TW200815591A - Regulatory nucleic acid elements - Google Patents

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nucleic acid
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cho
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Barbara Enenkel
Kerstin Sautter
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Boehringer Ingelheim Pharma
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Description

200815591 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於稱為TE元件之順式活性核酸序列。TE元 件較佳係源自CHO基因組◊將其用於（例如）穩定細胞群中 之表現载體中可使所要染色體基因座中所關注基因之表現 與先兩所用之載體相比至少高兩倍。 【先前技術】 哺乳動物細胞為產生複雜生物醫藥蛋白質之較佳宿主細 胞，因為轉譯後修飾在功能上及從藥物動力學觀點來看與 人頌相谷。主要相關細胞類型為融合瘤細胞、骨鰱瘤細 胞、CHO(中國倉鼠卵巢）細胞及BHK(幼倉鼠腎）細胞。培 養宿主細胞逐漸在無血清及無蛋白質之產生條件下進行。 其緣由為成本相應降低、純化重組蛋白中之干擾減少及引 入病原體（例如朊病毒及病毒）之可能性降低。使用CH〇細 胞作為宿主細胞變得越來越普遍，因為此等細胞適於懸浮 生長於無血清及無蛋白質之培養基中，而且被調控體視為 及當作安全製造性細胞。 為產生表現所關注異源基因之穩定哺乳動物細胞株，通 吊將異源基因與可選擇標記基因（諸如新黴素磷酸轉移酶 (NPT))—起藉由轉染引入所要細胞株内。異源基因及可選 擇標記基因可在宿主細胞中自個別或單獨經共轉染之載體 起始經表現。轉染後兩至三天，將經轉染之細胞轉移至含 有選擇劑（例如當使用新黴素磷酸轉移酶基因（Νρτ基因）時 為G418)之培養基中，且在此等選擇性條件下培養數週。 120734.doc 200815591 將整合有外源DNA之所得耐藥性細胞分離且用於所要基因 產物（所關注基因）表現之研究。 生物醫藥製造需要具有高穩定產率之細胞株。用於製造 性細胞之表現載體具有諸如CMV增強子及啟動子之較強的 一般組成性表現啟動子及增強子（例如）以便可實現高產量 表現。由於必須在最長可能時間内保證產物之表現，因此 應選擇基因組内已穩定整合產物基因之細胞。此舉可利用 可選擇標記（諸如新黴素磷酸轉移酶（NPT)及二氫葉酸還原 酶（DHFR))來實現。 根據表現載體整合至宿主細胞基因組中之可能性，獲得 具有不同所要基因產物表現量之細胞，因為其表現不僅僅 由上述啟動子之濃度或啟動子/增強子組合之強度來確 定。整合位點處存在之染色質結構可對表現量具有負面與 正面影響。因此，越來越多地將在染色質水平上正面影響 表現的順式活性元件整合至表現載體中。此等元件包括存 在於（例如）β-球蛋白基因之5,區中（Li等人，2002)及TCRa 基因之3’區中之基因座控制區（LCR)。其促使偶聯轉殖基 因在染色質中高組織特異性表現，此表現之特徵為其不取 決於位置而取決於複本數。此等特性表明LCr能夠使其天 然組織中之染色質開放（Ortiz等人，1997)。在各種形式之 β-地中海貧灰症中，球蛋白基因座完整但不表現。缺乏 表現的原因為卜球蛋白基因之5,方向上之嚴重缺失。此β_ 球蛋白LCR之缺失導致遍布整個基因座的封閉染色質構型 且‘致基因表現之抑制（Li等人，2002)。LCR與表現細胞 120734.doc 200815591 染色質中之DNAse I-超敏位點（HS)位置重疊。存在HS亦表 明開放之染色質。HS含有一系列針對轉錄因子之不同的一 般性結合位點及組織特異性結合位點。轉錄因子與DNA相 互作用而產生HS之開放染色質結構（Li等人，2002)。已知 許多LCR係由多個HS組成，HS之功能或多或少彼此有 別。舉例而言，TCRci基因僅在T細胞組織中在内源性控制 下表現。視組織及表現狀況而定，基因座可以各種染色質 模式存在。在3’區中，其具有含8個HS之基因座控制區。 HS 2-6(LCR之6 kb部分片段）具有染色質開放活性且無組 織特異性。HS7、HS 8及HS 1(3 kb)使胸腺中之T細胞特異 性表現具有組織特異性。僅在所有HS之完全組合之情況 下，TCRaLCR才具有完全功能（Ortiz等人，1997)。 TCRaLCR之個別HS功能之更明確的細分及說明可見於 Ortiz等人，1999中。此實例表明LCR在功能上極其複雜且 可由不同控制元件（諸如增強子、靜止子及隔離子）組成。 劃分各種結構域之間LCR功能的其他實例為TCRY基因座及 β-球蛋白基因座。前者係由DNAse I-超敏位點HsA及增強 子3Έ(：γ1組成。亦認為TCRy-LCR除具有其一般功能外亦在 TCRy基因重組中發揮一定作用（Baker等人，1999)。β-球 蛋白基因座具有5種具有可區分功能之HS，其亦需要組織 特異性啟動子以便充分行使功能。由於DN Α甲基化作用導 致封閉之染色質結構且使基因失活，因此LCR亦可能在 DNA之組織特異性去曱基化作用中發揮額外重要作用。藉 由增強組蛋白乙醯化作用來活化基因表現之活化機制亦有 120734.doc 200815591 可能（Li等人，2002)。 骨架/基質結合區（S/MAR)為以高親和力在活體外結合細 胞核之基質或骨架之組份的DNA序列。其形成染色質結構 域之結構性邊界且亦可能形成染色質結構域之功能性邊界 (Zahn-Zabal等人，2001)。S/MAR能夠與增強子相互作用 且能夠局部增加染色質中DNA之可及性，且由此可增加穩 定整合之異源基因在細胞株中、轉殖基因動物及植物中之 表現（Klehr 等人，1991 ; Stief 等人，1989 ; Jenuwein 等 人，1997 ; Zahn-Zabal等人，2001)。然而，其不能完全保 護染色體基因座免受鄰近元件之影響以便可實現位置獨立 性表現（Poljak等人，1994)。MAR之作用可用以增加在轉 染實驗中（高）表現細胞純系或轉殖基因動物之比例 (McKnight等人，1992 ; Zahn-Zabal等人，2001)。然而， 亦有報導MAR不賦予高表現，但在發育特異性基因之正確 調控中發揮重要作用（McKnight等人，1992)。 隔離子定義為相互影響之相鄰區域之間的中性邊界，例 如活性與非活性染色質之間的中性邊界（邊界元件）。其可 限制增強子之作用或隔離與其相抵之整個DNA結構域，且 保護經穩定轉染之報導基因免受位置效應影響（Bell及 Felsenfeld，1999; Udvardy，1999)。因此，此等元件可使 得表現與基因組位置無關。其亦可防止無選擇壓力之情況 下之轉殖基因靜止（Pikaart等人，1998)。隔離子之另一推 測功能為限制複製範圍（Bell及Felsenfeld，1999)。最先被 描述的隔離子為源自果题（Drosophila)之scs及scs1。其構成 120734.doc -10- 200815591 hsp70熱休克基因之邊界且抑制位置效應（Udvardy等人， 1985) 〇 已發現含有CpG島，源自d/z/r基因（中國倉鼠）之富含GC 的片段為另一具有隔離功能之元件（Poljak等人，1994)。 該片段單獨對報導基因表現不呈現任何影響。然而，該片 段位於表現促進SAR與報導基因之間，能夠大體上阻礙 SAR元件之增強表現作用。可能此富含GC的片段阻斷SAR 元件之染色質開放機制且因而充當隔離子。具有伸長CPG 島之元件甲基化之可能性較高，因為其可由使胞嘧啶轉化 成5-甲基胞嘧啶之DNA甲基轉移酶識別。從而形成非活性 染色質（Poljak等人，1994)。 在人類ADA基因（腺苦去胺酶）之第一内含子中，Aronow 與其同事定義一種新的調控元件，其大體上促進取決於基 因複本數但與位置無關之表現（Aronow等人，1995)。該元 件尺寸高達1 kb且僅在其側接200 bp T細胞特異性增強子 時行使功能。若兩個片段中僅有一個存在，或若該等片段 在序列及取向上排列錯誤，則由於此阻礙增強子上DNAse I-超敏位點之形成，該元件無功能性。
Cobra Therapeutics公司在其專利 WO 02/081677 中描述 另一種影響染色質之元件。廣布性染色質開放元件 (IJCOE)是具有廣布性表現之管家基因（人類hnRNP A2基 因、人類β-肌動蛋白基因、人類PDCD2基因）之染色體區 域中形成開放染色質結構之原因。所有此等基因在曱基化 相對較弱之未轉譯區中具有富含CpG之島。CpG島未經曱 120734.doc -11 - 200815591 基化表明此處存在活性染色質。UCOE有助於提供不依賴 於細胞或組織之基因組環境及性質的表現強度。
Immimex公司亦描述可增加表現之順式活性DNA序列 ' (US 6,027,915、US 6,309,851)。稱為表現增強序列元件 、 （EASE)之該元件需要重組蛋白在哺乳動物細胞中之高度表 現，在瞬間表現系統中無活性且不具有可見於LCR及 S/MAR之典型序列特性。由於其不含有開放閱讀框架，因 此其亦不為編碼反式活性蛋白質之序列。該片段長為14.5 • kb，源自CHO細胞之基因組DNA且可使經穩定整合之報導 基因之表現增加8倍。該元件超過50%之活性侷限於1.8 kb 長之片段，而此片段之前600個鹼基對是正確功能所必需 的。具有高EASE活性之序列部分之額外特性為存在多個 HMG-l(Y)結合位點。HMG-I(Y)蛋白屬於高活動性群非組 蛋白染色質蛋白之家族。其亦稱為”結構型轉錄因子”且形 成哺乳動物基因之新類別反式調控子。HMG-I(Y)蛋白識 別富含GC之序列且以小DNA分叉形式與其所謂的AT鉤 ^ (DNA結合結構域）結合。此可導致DNA拓撲發生局部變化 且從而導致基因表現改變。 美國專利6,3 09,841之作者推測EASE之作用與MTX誘導 之經整合質體之擴增有關。在MTX誘導之基因擴增中，存 在所謂的斷裂融合橋循環。易推測HMG-I(Y)蛋白在導致 DNA斷裂形成及移除之DNA結構變化中的作用。 用於增加哺乳動物細胞中基因表現之其他元件描述於 Kwaks等人，2003中。此等所謂的STAR元件（刺激性及抗 120734.doc -12- 200815591 抑制物元件）可由篩檢具有500至21〇〇 bp DNA片段之人類 基因文庫而得到。篩檢使用特定設計之報導質體來進行。 報導基因僅當其與人類基因庫之抗抑制物元件在功能上連 接時才可能表現。以由此所獲得之STAR元件，作者能夠 保護轉殖基因免受哺乳動物細胞基因組中之位置效應影 響。與小鼠基因組之比較表明大部分此等”八尺元件在人 頒基因組與鼠科基因組中均存在，且在此等兩物種内為高 度保守的。 建立鬲度表現所要蛋白質之細胞株的主要問題在於重組 載體隨機及無定向整合至宿主細胞基因組之轉錄活性基因 座或轉錄非活性基因座中。因此，獲得展示完全不同之異 源基因表現率而細胞產率通常遵循正態分布之細胞群。為 鑑別極尚度表現所關注異源基因之細胞純系，因此必需檢 查及測試大量純系，從而導致時間、勞力及成本之高消 耗。因此改良用於轉染之載體系統之努力旨在藉由使用適 當的順式活性元件甚至允許或增強經穩定整合之轉殖基因 之轉錄。在染色質水平發揮作用之順式活性元件包括（例 如）已描述之基因座控制區、骨架_基質結合區、隔離子 荨 些此荨元件保護特定基因免受周圍染色質影響。其 他元件呈現增強子樣活性，但此侷限於經穩定整合之構築 體。另外的元件本身組合數種此等功能。通常不能明顯地 將其確切歸類於特定群組。在穩定細胞株中，轉殖基因產 物基因之表現如此在很大程度上受染色體位置效應制約。 此現象係基於染色質結構之影響及/或在外來dna整合位 120734.doc -13- 200815591 點處存在内在調控元件。此導致表現量差異極大。因此， 在細胞選擇期間，常製得產物表現極低或完全無產物表現 之純系。此等染色體位置效應亦為產生表現高含量治療性 蛋白質之穩定製造性細胞株通常為耗時、高產能且昂貴之 過程之原因。具有高產率之穩定細胞株一般係藉由利用通 苇與誘導基因擴增之藥劑組合之陽性可選擇標記（例如二 氫葉還原酶/甲胺喋呤（meth〇trexate)或麵醮胺酸合成酶/ 甲硫胺酸磺醯亞胺）進行選擇來製得。將用此選擇策略製 得之細胞池及純系以複雜篩檢方法進行高度穩定表現研 究。大部分純系不產生或僅產生平均量之產物而僅有少數 、、、屯系為回產者。混合群中高產者之比例可（例如）藉由可選 擇‘ η己之犬變來增加（Sautter及Enenkei，2005，WO 2004/050884)。然而，需要進一步增加各個別純系之特定 產率以及經轉染之細胞群内高產者之比例。 應增加經穩定轉染之細胞，尤其*CH〇細胞或其他製造 相關性細胞之特定產率及轉染批次中之高產者之比例。此 應形成對更有效率之細胞株研發之最新分析。因此，可在 較短時間内建立更多較高產率之細胞株且從而節省勞力、 時間及成本。 【發明内容】 本發明係關於可使所關注基因在經敎轉染之細胞中之 轉錄或表現增加的稱為"TE元件”之調控核酸，尤其是具有 ㈣ID N。·丨之核酸’或其片段或衍生物。令人驚奇的是 已展不在穩定整合至宿主基因組（諸如CH〇DG44基因組） 120734.doc -14- 200815591 中之表現載體上與啟動子、產物基因、可選擇標記及可選 擇之增強子一起使用此種TE元件（例如）可克服、遮蔽或消 除染色體位置效應。因此，使轉染批次中高產者之比例以 及絕對表現量均增加。 本發明進一步係關於含有以下各物之表現載體：SEQ ID No. 1之轉錄或表現增加區、片段或衍生物，較佳為TE元 件 TE-00(SEQ ID Νο·2)、TE_01(SEQ ID Νο·3)、TE-02(SEQ ID Νο·4)、TE-03(SEQ ID Νο·5)、TE-04(SEQ ID Νο·6)、 TE-06(SEQ ID Νο·8)、TE-07(SEQ ID Νο·9)、TE-08(SEQ ID No.10)、TE-10(SEQ ID Νο·12)、TE-11(SEQ ID Νο·13)、TE-12(SEQ ID Νο·14)。TE-06、TE-07及 TE-08 因 尺寸小而尤其較佳。 SEQ ID No. 1源自位於自CHO-細胞所分離的泛素/S27a 基因之編碼區上游的序列區，該基因編碼細胞核糖體代謝 中之必需蛋白質。 與迄今所用之表現載體相比，將順式活性TE元件額外引 入表現載體中可使經穩定轉染之細胞池，尤其是 CHO-DG44細胞池之產率高出多達7倍。另一方面，在 CHO-DG44細胞池之瞬間轉染中，引入TE元件不能實現產 率提高。因此，在穩定細胞池中所觀測到之產率提高並非 基於存在於TE元件中之增強子。因此，染色體整合是TE 元件引起產率提高所絕對必需的。此表明TE元件可抑制、 遮蔽或消除染色體位置負面效應。因此，已製造且鑑別特 徵在於特別適用於選擇及富集高產細胞且因此能夠減少分 120734.doc • 15· 200815591 離及鑑別高產純系中時間、成本及產能之消耗的順式活性 元件。 本發明之可能應用包括研發（例如）製造生物醫藥、基於 細胞之分析性檢定、高產量物質篩檢或製造用於NMR光譜 分析、其他檢定之重組蛋白產物等中所需要之高產細胞 株。由於較高之特定產率及幾乎不表現或不表現產物之細 胞減少，因此可在較短時間内建立更多較高產率之細胞株 從而節省勞力及成本。其他可能應用為製造經穩定改良之 宿主細胞株（例如，引入抗細胞凋亡或糖基化基因）、轉殖 基因動物或植物及在基因治療中之應用。 本發明並非來源於先前技術。 具有SEQ ID No· 1之核駿為自中國倉鼠（Cr/ceiw/ws grhews)基因組份離之核酸序列。其來自位於泛素/S27a基 因之編碼區上游的序列區。 具有SEQ ID No.1之核酸具有44%之平均GC含量且不含 有任何冗長的GC重複序列段。此GC含量與針對哺乳動物 基因組DNA所述之約40%之平均GC含量相當（Delgado等 人，1998)〇
具有SEQ ID Νο·1之核酸部分已描述於WO 97/15664中： SEQ ID No. 1之核苷酸1579至3788對應於WO 97/15664中 之SEQ ID Νο·5之核苷酸1至2201，但有差異。在根據本發 明之SEQ ID No.l製備期間，將4個額外核苷酸藉由選殖方 法引入，此由填補現存ECORI切割位點之反應來形成。此 額外4個核苷酸之插入發生於WO 97/15664中之序列SEQ 120734.doc -16- 200815591 ID Νο·5之核苷酸357與358之間。然而，本發明之具有SEQ ID No· 1之核酸序列之核苷酸1至1578組成新穎的迄今未知 之序列區，其在本發明之範圍為經分離的。此外，WO 97/15664未揭示本發明之SEQ ID No.l或其片段或衍生物 在與使得功能上連接之所關注基因可轉錄之啟動子/增強 子組合在功能上連接時可增加所關注基因之轉錄或表現， 而此與染色體整合位點無關。更確切言之，WO 97/15664 揭示使用泛素/S27a基因之5’UTR序列作為啟動子，而根據 WO 97/15664中圖5之位置-161至-45之序列區是啟動子活 性所必需的。此序列區僅部分存在於本發明之SEQ ID No.l之核酸及自其衍生而得具有SEQ ID Νο·2之片段（根據 WO 97/15664 中圖 5之位置-161 至-89)中。SEQ ID No.l 之其 他片段及衍生物完全不含此序列區。此外，當使用標準比 對演算法（諸如BLAST)時，本發明之SEQ ID No. 1之核酸 不與以下專利申請案中所述之核酸序列展示出序列同源 性，以下序列亦可以順式在染色質水平正面影響表現： a) WO 00/05393中之UCOE核酸序列 b) US 6,309,841中之EASE核酸序列 c) WO 03/004704中之STAR核酸序列。 【實施方式】 本發明說明書範圍内所使用之術語及命名具有下文中所 定義之以下含義。一般術語’’含有”包括更具體術語’’由…組 成"。此外，無限制性使用術語’’單數”及π複數”。 術語ΠΤΕ元件"表示調控核酸。 120734.doc -17- 200815591 術語”ΤΕ元件”或"表現增強元件"或"轉錄增強元件"或，，表 現或轉錄增強核酸元件"在本文中以同義使用。此等術語 均指調控核酸序列。 特定言之，"ΤΕ元件”或”表現增強元件"或"轉錄增強元 件”或”表現或轉錄增強核酸元件，，意謂自中國倉鼠 (CWceiiz/似 基因組份離之序列m Ν〇. (包括其互 補序列），或其任何部分、片段或區域，或序列m N〇e i之 衍生物或其部分、片段或區域之一，當其穩定整合至染色 體中日守可使所關注基因之轉錄或表現增加。亦意謂序列ID No. 1之部分、片段、區域或衍生物之任何所要組合，其 係由多種相同或不同之SEq ID n〇_ 1之部分、片段、區域 或何生物組成，而各組份又可以任何所要取向且以任何所 要彼此相對間距排列或可與其他調控序列組合且可使所關 注之基因之轉錄或表現增加。術語了£元件可指SEQ ΐβ n〇. 1本身及其任何所要片段、部分、區域或衍生物。 此外，術語"TE元件"、"轉錄增強或表現增強核酸元件，， 或其片段、部分、區域或衍生物除中國倉鼠 序列之部分外亦涵蓋源自其他生物體之相應功能 性同源核苷酸序列。此等其他生物體之實例包括人類、小 鼠、大鼠、猴及其他哺乳動物及齧齒動物、爬行動物、鳥 類、魚類及植物。 片段’’或"部分"或"區域”乂此等術語以同義使用）意謂序 列與SEQ ID No. i或其互補序列之部分1〇〇%一致之核酸分 子（單股或雙股）。已知選殖藉由限制酶消化或藉由pCRm 120734.doc -18 - 200815591 製得之片#又可引起該片段末端區中之修飾，亦即添加或缺 失核苦酸或經由引子另外引人核：g：酸，此為填補反應或斷 裂反應之結果。片段之定義包括片段末端區中之此等變 異’即使此等序列區與SEQ ID Νο· 1之序列一致性小於 100%。序列ID No· k ”部分，，或，，片段，，或，，區域，，包括（例 如）ΤΕ-00(序列 ID No 2)、te_〇1(序列 ID Νο· 3)、τε·〇2(序 列 ID No· 4)、TE_03(序列 ID No· 5)、TE-04(序列 ID No· 6)、TE-05(序列 ID No. 7)、TE-〇6(序列 ID No· 8)、 丁£-07(序列1〇]^〇.9)、丁£-08(序列1〇如.10)、1^09(序列 ID No· 11)、TE_10(序列 ID ν〇· 12)、TE_U(序列 m N〇 13)、TE-12(序列 ID No· 14)、TE-13(序列 ID No. 15)、 TE_14(序列 ID No· 16)、TE-15(序列 ID No· 17)、TE-16(序 列 ID No· 18)、TE-17(序列 ID No· 19)、TE-18(序列 ID Νο· 2〇)。較佳地，片段經穩定染色體整合後可使得功能上連 接之所關注基因之轉錄或表現增加。可使所關注基因之轉 錄或表現增加之序列ID Νο· !之，，部分”或"片段，，或”區域"例 如為 ΤΕ-00(序列 ID No· 2)、TE-01(序列 id No· 3)、 TE-02(序列 ID No· 4)、TE-03(序列 ID Ν〇· 5)、TE-04(序列 ID No· 6)、TE-06(序列 ID No, 8)、TE-〇7(序列 id Νο· 9)、 TE-08(序列IDNo·10)、TE-10(序列IDNO.12)、TE-ll(序 列 ID No. 13)、TE-12(序列 ID No· 14)。然而，術語，，片段，， 亦包括可使所關注基因之轉錄或表現增加的任何所要取向 之SEQ ID No· 1之其他所有可能部分，尤其是完全或至少 部分處於TE-00(SEQ ID No· 2)之5,區中之部分。此對應於 120734.doc -19- 200815591 SEQ ID No· 1中介於1 bp與1578 bp之間的部分區域。片段 TE-08(SEQ ID No. 10)亦較佳。 在本發明中，"衍生物”意謂與SEQ ID No· 1或其互補序 列或與SEQ ID No. 1之部分或片段或區域或其互補序列具 有至少70%之序列一致性，較佳至少約80%之序列一致 性，尤其較佳至少約90%之序列一致性且最佳至少約95% 之序列一致且經染色體整合後可使所關注基因之轉錄或表 現增加之核酸分子（單股或雙股）。在一方面，與SEQ ID No· 1之序列差異可基於源自其他生物體之同源内源性核 苷酸序列之差異。另一方面，其亦可基於核苷酸序列之有 意修飾，例如至少一或多個核普酸之取代、插入或缺失。 缺失、插入及取代突變體可藉由”定點誘變’’及/或"基於 PCR之誘變技術”來製得。相應方法（例如）已由Lottspeich 及Zorbas描述（1998 ;第36·1章及其他參考文獻）。可使用 所謂的標準比對演算法，諸如nBLAST’’（Altschul，S.F. Gish，W.，Miller, W·，Myers，E.W_ & Lipman，D.J. (1990) nBasic local alignment search tool·1 J. Mol. Biol. 215:403-410; Madden，T.L·，Tatusov，R.L. & Zhang，J. (1996) Applications of network BLAST server11 Meth. Enzymol. 266:131-141; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation” Genome Res. 7:649-656)，使得序列一致性符合參考序列 (在此情況下為序列ID No· 1)。序列在其連續性相對應時 120734.doc -20- 200815591 達成相符且可使用標準比對演算法來鑑別。 根據本發明，"衍生物”意謂與SEQ ID N〇· i或與seq⑴ No· 1之片段或部分或區域之序歹^其互補序列雜交的核 。 酸分子（單股或雙股）。較佳地，雜交係在嚴格雜交及洗滌 " 條件（例如，在65°C下含有5x SSC之緩衝液中雜交；在42。〇 下用〇·2χ SSC/0.1% SDS洗滌）下進行。相應技術描述於（例 如）Ausubel等人，1994中。較佳地，SEQ ID N〇. j之部分 或片段或區域包括所有或至少部分核苷酸位置1卟與1578 鲁 bP之間的序列區。此對應於ΤΕ-00序列（SEQ ID No· 2)之5, 序列區。片段TE-08(SEQ ID No· 10)亦較佳。 術語”變異體”係指用於特定轉染混合物中之表現載體。 此等載體包括基本栽體（PTE4/MCP_1或PTE5/MCP-1)或基 本載體組合（PBING-LC+pBID-HC)以及含有一或多個不同 位置、組合及取向之TE元件之基本載體。 在引子之情況下，術語”取向"係指引子相對於SEQ m No· 1之排列。所有序列順序與SEQ id Νο·1所示之5·_3,順 • 序之序列一致的引子（=前置引子）均與此序列取向相同， 此亦稱為順向"。序列順序與SEQ ID Νο·1所示之序列互 補的引子（=反置引子）與此序列取向相反，此亦稱為，，逆 向"。在本發明中，與ΤΕ元件相關之術語”取向”係指相對 於所關注基因之排列。SEQ ID No· 1所示之序列表示位於 泛素/S27a基因之編碼區之5’（亦稱為”上游”）的基因組序 列。 SEQ ID Νο·1中所示之此序列沿其後泛素/S27a基因之編 120734.doc -21 - 200815591 馬區之方向延伸可達此基因之起始密碼子。此排列因此稱 為’’順向"。類似地，在本發明中，當SEQ ID N〇1中所示 之序列或其任何所要部分、片段、區域或衍生物在表現載 體中與所關注基因之起始密碼子存在於相同DNA股上時， ~ ΤΕτο件處於順向。相反，若與SEQ ID Ν〇ι或其任何所要 邓刀、片段、區域或衍生物互補之序列在表現載體中與所 關注基因之起始密碼子存在於相同DNA股上時，則元件 處於逆向。除非另有說明，否則當提及TE元件時，總是 • 包括/意謂兩種取向，亦即順行與逆向。 木色體整合’’意謂將任何所要核酸序列整合至細胞之基 因組（亦即染色體）中，此整合為視情況以任何所要數目、 位置及取向整合至一或多個染色體中。此外，術語"染色 體整合"亦包括將任何所要核酸序列整合至合成染色體、 人造染色體或微型染色體中。 所關注之基因： # 、本發明之表現載體中所包含之所關注基因包含編碼所關 注產物之任何長度的核苷酸序列。基因產物或"所關注之 產物"通常為蛋白質、多肽、肽或片段或其衍生物。然 而，其亦可為RNA或反義RNAe所關注之基因可以其全長 形式、縮短形式、融合基因形式或經標記基因形式存在。 其可為基因組DNA，或較佳為cDNA，或相應片段或融合 體。所關注之基因可為天然基因序列，或其可經突變或： 另外修飾。該等修飾包括密碼子最優化（以適應特定宿主 細胞）及人源化。所關注之基因可（例如）編碼分泌型 '細胞 120734.doc -22· 200815591 質、核定位、膜結合或細胞表面結合之多肽。 術語”核苷酸序列”或”核酸序列’’表示寡核苷酸、核苷 酸、聚核苷酸及其片段，以及以單股或雙股形式存在且可 代表基因之編碼股或非編碼股之基因組或合成來源之DN A 或RN A。核酸序列可使用標準技術進行修飾，標準技術諸 如定點誘變或PCR介導之誘變（例如，Sambrook等人， 1989或Ausubel等人，1994中所述）。 ”編碼’’意謂核酸中之特定核苷酸序列（例如染色體或 mRNA中之基因）在生物過程中充當其他聚合物及巨分子 (諸如rRNA、tRNA、mRNA、其他RNA分子、cDNA或多 肽）之合成基質的特性或能力。因此，若所要蛋白質係藉 由某mRNA之轉錄及後續轉譯在細胞或其他生物系統中產 生，則該基因編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一 致且通常亦可獲得於序列資料庫（例如EMBL或GenBank)之 編碼股以及充當轉錄基質之基因或cDNA之非編碼股均可 稱為編碼產物或蛋白質。編碼蛋白質之核酸亦包括基於簡 幷遺傳密碼具有不同順序之核苷酸序列但可產生蛋白質之 相同胺基酸序列的核酸。編碼蛋白質之核酸序列亦可含有 内含子。 術語ncDNA”表示藉由自mRNA或其他由基因產生之RNA 逆轉錄及合成第二DNA股而製得之去氧核糖核酸。若 cDNA以雙股DNA分子形式存在，則其含有編碼股與非編 碼股。 術語”内含子”表示具有任何長度之非編碼核苷酸序列。 120734.doc -23- 200815591 其天然存在於多種真核基因中且可藉由稱為剪接之方法自 預先轉錄之mRNA前驅物中消除。此需要準確切除5•端及3, 端處之内含子且正錢接所形成之❿财末端以產生且有 正確閱讀框架以便達成成功蛋白質合成之經成熟處理之 mRNA。許多與此剪接過程相關之剪接供體及剪接接受體 位點(亦即恰位於外顯子_内含子或内含子_外顯子界面處之 序列）迄今已得到表徵。可回顧參見〇hshima等人⑽7。 所關注之蛋白質/產物
/有生物醫藥重要性之蛋白f/多肽例如包括（但不限於） 抗體、酶、細胞激素、淋巴激素、黏著分子、受體及其衍 生物或片&。通系’可使用充當促效劑或拮抗劑及/或呈 有治療性或診斷性應用的所有多肽。其他所關注之蛋白質 例如為（但不限於）在所謂的"細胞工程"範圍内用於改㈣ 主細胞特性之蛋白質/多肽，諸如抗細胞阔亡蛋白、伴隨 蛋白、代谢酶、糖基化酶及其衍生物或片段。 術語"多肽"係用於胺基酸序列或蛋白質且係指具有任何 長度之胺基酸聚合物。此術語亦包括藉由諸如糖基化、磷 酸化、乙醯化或蛋白加以反應經轉譯後修飾之蛋白質。 多肽之結構可在保留其生物活性的同時（例如 >藉由取^、 缺失或插入胺基酸及與其他蛋白質融合來修飾。此外，多 肽可多聚化且形成同聚體及異聚體。 夕 治療性蛋白質之實例為騰島素、胰島素樣生長因子、人 類生長激素（hGH)及其他生長因子、受體、組織血纖 白溶解酶原活化因子（tPA)、紅血球生成素（Ep〇)、細胞激 120734.doc -24- 200815591 素（例如白細胞介素（IL)，諸如IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-13、IL-14、IL_15、IL-16、IL-17、IL-18)、干擾素 (IFN)-a、干擾素-β、干擾素_γ、干擾素-Ω或干擾素-τ、腫 瘤壞死因子（TNF)(諸如 TNF-a、TNF-β 或 TNF-γ)、TRAIL、 G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1 及 VEGF。其他實例為 單株抗體、多株抗體、多特異性抗體及單鏈抗體及其片 段，諸如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fc及Fc，片段、免疫球蛋白 輕鏈（L)及重鏈（Η)及其恆定區、可變區或高變區以及Fv及 Fd片段（Chamov等人，1999)。抗體可為人類或非人類起 源。人源化抗體及嵌合抗體亦可。
Fab片段（抗原結合片段=Fab)係由經相鄰恆定區連接在 一起之雙鏈之可變區組成。其可（例如）自習知抗體藉由用 蛋白酶（諸如木瓜酶）處理或藉由DNA選殖而產生。其他抗 體片段為F(ab’)2片段，其可藉由用胃蛋白酶進行蛋白水解 消化來產生。 藉由基因選殖亦可製備僅由重鏈（VH)及輕鏈（VX)之可變 區組成的縮短抗體片段。此等片段稱為！^片段（片段可變 區=可變區部分之片段）。由於在此等Fv片段中不可能經由 恒定鏈之半胱胺酸基團形成共價鍵，因此其通常藉由某些 其他方法達成穩定。為此，重鏈與輕鏈之可變區通常藉助 於約10至30個胺基酸，較佳15個胺基酸之短肽片段連接在 一起。由此產生VH與VL經肽連接子連接在一起的單一多 狀鏈。該等抗體片段亦稱為單鏈Fv片段（scFv)。scFv抗體 120734.doc -25- 200815591 之實例是已知的且已有描述，例如參見Hust〇n等人， 1988 〇 在過去數年中已研發多種用於製備多聚scFv衍生物之策 略。目的旨在製備具有經改良之藥物動力學特性及增加之 結合親和力之重組抗體。為達成^^片段之多聚化，將其 製成具有多聚化結構域之融合蛋白。多聚化結構域可例如 為IgG之CH3區或螺旋結構（"捲曲螺旋結構"），諸如白胺酸 拉鏈結構域。在其他策略中，利用scFv片段之VH區與vl 區之間的相互作用實現多聚化（例如，雙功能抗體、三功 能抗體及五功能抗體）。 術語”雙功能抗體"在此項技術中用於表示二價同二聚 scFv衍生物。藉由疊合VH/VL鏈使scFv分子中之肽連接子 縮短為5至10個胺基酸而形成同二聚體。雙功能抗體另外 可經由所插入之二亞硫酸根橋達成穩定。雙功能抗體之實 例可見於文獻中，例如Perisic等人，1994。 術語”微型抗體”在此項技術中用於表示二價同二聚scFv 衍生物。其係由融合蛋白組成，該融合蛋白含有作為二聚 化區之免疫球蛋白（較佳IgG，最佳IgGl)之CH3區。此區藉 助於亦為IgG之鉸鏈區及連接子區與scFv片段連接。該等 微型抗體之實例已由Hu等人，1996描述。 術語”三功能抗體π在此項技術中用於表示三價同三聚 scFv衍生物（Kortt等人，1997)。VH-VL直接融合而不使用 連接子序列可形成三聚體。 此項技術中稱為微抗體的具有二價、三價或四價結構之 120734.doc -26- 200815591 片段亦為scFv片段之衍生物。多聚化係藉助於二聚、三聚 或四聚捲曲螺旋結構達成（Pack等人，1993及1995 ; Lovejoy等人，1993)。 編碼螢光蛋白之基因： 在另一實施例中，本發明之表現載體含有與所關注基因 在功能上連接之編碼螢光蛋白之基因。較佳地，兩種基因 在單一異源啟動子控制下轉錄使得所關注之蛋白質/產物 與螢光蛋白由雙順反子mRNA編碼。此使得可藉助於螢光 蛋白之表現率鑑別大量產生所關注蛋白質/產物之細胞。 或者’編碼螢光蛋白之基因之轉錄可在其自身啟動子之控 制下進行。 螢光蛋白可為（例如）綠色、藍綠色、藍色、黃色或其他 顏色之螢光蛋白。一特定實例為自水母Wciorz’a) 或海腎CRemV/a 獲得之綠色螢光蛋白（GFP)及由 其所形成之突變體；例如參見Bennet等人，1998 ; Chalfie 等人’ 1994 ; WO 01/043 06及其中所引用之文獻。
其他螢光蛋白及其編碼基因描述於WO 00/34318、WO 00/34326、WO 00/34526及 WO 01/27150中，該等專利以引 用的方式併入本文中。此等螢光蛋白為珊瑚蟲綱 (dni/zozoa)物種之非生物發光生物體之螢光團，該等生物 體例如海葵mayawo)、羽珊瑚（CVavw/ark 印·)、 花群海葵 I(Zoanthus sp· Γ) ' 花群海葵 U(Zoanthus sp. II)、 白花蒜珊瑚（D/scwowa 、"紅色"圓盤擬珊蝴海葵 (D/scoMma印· "red")、”綠色"圓盤擬珊蝴海葵、π洋紅色” 120734.doc •27· 200815591 圓盤擬珊瑚海葵、溝迎風海葵以⑽⑽/⑽仏）、青色多 管水母〇 根據本發明所使用之螢光蛋白除野生型蛋白質外亦含有 天然或經基因工程設計之突變體及變異體、其片段、衍生 - 物或變異體，其（例如）已與其他蛋白質或肽融合。所使用 之突變可（例如）改變激勵或發射光譜、發色團之形成、蛋 白質之消光係數或穩定性。此外，可藉由密碼子最優化改 良在哺乳動物細胞或其他物種中之表現。根據本發明，螢 _ 光蛋白亦可以與可選擇標記，較佳可擴增之可選擇標記 (諸如二氫葉酸還原酶（DHFR))融合之形式使用。 螢光蛋白所發射之螢光使得可（例如）藉由流式細胞計數 法使用螢光活化細胞分選儀（FACS)或藉由螢光顯微法偵測 蛋白質。 其他調控元件： 表現載體含有至少一種異源啟動子，其使得所關注之基 修 因可表現且較佳亦使得螢光蛋白可表現。 術語"啟動子”表示允許且控制與其在功能上聯接之基因 或序列之轉錄的聚核苷酸序列。啟動子含有結合RNA聚合 酶之識別序列及轉錄起始位點。為在特定胞類型或宿主細 胞中表現所要序列，必須選擇適當的功能性啟動子。熟習 此項技術者熟悉各種來源之多種啟動子，包括組成性啟動 子、誘導性啟動子及可抑制性啟動子。其寄存於諸如 GenBank之資料庫中，且可以單獨元件或選殖於聚核苷酸 序列内之元件之形式自商業或個人來源獲得。在誘導性啟 120734.doc -28- 200815591 動子中，啟動子之活性可回應於信號而減弱或增強。誘導 性啟動子之一實例為四環素（tet)啟動子。此啟動子含有可 由四環素調控之反式活化蛋白（tTA)誘導之四環素操縱序 • 列（tet0)。在四環素存在下，tTA與tetO之結合受到抑制。 • 其他誘導性啟動子之實例為jun、f0S、金屬硫蛋白及熱休 克啟動子（亦參見Sambrook等人，1989 ; Gossen等人， 1994) 〇 尤其適用於在真核細胞中促成高表現之啟動子包括（例 春 如）倉鼠之泛素/S27a啟動子（WO 97/15664)、SV 40早期啟 動子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白啟動 子、勞斯（Rous)肉瘤病毒之長末端重複區、人類細胞巨大 病毒之早期啟動子。其他異源哺乳動物啟動子之實例為肌 動蛋白、免疫球蛋白或熱休克啟動子。 相應異源啟動子可與其他調控序列在功能上聯接用以增 強/調控表現序列盒中之轉錄活性。 • 舉例而言，啟動子可與增強子序列在功能上連接用以增 強轉錄活性。對此，可使用一或多個增強子及/或增強子 序列之數個複本，例如CMV或SV40增強子。因此，在另 一實施例中，本發明之表現載體含有一或多個增強子/增 強子序列，較佳為CMV或SV40增強子。 術語增強子表示以順式方位仙於啟動子活性且從而刺 激與此啟動子在功能上聯接之基因之轉錄的聚核普酸序 列。與啟動子不同，增強子之作用不依賴於位置及取向， 且因此其可定位於轉錄單元之前或之後、内含子内或甚至 120734.doc -29- 200815591
編碼區内。增強子可定位於緊鄰轉錄單元且遠離啟動子。 其亦可與啟動子具有實體性及功能性重疊。熟習此項技術 者瞭解來自各種來源（及寄存於諸如GenBank之資料庫中） 之多種增強子，例如SV40增強子、CMV增強子、多瘤病 毒增強子、腺病毒增強子，該等增強子可以獨立元件或選 殖於聚核苷酸序列内之元件之形式獲得（例如寄存於atcc 或來自商業及個人來源）。多種啟動子序列亦含有增強子 序列，諸如常用之CMV啟動子。人類CMV增強子是迄今 為止所鑑別的最強增強子之一。誘導性增強子之一實例為 金屬硫蛋白增強子，其可由糖皮質激素或重金屬刺激。 其他可能的修飾例如為引入多個Spl結合位點。亦可使 啟動子序列與使得可控制/調控轉錄活性之調控序列組 合。因此，可使得啟動子具有可抑制性/誘導性。此可（例 如）藉由與為上調或下調轉錄因子之結合位點的序列連接 來完成。舉例而言，上述轉錄因子Spl對轉錄活性具有正 面作用。實例為活化蛋白AP1之結合位點，活化蛋白 API可對轉錄起到正面與負面作用。Αρι之活性可由各種 因子（諸如生長因子、細胞激素及血清）控制等人， 1992及其中所引用之參考文獻）。亦'可如下增加轉錄效 率：藉由使-處、兩處 '三處或三處以上驗基突變（取 代、插入或缺失）來改變啟動子序列，且接著以報導基因 檢定判定此突變是否增強啟動子活性 額外調控元件主要包括異源啟動子 及多聚腺努酸化信號及其他表現控制 、增強子、終止信號 元件。用於各種細胞 120734.doc • 30 - 200815591 類型之誘導性及組成性調控序列均為已知的。 轉錄调控元件"通常包含待表現基因序列上游之啟動 子、轉錄起始位點及終止位點及多聚腺苷酸化信號。 ‘ 術語"轉錄起始位點”係指構築體中與併入初級轉錄物（亦 ‘ 即mRNA前驅物）中之第一核酸相對應的核酸。轉錄起始位 點可與啟動子序列重疊。 術語”轉錄終止位點”係指通常位於所關注基因或待轉錄 基因部分之3’端且經由rNa聚合酶使轉錄終止之核苷酸序 鲁列。 ”多聚腺苷酸化信號”為在真核mRNA 3,端之特定位點處 引起斷裂且在斷裂之3,端轉錄後併入約ι〇〇_2〇〇個腺嘌呤核 苷酸之序列（polyA尾）的信號序列。多聚腺苷酸化信號包含 斷裂位點上游約1 〇-30個核苷酸處之序列AATAAA及位於下 游之序列。已知多種多聚腺苷酸化元件，諸如tk p〇lyA、 SV40晚期及早期p〇iyA 或 BGH polyA(例如 US 5，122,458 中 所述）。 "轉譯調控元件”包含用於各待表現多肽之轉譯起始位點 (AUG)、終止密碼子及ρ〇1γΑ信號。對達成最佳表現，可 合理移除、添加或改變待表現核酸序列之5，_及/或3，_未轉 譯區以 >肖除任何潛在不適當的額外轉譯起始密碼子或其他 可能在轉錄量或表現量上影響表現之序列。或者，為促進 表現’可在起始密碼子之上游緊鄰插入核糖體一致結合仇 點。為產生分泌型多肽，所關注之基因通常含有編碼將合 成多肤轉運至且穿過ER膜之信號前驅肽的信號序列。信號 120734.doc -31 - 200815591 序列通常但不總是位於分泌型蛋白質之胺基末端，且在蛋 白質經由ER膜過濾後由信號肽酶裂解。基因序列通常但非 必定含有其自身信號序列。若不存在天然信號序列，則可 ^ 以已知方式引入異源信號序列。多種此類信號序列已為熟 • 習此項技術者所知且寄存於諸如GenBank及EMBL之序列 資料庫中。 另一種調控元件為内部核糖體進入位點（IRES)。IRES元 件包含獨立於5，-端甲基鳥苷帽（帽結構）及上游基因在功能 籲 上活化轉譯起始且在動物細胞中使得可自單一轉錄物轉譯 兩個順反子（開放閱讀框架）之序列。IRES元件提供獨立的 核糖體進入位點用於轉譯緊鄰位於下游之開放閱讀框架。 與可為多順反子性之細菌mRNA(亦即，其可編碼由mRNA 相繼轉譯的多種不同多肽或產物）相比，大部分動物細胞 之mRNA為單順反子的且僅編碼一種蛋白質或產物。在真 核細胞中之多順反子轉錄物之情況下，轉譯可自上游最近 _ 之轉譯起始位點起始且由第一終止密碼子終止，之後轉錄 物可自核糖體中釋放。因此，在轉譯期間僅產生由mRNA 編碼的第一多肽或產物。相比而言，具有與轉錄物中之第 二或後續開放閱讀框架在功能上連接之IRES元件的多順反 子轉錄物允許隨後轉譯位於IRES元件下游之開放閱讀框架 從而在真核細胞中產生兩種或兩種以上由相同轉錄物編碼 之多肽或產物。 IRES兀件可具有多種長度及多種來源且可（例如）源自腦 心肌炎病毒（EMC V)或其他小核糖核酸病毒。多種仪烈序 120734.doc -32- 200815591 列及其在載體構築中之用途已描述於文獻中，例如參見 Pelletier 等人，1988 ; Jang等人，1989 ; Davies 等人， 1992 ; Adam 等人，1991 ; Morgan 等人，1992 ; Sugimoto 等人，1994 ; Ramesh等人，1996 ; Mosser等人，1997。 使位於下游之基因序列與IRES元件之3’端在功能上連 接，亦即將間距選擇成使得基因之表現不受影響或僅受微 小影響或對於預定目的而言具有足夠的表現。IRES元件與 位於其下游之基因之起始密碼子之間的可允許足夠表現的 最佳距離可藉由簡單實驗藉由改.變間距且使用報導基因檢 定測定隨間距變化之表現率來判定。 藉由所述方法可獲得對於異源基因產物之表現具有重要 價值的最佳表現序列盒。因此，藉助於一或多種該等方法 所獲得之表現序列盒為本發明之另一目標。 倉鼠-泛素/S27a啟動子： 在另一實施例中，本發明之表現載體含有倉鼠之泛素/ S27a啟動子，其較佳係功能性連接至所關注之基因上，且 甚至更佳係功能性連接至所關注之基因及編碼螢光蛋白或 可選擇標記之基因上。 倉鼠之泛素/S27a啟動子為WO 97/15664中所描述之強效 同源啟動子。該啟動子較佳具有以下特徵中之至少一者： 富含GC之序列區、Spl結合位點、多嘧啶元件、無TATA 盒。具有Spl結合位點但無TATA盒之啟動子尤其較佳。可 經組成性活化且尤其在含jk清、低金清及無血清之細胞培 養條件下具有相等活性之啟動子亦較佳。在另一實施例 120734.doc -33 - 200815591 中，其為誘導性啟動子，尤其為可藉由移除血清而活化之 啟動子。 尤其有利之實施例為具有w〇 97/15664之圖5中所含之核 ^ 苷酸序列的啟動子。含有圖5中位置_161至_45之序列的啟 - 動子序列尤其較佳。 本專利說明書之實例中所使用之啟動子各含有具有對應 於WO 97/15664之圖5中之片段_372至+111之序列的以^八分 子且代表較佳啟動子，亦即較佳啟動子應併入有此序列 區 本發明之表現載體之製備 本發明之表現載體理論上可藉由此項技術中已知之習知 方法，例如Sambrook等人（1989)所述之方法來製備。 Sambrook亦描述載體之功能性組份，例如適當的啟動子 (除倉鼠泛素/S27a啟動子外）、增強子、終止信號及多聚腺 苷酸化信號、抗生素耐性基因、可選擇標記、複製起點及 鲁 剪接信號。可使用習知選殖載體製備其，例如質體、噬菌 體、噬菌粒、黏質體或病毒載體（諸如桿狀病毒、逆轉錄 病毒、腺病毒、腺相關病毒及單純疱療型病毒）以及合成 或人造染色體/微型染色體。真核表現載體通常亦含有原 核序列’諸如使得载體可在細菌中複製及選擇之複製起點 及抗生素耐性基因。已知多種含有用於引入聚核苷酸序列 之多選殖位點的真核表現載體，且有些載體可購自各公 司，諸如 Stratagene，La Jolla，CA，USA ; Invitrogen，
Carlsbad，CA，USA ; Promega，Madison，WI，USA 或 bd 120734.doc -34- 200815591
Biosciences Clontech，Palo Alto, CA，USA。
舉例而言，可以熟習此項技術者熟悉之方式將異源啟動 子、所關注之基因、可選擇標記及可選擇之編碼螢光蛋白 之基因、額外調控元件（諸如内部核糖體進入位點（jres)、 均強子、多聚腺苷酸化信號及諸如TE元件之其他順式活性 几件）引入表現載體。本發明之表現載體至少含有異源啟 動子、所關注之基因及TE元件。較佳地，表現載體亦含有 編碼螢光蛋白之基因。根據本發明尤其較佳使用泛素/ S27a啟動子作為異源啟動子。異源啟動子（較佳泛素 啟動子）、所關注之基因及TE元件在功能上連接在一起或 在功能上連接之表現載體尤其較佳。 在本說明書之範圍内，術語，，功能性連接”或"在功能上 連接”係指兩個或兩個以上定位成使其可執行各自預定功 能之核酸序列或部分序列。舉例而言，啟動子/增強子、 啟動子/ΤΕ το件或啟動子/增強子/TE元件貞編碼基因序列 在功能上連接之條件為其能夠以順式位置控制或調節連接 基=序列之轉錄。通常（但非必定），功能上連接之舰序 ^罪近在起’且若兩個編碼基因序列連接或在分泌信號 私列之情況下處於相同閱讀框架中M盡管功能上連接之啟 子通常位於編碼基因序列之上游，但其並非必須靠近該 因Li增強子不必靠近任—者，限制條件為其應有助於基 之上：轉錄或表現。為此目的，增強子可位於基因序列 :下游，可與該序列相隔一定距離。多刪酸化 七、基因序列在功能上連接之條件為其以一定方式位於 120734.doc -35- 200815591 基因序列之3,端使得轉錄經由編碼序列前進至多聚腺普酸 ，號可根據習知重組方法，例如藉由pcR技術、藉由 適田限制性切tl位點處之接合或藉由剪接實現連接。若無 適當的限制性㈣位點可用，則可以本身已知之方式使用 合成性养核苷酸連接子或銜接子。
在所述實施例之-中，異源啟動子（較佳泛素/S27a啟動 子或CMV啟動子)、所關注之基因及編碼螢光蛋白之基因 在力月b上連接在-起。此意謂（例如）所關注之基因與編碼 螢光蛋白之基因自相同異源啟動子起始經表現。在一尤直 較佳之實施例中’功能性連接經由刪元件而發生使得： 兩基因合成雙順反子mRNAe本發明之表現載體可另外含 有在功能上作用於-或多個啟動子之增強子元件及/或以 元件。異源啟動子（較佳泛素/82域動子或其修飾形式或 CMV啟動子）與增強子元件（例如SV4〇增強子《cmv增強子 元件）及TE元件連接之表現載體尤其較佳。 表現載體内基因之表現基本上可自一或多個轉錄單元起 始進行。術語轉錄單元定義為含有—或多個待轉錄基因之 區域。轉錄單元内之基因以―定方式在功能上彼此連接使 得該單元内之所有基因均處於相同啟動子、啟動子/增強 子或啟動子/增強子/TE元件之轉錄控制下。由於此基：轉 錄連接，可由轉錄單元轉錄—種以上蛋白f或產物且從而 使其得以表現。各轉錄單元含有其中所含基因序列之轉錄 及轉譯所必需的調控元件。各轉錄單元可含有相同或不同 的調控元件° IRES元件或内含子可用於轉錄單元内基因之 120734.doc -36- 200815591 功能性連接。 表現載體可含有用於表現所關注之基因、可選擇標記及 可選擇之編碼螢光蛋白之基因的單-轉錄單元。或者，此 等，因亦可排列於兩個或兩個以上轉錄單元中。基因在轉 錄單元内可具有各種組合。在本發明之另一實施例中，可 將一個以上由一個、兩個或兩個以上轉錄單元組成之表現 載體藉由共轉染或以任何所要順序相繼轉染插人宿主細胞 中。可選擇各載體上調控元件與基因之任何組合，其限制 條件為應確保轉錄單元之足夠表現m，可將其他調 控元件（諸如TE元件）及基因（例如，其他所關注之基因或 可選擇標記）安置於表現載體上。 根據本發明，含有一或多個TE元件且（替代所關注之基 因）僅具有使得可經由限制性核酸内切酶之識別序列選殖 所關注之基因之多選殖位點的彼等表現載體亦較佳。各種 限制性核酸内切酶之各種識別序列以及相關限制性核酸内 切酶在先前技術中是已知的。較佳使用由至少6個核苷酸 組成之序列作為識別序列。適當識別序列之清單可見於 (例如）Sambrook等人，1989 中。 根據本發明，（替代所關注之基因）僅具有使得可經由限 制性核酸内切酶之識別序列選殖所關注之基因之多選殖位 點及另外較佳在表現載體之不同位置具有一或多個另外使 得可經由限制性核酸内切酶之識別序列選殖TE元件之多選 殖位點的彼等表現載體亦較佳。各種限制性核酸内切酶之 各種識別序列以及相關限制性核酸内切酶在先前技術中是 120734.doc -37- 200815591 已知的。較佳使用由至少6個核苷酸組成之序列作為識別 序列。適當識別序列之清單可見於（例如）Sambrook等人， 1989 中。 宿主細胞： 對於用本發明之表現載體轉染而言，使用真核宿主細 胞，較佳為哺乳動物細胞且更尤其為齧齒動物細胞，諸如 小鼠、大鼠及倉鼠細胞株。用本發明之表現載體成功轉染 相應細胞可產生經轉化經基因修飾之重組或轉殖基因細 胞，其亦為本發明之目標。 用於本發明之目的之較佳宿主細胞為倉鼠細胞，諸如 BHK21、ΒΗΚ TK·、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO· DUKX B1及CHO-DG44細胞或此等細胞株之衍生物/子代。 尤其較佳為 CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1 及 BHK21 細胞，尤其是CHO-DG44及CHO-DUKX細胞。小鼠骨髓瘤 細胞，較佳NS0及Sp2/0細胞及此等細胞株之衍生物/子代 亦適用。 可根據本發明使用之倉鼠及小鼠細胞之實例提供於下表 1中。然而，此等細胞之衍生物及子代、其他哺乳動物細 胞（包括但不限於人類、小鼠、大鼠、猴、齧齒動物之細 胞株）或真核細胞（包括但不限於酵母、昆蟲、鳥類及植物 細胞）亦可用作產生生物醫藥蛋白質之宿主細胞。 表1 :倉鼠及小鼠製造性細胞株 細胞株 寄存編號 NS0 ECASS No· 85110503 120734.doc -38- 200815591
Sp2/0-Agl4 ATCC CRL-1581 BHK21 ATCC CCL40 BHKTK' ECACC No. 85011423 HaK ATCC CCL-15 2254-62·2(ΒΗΚ-21-衍生物） ATCC CRL-8544 CHO ECACC No. 8505302 CHO-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX (=CHOdukXHO/dhfr) ATCC CRL-9096 CHO-DUKXB1 ATCC CRL-9010 CHO-DG44 Urlaub等人；Cell 32[2]，405-412, 1983 CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 CHL ECACC No. 87111906 用聚核苷酸或本發明之表現載體之一轉染真核宿主細胞
可藉由習知方法來進行（Sambrook等人，1989 ;八1181^61等 人，1994)。適當的轉染方法包括（例如）脂質體介導之轉 染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、聚陽離子（例如DEAE葡聚 糖）介導之轉染、原生質體融合、顯微注射及病毒感染。 根據本發明，較佳進行穩定轉染，其中構築體整合至宿主 細胞之基因組中或人造染色體/微型染色體中，或以穩定 方式游離地包含於宿主、細胞中。可獲得最佳轉染頻率及所 述宿主細胞内異源基因之表現的轉染方法較佳。根據定 義，插入宿主細胞内的每個序列或每個基因均稱為相對於 宿主細胞之”異源序列”或”異源基因"。即使待引入之序列 或待引入之基因與宿主細胞之内源序列或内源基因一致， 120734.doc •39· 200815591 此定義亦適用。舉例而言，引入 動蛋白基因根據定義為異源基因。#主細胞中之倉鼠肌 根據本發明，較佳為已經本 一絲听甲所述之本發明之表現載 體之-轉尜的重組哺乳動物細胞 4八_ 4^ K土餐齒動物細胞，最 佳层鼠細胞，諸如CH〇或BHK細胞。 在異質蛋白質（諸如單株抗# ，九、商—士一 平休柷體(mAb))之重組製備中，轉 木適§值主細胞理論上可藉由 拖Λι_ j精由兩種不同的方法來進行。此 類mAb由大量亞單元重鍵 一 ^ 您汉転鏈組成。可使編碼此等亞單 兀之基因容納於單一質體上〜 _ 饲立轉錄早兀或多順反子轉 錄早7G中’接著用該質體轉毕 锝木佰主細胞。此舉旨在確保整 合至佰主細胞之基因組中後美 T傻之暴因之化學計量表示。然 而’在獨立轉錄單元之情況下，必須因此確保編碼不同蛋 白tmRNA表現出相㈣穩定性以及轉錄及轉譯效率。 在第種f月況下’基因之表現在多順反子轉錄單元内藉助 於單—啟動子而發生且僅形成_種轉錄物。藉由使用删 70件，在第二順反子及後續順反子中獲得高效基因内部轉 譯起始:然而，此等順反子之表現率比第一順反子之表現 率低第一順反子之轉譯起始藉助於所謂的"帽，，依賴性起 始前複合體而大體上比工㈣依賴性轉譯起始更有效。為達 成順反子之真正等莫耳表現，例如可引入其他順反子間元 件與IRES元件一起確保均一表現率（W() 94/〇5785)。 根據本發明較佳的另一種同時產生多種異源蛋白之可能 方法為共轉染，其中將基因單獨整合至不同的表現載體 中。此方法之優點在於可調節基因與基因產物彼此的特定 120734.doc -40 - 200815591 比例，從而消除副A穩定性及轉錄及轉釋效率方面的任 何差異。此外，表現載體因尺寸小而更為料且在選殖期 間與轉染期間更易於操控。
因此’在本發明之一特定實施例.中，另外用一或多個且 有編碼一或多種其他所關注之蛋白質之基因的载體轉染 (較佳共轉染）宿主細Μ。用於共轉染之其他載體（例如）在 相同啟動子控制下，較佳在相同啟動子/增強子組合控制 下’或尤其較佳在相同啟動子/增強子/ΤΕ元件組合控制 下’或在㈣㈣子/增強子組合與不㈣元件控制下編 馬八他所關庄之蛋白質以及編碼至少一種可選擇標記，例 如二氫葉酸還原酶。 在本發明之另—實施例中，用於轉染之載體可含有一或 多個任何組合、位置及取向2ΤΕ元件。 在本發明之另一特定實施例中，將宿主細胞用至少兩個 真核表現載體共轉染，該兩個載體中之至少一者含有至少 :種編碼至少所關注蛋白質之基因，而另-載體含有-或 多個任何組合、位置及取向之本發明之核酸且視情況亦編 碼至；一種所關注之基因，且藉由與另一載體共整合此等 本發明之核酸將其轉錄增強活性或表現增強活性賦予位於 另一共轉染載體上之所關注基因。 根據本發明，較佳在無企清條件下，視情況在不含動物 蛋白質/肽之培養基中建立、調適及培養宿主細胞。市售 〇 養基之實例包括 Ham 丨 s F12(Sigma，Deisenhofen，DE)、 RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco’s 經改良 Eagle’s 培養基 120734.doc -41- 200815591 (DMEM ; Sigma)、最低必需培養基（MEM ; sigma)、 IsC〇Ve，s 經改良 Dulbecco，S 培養基（1^11)^1;8411^)、（：1^
CHCKInvitrogen，Carlsbad，CA，USA)、CHO-S-SFMII (Invitrogen)、無血清CHO·培養基（Sigma)及無蛋白質CH〇_ 培養基（Sigma)。此等培養基各自可視情況補充有多種化 合物，例如激素及/或其他生長因子（例如胰島素、運鐵蛋 白、表皮生長因子、胰島素樣生長因子）、鹽（例如氯化 鈉、鈣鹽、鎂鹽、磷酸鹽）、緩衝液（例如HEPES)、核苷 (例如腺普、胸苷）、麵醯胺酸、葡萄糖或其他等效營養 物、抗生素及/或痕量元素。儘管根據本發明無血清之培 養基較佳，但亦可使用已混有適量血清之培養基培養宿主 細胞。為選擇表現一或多種可選擇標記基因之經基因修飾 之細胞，可將一或多種選擇劑添加至培養基中。 術語”選擇劑”係指一種影響缺乏所述可選擇標記基因之 宿主細胞之生長或存活的物質。在本發明之範圍内，較佳 使用遺傳黴素（geneticin)(G418)作為培養基添加劑用於選 擇帶有野生型或較佳經修飾之新黴素磷酸轉移酶基因之異 源宿主細胞。培養基中之所用G418濃度較佳介於1〇〇與8〇〇 Kg/ml之間，最佳為20Ό至400微克G418/毫升培養基。若將 用多種表現載體轉染宿主細胞，例如若將數種所關注之基 因單獨引入宿主細胞中，則其通常具有不同的可選擇標記 基因。 可選擇標記基因是一種使得可藉由向培養基中添加相應 選擇劑來特定選擇含有此基因之細胞的基因。舉例而言^ 120734.doc -42- 200815591 可使用^生素耐性基因作為陽性可選擇標記。僅已經此基 因轉化=細胞能夠在相應抗生素存在下生長且從而得以選 擇。、另一方面，未經轉化之細胞不能在此等選擇條件下生 長或存活。存在陽性、陰性及雙功能性可選擇標記。陽性 可選擇標記藉由賦予選擇劑耐性或藉由彌補宿主細胞中之 新陳代謝或分解代謝缺陷而允許選擇且由此富集經轉化之 細胞。相比之下，接收陰性可選擇標記之基因的細胞可經 由陰性可選擇標記被選擇性清除。其實例為單純録型病 毒之胸錢酶基因，該基因在細胞中表現並料添加阿昔 洛韋（acyclovir)或更昔洛韋（ganeycl〇vir)可導致清除該等細 胞。本發明中所使用之可選擇標記（包括可擴增之可選擇 標記）包括經基因修飾之突變體及變異體、片段、功能等 效物、衍生物、同源物及與其他蛋白質或肽之融合體，其 限制條件為可選擇標記保留其選擇特性。該等衍生物在被 認為具有選擇性之區域或結構域之胺基酸序列中展現相當 大的同源性。文獻中描述了大量的可選擇標記基因，包括 雙功能（陽性/陰性）標記（例如參見w〇 92/〇8796及w〇 94/28143)。通常用於真核細胞中之可選擇標記之實例包括 fe基糖苷鱗酸轉移酶（ΑΡΗ)、潮黴素填酸轉移酶（HYG)、 二氫葉酸還原酶（DHFR)、胸苷激酶（τκ)、麩醯胺酸合成 酶、天冬醯胺酸合成酶之基因以賦予新黴素（G418)、嘌呤 黴素（puromycin)、組胺醇D、博萊黴素（ble〇mycin)、腐草 黴素發（phleomycin)及爭光黴素（ze〇sin)耐性之基因。 術語π經修飾之新黴素璘酸轉移酶”(Νρτ)涵蓋w〇 120734.doc -43- 200815591 2004/050884中所述之所有突變體，尤其是突變體 D227G(Asp227Gly)，其特徵為胺基酸位置227處之天冬胺 酸（Asp，D)被甘胺酸（Gly，G)取代；且尤其較佳為突變體 FMOKPhpMOIle)，其特徵為胺基酸位置24〇處之苯丙胺酸 (Phe，F)被異白胺酸（Ile，I)取代。 因此，本發明包括一種製備及選擇重組哺乳動物細胞之 方法’其包含以下步驟··（i)用編碼至少一種所關注之蛋白 質/產物及新黴素磷酸轉移酶（較佳經修飾）之基因轉染宿主 細胞，其中為增強轉錄或表現，使至少所關注之基因與至 少一個TE元件在功能上連接；（ii)在能夠使不同基因得到 表現之條件下培養該等細胞；及（iii)藉由在諸如G418之選 擇劑存在下培養該等細胞來選擇此等經共整合之基因。較 佳地，在無血清之培養基中培養經轉染之細胞。較佳地， G418之濃度為至少2〇〇吨就。然而，濃度亦可為至少權 pg/mL °
N擴增之可選擇標記基因： 此外，本發明之細胞亦可視情況經歷一或多個基因擴增 2 =中將其在可使得可擴增之可選擇標記基因擴增之 選擇劑存在下培養。 先決條件為宿主細胞另外經編碼可擴増之可選擇 。可使編碼可擴增之可選擇標記之基因存::本 之表現載體之-上或藉助於另—载體引人宿主細胞 可擴増之可選擇標記基因 通常編碼真核細胞在特定培養 120734.doc -44 - 200815591 條件下生長所需之酶。舉例而言，可擴增之可選擇標記基 因可編碼二氫葉酸還原酶（DHFR)。在此情況下，若在選 擇劑甲胺喋呤（MTX)存在下培養用此基因轉染之宿主細 胞，則此基因可擴增。 下表2提供可根據本發明使用之其他可擴增之可選擇標 記基因及相關選擇劑之實例，其描述於Kaufman, Methods in Enzymology，185:537-566 (1990)之綜述中。 表2 :可擴增之可選擇標記基因 可擴增之可選擇標 記基因 寄存編號 選擇劑 — 二氫葉酸還原酶 M19869(倉鼠） E00236(小鼠） 丨 甲胺喋呤(MTX) ~ 金屬硫蛋白 D10551(倉鼠） M13003(人類） Ml 1794(大鼠） ---^〜 鎘 CAD(胺甲醯基磷 酸合成酶··天冬胺 酸胺甲醯基轉^ S# · —氣乳清酸 酶） M23652(倉鼠） D78586(人類） N-磷酸乙醯基天ϋ 酸 腺苷去胺酶 K02567(人類） M10319(小鼠） Xyl-A-或腺苷，2’去^^ 間型黴素 (2 'deoxycoformycin) AMP(腺芽酸)去胺 酶 D12775(人類） J02811(大鼠） 腺嘌呤，偶氮絲胺~ 助間型黴素 UMP合成酶 J03626(人類） 6-氮雜尿苷，11比嗤幷吱喃 IMP 5’-去氫酶 J04209(倉鼠） J04208(人類） M33934(小鼠） 黴酚酸 --- 120734.doc -45- 200815591 黃嘌呤-鳥嘌呤-碡 酸核糖基轉移酶 XO〇221(大腸桿菌(£.⑺⑼ 黴酚酸與限制性黃嗓呤 突變體HGPRTase 或突變體胸苷激酶 ：ί00060(倉鼠） Μ13542，Κ02581(人類） J00423，M68489(小鼠） M63983(大鼠） M36160(疱疹病毒） 次黃嘌呤，胺基喋呤及 胸苷(HAT) 胸普酸合成酶 D00596(人類） M13019(小鼠） L12138(大鼠） 5_氟去氧尿苷 P-糖蛋白 170(MDR1) AF016535(人類） J03398(小鼠） 數種藥物，例如阿黴素 (adriamycin)、長春新鹼 (vincristin)、秋水仙驗 (colchicine) 核糖核苷酸還原酶 M124223，K02927(小鼠） 阿非迪黴素(aphidicoline) 麩醯胺酸合成酶 AF150961(倉鼠） U09114，M60803(小鼠） M29579(大鼠） 甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX) 天冬醯胺酸合成酶 M27838(倉鼠） M27396(人類） U38940(小鼠) U07202(大鼠） β-天冬胺醯基異羥肟酸， 脲基丙胺酸，5’氮雜胞苷 精胺琥珀酸合成酶 X01630(人類） M31690(小鼠） M26198(牛） 刀豆胺酸(canavanin) 鳥胺酸去羧酶 M34158(人類） J03733(小鼠） M16982(大鼠） α-二氟*甲基鳥胺酸 HMG-CoA還原酶 L00183，M12705(倉鼠） M11058(人類） 康百汀(compactin) N-乙醯胺基葡萄糠 轉移酶 M55621(人類） 衣黴素(tmiicamycin) 120734.doc -46- 200815591 蘇胺醯基-tRNA合 成酶 M63180(人類） 疏螺體素(borrelidin) Na^-ATPase J05096(人類） M14511(大鼠） :巴因（ouabain) 根據本發明，所用之可擴增之可選擇標記基因較佳為編 碼具有DHFR功能之多肽的基因，例如編碼DHFR之基因或 編碼螢光蛋白與DHFR之融合蛋白之基因。DHFR為生物合 成嗓呤所必需的。缺乏DHFR基因之細胞不能生長於缺乏 嘌呤之培養基中。因此，DHFR基因為適用於選擇及擴增 在無嘌呤之培養基中培養之細胞中之基因的可選擇標記。 與DHFR基因一起使用之選擇性培養基為甲胺喋呤 (MTX)。 哺乳動物細胞（較佳小鼠骨髓瘤及倉鼠細胞）為對於使用 DHFR作為可擴增之可選擇標記而言的較佳宿主細胞。細 胞株 CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)及 CHO-GD44(Urlaub 等 人，1983)尤其較佳，因為其因突變而本身不具有DHFR活 性。為能夠亦在具有自身内源DHFR活性之其他細胞類型 中利用DHFR誘導之擴增，可在轉染過程中使用編碼對甲 胺喋呤具有低敏感性之蛋白質的突變DHFR基因（Simonson 等人，1983 ; Wigler等人，1980 ; Haber等人，1982)。 當使用DHFR陰性基本細胞（諸如CHO-DG44或CHO_ DUKX)時，DHFR標記尤其適用於選擇及後續擴增，因為 此等細胞不表現内源DHFR且從而不能生長於無嘌呤之培 養基中。因此，在此可使用DHFR基因作為主導選擇標記 且在無次黃嘌呤/胸苷之培養基中選擇所轉化之細胞。 120734.doc •47- 200815591 因此，本發明包括一種製備及選擇重組哺乳動物細胞之 方法，其包含以下步驟··⑴用編碼至少一種所關注之蛋白 貝/產物及可擴增之可選擇標記DHFR之基因轉染宿主細 胞，其中為增強轉錄或表現，使至少所關注之基因與至少 個TE元件在功能上連接；（η)在能夠使不同基因得到表 現之條件下培養該等細胞；及（iii)藉由在使得至少可擴增 之可選擇標記基因可擴增之選擇劑（諸如甲胺喋呤）存在下 培養該等細胞來使此等經共整合之基因擴增。較佳地，在 2血清存在下在無次黃嘌呤/胸苷之培養基中且添加遞增 濃度之MTX來培養經轉染之細胞。較佳地，第_擴增步驟 中MTX之濃度為至少1〇〇 nM。然而，Μτχ之濃度亦可為 至少250 ηΜ且可逐步增至i μΜ。在個別情況下，亦可使 用超過1 μΜ之濃度，例如2 μΜ。 本I月亦包括種製備及選擇重組哺乳動物細胞之方 法，其包含以下步驟：⑴用編碼至少一種所關注之蛋白質/ 產物、新黴素磷酸轉移酶（較佳經修飾）及可擴增之可選擇 標記DHFR之基因轉染宿主細胞，其中為增強轉錄或表 現，使至少所關注之基因與至少一個丁£元件在功能上連 接；⑼在能夠使不同基因得到表現之條件下培養該等細 胞；（iii)藉由在諸如G418之選擇劑存在下在無次黃嘌呤/胸 苷之培養基中培養該等細胞培養來選擇此等經共整合之基 因；及㈤藉由在使得至少可擴増之可選㈣記 增之選擇劑（諸如f胺存在τ料料細胞來使此等 經共整合之基因擴增。較佳地，在無血清存在下在補充有 120734.doc -48· 200815591 至少200 pg/mL G418，較佳400 pg/mL或甚至更多G418之 無次黃嘌呤/胸苷之培養基中且添加遞增濃度之MTX來培 養經轉染之細胞。較佳地，第一擴增步驟中MTX之濃度為 至少100 nM。然而，MTX之濃度亦可為至少250 nM且可 逐步增至1 μΜ。在個別情況下，亦可使用超過1 μΜ之濃 度，例如2 μΜ。 亦可藉由螢光活化細胞分選（FACS)選擇所轉化之細胞。 對此，可使用細菌β-半乳糖苷酶、細胞表面標記或螢光蛋 白（例如，自水母及海腎或其他物種獲得之綠色螢光蛋白 (GFP)及其變異體；自非生物發光生物體，諸如圓盤擬珊 瑚海葵、海葵印.）、羽珊瑚、花群海葵、青色 多管水母獲得之紅色螢光蛋白及發出其他顏色螢光之蛋白 質及其變異體）選擇所轉化之細胞。 基因表現及高產宿主細胞之選擇： 術語基因表現係指異源基因序列在宿主細胞中之轉錄及/ 或轉譯。表現率通常可基於存在於宿主細胞中之相應 mRNA之量或基於由所關注基因編碼之所產生之基因產物 之量來測定。所選梭苦酸序列經轉錄而產生之mRNA之量 可（例如）藉由北方墨點雜交、核糖核酸酶-RNA-保護、細 胞RNA之原位雜交或藉由PCR方法（例如定量PCR)來測定 (Sambrook等人，1989 ; Ausubel等人，1994)。由所選核皆 酸序列編碼之蛋白質亦可藉由多種方法來測定，諸如 ELIS A、蛋白質A HPLC、西方墨點法、放射免疫檢定、免 疫沈澱、偵測蛋白質之生物活性、先將蛋白質免疫染色再 120734.doc -49- 200815591 分析或榮光顯微法、藉由_分析或螢光顯微 接摘測螢先蛋白（Sambr〇〇k等人，i989 ; A臟^等 人，1994)。此等方法可用以(例如)研究本發明之SEQ ID ^0」之TE元件或其任何部分、片段或區域或其衍生物或組 4否可使得利注基因之轉錄或表現增加。 "表現、轉錄或產率增強"意謂與對照相&，引入宿主細 胞内之異源序列（例如編碼治療性蛋白質之基因）之表現或 合成增強。若藉由本文中所述之本發明之方法培養本發明 之細胞且若此細胞具有至少兩倍之特定產率，則存在表 現、轉錄或產率之增強。若本發明之細胞具有至少三户之 特定產率’則亦存在表現、轉錄或產率之增強。若本發明 之細胞具有至少四倍之料產率，則存在表現、轉錄或產 率之顯著增強。若本發明之細胞之特定產率增加至少五 倍，則存在表現、轉錄或產率之顯著增強。若本發明之細 胞之特定產率增加至少六倍，則存在表現、轉錄或產率之 顯著增強。若本發明之細胞之特定產率增加至少七倍，則 存在表現、轉錄或產率之顯著增強。 可藉由使用本發明之表現载體之—且㈣本發明之方法 之一達成增強之表現、轉錄或產率。 〆 々可將相應方法與FACS辅助選擇重組宿主細胞組合，該 等宿主細胞含有作為額外可選擇標記之一或多種榮光蛋白 (例如GFP)或細胞表面標記。亦可使用其他用於獲得表現 杧加之方法及不同方法之組合，該等方法例如基於使用 控染色質結構之順式活性元件(例如LCR、魏、ΕΜΕ :、 120734.doc -50- 200815591 隔離子、S/MAR、STAR元件），基於使用（人造）轉錄因 子，用天然或合成藥劑處理細胞以上調内源或異源基因表 現，改良mRNA或蛋白質之穩定性（半衰期），改良 譯之起始’藉由使用游離型質體增加基因劑量（基於使用 ， 病毒序列作為複製起點，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、 EBV或BPV)，使用擴增促進序列（Hemann等人，1994)或基 於DNA夕聯體之活體外擴增系統（M〇nac〇等人，Μ%)。 因此，在另一實施例中，本發明亦係關於用於獲得及選 表現至少-種所關注之異源基因之重組哺乳動物細胞之 方法，且該方法之特徵在於··⑴將重組哺乳動物細胞用本 發明之表現載體及可擴增之可選擇標記基因轉染；（丨丨）將 該等哺乳動物細胞在使得所關注之基因、經修飾之新徵素 礙酸轉移酶基因及編碼螢光蛋白之基因可表現之條件下培 養，(m)在至少一種選擇性作用於哺乳動物細胞之生長且 使表現新黴素磷酸轉移酶基因之彼等細胞適宜生長之選擇 鲁齊!存在下培養該等哺乳動物細胞；㈣藉由流式細胞分析 分選螢光蛋白呈高表現之哺乳動物細胞;(V)將分選出之細 胞在可擴增之可選擇標記基因可表現之條件下培養，·及 ㈣將使可擴增之可選擇標記基因擴增之選擇劑添加至培 "*明，將製造性細胞複製且用以製備所關注之編 =因產物的方法亦較佳。為此，較佳將所選高產細胞在 付所關庄之基因可表現之條件下培養於無血清之培養基 中且較佳培養於懸浮液培養物中。所關注之蛋白質/產物 120734.doc ㈣51· 200815591 較佳係以分泌型基因產物之形式自細胞培養基獲得。然 而，若蛋白質係在無分泌信號之情況下表現，則亦可自细 胞溶胞物中分離基因產物。為獲得大體上不含其他重組蛋 白及宿主細胞蛋白之純均f產物’可執行習知純化程序。 首先，將細胞及細胞碎片自培養基或溶胞物中移除。接 著，可自所要基因產物除去污染性可溶蛋白質、多肽及校 酸，例如藉由免疫親和管柱及離子交換柱分餾、乙醇沈 澱、逆相HPLC或葡聚糖凝膠、二氧化矽或陽離子交換樹 脂（諸如DEAE)層析進行分離。可用以純化由重組宿主細 胞表現之異源蛋白質之方法已為熟習此項技術者所知且已 描述於文獻中，例如Harris等人，1995及Scopes 1988。 本發明之組合物 本發明係關於一種核酸，其含有TE-13(SEQ ID No. 15) 或TE-13(SEQ ID No· 15)之片段或其互補核苷酸序列或 TE-13(SEQ ID No· 15)之衍生物或其片段或其互補核苷酸 序列’且在經染色體整合後可使得表現系統中所關注基因 之轉錄或表現增加。 本發明係關於一種核酸，其含有TE_13(SEQ ID No. 15) 或TE-13(SEQ ID No· 15)之片段或其互補核苷酸序列或 TE-13(SEQ ID No· 15)之衍生物或其片段或其互補核苷酸 序列，且在經染色體整合後可使得表現系統中所關注基因 之轉錄或表現增加，其限制條件為該片段包含至少一個來 自介於1 bp與1578 bp之間（相對於SEQ ID No. 01)的核酸區 中之序列區。 120734.doc -52- 200815591 本發明係關於一種核酸，其含有TE-13(SEQ ID No. 15) 或TE-13(SEQ ID No· 15)之片段或其互補核苷酸序列或 TE-13(SEQ ID No· 15)之衍生物或其片段或其互補核苷酸 序列，且在經染色體整合後可使得表現系統中所關注基因 之轉錄或表現增加，其限制條件為該片段包含至少一個 TE-09(SEQ ID No· 11)或 TE_08(SEQ m N〇 u)或 TE-13(SEQ ID No. 15)中之序列區。 序列區意謂至少 10 bp、15 bp、20 bp、50 bp、100 bp之 核酸區。 所關注基因之表現增強可（例如）藉由以ELISA量測產物 效價來量測。 在一較佳實施例中，本發明係關於一種核酸，其含有 TE-08(SEQ ID No. 10)或 TE-08(SEQ ID No· 10)之片段或其 互補核苦酸序列或TE-08(SEQ ID No· 10)之衍生物或其片 段或其互補核苷酸序列，且在經染色體整合後可使得表現 系統中所關注基因之轉錄或表現增加。 在上述本發明之核酸之一較佳實施例中，限制條件為該 片段必須亦包括至少一個來自介於1 #與1578 bp之間（相 對於SEQ ID No· 01)的核酸區中之序列區。 在上述本發明之核酸之一尤其較佳實施例中，限制條件 為該片段亦包括至少一個TE-09(SEQ ID No· 11)或 TE-08(SEQ ID No· 11)或 TE-13(SEQ ID No. 15)中之序列 區〇 序列區思谓至少 10 bp、15 bp、20 bp、50 bp、loo bp之 120734.doc -53- 200815591 核酸區。 在另一實施例中’本發明係關於一種核酸，其含有seq n> No. 1或SEQ ID No_ 1之片段或其互補核苷酸序列或SEQ ID No· 1之衍生物或其片段或其互補核苷酸序列，其在經 染色體整合後可使得表現系統中所關注基因之轉錄或表現 增加。 在上述本發明之核酸之一較佳實施例中，限制條件為該 片段亦包含至少一個來自介於1 bp與1578 bp之間（相對於 SEQ ID No· 01)的核酸區中之序列區。 在上述本發明之核酸之一尤其較佳實施例中，限制條件 為該片段亦包含至少一個TE-09(SEQ ID No· 11)或 TE-08(SEQ ID No. 11)或 TE_13(SEQ ID No. 15)中之序列 區〇 序列區意謂至少 10 bp、l5 bp、2〇 bp、50 bp、100 bp之 核酸區。 本發明亦係關於一種用於增加所關注基因之轉錄或表現 的具有SEQ ID No· 1之核酸（=TE元件）或其片段或其衍生物 或其互補核苷酸序列’其可使得所關注基因之轉錄或表現 增加。 所關注基因之表現增加可（例如）藉由以ELISA量測產物 效價來量測。 本發明尤其係關於在嚴格條件下與以下各物雜交之本發 明之核酸： (a)核酸序列 TE-13(SEQ ID No_ 15)或 TE、08(SEQ ID No. 10) 120734.doc -54- 200815591 之區域，或 (b)其互補核酸序列，或 0)與（a)或（b)具有至少約70%序列一致性之核酸序列，較 - 佳至少約80%序列一致性，最佳至少約90%序列一致性且 最佳至少約95%序列一致性。 在一特定實施例中，本發明之核酸具有至少5 11 bp之長 度（=SEQ ID Νο· 15 TE-13之長度）或至少1〇15 bp之長度 (=SEQ ID No. 10 TE-08之長度）。
_ 在一較佳實施例中，本發明係關於TE元件TE-00(SEQ ID No. 2)之5’片段。此片段對應於SEQ ID No. 1中介於1 bp與1578 bp之間的部分或其互補核苷酸序列。 本發明尤其係關於一種核酸或一種轉錄增強或表現增強 核酸元件（TE元件），其含有TE-13(SEQ ID No. 15)或 TE-08(SEQ ID No· 10)或其衍生物或其互補核苷酸序列， 其在經染色體整合後可使得所關注基因之轉錄或表現增 加。 鲁 本發明較佳係關於一種經分離之核酸或經分離之核酸分 子或經分離之核酸序列或經分離之轉錄增強核酸元件或經 分離之TE元件。 本發明尤其係關於一種經分離之核酸，其含有 TE-08(SEQ ID No· 10)或其互補核苷酸序列且在經染色體 整合後可使得表現系統中所關注基因之轉錄或表現增加。 在一實施例中，該核酸或轉錄增強核酸元件或經分離之 核酸含有TE元件或SEQ ID No· 1之衍生物，其與te元件序 120734.doc -55- 200815591 列或其互補序列之相應部分，尤其與相對於SEQ ID No. J 之核苷酸位置1 bp與1578 bp之間的序列區（對應於TE-00序 列之序列區5’），且尤其較佳與TE_13(Seq ID No_ 15)或 TE-08(SEQ ID No· 10)具有至少約70%之序列一致性，較 佳至少約80%之序列一致性，最佳至少約90%之序列—致 性且最佳至少約95%之序列一致性。 在一較佳實施例中，該核酸或轉錄增強核酸元件或經分 離之核酸含有TE_08核酸（SEQ ID No· 10)之衍生物或較佳 TE-13核酸（SEQ ID No· 15)之衍生物，其與TE元件序列或 其互補序列之相應部分具有至少約70%之序列一致性，較 佳至少約80%之序列一致性，最佳至少約90%之序列一致 性且最佳至少約95%之序列一致性。 在另一實施例中，本發明係關於一種核酸或轉錄增強核 酸元件或經分離之核酸或TE元件之衍生物，其與TE元件 之序列或與TE元件之互補序列，尤其與相對於SEQ ID No. 1之核苷酸位置1 bp與1578 bp之間的序列區（對應於ΤΕ-00 序列（SEQ ID No· 2)之序列區5J雜交，或尤其與TE_08元件 (SEQ ID No· 10)雜交。雜交較佳在嚴格雜交及洗滌條件下 進行。 在另一較佳實施例中，本發明之核酸或轉錄增強元件 (TE元件）係選自：TE-00(SEQ ID No· 2)、TE-01(SEQ ID No. 3)、TE-02(SEQ ID No. 4)、TE-03(SEQ ID No· 5)、 TE-04(SEQ ID No. 6)、TE-06(SEQ ID No. 8)、TE-07(SEQ ID No· 9)、TE-08(SEQ ID No· 10)、TE-10(SEQ ID No· 120734.doc -56- 200815591 12)、TE-11(SEQ ID No. 13)、TE-12(SEQ ID No· 14)、 TE-13(SEQ ID No· 15)、TE-14(SEQ ID No· 16)、TE-15 (SEQ ID No· 17)、TE-16(SEQ ID No· 18)、TE-17(SEQ ID No· 19)及 TE_18(SEQ ID No. 20)。 在另一實施例中，該核酸或轉錄增強元件（TE元件）之特 徵在於該核酸為 TE-00(SEQ ID No. 2)、TE-06(SEQ ID No. 8)、TE-10(SEQ ID No· 12)、TE_11(SEQ ID No· 13)或 TE-12(SEQ ID No· 14)，較佳為 TE-06(SEQ ID No. 8)。 在一較佳實施例中，該核酸或轉錄增強元件（TE元件）之 特徵在於該核酸為 TE-01(SEQ ID No. 3)、TE-02(SEQ ID No. 4)、TE-03(SEQ ID No· 5)、TE-07(SEQ ID No· 9)、 TE-08(SEQ ID No· 10)。 在一尤其較佳實施例中，該核酸或轉錄增強元件為丁£-08(SEQ ID No. 10) ° 在另一實施例中，該核酸或轉錄增強元件（TE元件）之特 徵在於其為TE-01(SEQ ID No. 3)之片段或衍生物，較佳為 TE-13(SEQ ID No· 15)、TE-14(SEQ ID No· 16)、TE-15 (SEQ ID No· 17)、TE-16(SEQ ID No_ 18)、TE-17(SEQ ID No· 19)、TE-18(SEQ ID No· 20)之片段或衍生物。 在一較佳實施例中，本發明之核酸為TE-13(SEQ ID No. 15)。 在另一實施例中，本發明之核酸或片段或衍生物為經分 離之核酸。 本發明亦係關於如申請專利範圍第1至12項中任一項之 120734.doc -57- 200815591 本發明之核酸，其特徵在於含有以下序列之核酸係與異源 序列連接：TE-13(SEQ ID No_ 15)或 TE-08(SEQ ID No· 10) 或 TE-07(SEQ ID No· 9)或 TE-06(SEQ ID Νο·8)，或此等序 列之片段或其互補核苷酸序列，或此等序列之衍生物或此 等序列之片段之衍生物，較佳為TE-13(SEQ ID No· 15)或 TE-08(SEQ ID No. 10)或此等序列之片段或此等序列之衍 生物或此等序列之片段之衍生物或其互補核苷酸序列。 在一較佳實施例中，與異源基因序列連接之核酸可為表 現載體，例如質體、噬菌體、噬菌粒、黏質體、病毒載體 或尤其是靶向載體。 然而，與異源基因序列連接之核酸亦可為其他任何合成 核酸分子，諸如合成、人造或微型染色體。 本發明進一步係關於一種真核表現載體，其特徵在於此 表現載體含有一或多個本發明之核酸或一或多個本發明之 轉錄增強元件（TE元件）。 在特疋實施例中，該真核表現載體之特徵在於其含有 啟動子及/或所關注之異源基因及/或可選擇標記及/或可選 擇之增強子。 本發明進一步係關於一種真核表現载體，其特徵在於此 表現載體含有，戈多個本發明之核酸或一或多㈤轉錄增強 元件（TE元件）及啟動子及/或所關注之異源基因及/或可選 擇標記及/或可選擇之本發明之增強子。 在另-實施例中’該真核表現載體之特徵在於其為用於 有意整合所關注基因之靶向載體。 120734.doc •58- 200815591 在車乂佳實施例令，該真核表現载體之特徵在於該啟動 子為異源啟動子’諸如人類巨細胞病毒之早期啟動子 (⑽啟動子）、SV4〇早期啟動子、腺病毒主要晚期啟動 子、小鼠金屬硫蛋白啟動子、勞斯肉瘤病毒之長末端重 複區、肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白或熱休克啟動子，較 佳為CMV啟動子。 在另一較佳實施例中，該真核表現载體之特徵在於該啟 動子為異源啟動子，較佳為泛素/S27a啟動子，最佳為倉 鼠泛素/S27a啟動子。 在一特定實施例中，該真核表現載體之特徵在於其含有 數個相同或不同的彼此間呈任何取向之本發明之核酸或 兀件之組合，其中一或多個核酸或7£元件位於所關注之基 因之前（亦即5’）且/或一或多個核酸或ΤΕ元件位於所關注之 基因之後（亦即3·)。 在一較佳實施例中，該真核表現載體之特徵在於經組合 之核酸或ΤΕ元件為TE-06(SEQ ID No· 8)且尤其較佳為 TE_08(SEQ ID No· 10)。 較佳之核酸或TE元件之組合為一個TE-〇6元件（SEQ ID No. 8)位於所關注之基因之前（亦即5，）且一個τε_μ元件 (SEQ ID No· 8)位於所關注之基因之後（亦即3，），以及3個 TE-06元件（SEQ ID No· 8)位於所關注之基因之後（亦即 3’)（亦參見圖13)。 在一尤其較佳實施例中，該真核表現載體之特徵在於一 或多個TE-08核酸或元件（SEQ ID Ν〇· 1〇)位於所關注之基 120734.doc -59- 200815591 因之前（亦即5，）且一或多個TE-08元件位於所關注之基因之 後（亦即3’），較佳為一個ΤΕ-08元件（SEQ ID No. 10)在前且 一個在後（亦參見圖13)。 其他較佳之TE核酸或元件之組合為兩個TE-08核酸/元件 (SEQ ID No· 10)位於所關注之基因之前及/或之後。 在另一實施例中，該真核表現載體之特徵在於複數個 (較佳為3個）TE-06核酸或元件（SEQ ID No. 8)位於所關注之 基因之後（3*)(參見圖13)。 在一較佳實施例中，該真核表現載體之特徵在於一或多 個TE_08核酸或元件（SEq ID ν〇· 10)與一或多個TE-06核酸 或元件（SEQ ID No· 8)之組合位於所關注之基因之前（亦即 5’）及/或之後（亦即3’)，較佳組合為ΤΕ_08核酸或元件（SEQ ID No· 10)與其後之ΤΕ-06核酸或元件（SEq m Ν〇 8)之組 合位於所關注之基因之前（亦即5，）（亦參見圖13)。 在一較佳實施例中，該真核表現載體之特徵在於其另外 含有整合酶。 在另一較佳實施例中，將宿主細胞用至少兩個真核表現 載體共轉染，而該兩個載體中之至少一者含有至少一種編 碼至少一種所關注蛋白質之基因，且另一載體含有一或多 個任何組合、位置及取向之本發明之核酸且視情況亦編碼 i ’ 種所關/主之基因，且耩由與另一載體共整合此等本 發明之核酸將其轉錄增強作用或表現增強作用賦予位於另 一共轉染載體上之所關注基因。 在一特定實施例中，該真核表現載體之特徵在於可選擇 120734.doc -60 - 200815591 標記為DHFR或Neo，例如Neo F240I。 本發明進一步係關於一種製備真核表現載體之方法，其 特徵為將本發明之核酸整合至表現載體中。 本發明進一步係關於一種真核宿主細胞，其特徵在於其 含有本發明之真核表現載體。 在一特定實施例中，該真核宿主細胞之特徵在於其為高 產者，亦即其特定產率高於無本發明之TE元件或核酸之對 等真核宿主細胞，此宿主細胞之表現量可增加兩倍、三 • 倍、四倍、五倍、六倍、七倍或十倍，或增加兩倍以上、 三倍以上、四倍以上、五倍以上、七倍以上或十倍以上， 較佳為高達五倍或三倍以上。 在一尤其較佳實施例中，該真核宿主細胞之特徵在於表 現載體係穩定地整合至基因組中。
在另一實施例中，該真核宿主細胞為倉鼠或小鼠細胞， 諸如 CHO、NS0、Sp2/0-Agl4、BHK21、ΒΗΚ TK·、HaK、 2254-62·2(ΒΗΚ-21衍生物）、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHO • duk·、CHO/dhf〇、CHO-DUKX B1、CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞，較佳為 CHO細胞 且尤其較佳為CHO-DG44細胞。 在另一實施例中，該真核宿主細胞為哺乳動物細胞，包 括（但不限於）人類、小鼠、大鼠、猴或齧齒動物細胞株。 在另一實施例中，.該宿主細胞為真核細胞，包括（但不 限於）酵母、昆蟲、鳥類及植物細胞。 在另一特定實施例中，該真核宿主細胞之特徵在於其另 120734.doc •61 - 200815591 外含有抗細胞凋亡基因，諸如BCL-XL、BCL-2、BCL_W、 BFL_1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-l、 CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL 或 CED-9，較佳為 Bcl-xL 或 BCL-2，最佳為 BCL-xL。 本發明進一步係關於一種培養經穩定轉染之高產真核宿 主細胞株之方法，該方法由以下步驟表徵： (a) 將至少一個本發明之核酸或一個本發明之τ E元件整合 至含有所關注基因之真核表現載體中；
(b) 用此表現载體轉染真核宿主細胞； (c) 選擇經轉染之高產宿主細胞。 本發明進一步係關於一種培養經穩定轉染之高產真核宿 主細胞株之方法，該方法由以下步驟表徵： ⑷將所關注之基因整合至含有至少—個本發明之核酸或本 發明之TE元件之真核表現載體中； (b) 用此表現载體轉染真核宿主細胞； (c) 選擇經轉染之高產宿主細胞。 在特疋實施例中，該方法由至少_個額外擴增步驟表 徵0 本發明亦係關於-種製備及選擇重組哺乳動物細胞之方 法，該方法由以下步驟表徵： ⑷用編碼至少所關注之蛋白質/產物、新黴素磷酸轉移酶 (較佳經修飾）及可擴增之可選擇標記卿R之基因轉染宿 主、胞〃中為增強轉錄或表現，使至少所關注之基因盘 至少一個如中請專利範圍第⑴”中任—項之核酸在;;力 120734.doc -62 - 200815591 能上連接； (b) 在能夠使不同基因得到表現之條件下培養該等細胞； (c) 藉由在諸如G418之選擇劑存在下在無次黃嘌呤/胸苷之 ^ 培養基中培養該等細胞來選擇此等經共整合之基因，及 . (d)藉由在使得至少可擴增之可選擇標記基因可擴增之選擇 ’劑（諸如甲胺喋呤）存在下培養該等細胞來使此等經共整合 之基因擴增。 在一特定實施例中，此方法之特徵在於在無血清存在下 _ 在補充有至少200 pg/mL G418，較佳400 pg/mL或更多 G418之無次黃嘌呤/胸苷之培養基中且添加遞增濃度之 MTX來培養經轉染之細胞。 在另一特定實施例中，此方法之特徵在於第一擴增步驟 中MTX之濃度為至少100 nM或至少250 nM且逐步增至1 μΜ或1 μΜ以上。在個別情況下，MTX濃度可為2 μΜ。 在另一特定實施例中，此方法由額外之選殖步驟表徵。 在本發明之方法之另一實施例中，宿主細胞為齧齒動物/ 倉鼠細胞，諸如 CHO、NS0、Sp2/0-Agl4、ΒΗΚ21、ΒΗΚ ΤΚ·、HaK、2254-62·2(ΒΗΚ-21 衍生物）、CHO-K1、 CHO-DUKX(=CHO duk_、CHO/dhfr·)、CHO-DUKX B1、 CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL 細 胞，較佳為CHO細胞且尤其較佳為CHO-DG44細胞。 在本發明之一較佳方法中，表現载體含有可選擇標記， 諸如 DHFR或 NPT，例如 NPT F240I或 NPT D227G 〇 在本發明之方法之一尤其較佳實施例中，高產者之比例 120734.doc -63- 200815591 可增加高達兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍或十 倍，或兩倍以上、三倍以上、四倍以上、五倍以上、七倍 以上或十倍以上，較佳為高達五倍或三倍以上。 ' 本發明進—步係關於-種製備生物醫藥產物之方法，該 . 方法由以下步驟表徵： (a) 將至/個本發明之核酸或一個本發明之te元件整合 至含有所關注基因之真核表現載體中； (b) 用此表現載體轉染真核宿主細胞； _ (c)選擇經轉染之高產宿主細胞，及 ⑷在使传所關注之基因可表現之條件下培養所獲得之經轉 染之高產宿主細胞。 本^月進纟係關於_種培養經穩定轉染之高產真核宿 主細胞株之方法，該方法由以下步驟表徵： ⑷將所關主之基因整合至含有至少一個本發明之核酸或一 個本發明之TE元件之真核表現載體中； (b) 用此表現載體轉染真核宿主細胞； (c) 選擇經轉染之高產宿主細胞，及 ⑷錢得所敎之基因可表狀條件下培養所獲得之經轉 染之局產宿主細胞。 在一特定㈣財，本㈣之方法由至少-個額外擴增 步驟表徵。 在-特定實施例中，本發明之方法由如下之額外步 徵： (e)收集並純化所關注之蛋白質。 120734.doc •64· 200815591 本發明進一步係關於本發明之核酸或本發明之轉錄增強 元件（TE元件）於真核表現載體中之用途，其係用於增加在 真核宿主細胞中表現系統中所關注基因之轉錄或表現或用 於製備生物醫藥產物。 本發明亦係關於本發明之核酸或本發明之轉錄增強元件 (TE元件）用於產生轉殖基因動物或植物之用途。 本發明進一步係關於本發明之核酸或本發明之轉錄增強 元件（ΤΈ元件）在基因治療中之用途。 本發明尤其係關於本發明之核酸或本發明之轉錄增強元 件（TE元件）作為藥物或在醫藥組合物中之用途。 本發明進一步係關於一種套組，其係由本發明之核酸或 本發明之TE元件、可選擇之表現載體、可選擇之宿主細胞 及可選擇之轉染試劑組成。 在一較佳實施例中，本發明係關於一種核酸，特定言之 為經分離之核酸，更確切言之為除TE元件TE-00(SEQ ID No. 2)以外的具有SEQ ID No· 1之轉錄增強或表現增強核 酸元件（TE元件）或其片段或其衍生物，其在經染色體整合 後可使得所關注基因之轉錄或表現增加。 在另一實施例中，本發明係關於除TE元件TE-00(SEQ ID No· 2)、TE-04(SEQ ID No· 6)及 TE-06(SEQ ID No. 8)以 外的本發明之核酸。 在另一實施例中，本發明係關於除TE元件TE-00(SEQ ID No· 2)、TE-04(SEQ ID No· 6)、TE-05(SEQ ID No. 7)及 TE-06(SEQ ID No· 8)以外的本發明之核酸。 120734.doc -65- 200815591 所關注基因尤表現增加可（例如）藉由利用eLISA量測產 物效價來量測。 本發明之另一實施例係關於一種長度超過16〇 bp，較佳 長度超過170 bp之本發明之TE元件、片段或衍生物。在一 特定實施例中，TE元件片段之長度介於“⑽卩與^以之 間或介於170 bp與1 kb之間，較佳超過2〇〇 bp且介於2〇〇 bp 與1 kb之間。 在一較佳實施例中，TE元件片段位於SEQ id Νο· i中介 於1 bP與1578 bp之間的部分中（此片段對應於元件 TE-00(SEQ ID No· 2)之片段5,且長度超過113 bp或超過132 bp且較佳長度超過160 bp或超過17〇 bp)。在一特定實施例 中，TE元件片段之長度介於113 0與12 kb之間或介於132 bP與1.2 kb之間或介於160矸與丨.2 kb之間，較佳超過2〇〇 bp且介於200 bp與1 kb之間。 在另一實施例中，TE元件片段不具有任何相鄰序列。此 意謂片段不為更大序列或序列區之部分，例如在其前 或其後（31)無其他序列相連。 在另一特定實施例中，本發明係關於不含任何Cp(}島之 本發明之核酸。 由以下實驗中可明顯看出當將具有與不具有7£元件之真 核宿主細胞相比較時，所關注基因之特定產率之相對變化 可展示高達七倍之增長。 總結有關產物效價及特定產率之資料顯示，平均而言幾 乎所有具有SEQ ID N。]之片段或衍生物之te元件的細胞 120734.doc • 66- 200815591 池均比無TE元件之細胞池表現更多的所關注之基因。在兩 個獨立轉染系列中（各情況下使用不同的可選擇標記（ΝΡΤ 或 DHFR))，ΤΕ元件 01(SEQ ID No. 3)、02(SEQ ID No. 4) 及08(SEQ ID No. 10)產生最高產率。其能夠使產率增加4 至7倍。當然，3 kb及2.5 kb之TE元件01(SEQ ID No_ 3)及 02(SEQ ID No· 4)對於另外與表現載體連接而言非常大。 另一方面，更受關注的為尺寸僅為1 kb之TE元件08(SEQ ID No· 10)，其能夠使表現增加5-6倍。TE元件06(SEQ ID No· 8)在兩個轉染系列中產生三倍之特定產率，該元件尺 寸僅為381 bp。由於較小載體通常更為穩定且更易於在選 殖期間與轉染期間處理，因此使表現載體盡可能的小是非 常有利的。因此，使用TE-元件06(SEQ ID No. 8)及08(SEQ ID No. 10)作為轉錄促進元件尤其有利。 以下實例亦顯示含有TE元件03(SEQ ID No· 5)、04(SEQ ID No· 6)或07(SEQ ID No· 9)之細胞池展示所關注之基因 約3至3.5倍之表現，且具有TE元件10(SEQ ID No. 12)、 11(SEQ ID No. 13)或 12(SEQ ID No· 14)之細胞池展示所關 注之基因約2倍之表現。 與無TE元件之對照池相比，與可選擇標記NPT F240I — 起使用之TE元件08(SEQ ID No. 10)展現所關注基因之特定 產率之最大增長（5倍）。與可選擇標記DHFR—起使用之TE 元件08(SEQ ID No. 10)展示約6.0倍之更佳增長。 此外，測試系列中TE元件02(SEQ ID No· 4)與可選擇標 記DHFR展示所關注基因之產率增加6.8倍。 120734.doc •67- 200815591 以下實例亦表明在一測試系列中具有TE元件05(SEQ ID No. 7)及〇9(SEQ ID No· 11)之池未展現所關注基因之表現 增加，且一測試系列中甚至展示比對照池低之所關注基因 - 之表現。因此，此等兩元件及可能此等序列區中之部分片 - 段可此在某些彳月况下具有抑制作用，儘管此並非必定情 形。 此外’在以下實例中由所測試之不同TE元件所達成之特 定產率之相對變化很大程度上與載體系統無關，亦即與所 _ 用之可選擇標記或所關注之特定基因無關。 以下實例亦表明標記基因表現之變化與所關注基因表現 之變化相關。 由以下實例亦可明顯看出所測試之TE j件均無增強作 口此可巧楚瞭解TE元件僅在染色體水平促使所關注 基因之表現增加。
—以下實例亦表明複數個相同或不同之短TE元件(諸如TE _ 1件〇6及G8)之組合或級聯可產生額外表現增強作用。 實例 AP ： Asp(=D) bp ： CHO : DHFR : ELISA ： 驗:性磷酸酶 天冬胺酸 鹼基對 十國倉鼠卵巢 二氫葉酸還原酶 酵聯免疫吸咐檢定 120734.doc •68· 200815591
FACS ： 螢光活化細胞分選儀 GFP ： 綠色螢光蛋白 Gly(=G): 甘胺酸 HT ： 次黃嘌呤/胸苷 IgG ： 免疫球蛋白G Ile(=I)： 異白胺酸 IRES ： 内部核糖體進入位點 kb : 千驗基 mAb : 單株抗體 MCP-1 ： 單核細胞趨化蛋白-1 MTX ： 甲胺喋呤 NPT ： 新黴素磷酸轉移酶 PCR ： 聚合酶鏈反應 Phe(=F)： 苯丙胺酸 SEAP ： 分泌型鹼性磷酸酶 Ub ： 泛素 UTR ： 未轉譯區 方法 細胞培養及轉染 在細胞培養瓶中，在37°C下在潮濕氣氛及5% C02中，在 補充有次黃嘌呤及胸苷（HT)之無血清之CHO-S-SFMII培養 基（Invitrogen GmbH，Karlsruhe，DE)中以懸浮細胞形式永 久性培養細胞 CHO-DG44/dhfr-/-(Urlaub 等人，1983)。用 Coulter Counter Z2(Beckmann Coulter)或用 Cedex 120734.doc -69- 200815591 (Innovatis)測定細胞數及存活力，且接著將細胞以 lxl05-3xl05/mL之濃度接種且每隔2-3天處理一次。 使用 Lipofectamine Plus 試劑（Invitrogen GmbH)轉染 CHO-DG44。對於各轉染混合物，將總共1.0-1.3 pg之質 體-DNA、4 pL之Lipofectamine及6 μίν之Plus試劑依照製造 商說明書混合在一起，且以200 pL之體積添加至〇·8 mL補 充有HT之CHO-S-SFMII培養基中之6χ105個細胞。在細胞 培育箱中在37°C下培育3小時後，添加2 mL補充有HT之 CHO-S-SFMII培養基。培養48小時後，收集轉染混合物 (瞬間轉染）或使轉染混合物經歷選擇。對於基於NPT之選 擇，將細胞在轉染後2天轉移至具有用400 μg/mL G418(Invitrogen)的補充有 HT之 CHO-S-SFMII培養基中。 對於基於DHFR之選擇，將細胞在轉染後2天轉移至無HT 之CHO-S-SFMII培養基中。若進行共轉染（其中一表現載 體含有DHFR而另一表現載體含有NPT可選擇標記），則在 基於DHFR及基於NPT之選擇中，將細胞在轉染後2天轉移 至未添加次黃嘌呤及胸苷之CHO-S-SFMII培養基中且亦將 G41 8(Invitrogen)以400 pg/mL之濃度添加至培養基中。 可藉由將選擇劑 MTX(Sigma，Deisenhofen，DE)以 5-2000 nM之濃度添加至無HT之CHO-S-SFMII培養基中來達成經 整合之異源基因之基於DHFR之基因擴增。 表現載體
為分析表現，使用基於pAD-CMV載體（Werner等人， 1998)且藉由CMV增強子/倉鼠泛素/S27a啟動子（WO 120734.doc -70- 200815591 97/15664)或CMV增強子/CMV啟動子之组合介導異源基因 之表現的真核表現載體。儘管基本載體pBID含有可充當可 擴增之可選擇標記之dhfr-微型基因（例如參見EP-0-393-438)，但在載體pBING中dhfr微型基因已置換為經修飾之 NPT基因。此基因為NPT變異體D227G(Asp227Gly)。如 W02004/05 0884中所述來執行用NPT變異體D227G及IRES-GFP基因區選殖pBING。基本質體pTE4含有可選擇標記 NPT變異體F240I(Phe240Ile)且為質體pBING之衍生物。除 將NPT變異體D227G置換為NPT變異體F240I外，亦將GFP 置換為來自載體pDsRed2(Clontech，Palo Alto, CA，USA)之 紅色螢光蛋白DsRed2。基本質體pTE5含有可選擇標記 DHFR且為載體pBIDG(W02004/050884)之衍生物，其中 GFP 亦置換為來自载體 pDsRed2(Clontech，Palo Alto，CA， US A)之紅色螢光蛋白DsRed2。 為表現單株人源化IgGl抗體，將重鏈以1.4 kb Sall/Spel 片段形式選殖至經Xbal及Sail消化之質體pBID中，以得到 質體pBID-HC(圖1A)。另一方面，將輕鏈以0.7 kb BamHI/Hindlll片段形式選殖至質體pBING之切割位點，從 而產生質體pBING-LC(圖1A)。 將人類 MCP-1 cDNA(Yoshimui:a 等人，1989)以 0.3 kb Hindlll/EcoRI片段形式選殖至載體pTE4或pTE5之相應切 割位點，從而產生質體PTE4/MCP-1及pTE5/MCP-l(分別參 見圖1B及圖2)。 FACS(螢光活化細胞分選儀) 120734.doc •71 · 200815591 使用BD FACScalibur(BD Bioscience)進行流式細胞分 析。FACS配備有激勵波長為488 nm之氦-氬激光器。螢光 強度在適於特定螢光蛋白之波長下吸收且藉助於所附軟體 Cell Quest Pro進行處理0 ELISA (酶聯免疫吸附檢定) 使用OptEIA Human MCP-1 Set套組，依照製造商說明書
(BD Biosciences Pharmingen，Heidelberg，DE)，藉由 ELISA 量化上清液中經穩定轉染或經瞬間轉染之CHO-DG44細胞 中之MCP-1效價。 在一方面使用山羊抗人類IgG Fc片段（Dianova， Hamburg，DE)，且另一方面使用AP結合山羊抗人類κ輕鏈 抗體（Sigma)，根據標準程序（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人，1994，已更新）藉由 ELISA量化上清液中經穩定轉染之CHO-DG44細胞中之 IgGl mAb。使用經純化之IgGl抗體作為標準。 根據公式pg/((Ct-Co)t/ln(Ct-Co))計算產率（pg/細胞/ 天），式中Co及Ct分別為接種及收集後之細胞數且t為培養 時間。 SEAP檢定 使用SEAP報導基因檢定，依照製造商說明書（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，DE)量化培養物上清液中經 瞬間轉染之CHO-DG44細胞中之SEAP效價。 實例1 : TE元件TE-A之分離及選殖 自W097/15664中所述之倉鼠基因組中包含泛素/S27a基 120734.doc -72· 200815591 因之編碼區以及相鄰包括Ub/S27a-啟動子之5，UTR區之序 列起始，分離進一步上游迄今未知之序列區。為此，使用 銜接子接合之基因組CHO-DG44 DNA作為”巢式PCR”之基 質。使用與銜接子互補之引子或與W097/15664中所列序 列SEQ ID No· 5之5’區中之倉鼠序列互補之引子（引子 Ub20 ： 5，-CTCCACACATTTACACATGGACAC-3丨(SEQ ID No· 39)，對應於 WO 97/15664 中 SEQ ID No· 5之核苷酸62 至85(互補序列））之組合來進行第一輪PCR。接著，使用由 内部銜接子引子與内部（"巢式"）倉鼠特異性引子（引子 Ub21 : 5，-GGGTTTCTCTGTGTAATAGCCATG-3.(SEQ ID No· 40)，對應於 W097/15664 中 SEQ ID Νο·5之核苷酸 16至 39(互補序列））組成之第二引子組合來進行第二輪PCR。將 起始於具有已知序列之倉鼠特異性引子端且接著併入位於 上游之未知新序列區之所得重疊DNA片段次選殖至pCR2.1 ΤΟΡΟ載體（Invitrogen)中且藉由測序加以分析。全部348 bp之迄今未知之新序列係自倉鼠Ub/S27a基因之上游獲 得。 基於此新的序列資訊，使用上述’’巢式PCR”分離另一進 一步上游之DNA區。此次，使用銜接子引子及引子 Ub33(5，-ATCTCACTGTGTCTACCAACTTAG-3’（SEQ ID No-41) ， 位於新 分離之384 bp 序列之5’區中， 對應於SEQ ID No· 1之核苷酸1268_1291(互補序列））進行第一輪PCR，且 使用内部銜接子引子及進一步靠内之倉鼠特異性引子 Ub32a(5，-TCTGCACCACCACTACCTGACT-3/(SEQ ID No. 120734.doc •73- 200815591 42) ，位於新分離之384 bp序列内引子Ub33之上游，對應 於SEQ ID No· 1之核苷酸1243-1264(互補序列））進行第二輪 PCR。將所得經擴增之物質次選殖至pCR2.1 TOPO載體 (Invitrogen)中且測序。其含有來自倉鼠ub/S27a基因上游 的另一 1239 bp之迄今未知的新序列。 利用重疊PCR片段之序列資訊，使用引子ub34(5*-CTAAGAGTACTTGCCATGAGAGCCTGAA-3，(SEQ ID No· 43) ，位於新分離之1239 bp序列之最外5,端，僅部分存在 於 SEQ ID Νο·1(核苷酸 1 至 14)中）&Ub35(5，-CATTGATACACCACCAAAGAACTTG-3，（SEQ ID No. 44)， 對應於SEQ ID No. 1之核苷酸1941至1965(互補序列）），藉 由PCR擴增來自CHO-DG44基因組DNA之内聚序列區，其 包含所有至此所分離且有383 bp延伸至WO 97/15664中 SEQ ID No· 5之5’序列區中的部分片段。 將所得2 kb DNA片段與WO 97/15664中所述之序列ID No· 5之5’11丁11區經由内源EcoRI切割位點（位置353·358)接 合，但此切割位點可用Klenow DNA聚合酶藉由填補反應 消除。以同樣方式消除新分離之基因組區中的第二内源 EcoRI切割位點，從而在SEQ ID No. 1中形成原基因組序 列額外的核苷酸326至329。與内源倉鼠序列相比，以此方 式在SEQ ID No. 1中插入總共8個額外核苷酸。將自位於倉 鼠Ub/S27a基因上游之序列區所得的3788 bp DNA片段命名 為具有序列ID Νο·1之TE元件A且將其次選殖至載體 pBluescript SKM(Stratagene，La Jolla，CA)中。 120734.doc -74- 200815591 實例2 :多種TE表現載體之產生 從來自CHO基因組之3.8 kb TE元件TE-A(圖3，序列ID No. 1)起始，藉由PCR製備多種片段，其與TE元件TE-A相 比在端或31-端具有缺失（圖4及圖5)。為合成此等片段， 使用順向引子與一反置引子之組合（圖5及圖6)。為進行選 殖，經由引子使BamHI切割位點連接於片段之5’_端且使 BsrGI切割位點連接於片段之3’-端。由此產生12種具有不 同長度的TE元件，其命名為ΤΈ-01至TE-12(圖4及5)。在用 BsrGI及BamHI消化後，將此等片段以順向選殖至基本質 體PTE4/MCP-1(圖1B)或pTE5/MCP-l(圖2)之銜接子區中。 藉由SacII限制性酶消化自TE-A次純系分離片段丁£-00(SEQ ID No· 2)，且將其經由位於啟動子/增強子元件之 5·之Spel切割位點以順向與逆向選殖至基本載體pBING· LC(圖 1A)或 pBID-HC(Fig· 1A)中。 TE元件之序列 TE-A(序列 ID NO. 1) ccatgagagcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggag agaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttat gccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggatt cctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagt ttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactct acttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaat agatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtc aaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgacc 120734.doc -75- 200815591 acaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacagga tttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaac cttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataag taaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaa gage aatggatactttcccatagaacctgggtttgactccc age act aacctacatgg tgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacac gcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtg gag c c ag gctggggtggtggcccacacctttaatcc cage act ccagaaggcagag
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ttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctt tgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactc aggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttg tggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtc caggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttcca ctataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccct atctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttg gaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatcca cctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctct acctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccc cccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggt tactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacagg cgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttat ctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaa atgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaaca aaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttaga gggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgca accgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttccca ggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacag 實例3 : TE元件變異體TE-00對GFP及免疫球蛋白 Gl(IgGl)之表現的影響 研究在CHO_DG44細胞之兩個獨立的穩定轉染系列中， TE元件ΤΕ-00對位於細胞質内之GFP(綠色螢光蛋白）及分泌 120734.doc -95- 200815591 型單株IgGl抗體之表現的影響。為此，將CHO-DG44細胞 用以下質體組合或質體變異體共轉染： 無TE元件之對照質體pBING-LC(圖1A)及pBID-HC(圖 1A)
在啟動子/增強手上游具有以順向整合之TE元件ΤΕ-00之 pBING-LC及 pBID-HC 在啟動子/增強子上游具有以逆向整合之TE元件ΤΕ-00之 pBING-LC及 pBID-HC。 在轉染系列A中，製備4個池；在轉染系列B中，每種變 異體製備10個池。使用等莫耳量之兩種質體。為使得分子 總數相同，對照混合物中系列A中所用之DNA之總量為1 gg，而在含有TE元件之混合物中此量為1·3 gg。此差異係 由不同質體尺寸所引起，由於具有TE元件之質體比對照質 體大1.3倍。由於轉染混合物中所用之DNA之量可影響轉 染效率，因此在系列B中用300 ngn模擬DNA"(=無產物基 因、TE元件及真核可選擇標記之載體）平衡DNA之總量， 以使得具有對照質體之混合物亦含有總計1.3 pg之 DNA。作為陰性對照，亦在各轉染系列中操作模擬轉染 池，亦即以同樣方式處理，但在轉染混合物中不添加 DNA。轉染後兩天用-HT/+G418(400 pg/mL)對經穩定轉染 之細胞進行選擇。 選擇之後，藉由FACS測定表現GFP之細胞之比例。在曲 線圖重疊中比較兩轉染系列中之變異體得出具有TE元件〇〇 之池中表現GFP細胞之比例比具有對照質體之池大（圖7)。 -96- 120734.doc 200815591 在質體中存在順向或逆向之TE元件之各池之間未發現任何 型式之差異。因此，TE元件〇〇之作用（亦即，增加混合群 中具有較高產率之細胞之比例）與其取向無關。 此外，測定經六至八次繼代之時期（繼代節律2-2-3天）各 池之IgGl效價及特定產率。此再次證明含有TE元件〇〇之細 胞池平均表現超過無TE元件之細胞池（圖9，系列八及^。 在兩個系列中，可證明池產率因TE元件之存在而加倍，而 此與元件在表現質體中選殖之取向無關。 實例4 · TE元件ΤΕ_01至TE-12對MCP-1之表現的影響 研究在CHO-DG44細胞之三個穩定轉染系列（系列c、d 及E)中’與無TE元件情況下之表現相比，TE元件ΤΕ-01至 TE-12對分泌型MCP-1之表現的影響。在所有三個系列 中，每種質體變異體製備6個池。系列C及D中之基本質體 為PTE4/MCP-1(圖1B ;可選擇標記NPT=新黴素磷酸轉移酶 F240I)，系列E中為PTE5/MCP-1(圖2 ;可選擇標記DHFR= 二氫葉酸還原酶）。此等質體不含TE元件（=對照混合物）或 在啟動子/增強子之上游含有處於順向之TE元件TE-01至 TE-12之一。為將由轉染混合物中DNA之不同量所引起之 對轉染效率的影響降至最小，使用總計1 ·2 之質 體-DNA。視所引入之TE元件之尺寸而定，質體尺寸介於 6.7 kb與10.7 kb之間不等。然而，為確保所有混合物中測 試質體之分子總數保持恆定，在具有較小質體分子之混合 物中用所謂的模擬質體平衡DNA之總量，該模擬質體既不 含有產物基因及TE元件，亦不含有任何真核可選擇標記。 120734.doc -97- 200815591 作為陰性對照，對於各轉染系列，亦操作模擬轉染池，亦 即以同樣方式處理，但不添加DNA至轉染混合物中。轉染 後兩天，在系列C及D中用補充有HT之CHO-S-SFMII+G418(400 pg/mL)且在系列 E 中用無 HT 之 CHO-S· SFMII對經穩定轉染之細胞進行選擇。 選擇之後，藉由FACS測定表現dsRed2之細胞之比例。 圖8展示系列C中存活轉染細胞之相對螢光百分比。與對照 池相比，含有TE元件TE-01、TE-02或TE-08之池含有多達 3至3·5倍的表現dsRed2之細胞，且具有元件TE-06之池含 有多達約2倍的表現dsRed2之細胞。另一方面，與對照池 相比’在具有片段T E 0 5及T E - 0 9之池中’表現d s R e d 2之細 胞之比例未明顯提高。 此外，經6次繼代之時期（繼代節律2-2-3天）MCP-1產物 效價及特定產率亦升高。圖9(系列C及D)及圖10(系列E)展 示相對特定MCP-1產率。與無TE元件之對照池相比，與可 選擇標記NPT-F240I—起使用之元件TE-08展示特定MCP-1 產率之最大增長（5.3倍）（圖9)。在此變異體中與可選擇標 記DHFR組合可達成6倍之增長（圖10)。與對照池相比，TE 元件01、02及03可使NPT選擇池之產率增加4至4.5倍（圖9) 且使DHFR選擇池之產率增加2.6至6.8倍（圖10)。在所有系 列中，長僅為300 bp之TE元件06亦能夠使產率增加2.5至 3.2倍（圖9及10)。用片段TE-04及TE-07達成之增長亦為此 數量級（圖10)。使用稍長片段TE-10、TE-11及TE-12之池 展示雙倍的MCP-1表現（圖9及10)。顯然，在所有此等池 I20734.doc -98- 200815591 中，幾乎不表現或不表現產物之細胞的數目減少且因此細 胞群中總體高產者之比例提高。此指示7£元件能夠抑制、 遮蔽或消除負面染色體位置效應。 相比之下，如有關dsRed2表現之所見，與對照相比藉由 使用片段TE-05及TE-09未能增加表現（圖8)，且在某些情 況下表現甚至更低（圖9及10) 〇此等元件或此等序列區中之 部分片段因此可能甚至具有抑制作用。 總之，所觀測到之MCP-1表現之變化與穩定細胞池中表 現dsRed2之細胞之比例有關。 實例5 · TE元件TE-01至TE-12增強子活性之測試 藉由瞬間轉染CHO-DG44細胞進行測試以瞭解所觀測到 之產物表現之增加實際上是基於TE元件之染色質開放作用 還是基於增強子活性。當質體在瞬間轉染中未整合至基因 組内時，直接由質體讀出遺傳資訊。因此，不存在染色體 位置效應。若仍存在對基因表現之正面影響，則此等影響 可歸因於存在於TE元件中之增強子。該等增強子可以順式 疋位作用於啟動子之活性（與位置及取向無關）且刺激功能 上連接基因之轉錄。 在圖11中所示之瞬間表現研究中，將6個池用基本質體 PTE4/MCP-1(=對照；圖1B)或其衍生物轉染，該等衍生物 各自額外在啟動子/增強子之上游含有TE元件TE-01至 TE-12之一。在以3 mL總體積培養48小時後，進行收集且 藉由ELISA測定細胞培養物上清液中之MCP-1效價。藉由 用SEAP表現質體共轉染（每種轉染混合物添加1〇〇 ng質體 120734.doc -99- 200815591 DNA)及隨後量測SEAP活性來修正轉染效率之差異。圖J J 展示6個平行池之平均值。資料表明，在所有池中細胞培 養物上清液中之]V1CP-1效價極其類似，且在表現上與無TE 元件之對照質體PTE4/MCP-1無顯著差異。因此，在經穩 定轉染之細胞池中，由某些TE元件所引起之2倍以上之產 率提高並非基於TE序列中存在增強子。因此，對於藉由 TE元件獲得表現增強而言，染色體整合是絕對必需的。 實例6 :其他TE元件之製備及不同TE元件位置及組合之 測試 可以類似於實例2中所述之方法產生序列m N〇· i之其他 口P为片段或其衍生物，且如實例3及5中所述測試其對產率 之正面衫響。可此片段之一些實例展示於圖12中。迄今所 獲得之結果指示（例如）圖12中所示之序列1〇 N〇· i之區亦 可促使基因表現增加。在穩定轉染系列中，關於對特定產 率之影響更精確表徵此等新的TE元件，以便定位及進一步 縮小具有功肖b重要性之序列區之範圍。將功能縮小在特定 序列區之範圍内及相關之片段長度之可能降低有利於表現 載體之有效使用，因為表現質體越小越穩定且越易於在選 殖期間與在轉染期間操控。 此外，可在質體内以彼此間之任何取向以及任何位置排 列相似或不同的片段區。亦可在敎轉染系列中研究何種 組合有可能使表現達成最佳增長。圖13中展示某些實施 例’該等實施例無任何限制性。因此，舉例而t，研究應 判疋TEtg件TE-06及TE-08當側接於產物基因兩侧或相繼 120734.doc -100- 200815591 排列時能否促使表現額外增強。此外，亦可設想諸如TE元 件06及08之可相同或不同之短ΤΕ元件之級聯（例如）亦可產 生額外的表現增強作用。 其他ΤΕ元件 ΤΕ元件 13(序列 ID NO· 15) gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtag ctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagaca cccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctgg
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aaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagt agaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatg atagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaa atatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagt gagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaat atacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttt tatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatca aagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacg tggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaag tgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaa aattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtaga gggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaact caggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaa agctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagag gggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccct aggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaac 120734.doc -103 - 200815591 tttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc TE元件 18(序列 ID NO· 20) gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtag ctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagaca cccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctgg agggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgact cccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacac acacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttaga
cagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcc cagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggt ctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaa aactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagt ggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcag agggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaata tttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtgg tgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctag tgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataatt ttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaattt accagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaa tttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccaggg agacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacac agagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagta tgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattctt cctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcat 120734.doc •104- 200815591 tagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttg ctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgt ggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtg tatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatg tccttgtccc TE元件 21(序列 ID NO. 21)
cttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgt gcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttc ctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttggg aagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacac cttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgag gacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctcta actctgactccagagtttagagactataaccagatag 實例7 : TE元件TE-13至TE-18對MCP-1之表現的影響 研究在CHO-DG44細胞之穩定轉染系列（系列F)中，與無 TE元件情況下之表現相比，TE元件TE-13至TE-18對分泌 型MCP-1之表現的影響。每種質體變異體製備4個池。在 所有系列中，基本質體為PTE4/MCP-1(圖1B ;可選擇標記 NPT=新黴素磷酸轉移酶F240I)。各種質體變異體不含TE 元件（=對照混合物）或於啟動子/增強子之上游含有處於順 向之TE元件TE-13至TE_18之一（圖12)。為將由轉染混合物 中DNA之不同量所引起之對轉染效率的任何影響降至最 小，各情況下均使用總計1·2 gg之質體DNA。視所引入之 TE元件之尺寸而定，質體尺寸介於6.7 kb與8.2 kb之間不 120734.doc -105- 200815591 等。作為陰性對照，在各轉染系列中同時操作模擬轉染 池，亦即以同樣方式處理，但在轉染混合物中不添加 DNA。轉染後兩天，使用補充有HT之CHO-S-SFMII+G41 8(400 pg/mL)對經穩定轉染之細胞進行選擇。 獲得經5至6次繼代之時期（繼代節律2-2-3天）MCP-1之產 物效價及特定產率。圖14(系列F)展示相對特定MCP-1產 率。該等各元件均可使MCP-1平均表現增加。使用元件13 獲得最大增長（15倍），其甚至超過元件08所產生之10倍增 長。 實例8 : 各種位置及各種組合之TE元件對MCP-1表現的 影響 研究在CHO-DG44細胞之兩個穩定轉染系列（系列G及H) 中，與無TE元件情況下之表現相比，表現質體中各種組合 及各種位置之TE元件TE-06及TE-08對分泌型MCP-1之表現 的影響。在兩個系列中，每種質體變異體製備6個池。基 本質體為PTE4/MCP-1 (圖1B ;可選擇標記NPT=新黴素磷酸 轉移酶F240I)。個別質體變異體不含TE元件（=對照混合 物），或在增強子/啟動子元件之前含有TE-08或TE-A，或 在增強子/啟動子元件之前含有TE-0-6與TE-08之組合，或 在增強子/啟動子元件之前含有逆向之TE-08或TE-09(系列 G)。在系列Η中，在增強子/啟動子元件（E/P)之前且另外在 終止信號（Τ)之後使用元件ΤΕ-06及ΤΕ-21或ΤΕ-08(圖13)。 為將由轉染混合物中DNA之不同量所引起之對轉染效率的 任何影響降至最小，各情況下均使用總計1.2 pg之質體 120734.doc -106- 200815591 DNA。視所引入之ΤΕ元件之尺寸而定，質體尺寸介於6·7 kb與10·2 kb之間不等。作為陰性對照，在各轉染系列中同 時操作模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但在轉染混合 物中不添加DNA。轉染後兩天，使用補充有HT之CHO-S-SFMII+G418(300 pg/mL)對經穩定轉染之細胞進行選擇。 獲得系列G中經6次繼代之時期（繼代節律天）MCP-1 之產物效價及特定產率在。亦對系列Η使用相同程序。圖 15展示系列G之相對特定MCP-1產率。所有元件均可使 MCP-1平均表現增加。最大增長（4倍）係由元件ΤΕ-Α產 生。在表現序列盒之前及之後使用元件TE-06及TE-21或 TE-08可產生增長。 實例9 : TE元件TE-08對兩種免疫球蛋白G-4(IgG-4)之表 現的影響 研究在CHO-DG44細胞之穩定轉染系列（系列J)中，與無 TE元件情況下之表現相比，TE元件TE-08對兩種IgG-4抗 體之表現的影響。用基本質體PBIN-LC2或pBIN-LC3及 PBID-HC2 或 pBID-HC3 製備 24個池，且用 pBIN-LC2/TE08 或 pBIN-LC3/TE08 及 pBID-HC2/TE08 或 pBID-HC3/TE08 製 備24個池（圖16 ;可選擇標記NPT=新黴素磷酸轉移酶F240I 及dhfr=二氫葉酸還原酶）。為將由轉染混合物中DNA之不 同量所引起之對轉染效率的任何影響降至最小，在各情況 下均使用總計1.2 gg之質體DNA。視所引入之TE元件之尺 寸而定，質體尺寸介於6.1 kb與7.5 kb之間不等。作為陰性 對照，在各轉染系列中同時操作模擬轉染池，亦即以同樣 120734.doc -107· 200815591 方式處理，但不添加DNA至轉染混合物中。轉染後兩天， 使用無HT之CHO-S-SFMII+G418(400 pg/rnL)對經穩定轉染 之細胞進行選擇。 獲得經4次繼代之時期（繼代節律2-2-3天）IgG-4之產物效 價及特定產率。元件08使得IgG4抗體之表現中之平均表現 率增加。此外，元件TE-08之存在亦可增加獲得高產細胞 池之機率。 實例10 : TE元件對293F細胞中之蛋白質表現的影響 研究在HEK293游離型細胞之穩定轉染系列（系列K)中， 與無TE元件情況下之MCP-1表現相比，各種TE元件對分泌 型MCP-1之表現的影響。基本質體為pTE4-4/MCP-l(圖 1B ;可選擇標記NPT=新黴素磷酸轉移酶F240I)。在增強 子/啟動子之上游使用順向之元件TE-08、TE-13及TE-A， 且每種質體變異體製備7-10個池。為將由轉染混合物中 DNA之不同量所引起之對轉染效率的任何影響降至最小， 在各情況下均使用總計1.2 pg之質體DNA。視所引入之TE 元件之尺寸而定，質體尺寸介於6.7 kb與10.2 kb之間不 等。作為陰性對照，在各轉染系列中同時操作模擬轉染 池，亦即以同樣方式處理，但不添加DNA至轉染混合物 中。轉染後兩天，用293 SFM II培養基+4 mM麩醯胺酸 +G418(100 pg/rnl)對經穩定轉染之細胞進行選擇。 獲得經5至6次繼代之時期（繼代節律2-2-3天）MCP-1之產 物效價及特定產率。在HEK293游離型細胞中，元件 TE-08、TE-13及TE-A使表現增加。 120734.doc -108- 200815591 實例11 : TE元件ΤΕ-08對酶（SEAP)表現之影響 研究在CHO-DG44細胞之穩定轉染系列（系列L)中，與無 TE元件情況下之8£八？表現相比，丁£元件丁£-08對酶
I (SEAP)表現之影響。每種質體變異體製備6個池。基本質 體為pTE-4/SEAP。其係藉由將MCP-l-IRES-DsRed2表現序 列盒替換為SEAP來產生。將元件TE-08選殖至銜接子A中 (圖1B，可選擇標記NPT=新徽素填酸轉移酶F240I)。為將 由轉染混合物中DNA之不同量所引起之對轉染效率的任何 影響降至最小，在各情況下均使用總計1.2 pg之質體 DNA。視所引入之TE元件之尺寸而定，質體尺寸介於6_6 kb與7·6 kb之間不等。作為陰性對照，在各轉染系列中同 時操作測試模擬轉染池，亦即以同樣方式處理，但不添加 DNA至轉染混合物中。轉染後兩天，用補充有HT之CHO-S-SFMII+G418(400 pg/mL)對經穩定轉染之細胞進行選 擇。 使用可購得之SEAP檢定（Clontech)來測定且獲得經6次 繼代之時期（繼代節律2-2-3天）的相對SEAP表現。在諸如 SEAP之酶表現期間，元件TE-08使平均表現增加。 參考文獻清單
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IgGl抗體。在此情況下，”E/P”為CMV增強子與倉鼠泛素/ S27a啟動子之組合，”P"僅為啟動子元件且”T”為經轉錄 mRNA之多聚腺苷酸化所必需之轉錄終止信號。各轉錄單 元内轉錄起始之位置及方向由箭頭指示。對於選殖ΤΈ元 件，Spel切割位點（’’Sper)存在於啟動子/增強子組合之 前。可擴增之可選擇標記二氫葉酸還原酶縮寫為 ’’DHFR”。可選擇標記新黴素磷酸轉移酶含有點突變D227G 且在圖中相應縮寫為"D227G”。源自腦心肌炎病毒之 "IRES"元件充當雙順反子轉錄單元内之内部核糖體結合位 點且使得其後綠色螢光蛋白’’GFP”可轉譯。nHC”及"LC"分 別編碼人源化單株IgGl抗體之重鏈及輕鏈。 使用B所示之載體在CHO-DG44中表現重組蛋白MCP1。 "E/P”為CMV增強子與CMV啟動子之組合，’’P”僅為啟動子 元件且"T"為經轉錄mRNA之多聚腺苷酸化所需之轉錄終止 信號。各轉錄單元内轉錄起始之位置及方向由箭頭指示。 對於選殖TE元件，將具有限制性核酸内切酶切割位點之序 列區”A”（銜接子）插在啟動子之前。 可選擇標記新黴素磷酸轉移酶含有點突變F240I且在圖 中相應縮寫成F240I。源自腦心肌炎病毒之IRES元件充當 雙順反子轉錄單元内之内部核糖體結合位點且使得其後紅 色螢光蛋白ndsRed"可轉譯。"MCP-1'編碼人類單核細胞趨 化蛋白-1。 圖2 : AN MCP-1基本載體之示意圖 使用此圖所示之載體在CHO-DG44細胞中表現重組蛋白 120734.doc -114- 200815591 MCP-1。”E/P”為CMV增強子與CMV啟動子之組合，”P"僅 為啟動子元件且"T”為經轉錄mRNA之多聚腺苷酸化所需之 轉錄終止信號。各轉錄單元内轉錄起始之位置及方向由箭 頭指示。對於選殖ΤΉ元件，將具有限制性核酸内切酶切割 位點之序列區"A”（銜接子）插在啟動子之前。可選擇標記 二氫葉酸還原酶在圖中縮寫為’’dhfr”。源自腦心肌炎病毒 之IRES元件充當雙順反子轉錄單元内之内部核糖體結合位 點且使得其後紅色螢光蛋白"dsRedn可轉譯。” MCP-1”編碼 人類單核細胞趨化蛋白-1。 圖3 : CHO泛素/S27S基因之5’序列 包含3788 bp之序列區（SEQ ID No· 1)係分離自CHO(中國 倉鼠卵巢）細胞之基因組且位於Ub/S27a基因之編碼區上 游，該基因為泛素單元（Ub)與小核糖體亞單元之核糖體蛋 白（S27a)之間的融合體。 圖4 : TE元件00至12之圖示 此圖示意性展示次選殖於質體中，位於CHO泛素/S27a 基因之編碼區上游之3 7 8 8 b p之基因組序列區。由此基因 組序列（SEQ ID No. 1)(亦稱為TE元件A)可製備不同長度之 部分片段（下文稱TE元件）。TE元件00(SEQ ID No· 2)係作 為Sac II限制性片段分離自此序列之次純系且經選殖至目 標載體pBID-HC及pBING-LC之Spel切割位點。此等載體含 有IgGI之重鏈（HC)或輕鏈之基因（參見圖1A)。因此，形成 表現載體，其中TE元件00以順向及逆向定位於啟動子上 游。TE元件01至12可使用多種引子對（參見圖5及6)藉由 120734.doc -115- 200815591 PCR製得且經由BamHI/BsrGI選殖至基本質體pTE4/MCP_ 1(圖 1B)及pTE5/MCP-l(圖 2)中。 圖5 : TE元件00至12 此表展示由TE-A序列（SEQ ID No· 1)製得之TE元件00至 21之尺寸及起始位置與末端位置。對於藉由PCR製得之片 段，另外指定所用引子。元件之尺寸等級為約500 bp，且 與起始序列TE-A(SEQ ID No.l)相比在5’端或3，端具有缺 失。 圖6:用於合成TE元件01至12之引子 此等引子以5’-3’方向展示。名稱中具有” for”之引子為 SEQ ID No· 1順向之引子，具有"rev"之引子為逆向之引 子。各引子由以下各物組成：5’端6個核苷酸，其後為 BamHI或BsrGI切割位點及與SEQ ID No. 1中之序列部分 100%同源之約20至30個核苷酸之序列。引子中與SEQ ID No· 1同源之區域展示為粗體。使用一個f〇T引子及一個rev 引子擴增SEQ ID No.l之序列區。將所得PCR產物經由 BamHI及BsrGI選殖至基本質體pTE4/MCP-l(圖1B)或 pTE5/MCP-l(圖 2)中。 圖7 :轉染系列B之FACS量測 此圖展示與無TE元件00之細胞相比，在具有TE元件00 之細胞中GFP表現之相對增強。對此，將CHO_DG4細胞用 質體組合pBING-LC與pBID-HC轉染，該等組合彼此間不 同之處僅為TE元件00之存在及取向。在於無HT之培養基 中經由添加G418對經轉染之細胞池進行長達兩至三週之選 120734.doc -116- 200815591 擇後，藉由FACS分析法量測GFP螢光。除作為陰性對照之 未經轉染之CHO-DG44細胞（DG44)外，各曲線圖由各情況 下轉染系列B之10個池之GFP螢光值之平均值組成。每池 研究20000個細胞。’’對照”表示基本質體pBING-LC與 pBID-HC，”逆向"表示基本載體中TE元件00為逆向，而π 順向”指示基本載體中ΤΕ元件00為順向。 圖8 :轉染系列C之FACS量測 此圖展示與不含有TE元件之細胞群中之細胞相比，含有 TE元件01、02、05、06、08或09之穩定細胞群中表現 dsRed2之細胞之比例。對此，將CHO-DG44細胞用質體 pTE4/MCP-1或由其所獲得之額外含有上述TE元件之一的 衍生物轉染。在於添加G418之培養基中對經轉染之細胞池 進行長達約三週之選擇後，藉由FACS分析法量測dsRed2 螢光。每池量測10000個細胞且減去未經轉染之CHO-DG44 細胞之固有螢光值。各值為轉染系列C之6個池之表現 dsRed2之細胞之平均百分比。 圖9 : TE元件對特定產率之影響 此圖以圖示（A)或表格形式（B)展示，與無TE元件之對照 池相比，IgGl或MCP-1之表現量因存在TE元件而獲得之變 化。細胞池係藉由用基本質體pBING-LC及pBID-HC或 pTE4/MCP-l("對照"）及由其所獲得之衍生物穩定轉染 CHO-DG44細胞而製得，各衍生物額外含有TE元件（順向 "00，，（，，00順向 π)及逆向"〇〇M("〇〇逆向 ”）、η〇1π至"12”）。在於 無ΗΤ之培養基中經由添加G418(系列Α及Β)或於含ΗΤ之培 120734.doc -117- 200815591 養基中經由添加G41 8(系列C及D)對經轉染之細胞池進行長 達兩至三週之選擇後，藉由ELISA量測細胞培養物上清液 中之蛋白貝表現且計异每天每個細胞之特定產率。經由在 75 cm2 T形燒瓶中，以2-2-3天之繼代節律數次繼代進行經 穩疋轉染之CHO-DG44細胞之培養。在系列A中，在培養 中經8次繼代測試取自質體組合"〇〇逆向"及,，⑽順向”之4個 池及對照之3個池；在系列b中，經6次繼代測試各質體組 合之10個池；且在系列C及D中，經由6次繼代測試各類型 質體之6個池。對質體組合及系列之池之特定產率取平均 值且將各系列中之對照平均值設定為丨。將具有TE元件之 池之特定產率平均值與此值相比較。 圖10 : TE元件對經DHFR選擇之細胞池之特定產率之影響 此圖以曲線圖（A)或表（B)之形式展示，與無te元件之對 照池相比，MCP-1之表現量因存在TE元件而產生之變化。 細胞池係藉由用基本質體pTE5/MCP-l(，，對照"）或由其所獲 得之各自額外含有TE元件（”01”至"12”）之衍生物穩定轉染 CHO_DG44細胞而製得（系列E)。在於無HT之培養基中對 經轉染之細胞池進行長達兩至三週之選擇後，藉由eusa 量測細胞培養物上清液中之蛋白質表現且計算每天每個細 胞之特定產率。經由在75 cm2 T形燒瓶中，以2_2_3天之繼 代節律數次繼代進行經穩定轉染之CH〇_DG44細胞之培 養。培養中各質體變異體之6個池經6次繼代。對質體變異 體之池之特定產率取平均值且將對照平均值設定為丨。將 具有TE元件之池之特定產率平均值與此值相比較。 120734.doc -118- 200815591 圖11 :測試TE元件之增強子活性 與無ΤΕ元件之對照載體相比，當使用具有ΤΕ元件之表 現載體時’ CHO-DG44細胞之瞬間轉染未展示MCP-1效價 顯著增加。因此ΤΕ元件01至12不充當增強子且因此僅在整 合至染色體中時才促使表現顯著增加。用PTE4/MCH(對 照）及自其所獲得之各自額外含有ΤΕ元件（”〇1”至，，i 2")之衍 生物轉染6個池。同時共轉染SEAP表現質體以測定轉染效 率（SEAP=分泌型鹼性磷酸酶）。以總體積3 ml培養48小時 後，移除細胞培養物上清液且藉由ELISA測定MCP-1效價 且測定SEAP活性。相對於藉由seAP表現所測定之轉染效 率修正MCP-1效價。圖中展示6個平行池之平均值與標準 偏差。 圖12 :其他TE元件 對此之結果指示選擇此圖中所示之序列ID N〇 . i之片段 亦可使得基因表現增加。選殖及穩定轉染此等額外TE元件 旨在更清晰地表徵序列ID No· 1以便更準確地定位對功能 至關重要之序列區。 圖13 : TE元件之不同位置及組合之測試 此圖描述可能的表現載體之選擇，其中使用1£元件之不 同位置、⑯向及組合來研究是$可以此匕#式達成表現之額 外增加。TE元件不僅可與產物基因侧接，而且多個相同或 不同之短TE元件亦可縱向連接在一起，諸如TE元件⑽與 08或新的TE元件13與14。 圖14 · TE元件TE 13至TE 18對特定Mcp]表現之影響 120734.doc -119· 200815591 此圖示意性展示與無TE元件之對照池相比，MCP-1之表 現量因ΤΈ元件之存在而產生之變化。細胞池係藉由用基本 質體pTE4/MCP-l(”對照”）或由其所獲得之各自額外含有TE 元件（"13”至”18’’）之衍生物穩定轉染CHO-DG44細胞而製得 * (系列F)。在於補充有HT之培養基+G418(4〇0 pg/ml)中對經 • 轉染之細胞池進行長達兩至三週之選擇後，藉由ELISA量 測細胞培養物上清液中之蛋白質表現且計算每天每個細胞 之特定產率。經由在75 cm2 T形燒瓶中，以2-2-3天之繼代 _ 節律數次繼代進行經穩定轉染之CHO-DG44細胞之培養。 各質體變異體之4個池在培養中經5至6次繼代。對質體變 異體之池之特定產率取平均值且將對照平均值設定為1。 將具有TE元件之池之特定產率平均值與此值相比較。 圖15 :各種位置及各種組合之TE元件對MCP-1表現之影響 此圖示意性展示與無TE元件之對照池相比，MCP-1之表 現量因不同TE元件之存在及組合而產生之變化。細胞池係 藉由用基本質體pTE4/MCP-l(”對照”）或由其所獲得之各自 ^ 額外含有一或兩個TE元件（"06及08、08rev、09rev、A”）之 衍生物穩定轉染CHO_DG44細胞而製得（系列G)。在於補充 有HT之培養基+G418(300 pg/ml)中對經轉染之細胞池進行 長達兩至三週之選擇後，藉由ELISA量測細胞培養物上清 液中之蛋白質表現且計算每天每個細胞之特定產率。經由 在6孔培養盤（MAT6)中，以2-2-3天之繼代節律數次繼代進 行經穩定轉染之CHO-DG44細胞之培養。各質體變異體之6 個池在培養中經6次繼代。對質體變異體之池之特定產率 120734.doc -120- 200815591 取平均值且將對照平均值設定為1。將具有TE元件之池之 特定產率平均值與此值相比較。 圖16:以IgG-4抗體測試ΤΕ元件ΤΕ-08 使用此圖所示之載體在CHO-DG44細胞中表現重組單株 — IgG4抗體。在此情況下，E/P為CMV增強子與啟動子之組 ^ 合，P僅為啟動子元件且T為經轉錄mRNA之多聚腺苷酸化 所需之轉錄終止信號。各轉錄單元内轉錄起始之位置及方 向由箭頭指示。選殖輕鏈（LC)及重鏈（HC)之基因替代 • MCP-l-IRES-dsRed2序列盒（圖1B及2)。其分別編碼人源化 單株IgG-4抗體之重鏈及輕鏈。可擴增之可選擇標記二氫 葉酸還原酶縮寫為"dhfr"。可選擇標記新黴素磷酸轉移酶 含有點突變F240I且在圖中相應縮寫為F240I。 120734.doc 121·
200815591 序列表 <110> 德商百靈佳殷格翰製藥公司 <120> 調控核酸元件 <130〉 P01-2092 <140〉 096121483 <141〉 2007-06-14 <150> EP 06117862.0 <151〉 2006-7-26 <160〉44 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 . <211> 3788 <212> DNA <213〉人造 <220> <223>中國倉鼠衍生物，額外8個核苷酸 <400> 1 ccatgagagc ctgaagacct gagttgatac ccagaaccca gatcaagatg gaggagagaa ccagccccac taagctgtcc cctgaccccc ataaatgcct ccctgtccag ttatgccaca caatgatagg tgaatacaga aaaacaccct tcctttagac actaagcgga ttcctcttac gcataccagt taagtgatag ttcttaggct tcaactcagc actttaaaaa gtttataltt tgcaatgctg gggactaaat tagggttgtg cacatgctaa gtaagcactc tacttttgta tcacatttta ataattgtaa gaattaattc gtgaaatagt agctgagaca atagatttgt ttctttcatg tgggaactgc tgtgtgtgct tcttgctgat gcaaacaagg tcaaatactt taitccccag tgtctgccta gccctgtaac acttctctat tatacaatga ccacaaataa ttaggtgagt gggttttgtt tcattttaaa ttgttgctat tttagagaca ggatttcttg caaacctggt tggtct taaa ctccgtatgt agctgagaat gaccttgaaa accttcctgt cccacccctc aaattccaga attatagaca cccaccacat ggcttaataa gtaaacaaca acaataaaag catgacttct gggtctggag ggagggcttg ccagttaaga gcaatggata ctttcccata gaacctgggt ttgactccca gcactaacct acatggtgat agtgatgcag cagacataca tgagggcaac acacacatgg gcacatacac acgcacccgc ccaccatggc Uticcccca tcacttagac agccatattt aaacgtagtg gagccaggct ggggtggtgg cccacacctt taatcccagc actccagaag gcagaggtag gcggatctct gtgggtttga gaccagcctg gtctacaaga gctagttcca ggacagcctc caaagccata gagaaaccct atctcaaaaa actgaaacaa caacaacaac aaaacaaaat aaaaaaacaa caaaagaatc ttagtggttc agtggttcca cacacaggaa agtagaaagg gccttgatgg gaaggttttc agagggagga gtatggatga gacaggatga tagtgaaaag aactcaaatt aaitaaatat ttgaaactat ctaagaataa aagctaaaat antaaaatt acagtcaggt agtggtggtg cagagggcta agttggtaga cacagtgaga tccaggccag ccagggctac ctagtgagac cttgttcaaa taactaataa aatatacaaa ataaaggaga caccacaata attttgaaat gtaaaagact aaattiacct tttatattga tgagttggat aaaaaaatca atttaccaga gaacataaag tagtcccatc aaagacaaaa gcaatatatg attaaactct aatttaaaag 120734·序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500
200815591 tttgttagag cctggcaacg tggcacatac ctttaatccc agcaccaggg agacagaggc catcctggtc taaaaagtga tctccaggac agccatggct attacacaga gaaaccctgt ctggaaaaac aaaaaattag tgtccatgtg taaatgtgtg gagtatgctt gtcatgccac aiacagaggi agagggcagt tiatgggagt cagttectat tetteettta tgggggacct «gggactgaa ctcaggtcat caggcttggc agaaagtgca ttagctcacg gageettate atiggegaaa gctctclcaa gtagaaaatc aatgtgtttg ctcatagtgc aatcattatg tttegagagg ggaagggtac aatcgttggg gcatgtgtgg tcacatctga atageagtag ciccctagga gaattaattc caagttcttt ggtggtgtat caatgcccit aaaggggtca acaacttttt ttccctctga caaaactatc ttcttatgtc cttgtccctc atattigaag Uittttattc tttgcagtgt tgaatatcaa ttctagcacc tcagacatgt taggtaagta ccctacaact caggttaact aatttaattt aactaattta accccaacac tttttctttg ttiatccaca tttgtggagt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcgcgcgcgc gcgcgctcgg atcattctac cttttgttta aaaaatgtta gtccaggggt ggggtgcact gtgaaagtct gagggtaact tgctggggtc agttctttcc actataggac agaactccag gtgtcaactc tttactgaca gaaccatcca aatagcccta tctaatttta gttttttatt tatttatttt ttgtttttcg agacagggtt tctctgtggc tttggaggct gtcctggaac tagetettgt agaccaggct ggtctcgaac tcagagatcc acctgcctct gcctcctgag tgctgggatt aaaggcatgc gccaccaacg ettggeteta cctaatttta aaagagattg tgtgtcacaa gggtgtcatg tcgccctgca accacccccc ccccaaaaaa aaaaaaaaaa aaacttcact gaagctgaag cacgatgatt tggttactct ggctggccaa tgagetetag ggagtctcct gtcaaacaga atctcaacag gcgcagcagt cttttttaaa gtggggttac aacacaggtt tttgeatate aggcatttta tetaagetat ttcccagcca aaaatgtgta ttttggaggc ageagageta atagattaaa atgagggaag agcccacaca ggttattagg aagataagea tettetttat ataaaacaaa accaaaccaa actggaggag gtctaccttt agggatggaa gaaaagacat ttagagggtg caatagaaag ggcactgagt ttgtgaggtg gaggactggg agagggegea accgctttaa ctgtcctgtt ttgcctattt tttggggaca gcacatgttc ctatttttcc caggatgggc aatctccacg tccaaacttg cggtcgagga ctacagtcat tttgcaggtt tccttactgt atggctttta aaacgtgcaa aggtgaccat taaccgtitc acgctgggag ggcacgtgcg gctcagatgc ttcctctgac tgagggccag gagggggcta cacggaagag gccacacccg cacttgggaa gactcgattt gggcttcagc tggctgagac gccccagcag gctcctcggc tacaccttca gccccgaatg ccttccggcc cataaccctt cccttctagg caittccggc gaggacccac cctcgcgcca aacattcggc cccatccccc ggtcctcacc tgaateteta actctgactc cagagtttag agactataac cagatagccc ggatgtgtgg aactgcatct tgggacgagt agttttagca aaaagaaagc gacgaaaaac tacaattccc agacagactt gtgttacctc lettctcatg ctaaacaagc cccctttaaa ggaaagcccc tettagtege atcgactgtg taagaaaggc gtttgaaaca ttttaatgtt gggcacaccg tttegaggae 120734-序列表.doe -2- 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720
200815591 cgaaatgaga aagagcatag ggaaacggag cgcccgagct agtctggcac tgcgUagac agccgcgg <210> 2 <21l> 2210 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400〉 2 gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc alcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt acaatcgtig gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattaat tccaagttct ttggtggtgt atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt ttttccctct gacaaaacta tcttcttatg tccttgtccc tcatatttga agtattttat tctttgcagt gttgaatatc aattctagca cctcagacat gttaggtaag taccctacaa ctcaggttaa ctaatttaat ttaactaatt taaccccaac actttttctt tgtttatcca catttgtgga gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtglgt gtgtgtgtgt ^tgcgcgcgc gcgcgcgctc ggatcattct accttttgtt taaaaaatgt tagtccaggg gtggggtgca ctgtgaaagt clgagggtaa cttgctgggg tcagttcttt ccactatagg acagaactcc aggtgtcaac tctltactga cagaaccatc caaatagccc tatctaattt tagtttttta tttatttatt ttttgttttt cgagacaggg tttctctgtg gctttggagg ctgtcctgga actagctctt gtagaccagg ctggtctcga actcagagat ccacctgcct ctgcctcctg agtgctggga ttaaaggcat gcgccaccaa cgcttggctc tacctaattt taaaagagat tgtgtgtcac aagggtgtca tgtcgccctg caaccacccc ccccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaacttca ctgaagctga agcacgatga tttggttact ctggctggcc aatgagcict agggagtctc ctgtcaaaca gaatctcaac aggcgcagca gtctttttta aagtggggtt acaacacagg tttttgcata tcaggcattt tatctaagct atttcccagc caaaaatgtg tattttggag gcagcagagc taatagatta aaatgaggga agagcccaca caggttatta ggaagataag catcttcttt atataaaaca aaaccaaacc aaactggagg aggtctacct ttagggatgg aagaaaagac atttagaggg tgcaatagaa agggcactga gtttgtgagg tggaggactg ggagagggcg caaccgcttt aactgtcctg ttttgcctat tttttgggga cagcacatgt tcctattttt cccaggatgg gcaatctcca cgtccaaact tgcggtcgag gactacagtc attttgcagg tttccttact gtatggcttt taaaacgtgc aaaggtgacc attaaccgtt tcacgctggg agggcacgtg cggctcagat gettcctctg actgagggcc aggagggggc tacacggaag aggccacacc cgcacttggg aagactcgat ttgggcttca gctggctgag acgccccagc aggciccteg gctacacctt cagccccgaa tgccttccgg cccataaccc ttcccttcta ggcatttccg gcgaggaccc accctcgcgc caaacattcg gccccatccc ccggtcctca cctgaatctc taactctgac tccagagttt 120734-序列表.doc 3780 3788 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920
200815591 agagactata accagatagc ccggatgtgt ggaactgcat cttgggacga gtagttttag caaaaagaaa gcgacgaaaa actacaattc ccagacagac ttgtgttacc tctcttctca tgctaaacaa gcccccttta aaggaaagcc cctcttagtc gcatcgactg tgtaagaaag gcgtttgaaa cattttaatg ttgggcacac cgtttcgagg accgaaatga gaaagagcat agggaaacgg agcgcccgag ctagtctggc actgcgttag acagccgcgg <210> 3 <211> 3005 <212> DNA <213>人造 <220〉 <223>中國倉鼠，其內源Ec〇RI位點經由取代4個鹼基處理 <400〉 3 gttgctattt tagagacagg atttcttgca aacctggttg gtcttaaact ccgtatgtag ctgagaatga ccttgaaaac cttcctgtcc cacccctcaa attccagaat tatagacacc caccacatgg cttaataagt aaacaacaac aataaaagca tgacttctgg gtctggaggg agggcttgcc agttaagagc aatggatact ttcccataga acctgggttt gactcccagc actaacctac atggtgatag tgatgcagca gacatacatg agggcaacac acacatgggc acatacacac gcacccgccc accatggctt ttcccccatc acttagacag ccatatttaa acgtagtgga gccaggctgg ggtggtggcc cacaccttta atcccagcac tccaguaggc agaggtaggc ggatctctgt gggtttgaga ccagcctggt ctacaagagc tagttccagg acagcctcca aagccataga gaaaccctat ctcaaaaaac tgaaacaaca acaacaacaa aacaaaataa aaaaacaaca aaagaatctt agtggttcag tggttccaca cacaggaaag tagaaagggc cttgatggga aggttttcag agggaggagt atggatgaga caggatgata gtgaaaagaa ctcaaattaa ttaaatattt gaaactatct aagaataaaa gctaaaatat ttaaaattac agtcaggtag tggtggtgca gagggctaag ttggtagaca cagtgagatc caggccagcc agggctacct agtgagacct tgttcaaata actaataaaa tatacaaaat aaaggagaca ccacaataat tttgaaatgt aaaagactaa atttaccttt tatattgatg agttggataa aaaaatcaat ttaccagaga acataaagta gtcccatcaa agacaaaagc aatatatgat taaactctaa tttaaaagtt tgttagagcc tggcaacgtg gcacatacct ttaatcccag caccagggag acagaggcca tcctggicta aaaagtgatc tccaggacag ccatggctat tacacagaga aaccctgtct ggaaaaacaa aaaattagtg tccatgtgta aatgtgtgga gtatgcttgt catgccacat acagaggtag agggcagttt atgggagtca gttcctattc ttcctttatg ggggacctgg ggactgaact caggtcatca ggcttggcag aaagtgcatt agctcacgga gccttatcat tggcgaaagc tctctcaagt agaaautcaa tgtgtttgct catagtgcaa tcattatgtt tcgagagggg aagggtacaa tcgttggggc aigtgtggtc acatctgaat agcagtagct ccctaggaga attaattcca agttctttgg tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aacttttttt ccctctgaca aaactatctt cttatgtcct tgtccctcat atttgaagta ttttattctt tgcagtgttg aatatcaatt ctagcacctc agacatgtta ggtaagtacc ctacaactca ggttaactaa tttaatttaa 120734-序列表.doc -4- 1980 2040 2100 2160 2210 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 】440 1500 1560 1620
200815591 ctaatttaac cccaacactt tttctttgtt tatccacatt tgtggagtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc gcgcgcgcgc gcgctcggat cattctacct tttgtttaaa aaatgttagt ccaggggtgg ggtgcactgt gaaagtctga gggtaacttg ciggggtcag ttctttccac tataggacag aactccaggt gtcaactctt tactgacaga accatccaaa tagccctatc taattttagt tttttattta tttattttti gtttttcgag acagggtttc tctgtggctt tggaggctgt cctggaacta gctcttgtag accaggctgg tctcgaactc agagatccac ctgcctctgc ctcctgagtg ctgggattaa aggcatgcgc caccaacgct tggctctacc taattttaaa agagattgtg tgtcacaagg gtgtcatgtc gccctgcaac cacccccccc ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa acitcactga agctgaagca cgatgatttg gttactctgg ctggccaatg agctctaggg agtctcctgt caaacagaat ctcaacaggc gcagcagtct tttttaaagt ggggttacaa cacaggtttt tgcatatcag gcattttatc taagctattt cccagccaaa aatgtgtatt itggaggcag cagagctaat agattaaaat gagggaagag cccacacagg ttattaggaa gataagcatc ttctttatat aaaacaaaac caaaccaaac tggaggaggt ctacctttag ggatggaaga aaagacattt agagggtgca atagaaaggg cactgagttt gtgaggtgga ggactgggag agggcgcaac cgctttaact gtcctgtttt gcctattttt tggggacagc acatgttcct atttttccca ggatgggcaa tctccacgtc caaacttgcg gtcgaggact acagtcattt tgcaggtttc cttactgtat ggcttttaaa acgtgcaaag gtgaccatta accgtttcac gctgggaggg cacgtgcggc tcagatgctt cctctgactg agggccagga gggggctaca cggaagaggc cacacccgca cttgggaaga ctcgatttgg gcttcagctg gctgagacgc cccagcaggc tcctcggcta caccttcagc cccgaatgcc ttccggccca taacccttcc cttctaggca tttccggcga ggacccaccc tcgcgccaaa cattcggccc catcccccgg tcctcacctg aatctctaac tctgactcca gagtttagag actataacca gatag <210> 4 <21I> 2517 <2I2> DNA <213>中國倉鼠 <400> 4 caaagccata gagaaaccct atctcaaaaa actgaaacaa caacaacaac aaaacaaaat aaaaaaacaa caaaagaatc ttagtggttc agtggttcca cacacaggaa agtagaaagg gccugatgg gaaggttttc agagggagga gtatggatga gacaggatga tagtgaaaag aactcaaatt aattaaatat ttgaaactat ctaagaataa aagctaaaat atttaaaatt acagtcaggt agtggtggtg cagagggcta agttggtaga cacagtgaga tccaggccag ccagggctac ctagtgagac cttgttcaaa taactaataa aatatacaaa ataaaggaga caccacaata attttgaaat gtaaaagact aaatttacct tttatattga tgagttggat aaaaaaatca atttaccaga gaacataaag tagtcccatc aaagacaaaa gcaatatatg attaaactct aatttaaaag tttgttagag cctggcaacg tggcacatac ctttaatccc agcaccaggg agacagaggc catcctggtc taaaaagtga tctccaggac agcca':ggct 120734-序列表.doc 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3005 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 660
200815591 attacacaga gaaaccctgt ctggaaaaac aaaaaattag tgtccatgtg taaatgtgtg gagtatgctt gtcatgccac atacagaggt agagggcagt ttatgggagt cagUcctat tcttccttta tgggggacct ggggactgaa ctcaggtcat caggcttggc agaaagtgca ttagctcacg gagccttatc attggcgaaa gctctctcaa gtagaaaatc aatgtgtttg ctcatagtgc aatcattatg tttcgagagg ggaagggtac aatcgttggg gcatgtgtgg tcacatctga atagcagtag ctccctagga gaattaattc caagttcttt ggtggtgtat caatgccctt aaaggggtca acaacttttt ttccctctga caaaactatc ttcttatgtc cttgtccctc atatttgaag tattttattc tttgcagtgt tgaatatcaa ttctagcacc icagacatgl taggtaagta ccctacaact caggttaact aatttaattt aactaattta accccaacac tttttctttg utatccaca tttgtggagt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcgcgcgcgc gcgcgctcgg aicattctac cttttgttta aaaaatgtta gtccaggggt ggggtgcact gtgaaagtct gagggtaact tgctggggtc agttctttcc actataggac agaactccag gtgtcaactc tttactgaca gaaccatcca aatagcccta tctaatttta gttttttatt tatttatttt ttgtttttcg agacagggtt tctctgtggc tttggaggct gtcctggaac tagctcttgt agaccaggci ggtctcgaac tcagagatcc acctgcctct gcctcctgag tgctgggatt aaaggcatgc gccaccaacg cttggctcta cctaatttta aaagagattg tgtgtcacaa gggtgtcatg tcgccctgca accacccccc ccccaaaaaa aaaaaaaaaa aaacttcact gaagctgaag cacgatgatt tggttactct ggctggccaa tgagctctag ggagtctcct gtcaaacaga atctcaacag gcgcagcagt cttttttaaa gtggggttac aacacaggtt tttgcatatc aggcatttta tctaagctat ttcccagcca aaaatgtgta ttttggaggc agcagagcta atagattaaa atgagggaag agcccacaca ggtlattagg aagataagca tcttctttat ataaaacaaa accaaaccaa actggaggag gtctaccttt agggatggaa gaaaagacat ttagagggtg caatagaaag ggcactgagt ttgtgaggtg gaggactggg agagggcgca accgctttaa ctgtcctgtt ttgcctattt tttggggaca gcacatgttc ctatttttcc caggatgggc aatctccacg tccaaacttg cggtcgagga ctacagtcat tltgcaggtt tccttactgt atggctttta aaacgtgcaa aggtgaccat taaccgtttc acgctgggag ggcacgtgcg gctcagatgc ttcctctgac tgagggccag gagggggcta cacggaagag gccacacccg cacttgggaa gactcgattt gggcttcagc tggctgagac gccccagcag gctcctcggc tacaccttca gccccgaatg ccttccggcc cataaccctt ccctictagg catttccggc gaggacccac cctcgcgcca aacattcggc cccatccccc ggtcctcacc tgaatctcia actctgactc cagagtttag agactataac cagatag <210〉5 <21]> 1989 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400> 5 acctttaatc ccagcaccag ggagacagag gccatcctgg tctaaaaagt gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt agtgtccatg 120734-序列表.doc 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2517 60 120 180 180
200815591 tgtaitatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc aagtagaaaa tcaatgtgit igctcatagt gcaatcatia tgtttcgaga ggggaagggt acaatcgtig gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattaat tccaagttct ttggtggtgt atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt ttttccctct gacaaaacta tcttcttatg tccttgtccc tcatatltga agtattttai tctttgcagt gttgaatatc aattctagca cctcagacat gtlaggtaag taccctacaa ctcaggttaa ctaatttaat naaciaati taaccccaac actilttctt tgtttatcca catttgtgga gigtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgcgcgc gcgcgcgctc ggatcattct accttttgtt taaaaaatgt tagtccaggg gtggggtgca cigtgaaagt ctgagggtaa cttgctgggg tcagttcttt ccactatagg acagaactcc aggtgtcaac tctttactga cagaaccatc caaatagccc tatctaattt tagtttttta tttatttatt ttltgnttt cgagacaggg utctctgtg gctttggagg ctgtcctgga actagctctt gtagaccagg ctggtctcga actcagagat ccacctgcct ctgcctcctg agtgctggga ttaaaggcat gcgccaccaa cgcttggctc tacctaattt taaaagagat tgtgtgtcac aagggtgtca tgtcgccctg caaccacccc ccccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaacttca ctgaagctga agcacgatga tttggttact ctggctggcc aatgagctct agggagtcic ctgtcaaaca gaatctcaac aggcgcagca gtctttttta aagtggggtt acaacacagg tttttgcata tcaggcattt tatctaagct atttcccagc caaaaatgtg tattttggag gcagcagagc taatagatta aaatgaggga agagcccaca caggitatta ggaagataag catcttcttt atataaaaca aaaccaaacc aaactggagg aggtctacct ttagggatgg aagaaaagac atttagaggg tgcaatagaa agggcactga gtttgtgagg tggaggactg ggagagggcg caaccgcttt aactgtcctg ttttgcctat tttttgggga cagcacatgt tcctattttt cccaggatgg gcaatctcca cgtccaaact tgcggtcgag gactacagtc attttgcagg tttccttact gtatggcttt taaaacgtgc aaaggtgacc aitaaccgU tcacgctggg agggcacgtg cggctcagat gcttcctctg actgagggcc aggagggggc tacacggaag aggccacacc cgcacttggg aagactcgat ttgggcttca gctggctgag acgccccagc aggctcctcg gctacacctt cagccccgaa tgccttccgg cccataaccc ttcccttcta ggcatttccg gcgaggaccc accctcgcgc caaacalteg gccccatccc ccggtcctca cctgaatctc taactctgac tccagagttt agagactata accagatag <210> 6 <211> 1M2 <2I2> DNA <213>中國倉鼠 <400〉 6 etatettett atgtccttgt ccctcatatt tgaagtattt tattctttgc agtgttgaat atcaattcta gcacctcaga catgttaggt aagtacccta caactcaggt taactaattt 120734·序列表.doc 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 1989 60 120
200815591 aatttaacta atttaacccc aacacttttt ctttgtttat ccacatttgt ggagtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgigtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgcgcg cgcgcgcgcg ctcggatcat tctacctttt gtttaaaaaa tgttagtcca ggggtggggt gcactgtgaa agtctgaggg taacttgctg gggtcagttc tttccactat aggacagaac tccaggtgtc aactctttac tgacagaacc atccaaatag ccctatctaa ttttagtttt ttatttattt attttttgtt tttcgagaca gggtttctct gtggctttgg aggctgtcct £gaactagct cttgtagacc aggctggtct cgaactcaga gatccacctg cctctgcctc ctgagtgctg ggattaaagg catgcgccac caacgcttgg ctctacctaa ttttaiiaaga gattgtgt^t cacaagggtg tcatgtcgcc ctgcaaccac ccccccccca aaaaaaaaaa aaaaaaaact tcactgaagc tgaagcacga tgatttggtt actctggctg gccaatgagc tctagggagt ctcctgtcaa acagaatctc aacaggcgca gcagtctttt ttaaagtggg gttacaacac aggtttttgc atatcaggca ttttatctaa gctatttccc agccaaaaat gtgtattttg gaggcagcag agctaataga ttaaaatgag ggaagagccc acacaggtta ttaggaagat aagcatcttc tttatataaa acaaaaccaa accaaactgg aggaggtcta cctttaggga tggaagaaaa gacatttaga gggtgcaata gaaagggcac tgagtttgtg aggiggagga ctgggagagg gcgcaaccgc tltaactgtc ctgttttgcc lattttttgg ggacagcaca tgttcctatt tttcccagga tgggcaatct ccacgtccaa acttgcggtc gaggactaca gtcattttgc aggtttcctt actgtatggc ttttaaaacg tgcaaaggtg accattaacc gtttcacgct gggagggcac gtgcggctca gatgcttcct ctgactgagg gccaggaggg ggctacacgg aagaggccac acccgcactt gggaagactc gatttgggct tcagctggct gagacgcccc agcaggctcc tcggctacac cttcagcccc gaatgccttc cggcccataa cccttccctt ctaggcattt ccggcgagga cccaccctcg cgccaaacat tcggccccat cccccggtcc tcacctgaat ctctaactct gactccagag tttagagact ataaccagat ag <210> 7 <211> 1013 <212> DNA <213〉中國倉鼠 <400〉 7 caggctggtc tcgaactcag agatccacct gcctctgcct cctgagtgct gggattaaag gcatgcgcca ccaacgcttg gctctaccta attttaaaag agattgtgtg tcacaagggt gtcatgtcgc cctgcaacca cccccccccc aaaaaaaaaa aaaaaaaaac ttcactgaag ctgaagcacg atgatttggt tactctggct ggccaatgag ctctagggag tctcctgtca aacagaatct caacaggcgc agcagtcttt tttaaagtgg ggttacaaca caggtttttg catatcaggc attttatcta agctatttcc cagccaaaaa tgtgtatttt ggaggcagca gagetaatag attaaaatga gggaagagee cacacaggtt attaggaaga taageatett ctttatataa aacaaaacca aaccaaactg gaggaggtet acctttaggg atggaagaaa agacatttag agggtgcaat agaaagggca ctgagtttgt gaggtggagg actgggagag ggcgcaaccg ctttaactgt cctgttttgc ctattttttg gggacagcac atgttcctat 120734-序列表.doc -8- 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1512 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 200815591 ttttcccagg atgggcaatc tccacgtcca aacttgcggt cgaggactac agtcattttg 660 caggtttcct tactgtatgg ctttiaaaac gtgcaaaggt gaccattaac cgtttcacgc 720 tgggagggca cgtgcggctc agatgcttcc tctgactgag ggccaggagg gggctacacg 780 gaagaggcca cacccgcact tgggaagact cgatttgggc ttcagctggc tgagacgccc 840 cagcaggctc ctcggctaca ccttcagccc cgaatgcctt ccggcccata acccttccct 900 tclaggcatt tccggcgagg acccaccctc gcgccaaaca ttcggcccca tcccccggtc 960 ctcacctgaa tctctaactc tgactccaga gtttagagac tataaccaga tag 1013 <210> 8 <211> 381 <212> DNA <213>人造 <220> <223>中國倉鼠序列中之突變/點突變 <400> 8
cttgcggtcg aggactacag tcattttgca ggtttcctta ctgtatggct tttaaaacgt 60 gcaaaggt^a ccattaaccg tttcacgctg ggagggcacg tgcggctcag atgcttcctc 120 tgactgaggg ccaggagggg gctacacgga agaggccaca cccgcacttg ggaagactcg 180 atttgggctt cagctggctg agacgcccca gcaggctcct cggctacacc ttcagccccg 240 aatgccttcc ggcccataac ccttcccttc taggcatttc cggcgaggac ccaccctcgc 300 gccaaacatt cggccccatc ccccggtcct cacctgaatc tctaactctg actccagagt 360 ttagcgacta taaccagata g 381 <210> 9 <21i> 529 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400> 9 gcctgaagac ctgagttgat acccagaacc cagatcaaga tggaggagag aaccagcccc 60 actaagctgt cccctgaccc ccataaatgc ctccctgtcc agttatgcca cacaatgata 120 ggtgaataca gaaaaacacc cttcctttag acactaagcg gattcctctt acgcatacca 180 gttaagtgat agttcttagg cttcaactca gcactttaaa aagtttatat tttgcaatgc 240 tggggactaa attagggttg tgcacatgct aagtaagcac tctacttttg tatcacattt 300 taataattgt aagaattaat tcgtgaaata gtagctgaga caatagattt gtttcittca 360 tgtgggaact gctgtgtgtg cttcttgctg atgcaaacaa ggtcaaatac tttattcccc 420 agtgtctgcc tagccctgta acacttctct attatacaat gaccacaaat aattaggtga 480 gtgggttttg tttcatttta aattgttgct attttagaga caggatttc 529 <210> 10 <211> 1015 <2i2> DNA <213>中國倉鼠 <400> 10 gcctgaagac ctgagttgat acccagaacc cagatcaaga tggaggagag aaccagcccc 60 actaagctgt cccctgaccc ccataaatgc ctccctgtcc agttatgcca cacaatgata 120 ggtgaataca gaaaaacacc cttcctttag acactaagcg gattcctctt acgcatacca 180 -9- 120734-序列表.doc 240 200815591 gttaagtgat agttcttagg cttcaactca tggggactaa attagggttg tgcacatgct taataattgt aagaattaat tcgtgaaata tgtgggaact gctgtgtgtg cttcttgctg agtgtctgcc tagccctgta acacttctct gtgggttttg tttcatttta aattgttgct gttggtctta aactccgtat gtagctgaga icaaattcca gaattataga cacccaccac agcatgactt ctgggtctgg agggagggct tagaacctgg gtttgactcc cagcactaac catgagggca acacacacat gggcacatac catcacttag acagccatat ttaaacgtag tttaatccca gcactccaga aggcagaggt tggtctacaa gagctagttc caggacagcc gcactttaaa aagtttatat tttgcaatgc aagtaagcac tctacttttg tatcacattt gtagctgaga caatagattt gtttcatca atgcaaacaa £gtcaaatac tttattcccc attatacaat gaccacaaat aattaggtga attuagaga caggatttct tgcaaacctg atgaccttga aaaccttcct gtcccacccc atggcttaat aagtaaacaa caacaataaa tgccagttaa gagcaatgga tactuccca ctacatggtg atagtgatgc agcagacata acacgcaccc gcccaccatg gcttttcccc tggagccagg ctggggtggt ggcccacacc aggcggatct ctgtgggttt gagaccagcc tccaaagcca tagagaaacc ctatc 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1015
<210> 11 <211> 1541 <212> DNA <2i3>中國倉鼠 <400> 11 gcctgaagac ctgagttgat acccagaacc cagatcaaga tggaggagag aaccagcccc actaagctgi cccctgaccc ccataaatgc ctccctgtcc agttatgcca cacaatgata ggtgaataca gaaaaacacc cttcctttag acactaagcg gattcctctt acgcatacca gttaagtgat agttcttagg cttcaactca gcactttaaa aagtttatat tttgcaatgc tggggactaa attagggttg tgcacatgct aagtaagcac tctacttttg tatcacattt taataattgt aagaattaat tcgtgaaata gtagctgaga caatagattt gtttctttca tgtgggaac! gctgtgtgtg cttcttgcig atgcaaacaa ggtcaaatac tttattcccc agtgtctgcc tagccctgta acacttctct attatacaat gaccacaaat aat taggtga gtgggttttg tttcatttta aattgttgct attttagaga caggatitct tgcaaacctg gttggtctta aactccgtat gtagctgaga atgaccttga aaaccttcct gtcccacccc icaaattcca gaattataga cacccaccac atggcttaat aagtaaacaa caacaataaa agcatgactt ctgggtctgg agggagggct tgccagttaa gagcaatgga tactuccca tagaacctgg gtttgactcc cagcactaac ctacatggtg atagtgatgc agcagacata catgagggca acacacacat gggcacatac acacgcaccc gcccaccatg gcttttcccc catcacttag acagccatat ttaaacgtag tggagccagg ctggggtggt ggcccacacc tttaatccca gcactccaga aggcagaggt aggcggatct ctgtgggttt gagaccagcc tggtctacaa gagctagttc caggacagcc tccaaagcca tagagaaacc ctatctcaaa aaactgaaac aacaacaaca acaaaacaaa ataaaaaaac aacaaaagaa tcttagtggt tcagtggttc cacacacagg aaagtagaaa gggccttgat gggaaggttt tcagagggag gagtatggat gagacaggat gatagtgaaa agaactcaaa ttaattaaat atttgaaact 120734-序列表.doc -10- 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 ΙΟδΟ 1140 1200
200815591 atctaagaat aaaagctaaa atatttaaaa ttacagtcag gtagt£gtgg tgcagagggc taagttggta gacacagtga gatccaggcc agccagggct acctagtgag accttgttca aataactaat aaaatataca aaataaagga gacaccacaa taattttgaa atgtaaaaga ctaaatttac cttttatatt gatgagttgg ataaaaaaat caattiacca gagaacataa agtagtccca tcaaagacaa aagcaataia tgattaaact ctaatttaaa agtttgttag agcctggcaa cgtggcacat acctttaatc ccagcaccag g <210> 12 <211> 2020 <2I2> DNA <213>中國倉鼠 <400> 12 gcctgaagac ctgagttgat acccagaacc cagatcaaga tggaggagag aaccagcccc actaagctgt cccctgaccc ccataaatgc ctccctgtcc agttatgcca cacaatgata ggtgaataca gaaaaacacc cttcctttag acactaagcg gattcctctt acgcatacca gttaagtgat agttcttagg cttcaactca gcactttaaa aagtttatat ttigcaatgc tggggactaa attagggttg tgcacatgct aagtaagcac tclactlttg tatcacattt taataattgt aagaattaat tcgtgaaata gtagctgaga caatagattt gtttctttca tgtgggaact gctgtgtgtg cttcttgctg atgcaaacaa ggtcaaatac ttiattcccc agtgtctgcc tagccctgta acacitctct attatacaat gaccacaaat aattaggtga gtgggttttg tttcatttta aattgttgct attttagaga caggatttct tgcaaacctg gttggtctta aactccgtat gtagctgaga atgaccttga aaaccttcct gtcccacccc tcaaattcca gaattataga cacccaccac atggcttaat aagtaaacaa caacaataaa agcatgactt ctgggtctgg agggagggct tgccagttaa gagcaatgga tactttccca tagaacctgg gtttgactcc cagcaciaac ctacatggtg atagtgatgc agcagacata catgagggca acacacacat gggcacatac acacgcaccc gcccaccatg gcttttcccc catcacttag acagccatat ttaaacgtag tggagccagg ctggggtggt ggcccacacc tttaatccca gcactccaga aggcagaggt aggcggatct ctgtgggttt gagaccagcc tggtctacaa gagctagttc caggacagcc tccaaagcca tagagaaacc ctatctcaaa aaactgaaac aacaacaaca acaaaacaaa ataaaaaaac aacaaaagaa tcttagtggt tcagtggttc cacacacagg aaagtagaaa gggccttgat gggaaggttt tcagagggag gagtatggat gagacaggat gatagtgaaa agaactcaaa ttaattaaat atttgaaact atctaagaat aaaagctaaa atatttaaaa ttacagtcag gtagiggtgg tgcagagggc taagttggta gacacagtga gatccaggcc agccagggct acctagtgag accttgttca aataactaat aaaatataca aaataaagga gacaccacaa taattttgaa atgtaaaaga ctaaatttac cttttatatt gatgagttgg ataaaaaaat caatttacca gagaacataa agtagtccca tcaaagacaa aagcaatata tgattaaact ctaatttaaa agtttgttag agcctggcaa cgtggcacat acctttaatc ccagcaccag ggagacagag gccatcctgg tctaaaaagt gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtaigc ttgtcatgcc acatacagag 120734-序列表.doc •11_ 1260 1320 1380 1440 1500 1541 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680
200815591 gtagagggca gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt acaatcgttg gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattaat tccaagttct ttggtggtgt atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt ttttccctct gacaaaacta tcttcttatg tccttgtccc <2I0> 13 <211> 2516 <212> DNA <2B>中國倉鼠 <4〇〇> 13 gcctgaagac ctgagttgat acccagaacc cagatcaaga tggaggagag aaccagcccc actaagctgt cccctgaccc ccataaatgc ctccctgtcc agttatgcca cacaatgata ggtgaataca gaaaaacacc cttcctttag acactaagcg gattcctctt acgcatacca gttaagtgat agttcttagg cttcaactca gcacttiaaa aagtttatat tttgcaatgc tggggactaa attagggttg tgcacatgct aagtaagcac tctacttttg tatcacattt taataattgt aagaattaat tcgtgaaata gtagctgaga caatagattt gtttctttca tgtgggaact gctgtgtgtg cttcttgctg atgcaaacaa ggtcaaatac tttattcccc agtgtctgcc tagccctgta acacttctct attatacaat gaccacaaat aattaggtga gtgggttttg tttcatctta aattgttgct attttagaga caggatttct tgcaaacctg gttggtctta aactccgtat giagctgaga atgaccttga aaaccttcct gtcccacccc tcaaattcca gaattataga cacccaccac atggcttaat aagtaaacaa caacaataaa agcatgactt ctgggtctgg agggagggct tgccagttaa gagcaatgga tactttccca tagaacctgg gtttgactcc cagcactaac ctacatggtg atagtgatgc agcagacata catgagggca acacacacat gggcacatac acacgcaccc gcccaccatg gcttttcccc catcacttag acagccatat ttaaacgtag tggagccagg ctggggtggt ggcccacacc tttaatccca gcactccaga aggcagaggt aggcggatct ctgtgggttt gagaccagcc tggtctacaa gagctagi tc caggacagcc tccaaagcca tagagaaacc ctatctcaaa aaactgaaac aacaacaaca acaaaacaaa ataaaaaaac aacaaaagaa tcttagtggi tcagtggttc cacacacagg aaagtagaaa gggccttgat gggaaggttt tcagagggag gagtatggat gagacaggat gatagtgaaa agaactcaaa ttaattaaat atttgaaact atctaagaat aaaagctaaa atatttaaaa ttacagtcag gtagtggtgg tgcagagggc taagttggta gacacagtga gatccaggcc agccagggct acctagtgag accttgttca aataactaat aaaatataca aaataaagga gacaccacaa taattttgaa atgtaaaaga ctaaatttac cttttatatt gatgagttgg ataaaaaaat caatttacca gagaacataa agtagtccca tcaaagacaa aagcaatata tgattaaact ctaatttaaa agtttgttag agcctggcaa cgtggcacat acctttaatc ccagcaccag ggagacagag gccatcctgg tctaaaaagt gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag 120734-序列表.doc -12- 1740 1800 I860 1920 1980 2020 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 200815591 gtagagggca gtttatggga gtcagttcct aactcaggtc atcaggcttg gcagaaagtg aagctctctc aagtagaaaa tcaatgtgtt ggggaagggt acaatcgttg gggcatgtgt gagaattaat tccaagttct ttggtggtgt ttttccctct gacaaaacta tcttcttatg tctttgcagt gttgaatatc aattctagca ctcaggttaa ctaatttaat ttaactaatt catttgtgga gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgcgcgc gcgcgcgctc tagtccaggg gtggggtgca ctgtgaaagt ccactatagg acagaactcc aggtgtcaac tatctaattt tagtttttta tttatttatt gctttggagg ctgtcctgga actagctctt attcttcctt tatgggggac ctggggactg cattagctca cggagcctta tcattggcga tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggtcacatct gaatagcagt agctccctag atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt tccttgtccc tcatatttga agtattttat cctcagacat gttaggtaag taccctacaa taaccccaac actttttctt tgtttatcca gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ggaicattct accttttgtt taaaaaatgt ctgagggtaa cttgctgggg tcagttcttt tctttactga cagaaccatc caaatagccc ttttgttttt cgagacaggg tttctctgtg gtagaccagg ctggtctcga actcag 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2516
<2i()> 14 <211> 3148 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400〉 14 gcctgaagac ctgagttgat acccagaacc cagatcaaga tggaggagag aaccagcccc actaagctgt cccctgaccc ccataaatgc ctccctgtcc agttatgcca cacaatgata ggtgaataca gaaaaacacc cttcctttag acactaagcg gattcctctt acgcatacca gttaaglgat agttcttagg cttcaactca gcactttaaa aagtttatat tttgcaatgc tggggactaa attagggttg tgcacatgct aagtaagcac tctacttttg tatcacattt taataattgt aagaattaat tcgtgaaata gtagctgaga caatagattt gtttctttca tgtgggaact gctgtgtgtg cttcttgctg atgcaaacaa ggtcaaatac tttattcccc agtgtctgcc tagccctgta acacttctct attatacaat gaccacaaat aattaggtga gtgggttttg tttcatttta aattgttgct attttagaga caggatttct tgcaaacctg gttggtctta aactccgtat gtagctgaga atgaccttga aaaccttcct gtcccacccc tcaaattcca gaattataga cacccaccac atggcttaat aagtaaacaa caacaataaa agcatgactt ctgggtctgg agggagggct tgccagttaa gagcaatgga tactttccca tagaacctgg gtttgactcc cagcactaac ctacatggtg atagtgatgc agcagacata catgagggca acacacacat gggcacatac acacgcaccc gcccaccatg gcttttcccc catcacttag acagccatat ttaaacgtag tggagccagg ctggggtggt ggcccacacc tttaatccca gcactccaga aggcagaggt aggcggatct ctgtgggttt gagaccagcc tggtctacaa gagctagttc caggacagcc tccaaagcca tagagaaacc ctatctcaaa aaactgaaac aacaacaaca acaaaacaaa ataaaaaaac aacaaaagaa tcttagtggt tcagtggttc cacacacagg aaagtagaaa gggccttgat gggaaggttt tcagagggag gagiatggat gagacaggat gatagtgaaa agaactcaaa ttaattaaat atttgaaact 120734-序列表.doc •13- 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200
200815591 citctaagaat aaaagctaaa atatttaaaa ttacagtcag gtagtggtgg tgcagagggc taagttggta gacacagtga gatccaggcc agccagggct acctagtgag acctlgttca aataactaat aaaatataca aaataaagga gacaccacaa taattttgaa atgtaaaaga claaatttac cttttatatt gatgagttgg ataaaaaaat caatttacca gagaacataa agtagtccca tcaaagacaa aagcaatata igattaaact ctaatttaaa agtttgttag agcctggcaa cgtggcacat acctttaatc ccagcaccag ggagacagag gccatcctgg tciaaaaagt gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt acaatcgttg gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattaat tccaagttct ttggtggtgt atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt ttttccctct gacaaaacta tcttcttatg tccttgtccc tcatatttga agtattttat tctttgcagt gttgaatatc aattctagca cctcagacat gttaggtaag taccctacaa ctcaggttaa ctaatttaat ttaactaatt taaccccaac actttttctt tgttiatcca catttgtgga gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgcgcgc gcgcgcgctc ggatcattct accttttgtt taaaaaatgt tagtccaggg gtggggtgca ctgtgaaagt ctgagggtaa cttgctgggg tcagttcttt ccactatagg acagaactcc aggtgtcaac tctttactga cagaaccatc caaatagccc tatctaattt tagtttttta tttatttatt ttttgttttt cgagacaggg tttctctgtg gctttggagg ctgtcctgga actagctctt gtagaccagg ctggtctcga actcagagat ccacctgcct ctgcctcctg agtgctggga ttaaaggcat gcgccaccaa cgcttggctc tacctaattt taaaagagat tgtgtgtcac aagggtgtca tgtcgccctg caaccacccc ccccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaacttca ctgaagctga agcacgatga tttggttact ctggctggcc aatgagctct agggagtctc ctgtcaaaca gaatctcaac aggcgcagca gtctttttta aagtggggtt acaacacagg tttttgcata tcaggcattt tatctaagct atttcccagc caaaaatgtg tattttggag gcagcagagc taatagatta aaatgaggga agagcccaca caggttatta ggaagataag catcttcttt atataaaaca aaaccaaacc aaactggagg aggtctacct ttagggatgg aagaaaagac atttagaggg tgcaatagaa agggcactga gtttgtgagg tggaggactg ggagagggcg caaccgcttt aactgtcctg ttttgcctat tttttgggga cagcacatgt tcctattttt cccaggatgg gcaatctcca cgtccaaact tgcggtcgag gactacag <210> 15 <211> 511 <2I2> DNA <2】3>中國倉鼠 <400> 15 gttgctattt tagagacagg atttcttgca aacctggitg gtcttaaact ccgtatgtag 120734-序列表.doc 14- 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3148 200815591 ctgagaatga ccttgaaaac cttcctgtcc cacccctcaa attccagaat tatagacacc 120 caccacatgg cttaataagt aaacaacaac aataaaagca tgacttctgg gtctggaggg 180 agggcttgcc agttaagagc aatggatact ttcccataga acctgggttt gactcccagc 240 actaacctac atggigatag tgatgcagca gacatacatg agggcaacac acacatgggc 300 acatacacac gcacccgccc accatggctt ttcccccatc acttagacag ccatatttaa 360 acgtagtgga gccaggctgg ggtggtggcc cacaccttta atcccagcac tccagaaggc 420 agaggtaggc ggatctctgt gggtttgaga ccagcctggt ctacaagagc tagttccagg 480 acagcctcca aagccataga gaaaccctat c 511 <210> 16 <211> 549 <212> DNA <2I3>中國倉鼠 <400> 16
caaagccata gagaaaccct atctcaaaaa actgaaacaa caacaacaac aaaacaaaat 60 aaaaaaacaa caaaagaatc ttagtggttc agtggttcca cacacaggaa agtagaaagg 120 gccttgatFg gaaggttttc agagggagga gtatggatga gacaggatga tagtgaaaag 180 aactcaaatt aattaaatat ttgaaactat ctaagaataa aagctaaaat atttaaaatt 240 acagtcaggt agtggtggtg cagagggcta agttggtaga cacagtgaga tccaggccag 300 ccagggctac ctagigagac cttgttcaaa taactaataa aatatacaaa ataaaggaga 360 caccacaata attttgaaat gtaaaagact aaatttacct tttatattga tgagttggat 420 aaaaaaatca atttaccaga gaacataaag tagtcccatc aaagacaaaa gcaatatatg 480 attaaactct aatttaaaag tttgttagag cctggcaacg tggcacatac ctttaatccc 540 agcaccagg 549 <2I0> 17 <211> 1037 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400〉 17 gtt£ctattt tagagacagg atttcttgca aacctggttg gtcttaaact ccgtatgtag 60 ctgagaatga ccttgaaaac cttcctgtcc cacccctcaa attccagaat tatagacacc 120 caccacatgg cttaataagt aaacaacaac aataaaagca tgacttctgg gtctggaggg 180 agggcttgcc agttaagagc aatggatact ttcccataga acctgggttt gactcccagc 240 actaacctac atggtgatag tgatgcagca gacatacatg agggcaacac acacatgggc 300 acatacacac gcacccgccc accatggctt ttcccccatc acttagacag ccatatttaa 360 acgtagtgga gccaggctgg ggiggtggcc cacaccttta atcccagcac tccagaaggc 420 agaggtag£C ggatctctgt gggtttgaga ccagcctggt ctacaagagc tagttccagg 480 acagcctcca aagccataga gaaaccctat ctcaaaaaac tgaaacaaca acaacaacaa 540 aacaaaataa aaaaacaaca aaagaatctt agtggttcag tggttccaca cacaggaaag 600 tagaaagggc cttgatggga aggttttcag agggaggagt atggatgaga caggatgata 660 gtgaaaagaa ctcaaattaa ttaaatattt gaaactatct aagaataaaa gctaaaatat 720 •15· 120734-序列表.doc 200815591 ttaaaattac agtcaggtag tggtggtgca gagggctaag ttggtagaca cagtgagatc 7BO caggccagcc agggctacct agtgagacct tgttcaaata actaataaaa tatacaaaat 840 aaaggagaca ccacaataat tttgaaatgt aaaagactaa atttaccttt tatattgatg 900 agttggataa aaaaatcaat ttaccagaga acataaagta gtcccatcaa agacaaaagc 960 aatatatgat taaactctaa tttaaaagtt tgttagagcc tggcaacgtg gcacatacct 1020 tlaatcccag caccagg 1037 鼠 倉 o AS-1850DN中 ΙΟ>1>12>3> <2I<21<21<21 <400> 18 acctttaatc acagccatgg tgtaaatgtg gtcagttcct gcagaaagtg tcaatgtgtt gggcatgtgt ttggtggtgt tcttcttatg ccagcaccag ctattacaca tggagtatgc attcttcctt cattagctca tgctcatagt ggtcacatct atcaatgccc tccttgtccc ggagacagag gagaaaccct ttgtcatgcc tatgggggac cggagcctta gcaatcatta gaatagcagt ttaaaggggt gccatcctgg gtctggaaaa acatacagag ctggggactg tcattggcga tgtttcgaga agctccctag caacaacm tctaaaaagt acaaaaaatt gtagagggca aactcaggtc aagctctctc ggggaagggt gagaattaat ttttccctct gatctccagg agtgtccatg gtttatggga atcaggcttg aagtagaaaa acaatcgttg tccaagttct gacaaaacta 60 120 180 240 300 360 420 480 500 <210> 19 <211> 1028 <212> DNA <2】3>中國倉鼠 <400〉 19 caaagccata gagaaaccct aaaaaaacaa caaaagaatc gccttgatgg gaaggttttc aactcaaatt aattaaatat acagtcaggt agtggtggtg ccagggctac ctagtgagac caccacaata attttgaaat aaaaaaatca atttaccaga attaaactct aatttaaaag agcaccaggg agacagaggc attacacaga gaaaccctgt gagtatgctt gtcatgccac tcttccttta tgggggacct ttagctcacg gagccttatc ctcatagtgc aatcattatg tcacatctga atagcagtag atctcaaaaa ttagtggttc agagggagga Ltgaaactat cagagggcta cttgttcaaa gtaaaagact gaacataaag tttgttagag catcct-ggtc ctggaaaaac atacagaggt ggggactgaa attggcgaaa tttcgagagg ctccctagga actgaaacaa agtggttcca gtatggatga ctaagaataa agttggiaga taactaataa aaatttacct tagtcccatc cctggcaacg taaaaagtga aaaaaattag agagggcagt ctcaggtcat gctctctcaa ggaagggtac gaattaattc caacaacaac cacacaggaa gacaggatga aagctaaaat cacagtgaga aatatacaaa tttatattga aaagacaaaa tggcacatac tctccaggac tgtccatgtg ttatgggagt caggcttggc gtagaaaatc aatcgttggg caagttcttt aaaacaaaat agtagaaagg tagtgaaaag atttaaaatt tccaggccag ataaaggaga tgagttggat gcaatatatg ctttaatccc agccatggct taaatgtgtg cagttcctat agaaagtgca aatgtgtttg gcatgtgtgg ggtggtgtat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 •16- 120734-序列表.doc 1020 200815591 caatgccctt aaaggggtca acaacttttt ttccctctga caaaactatc ttcttatgtc cttgtccc <210> 20 <2!1> 1516 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400> 20 gttgctattt tagagacagg atttcttgca aacctggttg gtcttaaact ccgtatgtag ctgagaatga ccttgaaaac cttcctgtcc cacccctcaa attccagaat tatagacacc caccacatgg cttaataagt aaacaacaac aataaaagca tgacttctgg gtctggaggg agggcttgcc agttaagagc aatggatact ttcccataga acctgggttt gactcccagc actaacctac atggtgatag tgatgcagca gacatacatg agggcaacac acacatgggc acatacacac gcacccgccc accatggctt ttcccccatc acttagacag ccatatttaa acgtagtgga gccaggctgg ggtggtggcc cacaccttta atcccagcac tccagaaggc agaggtaggc ggatctctgt gggtttgaga ccagcctggi ctacaagagc tagttccagg acagcctcca aagccataga gaaaccctat ctcaaaaaac tgaaacaaca acaacaacaa aacaaaataa aaaaacaaca aaagaatctt agtggttcag tggttccaca cacaggaaag tagaaagggc cttgatggga aggttttcag agggaggagt atggatgaga caggatgata gtgaaaagaa ctcaaattaa ttaaatattt gaaactatct aagaataaaa gctaaaatat ttaaaattac agtcaggtag tggtggtgca gagggctaag ttggtagaca cagtgagatc caggccagcc agggctacct agtgagacct tgttcaaata actaataaaa tatacaaaat aaaggagaca ccacaataat tttgaaatgt aaaagactaa atttaccttt tatattgatg agttggataa aaaaatcaat ttaccagaga acataaagta gtcccatcaa agacaaaagc aatatatgat taaactctaa tttaaaagtt tgttagagcc tggcaacgtg gcacatacct ttaatcccag caccagggag acagaggcca tcctggtcta aaaagtgatc tccaggacag ccatggctat tacacagaga aaccctgtct ggaaaaacaa aaaattagtg tccatgtgta aatgtgtgga gtatgcttgt catgccacat acagaggtag agggcagttt atgggagtca gttcctattc ttcctttatg ggggacctgg ggactgaact caggtcatca ggcttggcag aaagtgcatt agctcacgga gccttatcat tggcgaaagc tctctcaagt agaaaatcaa tgtgtttgct catagtgcaa tcattatgtt tcgagagggg aagggtacaa tcgltggggc atgtgtggtc acatctgaat agcagtagct ccctaggaga attaattcca agttctttgg tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aacttttttt ccctctgaca aaactatctt cttatgtcct tgtccc <2I0> 21 <211> 381 <212> DNA <213>中國倉鼠 <400〉 21 cttgcggtcg aggactacag tcattttgca ggtttcctta ctgtatggct tttaaaacgt gcaaaggtga ccattaaccg tttcacgctg ggagggcacg tgcggctcag atgcttcctc 120734-序列表.doc 1028
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1516 60 -17- 120 200815591 tgactgaggg ccaggagggg gctacacgga agaggccaca cccgcacttg ggaagactcg 180 atttgggctt cagctggctg agacgcccca gcaggctcct cggctacacc ttcagccccg 240 aatgccttcc ggcccataac ccttcccttc taggcatttc cggcgaggac ccaccctcgc 300 gccaaacatt cggccccatc ccccggtcct cacctgaatc tctaactctg actccagagt 360 ttagagacta taaccagata g 381 <210〉 22 <211〉 34 <212> DNA <213〉人造 <220><22$>引子 <400> 22 ctatgaggat ccgcctgaag acctgagttg atac 34
<210> 23 <211> 37 <212> DNA <213〉人造 <220> <223>引子 <400> 23 tatgcaggat ccgttgctat tttagagaca ggatttc 37 <210> 24 <2il> 35 <212> DNA 人造 <220> <223>引子 <400> 24 tatgcaggat cccaaagcca tagagaaacc date 35
<210> 25 <211> 33 <212> DNA <213〉人造 <220> <223>引子 <400〉 25 tatgcaggat ccacctttaa tcccagcacc agg 33 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引子 <400> 26 ctatgaggal ccctatcttc ttatgtcctt gtccc <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213>人造 120734-序列表.doc 18- 35 200815591 <220> <223>引子 <4€0> 27 tatgcaggat cccaggctgg tctcgaactc ag <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213>人造 <220> <223〉引子 <400> 28 ctatgaggat cccttgcggt cgaggactac ag <210> 29 <211> 34 <212〉 DNA <213> 人造 <220〉 <223〉 引子 <400> 29 ctatgatgta cagcctgaag acctgagttg atac
<210> 30 <211> 39 <212> DNA <213〉人造 <220> <223>引子 <400> 30 attgcatgta cactatctgg ttatagtctc taaactctg <210> 31 <211> 37 <212> DNA <2i3> <220〉 <223〉 引子 <400〉 31 atagcatgta cagaaatcct gtctctaaaa tagcaac <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引子 <400> 32 atagcatgta cagatagggt ttctctatgg ctttg <2I0> 33 <21i> 33 <212> DNA <2|3>人造 <220> <223>引子 120734-序列表.doc 200815591 <400> 33 atacgatgta cacctggtgc tgggattaaa ggt <2I0> 34 <21l> 35 <212> DNA <213>人造 <220> <223〉引子 <400> 34 atagcatgta cagggacaag gacataagaa gatag <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> 人造 <220〉 <223> 引子 <400〉 35 tagttatgta cactgagttc gagaccagcc tg <210> 36 <211> 32 <2!2> DNA <213> 人造 <220> <223〉 引子 <400> 36 atagcatgta cactgtagtc ctcgaccgca ag
<210> 37 <211> 33 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引子 <400> 37 atacgaggLt cccctggtgc tgggattaaa ggt <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引子 <400〉 38 atagcaggat ccgatagggt ttctctatgg ctttg <210> 39 <211> 24 <212> DNA 偷人造 <220> <223>引子 <400> 39 ctccacacat ttacacatgg acac 120734-序列表.doc 200815591 <210> 40 <2!1> 24 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引子 <400> 40 gggtttctct gtgiaatagc catg <210> 41 <211> 24 <2I2> DNA <213>人造 <220> 24 <223>引子 <400> 41 atctcactgt gtctaccaac ttag <21()> 42 <211> 22 <212> DNA <213〉人造 <220> 22 <223>引子 <400> 42 tctgcaccac cactacctga ct
A造 3 8 Na 4 2 D人 >>>> 0 12 3 2 2 2 2 < < < V <220〉 <223>引子 <4ϋ0> 43 ctaagagtac ttgccatgag agcclgaa <210> 44 <211〉 25 <212> DNA <213>人造 <220〉 <223>引子 <400> 44 cattgataca ccaccaaaga acttg -21 - 28 120734-序列表.doc

Claims (1)

  1. 200815591 十、申請專利範圍： 1， 一種核酸，其包含 TE-13(SEQ ID No_ 15)，或 TE-13(SEQ ID No. 15)之片段或其互補核苷酸序列，或te-13(SEQ ID No· 15)之衍生物或其片段或其互補核苷酸序列，其 中該核酸在經染色體整合後可使得表現系統中所關注基 因之轉錄或表現增加。 2· 一種核酸，其包含 TE-08(SEQ ID No· 10)，或 TE_08(SEQ m No· i〇)之片段或其互補核苷酸序列，或tE_〇8(SEq No· 10)之衍生物或其片段或其互補核苷酸序列，其 中該核酸在經染色體整合後可使得表現系統中所關注基 因之轉錄或表現增加。 3· 一種核酸，其包含SEQ ID No. 1，或SEQ ID No· 1之片 段或其互補核苷酸序列，或SEQ ID No. 1之衍生物或其 片段或其互補核苷酸序列，其中該核酸在經染色體整合 後可使得表現系統中所關注基因之轉錄或表現增加。 4·如請求項1至3中任一項之核酸，其特徵在於與不包含TE 元件之對照物相比，表現系統中所關注基因之轉錄或表 現之增加例如係藉由以ELISA量測產物效價來測定。 5·如請求項1至3中任一項之核酸，其在嚴格條件下與以下 各物雜交： (a) 核酸序列 TE-13(SEQ ID No_ 15)或 TE-08(SEQ ID No. i〇)之區域’或 (b) 其互補核酸序列，或 (c) 與（a)或（b)具有至少約70%序列一致性之核酸序列， 120734.doc 200815591 6. 7. • 較佳者至少約80%序列一致性，尤佳者至少約90%序列 一致性，及最佳者至少約95%序列一致性。 如請求項5之核酸，其特徵在於此核酸具有至少511 bp之 長度（=SEQ ID No· 15 TE-13之長度），或至少1015 bp之 長度（=SEQ ID No· 10 TE-08之長度）。 如請求項1至3中任一項之核酸，其中該核酸係選自： TE-00(SEQIDN〇.2)、TE-01(SEQIDN〇.3)、TE-02(SEQ ID No· 4)、TE-03(SEQ ID No. 5)、TE-04(SEQ ID No. 6)、TE-06(SEQ ID No. 8)、TE-07(SEQ ID No. 9)、TE-08(SEQ ID No· 10)、TE-10(SEQ ID No· 12)、TE-11(SEQ ID No· 13)、TE-12(SEQ ID No. 14)、TE-13(SEQ ID No. 15)、TE-14(SEQ ID No· 16)、TE-15(SEQ ID No· 17)、TE-16(SEQ ID No· 18)、TE-17(SEQ ID No· 19)及 TE-18(SEQ ID No· 20) 〇 8. 如請求項1至3中任一項之核酸，其特徵在於該核酸為 • TE-00(SEQIDN〇.2)、TE-06(SEQIDN〇.8)、TE-10(SEQ ID No· 12)、TE-11(SEQ ID No· 13)或 TE-12(SEQ ID No. 14)，較佳為 TE-06(SEQ ID No· 8)。 9. 如請求項1至3中任一項之核酸，其特徵在於該核酸為 TE-01(SEQIDN〇.3)、TE-02(SEQIDN〇.4)、TE-03(SEQ ID No· 5)、TE-07(SEQ ID No· 9)或 TE-08(SEQ ID No· 10)。 10·如請求項9之核酸，其中該核酸為TE-08(SEQ ID No 10)。 120734.doc -2- 200815591 11 ·如請求項1至3中任一項之核酸，其特徵在於該核酸為 TE-01(SEQ ID No. 3)之片段或衍生物，較佳為丁£-13(SEQ ID No. 15)、TE-14(SEQ ID No· 16)、TE-15(SEQ ID No· 17)、TE-16(SEQ ID No· 18)、TE-17(SEQ ID No. 19)、TE-18(SEQ ID No. 20)之片段或衍生物。 12_如請求項11之核酸，其中該核酸為TE-13(SEQ ID No. 15) 〇 13 ·如請求項1至3中任一項之核酸，其中該核酸或該片段或 該衍生物為經分離之核酸。 14·如請求項1至3申任一項之核酸，其特徵在於包含以下序 列之核酸係與異源序列連接·· TE-13(SEQ ID No· 15)或 TE-08(SEQ ID No· 10)或 TE-07(SEQ ID No· 9) 4TE- 〇6(SEQ ID No. 8)，或此等序列之片段或其互補核苷酸 序列，或此等序列之衍生物或此等序列之片段之衍生物 或其互補核苷酸序列，較佳為TE_13(SEQ ID No· 15)或 TE-08(SEQ ID No· 10)或此等序列之片段或此等序列之 衍生物或此等序列之片段之衍生物。 15· —種真核表現載體，其特徵在於此表現載體包含如請求 項1至14中任一項之核酸。 16.如請求項15之真核表現載體’其特徵在於其包含啟動子 及/或所關注之異源基因及/或可選擇標記及/或可選擇之 增強子。 17·如請求項15至16中任一項之真核表現載體，其特徵在於 其包含數個相同或不同之如請求項1至14中-或多項之 120734.doc 200815591 核酸之組合，其中一或多個核酸位於該所關注之基因之 刖（亦即5，）及/或一或多個核酸位於該所關注之基因之後 (亦即3’）。 18·如請求項17之真核表現載體，其特徵在於該等經組合之 核酸為TE-06(SEQ ID No· 8)，及較佳為 TE-08(SEQ ID No· 10) 〇 19·如請求項17之真核表現載體，其特徵在於一或多個1£_ 08 核酸（SEQ ID No· 10)與一或多個ΤΕ-06核酸（SEQ ID No. 8)之組合位於該所關注之基因之前（亦即5，）及/或之 後（亦即31) ’而該所關注之基因之前（亦即5，）之了匕〇8核 酸（SEQ ID No. 10)與其後 ΤΕ_06核酸（SEQ ID No· 8)之組 合為較佳。 20.如請求項17之真核表現載體，其特徵在於一或多個1£_ 08核酸（SEQ ID No· 10)位於該所關注之基因之前（亦即 5 )且一或多個TE-08核酸位於該所關注之基因之後（亦即 3 )，較佳為一個TE-08核酸在其之前且一個TE-〇8核酸在 其之後。 · 21·如請求項15至16中任一項之真核表現載體，其特徵在於 其包含一或多個分布於2個質體上之如請求項丨至14項中 任一項之核酸。 22·如請求項15至16中任一項之真核表現載體，其特徵在於 該可選擇標記為DHFR或Neo，諸如Neo F24〇I。 23· —種製造真核表現載體之方法，其特徵為將如請求項^ 至14中任一項之核酸整合至表現載體中。 120734.doc -4- 200815591 24· —種真核宿主細胞，其特徵在於其包含如請求項15至23 中任一項之真核表現載體。 25·如請求項24之真核宿主細胞，其特徵在於其為高產者， 亦即其特定產率高於無ΤΕ元件之對等真核宿主細胞，此 宿主細胞之表現量可增加高達兩倍、三倍、四倍、五 •倍、六倍、七倍或十倍，或增加兩倍以上、三倍以上、 四倍以上、五倍以上、七倍以上或十倍以上，較佳為高 達五倍或三倍以上。 _ 26.如請求項24或25之真核宿主細胞，其特徵在於該表現載 體係穩定地整合至基因組中。 27.如請求項24或25之真核宿主細胞，其中該宿主細胞為哺 乳動物細胞，諸如 CHO、NS0、Sp2/0-Agl4、ΒΗΚ21、 ΒΗΚ ΤΚ·、HaK、2254-62·2(ΒΗΚ-21衍生物）、CHO-K1、 CHO-DUKX(=CHO duk-、CHO/dhf〇、CHO-DUKX B1、 CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL 細 胞，較佳為CHO細胞且尤其較佳為CHO-DG44細胞。 ® 28.如請求項24或25之真核宿主細胞，其特徵在於其另外包 含抗細胞凋亡基因，諸如BCL-xL、BCL-2、BCL-w、 BFL-l、Al、MCL-l、BOO、BRAG-l、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL 或 CED-9，較 佳為 Bcl-xL或 BCL-2，最佳為 BCL-xL。 29. —種培養經穩定轉染之高產真核宿主細胞株之方法，其 具有下列步驟之特徵： (a)將至少一種如請求項1至14中任一項之核酸整合至 120734.doc 200815591 包含所關注基因之真核表現載體中； (b)用此表現載體轉染真核宿主細胞； (C)選擇經轉染之高產宿主細胞。 30.如請求項29之方法，其具有—額外擴增步驟之特徵。 3!.如請求項29或30之方法，其具有一額外選瘦步 徵。 32. —種製備及選擇重組哺乳動物細胞之方法，其具有下 步驟之特徵： μ a 1 /a)用編碼至少所關注之蛋白質/產物（較佳經修飾之新 黴素麟酸轉移酶及可擴增之可選擇標記_r)之基因轉 染宿主細胞’其中為了增強轉錄或表現，至少該：關注 之基因（或該等基因）係功能性連接至至少一種如請求項i 至14中任一項之核酸； w在能夠使該等不同基因得到表現之條件下培養該等 細胞； ⑷藉由在諸如糾8之選擇劑存在下在無次黃嗓吟/胸 普之培養基中培養該等細胞，以選擇此等經共整合之基 ⑷藉由在使得至少該可擴增之可選擇標記基因可擴增 ，選擇劑（諸如甲胺4呤）存在下培養該等細胞，以使此 等經共整合之基因擴增。 t請ί項32之方法，其特徵在於該經轉染之細胞㈣養 …、次黃w/㈣之培養基中，該培養基在無血清存在下 在補充有至少2〇hg/mLG418，較佳伽叫就或更多 120734.doc 200815591 G418，且添加遞增濃度之MTX。 34·如請求項32或33之方法，其特徵在於該第一擴增步驟中 該ΜΤΧ之濃度為至少1〇〇 ηΜ或至少250 ηΜ，且逐步增至 1 μΜ或更高。 35.如請求項29、30、32及33中任一項之方法，其可與改良 該所關注蛋白質之糖基化的方法組合。 36·如請求項29、30、32及33中任一項之方法，其中該宿主 細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0、Sp2/0-Agl4、 BHK21、BHK TK_、HaK、2254_62·2(ΒΗΚ-21衍生物）、 CHO-Kl、CHO-DUKX(=CHOdur、CHO/dhf〇、CHO-DUKX B1、CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞，較佳為CHO細胞，且尤其較佳為CHO-DG44細胞。 3 7·如請求項29、30、32及33中任一項之方法，其中該表現 載體包含可選擇標記，諸如DHFR或Neo，例如Neo F240I〇 3 8.如請求項29、30、32及33中任一項之方法，其中高產者 之比例增加高達兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍 或十倍，或兩倍以上、三倍以上、四倍以上、五倍以 上、七倍以上或十倍以上，較佳為高達五倍或三倍以 上。 39. —種製備生物醫藥產物之方法，其具有下列步驟之特 徵·· (a)將至少一種如請求項1至14中任一項之核酸整合至 120734.doc 200815591 包含所關注基因之真核表現载體中； (b)用此表現載體轉染真核宿主細胞； (Θ選擇經轉染之高產宿主細胞，及 ⑷在使得該（等）所關注之基因可表現之條件下培養該 所獲得之經轉染之高產宿主細胞。 如明求項3 9之方法，其具有下列額外步驟之特徵： (e)收集並純化所關注之蛋白質。 41· 一種如請求項n4tM壬一項之核酸在真核|現載體中 之用途，其係用以增加真核宿主細胞中表現系統中所關 注基因之轉錄或表現或用於製備生物醫藥產物。 42· 一種如請求項1至14中任-項之核酸之用途，其係用於 產生轉殖基因動物或植物。 43. —種如請求項u14中任一項之核酸之用途，其係用於 製造用於基因治療之藥物。 44. 一種如請求項丨至14中任一項之核酸元件之用途，其係 $ 用作藥物或用於醫藥組合物中。 45· 一種套組’其係由如請求項⑷中任一項之核酸、表現 載體、宿主細胞及可選擇之轉染試劑組成。 120734.doc
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