MX2009000781A - Elementos reguladores de acido nucleico. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a secuencias de ADN, en especial a elementos que aumentan la transcripción o bien la expresión (elementos TE), así como su uso en un vector de expresión en unión con un potenciador, un promotor, un gen de producto y un marcador de selección. La invención describe la secuencia Nº 1 y los elementos TE TE-01, -02, -03, -04, -06, -07, -08, -10, -11 o -12. Debido a su pequeño tamaño, se prefieren en especial TE-06. TE-07 o TE-08. La secuencia Nº1 proviene de una región de secuencias que está corriente arriba de la región codificadora de los genes Ub/S27a de células CHO. Los elementos TE producen un aumento de la expresión del producto génico en especial con una integración estable en el genoma eucarionte, con preferencia el genoma CHO-DG44. Los efectos de posición cromosómicos se vencen, protegen o anulan. De esta manera, se aumenta hasta quince veces, la proporción de grandes productos de una preparación de transfección, como también el nivel de expresión absoluto. (Ver fórmulas A B).

Description

ELEMENTOS REGULADORES DE ÁCIDO NUCLEICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN SECTOR TÉCNICO La invención se refiere a secuencias de ácido nucleico cis-activas, los llamados elementos TE. Los elementos TE provienen preferentemente del genoma CHO. Su empleo en, por ejemplo, vectores de expresión permite en poblaciones celulares estables una expresión de un gen de interés por lo menos dos veces más elevada en comparación con los vectores utilizados hasta ahora en cualquier ¡ocus cromosómico. ANTECEDENTES Las células de mamíferos son las células huésped preferidas para la producción de proteínas biofarmacéuticas complejas, ya que las modificaciones realizadas después de la traducción son compatibles con humanos desde un punto de vista funcional como también farmacocinético. Los tipos celulares preferentemente relevantes son hibridomas, mielomas, células de CHO (Chínese Hámster Ovary) y células de BHK (Baby Hámster Kidney). El cultivo de las células huésped se realiza de modo creciente en condiciones de producción libres de suero y de proteínas. Los motivos para ello son la reducción de costos asociada a ello, la menor interferencia en la purificación de la proteína recombinante, así como la reducción del potencial para la introducción de patógenos (por ejemplo, priones, virus). La aplicación de células CHO como células huésped tiene cada vez más difusión, ya que estas células se pueden adaptar al crecimiento en suspensión en un medio libre de suero y de proteína y, al mismo tiempo, son consideradas y aceptadas como células productivas seguras según las autoridades de regulación.

Para generar una línea celular de mamífero estable que expresa un gen heterólogo de interés, se incorpora el gen heterólogo por lo general junto con un gen marcador seleccionable tal como, por ejemplo, neomicina-fosfotransferasa (NPT), por transfección en la línea celular deseada. El gen heterólogo y el gen marcador seleccionable se pueden expresar en una célula huésped, a partir de un único vector o de vectores cotransfectados, separados. Dos a tres días después de la transfección, las células transfectadas se convierten medio que contiene un agente selectivo, por ejemplo, G418 al usar el gen de neomicina- fosfotransferasa (gen NPT), y se cultivan durante algunas semanas en estas condiciones selectivas. Las células resistentes de alto crecimiento que tienen integrado el ADN exógeno se pueden aislar e investigar en cuanto a la expresión del producto génico deseado (gen de interés). Para la producción biofarmacéutica son necesarias líneas celulares con productividad alta y estable. Los vectores de expresión para las células de producción son provistos de promotores y potenciadores ("enhancer") fuertes, que expresan principalmente en forma constitutiva, como por ejemplo, el potenciador y el promotor de CMV, para posibilitar una alta expresión del producto. Como esta expresión del producto tiene que ser garantizada durante un período de tiempo en lo posible prolongado, se seleccionan células que han integrado el gen del producto en forma estable en su genoma. Esto se realiza con marcadores de selección, como por ej., la neomicinafosfotransferasa (NPT) y la dihidrofolatorreductasa (DHFR). Por la integración casual de los vectores de expresión en el genoma de la célula huésped se obtienen células con una expresión de distinta magnitud del producto de gen deseado, ya que su expresión no está condicionada solamente por la intensidad del promotor precedente o de la combinación promotor/potenciador. La estructura de cromatina que se encuentra en el lugar de integración puede influir sobre la magnitud de la expresión tanto en forma negativa como también positiva. En forma creciente se integran en los vectores de expresión por lo tanto también elementos cis-activos, los que influyen de manera positiva sobre la expresión a nivel de la cromatina. Estos comprenden las regiones de control de locus ("Locus Control Regions") (LCR), las que se encuentran, por ej., en la región 5' del gen de la ß-globina (Li y col., 2002) y en la región 3' del gen TCRa. Estas provocan una alta expresión específica del tejido de un transgén acoplado en la cromatina, la que se caracteriza por la independencia de la posición y la dependencia del número de copias. Estas propiedades indican que las LCRs son capaces de abrir la cromatina en su tejido nativo (Ortiz et al., 1997). Existen diversas formas de ß-talasemia en las cuales el locus de la ß-globina se encuentra intacto, pero no se expresa. El motivo de la falta de expresión es una gran deleción en dirección 5' del gen de la ß-globina. La deleción de esta LCR de ß-globina conduce a una conformación de cromatina cerrada, la que se extienden a través de todo el locus y lleva a una supresión de la expresión del gen (Li et al., 2002). Las LCRs se localizan con sitios hipersensibles (HS) a la ADNasa I en las células que expresan cromatina. La presencia de HA indica igualmente una cromatina abierta. Los HS contienen una serie de diferentes sitios de ligadura generales y específicos del tejido para los factores de transcripción. Mediante la interacción de los factores de transcripción con el ADN se forma la estructura abierta de la cromatina de los HS (Li et al., 2002). De algunas LCRs se conoce que están compuestas por varios HS, cuyas funciones pueden ser delimitadas más o menos una de otra. El gen de TCRa, por ejemplo, es expresado bajo el control endógeno sólo en el tejido de las células T. El locus existe, según el tejido y el estado de expresión, en diversos modos de cromatina. Posee en la zona 3' una región de control de locus, que presenta ocho HS. El HS 2 - 6, un fragmento parcial de 6 kb de la LCR actúa abriendo la cromatina y no es específico del tejido. La especificidad con respecto al tejido le es otorgada a la expresión específica de las células T en el timo por el HS 7.8 y 1 (3 kb). Sólo en la combinación completa de todos los HS se encuentra funcionalmente completa la TCRaLCR (Ortiz et al., 1997). Una subdivisión y especificación más exacta de las funciones HS individuales de la TCRaLCR se puede leer en (Ortiz et al., 1999). Este ejemplo muestra que las LCRs son funcionalmente muy complejas y que pueden estar compuestas por diversos elementos de control como potenciadores, silenciadores y aisladores. Otros ejemplos para una división de las funciones de las LCR en diversos dominios son el locus de TCRy y el locus de ß-globina. El primero está compuesto por el sitio hipersensible a la ADNsa I HsA y el potenciador 3'CYi . A la TCRy-LCR se le adjudican además de las tareas usuales, un rol en la recombinación del gen TCRy (Baker et al., 1999). El locus de ß-globina presenta cinco HS con diversas funciones, las que para su funcionamiento completo necesitan además el promotor específico del tejido. Las LCRs podrían jugar otro rol importante en la desmetilación del ADN específica del tejido, ya que la mutilación de ADN provoca una estructura de cromatina cerrada y la inactivación de genes. También sería posible un mecanismo de acción que activa la expresión del gen por medio de una acetilación aumentada de histona (Li et al., 2002). Las regiones de andamio/unión a la matriz ("Scaffold/Matrix Attachment Regions") (S/MARs) son secuencias de ADN que se ligan con alta afinidad in Vitro a componentes de la matriz o de la estructura del núcleo celular. Ellas forman los límites estructurales y posiblemente también funcionales de los dominios de cromatina (Zahn-Zabal et al., 2001 ). Las S/MARs son capaces de interactuar con los potenciadores así como también de aumentar la accesibilidad del ADN en la cromatina localmente y de este modo pueden aumentar la expresión de genes heterólogos, integrados en forma estable, en líneas celulares, plantas y animales transgénicos (Klehr et al., 1991 ; Stief et al., 1989; Jenuwein et al., 1997; Zahn-Zabal et al., 2001). Pero no pueden proteger a un locus cromosómico completamente de sus elementos circundantes para posibilitar una expresión independiente de la posición (Polja et al., 1994). El efecto de las MARs se puede usar para aumentar la parte de clones celulares que expresan (fuertemente) y/o animales transgénicos en un experimento de transfección (McKnight et al., 1992; Zahn-Zabal et al., 2001). Sin embargo, también se informó de MARs que no producen una fuerte expresión, pero que tienen un rol importante en la regulación correcta de genes específicos para el desarrollo (McKnight et al., 1992). Los aisladores se definen como límite neutro entre regiones vecinas que se influyen mutuamente, por ej., entre cromatina activa e inactiva (elementos límite). Pueden limitar la acción de los potenciadores y/o aislar contra ellos dominios completos de ADN y proteger a genes informadores transfectados en forma estable contra efectos de posición (Bell y Felsenfeld, 1999; Udvardy, 1999). Estos elementos proveen así una independencia de la expresión de la posición genómica. Además pueden evitar el silenciamiento de transgenes en ausencia de presión de selección (Pikaart et al., 1998). Otra supuesta función de los aisladores es la delimitación de territorios de replicación (Bell y Felsenfeld, 1999).

Los primeros aisladores que se describieron son scs y scs' de Drosophila. Representan el límite para el gen del shock de calor hsp70 y suprimen efectos de posición (Udvardy et al., 1985). Como otro elemento con función aislante se halló un fragmento rico en GC del gen dhfr (hámster chino), que contienen islas de CpG (Poljak et al., 1994). El fragmento sólo no mostró influencia sobre la expresión del gen informador. Situado entre una SAR que promueve la expresión y el gen informador, el fragmento pudo, sin embargo, evitar en gran parte la acción aumentadora de la expresión del elemento SAR. Este fragmento rico en GC bloquea posiblemente el mecanismo de apertura de cromatina del elemento SAR y actúa por lo tanto como aislante. Los elementos con islas de CpG extendidas son muy probablemente metiladas, ya que son reconocidas por una ADN-metiltransferasa, la que transforma citosina en 5-metilcitosina. Como consecuencia se forma cromatina inactiva (Poljak et al., 1994). Aronow y colaboradores definieron en el primer intrón del gen ADA humano (adenosina desaminasa) un nuevo elemento regulador que aporta sustancialmente a la expresión dependiente del número de copias de gel e independiente de la posición (Aronow et al., 1995). El elemento es de hasta 1 kb y sólo funcional, cuando flanquea un potenciador específicos de las células T de 200 pb. Si sólo se encuentra presente uno de los dos segmentos o si los segmentos están mal ordenados con respecto al orden y la orientación, el elemento no tiene función, ya que de este modo se evita la formación de los sitios hipersensibles a la ADNasa I en el potenciador. La empresa Cobra Therapeutics describe en la patente WO 02/081677 otro elemento que influye sobre la cromatina. Los elementos de apertura de cromatina ubicuos ("Ubiquitous Chromatin Opening Elements") (UCOEs) son responsables de una estructura de cromatina abierta en regiones cromosómicas con genes domésticos expresados en forma ubicua (gen hnRNP A2 humano, gen ß-actina humano, gen PDCD2 humano). Todos estos genes poseen islas ricas en CpG en las zonas no traducidas, las que están relativamente poco metiladas. La falta de mutilación de las islas CpG indica que en este sitio se trata de cromatina activa. Los UCOEs ayudan a una intensidad de expresión que es independiente del ambiente circundante genómico y del tipo de célula o tejido. La empresa Immunex describe igualmente secuencias de ADN cis-activas, que provocan un aumento de la expresión (documento US 6.027.915, documento US 6.309.851 ). El elemento denominado elemento de secuencia que aumenta la expresión ("Expression Augmenting Sequence Element") (EASE) promueve una alta expresión de proteínas recombinantes en células de mamíferos, no es activo en sistemas de expresión transitorios y no posee las propiedades de secuencias típicas como se encuentran en LCRs y S/MARs. Tampoco se trata de una secuencia que codifica para una proteína trans-activante, ya que no contiene un marco de lectura abierto. El fragmento tiene un tamaño de 14.5 kb, proviene del ADN gnómico de células CHO y puede aumentar ocho veces la expresión de un gen informador integrado en forma estable. Más de 50% de la actividad del elemento está limitada a un segmento de 1.8 kb de tamaño, en donde los primeros 600 pares de bases de este segmento son indispensables para la función correcta. Una propiedad adicional de los sectores de secuencias con alta actividad EASE es la presencia de varios sitios de unión HMG-I (Y). Las proteínas HMG-I (Y) pertenecen a la familia de las proteínas de cromatina no histona del grupo de alta movilidad. También son denominadas "factores de transcripción arquitectónicos" y forman una nueva categoría de los trans-reguladores de genes de mamíferos. Las proteínas HMG-I (Y) reconocen secuencias ricas en AT y se ligan con sus así llamados ganchos AT (dominios que ligan ADN) en el surco pequeño del ADN. Esto puede llevar a modificaciones locales de la topología de ADN y en consecuencia a una expresión génica modificada. Los autores de la patente US 6.309.841 suponen que los efectos de los EASE están relacionados con la amplificación inducida por MTX del plásmido integrado. En la amplificación del gen inducida por MTX se producen los así llamados ciclos de rotura-fusión-puente ("Breakage-Fusion-Bridge"). Se puede imaginar un rol de las proteínas HMG-I(Y) en la modificación estructural del ADN que lleva a la formación y reparación de las roturas de ADN. Otros elementos para aumentar la expresión génica en células de mamíferos se describieron en Kwaks et al., 2003. Estos así llamados elementos STAR ("Stimulatory and Anti-Repressor Elements"), elementos estimuladores y anti-represores, provienen del rastreo de una biblioteca de genes humanos con fragmentos de ADN de 500 a 2100 pb. El rastreo se realizó con un plásmido informador construido especialmente. La expresión del gen informador sólo era posible cuando estaba unido funcionalmente con un elemento anti-represor del banco de genes humano. Con los elementos STAR así obtenidos, los autores pudieron proteger a transgenes de los efectos de posición en el genoma de células de mamíferos. En comparación con el genoma del ratón se mostró que la mayoría de estos elementos STAR se encuentran tanto en el genoma humano como en el del ratón y están altamente conservados en estas dos especies. Un gran problema en la determinación de líneas celulares con alta expresión de la proteína deseada resulta de la integración arbitraria y no dirigida del vector recombinante en los loci de transcripción activa o inactiva del genoma de la célula huésped. De este modo se obtiene una población de células que presentan tasas de expresión completamente diferentes del gen heterólogo, en donde la productividad de las células sigue en general una distribución normal. Para la identificación de clones de células, que presentan una muy alta expresión del gen heterólogo de interés, tienen que examinarse y probarse una multiplicidad de clones, dando por resultado un alto costo en cuanto a tiempo, trabajo y gastos. Las optimizaciones del sistema de vectores usado para la transfección están dirigidas por lo tanto primero a posibilitar la transcripción de un transgén integrado en forma estable por medio del uso de elementos cis-activos adecuados, o también a aumentarla. Los elementos cis-activos que tiene efecto sobre el nivel de cromatina comprenden, por ej., las ya descritas regiones de control de locus, las regiones de andamio/unión a la matriz, aisladores, entre otros. Algunos de estos elementos protegen a determinados genes contra la influencia de la cromatina circundante. Otros muestran un efecto similar a los intensificadores, estando ésta, sin embargo, limitada a constructos integrados en forma estable. Otros elementos reúnen varias de estas funciones en ellos. Frecuentemente no es posible una adjudicación exacta a un grupo determinado. En líneas celulares estables la expresión del gen del producto transgénico está sujeta considerablemente a efectos de posición cromosómicos. Este fenómeno se basa en la influencia de la estructura de la cromatina y/o a la presencia de elementos reguladores intrínsecos en el lugar de integración del ADN extraño. Esto lleva a niveles de expresión muy variables. En la selección de células se forman por lo tanto frecuentemente clones con expresión del producto muy reducida o que falta totalmente. Estos efectos de posición cromosómicos también son la causa de que la generación de líneas celulares de producción, que expresan un alto nivel de una proteína terapéutica, constituya en general un procedimiento muy costoso en cuanto a tiempo, capacidad y gastos. Las líneas celulares estables con alta productividad son generadas comúnmente por selección con marcadores de selección positivos, combinados frecuentemente con amplificación génica inducida por agentes (por ej., dihidrofolatorreductasa/metotrexato o glutaminasintetasa/metioninasulfoximina). Los pools y clones que se forman con esta estrategia de selección son examinados en un procedimiento de rastreo muy trabajoso con respecto a una expresión alta y estable. La mayoría de los clones no produce o sólo produce cantidades promedio de producto, sólo muy pocos son altos productores. La proporción de altos productos en una población mixta puede ser aumentada, por ejemplo, por una mutación en el marcador de selección (Sautter y Enenkel, 2005, documento WO 2004/050884). Un aumento adicional de la productividad específica de cada clon individual, así como también de la proporción de altos productores dentro de una población celular transfectada es, sin embargo, deseable. La productividad específica de células transfectadas en forma estable, especialmente células CHO u otras células relevantes para la producción, y la proporción de altos productores de una mezcla de transfección tienen que ser aumentados. Esto tiene que llevar en última instancia a un desarrollo más eficiente de las líneas celulares. De este modo se pueden establecer en menos tiempo más líneas celulares y con mayor producción, y de este modo se ahorra en tiempo, trabajo y costos.

LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a ácidos nucleicos reguladores, especialmente a un ácido nucleico con la SEQ ID N° 1 , denominado "elemento TE", o a un fragmento o derivado del mismo, el cual lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés en células transfectadas en forma estable. Se pudo mostrar sorprendentemente, que el uso de un elemento TE de este tipo soluciona, protege de, o elimina, los efectos de posición cromosómicos en un vector de expresión en unión con un promotor, un gen de producto, un marcador de selección y opcionalmente un potenciador con una integración estable en un genoma huésped como, por ejemplo, el genoma CHO-DG44. De este modo se aumenta tanto la proporción de altos productos de una mezcla de transfección como también el nivel de expresión absoluto. La invención se refiere además a vectores de expresión que contienen partes, fragmentos o derivados de la SEQ ID N° 1 que aumentan la transcripción y/o la expresión, preferentemente los elementos TE TE-00 (SEQ ID N° 2), TE-01 (SEQ ID N° 3), TE-02 (SEQ ID N° 4), TE-03 (SEQ ID N° 5), TE-04 (SEQ ID N° 6), TE-06 (SEQ ID N° 8), TE-07 (SEQ ID N° 9), TE-08 (SEQ ID N° 10), TE-10 (SEQ ID N° 12), TE-11 (SEQ ID N° 13), TE-12 (SEQ ID N° 14), TE-13 (SEQ ID N° 15), TE-14 (SEQ ID N° 16), TE-15 (SEQ ID N° 17), TE-16 (SEQ ID N° 18), TE-17 (SEQ ID N° 19), TE-18 (SEQ ID N° 20) und TE-21 (SEQ ID N° 21 ). En base a su tamaño reducido se prefieren especialmente TE-06, TE-07 o TE-08, así como TE-13 (SEQ ID N° 15). La SEQ ID N° 1 proviene de una zona de secuencias que se encuentra corriente arriba de la región codificadora del gen ubiquitina/S27a, que fue aislada de células CHO, en donde el gen codifica para una proteína esencial en el metabolismo de ribosomas de la célula. En comparación con los vectores de expresión usados hasta ahora, la introducción adicional de los elementos TE cis-activos en vectores de expresión posibilita una productividad específica sorprendentemente mayor hasta en un factor de 7, del pool de células transfectadas en forma estable, especialmente del pool de células CHO-DG44. En transfecciones transitorias de pools de células CHO-DG44 no se puede obtener en cambio con la introducción de los elementos TE ningún aumento de la productividad. Así, el aumento de productividad observado en el pool de células estable no se basa en un potenciador presente en los elementos TE. Para el aumento de la productividad causado por los elementos SE TE requiere obligatoriamente una integración cromosómica. Esto indica que los elementos TE pueden suprimir, proteger de, o eliminar, efectos de posición cromosómicos negativos. De este modo se pudieron generar e identificar elementos cis-activos que se caracterizan por su especial adecuación para la selección y el enriquecimiento de células de alta producción y de este modo pueden reducir tiempo, costos y capacidad en el aislamiento y la identificación de clones de alta producción. Las posibilidades de utilización de la invención se encuentran, por ej., en el desarrollo de líneas celulares de alta producción, que son requeridas, por ejemplo, para la preparación de productos biofarmacéuticos, en ensayos analíticos basadas en células, en "High Througput Screenings" de sustancias o para la obtención de productos de proteínas recombinantes para espectroscopia RMN, otros ensayos, etc. Por la mayor productividad específica y la reducción de células, que no expresan o expresan poco producto, se pueden establecer más líneas celulares y de mayor producción en menor tiempo y de este modo se puede ahorrar en trabajo y costos. Otras posibilidades de utilización se encuentran en la obtención de líneas de células huésped robusto, mejorado (por ej., introducción de genes anti-apoptosis o de glucosilación), de plantas o animales transgénicos así como también en la terapia génica. La invención no resulta del estado de la técnica. El ácido nucleico con la SEQ ID N° 1 es una secuencia de ácidos nucleicos que se aisló del genoma de hámster chinos (Cricetulus gríseus). Proviene de una zona de secuencias que se encuentra corriente arriba de la región codificadora del gen de ubiquitina/S27a. El ácido nucleico con la SEQ ID N° 1 presenta un contenido promedio de GC de 44% y no contiene pasajes más largos de repeticiones de GC. Este contenido de GC es comparable con el contenido de GC promedio descrito para ADN genómico de mamíferos de aprox. 40% (Delgado et al., 1998). La búsqueda con newcpgseek (paquete de análisis de la secuencia EMBOSS) de regiones ricas en CpG dio como resultado únicamente cinco regiones de secuencia, muy cortas, que presentan una frecuencia, absolutamente incrementada, de dímeros CpG y/o una proporción incrementada de CpG en relación con GpC: nucleótidos 2242 - 2259 (18 pb), 3129 - 3146 (18 pb), 3215 -3240 (26 pb), 3417 - 3461 (44 pb) y 3658 - 3788 (131 pb) de la SEQ ID N° 1. Los resultados de la búsqueda demuestran que la secuencia de ácidos nucleicos no contiene islas de CpG extendidas. Además, la SEQ ID N° 1 contiene dos repeticiones tándem (nucleótidos 2179 - 2244 y nucleótidos 1027 - 1080) y dos repeticiones invertidas (nucleótidos 8 - 47 y nucleótidos 1726 - 1766), las cuales fueron identificadas con los programas EMBOSS etandem y einverted. TE-08 contiene, por consiguiente, una repetición invertida. En el intervalo de la secuencia entre 1 pb y 1578 pb se encuentran, por consiguiente, una repetición tándem y una repetición invertida. Partes de los ácidos nucleicos con la SEQ ID N° 1 ya fueron descritas en el documento WO 97/15664: los nucleótidos 579 a 3788 de la SEQ ID N° 1 corresponden a los nucleótidos 1 a 2201 de la SEQ ID N° 5 de la WO 97/15664, pero con una diferencia. En la preparación de la SEQ ID N° 1 de acuerdo con la invención se introdujeron 4 nucleótidos adicionales condicionados por la clonación, los que se generaron por una reacción de relleno de un sitio de corte de EcoRI existente. Esta inserción de los 4 nucleótidos adicionales se realizó entre los nucleótidos 357 y 358 de la SEQ ID N° 5 del documento WO 97/15664. Los nucleótidos 1 a 1578 de la secuencia de ácidos nucleicos con la SEQ ID N° 1 de la presente invención presentan sin embargo, zonas de secuencias hasta ahora desconocidas, que fueron aisladas en el marco de esta invención. En el documento WO 97/15664 tampoco se reveló que la SEQ ID N° 1 de la presente invención, o fragmentos o derivados de la misma, aumentan la transcripción y/o la expresión de un gen de interés, independientemente del lugar de integración cromosómico, cuando se unen funcionalmente con una combinación de promotor/potenciador, la que posibilita la transcripción del gen de interés unido funcionalmente. En el documento WO 97/15664 se divulga en cambio el uso de las secuencias 5'UTR del gen de ubiquitina/S27a como promotor, en donde la zona de secuencias de la posición -161 hasta la -45, de acuerdo con la Figura 5 en el documento WO 97/15664, es esencial para una actividad del promotor. Esta zona de secuencias se encuentra en el ácido nucleico de la SEQ ID N° 1 , de acuerdo con la invención, y un fragmento derivado de la misma con la SEQ ID N° 2 mantenido sólo parcialmente (posición -161 a -89 de acuerdo con la Figura 5 en el documento WO 97/15664). Los otros fragmentos y derivados de la SEQ ID N° 1 ya no contienen esta zona de secuencias. Además, el ácido nucleico de la SEQ ID N° 1 de acuerdo con la invención, usando los algoritmos de alineamiento estándar, como por ejemplo BLAST, no presentan homologías de secuencias con las secuencias de ácidos nucleicos descritos en las siguientes solicitudes de patentes, las que también pueden influir en cis sobre la expresión a nivel de la cromatina: a) secuencias de ácido nucleico UCOE del documento WO 00/05393 b) secuencias de ácido nucleico EASE del documento US 6.309.841 c) secuencias de ácido nucleico STAR del documento WO 03/004704 Tampoco con estrategias de alineación más complejas se encuentran homologías de las secuencias extendidas con respecto a estas secuencias de ácidos nucleicos a) a c). DESCRIPCBÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1 : REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LOS VECTORES BASE Los vectores representados bajo A se usaron para la expresión de un anticuerpo lgG1 monoclonal, recombinante en células CHO-DG44. ?/?", en este caso, es una combinación del potenciador CMV y el promotor de ubiquitina/S27a de hámster, "P" es sólo un elemento del promotor y "T" es una señal de terminación para la transcripción, que se requiere para la poliadenilacion del mARN transcripto. La posición y la dirección de la iniciación de la transcripción en cada unidad de transcripción se indican mediante una flecha. Para la clonación de los elementos TE antes de la combinación promotor/potenciador se encuentra un sitio de corte Spel ("Spel"). El marcador de selección amplificable dihidrofolato-reductasa está abreviado con "dhfr". El marcador de selección neomicina-fosfotransferasa contiene la mutación puntual D227G y está abreviado en la Figura correspondientemente con "D227G". El elemento "IRES" proveniente del virus de la encefalomiocarditis sirve como sitio de ligadura de ribosomas interno dentro de la unidad de transcripción bicistronica posibilita la traducción de la siguiente proteína fluorescente verde "GFP". "HC" y "LC" codifican para la cadena pesada y/o liviana de un anticuerpo lgG1 monoclonal humanizado. El vector representado bajo B se usó para la expresión de la proteína recombinante MCP-1 en células CHO-DG44. ?/?" es una combinación de potenciador de CMV y promotor de CMV, "P" es sólo un elemento de promotor y "T" es una señal de terminación para la transcripción que se requiere para la poliadenilación del mARN transcripto. La posición y la dirección de la iniciación de la transcripción en cada unidad de transcripción se indican mediante una flecha. Para la clonación del elemento TE fue introducida una zona de secuencias "A" antes del promotor con sitios de corte para las endonucleasa de restricción (adaptador). El marcador de selección neomicina-fosfotransferasa contiene la mutación puntual F240I y está abreviada en la Figura correspondientemente con "F240I". El elemento "IRES" proveniente del virus de la encefalomiocarditis sirve como sitio de ligadura de ribosomas interno dentro de la unidad de transcripción bicistronica posibilita la traducción de la siguiente proteína fluorescente roja "dsRed". "MCP-1" codifica para la proteína quimioatractiva de monocitos humana-1. FIGURA 2: REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE UN VECTOR BASE MCP-1 El vector representado aquí se usó para la expresión de la proteína recombinante MCP-1 en células CHO-DG44. "E/P" es una combinación de potenciador de CMV y promotor de CMV, "P" es sólo un elemento de promotor y "T" es una señal de terminación para la transcripción que se requiere para la poliadenilación del mARN transcripto. La posición y la dirección de la iniciación de la transcripción en cada unidad de transcripción se indican mediante una flecha. Para la clonación del elemento TE fue introducida una zona de secuencias "A" antes del promotor con sitios de corte para las endonucleasa de restricción (adaptador). El marcador de selección dihidrofolato-reductasa está abreviado como "dhfr". El elemento "IRES" proveniente del virus de la encefalomiocarditis sirve como sitio de ligadura de ribosomas interno dentro de la unidad de transcripción bicistrónica posibilita la traducción de la siguiente proteína fluorescente roja "dsRed". "MCP-1" codifica para la proteína quimioatractiva de monocitos humana-1. FIGURA 3: SECUENCIA 5' DEL GEN DE UBIQUITINA/S27A DE CHO La zona de secuencias que comprende 2788 pb (SEQ ID N° 1 ) fue aislada del genoma de células de CHO (ovario de hámster chino) y se encuentra corriente arriba de la región codificadora del gen Ub/S27a, en el que se trata de una fusión entre una unidad de ubiquitina (Ub) y una proteína ribosómica de la pequeña subunidad de ribosomas (S27a). FIGURA 4: REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LOS ELEMENTOS TE 00 A 12 Esta Figura muestra esquemáticamente la zona de secuencias genómica que se encuentra corriente arriba de la región codificadora del gen de ubiquitina/S27a de CHO de 2788 pb, que se encontraba subclonado en un plásmido. De esta secuencia genómica (SEQ ID N° 1 ) denominada también elemento TE A se prepararon fragmentos parciales de diferente longitud, denominados a continuación elementos TE. El elemento TE 00 (SEQ ID N° 2) fue aislado de un subclón de esta secuencia como fragmento de restricción Sacll y clonado en el sitio de corte Spel de los vectores objetivo pBID-HC y pBING-LC. Estos contenía o bien el gen para la cadena pesada (HC) o la cadena liviana de un lgG1 (ver Figura 1a). De esta manera se obtuvieron los vectores de expresión, en los cuales el elemento TE 00 está posicionado en orientación directa e inversa corriente arriba del promotor. Los elementos TE 01 a 12 fueron preparados por PCR con diversos pares de cebadores (ver Figuras 5 y 6) y clonados mediante BamHI/BsrGI en los plásmidos de base pTE4/MCP-1 (Fig. 1 B) y pTE5/MCP-1 (Fig. 2). FIGURA 5: ELEMENTOS TE 00 A 12 En esta Tabla se representan tanto el tamaño como la posición inicial y final de los elementos TE 00 a 21 , que fueron generados de la secuencia TE-A (SEQ ID N° 1 ). Para los fragmentos que fueron generados a través de PCR se indican además los cebadores utilizados. Los escalonamientos de tamaño de los elementos son de aprox. 500 pb y presentan en comparación con la secuencia de partida TE-A (SEQ ID N° 1) deleciones en el extremo 5' o 3'. FIGURA 6: CEBADOR PARA LA SÍNTESIS DE LOS ELEMENTOS TE 01 A 12 Los cebadores están representados en dirección 5 -3'. Los cebadores con "for" en la denominación identifican a los cebadores en orientación directa de la SEQ ID N° 1 , los cebadores con "rev", indican la orientación inversa. Cada cebador está compuesto en el extremo 5' por seis nucleotidos cualesquiera, seguidos por un sitio de corte BamHI o BsrGI y una secuencia de aprox. 20 a 30 nucleótidos, la que es 100% homologa con respecto a un tramo de secuencia en la SEQ ID N° 1. La zona de los cebadores homologa a la SEQ ID N° 1 se resaltó. Se usaron un cebador "for" y un cebador "rev" para la amplificación de una zona de secuencias de la SEQ ID N° 1. El producto de PCR resultante en cada caso se clonó mediante BamHI y BsrGI en el plásmido de base pTE4/MCP-1 (Figura 1B) o pTE5/MCP-1 (Figura 2). FIGURA 7: MEDICIÓN FACS DE LA SERIE DE TRANSFECCIÓN B La Figura muestra el aumento relativo de la expresión GFP en células con el elemento TE 00 en comparación con células sin el elemento TE 00. Además se transfectaron células CHO-DG4 con las combinaciones de plásmidos pBING-LC y pBID-HC, que se diferenciaban una de otra solamente por la presencia y la orientación del elemento TE 00. Después de una selección de dos a tres semanas de los pools de células transfectados en medio libre de HT con adición de G418 se midió la fluorescencia GFP por análisis FACS. Cada gráfico, con excepción de las células CHO-DG44 ("DG44") no transfectadas, que servían como control negativo, representa el valor promedio de la fluorescencia GFP de diez pools de la serie de transfección B. Por pool se consideraron 20000 células. "Control" significa los plásmidos de base pBING-LC y pBID-HC. "Inversa" significa una orientación inversa del elemento TE 00 en los vectores base, "directa" significa una orientación directa del elemento TE 00 en los vectores base. FIGURA 8: MEDICIÓN FACS DE LA SERIE DE TRANSFECCIÓN C La Figura muestra la parte de las células que expresan dsRed2 en poblaciones de células estables, que contenían los elementos TE 01 , 02, 05, 06, 08 o 09, en comparación con las células en poblaciones celulares que no contenían elementos TE. Para ello se transfectaron células CHO-DG44 con el plásmido pTE4/MCP-1 o sus derivados, que contenían uno de los elementos TE arriba mencionados. Después de una selección de aprox. Tres semanas de los pools de células transfectadas en medio con adición de G418 se midió la fluorescencia dsRed2 por análisis FACS. Por pool se midieron en cada caso 10000 células y se restó la fluorescencia propia de las células CHO-DG44 no transfectada. Cada valor representa el valor promedio de la parte porcentual de células que expresan dsRed2 de 6 pools de la serie de transfección C. FIGURA 9: INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS TE SOBRE LA PRODUCTIVIDAD ESPECÍFICA En esta figura se representan en forma de gráfico (A) o tabla (B) las modificaciones del nivel de expresión de lgG1 y/o MCP-1 , las que resultan de la presencia de los elementos TE en comparación con el pool de control sin elemento TE. Los pools celulares se obtuvieron por transfección estable de células CHO-DG44 con los plásmidos base pBING-LC y pBID-HC y/o pTE4/MCP-1 ("control") y los derivados obtenidos de allí, los que contenían en cada caso un elemento TE ("00" en orientación directa ("00 directa") y en orientación inversa ("00 inversa"), "01 " a "12"). Después de una selección de dos a tres semanas de los pools de células transfectados en medio libre de HT con adición de G418 (Serie A y B) y/o en medio que contenía HT con adición de G418 (Serie C y D) se midió la expresión de proteínas por ELISA en el sobrenadante del cultivo celular y se calculó la productividad específica por célula y día. El cultivo de las células CHO-DG44 transfectadas en forma estable se realizó mediante varios pasajes en recipientes T de 75 cm2 con un ritmo de pasaje de 2-2-3 días. En la Serie A, de las combinaciones de plásmidos "00 inversa" y "00 directa" se encontraban en cultivo 4 pools y del control 3 pools a través de 8 pasajes, en la Serie B de cada combinación de plásmido 10 pools a través de 6 pasajes y en las Series C y D de cada tipo de plásmido 6 pools a través de 6 pasajes. Las productividades específicas de los pools en una combinación de plásmidos y una serie se calculó un valor medio y el valor medio de los controles en cada serie se igualó a 1. Las productividades específicas promediadas de los pools con elemento TE, se ajustaron en relación. FIGURA 10: INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS TE SOBRE LA PRODUCTIVIDAD ESPECÍFICA EN POOLS DE CÉLULAS SELECCIONADAS DHFR En esta figura se representan en forma de gráfico (A) o tabla (B) las modificaciones del nivel de expresión de MCP-1 , las que resultan de la presencia de los elementos TE en comparación con el pool de control sin elemento TE. Los pools celulares se obtuvieron por transfección estable de células CHO-DG44 con el plásmido base pTE4/MCP-1 ("control") o los derivados obtenidos de allí, los que contenían además en cada caso un elemento TE ("01" a "12") (Serie E). Después de una selección de dos a tres semanas de los pools de células transfectados en medio libre de HT se midió la expresión de proteínas por ELISA en el sobrenadante del cultivo celular y se calculó la productividad específica por célula y día. El cultivo de las células CHO-DG44 transfectadas en forma estable se realizó mediante varios pasajes en recipientes T de 75 cm2 con un ritmo de pasaje de 2-2-3 días. De cada variante de plásmido se encontraban en cultivo 6 pools a través de 6 pasajes. Las productividades específicas de los pools en una variante de plásmido se promediaron y el valor medio de los controles se igualó a 1. Las productividades específicas promediadas de los pools con elemento TE, se ajustaron en relación. FIGURA 11 : PRUEBA DE LOS ELEMENTOS TE CON RESPECTO A LA ACTIVIDAD POTENCIADORA La transfeccion transitoria de las células CHO-DG44 no mostró con el uso de los vectores de expresión con elementos TE ningún aumento significativo del título de MCP-1 con respecto a los vectores control sin elemento TE. Los elementos TE 01 a 12 no actúan por lo tanto como potenciador y sólo pueden provocar un aumento significativo de la expresión con integración cromosómica. Se transfectaron en cada caso 6 pools con el vector base pTE4/MCP-1 ("control") y los derivados que provenían de allí, los que contenían además un elemento TE ("01" a "12"). Al mismo tiempo se cotransfectó un plásmido de expresión SEAP, para determinar la eficiencia de transfeccion (SEAP = fosfatasa alcalina segregada). Después de 48 hs de cultivo en un volumen total de 3 mi se retiró el sobrenadante del cultivo celular y se determinó el título de MCP-1 por medio de ELISA así como también la actividad SEAP. El título de MCP-1 se corrigió con respecto a la eficiencia de transfeccion, calculada por medio de la expresión de SEAP. La figura muestra el valor medio de 6 pools paralelos con desviación estándar. FIGURA 12: OTROS ELEMENTOS TE Los resultados hasta ahora indican que la selección mostrada en esta figura de partes de la secuencia ID N° 1 también puede provocar un aumento de la expresión génica. Por clonación y transfeccion estable de estos elementos TE adicionales se puede caracterizar más aún la secuencia ID N° 1 , para localizar las zonas de secuencia importantes para la función en forma más exacta.

FIGURA 13: PRUEBA DE DIFERENTES POSICIONES Y COMBINACIONES DE LOS ELEMENTOS TE Esta figura representa una selección de posibles vectores de expresión en los cuales se usan diferentes posiciones, orientación y combinaciones de elementos TE, para investigar, si de este modo se puede lograr un aumento adicional de la expresión. Aparte del flanqueo del gen del producto por elementos TE, se introducen también varios elementos TE cortos idénticos o diferentes uno después de otro, como por ej., los elementos TE 06 y 08 o los nuevos elementos TE 13 y 14. FIGURA 14: INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS TE TE-13 A TE-18 SOBRE LA EXPRESIÓN DE MCP-1 ESPECÍFICA En esta figura se representan gráficamente las modificaciones del nivel de expresión de MCP-1 , las que resultan de la presencia de los elementos TE en comparación con los pools control sin elemento TE. Los pools celulares se obtuvieron por medio de transfección estable de células CHO-DG44 con el plásmido base pTE4/MCP-1 ("control") o derivados provenientes de allí, los que contenían adicionalmente un elemento TE ("13" a "18") (Serie F). Después de una selección de dos a tres semanas de los pools celulares transfectados en medio suplementado con HT +G418 (400 µ/ml) se midió la expresión de proteínas por ELISA en el sobrenadante de cultivo celular y se calculó la productividad específica por célula y día. El cultivo de las células CHO-DG44 transfectadas en forma estable se realizó mediante varios pasajes en recipientes T de 75 cm2 con un ritmo de pasaje de 2-2-3 días. De cada variante de plásmido se encontraban en cultivo 4 pools a través de 5 a 6 pasajes. Las productividades específicas de los pools en una variante de plásmido se promediaron y el valor medio de los controles se igualó a 1. Las productividades específicas promediadas de los pools con elemento TE, se ajustaron en relación. FIGURA 15: INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS TE EN DIVERSAS POSICIONES Y EN DIVERSAS COMBINACIONES SOBRE LA EXPRESIÓN DE MCP-1 En esta figura se representan gráficamente las modificaciones del nivel de MCP-1 , las que resultan de la presencia y combinación de diversos elementos TE en comparación con los pools control sin elemento TE. Los pools celulares se obtuvieron por medio de transfección estable de células CHO-DG44 con el plásmido base pTE4/MCP-1 ("control") o derivados provenientes de allí, los que contenían adicionalmente uno o dos elementos TE ("06 y 08, 08rev, 09rev, A") (Serie G). Después de una selección de dos a tres semanas de los pools celulares transfectados en medio suplementado con HT +G418 (300 µ/ml) se midió la expresión de proteínas por ELISA en el sobrenadante de cultivo celular y se calculó la productividad específica por célula y día. El cultivo de las células CHO-DG44 transfectadas en forma estable se realizó a través de varios pasajes en placas de 6 cavidades (MAT6) con un ritmo de pasaje de 2-2-3 días. De cada variante de plásmido se encontraban en cultivo 6 pools a través de 6 pasajes. Las productividades específicas de los pools en una variante de plásmido se promediaron y el valor medio de los controles se igualó a 1. Las productividades específicas promediadas de los pools con elemento TE, se ajustaron en relación. FIGURA 16: PRUEBA DEL ELEMENTO TE CON ANTICUERPOS IGG-4 Los vectores aquí representados se usaron para la expresión de anticuerpos lgG4 monoclonales, recombinantes, en células CHO-DG44. "E/P", en este caso, es una combinación del potenciador y promotor CMV, "P" es sólo un elemento del promotor y "T" es una señal de terminación para la transcripción, que se requiere para la poliadenilación del mARN transcripto. La posición y la dirección de la iniciación de la transcripción en cada unidad de transcripción se indican mediante una flecha. Los genes para la cadena liviana (LC2 o LC3) y la pesada (HC2 o HC3) fueron clonados por intercambio con el cásete MCP-1 - IRES - dsRed2 (Figs. 1 B y 2). Codifican para la cadena pesada y/o liviana de anticuerpos lgG4 monoclonales humanizados. El marcador de selección amplificable dihidrofolato-reductasa está abreviado con "dhfr". El marcador de selección neomicina-fosfotransferasa contiene la mutación puntual F240I y está abreviada en la Figura correspondientemente con "F240I". DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los conceptos y denominaciones utilizados en el marco de esta descripción de la invención tienen los siguientes significados definidos a continuación. Las formas de expresión generales "que contiene" o "contiene" comprenden la forma de expresión más especial "compuesto por". El "singular" y el "plural" no se utilizan en forma limitativa. El concepto "elemento TE" denota ácidos nucleicos reguladores. Los conceptos "elemento TE" o "elemento que aumenta la expresión" o "elemento que aumenta la transcripción" o "elemento de ácidos nucleicos que aumenta la expresión y/o la transcripción" se usan en el texto como sinónimos. Estos conceptos denotan todas las secuencias de ácidos nucleicos reguladoras. Por "elemento TE" o "elemento que aumenta la expresión" o "elemento que aumenta la transcripción" o "elemento de ácidos nucleicos que aumenta la expresión y/o la transcripción" se entiende aquí especialmente la secuencia ID N° 1 , inclusive su secuencia complementaria, la que fue aislada del genoma del hámster chino (cricetulus griseus), o una parte, fragmento o zona cualquiera de la misma, que conduce a un aumento de la transcripción y/o expresión de un de interés, en una integración cromosómica. También se entienden cualesquiera combinaciones de partes, fragmentos, zonas o derivados de la secuencia ID N° 1 , que están compuestas por varias partes, fragmentos, zonas o derivados idénticos o diferentes de la SEQ ID N° 1 , los cuales a su vez pueden estar en cualquier orientación y distancia unos de otros o también pueden ser combinados con secuencias reguladores y que llevan a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés. El concepto elemento TE puede ser la SEQ ID N° 1 propiamente dicha como también cualesquiera fragmentos, partes, zonas o derivados de ella. El concepto "elemento TE", "elemento de ácidos nucleicos que aumenta la transcripción y/o la expresión" y/o fragmentos, partes, zonas o derivados del mismo, comprende además aparte de zonas de secuencias de hámster chino (Cricetulus griseus) también secuencias de nucleótidos homologas funcionales correspondientes de otros organismos. Tales otros organismos son por ejemplo, el ser humano, ratón, rata, mono, así como también otros mamíferos y roedores, reptiles, pájaros, peces y plantas. Por un "fragmento" o "parte" o "zona" (estos conceptos se usan como sinónimos) se entiende una molécula de ácidos nucleicos (de hebra simple o doble) que presenta identidad de secuencia de 100% con una parte de la SEQ ID N° 1 o su secuencia complementaria. Es conocido que la clonación de fragmentos que son obtenidos o bien a través de digestión con enzimas de restricción o a través de PCR, puede llevar a modificaciones en las zonas de los extremos del fragmento, es decir, por ejemplo, nucleótidos adicionales o faltantes que resultan de reacciones de adición o supresión, o nucleótidos introducidos adicionalmente por medio de cebadores. Estas variaciones en las zonas de los extremos de los fragmentos están incluidas en la definición de un fragmento, aún cuando estas zonas de secuencias presenten una identidad de secuencia de menos de 100% con la SEQ ID N° 1. "Partes" y/o "fragmentos" y/o "zonas" de la secuencia ID N° 1 son, por ej., TE-00 (Secuencia ID N° 2), TE-01 (Secuencia ID N° 3), TE-02 (Secuencia ID N° 4), TE-03 (Secuencia ID N° 5), TE-04 (Secuencia ID N° 6), TE-05 (Secuencia ID N° 7), TE-06 (Secuencia ID N° 8), TE-07 (Secuencia N° 9), TE-08 (Secuencia ID N° 10), TE-09 (Secuencia N° 11 ), TE-10 (Secuencia ID N° 12), TE-11 (Secuencia N° 13), TE-12 (Secuencia ID N° 14), TE-13 (Secuencia ID N° 15), TE-14 (Secuencia ID N° 16), TE-15 (Secuencia ID N° 17), TE-16 (Secuencia ID N° 18), TE-17 (Secuencia ID N° 19), TE-18 (Secuencia ID N° 20), TE-21 (Secuencia ID N° 21 ). Preferentemente, el fragmento, en una integración cromosómica estable, lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés unido funcionalmente. "Partes" y/o "fragmentos" y/o "zonas" de la Secuencia ID N° 1 , que llevan a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés, son, por ej., TE-00 (Secuencia ID N° 2), TE-01 (Secuencia ID N° 3), TE-02 (Secuencia ID N° 4), TE-03 (Secuencia ID N° 5), TE-04 (Secuencia ID N° 6), TE-06 (Secuencia ID N° 8), TE-07 (Secuencia N° 9), TE-08 (Secuencia ID N° 10), TE-10 (Secuencia ID N° 12), TE-11 (Secuencia N° 13), TE-12 (Secuencia ID N° 14), TE-13 (Secuencia ID N° 15), TE-14 (Secuencia ID N° 16), TE-15 (Secuencia ID N° 17), TE-16 (Secuencia ID N° 18), TE-17 (Secuencia ID N° 19), TE-18 (Secuencia ID N° 20) y TE-21 (Secuencia ID N° 21 ).

Pero por "fragmento" también se entienden también todas las otras partes posibles de la SEQ ID N° 1 en cualquier orientación, las que llevan a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés, especialmente aquellas que se encuentran total o por lo menos parcialmente en la zona 5' de TE-00 (SEQ ID N° 2). Esto corresponde a la zona parcial de SEQ ID N° 1 entre 1 pb y 1578 pb. Se prefiere también el fragmento TE-08 (SEQ ID N° 10). Por "derivado" se entiende en la siguiente invención una molécula de ácidos nucleicos (de hebra simple y doble), que presenta con la SEQ ID N° 1 o su secuencia complementaria o con una parte y/o fragmento y/o zona de la SEQ ID N° 1 y/o su secuencia complementaria, una identidad de secuencia de por lo menos aprox. 70%, o una identidad de secuencia por lo menos aprox. 80%, preferentemente una identidad de secuencia de por lo menos 85%, de manera particularmente preferente una identidad de secuencia de por lo menos aprox. 90% y más preferentemente aún una identidad de secuencia de por lo menos aprox. 95% y que en la integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés. Las diferencias de secuencia con respecto a la SEQ ID N° 1 , por un lado, pueden basarse en diferencias en secuencias de nucleótidos endógenas, homologas, de otros organismos. Por otro lado, pueden basarse también en modificaciones de la secuencia de ácidos nucleótidos, por ej., la sustitución, la inserción o la deleción de por lo menos uno o más nucleótidos. Los mutantes de deleción, inserción y sustitución se pueden obtener por medio de "mutagénesis específica de un sitio" y/o "técnicas de mutagénesis basadas en PCR". Métodos correspondientes fueron descritos por Lottspeich y Zorbas (1998; Capítulo 36,1 ) con más referencias. Se puede establecer la concordancia de la identidad de secuencia por medio de los así llamados algoritmos de "alineamiento" estándar, como por ejemplo "BLAST" (Altschul, S. F., Gish, W., Millar, W., Myers, E. W. y Lipman, D. J. (1990) "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215:403-410; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST server" Met. Enzymol. 266:131-141 ; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." con una secuencia de referencia, que se encuentra en la SEQ ID N° 1. La concordancia de las secuencias se establece cuando coinciden en su orden de secuencia y se pueden identificar con ayuda de los algoritmos de "alineamiento" estándar. Por "derivado" se entiende en la presente invención además una molécula de ácidos nucleicos (de hebra simple o doble), la que híbrida con la SEQ ID N° 1 o con la secuencia de un fragmento y/o parte y/o zona de la SEQ ID N° 1 o una secuencia complementaria. Preferentemente, la hibridación se realiza bajo condiciones de hibridación y lavado severas (por ej., hibridación a 65°C en un búfer que contiene 5x SSC; lavado a 42°C con 0.2x SSC/0.1% SDS). Técnicas correspondientes se describen por ejemplo, en Ausubel et al., 1994. Preferentemente la parte y/o el fragmento y/o la zona de la SEQ ID N° 1 comprenden toda o por lo menos parte de la zona de la secuencia entre la posición de nucleotidos de 1 pb y 1578 pb. Esto corresponde a la zona de secuencia 5' de la secuencia TE-00 (SEQ ID N° 2). Se prefiere también el fragmento TE-08 (SEQ ID N° 10). La expresión "variante" se refiere a los vectores de expresión usados en la mezcla de transfección en cada caso. Entre ellos se encuentran tanto los vectores base (pTE4/MCP-1 y/o pTE5/MCP-1 ) y/p la combinación de vectores base (pBING-LC + pBID-HC) como también los vectores base que contienen en cada caso uno o más elementos TE en diferente posición, combinación y orientación. En los cebadores, la expresión "orientación" se refiere al ordenamiento del cebador con relación a la SEQ ID N° 1. Todos los cebadores, cuyo orden de secuencias se corresponde con la secuencia denominada SEQ ID N° 1 en el orden 5'-3' ("forward primer"), se encuentran en la misma orientación que esta secuencia, lo que también se denomina "orientación directa". Los cebadores cuyo orden de secuencias es complementario a la secuencia denominada SEQ ID N° 1 ("reverse primer") se encuentran en orientación opuesta a esta secuencia, lo que también se denomina "orientación inversa". Con relación a los elementos TE, en la presente invención se entiende bajo "orientación" el ordenamiento con respecto al gen de interés. La secuencia denominada SEQ ID N° 1 representa una secuencia del genoma que está posicionada 5' con respecto a la región codificadora para el gen de ubiquitina/S27a, lo que también se denomina "corriente arriba". La continuación de esta secuencia indicada en la SEQ ID N° 1 en dirección a la región de codificación del gen de ubiquitina/S27a siguiente llevaría al codón de inicio de este gen. Este ordenamiento se denomina por eso "orientación directa". Análogamente, el elemento SE TE encuentra en la presente invención en orientación directa, cuando la secuencia indicada bajo SEQ ID N° 1 , o una parte cualquiera, fragmento, zona o derivado de la misma, se encuentra en el vector de expresión en la misma hebra de ADN que el codón de inicio del gen de interés. Si por el contrario, la secuencia complementaria a la SEQ ID N° 1 , o una parte cualquiera, fragmento, zona o derivado de la misma, se encuentra en el vector de expresión en la misma hebra de ADN que el codón de inicio del gen de interés, entonces se tiene una "orientación inversa" del elemento TE correspondiente. Si no se indica de otro modo, cuando se menciona un elemento TE siempre están comprendidas/se entienden ambas orientaciones, es decir, directa e inversa. Bajo "integración cromosómica" se entiende la integración de una secuencia de ácidos cualquiera en el genoma, es decir en los cromosomas, de una célula, pudiendo realizarse la integración en uno o más cromosomas en cualquier número, posición y orientación. Bajo "integración cromosómica" se entiende además la integración de una secuencia de ácidos nucleicos cualquiera en cromosomas sintetizados, artificiales o mini-cromosomas. Gen de interés: El "gen de interés" contenido en el vector de expresión de acuerdo con la invención comprende una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que codifica para un producto de interés. El producto de gen o también el "producto de interés" es en general una proteína, polipéptido, péptido y/o fragmento o derivado del mismo. Pero también puede ser un ARN o ARN antisentido. El gen de interés puede encontrarse en longitud completa, en forma acortada, como gen de fusión o gen marcado. Se puede tratar de ADN genómico o preferentemente de cADN y/o fragmentos correspondientes o fusiones. El gen de interés puede representar la secuencia de gen nativa, mutada o puede estar modificada de otra manera. Tales modificaciones comprenden optimizaciones del codón para adaptarlo a una determinada célula huésped y una humanización. El gen de interés puede codificar, por ej., para un polipéptido segregado, citoplasmático, localizado en el núcleo, ligado a la membrana o ligado a la superficie de la célula.

La expresión "ácido nucleico", "secuencia de nucleotidos" o "secuencia de ácidos nucleicos" indica un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido y sus fragmentos así como también ADN o ARN de origen genómico o sintético, que se encuentran como hebra simple o doble y puede representar la hebra codificadora o no codificadora de un gen. Para la modificación de secuencias de ácidos nucleicos se pueden usar técnicas estándar, como por ej., mutagénesis específica de un sitio o mutagénesis mediada por PCR (por ej., como se describió en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1994). Bajo "codificar" se entiende la propiedad o capacidad de una secuencia específica de nucleotidos en un ácido nucleico, por ejemplo, un gen en un cromosoma o un mARN, de servir como matriz para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas, como por ej., rARN, tARN, mARN, otras moléculas de ARN, cADN o polipéptidos en un procedimiento biológico. Por lo tanto, un gen codifica para una proteína, cuando por transcripción y traducción subsiguiente del mARN, se produce la proteína deseada en una célula o en otro sistema biológico. Tanto la hebra codificadora, cuya secuencia de nucleotidos es idéntica a la secuencia de mARN y que se indica normalmente también en bancos de datos de secuencias, por ej., EMBL o GenBank, como también la hebra no codificadora de un gen o cADN que sirve como matriz para la transcripción, puede ser denotada entonces como codificadora para un producto o proteína. Un ácido nucleico que codifica para una proteína comprende también ácidos nucleicos que debido al código genético degenerado presentan otro orden de secuencias de nucleotidos, pero que dan por resultado la misma secuencia de aminoácidos de la proteína. Las secuencias de ácidos nucleicos, que codifican para proteínas, pueden contener también intrones. Con la expresión "cADN" se denotan ácidos desoxirribonucleicos, los que se obtienen por transcripción inversa y síntesis de la segunda hebra de ADN de un mARN producido por un gen o de otro ARN. Si el cADN se encuentra como molécula de ADN de doble hebra, entonces el mismo contiene tanto una hebra codificadora como también una hebra no codificadora. Con la expresión "intrón" se denotan secuencias de nucleótidos no codificadoras de cualquier longitud. Se encuentran naturalmente en muchos genes eucarióticos y se retiran de un precursor de mARN transcripto anteriormente por medio de un procedimiento denominado corte y empalme. Para ello es necesario un corte exacto del intrón en el extremo 5 -3' y una unión correcta de los extremos mARN obtenidos, para que se pueda obtener un mARN procesado maduro con el marco de lectura correcto para una síntesis de proteínas exitosa. Muchos de los sitios dadores de corte y empalme y de los sitios aceptores de corte y empalme que participan en este procedimiento de corte y empalme, estas son las secuencias que se encuentran directamente en los límites del exón-intrón y/o intrón-exón, han sido caracterizados mientras tanto. Para un panorama, ver Ohshima et al., 1987. Proteína/producto de interés: Proteínas/polipéptidos importantes para la industria biofarmacéutica comprenden, por ej., anticuerpos, enzimas, citoquinas, linfoquinas, moléculas de adhesión, receptores así como también sus derivados y/o fragmentos, pero no se limitan a ellos. En general, son importantes todos los polipéptidos que actúan como agonistas o antagonistas y/o pueden tener una aplicación en diagnóstico. Otras proteínas de interés son, por ejemplo, proteínas/polipéptidos que se usan para la modificación de las propiedades de células huésped en el marco de la así llamada "Cell Engineering", como por ej., proteínas anti-apoptóticas, chaperones, enzimas del metabolismo, enzimas de glucosilación así como también sus derivados y/o fragmentos, pero no se limitan a estos. La expresión "polipéptidos" se usa para secuencias de aminoácidos o proteínas y denota polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Esta expresión incluye también proteínas que son modificadas después de la traducción por reacciones como, por ejemplo, glucosilación, fosforilación, acetilacion o procesamiento de proteínas. La estructura del polipéptido puede ser modificada, por ej., por sustituciones, deleciones o inserción de aminoácidos, fusión con otras proteínas, manteniendo su actividad biológica. Además, los polipéptidos se pueden multimerizar y formar homo- y heterómeros. Ejemplos de proteínas terapéuticas son insulina, factor de crecimiento parecido a la insulina, hormona de crecimiento humana (hGH) y otros factores de crecimiento, receptores, activador del plasminógeno del tejido (tPA), eritropoyetina (EPO), citoquina, por ejemplo, interleuquina (IL) como IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón (IFN)-alfa, beta, gamma, omega o tau, factor de necrosis tumoral (TNF) como, por ej., TNF-alfa, beta o gamma, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF. Otros ejemplos son anticuerpos monoclonales, policlonales, multiespecíficos y de una sola cadena (single Caín) y fragmentos de los mismos, como por ej., FAb, Fab', F (ab')2, Fe y Fe', cadenas de inmunoglobulina livianas (L) y pesadas (H) y sus regiones constantes, variables o hipervariables así como también fragmentos Fv y Fd (Chamov et al., 1999). Los anticuerpos pueden ser de origen humano o no humano. También entran en consideración anticuerpos humanizados y quiméricos. Los fragmentos Fab ("Fragment antigen-binding = Fab) están compuestos por las regiones variables de ambas cadenas, las que se mantienen unidas por las regiones constantes limítrofes. Pueden ser obtenidos, por ej., por tratamiento con una proteasa, como por ejemplo, papaína, a partir de anticuerpos convencionales o también por clonación de ADN. Otros fragmentos de anticuerpos son los fragmentos F (ab')2, los que pueden ser preparados por medio de la digestión proteolítica con pepsina. Por clonación de genes también se pueden preparar fragmentos de anticuerpos acortados, los que están compuestos solamente por las regiones variables de la cadena pesada (VH) y la cadena liviana (VL). Estos son denominados fragmentos Fv (Fragment variable = Fragmento de la parte variable). Como en estos fragmentos Fv no es posible la unión covalente a través de los restos de cisterna de las cadenas constantes, estos fragmentos Fv son estabilizados frecuentemente en otro lado. Además, las regiones variables de la cadena pesada y liviana son unidas entre sí frecuentemente por medio de un fragmento de péptido corto de aprox. 10-30 aminoácidos, más preferentemente 15 aminoácidos. De esta manera se forma una cadena de polipéptidos individual, en la cual VH y VL se unen entre sí por medio de un ligador de péptidos. Tales fragmentos de anticuerpos son denominados también fragmento Fv de cadena simple (scFv) ("single Chain Fv"). Ejemplos de anticuerpos scFv son conocidos y se describieron, ver por ej., Huston et al. (1988). En los últimos años se desarrollaron diversas estrategias para preparar derivados de scFv multímeros. La intención es generar anticuerpos recombinantes con propiedades farmacocinéticas mejoradas y mayor actividad de ligadura. Para obtener la multimerización de los fragmentos scFv se preparan estos como proteínas de fusión con dominios de multimerización. Como dominios de multimerización pueden actuar para ello, por ej., la región CH3 de un IgG o estructuras helicoidales ("coiled coil structure") como los dominios de cremallera de leucina. En otras estrategias se usa la interacción entre las regiones VH y VL del fragmento scFv para una multimerización (por ej., dia-, tri- y pentacuerpos). Como "diacuerpo" un experto denota un derivado de scFv homodímero bivalente. El acortamiento del ligador peptídico en la molécula de scFv a 5-10 aminoácidos da por resultado la formación de homodímeros por superposición de cadenas VH/VL. Los diacuerpos pueden ser estabilizados además por puentes disulfuro introducidos. Ejemplos de diacuerpos se encuentran en la literatura, por ej., en Perisic et al. (1994). Como "minicuerpo" el experto denota un derivado de scFv homodímero, bivalente. Está compuesto por una proteína de fusión que contiene la región CH3 de una inmunoglobulina, preferentemente IgG, más preferentemente lgG1 , como región de dimerización. Esta une los fragmentos scFv a través de una región bisagra, igualmente de IgG, y una región del ligador. Ejemplos de tales minicuerpos se describen en Hu et al. (1996). Con "triacuerpo" el experto denota un derivado de scFv homotrímero, trivalente (Kortt et al., 1997). La fusión directa de VH-VL sin usar una secuencia de ligador lleva a la formación de trímeros. Los fragmentos denominados por el experto como mini-anticuerpos, que tienen una estructura bi-, tri- o tetravalente, son igualmente derivados de fragmentos de scFv. La multimerización se logra a través de estructuras de "coiled coil" di-, tri- o tetraméricas (Pack et al., 1993 y 1995; Lovejoy et al., 1993).

Gen que codifica una proteína fluorescente: En otra forma de realización, el vector de expresión de acuerdo con la invención contiene un gen que codifica para una proteína fluorescente en unión funcional con el gen de interés. Preferentemente, la transcripción de ambos genes se realiza bajo el control de un solo promotor heterólogo, de modo que la proteína/el producto de interés y la proteína fluorescente son codificados por un m-ARN bicistrónico. Esto posibilita una identificación de células que producen la proteína/el producto de interés en gran cantidad, a través de la tasa de expresión de la proteína fluorescente. Alternativamente, la transcripción del gen que codifica para la proteína fluorescente puede realizarse bajo el control de un promotor propio. La proteína fluorescente puede ser, por ej., una proteína fluorescente verde, azul-verdoso, azul, amarilla o de otro color. Un ejemplo especial es la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria o Renilla reniformes y los mutantes desarrollados a partir de allí; ver, por ejemplo, Bennet et al. (1998); Chalfie et al. (1994); documento WO 01/04306 y la literatura allí mencionada. Otras proteínas fluorescentes y los genes que las codifican se describen en los documentos WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 y WO 01/27150, los que se incorporan a la presente por referencia. Estas proteínas fluorescentes son fluoróforos de organismos no bioluminiscentes de la especie Anthozoa, por ejemplo de Anemonia majano, Clavularia sp., Zoanthus sp. I, Zoanthus sp. II, Discosoma striata, Discosoma sp. "roja", Discosoma sp. "verde", Discosoma sp. "magenta", Anemonia sulfata, Aequorea coerulescens. Las proteínas de fluorescencia usadas de acuerdo con la invención comprenden aparte de las proteínas de tipo salvaje también mutantes y variantes naturales o preparadas por tecnología génica, sus fragmentos, derivados, o por eje., variantes fusionadas con otras proteínas u otros péptidos. Las mutaciones introducidas pueden modificar, por ej., el espectro de excitación o emisión, la formación de cromóforos, el coeficiente de extinción o la estabilidad de la proteína. Por la optimización del codón, se puede mejorar además la expresión en células de mamíferos o de otras especies. De acuerdo con la invención, la proteína fluorescente también puede ser usada en fusión con un marcador de selección, preferentemente con un marcador de selección amplificable como por ejemplo, la dihidrofolato-reductasa (DHFR). La fluorescencia emitida por las proteínas fluorescentes posibilita la detección de las proteínas, por ej., por citometría de flujo con un separador de células activado por fluorescencia (FACS) o por microscopía de fluorescencia. Otros elementos reguladores: El vector de expresión contiene por lo menos un promotor heterólogo que posibilita la expresión del gen de interés y preferentemente también la de la proteína fluorescente. Como "promotor" se denota una secuencia de polinucleótidos que posibilita y controla la transcripción de los genes o secuencias unidos con la misma funcionalmente. Un promotor contiene secuencias de reconocimiento para la ligadura de la ARN-polimerasa y el sitio de iniciación de la transcripción (sitio de iniciación de la transcripción). Para la expresión de una secuencia deseada en un tipo celular determinado o una célula huésped tiene que elegirse en cada caso un promotor funcional, adecuado. El experto conoce una multiplicidad de promotores de diversas fuentes, inclusive promotores constitutivos, inducibles y reprimióles. Se encuentran depositados en bancos de datos, por ej., GenBank y se pueden adquirir de fuentes comerciales o individuales como elementos individuales o clonados dentro de secuencias de polinucleótidos. En promotores inducibles la actividad del promotor en reacción a una señal puede ser reducida o reforzada. Un ejemplo de un promotor inducible es el promotor de la tetraciclina (tet). Este contiene secuencias operadoras de tetraciclina (tetO), las que pueden ser inducidas por medio de una proteína transactivadora regulada (tTA). En presencia de tetraciclina se inhibe la ligadura de tTA a tetO. Ejemplos de otros promotores inducibles son el promotor jun, fos, metalotionina y del shock de calor (ver también Sambrook et al., 1989; Gossen et al., 1994). Entre los promotores, que son adecuados para una alta expresión en eucariotas, se encuentran, por ejemplo, el promotor de ubiquitina/S27a del hámster (documento WO 97/15664), el promotor temprano SV40, el promotor tardío mayor de Adenovirus, el promotor de metalotionina-l del ratón, la región de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, el promotor temprano del virus de citomegalia humano. Ejemplos de otros promotores de mamíferos heterólogos son el(los) promotores) de actina, inmunoglobulina o del shock térmico. Un promotor heterólogo correspondiente puede ser relacionado funcionalmente con otras secuencias reguladoras para el aumento/regulación de la actividad de transcripción en un cásete de expresión. Por ejemplo, el promotor puede ser unido funcionalmente con secuencias de potenciadotes para aumentar la actividad de transcripción. Para ello se pueden usar uno o más potenciadotes y/o varias copias de una secuencia de potenciador, por ejemplo, un potenciador de CMV o SV40.

Correspondientemente, un vector de expresión de acuerdo con la invención contiene en otra forma de realización uno o más potenciadotes/secuencias de potenciadotes, preferentemente un potenciador de CMV o SV40. Con la expresión "potenciador" se denota una secuencia de polinucleótidos, que actúa en localización cis sobre la actividad de un promotor y de este modo estimula la transcripción de un gen unido funcionalmente con este promotor. A diferencia de los promotores, la acción de los potenciadores es independiente de la posición y la orientación y por lo tanto pueden ser posicionados antes o después de una unidad de transcripción, dentro de un intrón o incluso dentro de la región de codificación. El potenciador puede estar localizado tanto en la cercanía inmediata de la unidad de transcripción como también a una distancia considerable del promotor. También es posible una superposición física y funcional con el promotor. El experto conoce una multiplicidad de potenciadotes de diversos orígenes (y depositados en bancos de datos como GenBank, por ej., el potenciador SV40, el potenciador CMV, el potenciador polioma, el potenciador adenovirus) y están disponibles en forma individual o como elementos clonados dentro de secuencias de polinucleótidos (por ej., depositados en ATCC o de orígenes comerciales e individuales). Una multiplicidad de secuencias de promotores contiene también secuencias de potenciadotes, como por ej., el promotor CMV usado frecuentemente. El potenciador CMV humano pertenece a los potenciadotes más fuertes identificados hasta el momento. Un ejemplo de un potenciador inducible es el potenciador de metalotionina, que puede ser estimulado por glucocorticoides o metales pesados.

Otra posible modificación es, por ej., la introducción de múltiples sitios de ligadura Sp1. Las secuencias de los promotores pueden ser combinadas además con secuencias reguladoras que permiten un control/regulación de la actividad de transcripción. Así se puede hacer al promotor reprimible/inducible. Esto se puede realizar, por ejemplo, por medio de la unión con secuencias que representan los sitios de unión para factores de transcripción que regulan positiva o negativamente. El factor de transcripción SP-1 arriba mencionado, por ejemplo, tiene una influencia positiva sobre la actividad de transcripción. Otro ejemplo es el sitio de unión para la proteína activadora AP-1 , que puede actuar tanto en forma positiva como negativa sobre la transcripción. La actividad de la AP-1 también puede ser controlada por los más diversos factores, como por ej., factores de crecimiento, citoquinas y suero (Faisst y col., 1992 y sus referencias). La eficiencia de transcripción también puede ser aumentada de tal modo que la secuencia del promotor es modificada por mutación (sustitución, inserción o deleción) de una, dos, tres o más bases y luego se determina en un ensayo de gen informador si de este modo se aumenta la actividad del promotor. Fundamentalmente, los elementos reguladores adicionales comprenden promotores heterologos, potenciadotes, señales de terminación y poliadenilación y otros elementos de control. Para los diversos tipos celulares se conocen tanto secuencias reguladoras inducibles como también constitutivas. "Elementos reguladores de la transcripción" comprenden usualmente por lo menos un promotor corriente arriba de la secuencia de gen a expresar, sitios de iniciación y terminación de la transcripción así como también una señal de poliadenilación. El término "sitio de iniciación de la transcripción" se refiere a un ácido nucleico en el constructo, que corresponde al primer ácido nucleico, el cual es incorporado en el transcripto primario, es decir, el precursor de mARN. El sitio de iniciación de la transcripción puede superponerse con las secuencias de los promotores. El término "sitio de terminación de la transcripción" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra normalmente en el extremo 3' del gen de interés o del tramo de gen a transcribir y que provoca la interrupción de la transcripción por la ARN-polimerasa. La "señal de poliadenilación" es una secuencia de señales que provoca la escisión en un sitio específico en el extremo 3' del mARN eucariótico y la incorporación post-transcripcional de una secuencia de aprox. 100-200 nucleótidos de adenina (cola poliA) en el extremo 3' escindido. La señal de poliadenilación comprende la secuencia AATAAA aproximadamente 10-30 nucleótidos corriente arriba del sitio de escisión así como también una secuencia que se encuentra corriente abajo. Se conocen varios elementos de poliadenilación, por ej., tk polyA, SV40 tardío y polyA temprano o BGH polyA (descritos, por ej. En el documento US 5.122.458). "Elementos transreguladores" comprenden un sitio de iniciación de la traducción (AUG), un codón de detención y una señal polyA para cada polipéptido a expresar. Para una expresión óptima puede ser favorable, retirar, agregar o modificar zonas 5' y/o 3' no traducidas de la secuencia de ácidos nucleicos a expresar, para eliminar potenciales codones de iniciación de traducción inadecuados adicionales u otras secuencias que pueden influir sobre la expresión a nivel de la transcripción o expresión. Para promover la expresión se pueden insertar alternativamente sitios de unión de consenso ribosomicos inmediatamente corriente arriba del codón de inicio. Para producir un polipéptido segregado, el gen de interés contiene comúnmente una señal de secuencia que codifica para un péptido precursor señal, que transporta al polipéptido a, y a través de, la membrana RE. La secuencia de señales se encuentra frecuentemente, pero no siempre, en el extremo amino de la proteína segregada y es escindida por peptidasas señal, después que la proteína fue pasada a través de la membrana RE. La secuencia de genes contendrá comúnmente, pero no necesariamente, una secuencia de señales propia. Cuando la secuencia de señales nativa no está presente, se puede introducir de manera conocida una secuencia de señales heteróloga. El experto conoce numerosas de estas secuencias de señales y están depositadas en bancos de datos de secuencias como GenBank y EMBL. Otro elemento regulador es el sitio de ligadura de ribosomas interno (IRES). El "elemento IRES" comprende una secuencia que realiza funcionalmente la iniciación de la traducción independientemente de un cap de metilguanosina 5' terminal (estructura CAP) así como también del gen que se encuentra corriente arriba, y posibilita en una célula animal la traducción de dos cistrones (marco de lectura abierto) de un solo transcripto. El elemento IRES pone a disposición un sitio de ligadura de ribosomas independiente para la traducción del marco de lectura abierto que se encuentra inmediatamente corriente abajo. Al contrario del mARN bacteriano, que puede ser multicistrónico, es decir, que puede codificar para varios polipéptidos o productos diferentes, los que son traducidos uno después de otro del mARN, la mayoría de los mARNs de células animales son monocistrónicos y codifican solo para una única proteína o producto. En un transcripto multicistrónico en una célula eucariótica se iniciaría la traducción por el sitio de iniciación de la traducción que se encuentra más cercano corriente arriba y sería terminado por el primer codón de detención, después de lo cual se liberaría el transcripto del ribosoma. En la traducción se formaría por lo tanto sólo el primero del polipéptido o producto codificado por el mARN. Por el contrario, un transcripto multicistrónico con un elemento IRES, que está unido funcionalmente con el segundo o con otros marcos de lectura abiertos en el transcripto, posibilita la traducción subsiguiente del marco de lectura abierto que se encuentra corriente abajo, de modo que en la célula eucariótica se producen dos o más polipéptidos o productos codificados por el mismo transcripto. El elemento IRES puede tener distinta longitud y origen diferente y provenir, por ej., del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) o de otros picornavirus. En la literatura se han descrito diversas secuencias IRES y su aplicación en la construcción de vectores; ver, por ejemplo, Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991 ; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996, Mosser et al., 1997. La secuencia de genes que se encuentra corriente abajo está unida funcionalmente con el extremo 3' del elemento IRES, es decir, la distancia es elegida de tal modo que la expresión del gen no es influida o sólo marginalmente y/o presenta una expresión suficiente para el objetivo. La distancia óptima y admisible entre el elemento IRES y el codón de inicio del gen que se encuentra corriente abajo para una expresión aún suficiente se puede calcular en ensayos sencillos mediante la variación de la distancia y la determinación de la tasa de expresión como función de la distancia con ayuda de ensayos de gen informador. Por medio de las medidas indicadas se puede obtener un cásete de expresión optimizado, el cual es de gran utilidad para la expresión de productos de genes heterólogos. Un cásete de expresión obtenido mediante una o más de tales medidas también es objeto de la invención. Promotor de ubiquitina/S27a del hámster: En otra forma de realización el vector de expresión de acuerdo con la invención contiene el promotor de ubiquitina/S27a del hámster, preferentemente en unión funcional con el gen de interés y aún más preferentemente en unión funcional con el gen de interés y el gen que codifica para una proteína fluorescente o un marcador de selección. El promotor de ubiquitina/S27a del hámster es un promotor homólogo fuerte que se describe en el documento WO 97/15664. Un promotor de este tipo presenta preferentemente por lo menos una de las siguientes características: zona de secuencia rica en GC, sitio de ligadura Sp1 , elemento de polipirimidina, presencia de un TATA-Box. Se prefiere especialmente un promotor que presenta un sitio de ligadura Sp1 en ausencia de un TATA-Box. Además, se prefiere un promotor de este tipo que está activado constitutivamente y que es activo especialmente bajo condiciones de cultivo de células con suero, con poco suero y sin suero. En otra forma de realización se trata de un promotor inducible, especialmente un promotor que es activado por extracción del suero. Una forma de realización especialmente ventajosa es un promotor con una secuencia de nucleótidos que está contenida en la Fig. 5 del documento WO 97/15664. Se prefieren especialmente las secuencias de promotores en las cuales está contenida la secuencia de la posición -161 a la -45 de la Fig. 5. Los promotores usados en los ejemplos de la presente descripción de patente comprenden en cada caso una molécula de ADN con una secuencia que corresponde al fragmento -372 a +111 de la Fig. 5 del documento WO 97/15664 y representa el promotor preferido, es decir, un promotor preferido debería comprender esta zona de secuencias. Preparación de vectores de expresión según la invención: La preparación del vector de expresión de acuerdo con la invención puede realizarse básicamente según métodos usuales, conocidos por el experto, como por ej., se describen en Sambrock et al. (1989). Allí se encuentra también una descripción de los componentes funcionales de un vector, por ej., promotores adecuados (adicionalmente al promotor de ubiquitina/S27a del hámster), potenciadotes, señales de terminación y poliadenilación, genes de resistencia a los antibióticos, marcadores de selección, puntos de partida de replicacion y señales de corte y empalme. Para la preparación se pueden usar vectores de clonación usuales, por ej., plásmidos, bacteriófagos, fagémidos, cósmicos o vectores virales como baculovirus, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus del herpes simple, pero también cromosomas sintéticos o artificiales o minicromosomas. Los vectores de expresión eucarióticos contienen típicamente también secuencias procarioticas como, por eje., origen de replicacion y genes de resistencia a los antibióticos, los que posibilitan la multiplicación y selección del vector en bacterias. Una multiplicidad de vectores de expresión eucarióticos, que contienen los sitios de clonación múltiples para la introducción de una secuencia de polinucleótidos, son conocidos y algunos se pueden obtener comercialmente de diversas empresas como Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.; Promega, Madison, Wl, EE. UU. o BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, EE. UU. De una manera usual para el experto se introducen en el vector de expresión el promotor heterólogo, el gen (o genes) de interés, el marcador de selección así como también eventualmente el gen codificador para la proteína fluorescente, elementos reguladores adicionales como por ejemplo, el sitio de ligadura de ribosomas (IRES), potenciadores, señales de poliadenilación y otros elementos cis-activos, como por ejemplo, elementos TE. Un vector de expresión de acuerdo con la invención contiene como mínimo un promotor heterólogo, el gen de interés y un elemento TE. Preferentemente, el vector de expresión contiene aún un gen codificador para una proteína fluorescente. De acuerdo con la invención, se prefiere especialmente el uso de un promotor de ubiquitina/S27a como promotor heterólogo. Se prefiere más aún un vector de expresión en el cual están unidos funcionalmente entre sí el promotor heterólogo, preferentemente un promotor de ubiquitina/S27a, el gen de interés y un elemento TE o que se encuentran en unión funcional. En el marco de la presente descripción el término "unión funcional" o "unido funcionalmente" se refiere a dos o más secuencias de ácidos nucleicos o secuencias parciales de ácidos nucleicos que están posicionadas de tal modo que pueden realizar la función prevista. Por ejemplo, un promotor/potenciador, un promotor/elemento TE o un promotor/potenciador/elemento TE están unidos funcionalmente con una secuencia de genes codificadora cuando pueden controlar o modular en posición cis la transcripción de la secuencia de genes unida. En general, pero no necesariamente, las secuencias de ADN unidas funcionalmente se encuentran muy cerca una de otra, y si se unen dos secuencias de genes codificadoras o en el caso de una secuencia de señal de secreción, en el mismo marco de lectura. Si bien un promotor unido funcionalmente se encuentra en general corriente arriba de la secuencia de genes codificadora, no tiene que estar necesariamente muy cercano. Los potenciadores o elementos TE tampoco tienen que estar muy próximos, en tanto favorezcan la transcripción y/o la expresión de la secuencia de genes. Para este fin pueden estar tanto corriente arriba como también corriente debajo de la secuencia de genes, eventualmente a una cierta distancia. Un sitio de poliadenilación está unido funcionalmente con una secuencia de genes, cuando la misma está posicionada en el extremo 3' de la secuencia de genes de tal modo que la transcripción se realiza a través de la secuencia codificadora hasta la señal de poliadenilación. La unión se puede realizar según métodos recombinantes usuales, por ej., por medio de la técnica de PCR, por ligadura a sitios de corte de restricción adecuados o por medio de corte y empalme. Cuando no se encuentran sitios de corte de restricción, se pueden usar de manera conocida ligadores de oligonucleótidos sintéticos o adaptadores. En una de las formas de realización descritas están unidos entre sí funcionalmente el promotor heterólogo, preferentemente un promotor de ubiquitina/S27a o promotor de CMV, el gen de interés y el gen codificador para una proteína fluorescente. Esto significa, por ej., que tanto el gen de interés como también el gen codificador para una proteína fluorescente son expresados por el mismo promotor heterólogo. En una forma de realización especialmente preferida se realiza la unión funcional a través de un elemento IRES, de modo que de ambos genes se sintetiza un mARN bicistrónico. El vector de expresión de acuerdo con la invención puede contener además elementos potenciadotes y/o elementos TE, que actúan funcionalmente sobre uno o más promotores. Se prefiere especialmente un vector de expresión, en el cual están unidos el promotor heterólogo, preferentemente el promotor de ubiquitina/S27a y/o una forma modificada del mismo o el promotor de CMV, con un elemento potenciador, por ej., un potenciador de SV40 o un elemento potenciador de CMV así como también un elemento TE. Básicamente se puede realizar la expresión de los genes dentro de un vector de expresión a partir de una o más unidades de transcripción. Como "unidad de transcripción" se define una región, que contiene uno o más genes a transcribir. Para ello los genes dentro de una unidad de transcripción están unidos funcionalmente de tal modo entre sí que todos los genes dentro de una unidad de este tipo se encuentra bajo el control transcripcional del mismo promotor, promotor/potenciador o promotor/ potenciador/elemento TE. Como resultado de esta unión transcripcional de genes se puede transcribir y por lo tanto expresar más de una proteína o producto de una unidad de transcripción. Cada unidad de transcripción contiene elementos reguladores que son necesarios para la transcripción y la traducción de las secuencias de genes contenidas en los mismos. Cada unidad de transcripción puede contener los mismos o diferentes elementos reguladores. Para la unión funcional de los genes dentro de una unidad de transcripción se pueden usar elementos IRES o intrones. El vector de expresión puede contener una sola unidad de transcripción para la expresión del gen (o también genes) de interés, del marcador de selección y eventualmente del gen, que codifica la proteína de fluorescencia. Alternativamente estos genes pueden estar ordenados también en dos o más unidades de transcripción. Para ello son posibles diversas combinaciones de genes dentro de una unidad de transcripción. En otra forma de realización de la presente invención se puede introducir más de un vector de expresión compuesto por una, dos o más unidades de transcripción, en una célula huésped por medio de cotransfección o en transfección subsiguiente en cualquier orden. Se puede elegir cualquier combinación de elementos reguladores y genes en cada vector, en tanto esté garantizada una expresión suficiente de las unidades de transcripción. Si fuera necesario se pueden posicionar en los vectores de expresión otros elementos reguladores, como por ejemplo, elementos TE y genes, como por ej., genes adicionales de interés o marcadores de selección. También son de acuerdo con la invención aquellos vectores de expresión que contienen uno o más elementos TE, y que presentan en lugar del gen de interés solamente un sitio de clonación múltiple, que posibilita la clonación del gen de interés a través de secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción. En el estado de la técnica se conocen numerosas secuencias de reconocimiento para las diversas endonucleasas de restricción, así como también las endonucleasas de restricción correspondientes. Preferentemente se usan secuencias que están compuestas por al menos 6 nucleótidos como secuencia de reconocimiento. Una lista de secuencias de reconocimiento adecuadas se encuentra por ejemplo, en Sambrook et al., (1989). También son de acuerdo con la invención aquellos vectores de expresión que en lugar del gen de interés presentan solamente un sitio de clonación múltiple, que posibilita la clonación del gen de interés a través de secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción y que además presentan uno o más, preferentemente múltiples sitios de clonación en diversas posiciones del vector de expresión, que posibilitan además la clonación de elementos TE a través de secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción. En el estado de la técnica se conocen numerosas secuencias de reconocimiento para las diversas endonucleasas de restricción, así como también las endonucleasas de restricción correspondientes. Preferentemente se usan secuencias que están compuestas por al menos 6 nucleótidos como secuencia de reconocimiento. Una lista de secuencias de reconocimiento adecuadas se encuentra por ejemplo, en Sambrook et al., (1989). Células huésped: Para la transfección con el vector de expresión de acuerdo con la invención se usan células huésped eucarióticas, preferentemente células de mamíferos y especialmente células de roedores, como por ej., líneas celulares de ratones, ratas y hámsteres. La transfección exitosa de las células correspondientes con un vector de expresión de acuerdo con la invención da por resultado células transformadas, modificadas genéticamente, recombinantes o transgénicas, las que también son objeto de la presente invención. Células huésped en el marco de la invención son células de hámster, como por ej., células BHK21 , BHK TK-, CHO, CHO-K1 , CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 y CHO-DG44 o derivados/ descendientes de estas líneas celulares. Se prefieren especialmente las células CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 y BHK21 , especialmente las células CHO-DG44 y CHO-DUKX. También son adecuadas las células de mieloma del ratón, preferentemente células NSO y Sp2/0, así como también derivados/descendientes de estas líneas celulares. Ejemplos de células de hámster y ratón, que se pueden usar de acuerdo con la invención, se indican en la siguiente Tabla 1. Pero también se pueden usar para la producción de proteínas para productos biofarmacéuticos derivados y descendientes de estas células, otras células de mamíferos, inclusive, pero no limitado a, líneas celulares de ser humano, ratón, rata, monos, roedores, o células eucarioticas, inclusive, pero no limitado a, células de levaduras, insectos, pájaros y plantas. Tabla 1 : Líneas celulares de producción de hámsteres y ratones La transfeccion de las células huésped eucarióticas con un polinucleótido o un vector de expresión de acuerdo con la invención se realiza según métodos usuales (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Métodos de transfeccion adecuados son, ore j., la transfeccion mediada por liposomas, coprecipitación de fosfato de calcio, electroporacion, transfeccion mediada por policationes (por ej., DEAE-dextrano), fusión de protoplastos, microinyección e infecciones virales. De acuerdo con la invención se realiza preferentemente una transfección estable, en donde los constructos son integrados en el genoma de la célula huésped o un cromosoma artificial/minicromosoma o están contenidos de manera estable episomal en la célula huésped. Se prefiere el método de transfección que posibilita la frecuencia de transfección óptima y la expresión del gen heterólogo en la célula huésped correspondiente. Por definición, cada secuencia o cada gen, que es introducido en la célula huésped, es denominado con respecto a la célula huésped "secuencia heteróloga" o "gen heterólogo". Aún cuando la secuencia a introducir o el gen a introducir sea idéntico a una secuencia endógena o a un gen endógeno de la célula huésped. Por ejemplo, un gen de actina de hámster, que es introducido en una célula huésped de hámster, es por definición un gen heterólogo. Son de acuerdo con la invención especialmente las células recombinantes de mamíferos, preferentemente células de roedores, más preferentemente células de hámster, como por ej., células CHO o BHK, que fueron transfectadas con uno de los vectores de expresión de acuerdo con la invención aquí descritas. En la preparación recombinante de proteínas heterómeras, como por ej., anticuerpos monoclonales (mAk), se puede realizar la transfección de células huésped adecuadas en principio de tres maneras diferentes. Tales mAk están formados por varias subunidades, las cadenas pesadas y livianas. Los genes codificadores para estas subunidades pueden ser introducidos en unidades de transcripción independientes o multicistrónicas en un solo plásmido, con el cual luego se transfecta la célula huésped. Esto tiene por objeto asegurar la representación estequiométrica de los genes después de la integración en el genoma de la célula huésped. Por supuesto se debe garantizar aquí en caso de unidades de transcripción independientes, que los mARNs, que codifican para las diversas proteínas, presenten la misma estabilidad, eficiencia de transcripción y de traducción. En el segundo caso, la expresión de los enes se realiza dentro de una unidad de transcripción multicistrónica por medio de un único promotor y se obtiene sólo un transcripto. Usando elementos IRES se posibilita una iniciación de traducción interna muy eficiente de los genes en el segundo y en los siguientes cistrones. Sin embargo, las tasas de expresión para estos cistrones son más reducidas que las del primer cistrón, cuya iniciación de traducción a través de un así llamado complejo de pre-iniciación dependiente de "cap" es sustancialmente más eficiente que la iniciación de traducción dependiente de IRES. Para obtener una expresión realmente equimolar del cistrón se pueden introducir por ejemplo todavía elementos cistrónicos adicionales, los cuales actuando junto con los elementos IRES logran tasas de expresión uniformes (documento WO 94/05785). Otra posibilidad de acuerdo con la invención de la preparación de varias proteínas heterologas es la transfeccion secuencial en la que los genes son transfectados, separados en el tiempo, de forma integrada en diferentes vectores de expresión. Por ejemplo, la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo se pueden incorporar en una célula en dos etapas de transfeccion. Otra posibilidad, y preferida de acuerdo con la invención, de la preparación simultánea de varias proteínas heterologas es la cotransfección, en la cual los genes son integrados en diversos vectores de expresión separadamente. Esto tiene la. ventaja de que determinadas relaciones de los genes y productos de genes pueden ser ajustados entre sí, por medio de los cual se pueden equilibrar diferencias en la estabilidad del mARN así como también en la eficiencia de transcripción y traducción. Además, los vectores de expresión son más estables por su tamaño reducido y se pueden manipular más fácilmente tanto en la clonación como también en la transfección. En una forma de realización especial de la invención, las células huésped son por lo tanto transfectadas, preferentemente cotransfectadas, con uno o más vectores con genes que codifican para una o más de otras proteínas de interés. El o los otros vectores usados para la cotransfeccíón codifican, por ej., para la o las otras proteínas de interés bajo el control del mismo promotor, preferentemente bajo el control de la misma combinación promotor/potenciador o más preferentemente bajo el control de la misma combinación de promotor/potenciador/elemento TE o también bajo el control de la misma combinación de promotor/potenciador con diferentes elementos TE así como también para por lo menos un marcador de selección, por ej., la dihidrofolato-reductasa. En otra forma de realización de la invención, los vectores usados para la transfección pueden contener uno o más elementos TE en cualquier combinación, posición y orientación. En otra forma de realización preferida de la invención se cotransfectan las células huésped con por lo menos dos vectores de expresión eucarióticos, en donde por lo menos uno de los dos vectores contiene por lo menos un gen que codifica por lo menos una proteína de interés, y el otro vector contiene uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en cualquier combinación, posición y orientación, y opcionalmente también codifica para por lo menos un gen de interés, y estos ácidos nucleicos de acuerdo con la invención transmiten su acción de aumento de la transcripción y/o expresión a los genes de interés que están localizados en el otro vector cotransfectado, a través de la cointegración con el otro vector. De acuerdo con la invención, las células huésped son establecidas, adaptadas y cultivadas bajo condiciones libres de suero, eventualmente en medios que están libres de proteínas/péptidos animales. Ejemplos de los medios que se obtienen en el comercio son Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI- 1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM; Sigma), Minimal Essential Médium (MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's Médium (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.), CHO-S-SFMII (Invitrogen), medio CHO libre de suero (Sigma) y medio CHO libre de proteína (Sigma). Cada uno de estos medios puede ser completado eventualmente con diversos compuestos, por ej., hormonas y/u otros factores de crecimiento (por ej., insulina, transferían, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento parecido a la insulina), sales (por ej., cloruro de sodio, calcio, magnesio, fosfato), búferes (por ej., HEPES), nucleósidos (por ej., adenosina, timidita), glutamina, glucosa u otras sustancias nutritivas equivalentes, antibióticos y/o oligoelementos. Si bien se prefieren de acuerdo con la invención medios libres de suero, se pueden usar también medios para el cultivo de las células huésped que fueron mezclados con una cantidad adecuada de suero. Para la selección de células modificadas genéticamente, que expresan uno o más genes marcadores de selección, se agregan al medio uno o más medios de selección adecuados. Como "medio de selección" se denota una sustancia que influye sobre el crecimiento o la supervivencia de células huésped con una deficiencia para el gen marcador de selección. En el marco de la presente invención se usa preferentemente geneticina (G418) como agregado de medio para la selección de células huésped heterólogas, que llevan un gen de tipo salvaje o preferentemente un gen de neomicina-fosfotransferasa modificado. Preferentemente, se usan concentraciones de G418 entre 100 y 800 pg/ml de medio, más preferentemente son 200 a 400 pg de G418/ml de medio. Si las células huésped tuvieran que ser transfectadas con varios vectores de expresión, por ej., cuando separadamente varios genes de interés tienen que ser introducidos en la célula huésped, estas disponen generalmente de varios genes marcadores de selección. Un "gen marcador de selección" es un gen que posibilita la selección específica de células que contienen este gen por medio de la adición de un medio de selección correspondiente en el medio de cultivo. Como aclaración, un gen de resistencia a los antibióticos puede ser usado como marcador de selección positivo. Sólo células que fueron transformadas con este gen pueden crecer en presencia del antibiótico correspondiente y por lo tanto ser seleccionadas. Las células no transformadas en cambio no pueden crecer o sobrevivir bajo estas condiciones de selección. Hay marcadores de selección positivos, negativos y bifuncionales. Los marcadores de selección positivos posibilitan la selección y con ello el enriquecimiento de células transformadas por medio de la transmisión de una resistencia con respecto al medio de selección o por compensación de un defecto metabólico o catabólico de la célula huésped. Por el contrario, por marcadores de selección negativos se pueden eliminar selectivamente células que obtuvieron el gen para el marcador de selección. Un ejemplo de ello es el gen de la timidinaquinasa del virus del herpes simple, cuya expresión en células con la administración simultánea de Acyclovir o Gancyclovir conduce a su eliminación. Los marcadores de selección usados en esta invención, inclusive el marcador de selección amplificable, incluye mutantes y variantes modificados biotecnológicamente, fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones con otras proteínas o péptidos, en tanto el marcador de selección mantenga sus propiedades selectivas. Tales derivados presentan una notable homología en la secuencia de aminoácidos en las zonas o dominios, a los cuales se les adjudica la propiedad selectiva. En la literatura se describen una multiplicidad de genes marcadores de selección, inclusive marcadores bifuncionales (positivos/ negativos) (ver, por ej., los documentos WO 92/08796 y WO 94/28143). Ejemplos de marcadores de selección que son usados comúnmente en células eucarióticas, contienen el gen para aminoglicósido-fosfotransferasa (APH), higromicina-fosfotransferasa (HYG), dihidrofolato-reductasa (DHFR), timidinaquinasa (TK), glutamina-sintetasa, asparagina-sintetasa y genes que transmiten resistencia con respecto a neomicina (G418), puromicina, histidinol D, bleomicina, fleomicina y zeocina. Bajo "neomicina-fosfotransferasa modificada (NPT)" están comprendidos todos los mutantes descritos en WO 2004/050884, especialmente el muíante D227G (Asp227Gly), que se caracteriza por el intercambio ácido aspártico (Asp, D) contra glicina (Gly, G) en la posición de aminoácidos 227 y más preferentemente el mutante F240I (Phe240lle) que se caracteriza por el intercambio de fenilalanina (Phe, f) contra isoleucina (lie I) en la posición de aminoácidos 240. La presente invención incluye por lo tanto un método para la preparación y selección de células recombinantes de mamíferos, que contiene los siguientes pasos: (i) transfección de las células huésped con genes que codifican por lo menos para una proteína/un producto de interés y una neomicina- fosfotransferasa, preferentemente modificada, en donde por lo menos el gen (o genes) de interés está unido funcionalmente con por lo menos un elemento TE para aumentar la transcripción y/o expresión; (ii) cultivo de las células bajo condiciones que posibilitan una expresión de los diversos genes; y (iii) la selección de estos genes co-integrados por medio del cultivo de células en presencia de un agente de selección, como por ej., G418. Preferentemente se cultivan las células transfectadas aquí en un medio en ausencia de suero. Preferentemente la concentración de G418 es de por lo menos 200 pg/ml. La concentración puede ser también de por lo menos 400 pg/ml. Gen marcador de selección amplificable: Además las células de acuerdo con la invención pueden opcionalmente ser sometidas también a pasos de amplificación de genes, cultivándolas en presencia de un medio de selección, que lleva a una amplificación de un gen marcador de selección amplificable. La condición es que las células huésped sean transfectadas adicionalmente con un gen que codifica para un marcador de selección amplificable. Es posible que el gen, que codifica para un marcador de selección amplificable, esté presente en uno de los vectores de expresión de acuerdo con la invención o que sea introducido en la célula huésped con ayuda de otro vector. El gen marcador de selección amplificable codifica comúnmente para una enzima que se requiere para el crecimiento de células eucarióticas bajo determinadas condiciones de cultivo. Por ejemplo, el gen marcador de selección amplificable puede codificar para la dihidrofolato-reductasa (DHFR). En este caso se amplifica el gen cuando se cultiva una célula huésped transfectada con el mismo en presencia del agente de selección metotrexato (MTX). En la siguiente Tabla 2 se indican ejemplos de otros genes marcadores de selección amplificables que se pueden usar de acuerdo con la invención y los medios de selección correspondientes, que se describen en un panorama en Kaufman, Methods in Enzymology, 185, 537-566 (1990). Tabla 2: Genes marcadores de selección amplificables Como gen marcador de selección amplificable se prefiere de acuerdo con la invención un gen que codifica para un polipéptido con la función de DHFR, por ej., para DHFR o una proteína de fusión de la proteína fluorescente y DHFR. La DHFR es necesaria para la biosíntesis de purinas. Las células en las cuales no está el gen de la DHFR no pueden crecer en medio deficiente en purina. El gen de DHFR es por lo tanto un marcador de selección útil para la selección y amplificación de genes en células que son cultivadas en medio libres de purina. El agente de selección, que se usa junto con el gen de DHFR es Metotrexato (MTX). Las células de mamíferos, preferentemente células de mieloma de ratón y de hámster son células huésped preferidas para el uso de DHFR como marcador de selección amplificable. Se prefieren especialmente las líneas celulares CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) y CHO-DG44 (Urlaub y col., 1983), ya que debido a la mutación no presentan actividad DHFR propia. Para poder aplicar la amplificación condicionada por DHFR también en otros tipos de células que disponen de una actividad DHFR endógena propia, se puede usar en la transfección un gen de DHFR mutado, que codifica para una proteína con una sensibilidad reducida con respecto a metotrexato (Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982). El marcador DHFR cuando se usan células base DHFR-negativas como CHO-DG44 o CHO-DUKX, es especialmente adecuado para la selección y la amplificación subsiguiente, ya que estas células no expresan una DHFR endógena y por lo tanto no crecen en medio libres de purina. Por lo tanto se puede usar aquí el gen de DHFR como marcador de selección dominante y las células transformadas son seleccionadas en medio libres de hipoxantina/timidina. La presente invención incluye por lo tanto un método para la preparación y selección de células recombinantes de mamíferos, que contiene los siguientes pasos: (i) Transfección de las células huésped con genes que codifican por lo menos para una proteína/un producto de interés y el marcador de selección amplificable DHFR, en donde por lo menos el gen (o genes) de interés está(n) unido(s) funcionalmente con por lo menos un elemento TE para aumentar la transcripción y/o expresión; (ii) cultivo de las células bajo condiciones que posibilitan una expresión de los diversos genes; y (iii) la amplificación de estos genes co-integrados por medio del cultivo de células en presencia de un agente de selección, que permite la amplificación de por lo menos el gen marcador de selección amplificable, como por ej., metotrexato. Preferentemente las células transfectadas son cultivadas en medio libres de hipoxantina/timidita en ausencia de suero y con adición de concentraciones crecientes de MTX. Preferentemente la concentración de MTX en el primer paso de amplificación es de por lo menos 100 nM. La concentración de MTX también puede ser de por lo menos 250 nM y puede ser aumentada escalonadamente hasta 1 µ?. En el caso individual también se puede usar una concentración de más de 1 µ?, por ej., 2 µ?. La presente invención incluye también un método para la preparación y selección de células recombinantes de mamíferos, que contiene los siguientes pasos: (i) Transfección de las células huésped con genes que codifican por lo menos para una proteína/un producto de interés, una neomicina- fosfotransferasa, preferentemente modificada, y el marcador de selección amplificable DHFR, en donde por lo menos el gen (o genes) de interés está(n) unido(s) funcionalmente con por lo menos un elemento TE para aumentar la transcripción y/o expresión; (ii) cultivo de las células bajo condiciones que posibilitan una expresión de los diversos genes; (iii) la selección de estos genes co-integrados por medio del cultivo de las células en presencia de un agente de selección, como por ej., G418, en medio libre de hipoxantina/timidina; y (iv) la amplificación de estos genes co-integrados por medio del cultivo de las células en presencia de un agente de selección que permite la amplificación de por lo menos el gen marcador de selección amplificable, como por ej., metotrexato. Preferentemente se cultivan las células transfectadas aquí en medio libre de hipoxantina/timidina, suplementado con por lo menos 200 pg/ml de 418, preferentemente 400 pg/ml o también más G418, eh ausencia de suero y con la adición de concentraciones crecientes de MTX. Preferentemente la concentración de MTX en el primer paso de amplificación es de por lo menos 100 nM. La concentración de MTX también puede ser de por lo menos 250 nM y puede ser aumentada escalonadamente hasta 1 µ?. En el caso individual también se puede usar una concentración de más de 1 µ?, por ej., 2 µ?. Una selección de células transfectadas también es posible por medio de separación de células activada por fluorescencia (FACS). Para ello se usan por ejemplo, ß-galactosidasa bacteriana, marcadores de la superficie de las células o proteínas fluorescentes (por ej., proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes de Aequorea victoria y Renilla reniformes u otras especies; proteína fluorescente roja y proteínas fluorescentes en otros colores y sus variantes de organismos no bioluminiscentes, como por ej., Discosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp., Aequorea coerulescens para la selección de células transformadas. Expresión génica y selección de células huésped de alta producción: El término "expresión génica" se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de genes heteróloga en una célula huésped. La tasa de expresión se puede determinar en general aquí o bien en base a la cantidad del mARN correspondiente que se encuentra presente en la célula huésped o en base a la cantidad producida de producto de gen, que es codificada por el gen de interés. La cantidad de mARN producida mediante la transcripción de una secuencia de nucleótidos elegida puede ser determinada, por ejemplo, por hibridación Northern Blot, protección de ribonucleasa-ARN, hibridación in situ de ARN celular o por métodos de PCR (por ej., PCR cuantitativa) (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Las proteínas que son codificadas por una secuencia de nucleótidos seleccionada también pueden ser determinadas por diversos métodos, como por ej., por ELISA, HPLC de proteínas A, Western blot, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, determinación de la actividad biológica de la proteína, inmunocoloración de la proteína con análisis FACS subsiguiente o microscopía de fluorescencia, detección directa de una proteína fluorescente por medio de análisis FACS o por microscopía de fluorescencia (Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Estos métodos posibilitan, por ejemplo, la investigación con respecto a si el elemento TE de acuerdo a la invención de la SEQ ID N° 1 o una parte cualquiera, fragmento o zona de la misma o sus derivados o combinaciones de estos llevan a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés. Con "aumento de la expresión, transcripción o productividad" se denota el aumento de la expresión o síntesis de una secuencia heteróloga introducida en una célula huésped, por ejemplo, de un gen que codifica para una proteína terapéutica, en comparación con un control. Hay un aumento de expresión, transcripción o productividad cuando una célula de acuerdo con la invención es cultivada de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con la invención aquí descrito y cuando esta célula presenta por lo menos un aumento de la productividad específica de 1.3 veces o de 1.5 veces o, preferentemente, una duplicación de la productividad específica. También hay un aumento de expresión, transcripción o productividad cuando la célula de acuerdo con la invención presenta una triplicación de la productividad específica. También hay especialmente un aumento de la expresión, transcripción o productividad cuando la célula de acuerdo con la invención presenta por lo menos una cuadruplicación de la productividad específica. Hay un aumento de la expresión, transcripción o productividad especialmente cuando la célula de acuerdo con la invención presenta por lo menos una quintuplicación de la productividad específica. Un aumento de la expresión, transcripción o productividad existe también especialmente cuando la célula de acuerdo con la invención presenta por lo menos una sextuplicación de la productividad específica. Hay un aumento especial de la expresión, transcripción o productividad cuando la célula de acuerdo con la invención presenta por lo menos una septuplicación de la productividad específica. Un aumento de la expresión, transcripción o productividad puede obtenerse tanto usando uno de los vectores de expresión de acuerdo con la invención como también mediante la aplicación de un procedimiento de acuerdo con la invención. Los procedimientos correspondientes pueden ser combinados con una selección basada en FACS de células huésped recombinantes que contienen como marcador de selección adicional por ejemplo, una o más proteínas de fluorescencia (por ej., GFP) o un marcador de superficie celular. Otros métodos para obtener una expresión aumentada, en donde también es posible una combinación de diversos métodos, se basan, por ejemplo, en el uso de elementos cis-activos para la manipulación de la estructura de cromatina (por ej., LCR, UCOE, EASE, aisladores, S/MARs, elementos STAR), uso de factores de transcripción (artificial), tratamiento de las células con agentes naturales o sintéticos para la regulación hacia arriba de la expresión endógena o heteróloga de genes, mejoramiento de la estabilidad (tiempo de vida media) del mARN o de la proteína, mejoramiento de la iniciación de traducción del mARN, aumento de la dosis de gen mediante el uso de plásmidos episomales (que se basa en el uso de secuencias virales como origen de replicación, por ej., de SV40, polioma, adenovirus, EBV o PBV), uso de secuencias que promueven la amplificación (Hemann et al., 1994) o en sistemas de amplificación in Vitro que se basan en concatémeros de ADN (Monaco et al., 1996). En otra forma de realización, la presente invención se refiere por lo tanto también a procedimientos para la obtención y la selección de células recombinantes de mamíferos, que expresan por lo menos un gen heterólogo de interés y que están caracterizados porque (i) se transfectan células recombinantes de mamíferos con un vector de expresión de acuerdo con la invención así como también el gen para un gen marcador de selección amplificable; (ii) se cultivan las células de mamíferos bajo condiciones que posibilitan una expresión del(de los) gen(es) de interés, del gen de neomicina-fosfotransferasa modificado; (iii) se cultivan las células de mamíferos en presencia de por lo menos un agente de selección, el cual actúa selectivamente sobre el crecimiento de células de mamíferos y prefiere aquellas células en el crecimiento que expresan el gen de neomicina-fosfotransferasa; (iv) se seleccionan las células de mamíferos por medio de análisis flujocitométrico que muestran una alta expresión de la proteína fluorescente; (v) se cultivan las células seleccionadas bajo condiciones bajo las cuales se expresa el gen marcador de selección amplificable; y (vi) se agrega al medio de cultivo un agente de selección que tiene como consecuencia la amplificación del gen marcador de selección amplificable. También es de acuerdo con la invención un procedimiento mediante el cual se reproducen las células de producción y se usan para la preparación del producto de gen de interés codificador. Para ello se cultivan las células de alta producción seleccionadas preferentemente en un medio de cultivo libre de suero y preferentemente en cultivo de suspensión bajo condiciones que permiten una expresión del gen de interés. La proteína/el producto de interés se obtiene así preferentemente como producto de gen segregado a partir del medio de cultivo de células. En la expresión de la proteína sin señal de secreción se puede aislar también el producto de gen a partir de lisados de células. Para obtener un producto puro, homogéneo, que se encuentra esencialmente libre de otras proteínas recombinantes y proteínas de células huésped se realizan pasos de purificación usuales. Para ello se retiran frecuentemente células y detritos celulares del medio de cultivo o lisado. El producto de gen deseado puede ser liberado luego de proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos solubles contaminantes, por ej., por fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad y de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC de fases inversas o cromatografía en Sephadex, sílice o resinas de intercambio de cationes como DEAE. Los métodos que llevan a una purificación de una proteína heteróloga expresada por células huésped recombinantes son conocidos por el experto y se describieron en la literatura, por ej., en Harris et al., (1995) y Scopes (1988). COMPOSICIONES DE ACUERDO CON LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID N° 15) o un fragmento de TE-13 (SEQ ID N° 15) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-13 (SEQ ID N° 15) y/o un fragmento del mismo o sus secuencias de nucleótidos complementarias y que lleva en la integración cromosómica a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés en un sistema de expresión. La presente invención se refiere a un ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID N° 15) o un fragmento de TE-13 (SEQ ID N° 15) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-13 (SEQ ID N° 15) y/o un fragmento del mismo o sus secuencias de nucleótidos complementarias y que lleva en la integración cromosómica a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés en un sistema de expresión, con la condición de que el fragmento o el derivado comprenda por lo menos una zona de secuencia de la zona de ácidos nucleicos entre 1 pb y 1578 pb (con referencia a la SEQ ID N° 01 ). En este caso, con una zona de secuencias se quiere dar a entender una zona de ácidos nucleicos de por lo menos 10 pb, 15 pb, 20 pb, 50 pb, 100 pb. La presente invención se refiere a un ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID N° 15) o un fragmento de TE-13 (SEQ ID N° 15) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-13 (SEQ ID N° 15) y/o un fragmento del mismo o sus secuencias de nucleótidos complementarias y que lleva en la integración cromosómica a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés en un sistema de expresión, con la condición de que el fragmento o derivado comprenda por lo menos una zona de secuencias de TE-09 (SEQ ID N° 11 ) o TE-08 (SEQ ID N° 11 ) o TE-13 (SEQ ID N° 15). También en este caso, con una zona de secuencias se quiere dar a entender una zona de ácidos nucleicos de por lo menos 10 pb, 15 pb, 20 pb, 50 pb, 100 pb. El aumento de expresión del gen de interés se puede determinar, por ejemplo, por medición del título de producto por medio de ELISA. La invención se refiere en una forma de realización preferida a un ácido nucleico que contiene TE-08 (SEQ ID N° 10) o un fragmento de TE-08 (SEQ ID N° 10) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-08 (SEQ ID N° 10) y/o un fragmento del mismo o sus secuencias complementarias y que en la integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés en un sistema de expresión. En una forma de realización preferida del ácido nucleico de acuerdo con la invención arriba mencionado existe la condición de que el fragmento o derivado comprenda por lo menos una zona de secuencias de la zona de ácidos nucleicos entre 1 pb y 1578 pb (con referencia a la SEQ ID N° 01). En una forma de realización especialmente preferida del ácido nucleico de acuerdo con la invención arriba mencionado, existe la condición de que el fragmento o derivado comprenda por lo menos una zona de secuencias de TE-09 (SEQ ID N° 11 ) o TE-08 (SEQ ID N° 11 ) o TE-13 (SEQ ID N° 15). En este caso, con una zona de secuencias se quiere dar a entender una zona de ácidos nucleicos de por lo menos 10 pb, 15 pb, 20 pb, 50 pb, 100 pb. La invención se refiere en otra forma de realización preferida a un ácido nucleico que contiene la SEQ ID N° 1 o un fragmento de SEQ ID N° 1 o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de la SEQ ID N° 1 y/o un fragmento del mismo o sus secuencias complementarias y que en la integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés en un sistema de expresión. En una forma de realización preferida del ácido nucleico de acuerdo con la invención arriba mencionado existe la condición de que el fragmento o derivado comprenda por lo menos una zona de secuencias de la zona de ácidos nucleicos entre 1 pb y 1578 pb (con referencia a la SEQ ID N° 01). En una forma de realización especialmente preferida del ácido nucleico de acuerdo con la invención arriba mencionado, existe la condición de que el fragmento o derivado comprenda por lo menos una zona de secuencias de TE-09 (SEQ ID N° 11 ) o TE-08 (SEQ ID N° 11 ) o TE-13 (SEQ ID N° 15). En este caso, con una zona de secuencias se quiere dar a entender una zona de ácidos nucleicos de por lo menos 10 pb, 15 pb, 20 pb, 50 pb, 100 pb. .

La presente invención se refiere además a un ácido nucleico (= elemento TE) para el aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés con la SEQ ID N° 1 o un fragmento o derivado del mismo o sus secuencias de nucleótidos complementarias, que lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés. El aumento de expresión del gen de interés se puede determinar, por ejemplo, mediante la medición del título del producto por medio de ELISA. La presente invención se refiere especialmente a un ácido nucleico de acuerdo con la invención que se híbrida bajo condiciones severas (a) con el sector de la secuencia de ácido nucleico TE-13 (SEQ ID N° 15) o bien TE-08 (SEQ ID N° 10) o (b) sus secuencias de ácido nucleico complementarias o (c) una secuencia de ácido nucleico que presenta al menos aproximadamente el 70% de identidad de secuencia, preferentemente al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia o al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia, con preferencia especial al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia y con máxima preferencia al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con (a) o (b). En una forma de realización especial, el ácido nucleico de acuerdo con la invención presenta una longitud de por lo menos 511 pb (=longitud TE-13, SEQ ID N° 15) y/o por lo menos 1015 pb (= longitud TE-08, SEQ ID N° 10). La presente invención se refiere en una forma de realización preferida al fragmento 5' del elemento TE TE-00 (SEQ ID N° 2). Esto corresponde a la zona parcial de la SEQ ID N° 1 entre 1 pb y 1578 pb o su secuencia de nucleótidos complementaria.

La presente invención se refiere especialmente a un ácido nucleico y/o un elemento de ácido nucleico que aumenta la transcripción y/o aumenta la expresión (elemento TE) que contiene TE-13 (SEQ ID N° 15) y/o TE-08 (SEQ ID N° 10) o un derivado del mismo o sus secuencias de nucleotidos complementarias que en la integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés. La presente invención se refiere preferentemente a un ácido nucleico aislado y/o una molécula de ácidos nucleicos aislada y/o una secuencia de ácidos nucleicos aislada y/o un elemento de ácido nucleico que aumenta la transcripción aislado y/o un elemento TE aislado. La presente invención se refiere especialmente a un ácido nucleico aislado que contiene TE-08 (SEQ ID N° 10) o su secuencia de ácidos nucleotidos complementaria y que en la integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés en un sistema de expresión. En una forma de realización el ácido nucleico y/o el elemento de ácido nucleico que aumenta la transcripción y/o el ácido nucleico aislado, contiene un derivado de un elemento TE y/o de la SEQ ID N° 1 que presenta por lo menos aprox. 70% de identidad de secuencias, preferentemente por lo menos aprox. 80% de identidad de secuencias, más preferentemente por lo menos aprox. 90% de identidad de secuencias y más preferentemente aún por lo menos aprox. 95% de identidad de secuencias con la zona parcial correspondiente de la secuencia del elemento TE y/o su secuencia complementaria, especialmente con la zona de secuencias entre la posición de nucleotidos de 1 pb y 1578 pb con respecto a la SEQ ID N° 1 , lo que corresponde a la zona de secuencias 5' de la secuencia TE-00 y más preferentemente con TE-13 (SEQ ID N° 15) y/o TE-08 (SEQ ID N° 10). En una forma de realización preferida, el ácido nucleico y/o el elemento de ácido nucleico que aumenta la transcripción y/o el ácido nucleico aislado, contiene un derivado de un ácido nucleico TE-08 (SEQ ID N° 10) o preferentemente un ácido nucleico (SEQ ID N° 15) que presenta por lo menos aprox. 70% de identidad de secuencias, preferentemente por lo menos aprox. 80% de identidad de secuencias o por lo menos aprox. 85% de identidad de secuencias, más preferentemente por lo menos aprox. 90% de identidad de secuencias y más preferentemente aún por lo menos aprox. 95% de identidad de secuencias con la zona parcial correspondiente de la secuencia del elemento TE y/o su secuencia complementaria. En otra forma de realización, la invención se refiere a un ácido nucleico y/o un elemento de ácido nucleico que aumenta la transcripción y/o un ácido nucleico aislado y/o un derivado de un elemento TE que se híbrida con la secuencia de un elemento TE o con la secuencia complementaria de un elemento TE, especialmente con la zona de secuencias entre la posición de nucleótidos de 1 pb y 1578 pb con respecto a la SEQ ID N° 1 , lo que corresponde a la zona de secuencias 5' de la secuencia TE-00 (SEQ ID N° 2) o especialmente con el elemento TE-08 (SEQ ID N° 10). Preferentemente la hibridación se realiza bajo condiciones de hibridación y lavado severas. En otra forma de realización preferida, el ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o el elemento que aumenta la transcripción (elemento TE) seleccionado entre el grupo compuesto por: TE-00 (SEQ ID N° 2), TE-01 (SEQ ID N° 3), TE-02 (SEQ ID N° 4), TE-03 (SEQ ID N° 5), TE-04 (SEQ ID N° 6), TE-06 (SEQ ID N° 8), TE-07 (SEQ ID N° 9), TE-08 (SEQ ID N° 10), TE-10 (SEQ ID N° 12), TE-11 (SEQ ID N° 13), TE-12 (SEQ ID N° 14), TE-13 (SEQ ID N° 15), TE-14 (SEQ ID N° 16), TE-15 (SEQ ID N° 17), TE-16 (SEQ ID N° 18), TE-17 (SEQ ID N° 19), TE-18 (SEQ ID N° 20) y TE-21 (SEQ ID N° 21 ). En otra forma de realización, el ácido nucleico y/o el elemento que aumenta la transcripción (elemento TE) está caracterizado porque el ácido nucleico es TE-00 (SEQ ID N° 2), TE-06 (SEQ ID N° 8), TE-10 (SEQ ID N° 12), TE-11 (SEQ ID N° 13) o TE-12 (SEQ ID N° 14), preferentemente TE-06 (SEQ ID N° 8). En una forma de realización preferida, el ácido nucleico y/o el elemento que aumenta la transcripción (elemento TE) está caracterizado porque el ácido nucleico es TE-01 (SEQ ID N° 3), TE-02 (SEQ ID N° 4), TE-03 (SEQ ID N° 5), TE-07 (SEQ ID N° 9), TE-08 (SEQ ID N° 10). En una forma de realización especialmente preferida, el ácido nucleico y/o el elemento que aumenta la transcripción (elemento TE) es TE-08 (SEQ ID N° 10). En una forma de realización especialmente preferida, el ácido nucleico y/o el elemento que aumenta la transcripción (elemento TE) es TE-18 (SEQ ID N° 20). En otra forma de realización, el ácido nucleico y/o el elemento que aumenta la transcripción (elemento TE) está caracterizado porque es un fragmento o derivado de TE-01 (SEQ ID N° 3), preferentemente TE-13 (SEQ ID N° 15), TE-14 (SEQ ID N° 16), TE-15 (SEQ ID N° 17), TE-16 (SEQ ID N° 18), TE-17 (SEQ ID N° 19), TE-18 (SEQ ID N° 20). En una forma de realización preferida, el ácido nucleico de acuerdo con la invención es TE-13 (SEQ ID N° 15).

En otra forma de realización, el ácido nucleico de acuerdo con la invención o el fragmento o el derivado es un ácido nucleico aislado. La presente invención se refiere además a un ácido nucleico de acuerdo con la invención, caracterizado porque el ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID N° 15) o TE-08 (SEQ ID N° 10) o TE-07 (SEQ ID N° 9) o TE-06 (SEQ ID N° 8) o un fragmento de estas secuencias o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de estas secuencias o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de estas secuencias y/o un derivado de fragmentos de estas secuencias, preferentemente TE-13 (SEQ ID N° 15) o TE-08 (SEQ ID N° 10) o un fragmento de estas secuencias o un derivado de estas secuencias y/o un derivado de fragmentos de estas secuencias o sus secuencias de nucleótidos complementarias, están unidas a una secuencia heteróloga. El ácido nucleico unido a una secuencia de gen heteróloga, en una forma de realización preferida, puede ser un vector de expresión, por ejemplo, plásmidos, bacteriófagos, fagémicos, cósmicos, vectores virales o también especialmente un vector "targeting". El ácido nucleico unido a una secuencia de gen heteróloga también puede ser otra molécula de ácidos nucleicos sintética, como por ej., cromosomas sintéticos, artificiales o mini-cromosomas. La presente invención se refiere además a un vector de expresión eucariótico, caracterizado porque este vector de expresión contiene uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y/o uno o más elementos de transcripción de acuerdo con la invención (elemento TE). En una forma de realización especial, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque contiene un promotor y/o un gen heterólogo de interés y/o un marcador de selección y/o opcionalmente un potenciador. La presente invención se refiere además a un vector de expresión eucariótico caracterizado porque este vector de expresión contiene uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la invención y/o uno o más elementos que aumentan la transcripción de acuerdo con la invención (elemento TE) y un promotor y/o un gen heterólogo de interés y/o un marcador de selección y/u opcionalmente un potenciador. En otra forma de realización, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque se trata de un vector "targeting" para la integración específica del gen de interés. En una forma de realización preferida, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque el promotor es un promotor heterólogo como el promotor temprano del virus de citomegalia humana (promotor CMV), el promotor temprano de SV40, el promotor principal tardío del adenovirus, el promotor de metalotionina-l del ratón, la región de repetición Terminal larga del virus del sarcoma de Rous, el o los promotores de actina, inmunoglobulina o del shock térmico, preferentemente el promotor de CMV. En otra forma de realización preferida, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque el promotor es un promotor heterólogo, preferentemente el promotor de ubiquitina/S27a, más preferentemente el promotor de ubiquitina/s27A del hámster. En una forma de realización especial, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque contiene una combinación de varios ácidos nucleicos y/o elementos TE de acuerdo con la invención, iguales o diferentes en cualquier orientación entre sí, en donde uno o más de los ácidos nucleicos y/o elementos TE están posicionados antes (es decir, 5') y/o uno o más ácidos nucleicos y/o elementos TE después (es decir, 3') del gen de interés. En una forma de realización preferida, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque los ácidos nucleicos y/o elementos TE combinados son TE-06 (SEQ ID N° 8) y más preferentemente TE-08 (SEQ ID N° 10). Combinaciones preferidas de ácidos nucleicos y/o elementos TE son un elemento TE-06 (SEQ ID N° 8) antes (es decir, 5') y un elemento TE-06 (SEQ ID N° 8) después (3') del gen de interés así como también tres elementos TE-06 (SEQ ID N° 8) después (es decir, 3') del gen de interés (ver al respecto también la Figura 13). En una forma de realización especialmente preferida, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque uno o más elementos TE-08-ácidos nucleicos y/o elementos (SEQ ID N° 10) están posicionados antes (es decir, 5') y uno o más después (es decir, 3') del gen de interés, preferentemente un elemento TE-08 (SEQ ID N° 10) antes y uno después (ver al respecto también la Figura 13). Otras combinaciones preferidas de ácidos nucleicos y/o elementos TE son 2 ácidos nucleicos/elementos TE-08 (SEQ ID N° 10) antes y/o después del gen de interés. En otra forma de realización, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque varios ácidos nucleicos y/o elementos TE-06 (SEQ ID N° 8) están posicionados después (3') del gen de interés, preferentemente 3 (ver Figura 13).

En una forma de realización preferida, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque una combinación de uno o más ácidos nucleicos y/o elementos TÉ-08 (SEQ ID N° 10) con uno o más ácidos nucleicos y/o elementos TE-06 (SEQ ID N° 8) están posicionados antes (es decir, 5') y/o después (es decir, 3') del gen de interés, se prefiere una combinación de un ácido nucleico y/o un elemento TE-08 (SEQ ID N° 10) seguido de un ácido nucleico y/o un elemento TE-06 (SEQ ID N° 8) antes (es decir, 5') del gen de interés (ver al respecto también la Figura 13). En otra forma de realización, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque uno o varios ácidos nucleicos y/o elementos TE-13 (SEQ ID N° 15) están posicionados delante (5') y/o después (3') del gen de interés. En una forma de realización preferida, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque contiene además una integrasa. En otra forma de realización preferida, las células huésped son cotransfectadas con por lo menos dos vectores de expresión eucarióticos, en donde por lo menos uno de los dos vectores contiene por lo menos un gen que codifica por lo menos una proteína de interés, y el otro vector contiene uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en cualquier combinación, posición y orientación, y opcionalmente también codifica para por lo menos un gen de interés, y estos ácidos nucleicos de acuerdo con la invención transmiten su efecto aumentador de la transcripción y/o de la expresión sobre los genes de interés, que están localizados sobre el otro vector cotransfectado, a través de la cointegración con el otro vector. En una forma de realización especial, el vector de expresión eucariótico está caracterizado porque el marcador de selección es DHFR o Neo, por ejemplo, Neo F240I. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de un vector de expresión eucariótico caracterizado por la integración de un ácido nucleico de acuerdo con la invención en un vector de expresión. La invención se refiere además a una célula huésped eucariótica caracterizada porque contiene un vector de expresión eucariótico de acuerdo con la invención. En una forma de realización especial, la célula huésped eucariótica está caracterizada porque tiene una alta producción, es decir, posee una mayor productividad específica que una célula huésped eucariótica comparable sin el elemento TE y/o el ácido nucleico de acuerdo con la invención, teniendo esta célula huésped un nivel de expresión aumentado dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o diez veces, o un nivel de expresión aumentado más de dos, más de tres, más de cuatro, más de cinco, más de siete, más de diez veces, se prefiere hasta cinco veces o más de tres veces. En una forma de realización especialmente preferida, la célula huésped eucariótica está caracterizada porque el vector de expresión está integrado en el genoma en forma estable. En otra forma de realización, la célula huésped eucariótica es una célula de hámster o ratón, como por ejemplo, una célula CHO, NSO, Sp2/0-Ag14, BHK21 , BHK TK-, HaK, 2254-62.2 (derivado BHK-21 ), CHO-K1 , CHO-DUKX (=CHO duk-, CHO/dhfr-), CHO-DUKX B1 , CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL, preferentemente una célula CHO y más preferentemente una célula CHO-DG44.

En otra forma de realización, la célula huésped eucariótica es una célula de mamífero, inclusive, pero no limitado a, líneas celulares de ser humano, ratón, rata, mono, roedores. En una forma de realización adicional, la célula huésped es una célula eucariótica inclusive, pero no limitado a, células de levaduras, insectos, pájaros y plantas. En otra forma de realización especial, la célula huésped eucariótica está caracterizada porque contiene además un gen anti-apoptosis, como BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1 , A1 , MCL-1 , BOO, BRAG-1 , NR-13, CDN-1 , CDN-2, CDN- 3, BHRF-1 , LMW5-HL o CED-9, preferentemente Bcl-xL o BCL-2, más preferentemente BCL-xL. La presente invención se refiere además a un procedimiento para el desarrollo de una línea celular eucariótica transfectada en forma estable, de alta producción, caracterizado por los siguientes pasos: (a) integración de por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento TE de acuerdo con la invención en un vector de expresión eucariótico que contiene un gen de interés, (b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión, (c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción. La presente invención se refiere además a un procedimiento para el desarrollo de una línea celular eucariótica transfectada en forma estable, de alta producción, caracterizado por los siguientes pasos: (a) integración de por lo menos un gen (genes) de interés en un vector de expresión eucariótico que contiene por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento TE de acuerdo con la invención, (b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión, (c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción. En una forma de realización especial, el procedimiento está caracterizado por al menos un paso de amplificación adicional. La presente invención se refiere además a un procedimiento para la preparación y selección de células recombinantes de mamíferos caracterizado por los siguientes pasos: (a) transfección de las células huésped con genes que por lo menos codifican una proteína/producto de interés, una neomicina-fosfotransferasa, preferentemente modificada, y el marcador de selección amplificable DHFR, en donde por lo menos el gen (o bien los genes) de interés está unido funcionalmente para el incremento de transcripción o bien expresión con por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14, (b) cultivo de las células en condiciones que permiten una expresión de los distintos genes, (c) la selección de estos genes cointegrados por cultivo de las células en presencia de un medio de selección como, por ejemplo, G418, en medio sin hipoxantina/timidina y (d) la amplificación de estos genes cointegrados por cultivo de las células en presencia de un medio de selección, que permite la amplificación de por lo menos el gen marcador de selección como, por ejemplo, metotrexato.

En una forma de realización especial, este procedimiento está caracterizado porque las células transfectadas son cultivadas en medio libres de ipoxantina/timidina, suplementado con por lo menos 200 pg/ml de G418, preferentemente 400 pg/ml o también más G418, en ausencia de suero y bajo adición de concentraciones crecientes de MTX. En otra forma de realización especial, este procedimiento está caracterizado porque la concentración de MTX en el primer paso de amplificación es de por lo menos 100 nM o por lo menos 250 nM y escalonadamente se puede aumentar hasta 1 µ? o más. En casos individuales, la concentración de MTX puede ser de 2 µ?. En otra forma de realización especial, el procedimiento está caracterizado por un paso de clonación adicional. En otra forma de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, la célula huésped es una célula de roedor/hámster, como por ejemplo, una célula de CHO, NS0, Sp2/0-Ag14, BHK21 , BHK TK-, HaK, 2254-62.2 (derivado BHK-21), CHO-K1 , CHO-DUKX (=CHO duk-, CHO/dhfr-), CHO-DUKX B1 , CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL, preferentemente una célula CHO y más preferentemente una célula CHO-DG44. En un procedimiento preferido de acuerdo con la invención, el vector de expresión contiene un marcador de selección como DHFR o NPT, por ejemplo, NPT F340I o NPT D227G. En una forma de realización más preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, la proporción de altos productores está aumentada dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o diez veces, o aumentada más de dos, más de tres, más de cuatro, más de cinco, más de siete, más de diez veces, más preferentemente hasta cinco veces o más de tres veces. La presente invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de un producto biofarmacéutico, caracterizado por los siguientes pasos: (a) integración de por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento TE de acuerdo con la invención en un vector de expresión eucariótico que contiene un gen de interés, (b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión, (c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción y (d) cultivo de la célula huésped transfectada obtenida de alta producción en condiciones que permiten una expresión del o de los genes de interés. La presente invención se refiere además a un procedimiento para el desarrollo de una línea celular eucariótica transfectada en forma estable, de alta producción, caracterizado por los siguientes pasos: (a) integración de por lo menos un gen (genes) de interés en un vector de expresión eucariótico que contiene por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento TE de acuerdo con la invención, (b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión, (c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción y (d) cultivo de la célula huésped transfectada obtenida de alta producción en condiciones que permiten una expresión del o de los genes de interés. En una forma de realización especial, el procedimiento de acuerdo con la invención está caracterizado por al menos un paso de amplificación adicional. En una forma de realización especial, el procedimiento de acuerdo con la invención está caracterizado por el siguiente paso adicional: (e) siembra y purificación de la proteína de interés. La presente invención se refiere además al uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento que aumenta la transcripción de acuerdo con la invención (elemento TE) en un vector de expresión eucariótico, para aumentar la transcripción y/o expresión de un gen de interés en un sistema de expresión en una célula huésped eucariótica o para la preparación de un producto biofarmacéutico. La presente invención se refiere además al uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento que aumenta la transcripción de acuerdo con la invención (elemento TE) para la generación de animales o plantas transgénicos. La presente invención se refiere además al uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento que aumenta la transcripción de acuerdo con la invención (elemento TE) en la terapia génica. La presente invención se refiere especialmente al uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o un elemento que aumenta la transcripción de acuerdo con la invención (elemento TE) como medicamento o en una composición farmacéutica.

La presente invención se refiere además a un kit compuesto por un ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o uno o más elementos TE de acuerdo con la invención, opcionalmente vectores de expresión, opcionalmente células huésped y opcionalmente reactivos de transfección. En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un ácido nucleico, especialmente a un ácido nucleico aislado, más precisamente un elemento de ácido nucleico que aumenta la transcripción y/o la expresión (elemento TE) con la SEQ ID N° 1 o un fragmento o un derivado del mismo, el cual en la integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción y/o expresión de un gen de interés, con excepción del elemento TE-00 (SEQ ID N° 2). En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la invención con excepción del elemento-TE TE-00 (SEQ ID N° 2), TE-04 (SEQ ID N° 6) y TE-06 (SEQ ID N° 8). En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la invención con excepción de los elementos-TE, TE-00 (SEQ ID N° 2), TE-04 (SEQ ID N° 6), TE-05 (SEQ ID N° 7) y TE-06 (SEQ ID N° 8). El aumento de la expresión del gen de interés se puede determinar, por ejemplo, por medición del título del producto por medio de ELISA. Otra forma de realización de la presente invención se refiere a un elemento-TE de acuerdo con la invención, fragmento o derivado, el cual tiene 160 pb, preferentemente 170 pb de longitud. En una forma de realización especial, el elemento TE es un fragmento de entre 160 pb y 1.2 kb y/o entre 170 pb y 1 kb, preferentemente más de 200 pb y entre 200 pb y 1 kb de longitud.

En una forma de realización preferida, el fragmento del elemento SE TE encuentra en la zona parcial de la SEQ ID N° 1 entre 1 pb y 1578 pb (esto corresponde a un fragmento 5' del elemento TE-00 (SEQ ID N° 2) y tiene más de 113 pb de longitud y/o más de 132 pb y preferentemente más de 150 pb y/o más de 170 pb de longitud. En una forma de realización especial, el fragmento del elemento TE tiene entre 113 pb y 1.2 kb y/o entre 132 pb y 1.2 kb y/o entre 160 pb y 1.2 kb, preferentemente más de 200 pb y entre 200 pb y 1 kb de longitud. En una forma de realización adicional, el fragmento del elemento SE TE encuentra sin secuencias vecinas. Esto significa que el fragmento no es parte integrante de una secuencia más grande o de una zona de secuencias, que por ejemplo, no se le han agregado otras secuencias antes (5') o después (3'). En otra forma de realización especial, la presente invención se refiere a un ácido nucleico de acuerdo con la invención, que no contiene islas de CpG. De los siguientes experimentos se puede ver que en una comparación de células huésped eucarióticas con y sin elemento SE TE pudo mostrar un aumento de hasta siete veces de la modificación relativa de la productividad específica del gen de interés. La obtención de datos para el título del producto y para la productividad específica dio por resultado que casi todos los pools de células con elementos TE, que representaban fragmentos y/o derivados de la SEQ ID N° 1 , expresaban en promedio más gen de interés que los pools de células sin elemento TE. Los elementos TE 01 (SEQ ID N° 3), 02 (SEQ ID N° 4) y 08 (SEQ ID N° 10) dieron por resultado en dos series de transfección independientes, en las cuales se usó en cada caso otro marcador de selección (NPT y/o DHFR) la mayor productividad. Pueden aumentar la productividad por un factor de 4 a 7. Por supuesto, los elementos TE 01 (SEQ ID N° 3) y 02 (SEQ ID N° 4) con 3 kb y 2.5 kb son muy grandes para agregar adicionalmente a un vector de expresión. Más interesante es en cambio el elemento TE 08 (SEQ ID N° 10) de solo 1 kb de tamaño, que puede aumentar la expresión por un factor de 5 a 6. También el elemento TE 06 (SEQ ID N° 8) dio por resultado en dos series de transfección una triplicación de la productividad específica con un tamaño de sólo 381 pb. Es muy ventajoso dejar los vectores de expresión tan pequeños como sea posible, pues los vectores más pequeños son en general más estables y son más fáciles de manipular tanto en la clonación como también en la transfección. Por lo tanto, los elementos TE 06 (SEQ ID N° 8) y 08 (SEQ ID N° 10), así como 13 (SEQ ID N° 15) son especialmente interesantes para el uso como elemento que promueve la transcripción. De los siguientes ejemplos se puede observar además, que los pools de células, que contenían el elemento TE 03 (SEQ ID N° 5), 04 (SEQ ID N° 6) o 07 (SEQ ID N° 9), mostraban una expresión de 3 a 3,5 veces del gen de interés y el pool de células con los elementos TE 10 (SEQ ID N° 12), 11 (SEQ ID N° 13) y/o 12 (SEQ ID N° 14) mostraban una expresión del gen de interés de aproximadamente el doble. El elemento TE 08 (SEQ ID N° 19) mostraba junto con el NPT F240I como marcador de selección con el Factor 5 el mayor aumento de la productividad específica del gen de interés con respecto al pool de control sin elemento TE. Junto con el DHFR como marcador de selección, el elemento TE 08 (SEQ ID N° 10) muestra un aumento aún mayor de aprox. Factor 6.0. El elemento TE 02 (SEQ ID N° 4) provoca además en la serie de ensayos con DHFR como marcador de selección un aumento de la productividad del gen de interés por un Factor de 6.8. El mayor aumento (15 veces) lo provoca el elemento 13. De los ejemplos siguientes se observa además, que los pools con los elementos TE 05 (SEQ ID N° 7) y 09 (SEQ ID N° 11 ) en una serie de ensayos no presentan un aumento de la expresión del gen de interés y en una serie de ensayos mostraron inclusive una expresión menor del gen de interés que el pool control. Estos dos elementos así como también posiblemente fragmentos parciales en estas zonas de secuencias pueden tener bajo algunas circunstancias un efecto de inhibición, aunque no tiene que ser así. Además, en los siguientes ejemplos, las modificaciones relativas de la productividad específica para los diversos elementos TE probados pudieron ser obtenidos independientemente del sistema de vectores, es decir, independientemente del marcador de selección usado o independientemente del gen de interés en cada caso. De los siguientes ejemplos se puede ver que la modificación de la expresión del gen marcador se correlaciona con las modificaciones de la expresión del gen de interés. De los ejemplos siguientes se puede observar además, que ninguno de los elementos TE probados tiene un efecto potenciador. Esto evidencia que los elementos TE sólo provocan un aumento de la expresión del gen de interés a nivel cromosómico. Los siguientes ejemplos evidencian además, que la combinación y/o la colocación uno después del otro de varios elementos TE cortos iguales o diferentes, eomo por ej., el elemento TE 06 y el 08 ó 21 , puede llevar a un efecto aumentador de la expresión adicional. EJEMPLOS ABREVIATURAS AP: fosfatasa alcalina Asp (=D): ácido aspártico pb: par de bases CHO: ovario de hámster chino DHFR: dihidrofolato reductasa ELISA: ensayo de inmunoabsorcion unido a enzima FACS: clasificador celular activado por fluorescencia GFP: proteína fluorescente verde Gly (=G): glicina HT: hipoxantina/timidina IgG: inmunoglobulina G He (=1): isoleucina IRES: sitio de entrada ribosomal interno kb: kilobase mAk: anticuerpo monoclonal MCP-1 : proteína 1 quimioatractiva de monocitos 1 MTX: metotrexato NPT: neomicina-fosfotransferasa PCR: reacción de polimerasa en cadena Phe (=F): fenilalanina SEAP: fosfatasa alcalina secretada Ub: ubiquitina UTR: región no traducida Métodos Cultivo celular y transfección Las células CHO-DG44/dhfr-/- (Urlaub et al., 1983) fueron cultivados en forma permanente como células de suspensión en medio CHO-S-SFMII libre de suero y suplementado con hipoxantina y timidina (HT) (Invitrogen GMBH, Karlsruhe, DE), en frascos de cultivo celular a 37°C en atmósfera húmeda y 5% de CO2. El número de células así como también la viabilidad se determinaron con un Coulter Counter Zw (Beckmann Coulter) o con un Cedex (Innovatis) y las células se sembraron luego en una concentración de 1-3 x 105/ml y se realizaron pasajes cada 2 a 3 días. Para la transfección de CHO-DG44 se usó Lipofectamine Plus Reagenz (Invitrogen). Por mezcla de transfección se mezclaron en total 1.0-1.3 pg de ADN-plásmido, 4 µ? de lipofectamina y 6 µ? de reactivo Plus según las instrucciones del fabricante y se agregaron en un volumen de 200 µ? a 6x105 células en 0.8 mi de medio CHO-S-SFMII suplementado con HT. Después de una incubación de tres horas a 37°C en una incubadora de células se realizó una adición de 2 mi de medio CHO-S-SFMII suplementado con HT. Después de un tiempo de cultivo de 48 horas, las mezclas de transfección se cosecharon (transfección transitoria) o se sometieron a una selección. Para la selección basada en NPT se transfirieron las células 2 días después de la transfección a un medio CHO-S-SFMII suplementado con HT con 400 pg/ml de G418 (llnvitrogen). Para la selección basada en DHFR se pasaron las células 2 días después de la transfección a un medio CHO-S-SFMII libre de HT. En una selección basada en DHFR y NPT en el caso de una cotransfeccion, en la cual un vector de expresión contenía un marcador de selección DHFR y el otro un marcador de selección NPT, se transfirieron las células 2 días después de la transfección a medio CHO- S-SFMII sin agregado de hipoxantina y timidina y se agregó al medio además G418 (Invitrogen) en una concentración de 400 pg/ml. Una amplificación del gen basada en DHFR del gen heterólogo integrado se puede lograr por adición del gen de selección MTX (Sigma, Deisenhofen, DE) en una concentración de 5-2000 nM a un medio CHO-S-SFMII libre de HT. Vectores de expresión Para el análisis de expresión se usaron vectores de expresión eucarióticos, que se basan en el vector pAD-CMV (Werner et al., 1998) y que transmiten la expresión de un gen heterólogo a través de la combinación promotor de CMV/hámster promotor de ubiquitína/S27a (WO 97/15664) o potenciador de CMV/promotor de CMV. Mientras que el vector base pBID contiene el minigén dhfr, que sirve como marcador de selección amplificable (ver, por ej., EP-0-393-438), en el vecto pBING se ha reemplazado el minigén dhfr por un gen NPT modificado. Se trata aquí de una variante de NPT D227G (Asp227Gly). La clonación de pBING con la variante de NPT D227G así como también de la región de gen IRES-GFP se realizó como se describió en (documento WO 2004/050884). El plásmido base pTE4 contiene la variante NPT F240I (Phe240lle) como marcador de selección y es un derivado del plásmido pBING. Aparte del reemplazo de la variante de NPT D227G por la variante de NPT F240I, se reemplazó también el GFP por la proteína fluorescente roja DsRed2 del vector pDsRed2 (Clontech, Palo Alto, CA, EE. UU.). El plásmido base pTE5 contiene DHFR como marcador de selección y es un derivado del vector pBIDG (documento WO 2004/050884) en el cual también se reemplazó la proteína fluorescente roja DsRed2 del vector pDsRed2 (Clontech, Palo Alto, CA, EE. UU). Para la expresión de un anticuerpo lgG1 humanizado monoclonal se clonó la cadena pesada como fragmento Sall/Spel de 1 .4 kb en el plásmido pBID digerido con Xbal y Salí, dando por resultado el plásmido pBID-HC (Fig. 1A). La cadena liviana en cambio fue clonada como fragmenteo BamHI/Hindi de 0.7 kb en los sitios de corte Bglll/Hindi del plásmido pBING, por medio de lo cual se obtuvo el plásmido pBING-LC (Fig. 1A). El cADN MCP-1 humano (Yoshimura et al., 1989) fue clonado como fragmento Hindi/EcoRI de 0.3 kb en los sitios de corte correspondientes del vector pTE4 y/o pTE4, dando por resultado los plásmidos pTE4/MCP-1 y/o pTE5/MCP-1 (Fig. 1 B y/o Fig. 2). FACS (fluorescent-activated cell sorter) Los análisis flujocitométricos se realizaron con un BD FACScalibur (BD Bioscience). El FACS está equipado con un láser de helio-argón con una longitud de onda de excitación de 488 nm. La intensidad de fluorescencia se capta a una longitud de onda adecuada para cada proteína de fluorescencia y se procesa por medio del Software Cell Queso Pro adjunto. ELISA (enzvme-liked immunosorbant assav) Los títulos de MCP-1 en sobrenadantes de células CHO-DG44 transfectadas en forma transitoria fueron cuantificados por medio de ELISA con el kit OptEIA Human MCP-1 Set según el protocolo del fabricante (BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, Alemania). La cuantificación del mAks lgG1 en los sobrenadantes de células CHO-DG44 transfectados en forma estable se realizó por medio de ELISA según protocolos estándar (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, actualizado), usándose por un lado un fragmento de Fs igG anti-humano de cabra (Dianota, Hamburgo, Alemania) y por el otro un anticuerpo de cadena liviana kappa anti-humano de cabra AP-conjugado (Sigma). Como estándar servía un anticuerpo lgG1 purificado. Las productividades (pg/célula/día) se calcularon con la fórmula pg/((Ct-Co) t/ In (Ct-Co)), en donde Co y Ct indican el número de células en la siembra y/o la cosecha y t la duración del cultivo. Ensayo SEAP El título de SEAP en los sobrenadantes de cultivo de células CHO-DG44 transfectadas de forma transitoria se cuantificó usando el SEAP Repórter Gene Assay según las indicaciones del protocolo del fabricante (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE). EJEMPLO 1 : AISLAMIENTO Y CLONACIÓN DEL ELEMENTO TE TE-A Partiendo de la secuencia del genoma del hámster que se describe en la WO97/15664, que abarca además de la región codificadora para el gen de la ubiquitina/S27a, también áreas adyacentes 5 'UTR inclusive las del promotor Ub/S27a, se aislaron otras áreas de secuencias hasta ahora desconocidas ubicadas más corriente arriba. Para ello se utilizaron ADN de CHO-DG44 ligados con adaptadores, como matriz para "PCRs anidados". La primera PCR se realizó en combinación con cebadores complementarios al adaptador o bien a una secuencia de hámster en el área 5' de la secuencia indicada en el documento W097/15664 bajo la SEQ ID N° 5 (cebador Ub20: 5'-CTCCACACATTTACACATGGACAC-3 ' (SEQ JD N° 39)); correspondiente a los nucleótidos 62 a 85 (secuencia complementaria) de la SEQ ID N° 5 del documento WO 97/15664). A continuación se realizó una segunda PCR con una segunda combinación de cebador, que se compone de un cebador interno del adaptador y un cebador interno específico de hámster ("anidado") (cebador Ub21 : 5'- GGGTTTCTCTGTGTAATAGCCATG-3' (SEQ ID N° 40); correspondiente a los nucleótidos 16 a 39 (secuencia complementaria) de la SEQ ID N° 5 del documento WO97/15664). Los fragmentos ADN superpuestos resultantes, que se iniciaron en el extremo del cebador específico de hámster con una secuencia conocida y luego pasaron a nuevas áreas de secuencia desconocidas ubicadas corriente arriba, fueron subclonadas en vectores pCR2.1 TOPO (Invitrogen) y analizadas mediante secuenciamiento. En total se obtuvieron 348 pb de una nueva secuencia hasta ahora desconocida corriente arriba del gen Ub/S27a de hámster. Sobre la base de esta nueva información de secuencia, se aisló un sector de ADN que se ubicaba más corriente arriba, mediante la antes descrita "PCR anidada". Esta vez se ubicó la primera PCR con un cebador del adaptador y el cebador Ub33 5 '-ATCTCACTGTGTCTACCAACTTAG-3 ' (SEQ ID N° 41 ); en el sector 5' de la nueva secuencia aislada 384 pb; correspondiente a los nucleótidos 1268 - 1291 (secuencia complementaria) de la SEQ ID N°. 1 ) y la segunda PCR con un cebador interno del adaptador y un cebador interno específico de hámster Ub32a (5 - TCTGCACCACCACTACCTGACT -3' (SEQ ID N° 42); ubicado corriente arriba del cebador Ub33 dentro de la nueva secuencia aislada 384 pb; correspondiente al nucleótido 1243 - 1264 (secuencia complementaria) de la SEQ ID N° 1 ). El amplificado resultante fue subclonado en el vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen) y se secuenció. Comprendía otros 1239 pb de una nueva secuencia hasta ahora desconocida, ubicada corriente arriba del gen Ub/S27a de hámster. La información obtenida de los fragmentos PCR superpuestos se aprovechó para amplificar vía PCR utilizando el cebador a) Ub34 (5 -CTAAGAGTACTTGCCATGAGAGCCTGAA-3' (SEQ ID N° 43); localizado en el extremo final 5' de la nueva secuencia 1239 pb aislada; contenida tan sólo parcialmente en la SEQ ID N° 1 (nucleótidos 1 a 14)) y b) Ub35 (5 '-CATTG ATACACCACCAAAG AACTTG-3 ' (SEQ ID N° 44); correspondiente a los nucleótidos 1941 a 1965 (secuencia complementaria) de la SEQ ID N° 1 ) un sector relacionado de secuencia del ADN genómico de CHO-DG44, que comprendía todos los fragmentos parciales aislados hasta el momento y asomaba 383 pb dentro del área de secuencia 5' de la SEQ ID N° 5 de la WO 97/15664. El fragmento de ADN de 2 kb resultante se ligó con el sector 5' UTR de la secuencia ID N° 5 que se describió en WO 97/15664, a través de la interfase EcoRI (posición 353 - 358), pero donde esta interfase fue eliminada mediante una reacción de rellenado con la ADN polimerasa Klenow. Se eliminó del mismo modo una segunda interfase endógena EcoRI en el nuevo sector genómico aislado, de lo que resultaron los nucleótidos adicionales 326 a 329 de la SEQ ID N° 1 respecto de la secuencia genómica originaria. En total se incorporaron de este modo en la SEQ ID N° 1 , 8 nucleótidos adicionales en comparación con la secuencia endógena de hámster. El fragmento de ADN resultante de 3788 pb de tamaño de un sector de secuencia ubicado corriente arriba del gen Ub/S27a de hámster, se denominó como elemento TE A con la secuencia ID N° 1 y se subclonó dentro del vector pBluescript SKM (Stratagene, La Jolla, CA). EJEMPLO 2: GENERACIÓN DE DIVERSOS VECTORES DE EXPRESIÓN TE Partiendo del elemento TE TE-A de 3.8 kb de tamaño (Fig. 3, secuencia ID N° 1 ) se generó desde el genoma CHO mediante PCR diversos fragmentos, que en comparación con el elemento TE TE-A presentaron deleciones en el extremo 5' o en el extremo 3' (Fig. 4 y Fig. 5). Para la síntesis de estos fragmentos se utilizaron en cada caso combinaciones de cebadores directos y reversos (Fig. 5 y Fig.6). A los efectos de clonación se agregó mediante el cebador en cada caso en el extremo 5' de la porción, una interfase BamHI y en el extremo 3' una interfase BsrGI. De ese modo se generaron 12 elementos TE de diferente longitud con la denominación TE-01 a TE-12 (Fig. 4 y 5). Después de la digestión con BsrGI y BamHI, estos se clonaron en cada caso en orientación directa dentro de la región de adaptación de los plásmidos base pTE4/MCP-1 (Fig. 1B) o bien pTE5/MCP-1 (Fig. 2). El fragmento TE-00 (SEQ ID N° 2) se aisló a través de la digestión de la enzima de restricción Sacll a partir de un subclon de TE-A y se clonó tanto en orientación directa, como también en orientación reversa a través de la interfase Spel ubicada 5' del elemento promotor/potenciador dentro de los vectores base pBING-LC (Fig. 1A) o bien pBID-HC (Fig. 1A). SECUENCIAS DE LOS ELEMENTOS TE TE-A (SECUENCIA ID N° 1) ccatgagagcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccact aagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaaca cccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcacttta aaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacatt ttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtg cttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatg accacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggtt ggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagac acccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgcca gttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcag cagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatca cttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccaga 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un anticuerpo IgGI monoclonal segregado se estudió en dos series de transfección estables independientes con células CHO-DG44. Para ello se realiza la cotransficacion de células CHO-DG44 con las siguientes combinaciones de plásmidos o bien variantes de plásmidos: a) plásmidos de control pBING-LC (Fig.lA) y pBID-HC (Fig. 1A) sin elemento TE b) pBING-LC y pBID-HC con un elemento TE TE-00 integrado en cada caso corriente arriba del promotor/potenciador en orientación directa c) pBING-LC y pBID-HC con un elemento TE TE-00 integrado en cada caso corriente arriba del promotor/ potenciador en orientación inversa En la serie de transfeccion A se produjeron en cada caso cuatro pools, en la serie de transfeccion B en cada caso diez pools por variante. Allí se utilizaron en cada caso cantidades equimolares de ambos plásmidos. A fin de llegar a la misma cantidad total de moléculas, la cantidad total de ADN utilizada para la transfeccion en la serie A fue en las preparaciones de control de 1 pg, en las preparaciones con el elemento TE de 1.3 pg. Esta diferencia resultó de los diferentes tamaños de plásmidos, dado que los plásmidos con el elemento TE fueron mayores en un factor 1.3 que los plásmidos de control. Dado que la cantidad de ADN en la mezcla de transfeccion puede tener una influencia sobre la eficiencia de transfeccion, en la serie B se equiparó la cantidad total de ADN con 300 ng de "ADN-Mock" (= vector sin gen del producto, elemento TE y marcador de selección eucarionte), de modo que en la preparación con los plásmidos de control en total también tenían un contenido de 1.3 pg de ADN. Como control negativo en cada serie de transfeccion también se mantuvo un pool transfectado con Mock, es decir, con el mismo tratamiento, pero sin agregado de ADN en la preparación de transfeccion. La selección de células transfectadas de modo estable se realizó dos días después de la transfeccion con -HT/+G418 (400 pg/ml).

Después de la selección se determinó en el FACS la proporción de células que expresan GFP. De la comparación de las variantes en el Plot-Overlay resultó en ambas series de transfección para pools con elemento TE 00 una mayor proporción de células que expresan GFP que en pools con plásmidos de control (Fig. 7). Entre los pools, en los cuales ya existía el elemento TE ya sea en orientación directa o inversa en el plásmido, no se evidenciaron diferencias de ningún tipo. El efecto del elemento TE 00, es decir aumentar la proporción de células con mayor productividad en una población mixta, por lo tanto no dependía de su orientación. Adicionalmente también se determinaron las titulaciones de lgG1 y la productividad específica de los pools a través de un período de seis a ocho pasajes (ritmo de realización de pasajes 2-2-3 días). También aquí se confirmó, que los pools celulares con el elemento TE 00 en promedio efectuaron mayor expresión que los pools celulares sin elemento TE (Fig. 9, serie A y B). En ambas series pudo comprobarse una duplicación de la producción del pool mediante la existencia del elemento TE, donde carecía de importancia, en qué orientación el elemento se incluía por clonación en el plásmido de expresión. EJEMPLO 4: INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS TEE TE-01 A TE-12 SOBRE LA EXPRESIÓN DE MCP-1 La acción de los elementos TEe TE-01 a TE-12 sobre la expresión del MCP-1 segregado, se analizó en 3 series estables de transfección (serie C, D y E) de células CHO-DG44 en comparación a la expresión sin el elemento TE. En las tres series se produjeron cada vez seis pools por variante de plásmido. El plásmido base estaba en la serie C y D pTE4/MCP-1 (Fig. 1B; marcador de selección NPT= neomicina-fosfotransferasa F240I), en serie E pTE5/MCP-1 (Fig. 2; marcador de selección DHFR = dihidrofolato-reductasa). Estas no contenían ningún elemento TE (= preparados de control) o en cada caso uno de los elementos TEe TE-01 a TE-12 en orientación directa corriente arriba del promotor/ potenciador. A fin de minimizar una influencia de la eficiencia de transfección mediante diferentes cantidades de ADNn en la preparación de transfección, se utilizó cada vez en total 1.2 pg del ADN del plásmido. Dependiendo del tamaño del elemento TE insertado, varió el tamaño del plásmido entre 6.7 kb y 10.7 kb. Pero para que en todas las preparación podía mantenerse constante la cantidad total de moléculas de los plásmidos de ensayo, en las preparaciones con cantidades menores de moléculas, se equiparó la cantidad total de ADN con un así llamado plásmido mock, que no contenía el gen del producto, ni el elemento TE, ni tampoco un marcador de selección eucarionte. Como control negativo en cada serie de transfección también se mantuvo un pool transfectado con Mock, es decir, con el mismo tratamiento, pero sin agregado de ADN en la preparación de transfección. La selección de células transfectadas de modo estable se realizó dos días después de la transfección, en las series C y D con CHO-S-SFMII +G418 suplementado con HT (400 pg/ml), en serie E con CHO-S-SFMII sin HT. Después de la selección se determinó en el FACS la proporción de células que expresaban dsRed2. La figura 8 representa la fluorescencia porcentual relativa de las células vivas transfectadas de la serie C. En comparación con los pools de control, los pools que incluían los elementos TEe TE-01 , TE-02 o TE-08, contenía aproximadamente 3 a 3.5 veces más células que expresaban dsRed2 y los pools con el elemento TE-06 una cantidad de aproximadamente el doble de células que expresaban dsRed2. En pools con los fragmentos TE-05 y TE-09, en cambio no pudo observarse un aumento de la proporción de células que expresaban DsRed2 en comparación al control. Además también se relevaron las titulaciones del producto MCP-1 y la productividad específica durante un período de 6 pasajes (ritmo de realización de pasajes 2-2-3 días). En la ilustración 9 (serie C y D) y la ilustración 10 (serie E) se representaron las productividades específicas relativas de MCP-1. El elemento TE-08 muestra aquí junto con NPT F240I como marcador de selección con el factor 5.3 el mayor aumento de la productividad específica MCP-1 respecto del pool de control sin elemento TE (Fig. 9). Junto con DHFR como marcador de selección se obtuvo con esta variante un aumento de 6 veces (Fig. 10). De los elementos TEe 01 , 02 y 03 resultó en los pools seleccionados con NPT, un aumento de 4 o bien 4.5 veces de la productividad (Fig. 9) y en los pools seleccionados con DHFR, un aumento de 2.6 a 6.8 veces de la productividad (Fig. 10) respecto de los pools de control. Incluso el elemento TE 06 de un tamaño de sólo 300 pb, pudo lograr un aumento de la productividad en todas las series en un factor 2.5 a 3.2 (Fig. 9 y 10). Los aumentos logrados con los fragmentos TE-04 y TE-07 también se ubicaron en este rango (Fig. 10). Los pools, en los cuales se utilizaron los fragmentos TE-10, TE-11 y TE-12 de una longitud algo mayor, presentaron una duplicación de la expresión MCP-1 (Fig. 9 y 10). Evidentemente, en todos estos pools esta reducida la cantidad de células que no expresan un producto o sólo expresan poca cantidad de producto, y por lo tanto aumentó la proporción total de altos productores en la población de células. Esto es un indicio de que los elementos TE pueden suprimir, prevenir o anular los efectos de la posición cromosómica negativa. En contraposición a ello, mediante el uso de los fragmentos TE-05 y TE-09, no pudo aumentarse la expresión, como ya se demostró también en la expresión DsRed2 (Fig. 8), en comparación con el control, la que incluso fue menor en algunos casos (Fig. 9 y 10). Es posible por lo tanto que estos elementos, o bien fragmentos parciales en estos rangos de secuencia puedan más bien ejercer una acción represora. Considerado en conjunto, la modificación observada en la expresión de MCP-1 fue correlativa con la proporción de las células que expresaban DsRed2 en los pools celulares estables. EJEMPLO 5: PRUEBA DE LOS ELEMENTOS TE TE-01 A TE-12 RESPECTO DE LA ACTIVIDAD Mediante la transfección transitoria de células CHO-DG44, se verificó, si el aumento observado de la expresión del producto realmente se debe a un efecto de apertura de cromatina de los elementos TE o si se basan en una actividad del potenciador. Dado que en una transfección transitoria, el plásmido no es integrado en el genoma, la información genética es leída directamente del plásmido. De ese modo no pueden producirse efectos debido a la ubicación cromosómica. Si a pesar de ello se presentan efectos positivos en la expresión génica, estos podrían deberse al potenciador existen en el elemento TE. Tales potenciadores pueden actuar en ubicación cis independientemente de la posición y la orientación, sobre la actividad de un promotor y estimular la transcripción de un gen enlazado funcionalmente. En el estudio de expresión transitoria que se muestra en la ilustración 11 , se realizó la transfección de en cada caso 6 pools con el plásmido base pTE4/MCP-1 (= control; Fig. 1 B) o bien de sus derivados, que en cada caso contenían adicionalmente uno de los elementos TE TE-01 a TE-12 corriente arriba del promotor/potenciador. Después de 48 h de cultivo en un volumen total de 3 mi, se realizó la cosecha y la determinación de la titulación MCP-1 en el sobrenadante del cultivo celular mediante ELISA. Las diferencias en la eficiencia de transfeccion se corrigieran mediante la cotransfección con un plásmido de expresión SEAP (agregado de en cada caso 100 ng de ADN del plásmido por preparación de transfeccion) y la posterior medición de la actividad SEAP. En la ilustración 11 se representó el valor medio de los 6 pools paralelos en cada caso. Los datos demuestran que las titulaciones MCP-1 en el sobrenadante del cultivo celular fueron muy similares en todos los pools y que no existían diferencias significativas de expresión respecto del plásmido de control pTE4/MCP-1 sin elemento TE. Por lo tanto, el aumento de productividad causada por algunos elementos TE, en más del factor 2 en pool celulares de transfeccion estable, no se debe a la existencia de un potenciador en la secuencia TE. En consecuencia, es imprescindible una integración cromosómica para el aumento de expresión causada por los elementos TE. EJEMPLO 6: PRODUCCIÓN DE OTROS ELEMENTOS TE Y TESTEO DE DIFERENTES POSICIONES Y COMBINACIONES DEL ELEMENTO TE Análogamente a la forma de proceder que se describe en el Ejemplo 2, pueden generarse otros fragmentos parciales de la secuencia ID N° 1 o también de derivados de los mismos y, como se indicó en el Ejemplo 3 y 4, y verificarse respecto de su influencia positiva sobre la productividad. Se representan algunos ejemplos de realización para posibles fragmentos en la ilustración 12. Los resultados obtenidos hasta el momento por ejemplo indican que las áreas de la secuencia ID N° 1 que muestran en la ilustración 12, también podrían producir un aumento de la expresión génica. En series de transfeccion estables, deben caracterizarse en mayor detalle estos nuevos elementos TE respecto de su influencia sobre la productividad específica, a fin de localizar con mayor exactitud y limitar aún más las áreas de secuencia importantes para la función. Una limitación de la función a determinadas áreas de secuencias y así la consecuente posible reducción de longitud de fragmento, es ventajosa para un uso eficiente de vectores de expresión, dado que los plásmidos de expresión más pequeños son más estables y de manipulación más sencilla tanto durante la clonación como también durante la transfección. Además es posible que se presente una disposición cualquiera de áreas de fragmentos del mismo tipo o diferentes en cualquier orientación entre sí, como también en una posición cualquiera dentro del plásmido. El análisis que resulta de la combinación en un aumento lo más favorable posible de la expresión, puede nuevamente realizarse en series de transfección estables. Algunos ejemplos de realización, que de ningún modo son limitativos, son representados en la ilustración 13. De ese modo debe analizarse por ejemplo, si los elementos TE TE-06 y TE-08 en el caso de un flanqueamiento de ambos lados del gen del producto o en el caso de conexión sucesiva, puede provocar un aumento adicional de la expresión. Además es factible que una conexión sucesiva de elementos TE cortos, ya sean iguales o diferentes, como p. Ej. el elemento TE 06 y 08, asimismo producen un efecto adicional incrementador de la expresión. Otros elementos TE ELEMENTO TE 13 (SECUENCIA ID N° 15) gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaa ccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaata aaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggttt gactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcac atacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggct ggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagacc agcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatc ELEMENTO TE 14 (SECUENCIA ID N° 16) caaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaa caaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagg gaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataa aagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccag gccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaat 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tgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaata actaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattg atgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgatt aaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagg ELEMENTO TE 16 (SECUENCIA ID N° 18) acctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctatt acacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgcca catacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcagg tcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaa tgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaa tagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttt tccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc ELEMENTO TE 17 (SECUENCIA ID N° 19) caaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaa caaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagg gaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataa aagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccag gccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaat aattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataa agtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggc acatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatgg ctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcat gccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaact caggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaa atcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacat ctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaaca actttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc ELEMENTO TE 18 (SECUENCIA ID N° 20) gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaa ccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaata aaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggttt gactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcac atacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggct ggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagacc agcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaa caacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacagg aaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaag aactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtgg tgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaata actaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattg atgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgatt aaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagag gccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaa aaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggag tcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctc acggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcga gaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattcc aagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttg tccc ELEMENTO TE 21 (SECUENCIA ID N° 21) cttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaacc gtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaag aggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggcta caccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgc caaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagat ag EJEMPLO 7: INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS TEE TE-13 A TE-18 SOBRE LA EXPRESIÓN DE MCP-1 La acción de los elementos TE TE-13 a TE-18 sobre la expresión del MCP-1 segregado se analizó en series estables de transfección (serie C, D y E) de células CHO-DG44 en comparación a la expresión sin el elemento TE. Se generaron en cada caso cuatro pools por variante de plásmido. El plásmido base estaba en todas las series pTE4/MCP-1 (Fig. 1 B; marcador de selección NPT = neomicina-fosfotransferasa F240I). Las distintas variantes de plásmido no contenían ningún elemento TE (= preparados de control) o en cada caso uno de los elementos TEe TE-13 a TE-18 en orientación directa corriente arriba del promotor/ potenciador (Figura 12). A fin de minimizar una influencia de la eficiencia de transfección mediante diferentes cantidades de ADNn en la preparación de transfección, se utilizó cada vez en total 1.2 pg del ADN del plásmido. Dependiendo del tamaño del elemento TE insertado, varió el tamaño del plásmido entre 6.7 kb y 8.2 kb. Como control negativo en cada serie de transfección también se mantuvo un pool transfectado con Mock, es decir, con el mismo tratamiento, pero sin agregado de ADN en la preparación de transfección. La selección de células transfectadas de modo estable se realizó dos días después de la transfección con CHO-S-SFMII suplementado con HT +G418 (400 pg/mL). También se relevaron las titulaciones del producto MCP-1 y la productividad específica durante un período de 5 a 6 pasajes (ritmo de realización de pasajes 2-2-3 días). En la Figura 14 (serie F) se representan las productividades específicas relativas de producto MCP-1. Cada uno de los elementos lleva a un aumento de la expresión promedio de MCP-1. El máximo aumento (15 veces) fue provocado por el elemento 13, que incluso supera el aumento de diez veces con el elemento 08. EJEMPLO 8: INFLUENCIA DE LOS ELEMENTOS TE EN DIVERSAS POSICIONES Y EN DIVERSAS COMBINACIONES SOBRE LA EXPRESIÓN DE MCP-1 La acción de los elementos TE TE-06 y TE-08 en diversas combinaciones y en distintas posiciones en el plásmido de expresión sobre la expresión del MCP-1 extraído se ensaya en dos series estables de transfecciones (series G y H) de células CHO en comparación con la expresión sin el elemento TE. En ambas series se producen cada vez seis pools por variante de plásmido. El plásmido de base es pTE4/MCP-1 (Fig. 1B; marcador de selección NPT = neomicina-fosfotransferasa F240I). Las distintas variantes de plásmido no contienen ya sea ningún elemento TE (= preparaciones de control) o TE-08 o bien TE-A antes del elemento potenciador/promotor o la combinación de TE-06 y TE-08 antes del elemento potenciador/promotor o TE-08 o bien TE-09 en orientación inversa antes del elemento potenciador/promotor (serie G). En la serie H se emplean los elementos TE-06 y TE-21 o bien TE-08 antes del elemento potenciador/promotor (E/P) y adicionalmente después de la señal de terminación (T) (Figura 13). A fin de minimizar una influencia de la eficiencia de transfección mediante diferentes cantidades de ADNn en la preparación de transfección, se utiliza cada vez en total 1.2 pg del ADN del plásmido. Dependiendo del tamaño del elemento TE insertado, varía el tamaño del plásmido entre 6.7 kb y 10.2 kb. Como control negativo en cada serie de transfección también se mantiene un pool transfectado con Mock, es decir, con el mismo tratamiento, pero sin agregado de ADN en la preparación de transfección. La selección de células transfectadas de modo estable se realiza dos días después de la transfección con CHO-S-SFMII suplementado con HT +G418 (300 pg/mL). También se relevan las titulaciones del producto MCP-1 y la productividad específica durante un período de 6 pasajes (ritmo de realización de pasajes 2-2-3 días). En la Figura 15 se representan las productividades específicas relativas de la serie G del producto MCP-1. Todos los elementos llevan a un aumento de la expresión promedio de MCP-1. El mayor aumento (4 veces) es ocasionado por el elemento TE-A. El empleo de los elementos TE-06 y TE-21 o bien TE-08 antes y después del cásete de expresión produce un aumento. EJEMPLO 9: INFLUENCIA DEL ELEMENTO TE TE-08 SOBRE LA EXPRESIÓN DE DOS INMUNOGLOBULINAS G-4 (IGG-4) La acción del elemento TE TE-08 sobre la expresión dos anticuerpos lgG-4 se ensaya en una serie estable de transfecciones (serie J) de células CHO-DG44 en comparación con la expresión sin el elemento TE. Se generan en cada caso 24 pools con los plásmidos de base pBIN-LC2 o bien pBIN-LC3 y pBID-HC2 o bien pBID-HC3 y 24 pools con pBIN-LC2/TE08 o bien pBIN-LC3/TE08 y pBID-HC2/TE08 o bien pBID-HC3/TE08 (Fig. 16; marcador de selección NPT= neomicina-fosfotransferasa F240I y dhfr = dihidrofolato reductasa). A fin de minimizar una influencia de la eficiencia de transfección mediante diferentes cantidades de ADNn en la preparación de transfección, se utiliza cada vez en total 1.2 pg del ADN del plásmido. Dependiendo del tamaño del elemento TE insertado, varió el tamaño del plásmido entre 6.1 kb y 7.5 kb. Como control negativo en cada serie de transfección también se mantiene un pool transfectado con Mock, es decir, con el mismo tratamiento, pero sin agregado de ADN en la preparación de transfección. La selección de células transfectadas de modo estable se realiza dos días después de la transfección con CHO-S-SFMII sin HT +G418 (400 pg/mL). También se relevan las titulaciones del producto lgG-4 y la productividad específica durante un período de 4 pasajes (ritmo de realización de pasajes 2-2-3 días). El elemento 08 lleva en la expresión de anticuerpos lgG-4 a un aumento del índice promedio de expresión. Además, con la presencia del elemento TE-08 se puede aumentar la posibilidad de hallar un pool celular de alta producción. EJEMPLO 10: INFLUENCIA DE ELEMENTOS TE SOBRE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNA EN CÉLULAS 293F La acción de distintos elementos TE sobre la expresión del MCP-1 segregado se ensaya en una serie estable de transfecciones (serie K) de células HEK293Freestyle en comparación con la expresión de MCP-1 sin un elemento TE. El plásmido de base era pTE4/MCP-1 (Fig. 1 B; marcador de selección NPT = neomicina-fosfotransferasa F240I). Se emplean los elementos TE-08, TE-13 y TE-A en orientación directa corriente arriba del potenciador/promotor y se generan en cada caso 7-10 pools por variante de plásmido. A fin de minimizar una influencia de la eficiencia de transfección mediante diferentes cantidades de ADNn en la preparación de transfección, se utiliza cada vez en total 1.2 pg del ADN del plásmido. Dependiendo del tamaño del elemento TE insertado, varió el tamaño del plásmido entre 6.7 kb y 10.2 kb. Como control negativo en cada serie de transfección también se mantiene un pool transfectado con Mock, es decir, con el mismo tratamiento, pero sin agregado de ADN en la preparación de transfección. La selección de células establemente transfectadas se realiza dos días después de la transfección con medio 293 SFM II + 4 mM de glutamina + G418 (100 pg/ml). También se relevan las titulaciones del producto MCP-1 y la productividad específica durante un período de 5 a 6 pasajes (ritmo de realización de pasajes 2-2-3 días). EJEMPL0 11 : INFLUENCIA DEL ELEMENTO TE TE-08 SOBRE LA EXPRESIÓN DE UNA ENZIMA (SEAP) La acción del elemento TE TE-08 sobre la expresión de una enzima (SEAP) se ensaya en una serie estable de transfecciones (serie L) de células CHO-DG44 en comparación con la expresión de SEAP sin el elemento TE. Se generaron en cada caso seis pools por variante de plásmido. El plásmido base es ???-4/SEAP. Se genera a través de un intercambio del cásete de expresión MCP-1 - IRES - DsRed2 por SEAP. El elemento TE-08 se clona en el adaptador A (Fig. 1 B; marcador de selección NPT = neomicina-fosfotransferasa F240I). A fín de minimizar una influencia de la eficiencia de transfección mediante diferentes cantidades de ADNn en la preparación de transfección, se utiliza cada vez en total 1.2 pg del ADN del plásmido. Dependiendo del tamaño del elemento TE insertado, varió el tamaño del plásmido entre 6.6 kb y 7.6 kb. Como control negativo en cada serie de transfeccion también se mantiene un pool transfectado con Mock, es decir, con el mismo tratamiento, pero sin agregado de ADN en la preparación de transfeccion. La selección de células transfectadas de modo estable se realiza dos días después de la transfeccion con CHO-S-SFMII suplementado con HT +G418 (400 pg/mL). La expresión relativa de SEAP se calcula por medio de ensayos de SEAP (Clontech) asequibles en comercios y durante un período de 6 pasajes (ritmo de pasajes 2-2-3 días). LISTA DE REFERENCIAS Adam, M.A. et al., J Virol 1991, 65, 4985 - 4990 Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25, 3389 - 3402 Altschul, S.F. et al., J Mol Biol 1990, 215, 403 - 410 Aronow, B.J. et al., Mol. Cell. Biol. 1995, 15, 1123-1135. Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in molecular biology. New York : Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience 1994 (actualizado) Baker, J.E., Journal of Experimental Medicine 1999, 190, 669-679. 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Claims (45)

1. REIVINDICACIONES 1. - Ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID N° 15) o un fragmento de TE-13 (SEQ ID N° 15) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-13 (SEQ ID N° 15) o bien uno de sus fragmentos o sus secuencias de nucleótidos complementarias, y que en el caso de una integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción o bien a la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión.
2. 2. - Ácido nucleico que contiene TE-08 (SEQ ID N° 10) o un fragmento de TE-08 (SEQ ID N° 10) o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de TE-08 (SEQ ID N° 10) o bien uno de sus fragmentos o sus secuencias de nucleótidos complementarias, y que en el caso de una integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción o bien a la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión.
3. 3. - Ácido nucleico que contiene SEQ ID N° 1 o un fragmento de SEQ ID N° 1 o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de SEQ ID N° 1 o bien uno de sus fragmentos o sus secuencias de nucleótidos complementarias, que en el caso de una integración cromosómica lleva a un aumento de la transcripción o bien a la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión, en donde el fragmento o derivado comprende por lo menos una zona de secuencias de la zona de ácidos nucleicos entre 1 pb y 1578 pb.
4. 4. - Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el aumento de la transcripción o bien la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión en comparación con un control que no contiene ningún elemento TE, por ejemplo, se determina por medición de la titulación del producto por medio de ELISA.
5. 5. - Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, que se hibridan en condiciones rigurosas (a) con el sector de la secuencia de ácido nucleico TE-13 (SEQ ID N° 15) o bien TE-08 (SEQ ID N° 10) o (b) sus secuencias de ácido nucleico complementarias o (c) una secuencia de ácido nucleico que presenta al menos aproximadamente el 70% de identidad de secuencia, preferentemente al menos aproximadamente el 80% y/u 85% de identidad de secuencia, con preferencia especial al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia y con máxima preferencia al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con (a) o (b).
6. 6. - Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque este ácido nucleico presenta una longitud de al menos 511 pb (=longitud TE-13, SEQ ID N° 15) o bien al menos 1015 pb (=longitud TE-08, SEQ ID N° 10).
7. 7. - Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ácido nucleico está seleccionado del grupo compuesto por: TE-00 (SEQ ID N° 2), TE-01 (SEQ ID N° 3), TE-02 (SEQ ID N° 4), TE-03 (SEQ ID N° 5), TE-04 (SEQ ID N° 6), TE-06 (SEQ ID N° 8), TE-07 (SEQ ID N° 9), TE-08 (SEQ ID N° 10), TE-10 (SEQ ID N° 12), TE-11 (SEQ ID N° 13), TE-12 (SEQ ID N° 14), TE-13 (SEQ ID N° 15), TE-14 (SEQ ID N° 16), TE-15 (SEQ ID N° 17), TE-16 (SEQ ID N° 18), TE-17 (SEQ ID N° 19), TE-18 (SEQ ID N° 20) y TE-21 (SEQ ID N° 21).
8. 8. - Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido nucleico es TE-00 (SEQ ID N° 2), TE-06 (SEQ ID N° 8), TE-10 (SEQ ID N° 12), TE-11 (SEQ ID N° 13) o TE-12 (SEQ ID N° 14) o TE-21 (SEQ ID N° 21 ), con preferencia TE-06 (SEQ ID N° 8).
9. 9. - Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque el ácido nucleico es TE-01 (SEQ ID N° 3), TE-02 (SEQ ID N° 4), TE-03 (SEQ ID N° 5), TE-07 (SEQ ID N° 9) o TE-08 (SEQ ID N° 10).
10. 10. - Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico es TE-08 (SEQ ID N° 10).
11. 11. - Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el ácido nucleico es un fragmento o derivado de TE-01 (SEQ ID N° 3), con preferencia TE-13 (SEQ ID N° 15), TE-14 (SEQ ID N° 16), TE- 15 (SEQ ID N° 17), TE-16 (SEQ ID N° 18), TE-17 (SEQ ID N° 19), TE-18 (SEQ ID N° 20).
12. 12. - Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde el ácido nucleico es TE-13 (SEQ ID N° 15).
13. 13. - Ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, en donde el ácido nucleico mencionado o el fragmento o el derivado es un ácido nucleico aislado.
14. 14. - Ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque un ácido nucleico que contiene TE-13 (SEQ ID N° 15) o TE-08 (SEQ ID N° 10) o TE-07 (SEQ ID N° 9) o TE-06 (SEQ ID N° 8) o TE-21 (SEQ ID N° 21) o un fragmento de estas secuencias o sus secuencias de nucleótidos complementarias o un derivado de estas secuencias o bien un derivado de fragmentos de estas secuencias o sus secuencias de nucleótidos complementarias, con preferencia TE-13 (SEQ ID N° 15) o TE-08 (SEQ ID N° 10) o un fragmento de estas secuencias o un derivado de estas secuencias o bien un derivado de fragmentos de estas secuencias, está unido con una secuencia heteróloga.
15. 15. - Vector de expresión eucarionte, caracterizado porque este vector de expresión contiene un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14.
16. 16. - Vector de expresión eucarionte de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque contiene un promotor y / o un gen de interés heterólogo y / o un marcador de selección y / u opcionalmente un potenciador.
17. 17. - Vector de expresión eucarionte de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 a 16, caracterizado porque contiene una combinación de varios ácidos nucleicos iguales o diferentes de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14, en donde uno o varios ácidos nucleicos están posicionados antes (es decir, 5' de) y / o uno o varios ácidos nucleicos después de (es decir, 3' de) del gen de interés.
18. 18. - Vector de expresión eucarionte de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque en el caso de los ácidos nucleicos combinados se trata de TE-06 (SEQ ID N° 8) y con preferencia de TE-08 (SEQ ID N° 10).
19. 19. - Vector de expresión eucarionte de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque una combinación de uno o varios ácidos nucleicos de TE-08 (SEQ ID N° 10) están posicionados con uno o varios ácidos nucleicos de TE-06 (SEQ ID N° 8) o ácidos nucleicos de TE-21 (SEQ ID N° 21 ) antes (es decir, 5' de) y / o después (es decir, 3' de) del gen de interés, prefiriendo una combinación de un ácido nucleico de TE-08 (SEQ ID N° 10) seguido de un ácido nucleico de TE-06 (SEQ ID N° 8) o un ácido nucleico de TE-21 (SEQ ID N° 21 ) antes (es decir, 5' de) del gen de interés.
20. 20. - Vector de expresión eucarionte de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque uno o varios ácidos nucleicos de TE-08 (SEQ ID N° 10) están posicionados antes (es decir, 5' de) y uno o varios están posicionados después (es decir, 3' de) del gen de interés, con preferencia un ácido nucleico de TE-08 antes y uno después.
21. 21. - Vector de expresión eucarionte de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque contiene uno o varios ácidos nucleicos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 distribuido en 2 plásmidos.
22. 22. - Vector de expresión eucarionte de acuerdo con una de las reivindicaciones 15 a 21 , caracterizado porque el marcador de selección es DHFR o Neo tal como, por ejemplo, Neo F240I.
23. 23. - Procedimiento para la preparación de un vector de expresión eucarionte, caracterizado por la integración de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 en un vector de expresión.
24. 24. - Célula huésped eucarionte, caracterizada porque contiene un vector de expresión eucarionte de acuerdo con la reivindicación 15 a 23.
25. 25. - Célula huésped eucarionte de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizada porque hay alta producción de ella, es decir, posee una mayor productividad específica que una célula huésped eucarionte comparable sin elemento TE, en donde esta célula huésped tiene un nivel de expresión aumentado en hasta dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces o diez veces o un nivel de expresión aumentado en más de dos veces, más de tres veces, más de cuatro veces, más de cinco veces, más de seis veces, más de siete veces o más de diez veces, con preferencia hasta cinco veces o más de tres veces.
26. 26. - Célula huésped eucarionte de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque el vector de expresión está integrado en el genoma de forma estable.
27. 27. - Célula huésped eucarionte de acuerdo con una de las reivindicaciones 24 a 26, en donde la célula huésped es una célula de mamífero como, por ejemplo, una célula de CHO, NSO, Sp2/0-Ag14, BHK21 , BHK ??· HaK, 2254-62.2 (derivado de BHK-21), CHO-K1 , CHO-DUKX (= CHO duk", CHO/dhfr ), CHO-DUKX B1 , CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL, con preferencia una célula CHO y con preferencia especial una célula CHO-DG44.
28. 28. - Célula huésped eucarionte de acuerdo con una de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizada porque contiene adicionalmente un gen antiapoptosis como BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1 , A1 , MCL-1 , BOO, BRAG-1 , NR-13, CDN-1 , CDN-2, CDN-3, BHRF-1 , LMW5-HL o CED-9, con preferencia Bcl-xL o BCL-2, con preferencia especial BCL-xL.
29. 29. - Procedimiento para desarrollar una línea celular huésped eucarionte establemente transfectada de alta producción caracterizado por las siguientes etapas: (a) integración de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 en un vector de expresión eucarionte que contiene un gen de interés, (b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión, (c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción.
30. 30. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29 caracterizado por una etapa adicional de amplificación.
31. 31. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29 ó 30 caracterizado por una etapa adicional de clonación.
32. 32. - Procedimiento para la preparación y selección de células de mamíferos recombinantes, caracterizado por las siguientes etapas: (a) transfección de las células huésped con genes que por lo menos codifican una proteína/producto de interés, una neomicina-fosfotransferasa, preferentemente modificada, y el marcador de selección amplificable DHFR, en donde por lo menos el gen (o bien los genes) de interés está unido funcionalmente para el incremento de transcripción o bien expresión con por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14, (b) cultivo de las células en condiciones que permiten una expresión de los distintos genes, (c) la selección de estos genes cointegrados por cultivo de las células en presencia de un medio de selección como, por ejemplo, G418, en medio sin hipoxantina/timidina y (d) la amplificación de estos genes cointegrados por cultivo de las células en presencia de un medio de selección, que permite la amplificación de por lo menos el gen marcador de selección como, por ejemplo, metotrexato.
33. 33. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque las células transfectadas se cultivan en medio sin hipoxantina/timidina, se suplementan con por lo menos 200 pg/mL de G418, preferentemente 400 pg/mL o incluso más G418, en ausencia de suero y con la adición de mayores concentraciones de MTX.
34. 34. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32 ó 33, caracterizado porque la concentración de MTX en la primera etapa de amplificación es de por lo menos 100 nM o de por lo menos 250 nM y se incrementa gradualmente hasta 1 µ? o más.
35. 35. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29 a 34 combinados con un procedimiento para mejorar la glucosilacion de la proteína de interés.
36. 36. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 29 a 35, en donde la célula huésped es una célula de mamífero como, por ejemplo, una célula CHO, NSO, Sp2/0-Ag14, BHK21 , BHK ??'· HaK, 2254-62.2 (derivado de BHK-21 )-, CHO-K1 , CHO-DUKX (= CHO duk", CHO/dhfr ), CHO-DUKX B1 , CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL, con preferencia una célula CHO y con preferencia especial una célula CHO-DG44.
37. 37. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 29 a 36, en donde el vector de expresión contiene un marcador de selección como DHFR o Neo, por ejemplo, Neo F240I.
38. 38. - Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 29 a 37, en donde la proporción de grandes productores está aumentado en hasta dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces o diez veces o más de dos veces, más de tres veces, más de cuatro veces, más de cinco veces, más de seis veces, más de siete veces, más de diez veces, con preferencia hasta cinco veces o más de tres veces.
39. 39. - Procedimiento para preparar un producto biofarmacéutico, caracterizado por las siguientes etapas: (a) integración de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 en un vector de expresión eucarionte que contiene un gen de interés, (b) transfección de una célula huésped eucarionte con este vector de expresión, (c) selección de una célula huésped transfectada de alta producción y (d) cultivo de la célula huésped transfectada obtenida de alta producción en condiciones que permiten una expresión del o de los genes de interés.
40. 40. - Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39 caracterizado por la siguiente etapa adicional: (e) siembra y purificación de la proteína de interés.
41. 41. - Uso de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 en un vector de expresión eucarionte para aumentar la transcripción o bien la expresión de un gen de interés en un sistema de expresión de una célula huésped eucarionte o para preparar un producto biofarmacéutico.
42. 42. - Uso de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 para la generación de animales o plantas transgénicas.
43. 43. - Uso de un ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 en la terapia génica.
44. 44. - Uso de un elemento de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 14 como medicamento o en una composición farmacéutica.
45. 45. - Kit compuesto de ácidos nucleicos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-14, vectores de expresión, células huésped y opcionalmente reactivos de transfección.