[表3]
如表3所示，与亲本菌株KCCM1137P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因失活的菌株的赖氨酸生产率增加了约5％。与此同时，可知与亲本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717、NCgl2912基因分别失活的菌株中产生的气泡减少了约4～15％左右。
因此，能够确认：在谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P(韩国授权专利第94-0001307号)中，同样与上述实施例5、6类似地，通过使赖氨酸生产所不必要的主要分泌蛋白失活，能够有效地控制在培养中所产生的气泡，由此能够提高L-赖氨酸生产率。
实施例8：制备及评价源于L-赖氨酸生产菌株CJ3P的分泌蛋白基因失活的菌株
为了在通过将三种变异[pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T311I)]导入到野生菌株中而具有L-赖氨酸生产率的谷氨酸棒状杆菌CJ3P(Binder等，Genome Biology 2012,13:R40)中，也如同上述实施例5、6、7那样确认分泌蛋白失活的效果，利用与上述实施例5、6、7相同的方法来制备三种分泌蛋白失活的菌株，并命名为CJ3P-ΔNCgl0336、CJ3P-ΔNCgl0717、CJ3P-ΔNCgl2912，并同时比较了L-赖氨酸生产率和气泡产生量。
为了比较上述菌株的赖氨酸生产率，利用与实施例5、6、7相同的方法与各对照组一同培养之后，利用与实施例5，6，7相同的方法测定了完成培养后的气泡产生量，并将利用HPLC分析的L-赖氨酸浓度示出到下述表4中。表4的结果为反复进行三次实验的结果值，并用平均值来评价生产率。
[表4]
如表4所示，与亲本菌株CJ3P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因失活的菌株的赖氨酸生产率增加了约8％。与此同时，可知与亲本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717、NCgl2912基因分别失活的菌株中产生的气泡减少了约5～17％左右。
因此，能够确认：在谷氨酸棒杆菌CJ3P中，同样与上述实施例5、6、7的实验结果类似地，通过使赖氨酸生产所不必要的主要分泌蛋白失活，能够有效地控制在培养中所产生的气泡，由此能够提高L-赖氨酸生产率。
实施例9：制备及评价源于L-赖氨酸生产菌株KCCM11016P的分泌蛋白基因同时失活的菌株
为了在L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中确认分泌蛋白同时失活后的效果，利用与上述实施例5、6、7、8相同的方法来制备分泌蛋白同时失活的三种菌株，并将使各基因组合失活的菌株命名为KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717、KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl2912、KCCM11016P-ΔNCgl0717/ΔNCgl2912，并同时比较了L-赖氨酸生产率和气泡产生量。
为了比较上述菌株的赖氨酸生产率，利用与实施例5、6、7、8相同的方法与各对照组一同培养之后，利用与实施例5、6、7、8相同的方法测定了完成培养后的气泡产生量，并将利用HPLC分析的L-赖氨酸浓度示出到下述表5中。表5的结果为反复进行三次实验的结果值，并用平均值来评价生产率。
[表5]
如表5所示，与亲本菌株KCCM11016P相比，NCgl0336/NCgl0717、NCgl0336/NCgl2912、NCgl0717/NCgl2912基因分别同时失活的菌株的赖氨酸生产率增加了约5％。与此同时，可知与亲本菌株相比，NCgl0336/NCgl0717、NCgl0336/NCgl2912、NCgl0717/NCgl2912基因分别同时失活的菌株的气泡产生减少了约10～14％左右。
因此，能够确认：在谷氨酸棒杆菌属微生物中，通过使赖氨酸生产所不必要的主要分泌蛋白同时失活，能够有效地控制在培养中所产生的气泡，由此能够提高L-赖氨酸生产率。
实施例10：制备及评价源于L-赖氨酸生产菌株KCCM11016P的分泌蛋白基因均失活的菌株
为了在L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中确认由分泌蛋白失活引起的综合效果，利用与上述实施例5、6、7、8、9相同的方法筛选出三种分泌蛋白均失活的菌株，并命名为KCCM11016P-ΔNCgl0336/ΔNCgl0717/ΔNCgl2912，并同时比较了L-赖氨酸生产率和气泡产生量。
为了比较上述菌株的赖氨酸生产率，利用与实施例5、6、7、8、9相同的方法与各对照组一同培养之后，利用与实施例5、6、7、8、9相同的方法测定了完成培养后的气泡产生量，并将利用HPLC分析的L-赖氨酸浓度示出到下述表6中。表6的结果为反复进行三次实验的结果值，并用平均值来评价生产率。
[表6]
如表6所示，可知与亲本菌株KCCM11016P相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因均失活的菌株的赖氨酸生产率增加了约7％，并且与亲本菌株相比，NCgl0336、NCgl0717及NCgl2912基因均失活的菌株中所产生的气泡减少了约17％左右。
因此，能够确认：在谷氨酸棒杆菌微生物中，通过使赖氨酸生产所不必要的主要分泌蛋白均失活，能够有效地控制在培养中所产生的气泡，由此能够提高L-赖氨酸生产率。
从上述结果能够确认，通过在L-赖氨酸生产菌株中使主要分泌蛋白失活而控制发酵中所过量产生的气泡，从而有效增加菌体生长且L-赖氨酸生产率，并将上述菌株KCCM11016P-ΔNCgl0336、KCCM11016P-ΔNCgl0717及KCCM11016P-ΔNCgl2912分别命名为CA01-2281、CA01-2279及CA01-2280，且CA01-2279及CA01-2280于2013年11月22日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，CA01-2281于2013年12月13日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，并且分别被赋予登记号KCCM11481P(CA01-2279)、KCCM11482P(CA01-2280)及KCCM11502P(CA01-2281)。
[登记号]
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
登记号：KCCM11481P
登记日期：2013年11月22日
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
登记号：KCCM11482P
登记日期：2013年11月22日
保藏机构名称：韩国微生物保藏中心(国外)
登记号：KCCM11502P
登记日期：2013年12月13日
序列表
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> L-赖氨酸生产率提高的微生物及用其生产L-赖氨酸的方法
<130> PA13-0400
<160> 18
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 365
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 缩氨酸
<222> (1)..(365)
<223> 由NCgl0336基因编码的酯酶
<400> 1
Met Lys Leu Leu Arg Arg Ile Ala Ala Pro Ala Ile Ala Leu Gly Ile
1 5 10 15
Ala Met Ser Thr Ile Val Thr Pro Ser Thr Ala Gly Ala Ala Glu Val
20 25 30
Thr Pro Ala Asp Val Ala Gly Asp Thr Ala Leu Ser Thr Ile Ser Asp
35 40 45
Ser Ala Pro Ala Asp Glu Ala Ser Ala Pro Arg Trp Arg Ala His Val
50 55 60
Asn Ala Ala Asp Glu Arg Val Lys Glu Met Trp Ala Tyr Ser Pro Ser
65 70 75 80
Met Asp Arg Asn Val Pro Leu Val Val Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ala
85 90 95
Gly Pro Arg Pro Val Ile Tyr Leu Leu Asn Gly Gly Asp Gly Gly Glu
100 105 110
Gly Ala Ala Asn Trp Val Met Gln Thr Asp Val Leu Asp Phe Tyr Leu
115 120 125
Glu Lys Asn Val Asn Val Val Ile Pro Met Glu Gly Lys Phe Ser Tyr
130 135 140
Tyr Thr Asp Trp Val Glu Glu Asn Ala Ser Leu Gly Gly Lys Gln Met
145 150 155 160
Trp Glu Thr Phe Leu Val Lys Glu Leu Pro Gly Pro Leu Glu Glu Lys
165 170 175
Leu Asn Thr Asp Gly Gln Arg Ala Ile Ala Gly Met Ser Met Ser Ala
180 185 190
Thr Thr Ser Leu Leu Phe Pro Gln His Phe Pro Gly Phe Tyr Asp Ala
195 200 205
Ala Ala Ser Phe Ser Gly Cys Ala Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Trp
210 215 220
Glu Tyr Leu Lys Leu Thr Leu Asp Arg Gly Asn Ala Thr Pro Glu Gln
225 230 235 240
Met Trp Gly Pro Arg Gly Gly Glu Tyr Asn Ile Tyr Asn Asp Ala Leu
245 250 255
Ile Asn Ser Asp Lys Leu Arg Gly Thr Glu Leu Tyr Val Ser Asn Ala
260 265 270
Ser Gly Leu Ala Gly Glu Trp Glu Ser Val Asp Ser Pro Arg Phe Glu
275 280 285
Gly Leu Asn Gln Gln Val Gln Ser Ile Ala Met Ala Glu Thr Val Val
290 295 300
Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ala Ala Thr Asn Lys Cys Thr His Asp Leu
305 310 315 320
Lys Ala Lys Leu Asp Ser Ala Gly Ile Pro Ala Asp Trp Asn Leu Arg
325 330 335
Pro Thr Gly Thr His Ser Trp Gly Trp Trp Gln Asp Asp Leu Arg Gly
340 345 350
Ser Trp Thr Thr Phe Ala Arg Ala Phe Glu Leu Glu Ala
355 360 365
<210> 2
<211> 1098
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1098)
<223> NCgl0336基因
<400> 2
atgaagcttc ttcgccgcat cgctgcacca gccatcgcgc tgggaattgc gatgtccacc 60
attgtcacgc catccaccgc aggcgctgcc gaagtaaccc cagcagacgt tgctggcgat 120
actgcactat ccaccatctc cgatagtgct cctgcagatg aagcctctgc acctcgctgg 180
cgcgcacacg tcaacgcagc agacgagcgc gtcaaagaaa tgtgggcata ctccccttcc 240
atggaccgca atgtgccact ggtagttata actgccgatg agtccgcagg tcctcgtcct 300
gtgatttacc ttcttaacgg tggcgacggt ggcgaaggtg ccgctaactg ggttatgcag 360
actgacgttc tggatttcta cctagaaaag aacgttaacg ttgttattcc aatggaaggc 420
aagttttcct actacaccga ctgggtagaa gagaatgcgt ccctcggtgg caagcaaatg 480
tgggaaacct tcctggtgaa ggaacttcca ggaccattgg aagaaaagct caacactgac 540
ggtcagcgtg caattgctgg catgtccatg tccgcaacta cttccctact cttcccacaa 600
cacttcccag gcttctacga cgcagcagca tccttctcag gatgcgcagc aacctcaagc 660
ctgctcccat gggaatacct caaactcacc cttgaccgcg gcaacgcaac cccagaacaa 720
atgtggggac cacgtggtgg cgaatacaac atctacaacg acgcactgat caactccgac 780
aaactacgcg gaaccgaact atacgtctcc aacgcatccg gccttgctgg tgaatgggaa 840
tccgtcgaca gcccacgctt cgaaggactc aaccaacaag ttcagtccat cgcaatggca 900
gaaactgtgg taaccggcgg catcatcgaa gctgcaacca acaagtgcac ccacgacctc 960
aaggcaaaac ttgactccgc cggcatccca gccgactgga acctccgccc aaccggcacc 1020
cactcatggg gctggtggca agatgacctc cgcggatctt ggaccacctt cgctcgtgcg 1080
tttgagctag aggcctag 1098
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
atcctctaga gtcgacgaag cctctgcacc tcgctg 36
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tatagttcgg ttccgcgtct ccaacgcatc cggcc 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
cggaaccgaa ctataccacc gagggacgca ttctc 35
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
atgcctgcag gtcgacgctc aaacgcacga gcgaag 36
<210> 7
<211> 261
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 缩氨酸
<222> (1)..(261)
<223> 由NCgl0717基因编码的酯酶
<400> 7
Met Lys Thr Glu Thr Arg Arg Ala Leu Val Phe Ile Val Ala Gly Cys
1 5 10 15
Leu Ala Ala Thr Ala Leu Gly Phe Met Val Trp Gln Met Ser Ser Pro
20 25 30
Ser Arg Pro Thr Ser Asp Ile Ala Thr Ser Thr Thr Thr Ser Thr Thr
35 40 45
Gln Thr Gln Ala Arg Tyr Asp Ser Pro Gly Asn Thr Glu Thr Lys Glu
50 55 60
Ala Glu Pro Asp Leu Glu Asn Gln Thr Leu Ala Pro Ile Asn Thr Glu
65 70 75 80
Asp Pro Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Phe Val Arg Pro Asp Asn Gly Arg
85 90 95
Ser Ser Gly Leu Thr Pro Ser Gly Ser Ser Pro Thr Thr Thr Ser Arg
100 105 110
Val Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Ser Ala Ser Pro Thr Gln Ile Thr
115 120 125
Ser Arg Ser Asn Glu Pro Ser Glu Pro Gly Asp Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Thr Gln Pro Ser Ser Pro Asp Arg Pro Thr Glu Pro Thr Asn Pro Val
145 150 155 160
Asp Pro Thr Gly Pro Ser Glu Pro Thr Glu Pro Thr Asp Pro Ile Glu
165 170 175
Thr Thr Asp Pro Ile Glu Thr Thr Asp Pro Val Ala Pro Ser Thr Pro
180 185 190
Pro Thr Ser Asp Asp Ser Thr Ser Thr Pro Gln Pro Asp Glu Ser Asp
195 200 205
Thr Pro Pro Thr Asp Phe Val Glu Glu Pro Thr Ala Pro Leu Asn Pro
210 215 220
Asp Gln Pro Ala Gly Ser Thr Thr Asp Ala Thr Pro Asn Ala Thr Pro
225 230 235 240
Ser Ala Pro Ala Asp Thr Thr Ser Asn Ser Val Ala Asn Ser Val Glu
245 250 255
Pro Thr Ala Thr Ser
260
<210> 8
<211> 786
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(786)
<223> NCgl0717基因
<400> 8
atgaaaacag aaactcgacg agccctcgtc ttcatcgtcg ccggctgttt agccgccacc 60
gccctgggtt ttatggtctg gcagatgtcc agcccaagcc gacccacctc tgatattgcc 120
acgtctacta ctacgtctac cacccaaacc caggctaggt acgattcccc aggtaataca 180
gagaccaaag aggcggaacc tgacctagaa aaccaaactt tggcgcccat caacaccgaa 240
gatccatatc ttccaccgaa tgcttttgtg cgtccagaca atggccgaag ctccggttta 300
accccttctg gcagttctcc aactaccacc tctcgggtga gttctccctc ctcagcagga 360
tcggcaagcc cgactcaaat cacctccagg tcaaacgagc ctagtgaacc tggtgatgag 420
tcaactgctg ctacacaacc gtcgagccca gacaggccaa ccgaacctac aaatccggta 480
gacccaactg gaccttctga acctacggaa cccaccgatc cgattgagac aaccgatccg 540
attgagacaa ccgatccggt agctccgtcc accccgccaa cgagcgatga ttcaacaagc 600
actccccaac cagatgagtc tgatacgcca cctaccgatt tcgtagagga acctactgct 660
cctctcaatc cggatcagcc agccggttca actactgatg cgacgccaaa cgcaacacca 720
agcgcaccag ctgacacaac atccaattct gtagctaact ctgtggaacc aactgccacg 780
agctaa 786
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ccggggatcc tctagagttc gcggataaat ggg 33
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
cacgtgaaat tcaggtcgcg tggttcacct ccgaag 36
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cttcggaggt gaaccacgcg acctgaattt cacgtg 36
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gcaggtcgac tctagaggtc ccatgattgt tctg 34
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 缩氨酸
<222> (1)..(107)
<223> 由NCgl2912基因编码的酯酶
<400> 13
Met Arg Lys Leu Arg Thr Ala Ser Val Ala Leu Leu Thr Ala Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Ala Thr Pro Ala Met Ala Gln Ser Thr Thr Gly Ser
20 25 30
Ser Ala Ser Ser Gln Val Gly Asp Ala Leu Gly Ala Ser Asp Tyr Glu
35 40 45
Arg Asp Ile Trp Gly Ser Ser Lys Asp Phe Asp Asp Val Thr Pro Phe
50 55 60
Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Tyr Thr Leu Ala Ala Thr Ala Val Ala Ile
65 70 75 80
Ser Gly Leu Val Tyr Ala Asn Leu Pro Ala Ile Glu Gln Ala Ala Ala
85 90 95
Gln Ala Gly Ile Lys Leu Glu Ile Pro Arg Tyr
100 105
<210> 14
<211> 324
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(324)
<223> NCgl2912基因
<400> 14
atgcgtaaac ttcgtactgc ttccgttgca ctgctgaccg caggtgcact tgcactgacc 60
gctactcctg caatggctca gtccaccacc ggttcttctg catcttctca ggttggcgac 120
gcactcggtg ctagcgacta cgagcgcgac atctggggtt cctctaagga cttcgacgat 180
gtaaccccat tcggttccgc ttggtacggc tacaccctgg ccgcaaccgc agttgctatc 240
tccggtcttg tgtacgcaaa ccttcctgca atcgagcagg ctgctgcaca ggccggcatc 300
aagctggaga tcccacgcta ctaa 324
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ccggggatcc tctagagctg caagaagtgc gac 33
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ctcgtagtcg ctagcaccta ttacgggagg tc 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gacctcccgt aataggtgct agcgactacg ag 32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gcaggtcgac tctagacccg agctatctaa cac 33
Claims (3)
1.一种棒状杆菌属微生物，其中，在所述棒状杆菌属微生物中，选自由序列号7及13的氨基酸序列组成的组中的至少一个的分泌蛋白失活，且所述棒状杆菌属微生物生产L-赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。
3.一种生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：通过培养棒状杆菌属微生物而在培养物或细胞中生产L-赖氨酸；以及
从上述培养物回收L-赖氨酸，
其中在所述棒状杆菌属微生物中，选自由序列号1、7及13的氨基酸序列组成的组中的至少一个的分泌蛋白失活，且所述棒状杆菌属微生物生产L-赖氨酸。
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