CN114096663A - 具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物及其用途 - Google Patents

具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114096663A
CN114096663A CN202180003334.2A CN202180003334A CN114096663A CN 114096663 A CN114096663 A CN 114096663A CN 202180003334 A CN202180003334 A CN 202180003334A CN 114096663 A CN114096663 A CN 114096663A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
microorganism
polypeptide
seq
methyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202180003334.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114096663B (zh
Inventor
申光秀
李光雨
苏义瑟
张莲在
沈知炫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Priority to CN202211667157.0A priority Critical patent/CN115960809A/zh
Publication of CN114096663A publication Critical patent/CN114096663A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114096663B publication Critical patent/CN114096663B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/02—Hydroxymethyl-, formyl- and related transferases (2.1.2)
    • C12Y201/02011—3-Methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase (2.1.2.11), i.e. ketopantoate hydroxymethyltransferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了具有3‑甲基‑2‑氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽；具有增强的3‑甲基‑2‑氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物；用于生产泛酸和/或泛解酸的组合物，所述组合物包含所述多肽和/或微生物；以及生产泛酸和/或泛解酸的方法，所述方法包括培养所述微生物。

Description

具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物 及其用途
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年7月1日向韩国知识产权局提交的KR10-2020-0081194的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
提供了具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽；具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物；用于生产泛酸和/或泛解酸的组合物，所述组合物包含该多肽和/或微生物；以及生产泛酸和/或泛解酸的方法，所述方法包括培养所述微生物。
背景技术
泛酸，也称为维生素B5，是一种属于维生素B复合物的物质，是商业上重要的物质之一，广泛应用于化妆品、药品、人类营养、动物营养等。泛酸具有其中β-丙氨酸通过酰胺键与泛解酸连接的结构。
泛酸或泛解酸可以通过化学合成或通过生物技术方式在合适的培养基中发酵合适的微生物来制备。使用微生物的生物技术制备方法的优点是形成了所需的泛酸或泛解酸的立体异构D型。
因此，需要开发在生物技术生产泛酸和/或泛解酸中具有有益效果的微生物以及使用该微生物高效生产泛酸和/或泛解酸的技术。
现有技术文献
专利文献
US 7,718,205 B2(2010年05月18日公布)
发明内容
技术问题
本公开的一种实施方式提供了一种具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽。例如，该多肽可以包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。
另一种实施方式提供了编码该多肽的多核苷酸。
另一种实施方式提供了包含该多核苷酸的重组载体。该重组载体可以是用于表达该多核苷酸的表达载体。
另一种实施方式提供了具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性并生产泛酸和/或泛解酸的微生物。
另一种实施方式提供用于生产泛酸和/或泛解酸的组合物，该组合物包含选自由多肽、多核苷酸、重组载体和微生物组成的组中的至少一种。
另一种实施方式提供了生产泛酸和/或泛解酸的方法，包括培养该微生物。
另一种实施方式提供了该多肽、该多核苷酸、该重组载体和该微生物在生产泛酸和/或泛解酸中的用途。
技术方案
在本公开中，寻找能够提高泛酸和/或泛解酸生产能力的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶或其变体，并将该3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶或其变体引入微生物中，从而提供具有优异的泛酸和/或泛解酸生产能力的重组微生物。
在本公开中，确认了表达源自大肠杆菌(E.coli)的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的微生物具有优异的泛酸生产能力，并且还确认了，当在源自大肠杆菌的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的特定位置处引入氨基酸取代突变时，泛酸生产能力进一步增强。
一种实施方式提供了具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽。该多肽可以是源自大肠杆菌的羟甲基转移酶或其变体。例如，该多肽可以包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。
另一种实施方式提供了编码该多肽的多核苷酸。
另一种实施方式提供了携带该多核苷酸的重组载体。该重组载体可以用作该多核苷酸的表达载体。
另一种实施方式提供具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物。该微生物可产生泛酸和/或泛解酸。羟甲基转移酶可以是源自大肠杆菌的羟甲基转移酶或其变体。例如，该羟甲基转移酶可以包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。
与未经历3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性增强并且属于同一物种的微生物相比，具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物可具有增加的生产泛酸和/或泛解酸的能力。
另一种实施方式提供用于生产泛酸和/或泛解酸的组合物，该组合物包含选自由该多肽、该多核苷酸、该重组载体和具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物组成的组中的至少一种。
另一种实施方式提供了生产泛酸和/或泛解酸的方法，包括培养具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物。
另一种实施方式提供了该多肽、该多核苷酸、该重组载体和具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物在生产泛酸和/或泛解酸中的用途。
将给出本公开的详细描述。
在本公开中，泛酸(例如，D-泛酸)是具有有化学式1的结构的化合物，是其中β-丙氨酸通过酰胺键与泛解酸偶联的维生素(维生素B5)。此外，泛酸是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的组成部分，参与活体的各种代谢。
Figure BDA0003351530370000031
(化学式1：泛酸)
泛解酸(例如，D-泛解酸)是具有化学式2的结构的化合物，并且充当多种生物活性化合物的组成部分：
Figure BDA0003351530370000032
(化学式2：泛解酸)
在本公开中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶是催化由5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-methylentetrahydrofolate)、3-甲基-2-氧代丁酸(3-methyl-2-oxobutanoate)和水生物合成四氢叶酸(tetrahydrofolate)和2-脱氢泛解酸(2-dehydropantoate)的酶。
在本公开中，具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物可以是其中引入了3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶编码基因的微生物。
在一个具体实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶是大肠杆菌来源的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶(野生型)或通过取代、缺失或插入至少一种氨基酸而突变的其变体。
野生型大肠杆菌来源的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶可包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在一种实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的变体可以是其中与由SEQID NO:37的氨基酸序列组成的大肠杆菌3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的多肽，该其他氨基酸选自由丙氨酸(A，Ala)、天冬酰胺(N，Asn)、苏氨酸(T，Thr)、谷氨酸(E，Glu)、丝氨酸(S，Ser)、缬氨酸(V，Val)、异亮氨酸(I，Ile)、亮氨酸(L，Leu)、天冬氨酸(D，Asp)、半胱氨酸(C，Cys)、谷氨酰胺(Q，Gln)、蛋氨酸(M，Met)、苯丙氨酸(F，Phe)、脯氨酸(P，Pro)、色氨酸(W，Trp)、酪氨酸(Y，Tyr)、精氨酸(R，Arg)、组氨酸(H，His)、赖氨酸(K，Lys)和甘氨酸(G，Gly)组成的组且与原来的氨基酸不同。在具体的实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的变体可以是其中与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的多肽，该其他氨基酸选自由丙氨酸(A，Ala)、天冬酰胺(N，Asn)、苏氨酸(T，Thr)、谷氨酸(E，Glu)、丝氨酸(S，Ser)、缬氨酸(V，Val)、异亮氨酸(I，Ile)、亮氨酸(L，Leu)、天冬氨酸(D，Asp)、半胱氨酸(C，Cys)、谷氨酰胺(Q，Gln)和蛋氨酸(M，Met)组成的组。当通过在除了与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸以外的部分氨基酸序列处进行缺失、取代、修饰和/或插入而进一步修饰变体时，部分进一步修饰的变体也可以包括在本公开的变体的范围内，只要该变体具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的活性和/或增加或赋予细胞(微生物)中泛酸和/或泛解酸的生产能力的活性即可。
在一种实施方式中，变体可以包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的序列同源性或同一性并且在与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸处通过用其他氨基酸取代而被修饰的多肽。也就是说，本公开的变体的范围内可以包含这样的多肽，该多肽：(1)在与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸处通过取代为其他氨基酸而被修饰，(2)与SEQ IDNO:37的氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高并且小于100％的序列同源性或同一性，并且(3)具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性和/或增加或赋予细胞(微生物)中泛酸和/或泛解酸生产能力的活性。
在具体的实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的变体可以包括以下多肽，该多肽包含选自由SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:73组成的组中的氨基酸序列，但不限于此。当通过在除了第116位的氨基酸以外的部分氨基酸序列处进行缺失、取代、修饰和/或插入而修饰由选自由SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:73组成的组中的氨基酸序列组成的多肽时，部分修饰的多肽也可以包括在本公开的变体的范围内，只要该多肽具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的活性和/或增加或赋予细胞(微生物)中泛酸和/或泛解酸的生产能力的活性即可。此外，所述变体可以包含多肽，其中在选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:73的氨基酸序列中与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸是固定的，并且该多肽与选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的序列同源性或同一性。例如，本公开的变体的范围内可以包含这样的多肽，该多肽由SEQ ID NO:37通过用其他氨基酸取代与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸而修饰，该多肽与选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高并且小于100％的序列同源性或同一性，并且表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性和/或增加或赋予细胞(微生物)中泛酸和/或泛解酸生产能力的活性。
在本公开中，术语“具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物”可以是被操纵(突变)以表达表现出如上所述的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的微生物，从而不具有泛酸和/或泛解酸生产能力的微生物变得具有泛酸和/或泛解酸生产能力，或者该微生物具有比其固有的泛酸和/或泛解酸生产能力更高的泛酸和/或泛解酸生产能力。在本公开中，术语“微生物”可以包括单细胞细菌，并且可以与“细胞”互换。在本公开中，未修饰或在修饰以表达表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽之前的微生物可以表述为亲本微生物(或亲本菌株)或宿主细胞，以便区别于经修饰的微生物。
在本公开中，微生物可以是选自由棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)等微生物组成的组中的至少一种。属于棒状杆菌属的微生物可包括：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产热棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)等，但不限于此。更具体地，属于棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。属于埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌。
在本公开中，术语“具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物”可以指表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的微生物，其由亲本菌株修饰(操纵)而来以表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽。在一种实施方式中，用于表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的突变可以通过将编码如上所述的具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体引入亲本菌株来进行。引入亲本菌株的编码具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸可以是替换了亲本菌株的内源性3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶基因的多核苷酸或除了内源基因而被进一步包含的多核苷酸。
在具体的实施方式中，表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的微生物可以是保藏号为KCCM12744P的微生物。
在本公开中，关于多核苷酸(与“基因”互换使用)或多肽(与“蛋白质”互换使用)，措辞“包含特定核酸或氨基酸序列”、“由特定核酸或氨基酸序列组成”和“被表示为特定核酸或氨基酸序列”是可互换表述，这些表述具有等同的含义，即多核苷酸或多肽基本上包含特定的核酸或氨基酸序列。此外，这些措辞可以被解释为“包含基本等同的序列”(或解释为“不排除引入以下突变”)，其由在多核苷酸或多肽保留其原始功能和/或所需功能的范围内对特定核酸或氨基酸序列进行的突变(缺失、取代、修饰和/或添加)而得到。
在一种实施方式中，本公开提供的核酸序列或氨基酸序列可以包括突变体，该突变体通过在保留序列的原始功能或所需功能的范围内进行的常规突变方法(例如直接进化和/或定点诱变)而获得。在一种实施方案中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸或氨基酸序列或由特定核酸或氨基酸序列组成”的表述可意指多核苷酸或多肽基本上包含以下或基本上由以下组成：(i)特定核酸或氨基酸序列，或(ii)具有60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高的序列同一性的核酸或氨基酸序列，其中该多核苷酸或多肽保留其原始功能和/或所需功能。如本文所用，术语“原始功能”可表示增加或赋予生产泛酸和/或泛解酸的能力的功能。
对于本公开所述的核苷酸序列，由于密码子简并性或考虑到要在其中表达蛋白质的微生物所优选的密码子，可以在不改变由编码区表达的多肽的氨基酸序列和/或功能的范围内在编码区中进行各种修饰。
在本公开中，术语“同一性”或“同源性”可以指两个给定的氨基酸序列或核酸序列之间的相关程度并且可以表示为百分比(％)。对于核酸序列之间的同一性，其百分比可以使用例如算法BLAST(参见Karlin and Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或Pearson的FASTA(参见Methods Enzymol.,183,63(1990))来确定。BLASTN和BLASTX程序是在BLAST算法的基础上开发的(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在一种实施方式中，包含本文提供的特定核酸序列的多核苷酸可被解释为包含：含有与特定核酸序列互补的核酸序列的多核苷酸以及含有特定核酸序列或与该特定核酸序列基本等同的核酸序列的多核苷酸。具体而言，互补多核苷酸可以根据目的在适当可调的Tm值下杂交，例如在55℃、60℃、63℃或65℃的Tm下杂交，并且可以在以下条件下进行分析：这些条件在已知文献中有详细描述。例如，可以可以提及以下条件，若基因的同源性为60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98％或更高、99.5％或更高、或99.9％或更高则基因间发生杂交，而若基因的同源性低于上述值则不杂交的条件；或通常的用于Southern杂交条件，在该条件下，在60℃、1x SSC(盐水-柠檬酸钠缓冲液)和0.1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠)；60℃、0.1x SSC和0.1％SDS；或68℃、0.1xSSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下，洗涤1次或多次、具体2次或3次，但不限于此。对于杂交，需要两个多核苷酸具有彼此互补的序列。根据杂交严格性，碱基之间可能允许一个或多个错配。术语“互补”可用于描述可以相互匹配的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。取决于包括多核苷酸长度和互补性在内的各种因素，多核苷酸的适当杂交严格度可能会有所不同，这是本领域众所周知的(参见Sambrook等人，9.50-9.51，11.7-11.8)。
对于基因或载体的引入，本领域技术人员可以适当采用本领域已知的转化方法。如本文所用，术语“转化”可以指携带编码靶蛋白(例如，表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性和/或增加或赋予泛酸和/或泛解酸的生产能力的多肽，如上所述)的多核苷酸的载体被引入宿主微生物中以在宿主细胞中表达由该多核苷酸编码的蛋白质的动作。引入的多核苷酸可以位于宿主微生物染色体的内部或外部，只要该多核苷酸在宿主微生物中表达即可。此外，多核苷酸包含编码靶蛋白的DNA或RNA。可以采用任何递送方式，只要该方式能够使得在宿主微生物中引入和表达多核苷酸。例如，多核苷酸可以采用包含自主表达所需的所有元件的表达盒的形式，以便将多核苷酸引入宿主细胞。表达盒通常可以包含与多核苷酸可操作地连接的表达调控元件，例如启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号。表达盒可以是可以自我复制的表达载体。此外，多核苷酸本身可以被引入宿主细胞并且可以与在宿主细胞中表达所必需的序列可操作地连接。如本文所用，术语“可操作地连接”是指表达调控元件(例如，启动子)和多核苷酸之间的功能连接，使得表达调控元件可以控制(例如，启动)编码靶蛋白(例如，表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性和/或增加或赋予泛酸和/或泛解酸的生产能力的多肽，如上所述)的多核苷酸的转录。可使用本领域已知的基因重组技术实现可操作的连接，例如典型的位点特异性DNA切割和连接，但不限于此。
对于宿主细胞的转化，可以采用任何方法，只要该方法允许将核酸转化到宿主微生物中即可。根据宿主微生物可以适当地选择本领域已知的转化技术。本领域已知的转化技术的实例可包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)介导的摄取、DEAE-葡聚糖介导的递送、阳离子脂质体方法、脂质转染和醋酸锂-DMSO法，但不限于此。
本领域技术人员可以选择合适的方法将多核苷酸整合到细胞的基因组(染色体)中。例如，可以使用RNA引导的核酸内切酶系统(或CRISPR系统)来完成整合；例如，RNA引导的核酸内切酶系统可以是选自由以下组成的组中的至少一种：(a)RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9蛋白等)、编码其的基因、或携带该基因的载体；(b)向导RNA(即单向导RNA(sgRNA)等)、编码其的DNA、或携带该DNA的载体(如RNA引导的核酸内切酶蛋白和向导RNA的混合物)、复合物(例如核糖核蛋白(RNP))、重组载体(例如，包含RNA引导的核酸内切酶编码基因和编码向导RNA的DNA两者的载体等)等，但不限于此。
如本文所用，术语“载体”可指包含靶蛋白编码核苷酸序列的DNA构建体，该核苷酸序列与能够影响靶蛋白在合适宿主中表达的合适调控序列可操作地连接。调控序列可以包含启动转录的启动子、任选的调控这种转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和/或调控转录和/或翻译的终止的序列。一旦转化到合适的宿主细胞中，载体可以独立于宿主细胞的基因组表达或可以整合到宿主细胞的基因组中。
任何载体都可以在本文中使用而对其没有特别限制，只要该载体在宿主细胞中复制即可。载体可以从常用的载体中选择。这样的常用载体的实例可以包括质粒、粘粒、病毒和噬菌体，它们可以处于天然或重组状态。例如，噬菌体载体或粘粒载体的实例有pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等。质粒载体可以源自选自pBR-、pUC-、pBluescriptII-、pGEM-、pTZ-、pCL-和pET-谱系中的一种。载体的实例可包括但不限于pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等。
本文中可用的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸整合到宿主细胞染色体中的载体。可以使用本领域已知的任何方法，例如同源重组，但不限于此，从而实现将多核苷酸整合到宿主细胞的染色体中。载体可以进一步携带用于确定感兴趣的基因是否被整合到染色体中的选择标记。选择标记是为了选择用载体转化的细胞，即为了确定多肽的整合，选择标记可以从赋予选择性表型(例如耐药性、营养缺陷型、细胞毒性耐药性和表达表面蛋白)的基因中选择。在将选择剂应用于细胞的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才能存活或表达独特的表型，从而可以选择转化的细胞。
另一种实施方式提供了一种增加微生物中泛酸和/或泛解酸生产能力或赋予微生物泛酸和/或泛解酸生产能力的方法，该方法包括活化微生物的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的步骤。
活化微生物的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的步骤可以包括将用于表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的突变引入该微生物中的步骤。
引入突变的步骤可以包括将编码具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体引入(转化)到该微生物中的步骤。
另一种实施方式提供了一种生产泛酸和/或泛解酸的方法，该方法包括在培养基中培养如上所述的具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物的步骤。该方法还可包括，在培养步骤之后，从培养的微生物、培养基或两者中回收泛酸或泛解酸。
在该方法中，培养微生物的步骤可以通过已知的分批培养方法、连续培养方法、补料分批培养方法等进行，但对其没有特别限制。在此，培养条件可以使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)，或在有氧条件下通过向细胞培养物供应氧气或含氧的气体混合物来维持，但对此没有特别限制。培养温度可保持在20℃至45℃或具体地保持在25℃至40℃，并且细胞可培养约10小时至160小时，但不限于此。通过培养产生的泛酸和/或泛解酸可以输出到培养基中或保留在细胞内。
可用于培养的培养基可以包括但不限于：选自由分别或组合地作为碳源的糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)组成的组中的至少一种。作为氮源，可以分别或组合地包含选自由含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米溶液、豆粕粉和尿素)、无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等组成的组中的至少一种，但不限于此。作为磷源，可以分别或组合地包含选自由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、与其对应的含钠盐等组成的组中的至少一种，但不限于此。此外，培养基可包含其他必需的生长刺激物质，例如金属盐(例如硫酸镁或硫酸亚铁)、氨基酸和/或维生素。
在回收泛酸和/或泛解酸的步骤中，可以根据培养方法使用本领域已知的合适方法从培养基、培养液或微生物中收集感兴趣的泛酸和/或泛解酸。例如，回收步骤可以使用选自离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等中的至少一种方法进行。生产泛酸和/或泛解酸的方法还可包括在回收步骤之前、同时或之后进行的纯化步骤。
有益效果
本公开提供了一种提高微生物的泛酸和/或泛解酸生产能力的技术。为此目的，提供了源自大肠杆菌的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶或其变体。将用于表达大肠杆菌来源的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶或其变体的突变引入微生物中可导致提高微生物的泛酸和/或泛解酸生产能力，或赋予微生物泛酸和/或泛解酸生产能力。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开，但这些实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本公开的范围。本领域技术人员清楚，可以在不脱离本公开的精神的情况下修改以下描述的实施例。
实施例1)3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶基因的筛选和选择
将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶编码基因(panB)作为检索请求(query)，进行NCBI BLAST检索，结果选择了预估具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶编码基因活性的候选基因以及包含该候选基因的微生物。在微生物中，选择出来源自微生物生物安全等级为1级的微生物的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶编码基因，汇总于表1：
[表1]
预期包含3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶编码基因的微生物和用于选择3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶基因的引物/质粒
Figure BDA0003351530370000121
Figure BDA0003351530370000131
实施例2)引入了外来微生物来源的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的棒状杆菌属微生物的制备
从实施例1中获得的微生物中提取基因组后，以基因组为模板，使用表1的引物进行PCR，以扩增编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的DNA片段。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)进行PCR，95℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃聚合1分钟，重复30个循环。结果，获得了每种3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶编码DNA片段(panB)。
为了制备谷氨酸棒状杆菌来源的PLM1启动子，使用谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)的基因组DNA作为模板，并使用SEQ ID NO:27和28的引物，在上述条件下进行PCR，以获得启动子DNA片段。
将用限制酶BamHI处理然后在65℃下热处理20分钟的pECCG117载体(韩国专利号10-0057684)和上述获得的DNA片段(每种panB、PLM1启动子)基于摩尔浓度(M)按2:1:1(pECCG117载体:panB:PLM1)的比例混合，并根据制造商手册用融合克隆试剂盒(InfusionCloning Kit，TaKaRa)进行克隆，获得质粒。获得的质粒的名称和引入其中的基因信息总结于表1中。
通过电穿孔将获得的13种载体转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中，从而制备表达外源PanB(3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶)的菌株。
实施例3)表达外来微生物来源的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的棒状杆菌属微生物的泛酸生产能力的检验
为了检验实施例2中制备的表达各种外来微生物来源的panB的菌株的泛酸生产力，将菌株和亲本菌株(非转化菌株)分别接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以200rpm振荡培养48小时以生产泛酸。
<生产培养基>
葡萄糖10％、β-丙氨酸0.5％、酵母提取物0.4％、硫酸铵1.5％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.05％、七水硫酸亚铁10mg/L、一水硫酸锰6.7mg/L、生物素50μg/L，盐酸硫胺素100μg/L，pH 7.2。
将获得的培养液以20,000rcf离心10分钟，然后用TDW(三次蒸馏水)将上清液稀释至1/10，并进行HPLC分析以测量泛酸和L-缬氨酸的浓度。所得结果示于下表2中。
[表2]
泛酸浓度(g/L) L-缬氨酸浓度(g/L)
ATCC13032(野生型) 0.0 2.4
ATCC13032 pECCG117-panB(EC) 1.2 1.5
ATCC13032 pECCG117-panB(BS) 0.5 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(PA) 0.6 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(SR) 0.7 1.8
ATCC13032 pECCG117-panB(SP) 0.3 2.2
ATCC13032 pECCG117-panB(PR) 0.7 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(PT) 0.7 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(CB) 0.7 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(ECl) 0.6 2.1
ATCC13032 pECCG117-panB(AP) 0.6 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(SE) 0.5 2.0
ATCC13032 pECCG117-panB(SF) 0.7 1.9
ATCC13032 pECCG117-panB(CG) 0.6 2.0
如表2所示，亲本菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032不产生泛酸，而所有测试的表达外来微生物来源的panB的谷氨酸棒状杆菌菌株平均产生约0.6g/L的泛酸。特别是，在表达外来微生物来源的panB的菌株中，表达外来大肠杆菌来源的PanB的菌株ATCC13032pECCG117-panB(EC)表现出最高的泛酸生产力(1.2g/L)。
以上结果表明，实施例1中选择的13种微生物来源的酶(3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶)均表现出泛酸生产能力，其中大肠杆菌来源的酶具有特别高的泛酸生产能力。
实施例4)引入了大肠杆菌来源的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的棒状杆菌属微生物的制备
制备质粒以将大肠杆菌来源的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶编码基因(panB)引入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，该基因在实施例3中被证明具有优异的泛酸生产能力。
首先，构建用于使存在于亲本菌株(野生型)中的panB缺失的载体。以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物SEQ ID NO：29和30以及SEQ ID NO：31和32进行PCR。通过在95℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃聚合1分钟，重复25个循环，进行PCR。结果分别获得了panB基因上游区1000bp的基因片段和panB基因下游区1000bp的基因片段。每个扩增产物均使用QIAGEN的PCR纯化试剂盒进行纯化，并用作载体构建的插入DNA片段。
将用限制酶smaI处理然后在65℃下热处理20分钟的pDZ载体(US9109242B2)和DNA片段(panB基因上游区1000bp的基因片段和panB基因panB下游区1000bp的基因片段)按2:1:1的比例(基于摩尔浓度(M))混合，并根据制造商手册用融合克隆试剂盒(TaKaRa)进行克隆，构建用于使panB基因从染色体中缺失的pDZ_ΔpanB载体。
提供大肠杆菌来源的PANB基因，使用实施例2制备的质粒pECCG117-panB(EC)作为模板，并使用SEQ ID NO:33和34引物，进行PCR。通过在95℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃聚合1分钟，重复25个循环，进行PCR。结果，获得了1077bp的DNA片段。将用限制酶smaI处理然后在65℃下热处理20分钟的pDZ_ΔpanB载体和如上获得的DNA片段按1:2的比例(基于摩尔浓度(M))混合，并根据制造商手册用融合克隆试剂盒(TaKaRa)进行克隆，构建用于将大肠杆菌来源的panB基因引入染色体的pDZ_ΔpanB::PLM1-panB(EC)载体。
将构建的载体pDZ_ΔpanB和pDZ_ΔpanB::panB(EC)各自转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中，然后进行二次交叉(secondary crossover)，从而制备panB从其染色体中缺失的菌株(ΔpanB菌株)以及panB从其染色体中缺失且大肠杆菌来源的panB基因被引入染色体的菌株(ΔpanB::panB(EC)菌株)。使用如下的引物组合通过MASA(突变等位基因特异性扩增)PCR方法(Takeda等人，Hum.Mutation,2,112-117(1993))确认了被大肠杆菌来源的panB正确地取代。即，通过选择使用适用于大肠杆菌的引物组合(SEQ ID NO：35和28以及SEQ ID NO：36和1)扩增的菌株进行第一次验证，然后通过使用SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的引物组合分析所选菌株的panB基因的序列进行第二次验证。
为了检验上述获得的突变体的泛酸生产能力，将谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032野生型菌株、ΔpanB菌株和ΔpanB::panB(EC)突变体分别接种到含有25ml生产培养基(参见实施例3)的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以200rpm振荡培养48小时以生产泛酸。
将获得的培养液以20,000rcf离心10分钟，然后用TDW(三次蒸馏水)将上清液稀释至1/10，并进行HPLC分析以测量泛酸和L-缬氨酸的浓度。所得结果示于下表3中。
[表3]
泛酸浓度(g/L) L-缬氨酸浓度(g/L)
ATCC13032(野生型) 0.1 1.9
ATCC13032ΔpanB 0.0 2.7
ATCC13032ΔpanB::panB(EC) 0.4 1.3
如表3中所示，野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和panB缺失(ΔpanB)的菌株显示不生产或生产非常少的泛酸，而表达外来panB的突变谷氨酸棒状杆菌(ΔpanB::panB(EC)菌株)产生浓度为0.4g/L的泛酸。
实施例5)通过人工突变(基于NTG的突变)制备随机突变菌株和选择生产panB的菌株
在本实施例中，为了获得泛酸生产能力更强的微生物突变体，如下诱导微生物突变。
更具体地，谷氨酸棒状杆菌ATCCΔpanB::panB(EC)菌株通过在活化培养基中培养16小时而活化，接种在经121℃灭菌15分钟的种子培养基上并培养14小时，然后，收集5ml获得的培养液。收集的培养液用100mM柠檬酸缓冲液洗涤，向其中添加NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)使其终浓度达到200mg/L，静置20分钟，然后，所得产物用100mM磷酸盐缓冲液洗涤。将经NTG处理的菌株涂在最低限度培养基上，测定其死亡率为85％。将存活的细胞接种到生产培养基上并进行培养，最终筛选出具有优异泛酸生产能力的突变体，命名为谷氨酸棒状杆菌CJVB5-01。
本实施例中所用培养基的组成如下：
<活化培养基>
牛肉提取物1％，聚蛋白胨1％，氯化钠0.5％，酵母提取物1％，琼脂2％，pH7.2
<种子培养基>
葡萄糖5％、细菌蛋白胨1％、氯化钠0.25％、酵母提取物1％、尿素0.4％、pH7.2
<生产培养基>
葡萄糖10％、β-丙氨酸0.5％、酵母提取物0.4％、硫酸铵1.5％、磷酸二氢钾0.1％、七水硫酸镁0.05％、七水硫酸亚铁10mg/L、一水硫酸锰6.7mg/L、生物素50μg/L，盐酸硫胺素100μg/L，pH7.2。
<最低限度培养基>
葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，硫胺素0.001％，生物素200μg/L，琼脂2％，pH7.2
为了检验上述获得的突变谷氨酸棒状杆菌CJVB5-01的泛酸生产能力，将谷氨酸棒状杆菌ΔpanB菌株、ΔpanB::panB(EC)菌株和CJVB5-01突变体分别接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以200rpm振荡培养48小时以生产泛酸。
将获得的培养液以20,000rcf离心10分钟，然后用TDW(三次蒸馏水)将上清液稀释至1/10，并进行HPLC分析以测量泛酸和L-缬氨酸的浓度。所得结果示于下表4中。
[表4]
基于NTG的突变菌株的泛酸生产力
泛酸浓度(g/L) L-缬氨酸浓度(g/L)
ATCC13032ΔpanB 0.0 2.4
ATCC13032ΔpanB::panB(EC) 0.3 1.4
CJVB5-01 1.2 1.0
如表4中所示，谷氨酸棒状杆菌ΔpanB不产生泛酸，而插入外来panB的谷氨酸棒状杆菌ΔpanB::panB(EC)菌株产生浓度为0.3g/L的泛酸，谷氨酸棒状杆菌CJVB5-01突变体产生浓度为1.2g/L的泛酸。由这些结果，确认了谷氨酸棒状杆菌CJVB5-01突变体显示出更优异的泛酸生产力。
由谷氨酸棒状杆菌CJVB5-01突变体的基因组测序结果，确认了插入的大肠杆菌panB基因发生突变，从而编码野生型大肠杆菌3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的变体(SEQ ID NO:37)，该变体中引入了G116A突变(与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸G(Gly)被A(Ala)取代)。在下文中，使用氨基酸位置的氨基酸突变的指示(例如'G116A')可以理解为是指氨基酸突变和/或导致这种氨基酸突变的基因突变。
引入了G116A突变的大肠杆菌3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶变体的氨基酸序列表示为SEQ ID NO:62。
结果确认了，通过随机诱变方法获得的突变体可以高效率、高产量地生产泛酸而不抑制由丙酮酸合成泛酸的途径。
实施例6)具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的突变PanB质粒的制备
为了检验作为大肠杆菌PanB(3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶)的突变位置并通过实施例5而确认影响泛酸生产力的第116位的氨基酸残基对于提高泛酸生产力很重要，制备了该位置被各种其他氨基酸取代的变体并检验了其效果。使用实施例2中制备的pECCG117-panB(EC)(参见表1)作为模板并使用下表5的引物，制备了19种具有随机突变(饱和诱变)的变体，其中大肠杆菌PanB(SEQ ID NO:37)的第116位氨基酸G(Gly)被其他氨基酸取代(即，通过引入编码随机突变的大肠杆菌PanB的突变panB基因来突变变体)。通过每种饱和诱变而突变的变体的取代氨基酸和其使用的引物总结在下表5中：
[表5]
Figure BDA0003351530370000181
Figure BDA0003351530370000191
特别地，使用表5提供的引物并使用实施例2中制备的pECCG117-panB(EC)(表1)作为模板进行PCR。作为聚合酶，使用SolgTM Pfu-X DNA聚合酶(SolGent co.,Ltd.)。通过在95℃变性10分钟；然后在95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合1分钟，重复25个循环；进行PCR。结果，获得了以3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶基因的突变位点为中心的5'上游区610bp和3'下游区470bp的DNA片段。
将用限制酶BamHI处理然后在65℃下热处理20分钟的pECCG117载体(韩国专利号10-0057684)和上述获得的DNA片段(5'上游610bp DNA片段和3'下游470bp DNA片段)按2:1:1)的比例(基于摩尔浓度(M))混合，并根据制造商手册用融合克隆试剂盒(TaKaRa)进行克隆，获得用于引入突变panBd的19种突变质粒。表6总结了19种突变质粒的信息。
[表6]
Figure BDA0003351530370000192
实施例7)具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的panB变体的泛酸生产力的测量
将实施例6制备的突变质粒和pECCG117-panB(WT-EC)(表1)分别通过电脉冲法导入实施例4制备的ATCC13032ΔpanB菌株中，然后涂在含25mg/L卡那霉素的选择性培养基上，获得总共19种转化的突变菌株，该突变菌株中引入了每种随机突变(饱和诱变)。此后，以与实施例3相同的方式进行烧瓶试验，并测量转化的突变菌株的泛酸生产能力。结果如表7所示：
[表7]
Figure BDA0003351530370000201
如表7所示，ATCC13032ΔpanB菌株不产生泛酸，而引入了大肠杆菌PanB(野生型)或其变体的所有突变菌株均显示出泛酸生产能力。此外与作为具有大肠杆菌PanB(野生型)的突变菌株的ATCC 13032ΔpanB pECCG117-panB(WT)相比，其中引入了突变G116S、G116C、G116L、G116I、G116T、G116V、G116D、G116E、G116N、G116A、G116M或G116Q的突变菌株生产更高水平的泛酸。结果确认了，野生型和突变型大肠杆菌PanB均表现出增加泛酸生产的作用，特别是PanB的第116位氨基酸残基(SEQ ID NO:37)在泛酸生产中是重要的位置，当该位置的氨基酸被与原来不同的各种氨基酸取代时，泛酸的生产能力进一步提高。
本实施例中被证实具有最优异的泛酸生产能力的ATCC 13032ΔpanB pECCG117-panB(G116A)菌株(称为谷氨酸棒状杆菌CV03-5001)于2020年6月8日在位于韩国首尔西大门区弘济洞的布达佩斯条约下的保藏机构韩国微生物培养中心保藏，保藏编号为KCCM12744P。
根据以上描述，本发明所属技术领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，可以以其他具体形式实施本发明。在这点上，应当理解，上述实施方式在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。本发明的范围应被解释为包括源自下述的权利要求书的含义和范围的所有变化或修改形式，而不是以上详细描述及其等效概念。
保藏机构：韩国微生物培养中心
保藏编号：KCCM12744P
保藏日期：2020年6月8日
(中文译文)
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
国际表格
至：CJ第一制糖株式会社 该页底部鉴定的国际保藏机构
韩国首尔市中区东湖路330号 根据细则第7.1条发布的原始保藏
CJ第一制糖中心 情况下的收据
(邮编)100-400
Figure BDA0003351530370000221
上述翻译文本与原文没有相违之处
Figure IDA0003351530420000011
Figure IDA0003351530420000021
Figure IDA0003351530420000031
Figure IDA0003351530420000041
Figure IDA0003351530420000051
Figure IDA0003351530420000061
Figure IDA0003351530420000071
Figure IDA0003351530420000081
Figure IDA0003351530420000091
Figure IDA0003351530420000101
Figure IDA0003351530420000111
Figure IDA0003351530420000121
Figure IDA0003351530420000131
Figure IDA0003351530420000141
Figure IDA0003351530420000151
Figure IDA0003351530420000161
Figure IDA0003351530420000171
Figure IDA0003351530420000181
Figure IDA0003351530420000191
Figure IDA0003351530420000201
Figure IDA0003351530420000211
Figure IDA0003351530420000221
Figure IDA0003351530420000231
Figure IDA0003351530420000241
Figure IDA0003351530420000251
Figure IDA0003351530420000261
Figure IDA0003351530420000271
Figure IDA0003351530420000281
Figure IDA0003351530420000291
Figure IDA0003351530420000301
Figure IDA0003351530420000311
Figure IDA0003351530420000321
Figure IDA0003351530420000331
Figure IDA0003351530420000341
Figure IDA0003351530420000351
Figure IDA0003351530420000361

Claims (16)

1.一种具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽，其中，与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被丙氨酸(A，Ala)、天冬酰胺(N，Asn)、苏氨酸(T，Thr)、谷氨酸(E，Glu)、丝氨酸(S，Ser)、缬氨酸(V，Val)、异亮氨酸(I，Ile)、亮氨酸(L，Leu)、天冬氨酸(D，Asp)、半胱氨酸(C，Cys)、谷氨酰胺(Q，Gln)或蛋氨酸(M，Met)取代。
3.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽由选自由SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:73组成的组中的氨基酸序列组成。
4.一种编码权利要求1至3中任一项所述的多肽的多核苷酸。
5.一种重组载体，包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种生产泛酸或泛解酸的微生物，所述微生物具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中，所述3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶是源自大肠杆菌(Escherichia Coli)的PanB蛋白。
8.根据权利要求6所述的微生物，其中，所述3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶由SEQID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求6所述的微生物，其中，所述微生物属于棒状杆菌属或埃希氏菌属。
10.根据权利要求9所述的微生物，其中，属于棒状杆菌属的所述微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
11.根据权利要求6所述的微生物，包含：权利要求1至3中任一项所述的多肽、编码所述多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的重组载体。
12.用于生产泛酸或泛解酸的组合物，包含：选自由权利要求1至3中任一项所述的多肽、编码所述多肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组载体和权利要求6至10中任一项所述的微生物组成的组中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的用于生产泛酸或泛解酸的组合物，其中，所述微生物包含：由SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列组成的多肽；编码所述多肽的多核苷酸；包含所述多核苷酸的重组载体。
14.一种生产泛酸和/或泛解酸的方法，包括：
在培养基中培养权利要求6至10中任一项所述的微生物。
15.根据权利要求14所述的生产泛酸或泛解酸的方法，进一步包括：在培养步骤之后，
从培养的微生物、培养基或两者中回收泛酸或泛解酸。
16.根据权利要求14所述的生产泛酸和/或泛解酸的方法，其中，所述微生物包含：由SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列的第116位对应的氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列组成的多肽；编码所述多肽的多核苷酸；包含所述多核苷酸的重组载体。
CN202180003334.2A 2020-07-01 2021-07-01 具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物及其用途 Active CN114096663B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211667157.0A CN115960809A (zh) 2020-07-01 2021-07-01 生产泛酸或泛解酸的棒状杆菌属微生物、组合物及方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200081194A KR102389327B1 (ko) 2020-07-01 2020-07-01 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
KR10-2020-0081194 2020-07-01
PCT/KR2021/008349 WO2022005225A1 (ko) 2020-07-01 2021-07-01 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211667157.0A Division CN115960809A (zh) 2020-07-01 2021-07-01 生产泛酸或泛解酸的棒状杆菌属微生物、组合物及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114096663A true CN114096663A (zh) 2022-02-25
CN114096663B CN114096663B (zh) 2023-09-26

Family

ID=79316584

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211667157.0A Pending CN115960809A (zh) 2020-07-01 2021-07-01 生产泛酸或泛解酸的棒状杆菌属微生物、组合物及方法
CN202180003334.2A Active CN114096663B (zh) 2020-07-01 2021-07-01 具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物及其用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211667157.0A Pending CN115960809A (zh) 2020-07-01 2021-07-01 生产泛酸或泛解酸的棒状杆菌属微生物、组合物及方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240167065A1 (zh)
EP (2) EP4032977A4 (zh)
KR (2) KR102389327B1 (zh)
CN (2) CN115960809A (zh)
WO (1) WO2022005225A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240105656A (ko) * 2022-12-28 2024-07-08 씨제이제일제당 (주) 음이온 수송 단백질의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도
KR20240118943A (ko) * 2023-01-27 2024-08-06 씨제이제일제당 (주) 글루타미시박터 할로피토콜라 유래 판토에이트-베타-알라닌 리가아제의 활성이 강화된 미생물 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997010340A1 (en) * 1995-09-13 1997-03-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing d-pantoic acid and d-pantothenic acid or salts thereof
CN1256313A (zh) * 1998-12-01 2000-06-14 底古萨－胡尔斯股份公司 使用棒状细菌发酵生产d－泛酸的方法
CN105658793A (zh) * 2013-06-25 2016-06-08 Cj第制糖株式会社 具有增强的l-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生物产生l-赖氨酸的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19855313A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen
IL148786A0 (en) * 1999-09-21 2002-09-12 Basf Ag Methods and microorganisms for production of panto-compounds
US20030073204A1 (en) * 2001-03-14 2003-04-17 Degussa Ag Process for the manufacture of D-pantothene acid and/or its salts by fermentation
KR101185656B1 (ko) * 2003-06-18 2012-09-24 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 포자를 형성할 수 없는 미생물을 사용한 판토텐산염의 제조방법
DE602005015692D1 (de) 2004-04-26 2009-09-10 Dsm Ip Assets Bv Verfahren zur herstellung von calcium-d-panthothenat
EP2066782A4 (en) 2006-09-15 2010-02-03 Cj Cheiljedang Corp CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH
US8517405B2 (en) 2007-09-10 2013-08-27 Hui Yan Human powered vehicle with two reciprocal pedals
EP2157174A1 (en) * 2008-08-12 2010-02-24 DSM IP Assets B.V. Increased production of pantothenate (vitamin B5)
US10385367B2 (en) * 2009-06-01 2019-08-20 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and molecules for yield improvement involving metabolic engineering
KR102589135B1 (ko) * 2021-05-10 2023-10-12 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997010340A1 (en) * 1995-09-13 1997-03-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing d-pantoic acid and d-pantothenic acid or salts thereof
US5932457A (en) * 1995-09-13 1999-08-03 Takeda Chemical Industries, Ltd Process for producing D-pantoic acid and D-pantothenic acid or salts thereof
CN1256313A (zh) * 1998-12-01 2000-06-14 底古萨－胡尔斯股份公司 使用棒状细菌发酵生产d－泛酸的方法
CN105658793A (zh) * 2013-06-25 2016-06-08 Cj第制糖株式会社 具有增强的l-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生物产生l-赖氨酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BO ZHANG 等人: "Metabolic engineering of Escherichia coli for D-pantothenic acid production", 《FOOD CHEMISTRY》 *
杨延辉 等人: "泛酸的功能和生物合成", 《生命的化学》 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102434925B1 (ko) 2022-08-19
EP4032977A1 (en) 2022-07-27
WO2022005225A1 (ko) 2022-01-06
US20240167065A1 (en) 2024-05-23
EP4032977A4 (en) 2024-03-06
EP4424834A2 (en) 2024-09-04
KR20220003411A (ko) 2022-01-10
CN115960809A (zh) 2023-04-14
KR20220003476A (ko) 2022-01-10
BR112022008745A2 (pt) 2023-01-10
KR102389327B1 (ko) 2022-04-20
CN114096663B (zh) 2023-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113544141B (zh) 包含突变的LysE的微生物和使用其生产L-氨基酸的方法
JP6998466B2 (ja) クエン酸シンターゼの活性が弱化された変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法
CN115038787B (zh) 新型支链氨基酸氨基转移酶变体和使用其的亮氨酸生产方法
CN114729338B (zh) 变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产l-苏氨酸的方法
CN112004926B (zh) 变体磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶及使用其制备嘌呤核苷酸的方法
CN108138191B (zh) 具有l-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物及利用其生产l-赖氨酸的方法
CN114096663B (zh) 具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物及其用途
JP2023110008A (ja) グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－グルタミン生産方法
KR102589135B1 (ko) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
KR102527895B1 (ko) GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
CN115500080A (zh) 新型双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/亚甲基四氢叶酸环水解酶变体及使用其生产xmp或gmp的方法
CN115552000A (zh) 新型双功能pyr操纵子转录调节因子/尿嘧啶磷酸核糖转移酶变体及使用其生产imp的方法
EP4047086A1 (en) Novel mutant polypeptide with attenuated activity of citrate synthase and l-amino acid production method using same
AU2020356064A1 (en) Meso-diaminopimelate dehydrogenase variant polypeptide and method for producing L-threonine using same
RU2805253C1 (ru) Новый модифицированный полипептид с ослабленной активностью цитратсинтазы и способ получения L-аминокислоты с его использованием
KR102527102B1 (ko) 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
CN115551999A (zh) 新型腺嘌呤磷酸核糖转移酶变体及使用其生产imp的方法
BR112022008745B1 (pt) Microrganismo com atividade aumentada da 3-metil-2-oxobutanoato hidroximetiltransferase e utilização do mesmo

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant