JP2023110008A - グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 - Google Patents
グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023110008A JP2023110008A JP2023090522A JP2023090522A JP2023110008A JP 2023110008 A JP2023110008 A JP 2023110008A JP 2023090522 A JP2023090522 A JP 2023090522A JP 2023090522 A JP2023090522 A JP 2023090522A JP 2023110008 A JP2023110008 A JP 2023110008A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- glutamine
- polypeptide
- microorganism
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 155
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 155
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 155
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 82
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 94
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 93
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 81
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 75
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 50
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 104
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 94
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 13
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000004220 glutamic acid Chemical group 0.000 claims description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Chemical group OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 5
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 42
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 38
- 108010064177 glutamine synthetase I Proteins 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 101150081163 glnA gene Proteins 0.000 description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 8
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 4
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 4
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 4
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 2
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010426 asphalt Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940097974 biotin 0.3 mg Drugs 0.000 description 2
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 206010001605 Alcohol poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100533902 Arabidopsis thaliana SPL13A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100533904 Arabidopsis thaliana SPL13B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 101100455080 Bacillus subtilis (strain 168) lmrB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000824268 Kuma Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-USLFZFAMSA-N LSM-4015 Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-USLFZFAMSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101100070556 Oryza sativa subsp. japonica HSFA4D gene Proteins 0.000 description 1
- 101100043227 Oryza sativa subsp. japonica SPL13 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101150099282 SPL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- -1 etc. can be used Chemical class 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010457 gene scissor Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- XHMJOUIAFHJHBW-VFUOTHLCSA-N glucosamine 6-phosphate Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O XHMJOUIAFHJHBW-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 101150062776 yccA gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
- C12Y603/01—Acid-ammonia (or amine)ligases (amide synthases)(6.3.1)
- C12Y603/01002—Glutamate-ammonia ligase (6.3.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【課題】活性が強化されたグルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いてL-グルタミンを製造する方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む、グルタミン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカム等の微生物、及び前記微生物を培地で培養するステップを含む、L-グルタミンを生産する方法とする。【選択図】なし
Description
本出願は、活性が強化されたグルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いてL-グルタミンを製造する方法に関する。
L-グルタミンは、消化器疾患治療剤、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品、健康食品などに広く用いられるアミノ酸である。
L-グルタミンの生産のために、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)と大腸菌(Escherichia coli)が代表的な微生物として用いられている。
L-グルタミン生合成経路においては、解糖過程(Glycolysis)とTCA回路(Tricarboxylic acid cycle)により生成されるα-ケトグルタミン酸(α-keto glutamic acid)を前駆体とし、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Glutamate dehydrogenase)によりL-グルタミン酸(L-glutamate)が生成され、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)の反応により最終的にL-グルタミンが生成される。
L-グルタミン生合成経路においては、解糖過程(Glycolysis)とTCA回路(Tricarboxylic acid cycle)により生成されるα-ケトグルタミン酸(α-keto glutamic acid)を前駆体とし、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(Glutamate dehydrogenase)によりL-グルタミン酸(L-glutamate)が生成され、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)の反応により最終的にL-グルタミンが生成される。
L-グルタミンを高濃度で生産するためには、グルタミンシンテターゼの発現を最適化し、活性を強化することが非常に重要である。グルタミンシンテターゼの活性化には2価の金属イオンが必要であり、グリシン、アラニン、トリプトファン、ヒスチジン、グルコサミン-6-リン酸、シチジン三リン酸などにより活性が阻害される。また、405番目のアミノ酸のアデニリル化により活性が阻害される。先行研究によれば、405番目のアミノ酸をチロシンからフェニルアラニンに置換してアデニリル化による阻害を解除する研究が報告されている(特許文献1)。しかし、依然として高効率でL-グルタミンを生産する方法の開発が求められている。
Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277
Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797
Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066
Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518
Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374
Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64
Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900
Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680
Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615
Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402
Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815
McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881
Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919
Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16
Sambrook et al. Molecular Cloning 2012
J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York 9.50-9.51, 11.7-11.8
Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)
Van der Rest et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 52:541-545, 1999
こうした背景の下、本発明者らは、L-グルタミン生産能が向上した微生物を開発すべく努力した結果、L-グルタミンの生産を増加させるグルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチドを確保し、本発明を完成するに至った。
本出願は、配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。
本出願は、本出願の微生物を培地で培養するステップを含む、L-グルタミンを生産する方法を提供する。
本出願のグルタミンシンテターゼ活性を強化した新規な変異型ポリペプチドを用いると、野生型のグルタミンシンテターゼ活性を有する菌株に比べて、成長速度を遅延させることなくグルタミンの生産量を増加させることができるので、グルタミンの大量生産に広く活用することができる。
以下、本出願をより詳細に説明する。なお、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な説明に本発明出願が限定されるものではない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。
本出願の一態様は、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)のアミノ酸配列において401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたグルタミンシンテターゼ変異体を提供する。
具体的には、本出願の一態様は、配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。
本出願における「変異体」、「変異型ポリペプチド」、「変異型タンパク質(酵素)」は混用されてもよい。
本出願における「グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)」とは、微生物にATPが存在する場合に、グルタミン酸とアンモニアをグルタミンに変換する酵素を意味する。例えば、glnA遺伝子によりコードされるものであってもよいが、これに限定されるものではない。本出願の目的上、グルタミン酸とアンモニアをグルタミンに変換する活性を有するタンパク質であればいかなる由来のものでもよく、任意の有機体(植物や微生物など)に由来する酵素を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
前記グルタミンシンテターゼは、コリネバクテリウム属微生物由来の酵素又はその変異体であってもよく、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)由来の酵素又はその変異体であるが、これらに限定されるものではない。
前記グルタミンシンテターゼは、コリネバクテリウム属微生物由来の酵素又はその変異体であってもよく、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)由来の酵素又はその変異体であるが、これらに限定されるものではない。
具体的には、前記グルタミンシンテターゼは、配列番号1のアミノ酸配列、又はそれと80%以上、100%未満の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよいが、グルタミンシンテターゼ活性を有するものであれば、これらに限定されるものではない。より具体的には、本出願のグルタミンシンテターゼは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の相同性もしくは同一性を有するポリペプチドを含むものである。また、このような相同性もしくは同一性を有して前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する補助タンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
本出願における「グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド」又は「グルタミンシンテターゼ変異体」とは、グルタミンシンテターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列の一部が他のアミノ酸に置換されることにより、変化したグルタミンシンテターゼ活性を有するポリペプチドを意味する。具体的には、前記変異型ポリペプチドは、グルタミンシンテターゼ活性を有する様々な配列のポリペプチド上で配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドであってもよい。
本出願の「N番目の位置」には、N番目の位置、及びN番目の位置に相当(Corresponding)するアミノ酸位置が含まれる。具体的には、対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドの対応するアミノ酸位置が含まれる。より具体的には、前記対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列又はそれと98%以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよく、配列番号1のアミノ酸配列において401番目、402番目又は404番目の位置には、配列番号1のアミノ酸配列に80%以上、100%未満の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列において前記401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸位置が含まれる。
前記N番目の位置に相当するアミノ酸位置、又は対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドの対応するアミノ酸位置は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献1)で行われるように、Needleman-Wunschアルゴリズム(非特許文献2)、具体的にはバージョン5.0.0又はそれ以降のバージョンを用いて決定することができる。用いられるパラメータは、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ延長ペナルティ0.5及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスであってもよい。
前記N番目の位置に相当するアミノ酸位置、又は対象タンパク質と同じ活性を有するポリペプチドの対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基の確認は、各デフォルトパラメータを用いるMUSCLE(multiple sequence comparison by log-expectation;バージョン3.5又はそれ以降のバージョン;非特許文献3)、MAFFT(バージョン6.857又はそれ以降のバージョン;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8)及びClustal Wを用いるEMBOSS EMMA(1.83又はそれ以降のバージョン;非特許文献9)をはじめとするいくつかのコンピュータプログラムを用いた複数のポリペプチド配列のアライメントにより決定することができるが、これらに限定されるものではない。
その他、ポリペプチドが従来の配列ベースの比較でそれらの関係を検出できない場合(非特許文献10)は、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムが用いられてもよい。配列ベースの検索においては、データベースを検索するためのポリペプチドファミリー(プロファイル)の確率的表現を用いる検索プログラムにより高感度が得られる。例えば、PSI-BLASTプログラムは、反復データベース検索過程により、プロファイルを算出し、遠縁な相同体を検出することができる(非特許文献11)。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて少なくとも1つの表現を有する場合は、はるかに大きな感度が得られる。GenTHREADER(非特許文献12;非特許文献13)などのプログラムは、クエリー配列(query sequence)の構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへの入力として様々な供給源(PSI-BLAST、二次構造予測、構造アラインメントプロファイル及び溶媒和ポテンシャル)からの情報を用いる。同様に、非特許文献14の方法は、未知の構造の配列とSCOPデータベースに存在するスーパーファミリーモデルをアラインメントするために用いられる。これらのアラインメントはポリペプチドに対する相同性、類似性又は同一性モデルを生成するために順次用いられ、これらのモデルはその目的のために開発された様々なツールを用いて正確性の評価が行われる。
前記「他のアミノ酸」は、各位置に相当するアミノ酸を除く他のアミノ酸であればいかなるものでもよい。具体的には、前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、セリン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジン、システイン、チロシン、リシン、アスファルト酸及びグルタミン酸からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸であるが、これらに限定されるものではない。
「アミノ酸」は、側鎖の性質によって酸性、塩基性、極性(親水性)、非極性(疎水性)の4種類に分けられる。
前記変異体は、配列番号1のアミノ酸配列において、各位置のアミノ酸が非極性アミノ酸であるグリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)及びプロリン(P)、極性アミノ酸であるセリン(S)、トレオニン(T)、システイン(C)、チロシン(Y)、アスファルト酸(D)及びグルタミン(Q)、酸性アミノ酸であるアスパラギン(N)及びグルタミン酸(E)、塩基性アミノ酸であるリシン(K)、アルギニン(R)及びヒスチジン(H)からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸に置換されたタンパク質であってもよいが、これらに限定されるものではない。
具体的には、401番目の位置に相当するアミノ酸は酸性アミノ酸又は極性アミノ酸に置換されたものであり、402番目の位置に相当するアミノ酸は塩基性アミノ酸に置換されたものであり、404番目の位置に相当するアミノ酸は非極性アミノ酸に置換されたものであるが、これらに限定されるものではない。
より具体的には、401番目の位置に相当するアミノ酸はアスパラギン、グルタミン酸又はセリンに置換されたものであり、402番目の位置に相当するアミノ酸はヒスチジンに置換されたものであり、404番目の位置に相当するアミノ酸はバリンに置換されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願において、配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドは、配列番号2~6のいずれかの配列であってもよい。
具体的には、前記401番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号2を含んでもよく、前記401番目の位置に相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換された変異型ポリペプチドは配列番号3を含んでもよく、前記401番目の位置に相当するアミノ酸がセリンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号4を含んでもよい。
また、前記402番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号5を含んでもよく、前記404番目の位置に相当するアミノ酸がバリンに置換された変異型ポリペプチドは配列番号6を含んでもよい。
前記変異型ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と80%以上、100%未満の配列相同性を有する、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。具体的には、本出願の前記変異型ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の相同性を有するものであり、また、そのような相同性を有して前記タンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、401番目、402番目又は404番目の位置のアミノ酸配列以外に、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記タンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、前記アミノ酸配列の前後へのタンパク質の機能を変更しない配列の付加や、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異(silent mutation)又は保存的置換を除外するものではなく、そのような配列の付加や突然変異を有するものも本願に含まれることは言うまでもない。
前記変異型ポリペプチドには、特定位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された以外に、少なくとも1つのアミノ酸が保存的置換(conservative substitution)及び/又は改変(modification)により前記列挙した配列(the recited sequence)とは異なるが、前記タンパク質の機能(functions)又は特性(properties)が維持されるポリペプチドが含まれる。
本出願における「保存的置換(conservative substitution)」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び/又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸の置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び/又は両親媒性(amphipathic nature)における類似性に基づいて発生し得る。通常、保存的置換は、タンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
また、前述した特定位置のアミノ酸以外の少なくとも1つのアミノ酸が変異した変異型は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に(co-translationally)又は翻訳後に(post-translationally)タンパク質の転移(transfer)に関与するタンパク質のN末端のシグナル(又はリーダー)配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
また、前記変異型ポリペプチドは、前述した配列番号1の変異及び/又は配列番号1の変異と変異位置以外に少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸を含んでもよい。すなわち、配列番号2~6のいずれかの配列と80%以上、100%未満の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されるものではない。具体的には、本出願の前記変異型ポリペプチドは、配列番号2~6のいずれかの配列と80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸を含んでもよい。配列番号1の変異は前述した通りであり、その相同性又は同一性は前述した変異以外の位置で相同性又は同一性を有するものであってもよい。
本出願の目的上、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、活性が野生型より強化されたものであってもよい。具体的には、配列番号1の野生型に比べて、グルタミンシンテターゼ活性が増加及び強化されたものであってもよい。
本出願におけるポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性を内在性活性に比べて増加させることを意味する。前記強化は、活性化(activation)、上方調節(up-regulation)、過剰発現(overexpression)、増加(increase)などと混用されてもよい。ここで活性化、強化、上方調節、過剰発現、増加には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。
前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用されてもよい。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「増加」するとは、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び/又は濃度(発現量)に比べて向上することを意味する。
前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用されてもよい。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「増加」するとは、形質変化の前に親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び/又は濃度(発現量)に比べて向上することを意味する。
前記強化は、外来ポリペプチドの導入により達成してもよく、内在性ポリペプチドの活性及び/又は濃度(発現量)の強化により達成してもよい。前記ポリペプチドの活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチドの活性の程度、発現量、又は当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加により確認することができる。
前記ポリペプチドの活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化できるものであれば、いかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であり、当該技術分野における通常の技術者に周知の遺伝子工学及び/又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない(例えば、非特許文献15、16など)。
具体的には、本出願のポリペプチドの強化は、1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換すること、3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドン又は5’UTR領域をコードする塩基配列を改変すること、4)ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドのアミノ酸配列を改変すること、5)ポリペプチドの活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変すること(例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列を改変すること)、6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチド又はそれをコードする外来ポリヌクレオチドを導入すること、7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、8)ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は9)前記1)~8)から選択される2つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。
より具体的には、前記1)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞内に導入することにより行われる。あるいは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体内に1コピー又は2コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞に導入することにより行われるが、これに限定されるものではない。前記ベクターについては前述した通りである。
前記2)ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域(又は発現調節配列)を活性が強力な配列に置換することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より強い活性を有する配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。例えば、本来のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
公知の強力なプロモーターの例としては、CJ1~CJ7プロモーター(特許文献2)、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、gapAプロモーター、SPL7プロモーター、SPL13(sm3)プロモーター(特許文献3)、O2プロモーター(特許文献4)、tktプロモーター、yccAプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
前記3)ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドン又は5'UTR領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が高い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
前記4)及び5)のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が増加するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。前記選択マーカーについては前述した通りである。
前記6)ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記ポリペプチドと同一/類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一/類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成されてその活性が増加する。
前記7)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化するか、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われる。
前記8)ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部位を選択して改変又は修飾することにより行われる。
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度、発現量が野生型や改変前の微生物菌株で発現するポリペプチドの活性又は濃度に比べて増加するか、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することにより行われるが、これらに限定されるものではない。
例えば、本出願の変異型ポリペプチドは、野生型に比べてグルタミン生産能が向上することが確認され、グルタミンシンテターゼ活性が強化されることが確認された(表1~3)。
本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、(a)微生物中の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ(engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)を用いたゲノム編集、並びに/又は(b)紫外線や放射線などの光及び/もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、DNA組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え(homologous recombination)を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。前記導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。
本出願の他の態様は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
配列番号1のアミノ酸配列、グルタミンシンテターゼ及びグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドについては前述した通りである。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体(monomer)が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体(polymer)であって、所定の長さより長いDNA又はRNA鎖であり、より具体的には前記変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本出願のポリヌクレオチドは、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチドをコードする配列であればいかなるものでもよい。例えば、配列番号2~6のアミノ酸配列のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列であるが、これらに限定されるものではない。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退(degeneracy)により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。よって、コドンの縮退(codon degeneracy)により、前記アミノ酸配列からなるポリペプチド、又はそれと相同性もしくは同一性を有するポリペプチド、より具体的には80%以上、100%未満の相同性もしくは同一性を有するポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドも含まれることは言うまでもない。
また、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードする配列であればいかなるものでもよい。
前記「ストリンジェントな条件(stringent condition)」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献(非特許文献17、18参照)に具体的に記載されている。
例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上もしくは99%以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション(southern hybridization)の洗浄条件である60℃、1×SSC、0.1%SDS、具体的には60℃、0.1×SSC、0.1%SDS、より具体的には68℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度及び温度において、1回、具体的には2回~3回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、2つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、DNAにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Tm値は、60℃、63℃又は65℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である(例えば、非特許文献17)。
本出願における「相同性(homology)」又は「同一性(identity)」とは、2つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられてもよい。
保存されている(conserved)ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか(homologous)又は同じ(identical)配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件(stringent conditions)下において、一般に配列全体又は一部分とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドンの縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。
任意の2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献19のようなデフォルトパラメーターと「FASTA」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献1)(バージョン5.0.0又はそれ以降のバージョン)で行われるように、ニードルマン=ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(非特許文献2)を用いて決定することができる(GCGプログラムパッケージ(非特許文献20)、BLASTP、BLASTN、FASTA(非特許文献21、22及び23)を含む)。例えば、国立生物工学情報センターのBLAST又はClustal Wを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献24に開示されているように、非特許文献2などのGAPコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、GAPプログラムは、2つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号(すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸)の数を割った値と定義している。GAPプログラムのためのデフォルトパラメーターは、(1)二進法比較マトリックス(同一性は1、非同一性は0の値をとる)及び非特許文献25に開示されているように、非特許文献26の加重比較マトリックス(又はEDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス)と、(2)各ギャップに3.0のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の0.10ペナルティ(又はギャップオープンペナルティ10、ギャップ延長ペナルティ0.5)と、(3)末端ギャップに無ペナルティとを含む。
本出願のさらに他の態様は、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、本出願の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本出願のベクターを含む微生物を提供する。
本出願のベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるための発現ベクターであってもよいが、これに限定されるものではない。
本出願におけるベクターとは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域(又は発現調節配列)に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。
例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、pDZ系、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系、pET系などを用いることができる。具体的には、pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いることができる。
例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、pDZ系、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系、pET系などを用いることができる。具体的には、pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いることができる。
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え(homologous recombination)により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤(selective agent)で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
前記微生物は、L-グルタミン生産能を有する微生物であってもよい。
本出願における「微生物(又は菌株)」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変(modification)が行われた微生物である。
具体的には、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含む微生物とは、自然にL-グルタミン生産能を有する微生物、又はL-グルタミン生産能のない親株にL-グルタミン生産能が付与された微生物を意味する。
本出願における「グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含む微生物」とは、本出願の変異型ポリペプチドが発現するように組換えられた微生物を意味する。
例えば、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはそれを含むベクターで形質転換されて前記変異型ポリペプチドを発現する、宿主細胞又は微生物を意味する。
本出願における「グルタミン」は、アミノ酸の一種であって、消化器疾患治療、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品、健康食品などに広く用いられるアミノ酸である。前記グルタミンは、ATP存在下でグルタミンシンテターゼによりグルタミン酸及びアンモニアから変換されることにより作製されてもよい。すなわち、本出願においては、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含むため、グルタミンシンテターゼの活性が強化されるので、それを含む微生物のグルタミン生産能を向上させることができる。
具体的には、本出願における前記グルタミンはL-グルタミンであってもよく、本出願において「グルタミン」と「L-グルタミン」は混用される。
本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするDNA及び/又はRNAを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター(promoter)、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。
本出願の目的上、前記微生物は、配列番号1のアミノ酸配列において401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよい。具体的には、配列番号1のN末端から401番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギン、グルタミン酸又はセリンに置換されるか、402番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジンに置換されるか、404番目の位置に相当するアミノ酸がバリンに置換されることにより、グルタミンシンテターゼ活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であり、より具体的には、配列番号1のN末端から401番目の位置のアミノ酸がアスパラギン、グルタミン酸又はセリンに置換されるか、402番目の位置のアミノ酸がヒスチジンに置換されるか、404番目の位置のアミノ酸がバリンに置換されることにより、グルタミンシンテターゼ活性を有する、変異型ポリペプチドを発現する微生物であるが、これらに限定されるものではない。例えば、前記微生物は、前記401番目、402番目又は405番目の位置に変異を含むと共に、配列番号1の配列と80%以上、100%未満の同一性又は相同性を有する変異型ポリペプチドを発現するか、配列番号2~6のいずれかの配列の変異型ポリペプチドを発現する微生物であってもよい。前記微生物は、前記変異位置のアミノ酸が置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを含むので、グルタミンシンテターゼ活性が強化され、生長を妨げることなくグルタミンの生産量を増加させるものである。
本出願において、前記変異型ポリペプチドを含む微生物は、その種類が特に限定されるものではないが、エンテロバクター(Enterbacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物であってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する微生物である。
本出願における「コリネバクテリウム属(The genus of Corynebacterium)微生物」は、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)などであるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。一具体例として、本出願におけるコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である。
本出願の微生物には、前記ポリヌクレオチド又はベクター導入以外にも、様々な公知の方法による、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを発現する微生物が全て含まれる。
本出願のさらに他の態様は、配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物(又は本出願の微生物)を培地で培養するステップを含む、L-グルタミンを生産する方法を提供する。
また、本出願の一具体例として、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよく、前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである。
本出願における「培養」とは、本出願の微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び/又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び/又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、pHなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
具体的には、コリネバクテリウム属菌株の培養培地は、非特許文献27に開示されている。
本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜(すなわち、還元糖に変換した糖蜜)などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、2種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、NZ-アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、2種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び/又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のpHを調整することができる。さらに、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入なくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願の培養において、培養温度は20~45℃、具体的には25~40℃に維持し、約10~160時間培養するが、これらに限定されるものではない。
本出願の培養により生産されたL-グルタミンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
本出願のL-グルタミン生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ(任意の順序,in any order)を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。
本出願のL-グルタミン生産方法は、前述したように培養した培地(培養培地)又は本出願の微生物からL-グルタミンを回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするL-グルタミンを回収(collect)するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理(塩析法)、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、HPLC又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするL-グルタミンを回収することができる。
また、本出願のL-グルタミン生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のL-グルタミン生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は1つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願の方法における変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、L-グルタミンなどについては前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、配列番号1のアミノ酸配列において401番目の位置に相当するアミノ酸、402番目の位置に相当するアミノ酸、又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドが発現するように微生物を改変することを含む、L-グルタミン生産能を向上させる方法を提供する。
本出願のさらに他の態様は、前記変異型ポリペプチド、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又はそれらのうち少なくとも1つを発現する微生物のL-グルタミン生産能向上用途を提供する。
前記変異型ポリペプチド、他のアミノ酸、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、L-グルタミンなどについては前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又はそれらのうち少なくとも1つを発現する微生物又はその培養液を含む、L-グルタミン生産用組成物を提供する。
前記変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、L-グルタミンなどについては前述した通りである。
前記L-グルタミン生産用組成物とは、本出願のグルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドによりL-グルタミンを生産する組成物を意味する。前記組成物は、前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチド、又は前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを作動させる構成を含むものであればいかなるものでもよい。前記グルタミンシンテターゼ活性を有する変異型ポリペプチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるようにベクターに含まれる形態であってもよい。
前記組成物は、凍結保護剤又は賦形剤をさらに含んでもよい。前記凍結保護剤又は賦形剤は、非自然発生(non-naturally occurring)の物質、又は自然発生の物質であるが、これらに限定されるものではない。
他の具体例として、前記凍結保護剤又は賦形剤は、前記微生物が自然に接触しない物質、又は前記微生物と自然に同時に含まれない物質であるが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
glnA遺伝子ORF内変異導入用ベクターライブラリーの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のグルタミンシンテターゼをコードするglnA遺伝子の発現量又はその活性が強化された変異体を見出すために、次の方法でライブラリーを作製した。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のグルタミンシンテターゼをコードするglnA遺伝子の発現量又はその活性が強化された変異体を見出すために、次の方法でライブラリーを作製した。
まず、glnA(1,434bp)遺伝子を含むDNA断片(1,434bp)に1kb当たり0~4.5個の変異を導入するために、GenemorphII Random Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いた。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032(WT)の染色体を鋳型とし、配列番号7及び8からなるプライマーセットを用いてError-prone PCRを行った。具体的には、WT菌株の染色体(500ng)、プライマー7及び8(それぞれ125ng)、Mutazyme II reaction buffer(1Υ)、dNTP mix(40mM)、Mutazyme II DNA polymerase(2.5U)を含む反応液を用いて、94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で2分間の重合を25サイクル行い、次いで72℃で10分間の重合反応を行った。
TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen)を用いて、増幅した遺伝子断片をpCRIIベクターに連結し、大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)を含むLB固体培地に塗抹した。形質転換したコロニー20種を選択し、プラスミドを得て塩基配列を分析した結果、0.5mutations/kbの頻度で異なる位置に変異が導入されたことが確認された。最終的に約10,000個の形質転換した大腸菌コロニーを得てプラスミドを抽出し、これをpTOPO-glnA(mt)ライブラリーと命名した。
glnA欠損株の作製及びglnA変異株のスクリーニング
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032においてglnA遺伝子が欠損した菌株を作製するために、次のようにglnA遺伝子が欠損したベクターpDZ-△glnAを作製した。具体的には、glnA遺伝子の5’及び3’末端に位置するDNA断片(それぞれ1000bp)がpDZベクター(特許文献5)に連結された形態に作製した。
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032においてglnA遺伝子が欠損した菌株を作製するために、次のようにglnA遺伝子が欠損したベクターpDZ-△glnAを作製した。具体的には、glnA遺伝子の5’及び3’末端に位置するDNA断片(それぞれ1000bp)がpDZベクター(特許文献5)に連結された形態に作製した。
配列番号29のglnA遺伝子の塩基配列に基づいて、5’断片及び3’断片に制限酵素SalI認識部位を挿入したプライマー配列番号10及び11と、それらからそれぞれ1000bp離れた位置のプライマー配列番号9及び12を合成した。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の染色体を鋳型とし、5’末端の遺伝子断片は、配列番号9及び10からなるプライマーセットを用いて、PCRにより作製した。同様に、glnA遺伝子の3’末端に位置する遺伝子断片は、配列番号11及び12を用いて、PCRにより作製した。PCR条件は、94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で40秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で10分間の重合反応を行うものとした。
一方、制限酵素SalIで処理し、その後65℃で20分間熱処理したpDZベクターと、前記PCRにより増幅した挿入DNA断片をInfusion Cloning Kitを用いて連結し、次いで大腸菌DH5αに形質転換し、カナマイシン(25mg/l)を含むLB固体培地に塗抹した。配列番号13及び14からなるプライマーセットを用いたPCRにより、標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法によりプラスミドを得て、このプラスミドをpDZ-△glnAと命名した。
前述したように作製したベクターpDZ-△glnAをコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032に電気パルス法(非特許文献28)で形質転換し、相同染色体組換えによりglnA遺伝子が欠損した菌株を作製した。このようにglnA遺伝子が欠損した菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032::△glnAと命名した。
また、ATCC13032::△glnA菌株を対象にpTOPO-glnA(mt)ライブラリーを電気パルス法で形質転換し、カナマイシン(25mg/l)を含む複合平板培地に塗抹して約100個のコロニーを確保した。確保した100株の菌株に対してL-グルタミン生産能テストを行った。グルタミン生産培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに得られた100株の菌株をそれぞれ接種し、その後32℃、200rpmで48時間振盪培養した。後述するL-グルタミン生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃、200rpmで48時間振盪培養した。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032及びATCC13032::△glnA菌株を対照区として用いた。培養終了後に、細胞を除去した培地の上清中に存在するL-グルタミンをYSI 7100 Multiparameter Bioanalytical System(YSI Inc.)により測定した。ATCC13032::△glnA菌株に比べてL-グルタミン生産能を有するだけでなく、ATCC13032よりL-グルタミン濃度が高い菌株を選択した。培養液中のグルタミン濃度を表1に示す。選択した種の菌株をATCC13032::glnA(mt)-1~3と命名した。その他97種のコロニーは、対照区として用いたATCC13032よりL-グルタミン濃度が低かった。
表1に示すように、対照群に比べて、ATCC13032::glnA(mt)-1においては、生産能が約40%向上することが確認され、ATCC13032::glnA(mt)-2においては、生産能が約11%向上することが確認され、ATCC13032::glnA(mt)-3においては、生産能が約18%向上することが確認された。
3種のglnA変異株の塩基配列の確認
3種の選択菌株ATCC13032::glnA(mt)-1~3のglnA遺伝子の塩基配列を確認するために、実施例1の配列番号7及び8のプライマーセットを用いて、染色体内glnA遺伝子を含むDNA断片をPCR増幅した。PCR条件は、94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で40秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で10分間の重合反応を行うものとした。
3種の選択菌株ATCC13032::glnA(mt)-1~3のglnA遺伝子の塩基配列を確認するために、実施例1の配列番号7及び8のプライマーセットを用いて、染色体内glnA遺伝子を含むDNA断片をPCR増幅した。PCR条件は、94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で40秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で10分間の重合反応を行うものとした。
増幅した遺伝子の塩基配列を分析した結果、3種の菌株のうち、順にATCC13032::glnA(mt)-1は、配列番号5の1201~1203番目の塩基配列が従来のGACからAACに置換され、N末端から401番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がアスパラギンに置換された形態の変異体が発現する菌株であり、ATCC13032::glnA(mt)-2は、配列番号5の1204~1206番目の塩基配列が従来のAAGからCACに置換され、N末端から402番目のアミノ酸であるリシンがヒスチジンに置換された変異体が発現する菌株であり、ATCC13032::glnA(mt)-3は、配列番号5の1210~1212番目の塩基配列が従来のCTCからGTCに置換され、N末端から404番目のアミノ酸であるロイシンがバリンに置換された変異体が発現する菌株であることが確認された。前記3種の菌株のうち、L-グルタミン生産量がATCC13032より増加すると共に、生長速度が同等であるATCC13032::glnA(mt)-1菌株を最も優れたグルタミンシンテターゼ活性強化菌株として選択した。
glnA遺伝子の401番目のアミノ酸であるアスパラギン酸が他のアミノ酸に置換された様々な菌株の作製
実施例3で401番目のアミノ酸が酵素活性に重要な位置であることが確認されたので、配列番号1で表されるタンパク質配列の401番目のアミノ酸の位置における、野生型が有するアスパラギン酸を除く他のアミノ酸への置換を試みた。
実施例3で401番目のアミノ酸が酵素活性に重要な位置であることが確認されたので、配列番号1で表されるタンパク質配列の401番目のアミノ酸の位置における、野生型が有するアスパラギン酸を除く他のアミノ酸への置換を試みた。
実施例3で確認した変異であるD401Nを含む4種の異種塩基置換変異を導入するために、それぞれの組換えベクターを次の方法で作製した。
まず、WT菌株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、glnA遺伝子の1201~1203番目の位置から前後にそれぞれ約600bp離れた位置の5’断片及び3’断片に制限酵素SalI認識部位を挿入したプライマー配列番号15及び16を合成した。4種の異種塩基置換変異を導入すべく、glnA遺伝子の1201~1203番目の塩基配列を置換するための配列番号17~26のプライマーを合成した。
さらに、周知のglnAのアデニリル化解除変異であるY405Fとグルタミン生産能を比較するために、配列番号27及び28のプライマーを合成した。
具体的には、pDZ-glnA(D401N)プラスミドは、glnA遺伝子の5’及び3’末端に位置するDNA断片(それぞれ600bp)がpDZベクター(特許文献5)に連結された形態に作製した。WT菌株の染色体を鋳型とし、5’末端の遺伝子断片は、配列番号15及び18からなるプライマーセットを用いて、PCRにより作製した。PCR条件は、94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で40秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で10分間の重合反応を行うものとした。同様に、glnA遺伝子の3’末端に位置する遺伝子断片は、配列番号17及び16からなるプライマーセットを用いて、PCRにより作製した。増幅したDNA断片をQuiagen社のPCR Purification kitを用いて精製し、その後ベクターの作製のための挿入DNA断片として用いた。
一方、制限酵素SalIで処理し、その後65℃で20分間熱処理したpDZベクターと、前記PCRにより増幅した挿入DNA断片をInfusion Cloning Kitを用いて連結し、次いで大腸菌DH5αに形質転換した。カナマイシン(25mg/l)を含むLB固体培地に前記菌株を塗抹した。配列番号13及び14からなるプライマーセットを用いたPCRにより、標的遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後周知のプラスミド抽出法によりプラスミドを得た。前記プラスミドをpDZ-glnA(D401N)と命名した。
同様に、配列番号15及び20からなるプライマーセット及び配列番号19及び16からなるプライマーセットを用いて、pDZ-glnA(D401E)を作製し、また、配列番号15及び24からなるプライマーセット及び配列番号23及び16からなるプライマーセットを用いて、pDZ-glnA(D401S)を作製した。それだけでなく、配列番号15及び28からなるプライマーセット及び配列番号27及び16からなるプライマーセットを用いて、pDZ-glnA(Y405F)を作製した。
glnA変異導入によるグルタミン濃度及び生長速度をより明確にするために、グルタミンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032に作製した各ベクターを電気パルス法で形質転換し、相同染色体組換えによりglnA遺伝子に異種塩基置換変異が導入された4種の菌株、ATCC13032::glnA(D401N)、ATCC13032::glnA(D401E)、ATCC13032::glnA(D401S)、ATCC13032::glnA(Y405F)を作製した。これらのうち、ATCC13032::glnA(D401N)をCA11-4021と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM)に2019年12月19日付けで寄託番号KCCM12645Pとして寄託した。
glnA変異株におけるグルタミン生産能の分析
ATCC13032菌株を対照群として用いて、実施例4で作製した4種の菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。
ATCC13032菌株を対照群として用いて、実施例4で作製した4種の菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。
まず、種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃、200rpmで20時間振盪培養した。次に、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、32℃、200rpmで48時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、HPLC(Waters 2478)を用いてL-グルタミンの濃度を測定した。グルタミン生産能及び糖消費速度の測定結果を表2に示す。
種培地(pH7.0)
グルコース20g,ペプトン10g,酵母抽出物5g,尿素1.5g,KH2PO4 4g,K2HPO4 8g,MgSO4・7H2O 0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
グルタミン生産培地(pH8.0)
原糖60g,(NH4)2SO4 45g,大豆タンパク質0.48g,CaCO3 50g,MgSO4・7H2O 0.4g,KH2PO4 1g,チアミン塩酸塩0.2mg,ビオチン0.3mg,ニコチンアミド60mg,FeSO4・7H2O 10mg,MnSO4・H2O 10mg(蒸留水1リットル中)
種培地(pH7.0)
グルコース20g,ペプトン10g,酵母抽出物5g,尿素1.5g,KH2PO4 4g,K2HPO4 8g,MgSO4・7H2O 0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
グルタミン生産培地(pH8.0)
原糖60g,(NH4)2SO4 45g,大豆タンパク質0.48g,CaCO3 50g,MgSO4・7H2O 0.4g,KH2PO4 1g,チアミン塩酸塩0.2mg,ビオチン0.3mg,ニコチンアミド60mg,FeSO4・7H2O 10mg,MnSO4・H2O 10mg(蒸留水1リットル中)
配列番号1の401番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドを含む菌株において、置換されたアミノ酸がアスパラギン(ATCC13032::glnA(D401N))、グルタミン酸(ATCC13032::glnA(D401E))であれば、グルタミン生産能がそれぞれ約40%、33%向上することが確認された。これは、glnAのアデニリル化解除変異が導入された菌株ATCC13032::glnA(Y405F)と比較してもグルタミン生産能が向上する結果であった。
グルタミン生産菌株ベースglnA変異株の作製
従来のグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC-10680(特許文献6)菌株を対象に、実施例4と同様に、pDZ-glnA(D401N)、pDZ-glnA(D401E)、pDZ-glnA(Y405F)をそれぞれ電気パルス法で形質転換した。glnA遺伝子に異種塩基置換変異が導入された3種の菌株をそれぞれKFCC-10680::glnA(D401N)、KFCC-10680::glnA(D401E)、KFCC-10680::glnA(Y405F)と命名した。
従来のグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC-10680(特許文献6)菌株を対象に、実施例4と同様に、pDZ-glnA(D401N)、pDZ-glnA(D401E)、pDZ-glnA(Y405F)をそれぞれ電気パルス法で形質転換した。glnA遺伝子に異種塩基置換変異が導入された3種の菌株をそれぞれKFCC-10680::glnA(D401N)、KFCC-10680::glnA(D401E)、KFCC-10680::glnA(Y405F)と命名した。
グルタミン生産菌株ベースglnA変異株におけるグルタミン生産能の分析
KFCC-10680菌株を対照群として用いて、3種の選択菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。
KFCC-10680菌株を対照群として用いて、3種の選択菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。
まず、種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃、200rpmで20時間振盪培養した。次に、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、32℃、200rpmで48時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、HPLC(Waters 2478)を用いてL-グルタミンの濃度を測定した。グルタミン生産能及び糖消費速度の測定結果を表3に示す。
種培地(pH7.0)
グルコース20g,ペプトン10g,酵母抽出物5g,尿素1.5g,KH2PO4 4g,K2HPO4 8g,MgSO4・7H2O 0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
グルタミン生産培地(pH8.0)
原糖60g,(NH4)2SO4 45g,大豆タンパク質0.48g,CaCO3 50g,MgSO4・7H2O 0.4g,KH2PO4 1g,チアミン塩酸塩0.2mg,ビオチン0.3mg,ニコチンアミド60mg,FeSO4・7H2O 10mg,MnSO4・H2O 10mg(蒸留水1リットル中)
種培地(pH7.0)
グルコース20g,ペプトン10g,酵母抽出物5g,尿素1.5g,KH2PO4 4g,K2HPO4 8g,MgSO4・7H2O 0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
グルタミン生産培地(pH8.0)
原糖60g,(NH4)2SO4 45g,大豆タンパク質0.48g,CaCO3 50g,MgSO4・7H2O 0.4g,KH2PO4 1g,チアミン塩酸塩0.2mg,ビオチン0.3mg,ニコチンアミド60mg,FeSO4・7H2O 10mg,MnSO4・H2O 10mg(蒸留水1リットル中)
配列番号1の401番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異型ポリペプチドを含む菌株において、置換されたアミノ酸がアスパラギン(KFCC-10680::glnA(D401N))、グルタミン酸(KFCC-10680::glnA(D401E))であれば、グルタミン生産能がそれぞれ約21%、9%向上することが確認された。
これは、glnAのアデニリル化解除変異が導入された菌株KFCC-10680::glnA(Y405F)と比較してもグルタミン生産能が向上する結果であった。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
寄託機関名:韓国微生物保存センター(国外)
受託番号:KCCM12645P
受託日:2019年12月19日
寄託機関名:韓国微生物保存センター(国外)
受託番号:KCCM12645P
受託日:2019年12月19日
Claims (15)
- 配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチド。
- 401番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギン(Asparagine)、グルタミン酸(Glutamic acid)又はセリン(Serine)に置換された、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
- 402番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジン(Histidine)に置換された、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
- 404番目の位置に相当するアミノ酸がバリン(Valine)に置換された、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
- 前記変異型ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と80%以上、100%未満の配列相同性を有する、請求項1に記載のグルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチド。
- 前記変異型ポリペプチドは、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5又は配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物。
- 前記微生物はL-グルタミン生産能を有する、請求項8に記載の微生物。
- 前記微生物はコリネバクテリウム属微生物である、請求項8に記載の微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項10に記載の微生物。
- 配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養するステップを含む、L-グルタミンを生産する方法。
- 前記培養した培地又は微生物からL-グルタミンを回収又は分離するステップをさらに含む、請求項12に記載のL-グルタミンを生産する方法。
- 前記微生物はコリネバクテリウム属微生物である、請求項12に記載のL-グルタミンを生産する方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項14に記載のL-グルタミンを生産する方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200027322A KR102198072B1 (ko) | 2020-03-04 | 2020-03-04 | 글루타민 신테타아제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법 |
KR10-2020-0027322 | 2020-03-04 | ||
JP2021562185A JP7371119B2 (ja) | 2020-03-04 | 2021-03-04 | グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 |
PCT/KR2021/002652 WO2021177731A1 (ko) | 2020-03-04 | 2021-03-04 | 글루타민 신테타아제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021562185A Division JP7371119B2 (ja) | 2020-03-04 | 2021-03-04 | グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023110008A true JP2023110008A (ja) | 2023-08-08 |
JP2023110008A5 JP2023110008A5 (ja) | 2023-08-31 |
Family
ID=74127205
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021562185A Active JP7371119B2 (ja) | 2020-03-04 | 2021-03-04 | グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 |
JP2023090522A Pending JP2023110008A (ja) | 2020-03-04 | 2023-05-31 | グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021562185A Active JP7371119B2 (ja) | 2020-03-04 | 2021-03-04 | グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220396815A1 (ja) |
EP (1) | EP3954767A4 (ja) |
JP (2) | JP7371119B2 (ja) |
KR (1) | KR102198072B1 (ja) |
CN (1) | CN114375332B (ja) |
BR (1) | BR112021022223B1 (ja) |
WO (1) | WO2021177731A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102198072B1 (ko) * | 2020-03-04 | 2021-01-04 | 씨제이제일제당 주식회사 | 글루타민 신테타아제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법 |
WO2022108383A1 (ko) | 2020-11-20 | 2022-05-27 | 씨제이제일제당 (주) | L-글루타민 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4560998B2 (ja) | 2001-02-05 | 2010-10-13 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−グルタミンの製造法及びl−グルタミン生産菌 |
RU2230114C2 (ru) * | 2001-11-30 | 2004-06-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Мутантная глутаминсинтетаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli - продуцент l-глутамина и способ получения l-аминокислот |
JP2004187684A (ja) * | 2002-11-26 | 2004-07-08 | Ajinomoto Co Inc | L−グルタミンの製造法及びl−グルタミン生産菌 |
JP4576850B2 (ja) * | 2003-03-03 | 2010-11-10 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−アルギニン又はl−リジンの製造法 |
EP1460128B1 (en) * | 2003-03-03 | 2016-11-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-arginine or L-lysine by fermentation |
KR100620092B1 (ko) | 2004-12-16 | 2006-09-08 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법 |
CN100392075C (zh) * | 2006-06-29 | 2008-06-04 | 清华大学 | 谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与应用 |
JP5048996B2 (ja) | 2006-11-10 | 2012-10-17 | 昭和電工株式会社 | 加工性に優れた耐摩耗性アルミニウム合金材およびその製造方法 |
EA031448B1 (ru) * | 2012-02-16 | 2019-01-31 | Зингента Партисипейшнс Аг | Сконструированные пестицидные белки |
KR101494072B1 (ko) * | 2012-03-12 | 2015-02-17 | 한화케미칼 주식회사 | 변이된 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법 |
KR101632642B1 (ko) | 2015-01-29 | 2016-06-22 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 프로모터 및 그의 용도 |
ES2907694T3 (es) | 2016-08-31 | 2022-04-26 | Cj Cheiljedang Corp | Nuevo promotor y uso del mismo |
KR102198072B1 (ko) * | 2020-03-04 | 2021-01-04 | 씨제이제일제당 주식회사 | 글루타민 신테타아제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법 |
-
2020
- 2020-03-04 KR KR1020200027322A patent/KR102198072B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-03-04 US US17/604,896 patent/US20220396815A1/en active Pending
- 2021-03-04 WO PCT/KR2021/002652 patent/WO2021177731A1/ko unknown
- 2021-03-04 JP JP2021562185A patent/JP7371119B2/ja active Active
- 2021-03-04 EP EP21764687.6A patent/EP3954767A4/en active Pending
- 2021-03-04 BR BR112021022223-5A patent/BR112021022223B1/pt active IP Right Grant
- 2021-03-04 CN CN202180004868.7A patent/CN114375332B/zh active Active
-
2023
- 2023-05-31 JP JP2023090522A patent/JP2023110008A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7371119B2 (ja) | 2023-10-30 |
BR112021022223B1 (pt) | 2023-09-26 |
CN114375332A (zh) | 2022-04-19 |
EP3954767A4 (en) | 2022-08-03 |
WO2021177731A1 (ko) | 2021-09-10 |
CN114375332B (zh) | 2024-01-12 |
JP2022529297A (ja) | 2022-06-20 |
US20220396815A1 (en) | 2022-12-15 |
BR112021022223A2 (pt) | 2022-09-20 |
KR102198072B1 (ko) | 2021-01-04 |
EP3954767A1 (en) | 2022-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021221374B2 (en) | Microorganism comprising variant LysE and method of L-amino acid production using same | |
JP6998466B2 (ja) | クエン酸シンターゼの活性が弱化された変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-アミノ酸生産方法 | |
JP2023110008A (ja) | グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 | |
CN112004926B (zh) | 变体磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶及使用其制备嘌呤核苷酸的方法 | |
CN114729338B (zh) | 变异二氢吡啶二羧酸还原酶多肽和使用其生产l-苏氨酸的方法 | |
KR102527895B1 (ko) | GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 | |
JP2024517013A (ja) | 3-メチル-2-オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物、およびその用途 | |
JP2023553135A (ja) | 新規な分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ変異体及びこれを用いたイソロイシン生産方法 | |
CN114402070A (zh) | 新的l-苏氨酸脱水酶变体及使用其生产l-异亮氨酸的方法 | |
CN115500080A (zh) | 新型双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/亚甲基四氢叶酸环水解酶变体及使用其生产xmp或gmp的方法 | |
KR102619598B1 (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 | |
KR102527102B1 (ko) | 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법 | |
RU2802274C1 (ru) | Новый вариант аминотрансферазы аминокислот с разветвленной цепью и способ получения лейцина с его использованием | |
RU2794484C1 (ru) | Новый вариант dahp синтазы и способ получения l-лизина с его применением | |
JP7470187B2 (ja) | アセトヒドロキシ酸シンターゼ新規変異体及びこれを含む微生物 | |
JP2023550131A (ja) | L-グルタミン生産能が向上した微生物及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 | |
KR20230045990A (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 | |
KR20230045989A (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 | |
CN114096663A (zh) | 具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物及其用途 | |
KR20230136447A (ko) | 거짓쌀도둑거저리 유래 아스파테이트 1-디카복실레이스의 변이체 및 이를 포함하는 미생물 | |
JP2023545878A (ja) | 新規なグルタミン加水分解gmp合成酵素変異体及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法 | |
KR20230031624A (ko) | 신규한 초산 대사 조절자 a 변이체 및 이를 이용한 l-분지쇄 아미노산 생산 방법 | |
JP2024502989A (ja) | aroGアルドラーゼ変異体及びそれを用いた分枝鎖アミノ酸生産方法 | |
JP2023511882A (ja) | L-分枝鎖アミノ酸生産能が強化された微生物及びそれを用いてl-分枝鎖アミノ酸を生産する方法 | |
KR20240023455A (ko) | 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230823 |