KR101494072B1

KR101494072B1 - 변이된 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법

Info

Publication number: KR101494072B1
Application number: KR20130023616A
Authority: KR
Inventors: 장현숙; 이동헌; 김선규; 안용호; 박상경
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2013-03-05
Publication date: 2015-02-17
Also published as: KR20130105380A; US20170211057A1; BR112014022409A2; US9567577B2; EP2825641A1; JP2015513406A; EP2825641A4; WO2013137583A1; US20150044753A1

Abstract

본 발명은 변이된 글루타민 합성효소(Glutamine synthetase, GS) 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 글루타민 합성효소 억제제에 대한 감수성이 증가되도록 변이된 GS, 상기 변이된 GS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 목적 단백질을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 목적 단백질에 관한 것이다.

Description

변이된 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법{An expression vector comprising a polynucleotide encoding a modified glutamine synthetase and a method for preparing a target protein employing the same}

재조합 단백질은 원핵 및 진핵세포를 포함하는 다양한 종류의 숙주세포에서 발현이 가능하다. 그러나 항체나 Fc 융합단백질처럼 당이 폴리펩티드의 특정한 아미노산과 결합하여 효능이나 안전성에 영향을 주는 당단백질(glycoprotein)은 단백질의 번역(translation) 후 수식과정(post-translational modification)에서 당질화(glycosylation)가 가능한 세포 즉, 동물세포를 주로 사용하게 된다. 특히 재조합 단백질 의약품 생산 시에는 당사슬이 인간형(천연형) 당단백질의 당사슬과 얼마나 유사한가가 단백질 의약품의 면역원성(immunogenicity)과도 밀접한 관련이 있기 때문에 인간형 당단백질과 동일하거나 유사한 당사슬을 지닌 당단백질을 생산하는 것이 중요하다.

지금까지 재조합 단백질 의약품의 발현 및 생산에 주로 이용된 동물세포로는 hybridoma, mouse myeloma, CHO 세포 등이 있다. 그러나 이들 동물세포를 이용한 단백질의 발현은 체내 단백질과의 유사성 측면에서는 우수하지만 그 발현량이 현저히 낮고 대량 배양이 어렵다는 단점을 가지고 있다. 특히 치료용 항체의 경우에는 보통 ㎏ 단위의 양을 발현시켜야 하므로 단순히 동물세포배양을 통해 충분한 양의 단백질을 확보하는 것이 쉬운 일이 아니다. 따라서, 이들 숙주세포에서 특정 유전자를 고발현시키기 위해서는 우선 발현을 원하는 DNA가 동물세포 게놈(genome) 상에 무작위적으로 도입될 때 동물세포 DNA의 전사율이 높은 곳으로 유전자를 도입시키는 일이 필요하다. 이렇게 도입된 외부 유전자는 숙주 세포의 게놈과 함께 복제가 되는데, 전사율이 좋은 특정 부위로의 도입 관련 기술(homologous recombination technology)은 아직 일반화되어 사용되지는 않고 있다.

무작위적으로 통합된 DNA의 발현율을 높이는 또 다른 방법은 삽입된 유전자를 증폭시키는 방법으로서, 상기 방법은 적절한 유전자 증폭 시스템을 도입한 벡터로의 클로닝을 필요로 한다. 일반적인 유전자 증폭 시스템은 DHFR 시스템(Takeshi omasa, gene amplification and its application in cell and tissue engineering, J. Bios. and Bioe (2002), Vol. 94, No. 6, 600-605)으로 DHFR(dihydrofolate reductase) 효소의 기질 저해제인 MTX(methotrexate)를 사용하여 원하는 유전자와 DHFR을 함께 증폭시키므로써 발현 단백질의 양을 증가시키는 방법이다. DHFR은 핵산 생합성에 관여하는 효소로 DHFR 활성이 없을 경우 세포 유지에 필수적인 핵산이 합성되지 않아 결국 세포가 죽게 되어, DHFR 유전자가 외부에서 삽입된 특정 클론만이 살아남는다는 원리를 이용한 것으로, MTX 농도를 높여주고 강력한 프로모터를 도입할 경우 수백 내지 수천 카피까지 DHFR 유전자를 증폭시킬 수 있다. 즉, 세포에 DHFR의 저해제인 MTX를 가할수록 세포는 살아남기 위해 DHFR과 주입된 목적 유전자를 함께 증폭시키게 된다. 이에 따라 여러 카피의 DNA가 혼성(incorporation)되므로, 다양한 분자적 변이체(molecular variants)의 확보가 가능하게 된다.

또한, CHO 세포주를 이용한 DHFR 시스템은 여러 단백질 의약품의 발현 시스템으로 도입되어 상용화되어 있으므로 그 안전성과 효용성이 검증되어 있다고 볼 수 있다. 그러나 DHFR 시스템을 사용할 경우 일정 수준 이상의 발현량을 보이는 단일 세포주를 선별하기 위해서는 수 개월 이상의 장시간이 소요되는 단점이 있을뿐만 아니라, MTX에 대한 저항성이 발생하여 MTX 농도를 높여주어도 더 이상 유전자의 증폭이 일어나지 않는다는 문제점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, DHFR 시스템에 사용되고 있는 CHO DUKX 세포 자체에 복귀 돌연변이체(revertant)가 쉽게 생긴다는 문제점 역시 존재하였다. 이에 DHFR 시스템 이외의 다른 단백질 유전자 고발현 시스템을 개발할 필요성이 요구되어 왔다

GS 시스템은 셀테크(Celltech) 사가 최초 개발한 유전자 고발현 시스템으로서(미국등록특허 제5122464호), 상기 DHFR을 이용한 유전자 발현 시스템의 단점 즉, 단일 세포주를 확보할 때까지 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 생산성도 아주 높지 않다는 단점을 개선한 시스템이다. 상기 시스템은, 글루타메이트와 암모니아를 사용하여 글루타민을 생성하는 유일한 대사경로에 관여하는 효소인 GS(glutamine synthetase)를 이용하여, 글루타민이 없는 환경에서 동물세포의 배양에 문제가 발생하는 점을 이용한 것이다. 이러한 GS 시스템은 DHFR 시스템 대비 세포당 적은 DNA 카피가 필요하며, 생산 세포주 스크리닝 초기 단계에서 고발현 세포주를 얻을 수 있다는 장점을 지니고 있다. 이에 따라 현재 단백질 의약품의 발현 시스템으로 GS 시스템을 도입하고 있는 관련업체들이 증가하고 있는 추세이다. 상기 GS 시스템에 주로 사용되는 세포주로는 NS0 세포주와 CHO 세포주가 있으며, 그 중 마우스 골수종 세포인 NS0 세포주의 경우 충분한 GS를 발현하지 못하므로 세포 배양액에 글루타민을 첨가하지 않은 상태에서 쉽게 목적 단백질 유전자가 도입된 세포만을 골라낼 수 있다는 장점을 가진다. 이러한 NS0 세포주와 달리, CHO 세포는 충분한 GS를 발현하기 때문에 배양액에 글루타민이 없는 상태에서도 생존이 가능하다. 그러나, MSX(methionine sulphoximine)와 같은 GS 특이적 저해제를 CHO 세포에 과도한 농도로 처리하게 되면, CHO 세포 자체에서 생산되는 GS 만으로는 생존이 불가능하게 되므로, GS 유전자 및 목적 단백질 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포만이 생존하게 된다.

이를 이용하여 목적 단백질 유전자가 도입된 세포만을 선택해낼 수 있게 되며, 나아가 목적 단백질을 생산할 수 있게 된다. 즉, 세포에 GS 특이적 저해제를 가할수록 세포는 살아남기 위해 GS와 함께 주입된 목적 유전자를 함께 증폭시키게 되므로, 목적 단백질의 생산을 증대시킬 수 있게 된다. 그러나, 현재까지 사용되는 GS 시스템의 경우, 목적 단백질 및 GS를 포함하는 벡터를 형질 감염시킨 세포를 GS 특이적 저해제를 처리하면서 목적 단백질을 생산하여도 생산되는 양에 한계가 존재하였으며, 장기간 배양하는 경우 목적 단백질의 생산량이 감소하는 단점이 여전히 존재하였다. 이에, GS 억제제에 대한 감수성이 증대되어 GS 억제제에 민감하게 반응함으로써, GS와 함께 주입된 목적 유전자를 더욱 많이 증폭시킬 수 있는, GS 억제제에 대한 감수성이 증대된 변이된 GS 단백질의 개발이 요구되어 왔다.

이에 본 발명자들은 GS 억제제에 대한 감수성이 야생형 GS 단백질에 비하여 현저히 증대된 변이된 GS 단백질을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 야생형 GS 단백질에 비하여 하나의 아미노산이 치환된, 변이된 GS 단백질로서, GS 억제제에 대한 감수성이 현저하게 증대된 단백질을 개발하였다. 이에, 상기 변이된 GS 단백질에 대한 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 동물세포에 도입하여 GS 억제제의 존재하에서 목적 단백질의 발현량을 확인하였고, 그 결과 상기 변이된 GS 단백질이 GS 억제제에 대하여 높은 감수성을 나타내어, 야생형 GS 단백질을 포함하는 벡터 시스템에 비하여 현저히 우수한 목적 단백질 생산량을 나타낼 뿐만 아니라, 장기간의 배양에도 목적 단백질의 생산량이 감소하지 않는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 글루타민 합성효소에 있어서, 299번째 아미노산인 글리신(Glycine, Gly)이 아르기닌(Arginine, Arg)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 변이된 글루타민 합성효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 목적 단백질 발현용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 목적 단백질을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 글루타민 합성효소에 있어서, 299번째 아미노산인 글리신(Glycine, Gly)이 아르기닌(Arginine, Arg)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 변이된 글루타민 합성효소를 제공한다.

본 발명에서 용어, "글루타민 합성효소(glutamine synthetase, GS)"란 포유류의 장기나 미생물에 존재하는, 글루탐산과 암모니아가 ATP가 존재시, 글루타민이 되는 합성반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소를 활성화시키기 위하여는 2가의 금속이온이 필요하며, 글리신, 알라닌, 트립토판, 히스티딘, 글루코사민-6인산, 시티딘삼인산 등에 의해 활성이 저해된다. 본 발명의 목적상 상기 글루타민 합성효소는 목적 단백질 발현 시스템에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포를 선별하는 목적으로 사용되거나, 글루타민 합성효소 저해제에 대해 억제되어, 글루타민 합성효소를 코딩하는 유전자와 폴리시스트로닉(polycistronic) 관계에 있는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키기 위한 목적으로 사용되는 단백질을 의미할 수 있다. 바람직하게는 글루타민 합성효소 저해제에 의해 억제되어 목적 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있는 단백질이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 글루타민 합성효소의 정보는 NCBI GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 햄스터 유래의 글루타민 합성효소인 Accession number가 X03495.1이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 글루타민 합성효소의 대표적인 야생형 뉴클레오티드 서열을 서열번호 3에, 아미노산 서열을 서열번호 4에 나타내었다.

본 발명에서 용어, "변이된 글루타민 합성효소"란 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 글루타민 합성효소에 있어서, 299번째 아미노산인 글리신(Glycine, Gly)이 아르기닌(Arginine, Arg)으로 치환된 단백질을 의미한다.

상기 변이된 글루타민 합성효소는 상기 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 유전자는 목적 단백질 발현용 벡터에 포함되어, 글루타민 합성효소를 발현하거나 발현하지 않는 세포주에 도입되어 선별마커로서 이용되거나, 바람직하게는 '프로모터-목적 단백질을 코딩하는 유전자-IRES-변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드' 또는 '프로모터-변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드-IRES-목적 단백질을 코딩하는 유전자'와 같은 형태로 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 폴리시스트론 전사(polycistronic translation)되도록 하여, 글루타민 합성효소 저해제 처리를 통해 목적 단백질의 발현을 증대시킬 수 있는 효과를 가져올 수 있는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서는, 서열번호 4의 글루타민 합성 효소에서 299번째 글리신에 대한 코돈의 G(Guanosine)이 C(cytidine)으로 변경되는 경우, 글루타민 합성효소 저해제에 대한 감수성이 야생형, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 글루타민 합성효소에 비해 현저하게 증가되는 것을 최초로 규명하였다. 본 발명의 변이된 글루타민 합성효소는 글루타민 합성효소 저해제에 대해 야생형에 비하여 감수성이 현저히 증가되어 있으므로, 이를 이용한 목적 단백질 발현 시스템에 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 상기 변이된 글루타민 합성효소는 서열번호 4의 상기 299번째 아미노산인 글리신이 아르기닌으로 치환된 것으로서, 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 글루타민 합성효소에 비하여 글루타민 합성효소 억제제에 대해 증가된 감수성을 나타내기만 한다면, 상기 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열도 모두 포함한다.

본 발명에서 용어, "글루타민 합성효소 억제제"는 상기 글루타민 합성효소의 효소 활성을 억제할 수 있는 외부 인자를 의미한다. 상기 글루타민 합성효소 억제제의 예로서, 글리신, 알라닌, 트립토판, 히스티딘, 글루코사민-6인산, 시티딘삼인산, 또는 MSX(methionine sulphoximine)가 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "감수성"은 일반적으로는 외부의 자극을 받아들이는 특성을 의미하고, 효소의 측면에서는 효소의 활성을 조절하는 외부의 인자에 의하여 효소활성이 증진 또는 감소되는 특성을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 감수성은 GS의 활성을 억제하는 GS 억제제에 의하여 GS의 활성이 억제되는 특성을 의미하는 것으로 사용되지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 햄스터 세포의 RNA로부터 글루타민 합성 효소를 PCR로 클로닝하는 과정을 통하여, 변이된 글루타민 합성 효소를 코딩하는 유전자를 확보하고자 하였다. 그 결과 서열번호 4의 야생형 글루타민 합성 효소의 299번째 아미노산인 글리신이 아르기닌으로 치환된, 변이된 글루타민 합성 효소를 확보하였고, 이를 GS PM을 명명하였다(실시예 3). 또한, 확보한 변이된 글루타민 합성 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 IRES에 연결시켜 IRES-GS PM을 제조하였고, 이를 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 연결시켜, 목적 단백질 유전자-IRES-GS PM이 서로 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 제조하였다(실시예 4). 또한, 상기 벡터를 사용하여 목적 단백질을 발현시킨 결과, 본 발명의 변이된 글루타민 합성효소를 이용하는 경우 야생형 글루타민 합성효소를 이용하여 목적 단백질을 발현시키는 경우보다 현저히 우수한 목적 단백질 생산량을 보일 수 있음을 확인하였다(실시예 6 및 7).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 상기 변이된 글루타민 합성효소는 서열번호 4의 야생형 글루타민 합성효소의 299번 아미노산인 글리신이 아르기닌으로 치환된 것을 특징으로 하므로, 상기 폴리뉴클레오티드의 글루타민 합성효소의 299번째 아미노산인 아르기닌에 대한 코돈이, CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 또는 AGG일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 본 발명의 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 목적 단백질의 발현을 증가시키기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 폴리시스트론 전사(Polycistronic translation)되는 형태로, 벡터 내에 존재할 수 있다. 이러한 벡터를 숙주세포 내로 도입시킨 다음, 글루타민 합성효소 억제제를 처리하게 되면 벡터로부터 발현되는 변이된 글루타민 합성효소의 활성이 억제되어, 글루타민의 합성량이 감소하게 된다. 그러나, 세포가 생존하기 위해서는 글루타민이 필요하므로, 글루타민 합성효소 억제제의 존재하에서 세포는 글루타민 합성효소를 더 생산하고자 하게 되며, 이때 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 주입된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 함께 증폭시키게 되므로, 이를 통해 목적 단백질의 발현 증가를 가져올 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및; 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 목적 단백질 발현용 벡터를 제공한다.

상기 변이된 글루타민 합성효소 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "목적 단백질"은 숙주세포에서 생산하고자 하는 단백질을 의미하며, 본 발명의 목적상 변이된 글루타민 합성효소에 의해 그 발현이 증폭되는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 목적 단백질은 본 발명의 벡터를 이용하여 발현될 수 있는 단백질이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 변이된 글루타민 합성효소를 이용하여 발현시킬 수 있는 대표적인 목적 단백질로서, TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc 융합 단백질을 사용하였다.

본 발명에서 용어, "TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc 융합 단백질"은 TNFR 단백질 전부 또는 일부분이 면역글로불린의 Fc 영역과 효소 작용에 의하여 연결되거나, 또는 유전자 조작을 통하여 상기 두 폴리펩타이드가 하나의 폴리펩타이드로 발현된 결과물을 의미한다. 상기 TNFR-Fc 융합 단백질은 TNFR 단백질과 면역글로불린의 Fc 영역이 직접 연결되거나 펩타이드 링커(peptide linker)를 통하여 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 TNFR-Fc 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "발현용 벡터"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 발현 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자, 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 발현벡터의 형태는 하나의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 모노시스트론(mono-cistronic) 벡터, 둘 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리시스트론(poly-cistronic) 벡터, 특히 바이시스트론 벡터로 하나의 프로모터에 의해 목적 단백질, 변이된 글루타민 합성효소가 발현되는 바이시스트론 벡터를 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적상 상기 발현벡터로는 바람직하게는 SV40 프로모터를 포함하는 모노시스트론 벡터 또는 IRES 염기서열을 포함하는 폴리시스트론 벡터를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자, IRES 및 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 발현카세트; 또는 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 유전자, IRES 및 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 작동가능하게 연결된 발현카세트를 포함하는 발현벡터를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 햄스터세포주인 CHO DG44로부터 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 수득하였고, 상기 수득한 폴리뉴클레오티드를 pGEMT 벡터에 연결하여 pGEMT-GS PM 벡터를 제조하였다. 이어, 상기 pGEMT-GS PM 벡터를 절단된 TOPO-IRES-DHFR 벡터에 삽입하여 pCR2.1-TOPO-IRES-GS PM 벡터를 수득하고, 상기 벡터로부터 IRES-GS PM 절편을 수득하였다. 상기 수득한 IRES-GS PM 절편을 절단된 pcDNA-Kozak-TNFR-Fc-IRES-DHFR 벡터에 삽입하여 Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PM 벡터("IRES-GS PM 벡터")를 제작하였다(도 1).

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명자들은 상기 GS PM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 절단된 pcDNA3.1-TNFR-Fc-SV40-DHFR 벡터에 삽입하여 pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PM 벡터를 수득하였다. 그런 다음, 상기 pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PM 벡터를 절단하고, 절단된 부위에 pcDNA3.1-Kozak-TNFR-FC-IRES-DHFR 벡터로부터 추출된 TNFR-FC 절편을 삽입하여, pcDNA-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PM 벡터("SV40-GS PM 벡터")를 제작하였다(도 3).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 목적 단백질 발현용 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "형질전환체"는 상기 벡터가 숙주세포(모세포)에 도입되어 상기 벡터에 포함된 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키도록 형질전환된 세포를 의미하며, 재조합 포유동물 세포, 설치류 세포, 바람직하게는 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있으며, 바람직하게는 NS0 세포주 또는 CHO 세포주일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 목적상 상기 형질전환체로는 상기 발현벡터가 NS0 세포주 또는 CHO 세포주에 도입된 형태의 형질전환체를 사용함이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다.

상기 형질전환체 및 목적 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 제조 방법은 구체적으로, (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 글루타민 합성효소 억제제를 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한 추가로, 목적 단백질을 배양액으로부터 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 글루타민 합성효소 억제제가 배지에 첨가되어, 기존에 사용되던 GS 시스템에 비해 보다 감수성이 증가된 본 발명의 글루타민 합성효소에 의하여 목적 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 목적 단백질을 제공한다.

상기 방법 및 목적 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 변이된 GS 유전자를 포함하는 발현벡터를 사용할 경우, CHO 세포를 숙주세포로 사용하고 GS 활성을 억제하기 위한 억제제를 처리한 조건에서도, 변이된 GS 유전자를 포함한 발현벡터의 선별능력을 그대로 나타낼 수 있으므로, 보다 효과적인 표적 단백질의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은, pcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS 또는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PM을 클로닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 개략도이다.
도 2는, 본 발명의 대표적인 목적 단백질인 TNFR-Fc를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GS 또는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PM을 도식화하여 나타낸 개열 지도이다.
도 3은, 본 발명의 대표적인 목적 단백질인 TNFR-Fc를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS 또는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PM을 클로닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 개략도이다.
도 4는, 본 발명의 대표적인 목적 단백질인 TNFR-Fc를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS 또는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PM을 도식화하여 나타낸 개열지도이다.
도 5는, 3종의 TNFR-Fc 발현 벡터(IRES-GS PM, IRES-GS 또는 SV40-GS)를 도입한 CHO K-1세포주에서 발현되는 TNFR-Fc의 발현수준을 비교한 그래프이다.
도 6은, 3종의 TNFR-Fc 발현 벡터(IRES-GS PM, IRES-GS 또는 SV40-GS)가 도입된 CHO K-1 세포주의 초기 MSX 처리 여부에 따른 TNFR-Fc 단백질 발현 수준 변화를 상기 발현 벡터의 도입 이후의 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 7은, 2차 임시적인 형질감염(transient transfection)으로 확인한 TNFR-Fc의 발현량으로, 형질감염 초기에는 SV40-GS 벡터의 발현량이 높아 보이나, GS 효소 기질 저해제인 MSX를 처리하여 장기간 계대할수록 본 발명의 IRES-GS PM 벡터의 발현량이 우수함을 나타내는 그래프이다.
도 8은, 안정한 CHO-S 세포주에서 IRES-GS PM 벡터와 SV4O-GS PM 벡터를 비교한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: TNFR - Fc 융합단백질을 코딩하는 유전자의 합성

재조합 단백질 발현 벡터 시스템을 이용하여 생산된 재조합 단백질의 발현수준을 확인하기 위해 목적 단백질로서 TNFR-Fc 융합 단백질을 사용하였다.

본 발명자들은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 다음의 기준에 부합되도록 GeneArt사에 의뢰하여 합성하였다(서열번호 5): (1) TNFR의 신호서열(signal sequence)을 포함하도록 한다 (2) TNFR 아미노산 1번부터 235번째 아미노산까지 발현할 수 있도록 한다 (3) CHO 세포에 도입할 수 있도록 CHO 세포에 특이적으로 코돈 최적화(codon optimization)한다 (4) Invitrogen 사의 pcDNA3.1 벡터에 삽입할 것을 감안하여 5'-말단에는 제한효소 NheI 절단부위를, 3'-말단에는 제한효소 NotI 절단부위를 삽입하도록 한다.

상기 합성된 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 최종 염기서열은 VectorNTI 프로그램을 사용하여 확인하였다.

실시예 2: TNFR - Fc 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작

본 발명의 변이된 GS 단백질을 이용한 재조합 단백질 발현 시스템에 대한 대조군으로 사용하기 위하여, 일반적인 재조합 단백질 발현 시스템인 DHFR 시스템을 확보하고자 하였고, 이에 하기와 같은 과정으로 햄스터의 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자를 클로닝하였다.

구체적으로, 햄스터의 DHFR 유전자를 확보하기 위하여, 돌연변이체 형태인(mutant type)의 햄스터 DHFR 유전자가 들어있는 pSVA3 벡터(ATCC 77273)를 구입한 뒤, 해당 DHFR 유전자를 주형으로 하여 점 돌연변이(point mutation) 방법을 사용하여 야생형 DHFR유전자를 확보하였다. 아울러, IRES 뉴클레오티드 서열은 해당 DNA 서열을 포함하고 있는 Clontech 벡터(Cat. #6029-1, PT3267-5)로부터 PCR 반응을 통해 확보하였다.

상기 확보한 DHFR 유전자와 IRES(Internal ribosome entry site) 염기서열을 pCR2.1 벡터에 클로닝하여, pCR2.1-IRES-DHFR 형태의 발현벡터를 제작하였다.

그 다음, 상기 실시예 1에서 수득한 TNFR-Fc가 삽입되어 있는 pcDNA3.1-TNFR-Fc 벡터와 상기 수득한 pCR2.1-IRES-DHFR 벡터를 각각 제한효소인 SalI 및 XbaI으로 절단한 다음, 이를 서로 연결하여 최종적으로 TNFR-Fc가 삽입된 pcDNA3.1-TNFR-Fc-IRES-DHFR 발현벡터를 제조하였다.

또한, 카나마이신 저항성 유전자를 함유한 벡터로 클로닝하기 위하여 Clontech 사의 pAC-GFP 벡터(#632483)로부터 카나마이신 저항성 유전자를 수득하여 Kan/Neo 유전자를 도입하였다. 상기 벡터는 TNFR-Fc 유전자의 전사 시작 부위에 Kozak 서열 및 항생제 선별 마커로 Kan/Neo 유전자를 지니고 있는 벡터로서, 이를 CHO 세포주를 사용한 재조합 단백질 발현량 비교를 위한 4종의 발현 벡터 시스템 클로닝에 대한 기본 골격으로 사용하였다.

실시예 3: 변이된 GS 유전자의 제조

GS 억제제에 대한 감수성이 증대되어, 목적 단백질의 발현 시스템에 적용할 수 있는 변이된 GS 유전자를 제조하기 위하여 하기와 같은 과정을 수행하였다.

구체적으로, 변이된 GS 유전자를 확보하기 위하여 햄스터 세포주인 CHO DG44(Invitrogen, 12609-012)를 배양한 후 TRIZOL 시약(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA를 확보하였다. 그 다음, 확보한 총 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하였고, 이로써 수득한 cDNA를 주형으로 하여 하기 서열을 가진 프라이머(GS SalI-F 프라이머 및 GS XbaI-R 프라이머)를 사용하여 PCR을 수행하였다(94℃에서 5분간 변성; 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 재결합, 72℃에서 90초간 신장과정을 25회 반복; 및 72℃에서 7분간 신장).

GS SalI-F(정방향 프라이머): 5'-gtcgacatggccacctcagcaagttccc-3'(서열번호 6)

GS XbaI-R(역방향 프라이머): 5'-tctagattagtttttgtattggaaaggg-3'(서열번호 7)

상기 과정으로 수득한 PCR 산물을 0.8% 아가로즈겔에 전기영동한 후, 해당 밴드를 잘라 Quiagen Cleaning kit(#28204)를 사용하여 세정(clean-up)한 후, 이를 유전자 클로닝벡터인 pGEMT 벡터(Promega, USA)에 삽입하였다. 상기 PCR 산물이 삽입된 pGEMT 벡터를 TOP10 세포에 도입하고, 콜로니를 얻어 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 확인하였다.

상기와 같은 과정을 수차례 수행하여, 야생형 햄스터 GS 유전자(NCBI GenBank Accession Number: X03495.1)의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)에서 하나의 뉴클레오티드에서 차이가 보이며, 아미노산 서열(서열번호 4)과 하나의 아미노산에 차이가 있는, 변이된 GS 단백질을 코딩하는 유전자를 확보하였다. 서열분석 결과, 본 발명에서 확보한 변이된 GS 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 야생형 햄스터 GS 유전자 서열(서열번호 3)에서, 895번째 뉴클레오티드인 G(Guanosine)가 C(Cytidine)로 변형된 것이었다. 또한, 야생형 햄스터 GS 단백질 서열(서열번호 4)의 299번째 아미노산인 글리신이 아르기닌으로 치환된 특징을 나타내었다. 본 발명에서는, 이와 같이 확보한 본 발명의 변이된 GS 단백질을 GS-PM으로 명명하였다.

또한, 추가로 야생형 햄스터 GS 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확보하기 위하여, 상기 GS-PM의 뉴클레오티드 서열에서 895번째 뉴클레오티드를 C에서 G로 치환시켰다. 구체적으로, 점 돌연변이 방법을 써서 별도의 클로닝을 진행하였다.

상기 점 돌연변이 방법에서는, GS PM으로부터 1개의 아미노산이 다른, 야생형 GS 유전자를 얻기 위하여 GS PM DNA를 주형으로 하고, 점 돌연변이시킬 부위(CGT → GGT)를 포함하도록 합성된 두 개의 프라이머(KpnI F-프라이머 및 XbaI R-프라이머)를 이용해 PCR을 수행한 결과(94℃에서 5분간 변성; 94℃에서 30초간 변성, 54℃에서 30초간 재결합, 72℃에서 30초간 신장과정을 30회 반복; 및 72℃에서 7분간 신장), CGT서열이 GGT로 변경된, 야생형 GS PCR 단편을 확보할 수 있었다.

KpnI F-primer(정방향 프라이머) :

5'-caccggtaccacattcgagcctacgatcccaaggggggcctggacaatgcccg

tggtctg-3'(서열번호 8)

XbaI R-primer(역방향 프라이머) :

5'-tctagattagtttttgtattggaaggg-3'(서열번호 9)

또한, PCR 산물의 염기서열을 확인한 결과, 야생형 GS 서열을 가지는 것을 확인하였으며, 해당 PCR 산물은 KpnI 및 XbaI으로 절단 후, KpnI 및 XbaI으로 처리한 pGEMT-GS PM 벡터에 연결하여, 최종 pGEMT-GS 벡터를 제조하였다.

실시예 4: 포유류 세포에서 단백질을 발현하기 위한 GS 벡터의 클로닝

상기 실시예 3의 pGEMT-GS PM 벡터에 포함된 GS PM 유전자는 상기 유전자의 N-말단과 C-말단에 각각 SalI과 XbaI 절단 부위를 넣어 클로닝되었기 때문에, pGEMT-GS PM을 SalI 및 XbaI 제한효소로 절단하였다. 그 다음 IRES에 연결된 GS PM 유전자(IRES-GS PM)를 확보하기 위하여 상기 절단된 단편을, SalI 및 XbaI 제한효소로 미리 절단해 둔 TOPO-IRES-DHFR 벡터에 삽입하여 pCR2.1-TOPO-IRES-GS PM을 수득하였다.

다음으로, TNFR-Fc 유전자와 IRES-GS PM 유전자를 결합시키기 위하여 각각 XhoI과 XbaI으로 절단한 TNFR-Fc-IRES-DHFR 유전자와 IRES-GS PM 단편을 접합(ligation)시켜, 최종적으로 kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PM 벡터("IRES-GS PM 벡터")를 제작하였다(도 1). 도 1은 본 발명의 pcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PM을 클로닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 개략도이다.

또한, kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PM 벡터 및 TOPO-GS 벡터를 사용하여 Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS 벡터("IRES-GS 벡터")를 제작하였다.

상기 pcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS 벡터 및 pcDNA3.1-Kozak-TNFR-Fc-IRES-GS PM 벡터에 대해서는 도 2에 도식화하였다.

한편, GS를 이용한 발현 시스템 중 Lonza와 동일한 SV40 프로모터-GS 시스템을 만들기 위하여 기존에 클로닝되어 있던 pcDNA3.1-TNFR-Fc-SV40-DHFR 벡터를 이용하였다. pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-DHFR에 GS PM 유전자를 삽입하기 위한 적당한 제한효소 절단부위가 없기 때문에 GS PM 유전자 양쪽 말단에 새로운 제한효소 절단부위를 삽입하는 과정을 우선적으로 수행하였다.

구체적으로, GS PM 유전자의 N-말단에는 BsaBI을, C-말단에는 BstBI을 포함한 프라이머(GS-BsaBI-F 프라이머 및 GS-BstBI-R 프라이머)를 합성한 다음 PCR을 수행하여, GS PM 유전자의 양쪽에 BsaBI과 BstBI 사이트를 삽입하였고, pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-DHFR의 DHFR을 제거하기 위해 BsaBI과 BstBI을 처리하였다. 이어, BsaBI/BstBI으로 절단된 GS PM 유전자를 삽입하여, pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PM 벡터를 제작하였다.

GS-BsaBI-F (정방향 프라이머):

5'-gatgaggatcatggccacctcagcaag-3'(서열번호 10)

GS-BstBI-R (역방향 프라이머):

5'-ttcgaattagtttttgtattggaaggg-3'(서열번호 11)

그러나 pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PM 벡터의 경우, 상기에서 제조한 pcDNA3.1-TNFR-FC-IRES-GS PM 벡터와 달리 TNFR-FC 유전자 앞부분에 kozak 서열이 없기 때문에 상기 벡터에 kozak 서열을 삽입하는 두 번째 클로닝 과정이 진행되었다. Kozak 서열은 이미 만들어져 있는 pcDNA3.1-Kozak-TNFR-FC-IRES-DHFR 벡터의 kozak을 이용하였으며, pcDNA3.1-TNFR-FC-SV40-GS PM 벡터의 TNFR-FC 대신 kozak-TNFR-FC을 삽입하여 pcDNA3.1-Kozak-TNFR-FC-SV40-GS PM을 제조하였다.

클로닝에 이용할 수 있는 제한효소로는 TNFR-FC의 N-말단에 있는 NdeI 및 NheI과, C-말단에 있는 BstXI, SgrAI 및 NotI을 사용할 수 있고, 이들 중에서 이용가능한 제한효소를 선택하여 pcDNA-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PM 벡터("SV40-GS PM 벡터")를 제작하였다(도 3). 여기서 도 3은, 본 발명의 TNFR-Fc를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PM 또는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS을 클로닝하는 방법을 도식화하여 나타낸 개략도이다.

상기 제작된 SV40-GS PM 벡터는 세포주 선별을 위한 항생제 내성 유전자인 암피실린 저항성 유전자를 포함하기 때문에, 상기 유전자를 카나마이신 저항성 유전자로 교체하기 위한 세 번째 클로닝을 수행하였다. 이처럼 항생제 저항성 유전자를 교체하는 이유는 암피실린의 경우 환자에게 많이 사용되고 있는 항생제의 하나로 안전성 측면에서 환자에 대한 투여 빈도가 낮은 항생제로 대체되고 있는 추세를 반영한 것이다.

이처럼, 투여빈도가 낮은 카나마이신 저항성 유전자로 바꾸는 클로닝을 수행하기 위하여, Clontech의 pAC-GFP 벡터(#632483)로부터 카나마이신 저항성 유전자를 수득하고, SV40-GS PM 벡터에 도입하였다. 아울러, 상기 SV40-GS PM 벡터를 이용하여 pcDNA-Kozak-TNFR-Fc-SV40-GS 벡터("SV40-GS 벡터")를 제작하였다(도 4). 도 4는 본 발명의 TNFR-Fc를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS PM 또는 pcDNA3.1-kozak-TNFR-Fc-SV40-GS를 도식화하여 나타낸 개열 지도이다.

결국, 표적 단백질을 포유류세포에서 발현시키기 위한 단백질 발현 벡터시스템으로 본 발명에서는, IRES-GS PM, IRES-GS, SV40-GS PM 및 SV40-GS의 4종의 발현벡터를 제작하였다.

실시예 5: 형질전환체의 제작

GS 및 DHFR 유전자 발현시스템의 TNFR-Fc 융합 단백질 생산성을 비교하기 위하여, 상기 실시예 4에서 제작한 각각의 발현벡터를 CHO K-1 세포에 도입하여 각각의 형질전환체를 제작하였다.

구체적으로, 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양된 CHO K-1 세포를 3 내지 4 x 10⁵ 세포수/웰로 6웰 플레이트에 분주하고 하룻밤 동안 배양하여, 80 내지 90%의 밀도가 되었을 때, 실시예 4의 발현벡터를 각각 도입하였다.

이를 위하여, 한편으로는 상기 실시예 4에서 제작한 각각의 발현벡터 4㎍과 Opti-MEM 250㎕를 혼합하고, 다른 한편으로는 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 10㎕와 Opti-MEM 250㎕를 혼합한 다음, 상기 각 혼합물을 상온에서 5분 동안 방치하였다. 이어, 상기 각 혼합물을 서로 혼합하여 상온에서 20분 동안 다시 방치하였다.

그런 다음, 상기 6웰 플레이트에 분주된 배양액을 2㎖의 Opti-MEM I media로 교체하고, 상기 준비된 최종 혼합물 500㎕를 상기 6웰 플레이트의 각 웰에 가한 다음, 37℃에서 4 내지 6시간동안 배양하고, 원래의 배양 배지(10% FBS를 포함하는 DMEM/F12 배지)로 교체한 다음, 하룻밤 동안 추가로 배양하였다. 이어, 상기 6웰 플레이트에 분주된 배양액을 GS 선별배지로 교체하고, 각 발현벡터가 도입된 세포의 성장속도에 맞추어 계대배양하였다. 이때, GS 선별배지는 10% FBS, 1X GS supplement, GS inhibitor인 MSX를 포함하는 글루타민-프리 DMEM(glutamine-free DMEM) 또는 글루타민-프리 IMDM(glutamine-free IMDM)을 사용하였고, 상기 1x GS supplement는 아데노신(500x, 15mM), 사이티딘(1000x, 30mM), 유리딘(1000x, 30mM), 구아노신(1000x, 3mM), 티미딘(1000x, 10mM), 아스파라긴(1000x, 500mM) 및 글루탐산(1000x, 500mM)을 포함하도록 제조한 것을 사용하거나 또는 상업적으로 입수가능한 50x GS supplement(SAFC)를 희석하여 사용하였다.

실시예 6: TNFR - Fc 의 발현수준 확인

상기 실시예 5에서 계대배양된 각 형질전환체의 배양액을 ELISA 방법에 적용하여, 상기 형질전환체로부터 발현된 각 단백질의 발현수준을 측정하였다.

구체적으로, 96 웰 플레이트를 항-인간 IgG Fc항체(Pierce, 31125)로 코팅하고, 1% BSA로 블로킹하였다. 다음으로, 상기 계대배양된 각 형질전환체의 배양액을 각 웰에 가하여 반응시켰다. 이어, 바이오틴이 융합된 항-인간 TNFR 항체(R&D 시스템)를 검출용 항체로서 각 웰에 가하여 반응시키고, HRP가 결합된 스트렙타비딘을 처리하고 다시 반응시켰다. 끝으로, 각 웰에 TMB를 처리하여 발색시켜서, 각 단백질의 발현수준을 측정하였다.

먼저, TNFR-Fc GS 벡터 3종(IRES-GS PM, IRES-GS, SV40-GS)을 이용하여 CHO K-1에서 IRES-DHFR 시스템과의 발현량 비교; 및 GS 벡터별 단백질 발현량의 차이를 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 3종의 TNFR-Fc 유전자 발현 벡터(IRES-GS PM, IRES-GS, SV40-GS)를 도입한 CHO K-1 세포주에서 발현되는 TNFR-Fc의 발현수준을 비교한 그래프이다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, CHO K-1 세포의 경우 발현벡터를 도입하고 64시간이 경과한 후에도 GS 벡터 3종의 TNFR-FC 단백질 발현량이나 세포 생존율에 문제가 없는 것을 확인하였다. 오히려 IRES-DHFR 시스템보다 3종의 GS 시스템이 발현수준의 측면에서 우수함을 확인하였다. 아울러, 발현벡터를 도입하고 5일이 경과한 후에도 상기 3종의 발현벡터가 도입된 세포는 세포 성장을 유지하면서 TNFR-Fc 단백질을 지속적으로 발현하였다.

다음으로, 25μM의 MSX를 포함하는 글루타민을 포함하지 않는 배지(selection media)를 사용하여 3종의 TNFR-Fc 유전자 발현 벡터(IRES-GS PM, IRES-GS, SV40-GS)가 도입된 세포를 지속적으로 배양할 경우에도 상술한 바와 동일한 결과를 얻을 수 있는지를 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 3종의 TNFR-Fc 유전자 발현 벡터(IRES-GS PM, IRES-GS, SV40-GS)가 도입된 CHO K-1 세포주의 초기 MSX 처리 여부에 따른 TNFR-Fc 단백질 발현수준의 변화를 상기 발현벡터의 도입 이후의 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 세포 배양시간이 지날수록, 총 TNFR-Fc 단백질 발현 수준 및 동일 세포수당 발현수준의 측면에서 본 발명의 변이된 GS 유전자를 포함하는 IRES-GS PM 벡터가 도입된 세포주가 다른 벡터가 도입된 세포주보다 현저히 우수한 결과를 보였다. 발현벡터를 도입한 직후에는 SV40-GS 벡터가 도입된 세포주가 가장 높은 수준을 나타내었으나, GS 특이적 억제제인 MSX를 가한 후에는 본 발명의 IRES-GS PM 벡터가 도입된 세포주가, 야생형 GS 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포주에 비하여 TNFR-Fc 단백질의 발현량이 현저히 높은 결과를 나타내었다.

한편, 상기 도 5의 결과를 전체적으로 분석하면, 동일한 IRES를 포함하는 벡터에서도 IRES-GS와 IRES-GS PM간 발현수준에 커다란 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 다시 말해서, 단 한 개의 아미노산 차이를 보이는 두 유전자의 경우 실험 시작 단계에서는 두 유전자 간 활성에 큰 차이가 없을 것이라고 예상이 되었지만 실제 선별배지에서의 배양이 지속될수록 GS와 GS PM간의 차이가 구별됨을 확인할 수 있었다.

이에 따라, 아미노산 한 개의 차이가 발현량에 커다란 영향을 미치는지 GS와 GS PM 간의 차이를 보다 명확히 구별하고자 SV40-GS PM 벡터를 사용하여 총 4종(IRES-GS, IRES-GS PM, SV40-GS, SV40-GS PM) 벡터가 도입된 세포주에서 TNFR-Fc 단백질의 발현수준을 비교하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다(도 7). 도 7은 2차 임시 형질감염시 확인한 TNFR-Fc의 발현량(상단); 및 시간의 경과에 따른 TNFR-Fc의 발현량의 변화(하단)를 나타내는 그래프이다.

그 결과, 도 7의 상단에서 보듯이, 형질감염 후 6일 동안 MSX 없이 배양한 경우에는, 대체로 TNFR-Fc의 발현수준이 6000 내지 9000ng/10⁶cells을 나타내었고, 야생형 GS 유전자를 포함하는, IRES-GS 및 SV40-GS 벡터로 형질감염된 세포에서 TNFR-Fc의 발현량이 상대적으로 증가하였다. 그러나, 도 7 하단에서 보듯이, 형질감염 후 3일이 경과된 후에 25μM MSX를 가하고, 20일이 경과된 후에는 200μM MSX를 가하며 7일 동안 추가로 배양한 경우에는, 25μM MSX를 가한 직후에는 1000ng/10⁶cells 이하의 TNFR-Fc의 발현수준을 나타내었으나 시간의 경과에 따라 목적 단백질의 발현량이 증가하는 결과를 보였으며, 200μM MSX를 가한 후에는 IRES-GS PM 벡터로 형질감염된 세포에서만 TNFR-Fc의 발현수준이 증가하는 결과를 나타내었다. 즉, 변이된 GS 유전자가 도입된 시스템에서 발현량이 현저히 증가하였다.

상기와 같은 결과는 본 발명의 변이된 GS 단백질은 우수한 GS 억제제에 대한 감수성을 나타내며, 상기 본 발명의 변이된 GS 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터는 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있는 벡터임을 시사하는 결과이다.

실시예 7: 안정적으로 형질도입된 CHO -S 세포에서의 TNFR - Fc 단백질의 발현량 비교

상기 실시예 6의 결과로부터 4종의 GS 발현벡터 중 GS PM을 포함하는 발현벡터(IRES-GS PM 및 SV40-GS PM 발현벡터)가 도입된 세포주는 동일 세포수당 단백질 발현수준의 측면에서 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었으므로, 상기 IRES-GS PM 및 SV40-GS PM 발현벡터를 이용한 안정적인 CHO-S 세포주에서 발현수준을 비교하고자 하였다. 재조합 단백질 대량 생산을 위하여 CHO K-1 대신 부유배양이 가능한 CHO-S 세포주를 안정적인 세포주 확립을 위한 세포주로 사용하였다.

우선, IRES-GS PM 또는 SV40-GS PM 발현벡터가 도입된 TNFR-Fc 발현 생산 세포주를 확립하였다. 확립된 각각의 TNFR-Fc 발현 생산 세포주를 25μM 또는 250μM의 MSX를 포함하는 배지에서 배양하고, 이들로부터 발현되는 TNFR-Fc 단백질의 발현수준을 비교하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다(도 8). 도 8은 안정한 세포주에서 IRES-GS PM 벡터와 SV4O-GS PM 벡터를 비교한 그래프이다. 이때, PCD는 pg/cell/day를 의미하는데 하기 식에 의하여 산출하였다.

PCD =발현량(ng/mL)/((A-B)*Culture day/LN(A/B))/1000

A: Harvest cell conc.( x 10⁶cells/mL)

B: Seed cell conc.( x 10⁶cells/mL)

그 결과, 도 8에서 보듯이, MSX의 처리농도에 관계없이 IRES-GS PM 발현벡터가 도입된 세포주가 SV40-GS PM 발현벡터가 도입된 세포주보다도 TNFR-FC 단백질을 높은 수준으로 발현시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, MSX 250μM에서의 최대 PCD는 ~8 PCD 정도를 나타내어, 기존 IRES-DHFR 시스템을 사용하여 제한 희석(limiting dilution)한 단일 세포주의 PCD보다 높은 값을 보였으므로, 8 PCD의 세포군에서 단일 세포주 선별 작업을 거칠 경우 8 PCD보다 높은 고발현 생산 세포주를 얻을 수 있을 것을 시사하였다.

상기와 같은 결과는 본 발명의 변이된 GS 단백질을 포함하는 발현 벡터 시스템, 특히 변이된 GS 단백질을 포함하는 폴리시스트로닉(polycistronic system) 시스템은, 목적 단백질을 우수하게 생산할 수 있는 시스템임을 시사하는 결과이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> An expression vector comprising a polynucleotide encoding a modified glutamine synthetase and a method for preparing a target protein employing the same <130> PA130223KR <150> KR 10-2012-0025197 <151> 2012-03-12 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene encoding a modified GS <400> 1 atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60 ccccagggtg agaaagtcca agccatgtat atctgggttg atggtactgg agaaggactg 120 cgctgcaaaa cccgcaccct ggactgtgag cccaagtgtg tagaagagtt acctgagtgg 180 aattttgatg gctctagtac ctttcagtct gagggctcca acagtgacat gtatctcagc 240 cctgttgcca tgtttcggga ccccttccgc agagatccca acaagctggt gttctgtgaa 300 gttttcaagt acaaccggaa gcctgcagag accaatttaa ggcactcgtg taaacggata 360 atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg aacaggagta tactctgatg 420 ggaacagatg ggcacccttt tggttggcct tccaatggct ttcctgggcc ccaaggtccg 480 tattactgtg gtgtgggcgc agacaaagcc tatggcaggg atatcgtgga ggctcactac 540 cgcgcctgct tgtatgctgg ggtcaagatt acaggaacaa atgctgaggt catgcctgcc 600 cagtgggaat tccaaatagg accctgtgaa ggaatccgca tgggagatca tctctgggtg 660 gcccgtttca tcttgcatcg agtatgtgaa gactttgggg taatagcaac ctttgacccc 720 aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 780 atgcgggagg agaatggtct gaagcacatc gaggaggcca tcgagaaact aagcaagcgg 840 caccggtacc acattcgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaatgc ccgtcgtctg 900 actgggttcc acgaaacgtc caacatcaac gacttttctg ctggtgtcgc caatcgcagt 960 gccagcatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga aaggttactt tgaagaccgc 1020 cgcccctctg ccaattgtga cccctttgca gtgacagaag ccatcgtccg cacatgcctt 1080 ctcaatgaga ctggcgacga gcccttccaa tacaaaaact aa 1122 <210> 2 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified GS <400> 2 Met Ala Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Asn Ile Lys Gln Met 1 5 10 15 Tyr Leu Cys Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 Val Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 Cys Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Ser 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Arg Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Phe Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Ser Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Lys Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Thr Gly 180 185 190 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 Cys Glu Gly Ile Arg Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile 210 215 220 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys His Ile Glu Glu 260 265 270 Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Arg Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Ser 305 310 315 320 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ala Val Thr 340 345 350 Glu Ala Ile Val Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 3 <211> 1122 <212> DNA <213> Cricetulus longicaudatus <400> 3 atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60 ccccagggtg agaaagtcca agccatgtat atctgggttg atggtactgg agaaggactg 120 cgctgcaaaa cccgcaccct ggactgtgag cccaagtgtg tagaagagtt acctgagtgg 180 aattttgatg gctctagtac ctttcagtct gagggctcca acagtgacat gtatctcagc 240 cctgttgcca tgtttcggga ccccttccgc agagatccca acaagctggt gttctgtgaa 300 gttttcaagt acaaccggaa gcctgcagag accaatttaa ggcactcgtg taaacggata 360 atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg aacaggagta tactctgatg 420 ggaacagatg ggcacccttt tggttggcct tccaatggct ttcctgggcc ccaaggtccg 480 tattactgtg gtgtgggcgc agacaaagcc tatggcaggg atatcgtgga ggctcactac 540 cgcgcctgct tgtatgctgg ggtcaagatt acaggaacaa atgctgaggt catgcctgcc 600 cagtgggaat tccaaatagg accctgtgaa ggaatccgca tgggagatca tctctgggtg 660 gcccgtttca tcttgcatcg agtatgtgaa gactttgggg taatagcaac ctttgacccc 720 aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 780 atgcgggagg agaatggtct gaagcacatc gaggaggcca tcgagaaact aagcaagcgg 840 caccggtacc acattcgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaatgc ccgtggtctg 900 actgggttcc acgaaacgtc caacatcaac gacttttctg ctggtgtcgc caatcgcagt 960 gccagcatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga aaggttactt tgaagaccgc 1020 cgcccctctg ccaattgtga cccctttgca gtgacagaag ccatcgtccg cacatgcctt 1080 ctcaatgaga ctggcgacga gcccttccaa tacaaaaact aa 1122 <210> 4 <211> 373 <212> PRT <213> Cricetulus longicaudatus <400> 4 Met Ala Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Asn Ile Lys Gln Met 1 5 10 15 Tyr Leu Cys Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp 20 25 30 Val Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp 35 40 45 Cys Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Ser 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Arg Asp Pro Asn Lys Leu 85 90 95 Val Phe Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn 100 105 110 Leu Arg His Ser Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His 115 120 125 Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly 130 135 140 His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro 145 150 155 160 Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Lys Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val 165 170 175 Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Thr Gly 180 185 190 Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro 195 200 205 Cys Glu Gly Ile Arg Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile 210 215 220 Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro 225 230 235 240 Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe 245 250 255 Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys His Ile Glu Glu 260 265 270 Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Arg Tyr His Ile Arg Ala Tyr 275 280 285 Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Gly Leu Thr Gly Phe His 290 295 300 Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Ser 305 310 315 320 Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ala Val Thr 340 345 350 Glu Ala Ile Val Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro 355 360 365 Phe Gln Tyr Lys Asn 370 <210> 5 <211> 1401 <212> DNA <213> TNFR-Fc <400> 5 ctgcctgccc aggtggcctt caccccttac gcccctgagc ctggctccac ctgccggctg 60 cgggagtact acgaccagac cgcccagatg tgctgctcca agtgctcccc tggccagcac 120 gccaaggtgt tctgcaccaa 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caggactggc tgaacggcaa ggaatacaag 1020 tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcccgct cctatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1080 ggccagcctc gcgagcctca ggtgtacacc ctgcctccct cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc cttccgacat cgccgtggag 1200 tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcctgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1320 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1380 ctgtccctga gccccggcaa g 1401 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS SalI-F <400> 6 gtcgacatgg ccacctcagc aagttccc 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS XbaI-R <400> 7 tctagattag tttttgtatt ggaaaggg 28 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KpnI F-primer <400> 8 caccggtacc acattcgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaatgc ccgtggtctg 60 60 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI R-primer <400> 9 tctagattag tttttgtatt ggaaggg 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS-BsaBI-F <400> 10 gatgaggatc atggccacct cagcaag 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS-BstBI-R <400> 11 ttcgaattag tttttgtatt ggaaggg 27

Claims

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(i) 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 글루타민 합성효소에 있어서, 299번째 아미노산인 글리신(Glycine, Gly)이 아르기닌(Arginine, Arg)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 목적 단백질 발현용 벡터로서, 상기 변이된 글루타민 합성효소는 글루타민 합성효소 억제제에 대한 감수성이 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 야생형 글루타민 합성효소보다 증가된 것인 벡터.
제4항에 있어서, 상기 글루타민 합성효소 억제제는 글리신, 알라닌, 트립토판, 히스티딘, 글루코사민-6-인산(glucosamine-6-phosphate), 시티딘 삼인산(cytidine triphosphate), MSX(methionine sulphoximine) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질의 발현을 증가시키기 위한 것인 벡터.
제6항에 있어서, 상기 목적 단백질의 발현 증가는 글루타민 합성효소 억제제에 대한 감수성 증가로 수행되는 것인 벡터.
제4항에 있어서, 상기 목적 단백질은 TNFR(tumor necrosis factor receptor)-Fc 융합 단백질인 것인 벡터.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 IRES(Internal ribosome entry site)를 추가로 포함하는 것인 벡터.
제9항에 있어서, 상기 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 유전자-IRES-변이된 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순으로 작동가능하게 연결된 발현카세트를 포함하는 것인 벡터.
제4항 내지 제10항 중 어느 한 항의 벡터가 도입된 형질전환체.
제11항에 있어서, 상기 형질전환체는 NS0 세포주 또는 CHO 세포주를 모세포로 하는 것인 형질전환체.
제11항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 제조 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법은 글루타민 합성효소 억제제를 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 방법은 야생형 글루타민 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 사용한 경우에 비하여, 목적 단백질의 생산량이 증대된 것인 방법.