EA016880B1 - Элементы нуклеиновых кислот, обладающие регуляторной функцией - Google Patents

Abstract

В изобретении описаны последовательности ДНК, прежде всего усиливающие транскрипцию или экспрессию элементы (ТЕ-элементы), а также их применение в экспрессионном векторе в сочетании с энхансером, промотором, геном продукта и селектируемым маркером. В изобретении описаны также последовательность SEQ ID NO: 1, а также ТЕ-элементы ТЕ-01, -02, -03, -04, -06, -07, -08, -10, -11 или -12. Наиболее предпочтительными являются ТЕ-06, ТЕ-07 или ТЕ-08, что обусловлено их небольшим размером. Последовательность NO: 1 выведена из области последовательности, расположенной против хода транскрипции относительно кодирующей области гена Ub/S27a из СНО-клеток. ТЕ-элементы вызывают усиление экспрессии гена продукта при стабильной интеграции в эукариотический геном, предпочтительно геном CHO-DG44-клетки. Это позволяет преодолевать хромосомальные позиционные воздействия, защищать от них или устранять их. В результате этого достигается повышение доли высокопродуктивных клеток в трансфектированной смеси, а также абсолютного уровня экспрессии вплоть до 15 раз.

Description

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к цис-активным нуклеотидным последовательностям, так называемым ТЕ-элементам. ТЕ-элементы предпочтительно выводят из генома СНО. Их применение, например, в экспрессионных векторах позволяет обеспечивать в стабильных клеточных популяциях по меньшей мере в два раза более высокий уровень экспрессии представляющего интерес гена в требуемом локусе хромосомы по сравнению с используемыми до настоящего времени векторами.

Предпосылки создания изобретения

Клетки млекопитающих представляют собой предпочтительные клетки-хозяева для получения сложных биофармацевтических белков, поскольку осуществленные посттрансляционные модификации совместимы с человеческим организмом как в функциональном, так и фармакокинетическом отношении. Наиболее пригодными типами клеток являются гибридомы, миеломы, СНО-клетки (клетки яичника китайского хомячка) и ВНК-клетки (клетки почки детеныша хомяка). Культивирование клеток-хозяев осуществляют во все возрастающем масштабе в бессывороточных и безбелковых условиях производства. Основаниями для этого являются связанное с этим снижение затрат, меньшие трудности при очистке рекомбинантного белка, а также уменьшение возможности внесения патогенов (например, прионов, вирусов). Применение СНО-клеток в качестве клеток-хозяев находит все большее распространение, поскольку такие клетки могут быть адаптированы к росту в виде суспензионной культуры в бессывороточной и безбелковой среде и, кроме того, рассматриваются и признаны регулирующими органами как безопасные клетки-продуценты.

Для создания стабильной линии клеток млекопитающего, экспрессирующих представляющий интерес гетерологичный ген, гетерологичный ген, как правило, вместе с селектируемым маркерным геном, таким, например, как ген неомицинфосфотрансферазы (ΝΡΤ), встраивают путем трансфекции в требуемую линию клеток. Гетерологичный ген и селектируемый маркерный ген могут экспрессироваться в клетке-хозяине после ее трансфекции одним вектором, содержащим оба указанных гена, или после котрансфекции векторами, содержащими каждый из указанных генов по отдельности. Через два-три дня после осуществления трансфекции трансфектированные клетки переносят в среду, содержащую селектирующий агент, например 0418, в случае применения гена неомицинфосфотрансферазы (ΝΡΤ-гена), и культивируют в течение нескольких недель в этих селектирующих условиях. Выращенные устойчивые клетки, в которые интегрирована экзогенная ДНК, можно выделять и анализировать в отношении экспрессии требуемого продукта гена (представляющего интерес гена).

Для биофармацевтического производства требуются линии клеток с высокой и стабильной продуктивностью. Для обеспечения высоких уровней экспрессии продукта в экспрессионные векторы для клеток-продуцентов встраивают сильные, прежде всего конститутивно экспрессируемые промоторы и энхансеры, такие, например, как энхансер и промотор СМУ. Поскольку экспрессию продукта необходимо обеспечивать в течение как можно большего промежутка времени, то отбирают клетки, в геном которых стабильно интегрирован ген продукта. Это осуществляют с помощью селектируемых маркеров, таких, например, как неомицинфосфотрансфераза (ΝΡΤ) и дигидрофолатредуктаза (ΌΗΕΒ).

В результате случайной интеграции экспрессионных векторов в геном клетки-хозяина получают клетки, характеризующиеся различными уровнями экспрессии требуемого продукта гена, поскольку его экспрессия обусловлена не только силой предварительно включенного промотора или комбинации промотор/энхансер. Присутствующие в сайте интеграции хроматиновые структуры могут оказывать на экспрессию как отрицательное, так и положительное влияние. Поэтому в экспрессионные векторы все более часто интегрируют также цис-активные элементы, которые оказывают положительное влияние на экспрессию на уровне хроматина.

К ним относятся локус контролирующие участки (Ьоси8 Сои1то1 Рсщоп5) (ЬСЯ), которые встречаются, например, в 5'-области гена β-глобина (Ь1 и др., 2002) и в З'-области гена ТСКа. Они обеспечивают высокий уровень тканеспецифичной экспрессии сшитого трансгена в хроматине, характеризующейся тем, что она не зависит от положения и не зависит от количества копий. Эти свойства свидетельствуют о том, что ЬСЯ обладают способностью открывать хроматин (закрытую конформацию хроматина) в его нативной ткани (Οτίίζ и др., 1997). Существуют различные формы (β-талассемии, при которых локус β-глобина находится в интактном состоянии, но не экспрессируется. Причина отсутствия экспрессии заключается в наличии большой делеции в 5'-области генов β-глобина. Делеция этого ЬСР β-глобина приводит к закрытой конформации хроматина, которая распространяется на весь локус и приводит к подавлению экспрессии гена (Ы и др., 2002). ЬСЯ локализованы вместе с гиперчувствительными сайтами (Η8) ДНКазы I в хроматине экспресирующих клеток. Присутствие Η8 свидетельствует также об открытой конформации хроматина. Η8 включают ряд различных общих и тканеспецифичных сайтов связывания факторов транскрипции. В результате взаимодействия факторов транскрипции с ДНК возникает открытая хроматиновая структура Η8 (Ь1 и др., 2002). Известно, что многие ЬСЯ состоят из нескольких Η8, функции которых в большей или меньшей степени отличаются друг от друга. Например, ген ТСКа экспрессируется под эндогенным контролем только в Т-клеточной ткани. В зависимости от ткани и ста

- 1 016880 туса экспрессии локус существует в различных формах хроматина. В З'-области он имеет локус, контролирующий участок, который содержит восемь Ηδ. Ηδ 2-6, представляющие собой частичный фрагмент ЬСК длиной 6 т.п.н., обладают активностью в отношении открытия хроматина и не являются тканеспецифичными. Ηδ 7, 8 и 1 (длиной 3 т.п.н.) придают тканеспецифичность специфичной в отношении Тклеток экспрессии в тимусе. ТСКаЬСК обладает полной функциональной способностью только при наличии полной комбинации всех Ηδ (Θτίίζ и др., 1997). Более полное описание распределения и спецификации функций индивидуальных Ηδ ТСВаБСВ можно найти у Θτίίζ и др., 1999. Этот пример показывает, что ЬСК в функциональном отношении являются очень сложными и могут состоять из различных контролирующих элементов, таких как энхансеры, выключающие элементы и изолирующие элементы. Другими примерами доменов, между которыми распределены функции ЬСК, являются ТСКу-локус и локус β-глобина. Первый состоит из гиперчувствительного сайта ДНКазы I ΗδΆ и энхансера 3'Е_Су₁. Считается, что ТСКу-ЬСК помимо своей обычной функции участвует в рекомбинации генов ТСКу (Вакег и др., 1999). Локус β-глобина имеет пять Ηδ с различными функциями, для осуществления которыми своих функций в полном объеме требуется также наличие тканеспецифичного промотора. ЬСК могут играть также важную роль в тканеспецифичном деметилировании ДНК, поскольку метилирование ДНК приводит к образованию закрытой структуры хроматина и инактивации генов. Возможно также наличие механизма действия, который активирует экспрессию гена в результате повышенного ацетилирования гистона (Ь1 и др., 2002).

Участки присоединения к ядерному скелету/матриксу (δ/МАК) представляют собой последовательности ДНК, которые связываются с высокой аффинностью ίη νίίτο с компонентами матрикса или скелета клеточного ядра. Они формируют структурные и возможно также функциональные границы доменов хроматина (Ζαΐιη-Ζαόαΐ и др., 2001). δ/МАК обладают способностью взаимодействовать с энхансерами, а также повышать местную доступность ДНК в хроматине и те самым усиливать экспрессию стабильно интегрированных гетерологичных генов в линиях клеток, в организме трансгенных животных и растениях (К1ейг и др., 1991; δ&ί и др., 1989; Кпитеет и др., 1997; Ζαΐιη-Ζαόαΐ и др., 2001). Однако они не могут полностью защитить хромосомный локус от близко расположенных элементов для того, чтобы могла осуществляться независимая от положения экспрессия (Ро1)ак и др., 1994). Воздействие МАК можно использовать для того, чтобы повышать долю клонов клеток или трансгенных животных, получаемых в эксперименте по трансфекции, характеризующихся высоким уровнем экспрессии (МеКшдЫ и др., 1992; Ζ;·ι1ιη-Ζ;·ιό;·ι1 и др., 2001). Однако опубликованы также данные о МАК, которые не приводят к высокому уровню экспрессии, но играют важную роль в правильной регуляции генов, специфических в отношении стадии развития (МеКшдЫ и др., 1992).

Под изолирующими элементами понимают нейтральную границу между соседними участками, оказывающими друг на друга влияние, например между активным и неактивным хроматином (пограничные элементы). Они могут ограничивать воздействие энхансеров или изолировать от него целые домены ДНК и защищать стабильно трансфектированные репортерные гены от позиционных воздействий (Ве11 и БеПеПеИ, 1999; Штагбу. 1999). Таким образом, эти элементы приводят к независимости экспрессии от положения в геноме. Кроме того, они могут предотвращать молчание (выключение) трансгенов в отсутствие давления отбора (Р1каай и др., 1998). Еще одна предполагаемая функция изолирующих элементов заключается в ограничении территорий репликации (Ве11 и БекепТе1б, 1999). Первыми описанными изолирующими элементами были вез и вез' из Эго8орЫ1а. Они образуют границу для генов теплового шока йзр70 и подавляют позиционные воздействия (ибтагбу и др., 1985).

Еще одним элементом, обладающим изолирующей функцией, является богатый ОС фрагмент, присутствующий в бЫг-гене китайского хомячка, который содержит СрО-островки (Ро1)ак и др., 1994). Сам по себе фрагмент не оказывает никакого влияния на экспрессию репортерного гена. Однако этот фрагмент, расположенный между стимулирующим экспрессию δАК и репортерным геном, может существенно препятствовать усиливающему экспрессию воздействию δАК-элемента. Возможно, что этот богатый ОС фрагмент блокирует присущий δАК-элементу механизм открытия хроматина и, следовательно, функционирует в качестве изолятора. Элементы, содержащие обширные СрО-островки, с высокой вероятностью подвергаются метилированию, поскольку они распознаются ДНК-метилтрансферазой, которая превращает цитозин в 5-метилцитозин. В результате этого образуется неактивный хроматин (Ро1)ак и др., 1994).

Впервые Агопоте с соавторами обнаружили в первом интроне человеческого гена АЭА (аденозиндеаминаза) новый регуляторный элемент, который вносит существенный вклад в зависимую от количества копий гена и не зависимую от положения экспрессию (Агопоте и др., 1995). Элемент имеет длину вплоть до 1 т.п.н. и обладает функциональной активностью только в том случае, когда он фланкирует специфический в отношении Т-клеток энхансер длиной 200 пар нуклеотидов. Если присутствует только один из двух сегментов или сегменты расположены в неправильном порядке и ориентации, то элемент не обладает функциональной активностью, так как это препятствует образованию гиперчувствительных в отношении ДНКазы I сайтов на энхансере.

В заявке на патент АО 02/081677 на имя фирмы СоЬга Тйегареибез описан еще один оказывающий

- 2 016880 влияние на хроматин элемент. Повсеместно распространенные открывающие хроматин элементы (ИСОЕ) ответственны за открытие структуры хроматина в областях хромосомы, несущих повсеместно экспрессируемые гены домашнего хозяйства (человеческий ген ΙιπΡΝΡ А2, человеческий ген β-актина, человеческий ген РПСП2). Все эти гены имеют богатые СрС островки в нетранслируемых областях, которые сравнительно слабо метилированы. Отсутствие метилирования СрО-островков означает, что в этом месте хроматин является активным. ИСОЕ способствуют усилению экспрессии, независимо от геномного окружения и типа клетки или ткани.

Фирма 1ттипех также опубликовала данные о цис-активных последовательностях ДНК, которые вызывают усиление экспрессии (И8 6027915, И8 6309851). Элемент, который получил название элемент последовательности, усиливающий экспрессию (Ехргеззюп Ацдтепйпд Зециепсе Е1етеШ) (ЕА8Е), способствует обеспечению высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, он не обладает активностью в системах кратковременной экспрессии и не обладает типичными особенностями последовательности, присущими ЬСК. и 8/МАК. Он не представляет собой также последовательность, кодирующую транс-активируемый белок, поскольку не содержит открытой рамки считывания. Фрагмент имеет длину 14,5 т.п.н., происходит из геномной ДНК СНО-клеток и обладает способностью повышать в восемь раз экспрессию стабильно интегрированного репортерного гена. Свыше 50% активности элемента обусловлены сегментом длиной 1,8 т.п.н., причем первые 600 пар оснований этого сегмента являются необходимыми для правильного его функционирования. Дополнительным свойством участков последовательности с высокой ЕА8Е-активностью является наличие нескольких сайтов связывания ΗΜΟ-Ι(Υ). НМО-1(У)-белки относятся к семейству высокоподвижной группы не содержащих гистон хроматиновых белков. Их обозначают также как архитектурные факторы транскрипции и они образуют новую категорию транс-регуляторов генов млекопитающих. НМС-1(У)-белки распознают богатые АТ последовательности и связываются с их так называемыми АТ-крючками (ДНК-связывающими доменами) в малой борозде ДНК. Это может приводить к локальным изменениям топологии ДНК и вследствие этого к изменению экспрессии гена. Авторы патента И8 6309841 предполагают, что воздействия ЕА8Е связаны с индуцируемой МТХ амплификацией интегрированной плазмиды. В случае индуцируемой МТХ амплификации гена возникают так называемые циклы разрыва-слияния мостиков. Легко можно предположить, что при этом НМС-1(У)-белки играют роль в структурных изменениях ДНК, приводящих к возникновению и устранению разрывов ДНК.

Другие элементы, усиливающие экспрессию гена в клетках млекопитающих, описаны у Кетакз и др., 2003. Эти так называемые 8ТАК-элементы (стимулирующие и антирепрессорные элементы (8йти1а1огу апб Апб-Кергеззог Е1етеп1з)) получают путем скрининга библиотеки человеческих генов, содержащей ДНК-фрагменты длиной от 500 до 2100 пар оснований. Скрининг осуществляют с использованием специально сконструированной репортерной плазмиды. Экспрессия репортерного гена может осуществляться только в том случае, когда он функционально связан с антирепрессорным элементом из банка человеческих генов. С помощью таких 8ТАК-элементов авторам удалось защитить трансгены от позиционных воздействий в геноме клеток млекопитающих. Сопоставление с геномом мыши показало, что большинство таких 8ТАК-элементов присутствуют как в человеческом, так и в мышином геноме и являются высококонсервативными в обоих этих видах.

При создании линий клеток с высоким уровнем экспрессии требуемых белков возникает большая проблема, связанная со случайной и ненаправленной интеграцией рекомбинантного вектора в обладающие транскрипционной активностью или неактивные локусы генома клетки-хозяина. В результате этого получают популяцию клеток, характеризующихся совершенно различными уровнями экспрессии гетерологичного гена, причем продуктивность клеток, как правило, подчиняется нормальному закону распределения. Поэтому для идентификации клонов клеток, которые обеспечивают очень высокий уровень экспрессии представляющего интерес гетерологичного гена, необходимо проверить и протестировать большое количество клонов, что сопряжено с большими затратами времени, трудоемкостью и высокой стоимостью. Поэтому оптимизация применяемых для трансфекции векторных систем нацелена на то, чтобы, прежде всего, обеспечить или даже усилить транскрипцию стабильно интегрированного трансгена путем применения пригодных цис-активных элементов. К цис-активным элементам, которые оказывают свое действие на уровне хроматина, относятся, например, уже описанные локус контролирующие участки, участки присоединения к скелету/матрице, изолирующие элементы и т.д. Некоторые из этих элементов защищают определенные гены от воздействий окружающего хроматина. Другие обладают энхансер-подобной активностью, хотя она распространяется только на стабильно интегрированные конструкции. Еще одни элементы объединяют некоторые из указанных функций. Часто оказывается невозможным однозначно отнести такие элементы именно к определенной группе.

В стабильных линиях клеток экспрессия трансгенного продукта гена в значительной степени зависит также от хромосомных позиционных воздействий. Это явление обусловлено воздействием структуры хроматина и/или присутствия присущих ей регуляторных элементов на сайт интеграции чужеродной ДНК. Это приводит к очень сильной вариации уровней экспрессии. Поэтому в процессе отбора клеток часто возникают клоны, характеризующиеся очень низким уровнем экспрессии продукта или полным ее отсутствием. Такие хромосомные позиционные воздействия часто являются причиной того, что создание

- 3 016880 стабильных линий клеток-продуцентов, в которых происходит экспрессия терапевтических белков с высоким уровнем, как правило, является продолжительным, трудоемким и дорогостоящим процессом. Как правило, стабильные линии клеток с высокой продуктивностью создают путем отбора с использованием положительных селектируемых маркеров, часто в сочетании с индуцируемой различными агентами амплификацией гена (например, дигидрофолатредуктаза/метотрексат или глутаминсинтетаза/метионинсульфоксим). Полученные с помощью этой стратегии отбора пулы и клоны анализируют в отношении высокой и стабильной экспрессии с помощью трудоемкого процесса скрининга. Большинство клонов не обладают способностью продуцировать продукт или продуцируют его лишь в небольших количествах, только немногие клоны являются высокоэффективными продуцентами. Долю эффективных продуцентов в смешанной популяции можно повышать, например, с помощью мутации, введенной в селектируемый маркер (8аибег и Епепке1, 2005, \У0 2004/050884). Однако желательным является дальнейшее повышение удельной продуктивности каждого индивидуального клона, а также доли высокоэффективных продуцентов в популяции трансфектированных клеток.

Необходимо повышать удельную продуктивность стабильно трансфектированных клеток, прежде всего СНО-клеток или других пригодных для продуцирования клеток, и долю высокоэффективных продуцентов в трансфектированной партии. В конечном итоге это должно приводить к созданию более эффективной линии клеток. Таким путем можно за более короткий промежуток времени создавать в большем количестве обладающие более высокой продуктивностью линии клеток и при этом сокращать трудоемкость, затраты времени и средств.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к регуляторным нуклеиновым кислотам, прежде всего к нуклеиновой кислоте, которая имеет последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 1, которую называют ТЕ-элементом, или ее фрагменту или производному, которая приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в стабильно трансфектированных клетках. При создании изобретения неожиданно было установлено, что встраивание такого ТЕ-элемента в экспрессионном векторе в сочетании с промотором, геном продукта, селектируемым маркером и необязательно энхансером путем стабильной интеграции в геном хозяина, такой, например, как геном СН0-Э044, позволяет преодолевать хромосомные позиционные воздействия, защищает от них или устраняет их. В результате этого повышается как доля высокоэффективных продуцентов в трансфектированной партии, так и абсолютный уровень экспрессии.

Кроме того, изобретение относится к экспрессионным векторам, которые содержат усиливающие транскрипцию или экспрессию области, фрагменты или производные 8ЕО ГО N0: 1, предпочтительно ТЕ-элементы ТЕ-00 (8ЕО ГО N0: 2), ТЕ-01 (8ЕО ГО N0: 3), ТЕ-02 (8ЕО ГО N0: 4), ТЕ-03 (8ЕО ГО N0: 5), ТЕ-04 (8ЕО ГО N0: 6), ТЕ-06 (8ЕО ГО N0: 8), ТЕ-07 (8ЕО ГО N0: 9), ТЕ-08 (8ЕО ГО N0: 10), ТЕ-10 (8ЕО ГО N0: 12), ТЕ-11 (8ЕО ГО N0: 13), ТЕ-12 (8ЕО ГО N0: 14), ТЕ-13 (8ЕО ГО N0: 15), ТЕ-14 (8ЕО ГО N0: 16), ТЕ-15 (8ЕО ГО N0: 17), ТЕ-16 (8ЕО ГО N0: 18), ТЕ-17 (8ЕО ГО N0: 19), ТЕ-18 (8ЕО ГО N0: 20) и ТЕ-21 (8Е0 ГО N0: 21). Наиболее предпочтительными являются ТЕ-06, ТЕ-07 или ТЕ-08, а также ТЕ-13 (8Е0 ГО N0: 15) благодаря их малому размеру.

8Е0 ГО N0: 1 происходит из области последовательности, которая расположена против хода транскрипции относительно кодирующей области гена убикитина/827а, выделенной из СНО-клеток, где указанный ген кодирует белок, необходимый для метаболизма рибосомы клетки.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что дополнительное введение цисактивных ТЕ-элементов в экспрессионные векторы приводит к повышению вплоть до 7 раз удельной продуктивности стабильно трансфектированных пулов клеток, прежде всего пулов клеток линии СНОΌΟ44, по сравнению с используемыми до настоящего времени экспрессионными векторами. В отличие от этого при кратковременной трансфекции пулов клеток линии СН0-Э044 введение ТЕ-элементов не позволяет достигать повышения продуктивности. Следовательно, наблюдаемое повышение продуктивности в стабильных пулах клеток не обусловлено энхансером, присутствующим в ТЕ-элементах. Таким образом, для обусловленного ТЕ-элементами повышения продуктивности абсолютно необходима интеграция в хромосому. Это свидетельствует о том, что ТЕ-элементы могут подавлять негативные хромосомальные позиционные воздействия, защищать от них или устранять их. Тем самым можно создавать и идентифицировать цис-активные элементы, которые отличаются тем, что они являются наиболее пригодными для применения при отборе и обогащении клеток, обладающих высокой продуктивностью, и тем самым можно снижать затраты времени, денежных средств и мощностей для выделения и идентификации высокоэффективных клонов-продуцентов.

Изобретение можно применять, например, для создания линий клеток, обладающих высокой продуктивностью, которые, например, требуются для производства биофармацевтических лекарственных средств, в аналитических анализах, основанных на использовании клеток, в высокопроизводительных методах скрининга субстанций или для получения рекомбинантных белковых продуктов для ЯМРспектроскопии, а также для других анализов и т. д. Благодаря высокой удельной продуктивности и уменьшению доли клеток, которые не экспрессируют продукт или экспрессируют его в небольшом количестве, можно за более короткое время создавать большее количество обладающих высокой продук

- 4 016880 тивной способностью линий клеток и тем самым снижать трудоемкость и стоимость. Другими возможными применениями являются создание более совершенных робастных линий клеток-хозяев (например, встраивание антиапоптозных генов или генов гликозилирования), трансгенных животных или растений, а также применение в генной терапии.

Прототипы для изобретения отсутствуют.

Нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена в 8ЕО ΙΌ N0: 1, представляет собой нуклеотидную последовательность, выделенную из генома китайского хомячка (Спсе1и1и8 дпкеик). Она происходит из области последовательности, расположенной против хода транскрипции относительно кодирующей области гена убикитина/827а.

Нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 1, имеет среднее содержание ОС 44% и не содержит никаких более длинных участков, состоящих из ОС-повторов. Такое содержание ОС сопоставимо со средним содержанием ОС в геномной ДНК млекопитающих, которое, как описано, составляет примерно 40% (Эе1да6о и др., 1998). Поиск богатых СрО областей с помощью иетердкеек (пакет программ для анализа последовательностей ЕМВ088) позволил выявить только пять очень коротких областей последовательности, которые характеризуются абсолютно более высокой частотой встречаемости димеров СрО и/или повышенной долей СрО по сравнению с ОрС: нуклеотиды 2242-2259 (18 пар оснований), 3129-3146 (18 пар оснований), 3215-3240 (26 пар оснований), 3417-3461 (44 пары оснований) и 3658-3788 (131 пара оснований) 8Е0 ΙΌ N0: 1. Результаты поиска показали, что нуклеотидная последовательность не содержит более длинных СрО-островков.

Кроме того, 8Е0 ΙΌ N0: 1 содержит два тандемных повтора (нуклеотиды 2179-2244 и нуклеотиды 1027-1080) и два инвертированных повтора (нуклеотиды 8-47 и нуклеотиды 1726-1766), которые были идентифицированы с помощью программ ЕМВ088 как е1ап6еш (тандемные) и етуейеб (инвертированные). ТЕ-08 соответственно содержит один инвертированный повтор. В области последовательности, расположенной между 1 и 1578 парой оснований, находится соответственно один тандемный повтор и один инвертированный повтор.

Участки нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0: 1, уже были описаны в \У0 97/15664: нуклеотиды 1579-3788 8Е0 ΙΌ N0: 1 соответствуют нуклеотидам 12201 8Е0 ΙΌ N0: 5, описанной в \У0 97/15664, однако с одним отличием. При создании 8Е0 ΙΌ N0: 1, предлагаемой в изобретении, в процессе клонирования были встроены 4 дополнительных нуклеотида, которые возникли в результате реакции заполнения существующего сайта рестрикции ЕсоШ. Указанное встраивание 4 дополнительных нуклеотидов имело место между нуклеотидами 357 и 358 8Е0 ΙΌ N0: 5, описанной в \У0 97/15664. Однако нуклеотиды 1-1578 нуклеотидной последовательности, которая представлена 8Е0 ΙΌ N0: 1, предлагаемой в настоящем изобретении, представляют собой новые, до настоящего времени неизвестные области последовательности, которые выделены согласно настоящему изобретению. В \У0 97/15664 не было описано также, что 8Е0 ΙΌ N0: 1, предлагаемая в настоящем изобретении, или ее фрагменты или производные, усиливают транскрипцию или экспрессию представляющего интерес гена независимо от сайта интеграции в хромосому, когда они функционально связаны с комбинацией промотор/энхансер, которая позволяет осуществляться транскрипции представляющего интерес функционально связанного гена. Напротив, в XV0 97/15664 описано применение 5'ϋΤΚпоследовательностей гена убикитина/827а в качестве промотора, где область последовательности от положения - 161 до положения - 45, представленная на фиг. 5 ν0 97/15664, является необходимой для обеспечения промоторной активности. Указанная область последовательности только частично присутствует в предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоте, последовательность которой представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 1, и в выведенном из нее фрагменте, последовательность которого представлена в 8Е0 ΙΌ N0:2 (от положения - 161 до положения -89 согласно фиг. 5 ν0 97/15664). Другие фрагменты и производные 8Е0 ΙΌ N0: 1 вообще не содержат указанной области последовательности.

Кроме того, предлагаемая в изобретении нуклеиновая кислота, последовательность которой представлена в 8Е0 ΙΌ N0: 1, согласно результатам анализа с помощью стандартного алгоритма сравнения первичной структуры последовательностей, такого, например, как ВЬА8Т, не обладает гомологией последовательности с нуклеотидными последовательностями, описанными в перечисленных ниже заявках на патент, которые также могут оказывать положительное воздействие на экспрессию на уровне хроматина в С18:

а) нуклеотидные последовательности ИС0Е, описанные в ν0 00/05393;

б) нуклеотидные последовательности ЕА8Е, описанные в υδ 6309841;

в) нуклеотидные последовательности 8ТАК, описанные в ν0 03/004704.

Применение более сложных стратегий сравнительного анализа первичной структуры последовательностей также не позволило выявить обширной гомологии последовательности с нуклеотидными последовательностями, указанными в подпунктах а)-в).

Описание чертежей

Фиг. 1 - схематическое изображение базовых векторов.

Векторы, обозначенные буквой А, применяли для экспрессии рекомбинантных моноклональных антител ^ОНипа в клетках линии СНО-ОО44. В данном случае Е/Р обозначает комбинацию энхансера

- 5 016880 из СМУ и промотора убикитина/827а хомячка, Р обозначает только промоторный элемент, а Т обозначает сигнал терминации транскрипции, необходимый для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждой транскрипционной единице обозначено стрелкой. Для клонирования ТЕ-элементов перед комбинацией промотор/энхансер присутствует сайт, распознаваемый рестриктазой 8ре1 (8ре1). Амплифицируемый селектируемый маркер, представляющий собой дигидрофолатредуктазу, обозначен сокращением б11Гг. Селектируемый маркер, представляющий собой неомицинфосфотрансферазу, содержит точковую мутацию Ό227Ο и на чертеже сокращенно обозначен как Ό227Ο. Элемент ΙΚΕ8, имеющий происхождение из вируса энцефаломиокардита, служит в качестве внутреннего сайта связывания рибосомы в бицистронной единице транскрипции и позволяет осуществлять трансляцию расположенного за ним зеленого флуоресцентного белка СЕР. НС и ЬС обозначают тяжелую и легкую цепь гуманизированного моноклонального антитела 1дС1-типа соответственно.

Вектор, обозначенный буквой Б, применяли для экспрессии рекомбинантного белка МСР-1 в клетках линии СН0-ИС44. Е/Р обозначает комбинацию энхансера из СМУ и промотора из СМУ, Р обозначает только промоторный элемент, а Т обозначает сигнал терминации транскрипции, необходимый для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждой транскрипционной единице обозначено стрелкой. Для клонирования ТЕ-элемента перед промотором встроена область последовательности А, содержащая сайты ресткрикции, расщепляемые эндонуклеазами (адаптер). Селектируемый маркер неомицин-фосфотрансфераза содержит точковую мутацию Ε240Ι и сокращенно обозначен на чертеже как Ε240Ι. Элемент ΙΚΕ8, имеющий происхождение из вируса энцефаломиокардита, служит в качестве внутреннего сайта связывания рибосомы в бицистронной транскрипционной единице и позволяет осуществлять трансляцию расположенного за ним красного флуоресцентного белка бЖеб. МСР-1 обозначает человеческий моноцитарный хемоаттрактантный белок-1.

Фиг. 2 - схематическое изображение базового экспрессионного вектора для МСР-1.

Представленный на данном чертеже вектор применяли для экспрессии рекомбинантного белка МСР-1 в клетках линии СНО-ЭС44. Е/Р обозначает комбинацию энхансера из СМУ и промотора из СМУ, Р обозначает только промоторный элемент, а Т обозначает сигнал терминации транскрипции, необходимый для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждой транскрибируемой единице обозначено стрелкой. Для клонирования ТЕ-элемента перед промотором встроена область последовательности А, содержащая сайты ресткрикции, расщепляемые эндонуклеазами (адаптер). На данном чертеже селектируемый маркер, представляющий собой дигидрофолатредуктазу, сокращенно обозначен как бЫт. Элемент ΙΚΕ8, имеющий происхождение из вируса энцефаломиокардита, служит в качестве внутреннего сайта связывания рибосомы в бицистронной единице транскрипции и позволяет осуществлять трансляцию расположенного за ним красного флуоресцентного белка бкКеб. МСР-1 обозначает человеческий моноцитарный хемоаттрактантный белок-1.

Фиг. 3-5' - последовательность гена убикитина/827а СНО.

Область последовательности длиной 3788 пар оснований (8ΕΟ ΙΌ N0: 1) выделяли из генома СНОклеток (клетки яичника китайского хомячка) и помещали против хода транскрипции относительно кодирующей области гена ИЬ/827а, которая представляет собой слияние единицы убикитина (ИЬ) и рибосомального белка малой рибосомальной субъединицы (827а).

Фиг. 4 - графическое изображение ТЕ-элементов 00-12.

На этом чертеже схематически представлена область геномной последовательности длиной 3788 пар оснований, локализованная против хода транскрипции относительно кодирующей области гена убикитина/827а СНО, которую субклонировали в плазмиде. Из этой геномной последовательности (8Ε0 ΙΌ N0: 1), которая обозначена также как ТЕ-элемент А, получали частичные фрагменты различной длины, которые ниже обозначены как ТЕ-элементы. ТЕ-элемент 00 (8Ε0 ΙΌ N0: 2) выделяли из субклона указанной последовательности в виде рестрикционного 8аеП-фрагмента и клонировали в сайте, расщепляемом 8ре1 векторов-мишеней рВГО-НС и рВШС-ЬС. Они содержали либо ген тяжелой цепи (НС), либо ген легкой цепи 1дС1 (см. фиг. 1А). В результате получали экспрессионные векторы, в которых ТЕэлемент 00 расположен в прямой и обратной ориентации против хода транскрипции относительно промотора. ТЕ-элементы 01-12 получали с помощью ПЦР с использованием различных пар праймеров (см. фиг. 5 и 6) и клонировали в сайте ВатН1/В5гС1 в базовых плазмидах рТЕ4/МСР-1 (фиг. 1Б) и рТЕ5/МСР1 (фиг. 2).

Фиг. 5 - ТЕ-элементы 00-12.

В этой таблице представлены размеры, а также начальные и конечные положения ТЕ-элементов 0021, полученных из последовательности ТЕ-А (8Ε0 ΙΌ N0: 1). Для фрагментов, которые получали с помощью ПЦР, дополнительно указаны праймеры, которые применяли для этой цели. Градации размеров элементов составляли примерно 500 пар оснований, и элементы по сравнению с исходной последовательностью ТЕ-А (8Ε0 ΙΌ N0: 1) имели делеции на 5'- или З'-конце.

Фиг. 6 - праймеры для синтеза ТЕ-элементов 01-12

- 6 016880

Праймеры представлены в направлении 5'^3'. Праймеры, в обозначении которых имеется слово ίοτ, представляют собой праймеры в прямой ориентации относительно 8ЕО ГО N0: 1, праймеры, в обозначении которых имеется слово геу, представляют собой праймеры в обратной ориентации. Каждый праймер на 5'-конце содержит шесть любых нуклеотидов, за которыми следует сайт рестрикции ВатН1 или В§тО1 и последовательность длиной примерно 20-30 нуклеотидов, которая на 100% гомологична участку последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1. Область праймера, гомологичная 8Е0 ГО N0: 1, выделена жирным шрифтом. Для амплификации участка последовательности 8Е0 ГО N0: 1 каждый раз применяли один ίοτ-праймер и один геу-праймер. Полученный ПЦР-продукт клонировали в сайтах рестрикции ВатН1 и В§тО1 в базовой плазмиде рТЕ4/МСР-1 (фиг. 1Б) или рТЕ5/МСР-1 (фиг. 2).

Фиг. 7 - ЕАС8-анализ серий трансфектированных продуктов Б.

На чертеже представлено относительное усиление экспрессии ОБР в клетках, несущих ТЕ-элемент 00, по сравнению с клетками, не имеющими ТЕ-элемент 00. Для этого анализа клетки линии СН0ГО04 трансфектировали комбинациями плазмид рВШО-ЬС и рВГО-НС, которые отличались друг от друга только наличием и ориентацией ТЕ-элемента 00. После двух-, трехнедельного отбора трансфектированных пулов клеток в среде, не содержащей НТ, но дополненной 0418, измеряли флуоресценцию ОБР с помощью ЕАС8-анализа. На каждом графике, за исключением графика для служивших в качестве отрицательного контроля нетрансфектированных клеток линии СН0ГО044 (Ό044) данные представляют собой средние значения флуоресценции ОБР, полученные в каждом случае для десяти пулов серий трансфектированных продуктов Б. Анализировали по 20000 клеток на пул. Контроль обозначает базовые плазмиды рВГОО-ЬС и рВГО-НС, Кеуега обозначает обратную ориентацию ТЕ-элемента 00 в базовых векторах, ОйекГ обозначает прямую ориентацию ТЕ-элемента 00 в базовых векторах.

Фиг. 8 - ЕАС8-анализ серий трансфектированных продуктов В.

На чертеже представлена доля клеток, экспрессирующих б§Кеб2, в стабильных популяциях клеток, которые содержат ТЕ-элементы 01, 02, 05, 06, 08 или 09, в сравнении с долей клеток в популяциях клеток, которые не содержат ТЕ-элемент. Для этого анализа клетки линии СН0ГО044 трансфектировали плазмидой рТЕ4/МСР-1 или полученными на ее основе производными, которые дополнительно содержали один из указанных выше ТЕ-элементов. После примерно трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в среде, дополненной 0418, измеряли флуоресценцию б&Кеб2 с помощью ЕАС8анализа. Анализировали по 10000 клеток на пул и вычитали флуоресценцию, обусловленную нетрансфектированными клетками линии СН0ГО044. Каждое значение представляет собой среднее значение доли (в процентах) клеток, экспрессирующих б§Кеб2, полученное для 6 пулов серий трансфектированных продуктов В.

Фиг. 9 - влияние ТЕ-элементов на удельную продуктивность.

На этом чертеже проиллюстрированы изменения уровня экспрессии 1дО1 или МСР-1, обусловленные присутствием ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элемент, которые представлены в виде графика (А) или в виде таблицы (Б). Пулы клеток получали путем стабильной трансфекции клеток линии СН0ГО044 базовыми плазмидами рВШО-ЬС и рВГО-НС или рТЕ4/МСР1 (контроль) и созданными на их основе производными, каждая из которых дополнительно содержала ТЕ-элемент (00 в прямой ориентации (00 бпееЕ') и в обратной ориентации (00 теуега), 01-12). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в несодержащей НТ среде, дополненной 0418 (серии А и Б) или в содержащей НТ среде, дополненной 0418 (серии В и Г) оценивали с помощью ЕЫ8А экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линии СН0ГО044 осуществляли путем нескольких пересевов в Т-колбах площадью 75 см² с цикличностью пересевов 2-2-3 дня. В сериях А анализировали по 4 пула для комбинаций плазмид 00 обратная и 00 прямая и по 3 пула для контроля с использованием 8 пересевов в культуре, в сериях Б анализировали по 10 пулов для каждой комбинации плазмид с использованием 6 пересевов и в сериях В и Г анализировали по 6 пулов для каждого типа плазмид с использованием 6 пересевов. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для каждой комбинации плазмид и серии опытов и среднее значение для контролей в каждой серии принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент.

Фиг. 10 - влияние ТЕ-элементов на удельную продуктивность в пулах клеток, полученных в результате отбора с использованием ЭНЕЕ.

На этом чертеже проиллюстрированы изменения уровня экспрессии МСР-1, обусловленные присутствием ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элементы, которые представлены в виде графика (А) или в виде таблицы (Б). Пулы клеток получали путем стабильной трансфекции клеток линии СН0ГО044 базовой плазмидой рТЕ5/МСР-1 (контроль) или созданными на ее основе производными, каждая из которых дополнительно содержала ТЕ-элемент (01-12) (серии Д). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в несодержащей НТ среде оценивали с помощью ЕЫ8А экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линии СН0ГО044 осуществляли путем нескольких пересевов в Т-колбах площадью 75 см² с циклично

- 7 016880 стью пересевов 2-2-3 дня. Для каждого варианта плазмиды использовали по 6 пулов, которые подвергали 6 пересевам в культуре. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для рассматриваемого варианта плазмиды и среднее значение для контролей принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент.

Фиг. 11 - результаты анализа ТЕ-элементов в отношение энхансерной активности.

Результаты, полученные при кратковременной трансфекции клеток линии СНО-ОО44, показали, что использование экспрессионных векторов, содержащих ТЕ-элементы, не приводило к существенному повышению титров МСР-1 по сравнению с использованием контрольных векторов, не содержащих ТЕэлемент. Таким образом, ТЕ-элементы 01-12 не функционируют в качестве энхансеров и, следовательно, могут приводить к существенному повышению экспрессии только в том случае, когда они интегрированы в хромосомы. Шесть пулов трансфектировали базовым вектором рТЕ4/МСР-1 (контроль) и полученными на его основе производными, каждое из которых дополнительно содержало ТЕ-элемент (0112). Одновременно производили котрансфекцию с использованием экспрессионной плазмиды 8ЕАР с целью оценки эффективности трансфекции (8ЕЛР = секретируемая щелочная фосфатаза). После культивирования в течение 48 ч в общем объеме 3 мл удаляли супернатант клеточной культуры и с помощью ЕЫ8Л определяли титр МСР-1, а также 8ЕЛР-активность. Титр МСР-1 корректировали с помощью коэффициента эффективности трансфекции, полученного на основе данных об экспрессии 8ЕЛР. На чертеже представлены средние значения со стандартными отклонениями, каждое из которых получено для 6 параллельных пулов.

Фиг. 12 - другие ТЕ-элементы.

Полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что путем выбора фрагментов последовательности 8ЕО Ш N0: 1, представленных на чертеже, можно также достигать усиления экспрессии гена. Путем клонирования этих других ТЕ-элементов и осуществления стабильной трансфекции с их использованием следует более полно охарактеризовать последовательность 8Е0 Ш N0: 1 для более точного определения положения областей последовательности, важных для осуществления функции.

Фиг. 13 - результаты анализа различных положений и комбинаций ТЕ-элементов.

На этом чертеже представлен набор возможных экспрессионных векторов, в которых использовали различные положения, ориентация и комбинации ТЕ-элементов для исследования того, можно ли таким путем достичь дополнительного усиления экспрессии. Наряду с фланкированием гена продукта ТЕэлементами присоединяли также один за другим несколько идентичных или различных коротких ТЕэлементов, таких, например, как ТЕ-элементы 06 и 08 или новые ТЕ-элементы 13 и 14.

Фиг. 14 - влияние ТЕ-элементов ТЕ-13-ТЕ-18 на удельный уровень экспрессии МСР-1.

На этом чертеже представлены в виде графиков изменения уровней экспрессии МСР-1, обусловленные присутствием ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕэлементы. Пулы клеток создавали путем стабильной трансфекции клеток линии СНО-ОО44 базовой плазмидой рТЕ4/МСР-1 (контроль) или созданными на ее основе плазмидами-производными, каждая из которых дополнительно содержала ТЕ-элемент (13-18) (серия Е). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в дополненной НТ среде + 0418 (400 мкг/мл) оценивали с помощью ЕЫ8Л экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линии СНО0044 осуществляли путем нескольких пересевов в Т-колбах площадью 75 см² с цикличностью пересевов 2-2-3 дня. Для каждого варианта плазмиды анализировали по 4 пула с использованием от 5 до 6 пересевов в культуре. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для рассматриваемого варианта плазмиды и среднее значение для контролей принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент.

Фиг. 15 - влияние ТЕ-элементов в различных положениях и в различных комбинациях на экспрессию МСР-1.

На этом чертеже представлены в виде графиков изменения уровней экспрессии МСР-1, обусловленные присутствием и положением ТЕ-элементов, по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элементы. Пулы клеток создавали путем стабильной трансфекции клеток линии СНО-ОО44 базовой плазмидой рТЕ4/МСР-1 (контроль) или созданными на ее основе плазмидами-производными, каждая из которых дополнительно содержала один или два ТЕ-элемента (06 и 08, 08геу, 09геу, А) (серия Ж). После двух-, трехнедельного отбора пулов трансфектированных клеток в дополненной НТ среде + 0418 (300 мкг/мл) оценивали с помощью ЕЫ8А экспрессию белка в супернатанте клеточной культуры и рассчитывали удельную продуктивность на одну клетку в день. Культивирование стабильно трансфектированных клеток линии СНО-ОО44 осуществляли путем нескольких пересевов в 6-луночных планшетах (МАТ6) с цикличностью пересевов 2-2-3 дня. Для каждого варианта плазмиды анализировали по 6 пулов с использованием 6 пересевов в культуре. Проводили усреднение удельных продуктивностей пулов для рассматриваемого варианта плазмиды и среднее значение для контролей принимали за 1. С ним сравнивали средние значения удельных продуктивностей пулов, содержащих ТЕ-элемент.

Фиг. 16 - тестирование ТЕ-элемента ТЕ-08 с помощью антител 1дО4-типа.

Представленные на этом чертеже векторы применяли для экспрессии рекомбинантных монокло

- 8 016880 нальных антител 1дС4-типа в клетках линии СНО-ОС44. В этом случае Е/Р обозначает комбинацию энхансера и промотора из СМУ, Р обозначает только промоторный элемент и Т обозначает сигнал терминации транскрипции, который необходим для полиаденилирования транскрибируемой мРНК. Положение сайта инициации транскрипции и ее направление в каждом транскрипционной единице указано стрелкой. Гены легкой цепи (ЬС2 или ЬС3) и тяжелой цепи (НС2 или НС3) клонировали вместо кассеты МСР-1-1КЕБ-ббК.еб2 (фиг. 1Б и 2). Они кодируют тяжелую и легкую цепи гуманизированного моноклонального антитела 1дС4-типа. Амплифицируемый селектируемый маркер дигидрофолатредуктаза сокращенно обозначен как άΐιίϊ. Селектируемый маркер неомицинфосфотрансфераза содержал точковую мутацию Б2401 и соответственно обозначен на чертеже как Б2401.

Подробное описание изобретения

Употребляемые в описании настоящего изобретения понятия и обозначения имеют следующие указанные ниже значения. Общие понятия содержащий или содержит включают более конкретное понятие состоящий из. Кроме того, понятия единственное число и множественное число не следует рассматривать как ограничительные.

Понятие ТЕ-элемент обозначает регуляторные нуклеиновые кислоты.

Понятия ТЕ-элемент или усиливающий экспрессию элемент либо усиливающий транскрипцию элемент, или усиливающий экспрессию или транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты применяются в тексте как синонимы. Все эти понятия обозначают регуляторные нуклеотидные последовательности.

ТЕ-элемент или усиливающий экспрессию элемент либо усиливающий транскрипцию элемент, или усиливающий экспрессию или транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты обозначает, прежде всего, последовательность, представленную в БЕЦ ГО N0: 1, включая комплементарную ей последовательность, выделенную из генома китайского хомячка (СпсеШ1и8 дпвеиб), или любую ее часть, фрагмент или область, или производное последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 1, или одной из ее частей, фрагментов или областей, которая при стабильной интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Равным образом указанные понятия относится к любой комбинации частей, фрагментов, областей или производных последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 1, которые состоят из нескольких идентичных или различных частей, фрагментов, областей или производных последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 1, которые в свою очередь могут быть расположены в любой ориентации и на любом расстоянии по отношению друг к другу, или могут быть также скомбинированы с другими регуляторными последовательностями, и которые приводят к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Понятие ТЕэлемент может обозначать также саму последовательность, представленную в БЕЦ ГО N0: 1, а также любые ее фрагменты, части, области или производные.

Кроме того, понятие ТЕ-элемент, усиливающий транскрипцию или усиливающий экспрессию элемент нуклеиновой кислоты или его фрагменты, части, области или производные включает помимо частей последовательности, полученной из китайского хомячка (Сисе1и1и8 дпвеиб), также соответствующие функциональные гомологи нуклеотидных последовательностей, полученные из других организмов. К таким другим организмам относятся, например, человек, мышь, крыса, обезьяна, а также другие млекопитающие и грызуны, рептилии, птицы, рыбы и растения.

Понятие фрагмент или часть либо область (указанные понятия используются как синонимы) обозначает молекулу нуклеиновой кислоты (одно- или двухцепочечную), которая идентична на 100% части последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 1, или комплементарной ей последовательности. Известно, что клонирование фрагментов, которые получены путем расщепления рестриктазами или с помощью ПЦР, может приводить к модификациям в концевых областях фрагмента, например реакции заполнения или расщепления могут приводить к появлению дополнительных нуклеотидов или к удалению нуклеотидов, или дополнительные нуклеотиды могут появляться в результате использования праймеров. Такие фрагменты, имеющие вариации в концевых областях, подпадают под определение понятия фрагмент, даже если такие области последовательности идентичны последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 1, менее чем на 100%. Участки или фрагменты либо области представляют собой, например, ТЕ-00 (БЕС) ГО N0: 2), ТЕ-01 (БЕС) ГО N0: 3), ТЕ-02 (БЕС) ГО N0: 4), ТЕ-03 (БЕС) ГО N0: 5), ТЕ-04 (БЕС) ГО N0: 6), ТЕ-05 (БЕС) ГО N0: 7), ТЕ-06 (БЕС) ГО N0: 8), ТЕ-07 (БЕС) ГО N0: 9), ТЕ-08 (БЕС) ГО N0: 10), ТЕ-09 (БЕС) ГО N0: 11), ТЕ-10 (БЕС) ГО N0: 12), ТЕ-11 (БЕС) ГО N0: 13), ТЕ-12 (БЕС) ГО N0: 14), ТЕ-13 (БЕС) ГО N0: 15), ТЕ-14 (БЕС) ГО N0: 16), ТЕ-15 (БЕС) ГО N0: 17), ТЕ-16 (БЕС) ГО N0: 18), ТЕ-17 (БЕС) ГО N0: 19), ТЕ-18 (БЕЦ ГО N0: 20), ТЕ-21 (БЕЦ ГО N0: 21). Предпочтительно при стабильной интеграции в хромосому фрагмент приводит к усилению транскрипции или экспрессии функционально связанного представляющего интерес гена. Частями или фрагментами либо областями последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 1, которые приводят к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена, являются, например, ТЕ-00 (БЕЦ ГО N0: 2), ТЕ-01 (БЕЦ ГО N0: 3), ТЕ-02 (БЕС) ГО N0: 4), ТЕ-03 (БЕС) ГО N0: 5), ТЕ-04 (БЕС) ГО N0: 6), ТЕ-06 (БЕС) ГО N0: 8), ТЕ07 (БЕС) ГО N0: 9), ТЕ-08 (БЕС) ГО N0: 10), ТЕ-10 (БЕС) ГО N0: 12), ТЕ-11 (БЕС) ГО N0: 13), ТЕ-12 (БЕС) ГО N0: 14), ТЕ-13 (БЕС) ГО N0: 15), ТЕ-14 (БЕС) ГО N0: 16), ТЕ-15 (БЕС) ГО N0: 17), ТЕ-16 (БЕС) ГО N0: 18), ТЕ-17 (БЕС) ГО N0: 19), ТЕ-18 (БЕС) ГО N0: 20) и ТЕ-21 (БЕС) ГО N0: 21). Однако понятие фраг

- 9 016880 мент относится также ко всем возможным другим участкам последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, расположенным в любой ориентации, которые приводят к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена, прежде всего к таким, которые целиком или, по меньшей мере, частично расположены в 5'-области ТЕ-00 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2). Она соответствует области 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, расположенной между парами оснований 1 и 1578. Предпочтительным является также фрагмент ТЕ-08 (8Е0) ΙΌ N0: 10).

В контексте настоящего изобретения понятие производное относится к молекуле нуклеиновой кислоты (одно- или двухцепочечной), последовательность которой идентична по меньшей мере примерно на 70% или идентична по меньшей мере примерно на 80%, предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 или комплементарной ей последовательности, или части или фрагменту, или области 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 или комплементарной ей последовательности, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена. Отличия от последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, с одной стороны, могут быть результатом различий в гомологичных эндогенных нуклеотидных последовательностях, выведенных из других организмов. С другой стороны, они могут быть результатом целенаправленных модификаций нуклеотидной последовательности, например замены, инсерции или делеции одного или нескольких нуклеотидов. Мутанты, образованные в результате делеции, инсерции и замены, можно создавать с помощью сайт-направленного мутагенеза и/или методов мутагенеза, основанных на ПЦР. Соответствующие методы описаны, например, у Ьойкροίοΐι и Ζογ035 (1998; см. главу 36.1 и указанные в ней ссылки). Идентичность последовательности референс-последовательности, в данном случае последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, можно определять с помощью так называемых стандартных алгоритмов сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, таких, например, как ВЬА8Т (А11ксйи1 8.Е., СМ1 V.. МШег V.. Муегк Ε.ν. и Ыршаи Ό.Ε, Ваис 1оса1 айдитеи! кеагсй !оо1, 1. Мо1. Вю1. 215, 1990, с. 403-410; Маббеп Т.Ь., Та1икоу КЬ. и Ζйаид 1., Аррйсабопк оГ пеЕгогк ВЬА8Т кегуег, Ме111. ЕпхутоЕ 266, 1996, с. 131-141; Ζΐιηηβ 1. и Маббеп Т.Ь., РотегВЬА8Т: А пе\у пе1\уогк ВЬА8Т аррйсабоп Гог йиегасйуе ог аи!ота1еб кесщенсе апа1ук15 апб аппо1абоп, Оепоте Век. 7, 1997, с. 649-656). Последовательности можно сопоставлять в том случае, когда их последовательности соответствуют друг другу и их можно идентифицировать с использованием стандартных алгоритмов сравнительного анализа первичной структуры последовательностей.

В контексте настоящего изобретения понятие производное относится также к молекуле нуклеиновой кислоты (одно- или двухцепочечной), которая гибридизуется с последовательностью, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, или с последовательностью фрагмента или участка, или области последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, или комплементарной ей последовательности. Предпочтительно гибридизацию осуществляют в строгих условиях гибридизации и отмывки (например, гибридизация при 65°С в буфере, содержащем 5x880; отмывка при 42°С с помощью 0,2x880/0,1% ДСН). Соответствующие методы описаны, например, у АикиЬе1 и др., 1994, предпочтительно участок или фрагмент, или область 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 содержит всю или по меньшей мере части области последовательности между парами нуклеотидов 1 и 1578. Это соответствует 5'-области последовательности ТЕ-00 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2). Предпочтительным является также фрагмент ТЕ-08 (8ЕЦ ΙΌ N0: 10).

Понятие вариант относится к экспрессионным векторам, применяемым в конкретной смеси для трансфекции. Оно включает как базовые векторы (рТЕ4/МСР-1 или рТЕ5/МСР-1) или комбинации базовых векторов (рВЕНО-ЬС + рВГО-НС), так и базовые векторы, содержат один или несколько ТЕэлементов в различных положениях, комбинациях и ориентации.

В случае праймеров понятие ориентация относится к расположению праймера в определенном порядке по отношению к 8ЕЦ ΙΌ N0: 1. Все праймеры, порядок расположения последовательности которых соответствует направлению 5'^3' последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 (= прямой праймер), находятся в одинаковой ориентации с указанной последовательностью, что называют также прямой ориентацией. Праймеры, порядок расположения последовательностей которых комплементарен порядку расположения последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1 (обратный праймер), находятся в противоположной ориентации по отношению к указанной последовательности, что называют также обратной ориентацией. Применительно к ТЕ-элементам, предлагаемым в настоящем изобретении, под ориентацией следует понимать порядок расположения относительно представляющего интерес гена. Последовательность, представленная в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, представляет собой геномную последовательность, которая расположена в 5'-направлении относительно кодирующей области гена убикитина/827а, что обозначают также как расположенная против хода транскрипции. Если следовать вдоль указанной последовательности, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, в направлении кодирующей области следующего за ней гена убикитина/827а, то это должно привести к стартовому кодону указанного гена. Поэтому такой порядок расположения обозначают как прямая ориентация. Аналогично этому согласно настоящему изобретению ТЕ-элемент находится в прямой ориентации, если последовательность, пред

- 10 016880 ставленная в 8ЕО Ш N0: 1, или ее любой участок, фрагмент, область или производное присутствует в экспрессионном векторе на той же цепи ДНК, что и стартовый кодон представляющего интерес гена. Если, в противоположность этому, в экспрессионном векторе на той же цепи ДНК, что и стартовый кодон представляющего интерес гена, присутствует последовательность, комплементарная 8Е0 Ш N0: 1, или ее любой участок, фрагмент, область или производное, то ТЕ-элемент находится в обратной ориентации. Если не указано иное, то при упоминании ТЕ-элемента всегда имеется в виду, что это понятие включает/подразумевает обе ориентации, т.е. как прямую, так и обратную.

Понятие интеграция в хромосому относится к интеграции любой нуклеотидной последовательности в геном, т.е. в хромосомы, клетки, причем интеграцию необязательно можно осуществлять в одну или несколько хромосом в любом количестве, положении и ориентации. Кроме того, понятие интеграция в хромосому относится также к интеграции любой куклеотидной последовательности в синтетические, искусственные или мини-хромосомы.

Представляющий интерес ген.

Представляющий интерес ген, который содержится в экспрессионном векторе, предлагаемом в изобретении, содержит нуклеотидную последовательность любой длины, которая кодирует представляющий интерес продукт. Продукт гена или также представляющий интерес продукт, как правило, представляет собой белок, полипептид, пептид или его фрагмент либо производное. Однако он может представлять собой также РНК или антисмысловую РНК. Представляющий интерес ген может находиться в своей полноразмерной форме, укороченной форме, в виде слитого гена или меченого гена. Он может представлять собой геномную ДНК или предпочтительно кДНК либо соответствующие фрагменты или слияния. Представляющий интерес ген может иметь нативную последовательность гена или содержать мутации либо может быть модифицирован иным путем. К таким модификациям относятся оптимизации кодонов для адаптации к конкретной клетке-хозяину, а также гуманизация. Представляющий интерес ген может, например, кодировать секретируемый, цитоплазматический, локализованный в ядре, связанный с мембраной или связанный с клеточной поверхностью полипептид.

Понятие нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты обозначает олигонуклеотид, нуклеотиды, полинуклеотиды и их фрагменты, а также ДНК или РНК, выведенную из генома или полученную синтетическим путем, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной или может представлять собой кодирующую или некодирующую цепь гена. Модификацию нуклеотидных последовательностей можно осуществлять с помощью стандартных методов, таких, например, как сайт-специфический мутагенез или ПЦР-опосредуемый мутагенез (такие методы описаны, например, у 8атЬтоок и др., 1989 или у Ли8иЬе1 и др., 1994).

Понятие кодировать обозначает свойство или способность конкретной последовательности нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, например гена в хромосоме или мРНК, выполнять функцию матрицы для синтеза других полимеров и макромолекул, таких, например, как рРНК, тРНК, мРНК, других молекул РНК, кДНК или полипептидов, в ходе биологического процесса. Таким образом, ген кодирует белок, если требуемый белок продуцируется в клетке или другой биологической системе в результате транскрипции и последующей трансляции мРНК. При этом как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и, как правило, содержится также в банке данных о последовательностях, например ЕМВЬ или ОепВапк, так и служащая в качестве матрицы для транскрипции некодирующая цепь гена могут рассматриваться как кодирующие продукт или белок. К нуклеиновым кислотам, которые кодируют белок, относятся также нуклеиновые кислоты, которые вследствие вырожденности генетического кода имеют другой порядок нуклеотидной последовательности, но приводят к образованию такой же аминокислотной последовательности белка. Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, могут содержать также интроны.

Понятие кДНК обозначает дезоксирибонуклеиновые кислоты, которые получают путем обратной транскрипции и синтеза второй цепи ДНК с продуцируемой геном мРНК или другой РНК. Если кДНК присутствует в виде молекулы двухцепочечной ДНК, то она содержит как кодирующую, так и некодирующую цепь.

Понятие интрон обозначает некодирующие нуклеотидные последовательности любой длины. Они встречаются в естественных условиях во многих генах эукариотических организмов и их удаляют из ранее транскрибированного мРНК-предшественника с помощью процесса, известного как сплайсинг. Для этого требуется осуществлять точное вырезание интрона на 5'- и З'-концах и правильное соединение возникающих в результате этого концов мРНК, чтобы создать зрелую процессированную мРНК, содержащую правильную рамку считывания для успешного синтеза белка. В настоящее время охарактеризованы многочисленные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, участвующие в этом процессе сплайсинга, которые представляют собой последовательности, расположенные непосредственно на границах раздела экзон-интрон или интрон-экзон (см. обзор ΟΙΜιίιηα и др., 1987).

Представляющий интерес белок/продукт.

К имеющим биофармацевтическое значение белкам/полипептидам относятся (но не ограничиваясь только ими), например, антитела, ферменты, цитокины, лимфокины, адгезионные молекулы, рецепторы, а также их производные или фрагменты. В целом, заслуживают внимание все полипептиды, которые

- 11 016880 действуют в качестве агонистов или антагонистов и/или могут найти применение в качестве терапевтических или диагностических средств. К другим представляющим интерес белкам относятся (но не ограничиваясь только ими), например, белки/полипептиды, которые применяют для изменения свойств клеток-хозяев в рамках так называемой клеточной инженерии, такие, например, как антиапоптозные белки, шапероны, ферменты, участвующие в метаболизме, гликозилирующие ферменты, а также их производные или фрагменты.

Понятие полипептиды применяют к аминокислотным последовательностям или белкам и оно означает полимеры аминокислот любой длины. Это понятие включает также белки, подвергнутые посттрансляционной модификации с помощью таких реакций, как, например, гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование или процессинг белка. Структуру полипептида можно модифицировать, например, с помощью замен, делеций или инсерций аминокислот, путем слияния с другими белками при сохранении его биологической активности. Кроме того, полипептиды можно подвергать мультимеризации и образовывать гомо- и гетеромеры.

Примерами имеющих терапевтическое значение белков являются инсулин, инсулиноподобный фактор роста, человеческий гормон роста (ЬСН) и другие факторы роста, рецепторы, тканевый активатор плазминогена (ΐΡΑ), эритропоэтин (ЕРО), цитокины, например интерлейкины (1Ь), такие как 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-14, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18, интерферон (1ЕЫ)-альфа, -бета, -гамма, -омега или -тау, фактор некроза опухоли (ΤΝΕ), такой, например, как ΤΝΤ-альфа, -бета или -гамма, ТКА.1Ь, С-С8Е, СМ-С8Е, М-С8Е, МСР-1 и УЕСЕ. Другими примерами являются моноклональные, поликлональные, мультиспецифические и одноцепочечные антитела и их фрагменты, такие, например, как ЕаЬ-, ЕаЬ'-, Е(аЬ')₂-, Ес- и Ес'-фрагменты, легкие (Ь) и тяжелые (Н) цепи иммуноглобулина и их константные, вариабельные или гипервариабельные области, а также Εν- и Ебфрагменты (Οιηιηον и др., 1999). Антитела могут иметь человеческое происхождение или происходить из организма, кроме человека. Можно рассматривать также гуманизированные и химерные антитела.

ЕаЬ-фрагменты (антигенсвязывающий фрагмент = ЕаЬ) состоят из вариабельных областей обеих цепей, которые связаны друг с другом посредством примыкающих константных областей. Их можно создавать из обычных антител, например, путем обработки протеазой, такой как папаин, или также путем клонирования ДНК. Другими фрагментами антител являются Е(аЬ')2-фрагменты, которые можно создавать путем протеолитического расщепления пепсином.

С помощью клонирования гена можно создавать также укороченные фрагменты антител, которые состоят только из вариабельных областей тяжелой (УН) и легкой (УЬ) цепи. Их обозначают как Ενфрагменты (вариабельный фрагмент - синоним фрагмента вариабельной области). Поскольку в этих Ενфрагментах не может иметь место ковалентное связывание посредством цистеиновых остатков, присутствующих в константных цепях, то эти Εν-фрагменты часто стабилизируют другим образом. Для этой цели вариабельные области тяжелой и легкой цепей часто связывают друг с другом с помощью короткого пептидного фрагмента, состоящего примерно из 10-30 аминокислот, предпочтительно из 15 аминокислот. Таким путем получают одну полипептидную цепь, в которой УН и УЬ связаны друг с другом через пептидный линкер. Такие фрагменты антител обозначают также как одноцепочечные Ενфрагменты (5сЕ\^г). Примеры 8сΕν-фрагментов антител известны и они описаны, например, у Нийоп и др. (1988).

В прошлые годы были разработаны различные стратегии создания мультимерных 5сЕ\^гпроизводных. Целью этого являлось создание рекомбинантных антител с улучшенными фармакокинетическими свойствами и повышенной авидностью к связыванию. Для достижения мультимеризации 5сЕ\^гфрагментов их создавали в виде слитых белков, содержащих домены мультимеризации. При этом в качестве доменов мультимеризации могут служить, например, СНЗ-области 1дС или спиралевидные структуры (структуры в виде свернутой спирали), такие как домены типа лейциновой молнии. В других стратегиях для мультимеризации используют взаимодействие между УН- и УЪ-областями 5сЕ\^гфрагмента (например, двойные, тройные и пентатела).

В данной области техники понятие двойное антитело обозначает бивалентное гомодимерное производное 5сЕ\^г. Укорочение пептидного линкера в молекуле 5сЕ\' до 5-10 аминокислот приводит к образованию гомодимеров в результате наложения друг на друга УН/УЪ-цепей. Двойные антитела можно дополнительно стабилизировать путем встраивания дисульфидных мостиков. Примеры двойных антител описаны в научной литературе (см., например, у Рсгыс и др. (1994)).

В данной области техники понятие минитело обозначает бивалентное гомодимерное производное 5сЕ\'. Оно состоит из слитого белка, который в качестве области димеризации содержит СНЗ-область иммуноглобулина, предпочтительно 1дС, наиболее предпочтительно 1дС1. Она связывает 5с Ενфрагменты посредством шарнирной области, также происходящей из 1дС, и линкерной области. Примеры таких минител описаны у Ни и др. (1996).

В данной области техники понятие тройное тело обозначает трехвалентное гомодимерное производное 5сЕт (Когй и др., 1997). К образованию тримеров приводит непосредственное слияние УН-УЪ без использования линкерной последовательности.

Фрагменты, которые в данной области техники обозначают как миниаантитела, имеющие би-,

- 12 016880 три- или тетравалентную структуру, также представляют собой производные всЕу-фрагментов. При этом мультимеризации достигают с помощью ди-, три- или тетрамерных структур типа свернутой спирали (Раск и др., 1993 и 1995; Ьоуе_)оу и др., 1993).

Ген, кодирующий флуоресцентный белок.

В другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит ген, кодирующий флуоресцентный белок, функционально связанный с представляющим интерес геном. Предпочтительно транскрипцию обоих генов осуществляют под контролем одного гетерологичного промотора, так что белок/представляющий интерес продукт и флуоресцентный белок кодируются бицистронной мРНК. Это позволяет идентифицировать клетки, продуцирующие в больших количествах представляющий интерес белок/продукт, по уровню экспрессии флуоресцентного белка. В альтернативном варианте транскрипцию гена, кодирующего флуоресцентный белок, можно осуществлять под контролем его собственного промотора.

Флуоресцентный белок может представлять собой, например, зеленый, сине-зеленый, синий, желтый или имеющий другой цвет флуоресцентный белок. Конкретным примером является зеленый флуоресцентный белок (СЕР) из Аедиогеа \зсЮпа или Кеш11а гешГогшк и полученных из них мутантов (см., например, Вейле! и др. (1998); Сйа1йе и др. (1994); АО 01/04306 и процитированную в этой заявке литературу).

Другие флуоресцентные белки и кодирующие их гены описаны в АО 00/34318, АО 00/34326, АО 00/34526 и АО 01/27150, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Эти флуоресцентные белки представляют собой флуорофоры не обладающих биолюминисцентностью организмов видов Апйюхоа. например красный из Аттоша та)апо. С1ауи1апа ер., 2оаи1йив βρ. I, 2оаи1йив βρ. II, Όίβсовота в!г1а!а, Эксовота ер., зеленый из Эксовота ер., фуксин из Эксовота ер., Аттоша ви1са!а, Аедиогеа соеги1евсепв.

К флуоресцентным белкам, предлагаемым в изобретении, относятся помимо белков дикого типа также встречающиеся в естественных условиях или созданные с помощью генной инженерии мутанты и варианты, их фрагменты, производные или, например, слитые с другими белками или пептидами варианты. При этом созданные мутации могут, например, изменять спектр возбуждения или испускания, образование хромофоров, коэффициент экстинкции или стабильность белка. Кроме того, путем оптимизации кодонов можно повышать уровень экспрессии в клетках млекопитающих или других видов. Флуоресцентный белок, предлагаемый в изобретении, можно применять также в виде слияния с селектируемым маркером, предпочтительно с амплифицируемым селектируемым маркером, таким, например, как дигидрофолатредуктаза (ΌΗΕΒ).

Испускаемая флуоресцентными белками флуоресценция дает возможность осуществлять обнаружение белков, например, методом проточной цитометрии с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) или флуоресцентной микроскопии.

Другие регуляторные элементы.

Экспрессионный вектор содержит по меньшей мере один гетерологичный промотор, который позволяет осуществлять экспрессию представляющего интерес гена и предпочтительно также флуоресцентного белка.

Понятие промотор обозначает полинуклеотидную последовательность, которая позволяет осуществлять и контролирует транскрипцию функционально связанных с ней генов или последовательностей. Промотор содержит последовательности, распознаваемые связывающейся с ними РНК-полимеразой, и сайт инициации транскрипции. Для экспрессии требуемой последовательности в определенном типе клеток или клетке-хозяине необходимо выбрать пригодный функциональный промотор. Специалисту в данной области известны многочисленные промоторы из различных источников, к которым относятся конститутивные, индуцибельные и репрессируемые промоторы. Они депонированы в банках данных, например в СепВапк, и их можно получать в виде выделенных элементов или в виде элементов, клонированных в полинуклеотидных последовательностях, от коммерческих поставщиков или индивидуальных производителей. У индуцибельных промоторов активность промотора может понижаться или повышаться в ответ на сигнал. Примером индуцибельного промотора является промотор тетрациклина (1е1). Он содержит операторные последовательности тетрациклина (1е!О), которые можно индуцировать с помощью регулируемого тетрациклином белка-активатора (!ТА). Присутствие тетрациклина ингибирует связывание 1ТА с 1е1О. Примерами других индуцибельных промоторов являются промоторы _)ип, Гов, металлотионеина и промотор белка теплового шока (см. также у 8атЬгоок и др., 1989; Соввеп и др., 1994).

К промоторам, которые являются наиболее пригодными для обеспечения экспрессии с высоким уровнем в эукариотических организмах, относятся, например, промотор убикитина/827а хомячка (АО 97/15664), ранний промотор 8У40, главный поздний промотор аденовируса, мышиный промотор металлотионеина-Ι, область длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса, ранний промотор человеческого цитомегаловируса. Примером(ами) других гетерологичных промоторов млекопитающих является(ются) промотор(ы) актина, иммуноглобулина или белка теплового шока.

Для повышения/регулирования транскрипционной активности в кассете экспрессии соответствующий гетерологичный промотор можно функционально связывать с другими регуляторными последова

- 13 016880 тельностями.

Например, для повышения транскрипционной активности промотор можно функционально связывать с энхансерными последовательностями. Для этой цели можно использовать один или несколько энхансеров и/или одну или несколько копий энхансерной последовательности, например энхансер СМУ или 8У40. Соответственно в другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит один или несколько/одну или несколько энхансеров/энхансерных последовательностей, предпочтительно энхансер СМУ или 8У40.

Понятие энхансер обозначает полинуклеотидную последовательность, которая в цис-положении оказывает воздействие на активность промотора и тем самым стимулирует транскрипцию функционально связанного с этим промотором гена. В отличие от промоторов действие энхансеров не зависит от положения и ориентации и поэтому их можно помещать перед или после транскрипционной единицы, внутри интрона или даже внутри кодирующей области. При этом энхансер можно располагать как в непосредственной близости от транскрипционной единицы, так и на значительном расстоянии от промотора. Может иметь место также физическое или функциональное перекрытие с промотором. Специалисту в данной области известны многочисленные энхансеры, происходящие из различных источников (и депонированные в банках данных, таких как СеиВапк, например энхансеры 8У40, энхансеры СМУ, энхансеры полиомы, энхансеры аденовируса) и доступные в виде индивидуальных элементов или клонированные в полинуклеотидных последовательностях (например, депонированных в АТСС или получаемых от коммерческих поставщиков или индивидуальных производителей). Многие промоторные последовательности, такие, например, как часто применяемый промотор СМУ, содержат также энхансерные последовательности. Человеческий энхансер СМУ является одним из наиболее сильных из известных в настоящее время энхансеров. Примером индуцибельного энхансера является энхансер металлотионеина, который можно стимулировать глюкокортикоидами или тяжелыми металлами.

Еще одной возможной модификацией является, например, встраивание множественных сайтов связывания 8р1. Кроме того, промоторные последовательности можно комбинировать с регуляторными последовательностями, которые позволяют контролировать/регулировать транскрипционную активность. Таким путем можно создавать репрессируемый/индуцибельный промотор. Это можно осуществлять, например, путем связывания с последовательностями, которые являются сайтами связывания осуществляющих повышающую или понижающую регуляцию факторов транскрипции. Например, вышеупомянутый фактор транскрипции 8Р-1 оказывает положительное воздействие на транскрипционную активность. Другим примером является сайт связывания белка-активатора АР-1, который может оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на транскрипцию. Активность АР-1 можно контролировать с помощью различных типов факторов, таких, например, как факторы роста, цитокины и сыворотка (см. Εαίκκΐ и др., 1992 и приведенные в этой публикации ссылки). Эффективность транскрипции можно повышать также путем изменения промоторной последовательности с помощью мутации (замены, инсерции или делеции) одного, двух, трех или большего количества оснований и последующего определения с помощью анализа с использованием репортерного гена, повышается ли за счет этого промоторная активность.

В целом к регуляторным элементам относятся гетерологичные промоторы, энхансеры, сигналы терминации и полиаденилирования и другие контролирующие экспрессию элементы. Для различных типов клеток известны как индуцибельные, так и конститутивные регуляторные последовательности.

Элемент, регулирующий транскрипцию, как правило, включает промотор, расположенный против хода транскрипции относительно последовательности гена, предназначенного для экспрессии, сайты инициации и терминации транскрипции, а также сигнал полиаденилирования.

Понятие сайт инициации транскрипции обозначает нуклеиновую кислоту в составе конструкции, соответствующую первой нуклеиновой кислоте, которую встраивают в первичный транскрипт, т.е. мРНК-предшественник. Сайт инициации транскрипции может перекрываться с промоторной последовательностью.

Понятие сайт терминации транскрипции относится к нуклеотидной последовательности, которая, как правило, присутствует на 3'-конце представляющего интерес гена или транскрибируемого участка гена и которая вызывает прекращение транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой.

Сигнал полиаденилирования представляет собой сигнальную последовательность, которая вызывает расщепление в специфическом сайте на 3'-конце эукариотической мРНК и посттранскрипционное встраивание последовательности, состоящей примерно из 100-200 аденильных нуклеотидов (ро1уАхвост), на расщепленном З'-конце. Сигнал полиаденилирования содержит последовательность ААТААА, расположенную на расстоянии примерно 10-30 нуклеотидов против хода транскрипции от сайта расщепления, а также последовательность, расположенную по ходу транскрипции. Известны различные элементы полиаденилирования, такие, например, как 1к ро1уА, поздний 8У40 и ранний ро1уА или ВОН ро1уА (которые описаны, например, в И8 5122458).

Элементы, регулирующие трансляцию включают сайт инициации трансляции (АИС), стоп-кодон и ро1уА-сигнал для каждого экспрессируемого полипептида. Для оптимальной экспрессии может оказаться целесообразным удалять, добавлять или изменять 5'- и/или З'-нетранслируемые области экспрес

- 14 016880 сируемой нуклеотидной последовательности для того, чтобы элиминировать все потенциально непригодные дополнительные кодоны инициации трансляции или иные последовательности, которые могут оказывать неблагоприятное воздействие на экспрессию на уровне транскрипции или экспрессии. В альтернативном варианте для стимулирования экспрессии можно встраивать рибосомальные консенсусные сайты связывания против хода транскрипции непосредственно перед стартовым кодоном. Для получения секретируемого полипептида представляющий интерес ген, как правило, должен содержать сигнальную последовательность, которая кодирует сигнальный пептид-предшественник, транспортирующий синтезируемый полипептид к мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР-мембране) и через нее. Сигнальная последовательность часто, но не всегда, располагается на аминоконце секретируемого белка, и она расщепляется сигнальными пептидазами после проникновения белка через ЭР-мембрану. Последовательность гена, как правило, но не обязательно, содержит свою собственную сигнальную последовательность. Если нативная сигнальная последовательность отсутствует, то можно известным методом встраивать гетерологичную сигнальную последовательность. Специалисту в данной области известны многочисленные сигнальные последовательности такого типа, и они депонированы в банках данных последовательностей, таких как ОепВапк и ЕМВЬ.

Другим регуляторным элементом является внутренний рибосомальный сайт проникновения (ШЕ8). 1КЕ8-элемент содержит последовательность, которая функционально активирует инициацию трансляции независимо от 5'-концевого метилгуанозинового кэпа (кэп-структура) и расположенного против хода транскрипции гена и позволяет осуществлять в клетке животного трансляцию двух цистронов (открытых рамок считывания) из одного транскрипта. 1КЕ8-элемент представляет собой независимый рибосомальный сайт проникновения для трансляции открытой рамки считывания, расположенной непосредственно перед ним против хода транскрипции. В отличие от бактериальной мРНК, которая может быть мультицистронной, т. е. может кодировать несколько различных полипептидов или продуктов, которые мРНК транслирует один за другим, большинство мРНК из клеток животных являются моноцистронными и кодируют только один белок или продукт. В случае мультицистронного транскрипта в эукариотической клетке трансляция инициируется от ближайшего расположенного против хода транскрипции сайта инициации трансляции и заканчивается на первом стоп-кодоне, после чего транскрипт высвобождается из рибосомы. Таким образом, в результате трансляции образуется только первый кодируемый мРНК полипептид или продукт. В отличие от этого мультицистронный транскрипт, содержащий 1КЕ8-элемент, функционально связанный со второй или следующей открытой рамкой считывания в транскрипте, позволяет осуществлять последующую трансляцию открытой рамки считывания, расположенной по ходу транскрипции относительно него, в результате чего в эукариотической клетке продуцируются два или большее количество плипептидов или продуктов, кодируемых одним транскриптом.

1КЕ8-элемент может иметь различную длину и различное происхождение, он может происходить, например, из вируса энцефаломиокардита (ЕМСУ) или из других пикорнавирусов. В научной литературе описаны различные 1КЕ8-последовательности и их применение при конструировании векторов; см., например, у Ре11еОег и др., 1988; 1аид и др., 1989; БаЛек и др., 1992; Абат и др., 1991; Могдап и др., 1992; 8идппо1о и др., 1994; Катекй и др., 1996, Моккег и др., 1997.

Расположенную по ходу транскрипции последовательность гена функционально связывают с З'концом 1КЕ8-элемента, т.е. выбирают такое расстояние, чтобы он не оказывал влияния или оказывал лишь незначительное влияние на экспрессию гена, или чтобы уровень экспрессии был достаточным для конкретной цели. Для обеспечения достаточного уровня экспрессии можно выбирать оптимальное и допустимое расстояние между 1КЕ8-элементом и стартовым кодоном расположенного по ходу транскрипции относительно него гена на основе простых экспериментов путем вариации расстояния и определения уровня экспрессии в функции расстояния с помощью анализа с использованием репортерного гена.

С помощью описанных мер можно создавать оптимальную кассету экспрессии, которая имеет большую ценность с точки зрения обеспечения экспрессии гетерологичных продуктов гена. Таким образом, кассета экспрессии, полученная с помощью одного или нескольких таких средств, представляет собой еще одни объект изобретения.

Промотор убикитина/827а хомячка.

В другом варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит промотор убикитина/827а хомячка, предпочтительно функционально связанный с представляющим интерес геном и еще более предпочтительно функционально связанный с представляющим интерес геном и геном, кодирующим флуоресцентный белок или селектируемый маркер.

Промотор убикитина/827а хомячка представляет собой сильный гомологичный промотор, описанный в АО 97/15664. Такой промотор предпочтительно обладает по меньшей мере одним из следующих отличительных признаков: наличием богатой ОС области последовательности, сайта связывания 8р1, полипиримидинового элемента, отсутствием ТАТА-бокса. Наиболее предпочтительным является промотор, в котором присутствует сайт связывания 8р1, но отсутствует ТАТА-бокс. Кроме того, предпочтительным является такой промотор, который конститутивно активируется и, прежде всего, обладает одинаковой активностью в содержащей сыворотку, имеющей низкое содержание сыворотки и бессывороточной клеточной культуре. Другой вариант осуществления изобретения относится к индуцибельному

- 15 016880 промотору, прежде всего к промотору, который активируется при удалении сыворотки.

Наиболее предпочтительным вариантом осуществления изобретения является промотор, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 5 XVΟ 97/15664. При этом наиболее предпочтительными являются промоторные последовательности, которые содержат участок от положения -161 до - 45 последовательности, представленной на фиг. 5.

Каждый из промоторов, описанных в примерах, которые приведены в описании настоящей заявки, содержат молекулу ДНК, имеющую последовательность, которая соответствует фрагменту от положения - 372 до положения +111 последовательности, представленной на фиг. 5 νΟ 97/15664, и представляет собой предпочтительный промотор, т.е. предпочтительный промотор должен содержать указанную область последовательности.

Создание экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении.

Экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, можно создавать в целом согласно общепринятым известным в данной области методам, которые описаны, например, у 8атЬгоск и др. (1989). В этом руководстве описаны также функциональные компоненты вектора, например пригодные промоторы (в дополнение к промотору убикитина/827а хомячка), энхансеры, сигналы терминации и полиаденилирования, гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, селектируемые маркеры, сайты инициации репликации и сигналы сплайсинга. Для конструирования можно применять общепринятые клонирующие векторы, например плазмиды, бактериофаги, фагмиды, космиды или вирусные векторы, такие как векторы на основе бакуловируса, ретровируса, аденовирусы, аденоассоциированного вируса и вируса герпеса простого, а также синтетические или искусственные хромосомы/мини-хромосомы. Эукариотические экспрессионные векторы, как правило, содержат также прокариотические последовательности, такие, например, как сайт инициации репликации, и гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам, которые позволяют осуществлять репликацию и отбор вектора в бактериях. Известно большое количество эукариотических экспрессионных векторов, которые содержат множественные сайты клонирования для встраивания полинуклеотидной последовательности, некоторые их них можно покупать у различных фирм, таких как 81га1адспс. Ла-Джолла, шт. Калифорния, США; 1пуйгодеп, Карлсбад, шт. Калифорния, США; Рготеда, Мэдисон, шт. Висконсин, США или ΒΌ Вю8С1епсе8 С1оп!есй, Пало-Альто, шт. Калифорния, США.

Гетерологичный промотор, представляющий(е) интерес ген (или гены), селектируемые маркеры и необязательно также ген, кодирующий флуоресцентный белок, дополнительные регуляторные элементы, такие, например, как внутренний рибосомальный сайт проникновения (ΙΚΕ8), энхансер, сигнал полиаденилирования и другие цис-активные элементы, такие, например, как ТЕ-элемент, встраивают в экспрессионный вектор с помощью известного специалистам в данной области метода. Экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, содержит, как минимум, гетерологичный промотор, представляющий интерес ген и ТЕ-элемент. Предпочтительно экспрессионный вектор содержит также ген, кодирующий флуоресцентный белок. Согласно изобретению наиболее предпочтительно использовать в качестве гетерологичного промотора промотор убикитина/827а. Наиболее предпочтительным является экспрессионный вектор, в котором гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/827а, представляющий интерес ген и ТЕ-элемент функционально связаны друг с другом или находятся в функциональной связи.

В контексте настоящего описания понятие функциональная связь или функционально связаны относится к двум или большему количеству нуклеотидных последовательностей или фрагментов последовательностей, которые расположены таким образом, что они могут выполнять предназначенные для них функции. Например, промотор/энхансер, промотор/ТЕ-элемент или промотор/энхансер/ТЕ-элемент функционально связаны с кодирующей последовательностью гена, если они могут контролировать или модулировать транскрипцию связанной последовательности гена в цис-положении. Как правило, хотя это не является необходимым, функционально связанные последовательности ДНК расположены близко друг к другу и, если связаны две кодирующие последовательности генов, или в случае последовательности сигнала секреции, находятся в одной рамке считывания. Хотя, как правило, функционально связанный промотор расположен против хода транскрипции относительно кодирующей последовательности гена, не является необходимым, чтобы они были смежными. Не является необходимым также, чтобы энхансер или ТЕ-элементы были смежными при условии, что они способствуют осуществлению транскрипции или экспрессии последовательности гена. Для осуществления своей функции они могут располагаться как против хода транскрипции, так и по ходу транскрипции относительно последовательности гена, при необходимости на определенном расстоянии от нее. Сайт полиаденилирования функционально связан с последовательностью гена, если он расположен на З'-конце последовательности так, что транскрипция кодирующей последовательности проходит до сигнала полиаденилирования. Связывание можно осуществлять с помощью общепринятых методов рекомбинации, например с помощью метода ПЦР, встраивания путем лигирования в пригодные сайты рестрикции или путем сплайсинга. Если пригодные сайты рестрикции отсутствуют, то можно применять хорошо известным методом синтетические олигонуклеотидные линкеры или адаптеры.

В одном из описанных вариантов осуществления изобретения функционально связывают друг с

- 16 016880 другом гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/827а или промотор СМУ, представляющий интерес ген и ген, кодирующий флуоресцентный белок. Это означает, например, что как представляющий интерес ген, так и ген, кодирующий флуоресцентный белок, экспрессируются под контролем одного и того же гетерологичного промотора. В одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления изобретения функциональное связывание осуществляют с использованием 1КЕ8элемента, так что из обоих генов синтезируется бицистронная мРНК. Экспрессионный вектор, предлагаемый в изобретении, может дополнительно содержать энхансерные элементы и/или ТЕ-элементы, которые оказывают функциональное воздействие на один или несколько промоторов. Наиболее предпочтительным является экспрессионный вектор, в котором гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/827а или его модифицированная форма либо промотор СМУ связаны с энхансерным элементом, например энхансером 8У40 или энхансерным элементом СМУ, а также с ТЕ-элементом.

В принципе экспрессия генов в экспрессионном векторе может инициироваться из одной или нескольких транскрипционных единиц. При этом транскрипционная единица обозначает область, которая содержит один или несколько транскрибируемых генов. При этом гены в транскрипционной единице функционально связаны друг с другом таким образом, что все гены, содержащиеся в такой единице, находятся под транскрипционным контролем одного и того же промотора, промотора/энхансера или промотора/энхансера/ТЕ-элемента. В результате такого транскрипционного связывания генов из одной транскрипционной единицы могут осуществляться транскрипция и, следовательно, экспрессия более чем одного белка или продукта. При этом каждая транскрипционная единица содержит регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции содержащихся в ней последовательностей гена. Каждая транскрипционная единица может содержать одинаковые или различные регуляторные элементы. Для функционального связывания генов в транскрипционной единице можно применять 1ВЕ8элементы или интроны.

Экспрессионный вектор может содержать одну транскрипционную единицу, предназначенную для экспрессии представляющего(их) интерес гена (или генов), селектируемый маркер и необязательно ген, кодирующий флуоресцентный белок. В альтернативном варианте указанные гены могут располагаться также в двух или большем количестве транскрипционных единиц. Могут иметь место различные комбинации генов в транскрипционной единице. В другом варианте осуществления настоящего изобретения в клетку-хозяина можно встраивать путем котрансфекции или последовательных трансфекций, осуществляемых в любом порядке, более одного экспрессионного вектора, состоящего из одной, двух или большего количества транскрипционных единиц. Можно выбирать любые комбинации регуляторных элементов и генов в каждом векторе при условии, что при этом обеспечивается достаточный уровень экспрессии транскрипционных единиц. При необходимости в экспрессионных векторах можно размещать другие регуляторные элементы, такие, например, как ТЕ-элементы, и гены, такие, например, как дополнительные представляющие интерес гены или селектируемые маркеры.

Под объем изобретения подпадают также предпочтительные экспрессионные векторы, которые содержат один или несколько ТЕ-элементов и вместо представляющего интерес гена содержат множественный сайт клонирования, который позволяет осуществлять клонирование представляющего интерес гена с использованием последовательностей, распознаваемых рестриктазами. Из существующего уровня техники известны многочисленные последовательности, распознаваемые самыми разнообразными рестриктазами, а также соответствующие рестриктазы. Предпочтительно в качестве распознаваемой последовательности применяют последовательность, которая состоит по меньшей мере из 6 нуклеотидов. Перечень пригодных распознаваемых последовательностей можно найти, например, у 8атЬгоок и др., (1989).

Кроме того, под объем изобретения подпадают также такие экспрессионные векторы, которые вместо представляющего интерес гена содержат только множественный сайт клонирования, который позволяет осуществлять клонирование представляющего интерес гена с использованием последовательностей, распознаваемых рестриктазами, и которые, кроме того, содержат один или несколько множественных сайтов клонирования в различных положениях экспрессионного вектора, которые дополнительно позволяют клонировать ТЕ-элементы с использованием последовательностей, распознаваемых рестриктазами. Из существующего уровня техники известны многочисленные последовательности, распознаваемые самыми разнообразными рестриктазами, а также соответствующие рестриктазы. Предпочтительно в качестве распознаваемых последовательностей применяют последовательности, которые состоят по меньшей мере из 6 нуклеотидов. Перечень пригодных распознаваемых последовательностей можно найти, например, у 8атЬгоок и др. (1989).

Клетки-хозяева.

Для трансфекции экспрессионным вектором, предлагаемым в изобретении, применяют эукариотические клетки-хозяева, предпочтительно клетки млекопитающих и наиболее предпочтительно клетки грызунов, например линии клеток мышей, крыс и хомячков. В результате успешной трансфекции соответствующих клеток экспрессионным вектором, предлагаемым в изобретении, получают трансформированные, генетически модифицированные, рекомбинантные или трансгенные клетки, которые также являются объектом настоящего изобретения.

- 17 016880

Для целей изобретения предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки хомячка, такие, например, как клетки линий ВНК21, ВНК ТК^-, СНО, СН0-К1, СН0-0ИКХ, СН0-0ИКХ В1 и СН0ЭС44 или производные/потомки указанных линий клеток. Наиболее предпочтительными являются клетки линий СН0-ЭО44, СН0-0ИКХ, СН0-К1 и ВНК21, прежде всего клетки линий СНО-ЭС44 и СН0ЭиКХ. Пригодными являются также клетки мышиной миеломы, предпочтительно клетки линий N80 и 8р2/0, а также производные/потомки этих линий клеток.

Примеры линий клеток хомячка и мыши, которые можно применять согласно изобретению, представлены в приведенной ниже табл. 1. Однако в качестве клеток-хозяев для производства биофармацевтических белков пригодны также производные и потомки этих линий клеток, линии клеток других млекопитающих, включая (но не ограничиваясь только ими) линии клеток человека, мыши, крыс, обезьян, грызунов, или эукариотические клетки, включая (но не ограничиваясь только ими) клетки дрожжей, насекомых, птиц и растений.

Таблица 1

Применяемые для получения продукта линии клеток хомячка и мыши

Линия клеток	Номер депозита
N80	ЕСАСС Νο. 85110503
8р2/0-А§14	АТСС СК.Е-1581
ВНК21	АТСС ССЫО
ВНК ТК'	ЕСАСС Νο. 85011423
НаК	АТСС ССЬ-15
Линия клеток	Номер депозита
2254-62.2 (производное ВНК-21)	АТСС СКЬ-8544
СНО	ЕСАСС Νο. 8505302
СНО-К1	АТСС ССЬ-61
сно-оикх (= СНО Лик', СНО/дкй··)	АТСС СКЬ-9096
сноюикх В1	АТСС СКЬ-9010
СНО-Ц644	иг1аиЬ и др., Се1133 [21, 405-412, 1983
СНО Рго-5	АТСС СК.Ь-1781
У79	АТСС ССС-93
В14АЕ28-ОЗ	АТСС ССЬ-14
СНЕ	ЕСАСС Νο. 87111906

Трансфекцию эукариотических клеток-хозяев полинуклеотидом или одним из экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении, осуществляют с помощью общепринятых методов (8атЬгоок и др., 1989; Аи8иЬе1 и др., 1994). К пригодным методам трансфекции относятся, например, опосредуемая липосомой трансфекция, совместное осаждение фосфатом кальция, электропорация, опосредуемая поликатионами (например, ДЭАЭ-декстраном) трансфекция, слияние с протопластами, микроинъекция и заражение вирусом. Согласно изобретению предпочтительно осуществляют стабильную трансфекцию, при которой конструкцию интегрируют либо в геном клетки-хозяина или в искусственную хромосому/минихромосому, либо стабильно встраивают в клетку в составе эписомы. При этом предпочтительным является метод трансфекции, который позволяет осуществлять оптимальную частоту трансфекции и экспрессию гетерологичного гена в конкретной клетке-хозяине. По определению каждую последовательность или каждый ген, которую/который встраивают в клетку-хозяина, обозначают как гетерологичная последовательность или гетерологичный ген по отношению к клетке-хозяину. Это имеет место даже в том случае, когда встраиваемая последовательность или встраиваемый ген является идентичной/идентичным эндогенной последовательности или эндогенному гену клетки-хозяина. Например, ген актина хомячка, встроенный в клетку хомячка, служащую в качестве клетки-хозяина, по определению является гетерологичным геном.

Согласно изобретению предпочтительными являются рекомбинантные клетки млекопитающих, предпочтительно клетки грызунов, наиболее предпочтительно клетки хомячка, такие, например, как СНО- или ВНК-клетки, трансфектированные одним из представленных в настоящем описании экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении.

Для рекомбинантного производства гетеромерных белков, таких, например, как моноклональные антитела (МАт), трансфекцию пригодных клеток-хозяев в принципе можно осуществлять двумя различными путями. Такие МАт состоят из нескольких субъединиц, т.е. тяжелых и легких цепей. Гены, кодирующие эти субъединицы, можно вводить в независимые или мультицистронные транскрипционные единицы в одну плазмиду, которой затем трансфектируют клетку-хозяина. Это должно обеспечивать стехиометрическое представление генов после интеграции в геном клетки-хозяина. Однако в случае независимых транскрипционных единиц необходимо гарантировать, чтобы мРНК, которые кодируют различные белки, обладают одинаковой стабильностью и эффективностью транскрипции и трансляции. Во втором случае экспрессия гена осуществляется в мультицисторонной транскрипционной единице при участии одного промотора и при этом образуется только один транскрипт. Путем применения ШЕ8элементов достигают высокоэффективной внутренней инициации трансляции генов во втором и последующих цисторонах. Однако скорости экспрессии для этих цистронов меньше, чем для первого цистрона, инициация трансляции которого благодаря так называемому кэп-зависимому комплексу предварительной инициации является существенно более эффективной по сравнению с ШЕ8-зависимой инициа

- 18 016880 цией трансляции. Для достижения действительно эквимолярных уровней экспрессии цистронов можно, например, встраивать дополнительные межцистронные элементы, которые в сочетании с 1КЕ8элементами обеспечивают одинаковые уровни экспрессии (\УО 94/05785).

Другим возможным путем получения многочисленных гетерологичных белков, предлагаемым в изобретении, является последовательная трансфекция, при которой трансфекцию генами, интегрированными в различные экспрессионные векторы, осуществляют в разные моменты времени. Например, тяжелую цепь и легкую цепь антитела можно встраивать в клетку одну после другой в ходе двух стадий трансфекции.

Еще один путь одновременного получения нескольких гетерологичных белков, который является предпочтительным согласно изобретению, заключается в осуществлении котрансфекции, при которой гены по отдельности интегрируют в различные экспрессионные векторы. Этот путь обладает тем преимуществом, что он позволяет регулировать определенные взаимные соотношения между генами и продуктами генов, благодаря чему можно выравнивать различия в стабильности мРНК, а также эффективности транскрипции и трансляции. Кроме того, экспрессионные векторы благодаря их небольшим размерам являются более стабильными и ими легче манипулировать в процессе клонирования, а также трансфекции.

Для этого в одном конкретном варианте осуществления изобретения клетки-хозяева дополнительно трансфектируют, предпочтительно котрансфектируют одним или несколькими векторами, содержащими гены, которые кодируют один или несколько других представляющих интерес белков. Другой вектор или другие векторы, применяемые для котрансфекции, кодируют, например, другой или другие белок/белки, представляющий/представляющие интерес, под контролем одного и того же промотора, предпочтительно под контролем одной и той же комбинации промотор/энхансер или наиболее предпочтительно под контролем одной и той же комбинации промотор/энхансер/ТЕ-элемент, или также под контролем одной и той же комбинации промотор/энхансер с различными ТЕ-элементами, а также по меньшей мере один селектируемый маркер, например дигидрофолатредуктазу.

В другом варианте осуществления изобретения векторы, применяемые для трансфекции, могут содержать один или несколько ТЕ-элементов в любой комбинации, положении и ориентации.

В следующем конкретном варианте осуществления изобретения клетки-хозяева котрансфектируют по меньшей мере двумя эукариотическими экспрессионными векторами, причем по меньшей мере один из двух векторов содержит по меньшей мере один ген, который кодирует, по меньшей мере, представляющий интерес белок, а второй вектор содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, в любой комбинации, положении и ориентации, и необязательно кодирует также по меньшей мере один ген, представляющий интерес, и указанные нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, благодаря коинтеграции с другим вектором оказывают свое усиливающее транскрипцию или экспрессию действие на гены, представляющие интерес.

Согласно изобретению клетки-хозяева предпочтительно создают, адаптируют и культивируют в бессывороточных условиях, необязательно в средах, не содержащих белков/пептидов животного происхождения. Примерами имеющихся на рынке сред являются среда Хэма Е12 (фирма 81§та, Дейзенхофен, Германия), ΚΡΜΙ-1640 (фирма 81§та), модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (ИМЕМ; фирма 81§та), минимальная поддерживающая среда (МЕМ; фирма 81§та), модифицированная по способу Исков среда Дульбекко (1МИМ; фирма 81§та), СИ-СНО (фирма 1пуйго§еп, Карлсбад, шт. Калифорния, США), СНО-8-8ГМП (фирма 1пуйго§еп), бессывороточная СНО-среда (фирма 81§та) и безбелковая СНО-среда (фирма 81§та). Каждую из этих сред необязательно можно дополнять различными соединениями, например гормонами и/или другими факторами роста (например, инсулином, трансферрином, эпидермальным фактором роста, инсулинподобным фактором роста), солями (например, хлоридом натрия, кальция, магния, фосфатом), буферами (например, НЕРЕ8), нуклеозидами (например, аденозином, тимидином), глутамином, глюкозой или другими эквивалентными питательными веществами, антибиотиками и/или микроэлементами. Хотя согласно изобретению предпочтительными являются бессывороточные среды, для культивирования клеток-хозяев можно использовать также среды, дополненные сывороткой в пригодном количестве. Для отбора генетически модифицированных клеток, которые экспрессируют один или несколько маркерных генов, в среду можно добавлять один или несколько селектирующих агентов.

Понятие селектирующий агент обозначает субстанцию, которая оказывает воздействие на рост или выживание клеток-хозяев с дефицитом соответствующего гена селектируемого маркера. В рамках настоящего изобретения предпочтительно используют генетицин (О418) в качестве добавки к среде для отбора гетерологичных клеток-хозяев, которые несут ген неомицинфосфотрансферазы дикого типа или предпочтительно модифицированный ген. Предпочтительно О418 применяют в концентрации от 100 до 800 мкг/мл среды, наиболее предпочтительно концентрация составляет от 200 до 400 мкг О418/мл среды. Если требуется трансфектировать клетки-хозяева несколькими экспрессионными векторами, например если требуется по отдельности встраивать в клетку-хозяина несколько представляющих интерес генов, то, как правило, они имеют различные селектируемые маркерные гены.

Селектируемый маркерный ген представляет собой ген, который позволяет осуществлять специ

- 19 016880 фический отбор клеток, содержащих этот ген, путем добавления соответствующего селектирующего агента в культуральную среду. Примером позитивного селектируемого маркера может служить ген, обусловливающий устойчивость к антибиотикам. В присутствии соответствующего антибиотика могут расти только клетки, трансформированные этим геном, и можно осуществлять их отбор по этому признаку. В отличие от них нетрансформированные клетки не могут расти или выживать в этих селектирующих условиях. Существуют позитивные, негативные и бифункциональные селектируемые маркеры. Позитивные селектируемые маркеры позволяют осуществлять отбор и тем самым обогащение трансформированных клеток в результате придания устойчивости к селектирующему агенту или за счет компенсации метаболического или катаболического дефекта клетки-хозяина. В отличие от этого благодаря негативному селектируемому маркеру можно избирательно элиминировать клетки, несущие селектируемый маркер. Примером является ген тимидинкиназы вируса герпеса простого, экспрессия которого в клетках при одновременном добавлении ацикловира или ганцикловира приводит к их элиминации. К применяемым согласно настоящему изобретению селектируемым маркерам относятся амплифицируемые селектируемые маркеры, включая измененные методами генной инженерии мутанты и варианты, фрагменты, функциональные эквиваленты, производные, гомологи и слияния с другими белками или пептидами при условии, что селектируемый маркер сохраняет свои избирательные (пригодные для селекции) свойства. Такие производные обладают значительной гомологией аминокислотной последовательности в областях или доменах, которые, как предполагается, обусловливают пригодные для селекции свойства. В научной литературе описаны многочисленные селектируемые маркерные гены, включая бифункциональные (позитивные/негативные) маркеры (см., например, XV 0 92/08796 и XV0 94/28143). Примерами селектируемых маркеров, которые, как правило, применяют в эукариотических клетках, являются гены аминогликозидфосфотрансферазы (АРН), гигромицинфосфотрансферазы (НУС), дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ), тимидинкиназы (ТК), глутаминсинтетазы, аспарагинсинтетазы и гены, обусловливающие устойчивость к неомицину (С418), пуромицину, гистидинолу Ό, блеомицину, флеомицину и зеоцину.

Понятие модифицированная неомицинфосфотрансфераза (ЫРТ) включает все описанные в Χν0 2004/050884 мутанты, прежде всего мутант Э227С (Акр227С1у), который характеризуется заменой аспарагиновой кислоты (Акр, Ό) на глицин (С1у, С) в положении 227 аминокислотной последовательности, и наиболее предпочтительно мутант Ε240Ι (Рйе240Пе), который характеризуется заменой фенилаланина (Рйе, Е) на изолейцин (Не, I) в положении 240 аминокислотной последовательности.

Таким образом, под объем настоящего изобретения подпадает способ создания и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, который заключается в том, что осуществляют следующие стадии: (Ι) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют по меньшей мере один белок/продукт, представляющий интерес, и неомицинтрансферазу, предпочтительно модифицированную, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген (или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одним ТЕ-элементом; (II) культивируют клетки в условиях, в которых может происходить экспрессия различных генов; и (III) отбирают такие коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как С418. При этом предпочтительно трансфектированные клетки культивируют в бессывороточной среде. Предпочтительно концентрация С418 составляет по меньшей мере 200 мкг/мл. Однако концентрация может составлять также по меньшей мере 400 мкг/мл.

Амплифицируемый селектируемый маркерный ген.

Кроме того, клетки, предлагаемые в изобретении, необязательно можно подвергать также одной или нескольким стадиям амплификации гена, на которых их культивируют в присутствии селектирующего агента, что приводит к амплификации амплифицируемого селектируемого маркерного гена.

Предпосылкой этого является осуществление дополнительной трансфекции клеток-хозяев геном, который кодирует амплифицируемый селектируемый маркер. Возможно, чтобы ген, который кодирует амплифицируемый селектируемый маркер, присутствовал в одном из экспрессионных векторов, предлагаемых в изобретении, или был встроен в клетку-хозяина с помощью другого вектора.

Амплифицируемый селектируемый маркерный ген, как правило, кодирует фермент, необходимый для роста эукариотических клеток в определенных условиях культивирования. Например, амплифицируемый селектируемый маркерный ген может кодировать дигидрофолатредуктазу (ЭНЕЕ). В этом случае амплификация гена происходит, когда трансфектированную им клетку-хозяина культивируют в присутствии селектирующего агента метотрексата (МТХ).

В приведенной ниже табл. 2 даны примеры других амплифицируемых селектируемых маркерных генов и соответствующих селектирующих агентов, которые можно применять согласно изобретению и которые описаны в обзоре КаиЕтаи, Мебюбк ίη Епхуто1оду. 185, 1990, с. 537-566.

- 20 016880

Таблица 2

Амплифицируемые селектируемые маркерные гены

Амплифицирумый селектируемый маркерный ген	Номер депозита	Селектирующий агент
ОНГк (дигидрофолат редуктаза)	М19869 (хомячок) Е00236 (мышь)	метотрексат (МТХ)
металлотионеин	ϋ 10551 (хомячок) М13003 (человек) М11794 (крыса)	кадмий
САО (карбамоилфосфатсинтетаз агаспартаттранскарбамилаз агдигидрооротаза)	М23652 (хомячок) 078586 (человек)	М-фосфоацетил-Ьаспартат
аденозиндеаминаза	К.02567 (человек) М10319 (мышь)	Ху1-А- или аденозин, 2'дезоксикоформицин
АМР (аденилат)-деаминаза	012775 (человек) 102811 (крыса)	аденин, азасерин, коформицин
иМР-синтаза	Ί03626 (человек)	6-азауридин, пиразофуран
ΙΜΡ 5'-дегидрогеназа	Ί04209 (хомячок) 104208 (человек) М33934 (мышь)	микофеноловая кислота
ксантин-гуанин- фосфорибозилтрансфераза	Х00221 (Е. соН)	микофеноловая кислота с ограничивающим !!! ксантином
мутантная НОРКТаза или мутантная тимидинкиназа	ЛОООбО (хомячок) М13542, К02581 (человек) Σ00423, М68489(мышь) М63983 (крыса) М36160 (вирус герпеса)	гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ)
тимидилатсинтетаза	000596 (человек) М13019 (мышь) Ы2138 (крыса)	5 - фтор дезо ксиу р и дин
Р-гликопротеин 170 (МПК1)	АЕ016535 (человек) .103398 (мышь)	несколько лекарственных средств, например, адриамицин, винкристин, колхицин
рибонуклеотидредуктаза	М124223, К02927 (мышь)	афидиколин
глутаминсинтетаза	АГ150961 (хомячок) и09114, М60803 (мышь) М29579 (крыса)	метионинсульфоксимин (М8Х)
аспарагинсинтетаза	М27838 (хомячок) М27396 (человек) из 8940 (мышь) 007202 (крыса)	β-аспартилгидроксамат, албиззин, 5'-азацитидин
аргининсукцинатсинтетаза	Х01630 (человек) М31690 (мышь) М26198 (корова)	канаванин
орнитиндекарбоксилаза	М34158 (человек) 303733 (мышь) М16982 (крыса)	а-дифторметилорнитин
НМ6-СоА-редуктаза	Ь00183, М12705 (хомячок) М11О58 (человек)	компактин
Ν- ацетилглюкозаминилтранс фераза	М55621 (человек)	туникамицин
треонил-тРНК-синтетаза	М63180 (человек)	боррелидин
Иа+К+-АТФаза	Ί05096 (человек) М14511 (крыса)	оуабоин

В качестве амплифицируемого селектируемого маркерного гена согласно изобретению предпочтительно применяют ген, который кодирует полипептид, обладающий функцией ΌΗΡΒ, например ΌΗΡΒ или слитый белок, содержащий флуоресцентный белок и ΌΗΡΒ. ΌΗΡΒ необходим для биосинтеза пуринов. Клетки, в которых отсутствует ген ΌΗΡΒ, не могут расти в среде с дефицитом пурина. Поэтому ген ΌΗΡΒ представляет собой селектируемый маркер, который можно применять для отбора и амплификации генов в клетках, культивируемых в не содержащей пурин среде. Селектирующим агентом, который применяют в сочетании с геном ΌΗΡΒ, является метотрексат (МТХ).

При использовании ΌΗΡΒ в качестве амплифицируемого селектируемого маркера предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки млекопитающих, предпочтительно клетки мышиной миеломы и клетки хомячка. Наиболее предпочтительными являются линии клеток СИ0-ЭиКХ (АТСС СКЕ9096) и №0-0644 (Иг1аиЬ и др., 1983), поскольку вследствие мутации они не обладают собственной ΟΗΡΒ-активностью. Для того чтобы иметь возможность применять индуцируемую ΏΗΡΒ амплификацию также и в других типах клеток, которые обладают собственной эндогенной ΟΗΡΒ-активностью, можно использовать для трансфекции мутантный ген ΏΗΡΒ, который кодирует белок с пониженной чувствительностью к метотрексату (81топ§оп и др., 1983; ^1§1ег и др., 1980; ШЬег и др., 1982).

ΏΗΡΒ-маркер наиболее пригоден для отбора и последующей амплификации при использовании ΟΗΡΒ-негативных базовых клеток, таких как СИ0-Э644 или 6Η0-0υΚΧ, поскольку эти клетки не экс

- 21 016880 прессируют эндогенную ЭНБК и следовательно не растут в не содержащей пурин среде. Поэтому в данном случае можно применять ген ЭНБК в качестве основного селектируемого маркера и отбирать трансформированные клетки в не содержащей гипоксантин/тимидин среде.

Таким образом, под объем настоящего изобретения подпадает способ получения и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, отличающийся тем, что осуществляют стадии, на которых: (Ι) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют по меньшей мере один белок/продукт, представляющий интерес, и амплифицируемый селектируемый маркер ЭНБК, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген (или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одним ТЕ-элементом; (II) культивируют клетки в условиях, в которых может происходить экспрессия различных генов; и (III) осуществляют амплификацию таких коинтегрированных генов путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, который позволяет осуществлять амплификацию, по меньшей мере, амплифицируемого селектируемого маркерного гена, такого, например, как метотрексат. При этом предпочтительно трансфектированные клетки культивируют в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, в присутствии сыворотки и при добавлении МТХ в возрастающих концентрациях. Предпочтительно концентрация МТХ на первой стадии амплификации составляет по меньшей мере 100 нМ. Однако концентрация МТХ может составлять также по меньшей мере 250 нМ и ее можно ступенчато повышать вплоть до 1 мкМ. В отдельных случаях можно применять концентрации, превышающие 1 мкМ, например 2 мкМ.

Под объем настоящего изобретения подпадает также способ получения и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, который отличается тем, что осуществляют стадии, на которых: (I) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют по меньшей мере один белок/продукт, представляющий интерес, неомицинфосфотрансферазу, предпочтительно модифицированную, и амплифицируемый селектируемый маркер ЭНБК, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген (или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одним ТЕэлементом; (II) культивируют клетки в условиях, в которых может происходить экспрессия различных генов; и (III) осуществляют отбор таких коинтегрированных генов путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как 0418, в не содержащей гипоксантин/тимидин среде; и (IV) осуществляют амплификацию таких коинтегрированных генов путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, который позволяет осуществлять амплификацию, по меньшей мере, амплифицируемого селектируемого маркерного гена, такого, например, как метотрексат. При этом предпочтительно трансфектированные клетки культивируют в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, дополненной по меньшей мере 200 мкг/мл 0418, предпочтительно 400 мкг/мл 0418 или даже более, в присутствии сыворотки и при добавлении МТХ в возрастающих концентрациях. Предпочтительно концентрация МТХ на первой стадии амплификации составляет по меньшей мере 100 нМ. Однако концентрация МТХ может составлять также по меньшей мере 250 нМ и ее можно ступенчато повышать вплоть до 1 мкМ. В отдельных случаях можно применять концентрации, превышающие 1 мкМ, например 2 мкМ.

Отбор трансфектированных клеток можно осуществлять также с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (БАС8). Для этой цели можно применять, например, бактериальную βгалактозидазу, маркеры клеточной поверхности или флуоресцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок (ОБР) и его варианты, полученные из Аедиогеа νίοΙοΓία и Кеш11а гешГогтб или других видов; красный флуоресцентный белок и белки, испускающие флуоресценцию другого цвета, и их варианты, полученные из не обладающих биолюминесценцией организмов, таких, например, как Эйсоюта §р., Аттоша ер., С1а\'и1апа ер., Ζοηηΐΐιιΐδ ер., Аедиогеа соеги1е8сеи8.

Экспрессия гена и отбор высокопродуктивных клеток-хозяев.

Понятие экспрессия гена относится к транскрипции и/или трансляции гетерологичной генной последовательности в клетке-хозяине. Уровень экспрессии, как правило, можно оценивать либо на основе количества соответствующей мРНК, присутствующей в клетке-хозяине, либо на основе количества продуцированного продукта гена, кодируемого представляющим интерес геном. Количество мРНК, полученной в результате транскрипции выбранной нуклеотидной последовательности, можно определять, например, с помощью гибридизации методом нозерн-блоттинга, защиты РНК от рибонуклеазы, гибридизации ίη 811и клеточной РНК или методами ПЦР (например, с помощью количественной ПЦР) (8атЬгоок и др., 1989; Аи8иЬе1 и др., 1994). Белки, кодируемые выбранной нуклеотидной последовательностью, также можно оценивать с помощью различных методов, таких, например, как ЕЫ8А, ЖХВР с использованием протеина А, вестерн-блоттинг, радиоиммунный анализ, иммунопреципитация, путем выявления биологической активности белка, путем иммунноокрашивания белка с последующим БАС8-анализом или с помощью флуоресцентной микроскопии, путем прямого обнаружения флуоресцирующего белка с помощью БАС8-анализа или флуоресцентной микроскопии (8атЬгоок и др., 1989; Аи8иЬе1 и др., 1994). Эти методы позволяют, например, исследовать приводит ли предлагаемый в изобретении ТЕ-элемент, имеющий последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0: 1, или его любой участок, фрагмент или область либо их производные или комбинации к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена.

- 22 016880

Повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности означает повышение экспрессии или синтеза встроенной в клетку-хозяина гетерологичной последовательности, например, гена, кодирующего терапевтический белок, по сравнению с контролем. Считается, что повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место, если предлагаемую в изобретении клетку культивируют согласно представленному в настоящем описании способу, предлагаемому в изобретении, и если указанная клетка обладает по меньшей мере в 1,3 раза или в 1,5 раза более высокой удельной продуктивностью либо предпочтительно в два раза более высокой удельной продуктивностью. Повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в три раза более высокой удельной продуктивностью. Предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в четыре раза более высокой удельной продуктивностью. Наиболее предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в пять раз более высокой удельной продуктивностью. Наиболее предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в шесть раз более высокой удельной продуктивностью. Наиболее предпочтительно повышение экспрессии, транскрипции или продуктивности имеет место также в том случае, когда предлагаемая в изобретении клетка обладает по меньшей мере в семь раз более высокой удельной продуктивностью.

Повышения экспрессии, транскрипции или продуктивности можно достигать как путем применения одного из предлагаемых в изобретении экспрессионных векторов, так и путем применения одного из предлагаемых в изобретении способов.

Соответствующие способы можно объединять с БАСδ-опосредуемым отбором рекомбинантных клеток-хозяев, которые содержат в качестве дополнительного селектируемого маркера, например, один (или несколько) флуоресцентный белок/флуоресцентных белков (например, ОБР) или маркер клеточной поверхности. Для достижения повышенной экспрессии можно применять другие методы, а также комбинации различных методов, которые основаны, например, на использованиии цис-активных элементов для воздействия на структуру хроматина (например, ЬСК, ИСОЕ, ЕАδЕ, изоляторы, δ/МАК, δТАКэлементы), использовании (созданных искусственным путем) факторов транскрипции, обработке клеток природными или синтетическими агентами с целью повышающей регуляции экспрессии эндогенного или гетерологичного гена, улучшении стабильности (времени полужизни) мРНК или белка, улучшении инициации трансляции мРНК, повышении уровня гена за счет применения эписомальных плазмид (основанных на использовании в качестве сайтов инициации репликации вирусных последовательностей, например вирусов δν40, полиомы, аденовируса, ЕВУ или ВРУ), применении стимулирующих амплификацию последовательностей Щетапп и др., 1994) или систем амплификации ίη т11го на основе ДНКконкатемеров (Мопаео и др., 1996).

Таким образом, следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится также к способам получения и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, экспрессирующих по меньшей мере один представляющий интерес гетерологичный ген, который отличается тем, что: (I) трансфектируют рекомбинантные клетки млекопитающих экспрессионным вектором, предлагаемым в изобретении, и геном, представляющим собой амплифицируемый селектируемый маркерный ген; (II) культивируют клетки млекопитающих в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию гена(ов), представляющего(их) интерес, модифицированный ген неомицинфосфотрансферазы и ген, кодирующий флуоресцентный белок; (III) культивируют клетки млекопитающих в присутствии по меньшей мере одного селектирующего агента, который оказывает избирательное воздействие на рост клеток млекопитающих и создает предпочтительные условия для роста тех клеток, которые экспрессируют ген неомицинфосфотрансферазы; (IV) отбирают с помощью анализа методом проточной цитометрии клетки млекопитающих, обладающие высоким уровнем экспрессии флуоресцентного белка; (V) культивируют отобранные клетки в условиях, в которых экспрессируется амплифицируемый селектируемый маркерный ген; и (VI) добавляют в культуральную среду селектирующий агент, который приводит к амплификации амплифицируемого селектируемого маркерного гена.

Кроме того, в изобретении предложен способ, с помощью которого размножают продуцирующие клетки и используют их для получения представляющего интерес продукта кодирующего гена. Для этого отобранные высокопродуктивные клетки предпочтительно культивируют в бессывороточной культуральной среде и предпочтительно в суспензионной культуре в условиях, в которых может происходить экспрессия представляющего интерес гена. При этом представляющий интерес белок/продукт предпочтительно выделяют из среды для культуры клеток в виде секретируемого продукта гена. В том случае, когда экспрессия белка осуществляется при отсутствии сигнала секреции, то продукт гена можно выделять также из клеточных лизатов. Для получения чистого гомогенного продукта, практически не содержащего другие рекомбинантные белки и белки клеток-хозяев, осуществляют общепринятые стадии очистки. Для этого часто сначала из культуральной среды или лизата удаляют клетки и клеточный дебрис. Затем требуемый продукт гена можно очищать от загрязняющих растворимых белков, полипептидов и

- 23 016880 нуклеиновых кислот, например, с помощью фракционирования на иммунноаффинных и ионообменных колонках, осаждения этанолом, ЖХВР с обращенной фазой или хроматографии на сефадексе, силикагеле или катионообменных смолах, таких как ДЭАЭ. Методы, позволяющие очищать гетерологичные белки, экспрессируемые рекомбинантными клетками-хозяевами, известны специалисту в данной области и описаны в научной литературе, например, у Натв и др. (1995) и 8сорев (1988).

Композиции, предлагаемые в изобретении.

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-13 (8ЕО ГО ΝΌ: 15) или фрагмент ТЕ-13 (8Е0 ГО ΝΌ: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное ТЕ-13 (8Е0 ГО ΝΌ: 15) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе.

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-13 (8Е0 ГО ΝΌ: 15) или фрагмент ТЕ-13 (8Е0 ГО ΝΌ: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное ТЕ-13 (8Е0 ГО ΝΌ: 15) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе, при условии, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности из области нуклеиновой кислоты между 1 и 1578 парой оснований (положения указаны для 8Е0 ГО ΝΌ: 01). Под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований.

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-13 (8ЕО ГО ΝΌ: 15) или фрагмент ТЕ-13 (8ЕО ГО ΝΌ: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное ТЕ-13 (8ЕО ГО ΝΌ: 15) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе, при условии, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности ТЕ-09 (8ЕО ГО ΝΌ: 11) или ТЕ-08 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 10) либо ТЕ-13 (8ЕО ГО ΝΌ: 15). И в этом случае также под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований.

Усиление экспрессии представляющего интерес гена можно оценивать, например, путем измерения титра продукта с помощью ЕЬЕЗА.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-08 (8ЕО ГО ΝΌ: 10) или фрагмент ТЕ-08 (8ЕО ГО ΝΌ: 10), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное ТЕ-08 (8ЕО ГО ΝΌ: 10) или его фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе.

В предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении, условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности из области нуклеиновой кислоты между 1 и 1578 парой оснований (положения указаны для 8ЕО ГО ΝΌ: 01).

В наиболее предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении, условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности ТЕ-09 (8ЕО ГО ΝΌ: 11) или ТЕ-08 (8ЕО ГО ΝΌ: 10) либо ТЕ-13 (8ЕО ГО ΝΌ: 15). Под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований.

Другой вариант осуществления изобретения относится к нуклеиновой кислоте, которая содержит 8ЕО ГО ΝΌ: 1 или фрагмент 8ЕО ГО ΝΌ: 1, или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное 8ЕО ГО ΝΌ: 1 или ее фрагмента, или комплементарных им нуклеотидных последовательностей, которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе.

В предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении, условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности из области нуклеиновой кислоты между 1 и 1578 парой оснований (положения указаны для 8ЕО ГО ΝΌ: 01).

В наиболее предпочтительном варианте указанной выше нуклеиновой кислоты, предлагаемой в изобретении, условием является то, что фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности ТЕ-09 (8ЕО ГО ΝΌ: 11) или ТЕ-08 (8ЕО ГО ΝΌ: 10) либо ТЕ-13 (8ЕО ГО ΝΌ: 15). Под областью последовательности следует понимать область нуклеиновой кислоты, длина которой составляет по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 100 пар оснований.

Настоящее изобретение относится также к нуклеиновой кислоте (т.е. ТЕ-элементу), предназначенной для усиления транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена, которая имеет 8ЕО ГО ΝΌ: 1 либо ее фрагмент или производное, или комплементарные им нуклеотидные последовательности,

- 24 016880 которая приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена.

Усиление экспрессии представляющего интерес гена можно оценивать, например, путем измерения титра продукта с помощью ЕЬ18А.

Настоящее изобретение относится, прежде всего, к нуклеиновой кислоте, предлагаемой в изобретении, которая гибридизуется в строгих условиях:

(а) с областью нуклеотидной последовательности ТЕ-13 (8ЕО ГО N0: 15) или ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10); или (б) с комплементарными им нуклеотидными последовательностями; или (в) с нуклеотидной последовательностью, которая идентична по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% последовательностям, указанным в подпункте (а) или (б).

В конкретном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, имеет длину, составляющую по меньшей мере 511 пар оснований (длина ТЕ-13, 8Е0 ГО N0: 15) или по меньшей мере 1015 пар оснований (длина ТЕ-08, 8Е0 ГО N0: 10).

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к 5'-фрагменту ТЕэлемента ТЕ-00 (8Е0 ГО N0: 2). Он соответствует области, расположенной между 1 и 1578 парой оснований 8Е0 ГО N0: 1 или комплементарной ей нуклеотидной последовательности.

Настоящее изобретение относится, прежде всего, к нуклеиновой кислоте или усиливающему транскрипцию или усиливающему экспрессию элементу нуклеиновой кислоты (ТЕ-элементу), которая/который содержит ТЕ-13 (8Е0 ГО N0: 15) или ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10), или его производное, или комплементарные им нуклеотидные последовательности, которая/который при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте или выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, или выделенной нуклеотидной последовательности, или выделенному усиливающему транскрипцию элементу нуклеиновой кислоты, или выделенному ТЕ-элементу.

Настоящее изобретение относится, прежде всего, к выделенной нуклеиновой кислоте, которая содержит ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10) или комплементарную ему нуклеотидную последовательность, и при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе.

В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты, или выделенная нуклеиновая кислота содержит производное ТЕ-элемента или 8Е0 ГО N0: 1, последовательность которого идентична по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% соответствующей области последовательности ТЕэлемента или комплементарной ему последовательности, прежде всего области последовательности, расположенной между 1 и 1578 парой оснований нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1, которая соответствует 5'-области последовательности ТЕ-00 и наиболее предпочтительно ТЕ-13 (8ЕЕ) ГО N0: 15) или ТЕ-08 (8ЕЕ) ГО N0: 10).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент нуклеиновой кислоты, или выделенная нуклеиновая кислота содержит производное нуклеиновой кислоты ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10) или предпочтительно нуклеиновой кислоты ТЕ-13 (8Е0 ГО N0: 15), последовательность которого идентична по меньшей мере примерно на 70%, предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 90% и наиболее предпочтительно идентична по меньшей мере примерно на 95% соответствующей области последовательности ТЕ-элемента или комплементарной ему последовательности.

Другой вариант осуществления изобретения относится к нуклеиновой кислоте или усиливающему транскрипцию элементу нуклеиновой кислоты, или выделенной нуклеиновой кислоте или производному ТЕ-элемента, которые гибридизуются с последовательностью ТЕ-элемента или с последовательностью, комплементарной ТЕ-элементу, прежде всего с областью последовательности, расположенной между 1 и 1578 парой оснований нуклеотидной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1, которая соответствует 5'-участку последовательности элемента ТЕ-00 (8Е0 ГО N0: 2), или предпочтительно гибридизуется с элементом ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10). Предпочтительно гибридизацию осуществляют в строгих условиях гибридизации и отмывки.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или предлагаемый в изобретении усиливающий транскрипцию элемент (ТЕэлемент) выбирают из группы, включающей ТЕ-00 (8Е0 ГО N0: 2), ТЕ-01 (8Е0 ГО N0: 3), ТЕ-02 (8Е0 ГО N0: 4), ТЕ-03 (8ЕЕ) ГО N0: 5), ТЕ-04 (8ЕЕ) ГО N0: 6), ТЕ-06 (8ЕЕ) ГО N0: 8), ТЕ-07 (8ЕЕ) ГО N0: 9), ТЕ-08 (8ЕЕ) ГО N0: 10), ТЕ-10 (8ЕЕ) ГО N0: 12), ТЕ-11 (8ЕЕ) ГО N0: 13), ТЕ-12 (8ЕЕ) ГО N0: 14), ТЕ-13 (8ЕЕ) ГО N0: 15), ТЕ-14 (8ЕЕ) ГО N0: 16), ТЕ-15 (8ЕЕ) ГО N0: 17), ТЕ-16 (8ЕЕ) ГО N0: 18), ТЕ-17 (8ЕЕ) ГО

- 25 016880

ΝΟ: 19), ΤΕ-18 (81У) ΙΌ ΝΟ: 20) и ТЕ-21 (81У) ΙΌ ΝΟ: 21).

В следующем варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) отличается тем, что нуклеиновая кислота представляет собой ТЕ-00 (8Еф Ш ΝΟ: 2), ΤΕ-06 (81У) ΙΌ ΝΟ: 8), ΤΕ-10 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 12), ΤΕ-11 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 13) или ΤΕ-12 (81У) ΙΌ ΝΟ: 14), предпочтительно ΤΕ-06 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 8).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) отличается тем, что нуклеиновая кислота представляет собой ТЕ-01 (81Т) ΙΌ ΝΟ: 3), ΤΕ-02 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 4), ΤΕ-03 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 5),ΤΕ-07 (81У) ΙΌ ΝΟ: 9), ΤΕ-08 (81У) ΙΌ ΝΟ: 10).

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) представляет собой ΤΕ-08 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 10).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) представляет собой ТЕ-18 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 20).

В другом варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота или усиливающий транскрипцию элемент (ТЕ-элемент) отличается тем, что она/он представляет собой фрагмент или производное ТЕ01 (81У) ΙΌ ΝΟ: 3), предпочтительно ТЕ-13 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 15), ТЕ-14 (81У) ΙΌ ΝΟ: 16), ΤΕ-15 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 17), ΤΕ-16 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 18), ТЕ-17 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 19), ТЕ-18 (81 Τ) ΙΌ ΝΟ: 20).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, представляет собой ТЕ-13 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 15).

В другом варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении нуклеиновая кислота или ее фрагмент либо производное представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту.

Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, предлагаемой в изобретении, которая отличается тем, что содержащий нуклеиновую кислоту ТЕ-13 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 15), или ТЕ-08 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 10), или ТЕ-07 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 9), или ТЕ-06 (8Еф ΙΌ ΝΟ:8), или фрагмент этих последовательностей, или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производные этих последовательностей, или производные фрагментов этих последовательностей, предпочтительно ТЕ-13 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 15) или ТЕ-08 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 10), или фрагмент этих последовательностей, или производные этих последовательностей, или производные фрагментов этих последовательностей, или комплементарные им нуклеотидные последовательности связаны с гетерологичной последовательностью.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, связанная с гетерологичной последовательностью гена, может представлять собой экспрессионный вектор, например плазмиды, бактериофаги, фагмиды, космиды, вирусные векторы или также конкретно вектор, осуществляющий направленный перенос.

Нуклеиновая кислота, связанная с гетерологичной последовательностью гена, может также представлять собой любую другую синтетическую молекулу нуклеиновой кислоты, такую, например, как синтетическую, искусственную молекулу или мини-хромосомы.

Кроме того, настоящее изобретение относится к эукариотическому экспрессионному вектору, отличающемуся тем, что указанный экспрессионный вектор содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, или один или несколько усиливающих транскрипцию элементов (ТЕэлементов), предлагаемых в изобретении.

В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он содержит промотор и/или представляющий интерес гетерологичный ген, и/или селектируемый маркер, и/или необязательно энхансер.

Кроме того, настоящее изобретение относится к эукариотическому экспрессионному вектору, отличающемуся тем, что указанный экспрессионный вектор содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, предлагаемых в изобретении, или один или несколько усиливающих транскрипцию элементов (ТЕэлементов), предлагаемых в изобретении, и промотор и/или представляющий интерес гетерологичный ген и/или селектируемый маркер, и/или необязательно энхансер.

В другом варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он представляет собой вектор, осуществляющий направленный перенос, который предназначен для направленной интеграции представляющего интерес гена.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что промотор представляет собой гетерологичный промотор, такой как ранний промотор человеческого цитомегаловируса (СМУ-промотор), ранний промотор 8У40, главный поздний промотор аденовируса, мышиный промотор металлотионеина-Ι, участок длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса, промотор(ы) актина, иммуноглобулина или белка теплового шока, предпочтительно СМУ-промотор.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что промотор представляет собой гетерологичный промотор, предпочтительно промотор убикитина/827а, наиболее предпочтительно промотор убикитина/827а хомячка.

В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он содержит комбинацию нескольких одинаковых или различных предлагаемых в изо

- 26 016880 бретении нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов, расположенных в любой ориентации по отношению друг к другу, причем одна/один или несколько нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов расположены перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и/или одна/один или несколько нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов расположены после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что входящие в комбинацию нуклеиновые кислоты или ТЕ-элементы представляют собой ТЕ-06 (8Е0 ГО NО: 8) и наиболее предпочтительно ТЕ-08 (8Е0 ГО NО: 10).

Предпочтительными комбинациями нуклеиновых кислот или ТЕ-элементов являются ТЕ-06элемент (8ЕО ГО NО: 8), расположенный перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и ТЕ-06-элемент (8ЕО ГО NО: 8), расположенный после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него), а также три ТЕ-06-элемента (8ЕО ГО NО: 8), расположенные после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него) (см. также фиг. 13).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что одна/один или несколько ТЕ-08-нуклеиновых кислот или -элементов (8ЕО ГО NО: 10) расположены перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и одна/один или несколько расположены после представляющего интерес гена (т.е. в 3'направлении относительно него), предпочтительно один ТЕ-08-элемент (8ЕО ГО NО: 10) расположен перед указанным геном и один после него (см. также фиг. 13).

Другой предпочтительной комбинацией ТЕ-нуклеиновых кислот или -элементов являются 2 ТЕ-08нуклеиновые кислоты/элемента (8ЕО ГО NО: 10), расположенные перед и/или после представляющего интерес гена.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является эукариотический экспрессионный вектор, отличающийся тем, что несколько ТЕ-06-нуклеиновых кислот или элементов (8ЕО ГО NО: 8), предпочтительно 3, расположены после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него) (см. также фиг. 13).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что комбинация, включающая одну/один или несколько ТЕ-08нуклеиновых кислот или элементов (8ЕО ГО NО: 10) и одну/один или несколько ТЕ-06-нуклеиновых кислот или элементов (8ЕО ГО NО: 8), расположена перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'направлении относительно него) и/или после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него), предпочтительной является комбинация, включающая одну/один ТЕ-08-нуклеиновую кислоту или элемент (8ЕО ГО NО: 10), за которой следует одна/один ТЕ-06-нуклеиновая кислота или элемент (8ЕО ГО NО: 8), расположенная перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) (см. также фиг. 13).

В другом варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что одна/один или несколько ТЕ-13-нуклеиновых кислот или элементов (8ЕО ГО NО: 15) расположены перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и/или после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что он дополнительно содержит интегразу.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки-хозяева котрансфектируют по меньшей мере двумя эукариотическими экспрессионными векторами, причем по меньшей мере один из двух векторов содержит по меньшей мере один ген, который кодирует по меньшей мере один представляющий интерес белок, и другой вектор содержит одну или несколько предлагаемых в изобретении нуклеиновых кислот в любой комбинации, положении и ориентации и необязательно кодирующих также по меньшей мере один ген, представляющий интерес, и указанные нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, оказывают свое усиливающее транскрипцию или экспрессию воздействие на представляющие интерес гены, которые локализованы на другом применяемом для котрансфекции векторе, в результате коинтеграции с другим вектором.

В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотический экспрессионный вектор отличается тем, что селектируемый маркер представляет собой ЭНЕЕ или №о, например №о Ε240Ι.

Кроме того, изобретение относится к способу получения эукариотического экспрессионного вектора, отличающегося тем, что осуществляют интеграцию предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты в экспрессионный вектор.

Кроме того, изобретение относится к эукариотической клетке-хозяину, отличающейся тем, что она содержит предлагаемый в изобретении эукариотический экспрессионный вектор.

В конкретном варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин отличается тем, что она обладает высокой продуктивностью, т. е. обладает более высокой удельной продуктивностью по сравнению с эукариотической клеткой-хозяином, которая не содержит предлагаемый в изобретении ТЕэлемент или предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту, причем указанная клетка-хозяин характеризуется повышенным вплоть до двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или десяти раз уровнем экс

- 27 016880 прессии или повышенным более чем в два, более чем в три, более чем в четыре, более чем в пять, более чем в шесть, более чем в семь, более чем в десять раз уровнем экспрессии, предпочтительно повышенным вплоть до пяти раз или более чем в три раза уровнем экспрессии.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения эукариотическая клеткахозяин отличается тем, что экспрессионный вектор стабильно интегрирован в геном.

В другом варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку хомячка или мыши, такую, например, как СНО-, N80-, 8р2/0-Ад14-, ВНК21-, ВНК ТК^-, НаК-, 2254-62.2 (производное ВНК-21)-, СН0-К1-, СЮ-1)Е'К\ (т.е. СНО с1ик, СН0/аЫг), С1Ю-Ш.'1\\ В1-, СН0-ЭС44-, СНО Рго-5-, У79-, В14АТ28-С3-, СНЬ-клетку, предпочтительно СНО-клетку, и наиболее предпочтительно СН0-ЭС44-клетку.

В следующем варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, включая (но не ограничиваясь только ими) линии клеток человека, мыши, крысы, обезьян или грызунов.

Еще в одном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, включая (но не ограничиваясь только ими) клетки дрожжей, насекомых, птиц и растений.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения эукариотическая клетка-хозяин отличается тем, что она дополнительно содержит антиапоптозный ген, такой как ВСЬ-хЬ, ВСЬ-2, ВСЬ-те, ВЕЬ1, А1, МСЬ-1, В00, ВИАС-1, Ν0:-13, ϋϋΝ-1, СП^2, СП^З, ВНИЕ-1, ЬМ№5-НЬ или СЕП-9, предпочтительно ВсЬ-хЬ или ВСЬ-2, наиболее предпочтительно ВсЬ-хЬ.

Настоящее изобретение относится также к способу создания линии высокопродуктивных стабильно трансфектированных эукариотических клеток-хозяев, отличающемуся тем, что осуществляют стадии, на которых:

(а) интегрируют по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, или один ТЕ-элемент, предлагаемый в изобретении, в эукариотический экспрессионный вектор, который содержит представляющий интерес ген, (б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором, (в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина.

Настоящее изобретение относится также к способу создания линии высокопродуктивных стабильно трансфектированных эукариотических клеток-хозяев, отличающемуся тем, что осуществляют стадии, на которых:

(а) интегрируют представляющий(ие) интерес ген(гены) в эукариотический экспрессионный вектор, который содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, или один ТЕ-элемент, предлагаемый в изобретении, (б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором, (в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ отличается тем, что осуществляют по меньшей мере одну дополнительную стадию амплификации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу создания и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, который отличается тем, что осуществляют стадии, на которых:

(а) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют, по меньшей мере, представляющий интерес белок/продукт, неомицинтрансферазу, предпочтительно модифицированную, и амплифицируемый селектируемый маркер ЭНЕИ причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, ген (или гены), представляющий(ие) интерес, функционально связывают по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой по одному из пп.1-14 формулы изобретения, (б) культивируют клетки в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию различных генов, (в) отбирают такие коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как С418, в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, и (г) амплифицируют указанные коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, позволяющего осуществлять амплификацию, по меньшей мере, амплифицируемого селектируемого маркерного гена, такого, например, как метотрексат.

В конкретном варианте осуществления изобретения указанный способ отличается тем, что трансфектированные клетки культивируют в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, дополненной по меньшей мере 200 мкг/мл С418, предпочтительно 400 мкг/мл С418 или даже более, в отсутствие сыворотки и при добавлении МТХ в возрастающих концентрациях.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный способ отличается тем, что концентрация МТХ на первой стадии амплификации составляет по меньшей мере 100 нМ или по меньшей мере 250 нМ и ее ступенчато повышают до 1 мкМ или более. В отдельных случаях концентрация МТХ может составлять 2 мкМ.

Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения способ отличается тем, что осуществляют дополнительную стадию клонирования.

В другом варианте способа, предлагаемого в изобретении, клетка-хозяин представляет собой клетку грызуна/хомячка, такую, например, как СНО-, N80-, 8р2/0-Ад14-, ВНК21-, ВНК ТК^-, НаК^-, 2254-62.2

- 28 016880 (производное ВНК-21)-, СНО-К1-, СН0-ПЕКХ (т.е. СНО бик^-, СНО/бкГг^-), СН0-ПЕКХ В1-, 0Η0-Ό644-, СНО Рго-5-, У79-, В14АЕ28-63-, СНЬ-клетку, предпочтительно СНО-клетку и наиболее предпочтительно СН0-О644-клетку.

В предпочтительном способе, предлагаемом в изобретении, экспрессионный вектор содержит селектируемый маркер, такой как ЭНЕЕ или ИРТ, например ИРТ Ε240Ι или ИРТ Ό2276.

В наиболее предпочтительном варианте предлагаемого в изобретении способа долю высокопродуктивных клеток повышают вплоть до двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или десяти раз или повышают более чем в два, три, четыре, пять, шесть, семь или десять раз, предпочтительно повышают вплоть до пяти раз или более чем в три раза.

Настоящее изобретение относится также к способу получения биофармацевтического продукта, который отличается тем, что осуществляют стадии, на которых:

(а) интегрируют по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или один предлагаемый в изобретении ТЕ-элемент в эукариотический экспрессионный вектор, содержащий представляющий интерес ген, (б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором, (в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина и (г) культивируют полученную высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию гена (генов), представляющего(их) интерес.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу создания высокопродуктивной линии стабильно трансфектированных эукариотических клеток-хозяев, отличающемуся тем, что осуществляют стадии, на которых:

(а) интегрируют ген (гены), представляющий(ие) интерес, в эукариотический экспрессионный вектор, содержащий по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или один предлагаемый в изобретении ТЕ-элемент, (б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором, (в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина и (г) культивируют полученную высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию гена (генов), представляющего(их) интерес.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что осуществляют по меньшей мере одну дополнительную стадию амплификации.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, отличается тем, что осуществляют дополнительную стадию, на которой:

(г) собирают и очищают представляющий интерес белок.

Настоящее изобретение относится также к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕ-элемента) в эукариотическом экспрессионном векторе для усиления транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе в эукариотической клетке-хозяине или для получения биофармацевтического продукта.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕ-элемента) для создания трансгенных животных или растений.

Настоящее изобретение относится также к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕ-элемента) в генной терапии.

Настоящее изобретение относится, прежде всего, к применению предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоты или предлагаемого в изобретении усиливающего транскрипцию элемента (ТЕэлемента) в качестве лекарственного средства или в составе фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение относится также к набору, включающему предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту или предлагаемый(е) в изобретении ТЕ-элемент(ы), необязательно экспрессионный(е) вектор(ы), необязательно клетку-хозяина (клетки-хозяева) и необязательно реагент(ы) для осуществления трансфекции.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, прежде всего к выделенной нуклеиновой кислоте, более точно к усиливающему транскрипцию или усиливающему экспрессию элементу нуклеиновой кислоты (ТЕ-элементу), который имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, или его фрагменту или производному, который при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена, за исключением ТЕ-элемента ТЕ-00 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоте за исключением ТЕ-элементов ТЕ-00 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2), ТЕ-04 (8ЕЦ ΙΌ N0: 6) и ТЕ06 (8ЕС) ΙΌ N0: 8).

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоте за исключением ТЕ-элементов ТЕ-00 (8ЕЦ ΙΌ N0: 2), ТЕ-04 (8ЕЦ ΙΌ N0: 6), ТЕ-05

- 29 016880 (8ЕО ГО N0: 7) и ТЕ-06 (8ЕО ГО N0: 8).

Усиление экспрессии представляющего интерес гена можно оценивать путем измерения титра продукта с помощью ЕЫ8А.

Следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится к предлагаемому в изобретении ТЕ-элементу, фрагменту или производному, имеющему длину более 160 пар оснований, предпочтительно более 170 пар оснований. В конкретном варианте осуществления изобретения фрагмент ТЕэлемента имеет длину от 160 пар оснований до 1,2 т.п.н. или от 170 пар оснований до 1 т.п.н., предпочтительно более 200 пар оснований и от 200 пар оснований до 1 т.п.н.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фрагмент ТЕ-элемента расположен в области последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 1, между 1 и 1578 парой оснований (это соответствует 5'-концевому фрагменту элемента ТЕ-00 (8Е0 ГО N0: 2) и имеет длину более 113 пар оснований или более 132 пар оснований и предпочтительно более 160 пар оснований либо более 170 пар оснований. В конкретном варианте осуществления изобретения фрагмент ТЕ-элемента имеет длину от 113 пар оснований до 1,2 т.п.н. или от 132 пар оснований до 1,2 т.п.н. либо от 160 пар оснований до 1,2 т.п.н., предпочтительно более 200 пар оснований и от 200 пар оснований до 1 т. п. н.

В следующем варианте осуществления изобретения фрагмент ТЕ-элемента присутствует без смежных последовательностей. Это означает, что фрагмент не является составной частью более длинной последовательности или области последовательности, например не имеет других последовательностей, присоединенных к нему спереди (5') или сзади (3').

Еще один конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к предлагаемой в изобретении нуклеиновой кислоте, которая не содержит СрС-островков.

Результаты описанных ниже экспериментов свидетельствуют о том, что при сравнении эукариотических клеток-хозяев, содержащих ТЕ-элемент и не содержащих этот элемент, можно выявить относительное изменение удельной продуктивности представляющего интерес гена, заключающееся в ее увеличении вплоть до семи раз.

Обобщение данных о титрах продукта и удельной продуктивности позволило установить, что почти все пулы клеток, содержащие ТЕ-элементы, которые представляли собой фрагменты или производные 8Е0 ГО N0: 1, в среднем экспрессировали представляющий интерес ген в большем количестве копий, чем пулы клеток, не содержащие ТЕ-элемент. ТЕ-элементы 01 (8Е0 ГО N0: 3), 02 (8Е0 ГО N0: 4) и 08 (8Е0 ГО N0: 10) приводили к наиболее высокой продуктивности, что было установлено в двух независимых сериях опытов по трансфекции, в каждой из которых использовали свой селектируемый маркер ЩРТ или ЭНЕЕ). Применение этих элементов позволило увеличивать продуктивность в 4-7 раз. Однако ТЕ-элементы 01 (8Е0 ГО N0: 3) и 02 (8Е0 ГО N0: 4) длиной 3 т.п.н. и 2,5 т.п.н. соответственно являются слишком крупными для дополнительного встраивания в экспрессионный вектор. В отличие от них больший интерес представляет ТЕ-элемент 08 (8Е0 ГО N0: 10), имеющий длину лишь 1 т.п.н., который обладает способностью усиливать экспрессию в 5-6 раз. В двух сериях опытов по трансфекции было установлено также, что и ТЕ-элемент 06 (8Е0 ГО N0: 8), длина которого составляет только 381 пару оснований, приводил к трехкратному увеличению удельной продуктивности. Наиболее целесообразно, чтобы размер экспрессионных векторов оставался как можно меньшим, поскольку меньшие векторы, как правило, обладают большей стабильностью и ими проще манипулировать как при клонировании, так и при осуществлении трансфекции. Вследствие этого ТЕ-элементы 06 (8Е0 ГО N0: 8) и 08 (8Е0 ГО N0: 10), а также 13 (8Е0 ГО N0: 15), представляют наибольший интерес с точки зрения применения в качестве усиливающих транскрипцию элементов.

В приведенных ниже примерах продемонстрировано также, что пулы клеток, которые содержат ТЕэлементы 03 (8Е0 ГО N0: 5), 04 (8Е0 ГО N0: 6) или 07 (8Е0 ГО N0: 9), характеризуются примерно в 33,5 раза более высоким уровнем экспрессии представляющего интерес гена, а пулы клеток, которые содержат ТЕ-элементы 10 (8Е0 ГО N0: 12), 11 (8Е0 ГО N0: 13) или 12 (8Е0 ГО N0: 14), характеризуются примерно удвоенным уровнем экспрессии представляющего интерес гена.

ТЕ-элемент 08 (8Е0 ГО N0: 10) в сочетании с ИРТ Е240I в качестве селектируемого маркера приводил к повышению удельной продуктивности представляющего интерес гена в 5 раз по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элемент. ТЕ-элемент 08 (8Е0 ГО N0: 10) в сочетании с ЭНЕЕ в качестве селектируемого маркера приводил к наибольшему, а именно примерно в 6,0 раз, повышению продуктивности.

Кроме того, ТЕ-элемент 02 (8Е0 ГО N0: 4) в серии опытов с использованием ЭНЕЕ в качестве селектируемого маркера приводил к повышению примерно в 6,8 раз продуктивности представляющего интерес гена.

Наибольшее повышение (15-кратное) достигали при использовании элемента 13.

В представленных ниже примерах продемонстрировано также, что пулы, содержащие ТЕ-элементы 05 (8Е0 ГО N0: 7) и 09 (8Е0 ГО N0: 11) в одной серии опытов не приводили к усилению экспрессии представляющего интерес гена и в одной серии опытов приводили даже к более низкой экспрессии представляющего интерес гена по сравнению с контрольными пулами. Оба эти элемента, а возможно также и частичные фрагменты в этих областях последовательности в определенных обстоятельствах могут, хотя

- 30 016880 это не является обязательным, оказывать подавляющее воздействие.

Кроме того, в приведенных ниже примерах показано, что относительные изменения удельной продуктивности, обусловленные различными протестированными ТЕ-элементами, в основном достигаются независимо от векторной системы, т.е. независимо от применяемого селектируемого маркера или независимо от конкретного представляющего интерес гена.

В приведенных ниже примерах продемонстрировано также, что изменение экспрессии маркерного гена коррелирует с изменениями уровня экспрессии представляющего интерес гена.

Из приведенных ниже примеров следует также, что ни один из протестированных ТЕ-элементов не обладал энхансерным действием. Это свидетельствует о том, что ТЕ-элементы приводят только к усилению экспрессии представляющего интерес гена на уровне хромосомы.

В приведенных ниже примерах продемонстрировано также, что комбинация или сцепление друг с другом нескольких одинаковых или различных коротких ТЕ-элементов, таких, например, как ТЕэлементы 06 и 08 или 21, может приводить к дополнительному усиливающему экспрессию действию.

Примеры

Сокращения:

АР: щелочная фосфатаза

Азр (И): аспарагиновая кислота

Ьр: пара оснований

СНО: яичник китайского хомячка

ОНГК: дигидрофолатредуктаза

Е1Л8А: твердофазный иммуноферментный анализ

ЕАС8: клеточный сортер с возбуждением флуоресценции

ОРР: зеленый флуоресцентный белок

О1у (О): глицин

НТ: гипоксантин/тимидии

Ι^Ο: иммуноглобулин О

Не (I): изолейцин

ΙΚΕ8: внутренний рибосомальный сайт проникновения кЬ: тысяча пар оснований

МАт: моноклональное антитело

МСР-1: моноцитарный хемоаттрактантный белок-1

МТХ: метотрексат

ΝΡΤ: неомицинфосфотрансфераза

ПЦР: полимеразная цепная реакция

Рйе (Р): фенилаланин

8ЕАР: секретируемая щелочная фосфатаза иЪ: убикитин иТК: нетранслируемая область

Методы

Культура клеток и трансфекция.

Осуществляли непрерывное культивирование клеток линии СНО-ЭО44/бЫг7^- (Иг1аиЬ и др., 1983) в виде клеточной суспензии в бессывороточной среде СНО-8-8ЕМП, дополненной гипоксантином и тимидином (НТ) (фирма 1пуЦгодеп ОтЬН, Карлсруэ, Германия), в колбах для культур клеток при 37°С в увлажненной атмосфере при 5% СО₂. Подсчет клеток и оценку жизнеспособности осуществляли с помощью счетчика СоиНег Соипкег Ζ2 (фирма Весктапп Сои1кег) или Себех (фирма [ппоуаНк) и после этого клетки высевали в концентрации 1-3 х 10⁵/мл и пересевали через каждые 2-3 дня.

Для трансфекции клеток линии СНО-ОО44 применяли реагент липофектамин Плюс (Ыро£ес1ат1ие Р1ик) (фирма 1пуЦгодеп). Для получения каждой смеси для трансфекции смешивали в целом 1,0-1,3 мкг плазмидной ДНК, 4 мкл липофектамина и 6 мкл Плюс-реагента согласно инструкциям производителя и вносили из расчета 200 мкл на 6 х 10⁵ клеток в 0,8 мл среды СНО-8-8ЕМП, дополненной НТ. После инкубации в течение трех часов при 37°С в инкубаторе для клеток добавляли 2 мл среды СНО-8-8ЕМП, дополненной НТ. После культивирования в течение 48 ч полученные в результате трансфекции смеси либо собирали (кратковременная трансфекция), либо подвергали отбору. Для отбора с использованием ΝΡΤ клетки через 2 дня после осуществления трансфекции переносили в среду СНО-8-8ЕМП, дополненную НТ, которая содержала 400 мкг/мл О418 (фирма Тпуйгодеп). Для отбора с использованием БНЕК клетки через 2 дня после осуществления трансфекции переносили в среду СНО-8-8ЕМП, не содержащую НТ. При отборе с использованием БНЕК и ΝΡΤ в случае котрансфекции, когда один экспрессионный

- 31 016880 вектор содержал ЭНЕЕ-, а другой ИРТ-селектируемый маркер, клетки переносили через 2 дня после осуществления трансфекции в среду СН0-Б-БЕМ11, не содержащую гипоксантин и тимидин, и в среду добавляли 6418 (фирма 1пуйгодеп) в концентрации 400 мкг/мл.

Амплификацию интегрированных гетерологичных генов с использованием ΌΗΕΒ можно обеспечивать путем добавления селектирующего агента МТХ (фирма Б^та, Дейзенхофен, Германия) в концентрации 5-2000 нМ в среде СН0-Б-БЕМ11, не содержащей НТ.

Экспрессионные векторы.

Для анализа экспрессии применяли эукариотические экспрессионные векторы на основе вектора рАЭ-СМУ (ХУегпег и др., 1998), в которых экспрессия гетерологичного гена опосредовалась комбинацией энхансер СМУ/промотор убикитина/Б27а хомячка (\У0 97/15664) или энхансер СМУ/промотор СМУ. В то время как базовый вектор рВГО содержал бШг-миниген, который служил в качестве амплифицируемого селектируемого маркера (см, например, ЕР-0-393-438), в векторе рВШО бШг-миниген был заменен на модифицированный ген №Т. В данном случае он представлял собой вариант НРТ Ό2276 (А§р22761у). Клонирование рВГЫО, содержащей вариант КРТ Ό2276, а также 1ЕЕБ-область гена СЕР, осуществляли согласно описанному в \У0 2004/050884 методу. Базовая плазмида рТЕ4 содержала вариант МТ Е2401 (Р11е240Пе) в качестве селектируемого маркера и представляла собой производное плазмиды рВГЫО. Помимо замены варианта №Т Ό2276 на вариант КРТ Е2401 была осуществлена также замена СЕР на красный флуоресцентный белок Э5Еей2 из вектора рЭ5Еей2 (фирма ОоШеск Пало-Альто, шт. Калифорния, США). Базовая плазмида рТЕ5 содержала ΌΗΕΒ в качестве селектируемого маркера и представляла собой производное вектора рВГОС (\У0 2004/050884), в котором также 6ЕР был заменен на красный флуоресцентный белок ΌδΚ£ά2 из вектора рЭ5Ее<12 (фирма ОоШеск Пало-Альто, шт. Калифорния, США).

Для осуществления экспрессии моноклонального гуманизированного антитела 1д61-типа клонировали тяжелую цепь в виде Ба11/Бре1-фрагмента длиной 1,4 т.п.н. в расщепленной с помощью ХЬа1 и Ба11 плазмиде рВГО, в результате чего получали плазмиду рВГО-НС (фиг. 1А). В свою очередь, легкую цепь клонировали в виде ВатШ/НтбШ-фрагмента длиной 0,7 т.п.н. в сайтах рестрикции ВдШ/НшбШ плазмиды рВШО, получая плазмиду рВШС-ЬС (фиг. 1А).

кДНК человеческого МСР-1 (УокЫтига и др., 1989) клонировали в виде НтйШ/ЕсоВ1-фрагмента длиной 0,3 т.п.н. в соответствующих сайтах рестрикции вектора рТЕ4 или рТЕ5, в результате чего получали плазмиды рТЕ4/МСР-1 и рТЕ5/МСР-1 (фиг. 1Б и 2 соответственно).

ЕАСБ (анализ с использованием клеточного сортера с возбуждение флуоресценции).

Анализы методом проточной цитометрии проводили с помощью устройства ВО ЕАСБсакЬиг (фирма ВО Вюкаепсе). ЕАСБ снабжали гелий-аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 488 нм. Интенсивность флуоресценции регистрировали при длине волны поглощения, соответствующей конкретному флуоресцентному белку, и данные обрабатывали с использованием прилагаемого программного обеспечения Се11 ОнеШ Рго.

ЕЫБА (твердофазный иммуноферментный анализ).

Титр МСР-1 в супернатантах стабильно или кратковременно трансфектированных клеток линии СН0-Э644 количественно оценивали с помощью ЕЫБА с использованием набора 0р1Е1А Нитап МСР-1 Бе! согласно протоколу производителя (фирма ВО Вюкшепсек Рйагтшдеп, Гейдельберг, Германия).

Количественную оценку МАт 1д61-типа в супернатантах стабильно трансфектированных клеток линии СН0-Э644 осуществляли с помощью ЕЫБА согласно стандартному протоколу (Аи8иЬе1 и др., СиггеШ РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1994, пересмотренное и дополненное издание), используя, с одной стороны, Ес-фрагмент козьего античеловеческого 1д6 (фирма ^^аηоνа, Гамбург, Германия) и, с другой стороны, конъюгированное с АР козье антитело к человеческой легкой каппа-цепи (фирма Бщта). В качестве стандарта использовали очищенное антитело 1д61-типа.

Продуктивность (пг/клетку/день) рассчитывали согласно формуле пг/((О-Со)-1/1п(С1-Со)), где Со и С! обозначают количество клеток в момент посева и сбора соответственно и ΐ обозначает продолжительность культивирования.

БЕАР-анализ.

БЕАР-титр в супернатантах культур кратковременно трансфектированных клеток линии СН0Ό644 количественно оценивали с помощью анализа с использованием репортерного гена БЕАР согласно инструкциям производителя (фирма ЕосЕе О|ацпо511с5 СтЬН, Маннгейм, Германия).

Пример 1. Выделение и клонирование ТЕ-элемента ТЕ-А.

Из описанной в \У0 97/15664 последовательности из генома хомячка, которая наряду с кодирующей областью гена убикитина/Б27а содержит также смежные 5 'ИТЕ-области, включая промотор иЬ/Б27а, выделяли неизвестные до настоящего времени участки последовательности, расположенные против хода транскрипции. Для этого использовали связанную путем лигирования с адаптером геномную ДНК СН0-Э644 в качестве матрицы для осуществления гнездовых ПЦР. Первую ПЦР проводили с использованием комбинации праймеров, комплементарных адаптеру или последовательности хомячка в 5'-области последовательности, представленной в БЕЦ ГО N0: 5 XV0 97/15664 (праймер ИЬ20: 5'- 32 016880

СТССАСАСАТТТАСАСАТООАСАС-3' (8Е0 ΙΌ NО: 39); соответствует нуклеотидам с 62 по 85 (комплементарная последовательность) 8Е0 ΙΌ NО: 5, описанной в \УО 97/15664). Затем проводили вторую ПЦР с использованием второй комбинации праймеров, состоящей из внутреннего праймера-адаптора и внутреннего (гнездового) специфического для хомячка праймера (праймер ИЬ21: 5'666ТТТСТСТ6Т6ТААТА6ССАТ6-3' (ЗЕО ΙΌ NО: 40); соответствует нуклеотидам с 16 по 39 (комплементарная последовательность) ЗЕО ΙΌ NО: 5, описанной в XVО 97/15664). Полученные перекрывающиеся ДНК-фрагменты, которые начинались на специфическом для хомячка конце праймера в виде известной последовательности и затем переходили в новую неизвестную локализованную против хода транскрипции область последовательности, субклонировали в векторах рСК.2.1 ТОРО (фирма [пуЦгодеп) и анализировали путем секвенирования последовательности. В целом получали 348 пар новой до настоящего времени неизвестной последовательности, локализованной против хода транскрипции относительно гена ИЬ/827а хомячка.

На основе этой новой информации о последовательности была выделена с помощью описанной выше гнездовой ПЦР другая локализованная еще дальше против хода транскрипции область ДНК. Для этого первую ПЦР проводили с использованием праймера-адаптора и праймера ИЬ33 (5'АТСТСАСТ6Т6ТСТАССААСТТА6-3' (8ЕО ΙΌ NО: 41); расположен в 5'-области новой выделенной последовательности длиной 384 пары оснований; соответствует нуклеотидам 1268-1291 (комплементарная последовательность) 8ЕО ΙΌ NО: 1), а вторую ПЦР проводили с использованием внутреннего праймера-адаптора и расположенного еще дальше внутреннего специфического для хомячка праймера ИЬ32а (5'-ТСТОСАССАССАСТАССТОАСТ-3' (8ЕО ΙΌ NО: 42); расположен против хода транскрипции относительно праймера иЬ33 в новой выделенной последовательности длиной 394 пары оснований; соответствует нуклеотидам 1243-1264 (комплементарная последовательность) 8ЕО ΙΌ NО: 1). Полученный в результате амплификации продукт субклонировали в векторе рСК2.1 ТОРО (фирма Iην^ί^одеη) и секвенировали. Он содержал другой участок длиной 1239 пар оснований новой, до настоящего времени неизвестной последовательности, расположенной против хода транскрипции относительно гена ИЬ/827а хомячка.

Полученную из перекрывающихся ПЦР-фрагментов информацию о последовательности использовали для того, чтобы с помощью праймеров:

а) ИЬ34 (5'-СТАА6А6ТАСТТ6ССАТ6А6А6ССТ6АА-3' (%ЕО ΙΌ ^: 43); локализован на внешнем 5'-конце новой выделенной последовательности длиной 1239 пар оснований; в 8ЕО Ш NО: 1 содержится лишь частично (нуклеотиды с 1 по 14)) и

б) ИЬ35 (5'-САТТ6АТАСАССАССААА6ААСТТ6-3' (%ЕО ΙΌ 44); соответствует нуклеотидам с 1941 по 1965 (комплементарная последовательность) 8ЕО ΙΌ NО: 1) амплифицировать с помощью ПЦР связанную с ними область последовательности из геномной ДНК СНО-ОС44, которая охватывает все выделенные до сих пор частичные фрагменты и простирается на 383 пары оснований в 5'-область последовательности 8ЕО ΙΌ NО: 5, описанной в VО 97/15664. Полученный таким путем ДНК-фрагмент длиной 2 т.п.н. связывали путем лигирования с 5'-ИТК-областью 8ЕО ΙΌ NО: 5, описанной в VО 97/15664, в эндогенном сайте рестрикции ЕсоК! (положения 353-358), при этом указанный сайт рестрикции был элиминирован с помощью реакции заполнения с использованием ДНК-полимеразы Кленова. Второй эндогенный сайт рестрикции ЕсоШ в новой выделенной области генома элиминировали таким же образом, в результате в 8ЕО ΙΌ NО: 1 были встроены дополнительные по сравнению с исходной геномной последовательностью нуклеотиды с 326 по 329. В целом таким путем в 8ЕО ΙΌ NО: 1 было встроено 8 дополнительных нуклеотидов по сравнению с эндогенной последовательностью хомячка. Полученный таким путем ДНК-фрагмент длиной 3788 пар оснований из области последовательности, расположенной против хода транскрипции относительно гена ИЬ/827а хомячка обозначили как ТЕ-элемент А, имеющий 8ЕО ΙΌ NО: 1, и его субклонировали в векторе рВ1иексг1р( 8КМ (фирма 81га1а_ёепе. Ла-Джолла, шт. Калифорния).

Пример 2. Создание экспрессионных векторов, содержащих различные ТЕ-элементы.

На основе ТЕ-элемента ТЕ-А (фиг. 3, 8ЕО ΙΌ NО: 1) длиной 3,8 т.п.н., полученного из генома СНО, создавали с помощью ПЦР различные фрагменты, которые по сравнению с ТЕ-элементом ТЕ-А имели делеции либо на 5'-, либо на 3'-конце (фиг. 4 и 5). Для синтеза этих фрагментов применяли комбинации, включающие каждый раз прямой и один из обратных праймеров (фиг. 5 и 6). Для клонирования с помощью праймеров присоединяли на 5'-конец сайт рестрикции ВатШ, а на 3'-конец - сайт рестрикции ВкгСЕ Таким путем создавали 12 ТЕ-элементов различной длины, обозначенных как ТЕ-01-ТЕ-12 (фиг. 4 и 5). После расщепления с помощью ΒκγΘΙ и ВатШ эти элементы клонировали в прямой ориентации в адапторной области базовых плазмид рТЕ4/МСР-1 (фиг. 1Б) или рТЕ5/МСР-1 (фиг. 2).

Фрагмент ТЕ-00 (8ЕО ΙΌ NО: 2) выделяли с помощью расщепления рестриктазой 8асП из субклона ТЕ-А и клонировали в базовых векторах рВШС-БС (фиг. 1А) или рВШ-НС (фиг. 1А) как в прямой, так и в обратной ориентации в сайте рестрикции 8реЕ расположенном в 5'-направлении относительно промо торного/энхансерного элемента.

- 33 016880

Последовательности ТЕ-элементов.

ТЕ-А (δΕΟ ГО N0: 1) сса1ёа§а§сс1§аа§асс1§а8й§а1ассса8аасссаёа1сааёа1§§а@@а8а8аасса8ссссас1аа8с1рс ссс1£асс<:сса1ааа18сс1ссс1£1сса811аЦгссасасаа18а1১18аа1аса£ааааасассс11ссШаёасас 1аа8с§@а11сс1с11ас8са1ассаЁ11аа81Ёа1ав11сКа8ёсиеаас1са8сасШаааааеТПа1аП11§саа18с1 888ёас1ааа11а888118г8саса18с1аа§1аа®сас1с1асиП81а1сасайН:аа1аай81аа8аа11аайс818аа а1а§1а§с1§а(>асаа1а8аШ8Н1стса181§£(’аасЦ>с1{;((’1818с11сЩ’с18а1;’сааасаа881сааа1асШ аиссссав181с1§сс1а8ссс1§1аасас11с1с1а11а1асаа1£ассасааа1аа11а881ва§18ё8^¹ё*«^са®^1а ааН8И8сШЙ1а8а8аса88а1йси8сааасс188И£81с11ааае(се§4а1[Да8^с1ё^а8^аа18^асс1¹8^{аааасс1} 1сс1§1сссасссс1:саааПсса§аайа1а8асасссассаса18§с11аа1аа81ааасаасаасаа1аааа8са18ас1 1с188ё1‘^;18ё^а88ё^аёё8^сМ8^еса811^аа8^а8^саа1ёё^а1^асй^1ссса1^а8^аасс188ВК¹8^ас1^:ссса8^сас1^аасс1 аса18818а1а8г8а18са8са8асагасаг8а8вёсаасасасаса1£88^саса1^ас^ас^ас8^сассс8^{сссассаг}ё8 с1Шссссса1сас11а8аса8сса1ай1^ааас81^а81ё8^а8с^ааёё^с18ёё818ё¹8ё^{сссасасс}1Ч^аа*^ссса8^сас 1сса|>аа88са8а8ё1а88С88а1с1с1818§§Ш8а8асса8сс1£81с1асаа§авс1а£Нсса88аса8СС1сеаа а8сса1а§а8ааассс1агс1саааааас1ёааасаасаасааеаасаааасаааа1ааааааасаасааа^а8^аа1саа 8188Нса8188Иссасасаса88ааав1а8ааа88ёсси8а1§88^аа88^И11са8^аё88^а88^а8^1а188^а18^а8^ас а88а18а1а818ааааёаас1сааа11аа11ааа1аШ8ааас1а1с1аа8аа1ааааёс1аааа1аШаааа(1аса81са8 цГа^цзгееТйса^абцесиадиезийасасасТдадайсаедссадссададаассга^дадассибПсаа а1аас(аа1аааа(а1асаааа1ааа88а8асассасаагаа1Ш8^ааа181^ааааё^{ас1аааШасс}1^111а1а118^а18^а81 188а1^аааааа^а1сааШасс^а8^а8а^аса1ааа81а£1ссса1сааа8асаааа8с^аа1а1а18а11ааас1с1ааШаааа §Ш811а§а§сс188саас8г§8саса1асс1ггаа1ссса8сасса88ё^а8^ас^а8^а88^сса1е(4ё81^{с1ааааа}8^,;8^а· с1сса88аса8сса1@8с1айасаса8^а8^ааассс181с188ааааасаааааа(1а8(@1сса18181^ааа181818ё^а8 1а18си8Гса1ёсеаса1аса8^а881а8^а88ёса§1На(8§8^аё^1са8^{<:1сс1а11с}И^сс1И^а188888^асс1ёё8ё^ас1 8аас1са881са1са88Сй88^са8^ааа8¹ё^саЯа8^а1сасё8^аё^ссй^а1^са1¹8ё^аё^ааа8^с,с1с1^саа8^1а8^аааа1 с^аа18181Ив^с1са,:а818^саа1саЧ^а1ёЧ^1сё^а8^а88ёё^аа8ё81^асаа1сё1¹8В88^са1ё181884^саса1с(8^аа1а 8са81а£с1ссс1а88^а£ааи^аа11ссаа£11си18в1в8(8Шсаа18ссс11ааа888£1^саас^аасШШ1ссс1с18 асаааасВДсиспа^ссйвйссйаМйгвааЕПаийайшпвсарвйааагай.аайсивсассгсадаса! 8йа§81аа81ассс1асаас1са88йаас1аай1аай1аас1аай1а^ассссаасасйй1сй18й1а1ссасаШ§1в8 а§1в1818*8181ё18<:8181ё>818*ё181818<81ё18181ёи*ё<8181ё18181818<8С§^а8^а8^а8С8С8Сё^аМ8^а< саис1ассШ18Шаааааа18Н^а81сса888ё^,888ё^,ё^сас18¹8^аааё^,с*8^аё881^аас<¹8^с188ёё^(саё^11с·· 1ссас1а1а88аса8аас1сса88181еаас1с1йас18аса8аасса1ссааа1а8ссс1а1с1аа1й1а81йй1а1йа1й а1йШ8й(11с§а£аса£88Шс1е1§188сШ88аё8с181сс1£ваас1аёс1с1181а8асса££с1вв1с1с2аас1 са8а8а1ссасс18сс(с18сс1сс18^а81ё^с1ёёё^аЧ^аааёё^са18^сё^{ссассаа1:}ё^<:Чё8^с'^;с1^асс*^аа1*Ч^ааааё ^а8а11818181сасаа8ёё1Е1^са181^с8^ссс*^:8^{саассасссссс1;сссааааааааааааааааааас}Н^сас1ё^ааё^с 18аа8сас8агдагпе8пас1сх88с1ввссаа18а2;стс1ас;<’£;а21сгсс(81саааса8аа1с1саасао<>с(>са£>с ацйНЩиаа^ТйёёйПасаасаса^вйШрс.Иайа^рсаииагсааацсиЩессаассааааа^а.ТаШи’, аа88са8сааа£с1аа1а£а((аааа18ао££аава8сссасаса8о1(апа£2аапа1аайсаиисша1а1аааас аааассааассааас188^аё8^аё8‘^с1^асс1^,1аё68^а*ёё^аа8^ааааё^асатаё^аёёё¹8^саа1а8^ааа888^сас*8 а8т8(8^а8ё1§ё^а8ё^ас(888^а8^аё88С8^саасс8^1:11*^аас18^(;сс1ё^пИ8^сс(:аИ1^:Ч^1;8888^асаё^саса1ё^11сс 1а«(:(1ссса88^а1888^ааа«^:1сс^ас§1ссааа<;(18С881с8а88ас1аса81саи11£са88Шсс11ас181^а1§8е11 (1аааас818сааа£§18ассаНаасс8Шсас8с(888а§в8сас81£св(5с1са8а1£сисс(с18ас(8а888сс ^а8ё^а88888^с1^асас88^аа8^а88с^аас^ас^асё^саси888^аа8^ас1^сё^а1и888^с11^са8^с1ё8^с18^а8^ас8^сссса8 са88с1сс1с88с1асасс11са8ссссваа(8сс11ссввссса1аассс11ссс11с1а8§саШсс8вс£^а8вассса ссс1свс§ссаааса1(с8£сссса1ссссс881сс1сасс18аа1с1с1аас1с18ас1ссав^ав1йававас£а1аасса 8а1а§ссс88^а1818188^аас18^са1^с11888^ас8^а81^аёЧй^аё^саааааё^ааа8^сё^ас8^ааааас1^асаа14^ссса8^а са8асй818^Пасс*^с1с*1^с*^са1Е^{с<;ааасаа}8^сссссй1^ааа8ё^ааа8^сссс(^сЧ^а8*^с8^са*^сё^ас1Е1ё*^аа8^ааа §8с81й§ааасайпаа18й88цсасасс81йс8а§8асс8аа^а1£^а§ааа8а8са1а§88ааас8ва§с8ссс8а 8с1а8(с(88сас18С8П^аеаса§ссвс8ё

- 34 016880

ТЕ-элемент 00 (8ЕО ГО N0: 2)

8а1с1сса£8аса8сса18вс1аиасасава£ааассс1£1с1в8ааааасаааааа11аё181сса{£1ё1ааа18{д(8

8а|>1а18с1181са18Ссаса1аса£а£81а£а888са£1:На(8££а8(:са|>Ксс1аНсйссШа1§(’£8;>асс1£88

8ас18аас1са881са1са88сн88саёааа£18са11а8с1сас88а8сс11а1са觧с§ааа§с(сгс1саа§1а8а ааа1саа1ё1£Ш8с1са(а8:8саа1са1Ш8тс8а8а88@8аа8£81асаа1с£;1(88££саЦ’1£1:;’!’1саса1сЦ;

аа(а§са§1а§с1ссс1а@§а8аайаапссаа@йсш881§8181а1саа18сссйааа@§881саасаас111ййссс

1М8асаааас<а1с11сПа181сси81ссс1саТа(П§аа81а«Ка11ст£са81§и8аа1а1сааЙс1а§сасс1еа§а са1811а881аа£1ассс1асаас1са8811аас1аай1ааШаас1аа111аассссаасас1Ш(с111§Ша4ссаса1и:£(

88а818(е(818181е18(818181818181818184818181818181Е181818181ё181ё18С8С8С8С8С8С8С8с1с8

8а1сайс1асс1(й8Шаааааа18йа81сса88281§88@18сас1818ааа81с1§а8§84аас118^с1888?!^;саё^ с1иссас1а1а8§аса8аас1сса88181саас1сй1ас18аса§аасса1ссааа1а8ссс:а1с1аапйа8(йй1аша й1а1111йцШ11с8ацаса8Ц81ис1с181в8С111и8а88С181сс(88аас1а8е1с1181аасса88с12Е1с1С8аа с1са8а8а1ссасс1:£сс(с18сс1сс18а818с18§8айааа88са18с8ссассаас8с1<88с1с1асщааш1ааа а8а8а1(818г81сасаа8ё8181са181с8^ссс18^{еаассасссссссссеааааааааааааааааааасПсас,}8^аа

8с(8аа8сас8а18а1й8811ас(с188с188ссаа18а8с1с1а888а81с1сс181саааса8аа1с1сааса88С8^са

8са81сиииааа81888£иасаасаса8Щ1Ш8са1агсаа8сайиа1с1аа8с1аШссса8^ееааааа1£|.8^1аШ

18§а88са8^са8^а8^с1аа1а8^а11аааа18а888^ааё^а8^{сссасаса}ё8й^аИ^а88^аа8^а1ааё^{са1сйсМ1а,;а1ааа} асаааассааассааас1£>8аеоаао(с(ассШаа88аХ88аапаааа8асаП1а§а£81гГ8сааха§ааа888сас

18а8т818^а88¹88^а88^ас1888^а8^а888^с8^саасс8^сШаас18<^сс18НМ8^сс1а«М^(:18888^аса8'^:аса^8Ч сс1аПЙ1ссса88^а4888^саа1^с1^ссас81^ссааас118^с88!^с8^а88^ас1^аса8^1саЙЧ8^са88^111ссЧ^ас18^1а188 сййаааас81:8сааа§21§ассайаасс§:йсас§с1§@§а@@§сас§1дс§§с1са8^а{8сй:сс1с18ай§а§88 сса88^а88888^с1асас88^аа8^а88^{ссаеассс}8^са,::И8ё8^аа8^ас1с8^а(п88ё^сМса8^с*8ё^с18^а8^асё^ссс<: а8са8§с1сс1с88с1асасс11са§сссс8аа4§сс11сс88ссса1аасссйссс11с1а88^са41^сс88^с8^а88^асс сассс1с8с8ссааасаис8§сссса1ссссс8ё1:сс1с^асс18^аа1с1с(аас1с1£ас1сса8а8й1а(>а8ас1а1аас са(’а1а£ссс2§а1§1|11£8аас18са1с11(’|Л’ас8а8(а|’11На8сааааа8ааа§с§ас§ааааас1асаа11ссса

8аса8асП818йасс1с1сйс1са18с1ааасаа8Ссссс1йааа8ёаааЁСссс1сйа81С8са1с8ас1§1£1аа@а аа88^сё1Ч8^ааас^а11Паа18йё88^сасасс8¹1^1с8^а8ё^асс8^ааа18^а8^аааё^аё^са1^а8ёё^ааас8ё^аё^сё^ссс

8^а8с<^:а8^,:с*§8^сас1^;8^с8^,:1а8^аса8^сс8^с8§

- 35 016880

ТЕ-элемент 01 (8ЕО ΙΌ N0: 3) ё11дс1аШ1а§аваса£§аШс11§сааасс1|₂§Н§§1си:ааас1сс(’1а1£1а§с1§а(гаа1§асс11ёаааассНсс1

Е1сссасссс1сааа11ссаёаа11а1азасасссассаса(§@с11аа(аа§1ааасаасаасаа1аааа8са(§аснс1£

В81с1§8а§8§а8в8си8сса§11аа§а§саа1§8а1аси(ссса1а8аасс1§88ш§ас1ссса8сас1аасс1аса

1ё818а1а81§а1всавса8аса1аса1ва88ё^сазс^ас4^саса1В88^саса1асасасвсасссЕсссасса1евсШ1 ссссса1саснаёаса8сеа1аи1ааас£1а8188а|'ссаё8с1£ё!’8ц>£18£сссасассш^аа1сссаёсас1сса

8аа§8са8а881а8ёс8ёа1с1сх81ё88¹«8^а8^ассаёсс1®81с1асаа§а8с1аё11сса88аса8сс1ссааа8с са1а8а§ааассс1а1с1саа^аааас1£ааасаасаасаасаасаааасаааа1ааа^аааасаасаааа£аа1сйа£(8§

Псаё1§ё11ссасасаса88ааае1а8ааа888ссйё^а1ё88аа88ийсаеаёёёаё8а81а1ё8а18а8аса88^а (8а1а£1§аааа§аас1сааа1(аайааа1а1118ааас1а1с7аа£аа1аааа8с1аааа1аШаааа(1асаё1с^а5ё1а81

8В1В818^са8^аВВес1аавивё1^а8^асасаВ¹В^а§^а1ссаё8Ссаёсса8В8^с1асс1а818^а8^ассйё11сааа1аа с1аа1аааа1а1асаааа1ааавв^а8^{асассасаа}1^аа111¹8^ааа181^аааа8^ае1^{ааа1ПассШ}4^а1^аЧ8^а18^а81¹88^а

1ааааааа1сааШасса§авааса1ааа81а84ссса1саааёасаааа§саа1а1а1§а11ааас1с1аа111аааа8111в

11а8а8сс188саас81в8саса1ассй1аа1сссавсасса888^а8^аса8^а8ВСса1сс1881с1ааааа818а1с1сс а§£аса£ссаг88с1а11асасада!’аа^ассс1ц1с188ааааасаааааапац1в1сса181;’1а^аа1й1818ца81111й си8гса18Ссаса1аса8^аё81^аВ^аВ88^са8^п1^а1ё8ё^аё^,;са8М^сс,:а11с11^|гс1И^а188888^асс18888^ас:,:8^аа с1са821са1са28^сЧ8ё5аёааа8185а11аас1сас88^а8^есй^а1-5^а1188О8ааа85К1с1саа81а8аааа1саа1

В18Й18с1са1аё1ёсаа(:са1Шё1ЙСёа8а888еаа8ё81асаа1с8(18888са1818188(с^аса1с18аа1а8са

8<:а8с1ссс1а88а8аа11ааиссаа81(с1:118818818Шсаа18^сссйааа888(>1сааса^аст1й1ссс(с1васа ааас1а1с11с1Ш81ссНв1ссс1:са{аН1ваа81^аШ1а11сИ:18са818Ч8^аа1а1сааНс1а8сасс1са8аса18иа

В81^аа81ассс1асаас1сав811аас1ааШааШаас1аа1ИаассссаасасШ11сШ8Н1^{а1ссаса}И1В¹88^а818 с1ассШ18111аааааа1811а84сса8В8818888¹8^сас1В1В^ааа81^с1В^а888^1аасН8^с^8888^1са8¹1^с1Нсса с1ага88^ас^а8^аас1с«^а88¹8^1саас^1с111ас18аса8аассагссааа1а8сес1а1с1ааПНа8Ши1аШа1КаХ1и

118й1ис8а8^аса888й1с1с18188^сй188^а88^с181^сс188^аас3^а8^с1^с481^а8^асса88^с188*^с1^с8^аас4са8^а

8а(ссасстёсс1с(2сс(сс<8^а8<есш88^а11ааа8йтй8сёссассаас<;спсес1с1асс1аа(шааааца2аи

8181в1сасаа88е-1а1с^а181с8ссс18са^ас^сассссессс^сса^аа^ааааааааа^ааааааа^сп^сасааааа,^сгцаад сас8а18ай18811ас1с18в^с1вв^ссаа48^а8^с1^с1а888^а8^1с1сс1ё1^саааса8^{аа1с1сааса}88^сВ^са8^са8^1сИ йНаааёГ§в8в11асаасасаёёК1П:8са(а1са8ВС^а1И1а1с1аа8с1а11(ссса8Ссааааа1ё1раН1188а8ёс а§са£а8С1аа1аё^{аиаааа<}8^а88ё^аа8^а8^{сссасаса}8ё^11ай^аёё^ааё^а1ааё^са1с11с1И^{а1а<;аааасаааас}

Сааассааас188^а88^а881^с1ассй1а888а1ё8^аа8^аааа8^аса41^а8^а88818^саа1а8^ааа888^сас18^а8й18

18а88188^а88^ас(888^аВ^а888^сВ^саасс8^сЧ1аас181сс18Ш18СС1аШШ8888^аса8^саса18«^сс1^айи1 ссса88а(888саа1с1ссас81ссааас11ёс881с8аё8ас1асав1:са11118саёё111сс1(ас184а1ё8^с1шааа ас§18сааа8818ассайаассё1«сас8С18§8^а8ё8^сасб1^;ё^сё8^с1саё^а1:ё^с11сс1с1ё^ас18^а5Вё^сса8ё^а

88888^с1^асасё8^ааё^а88^{ссасассс}8^сасй888^аа8^ас1^с8^ай1888^с1^1са8^с188^с18^а8^ас8^сссса8^сав8 с1сс1с88с1^ас^ассиса8сссс8^аа18^ссйсс88ссс^а1^аасссйсссис1а88са1нсс88с8^а88^{ассса1;сс}1с

8с8ссаааса11сёёсссса1сссссёё1сс1сасс1ё^аа1с1с1аас1с1ёас1сса§а81:йа8а8асшаасса§а1ав

- 36 016880

ТЕ-элемент 02 (8ЕО ΙΌ NО: 4) сааа£сса1а8а8ааассс1а1с(саааааас18ааасаасаасаасаасаааасаааа1ааааааасаасаааа§аа1с 11ав18811сав18£11ссасасасав8ааа81а8ааав£8ссНва1ёЕ8аа8Е1й1са8а£8ёа£8а81а1£8а18а§ аса8§а18а1а84£аааа§аас1сааа11аа11ааа1а1118ааас1а1с1аа8ааХаааа8с1аааа1атаааа11аса81с ^а881а£188¹88¹8^са8^а888^с1ааёй881^а8^аса(;а8¹В^а8^а1сса88^ссаё^сса8ё8^с1асс1а8¹8^аё^ассИ8й сааа1аас1аа1аааа1а1асаааа1ааа88а§асассасаа(ааии§ааа181аааа8ас1аааи1асс1П1а1а118аг8 а8й88^а1^{ааааааа}1сааШасса8а8ааса1ааа81а8(ссса1сааа8асаааа8саа1а1а1ёа11ааас1с1ааШа ааа81118К^а8^а8^сс188^саас8188^саса1^асс1Чаа1ссса8сасса888а8аса8а88сса1сс1881с1^ааааа81 §а1с1ссаз§аса§сса188^{с1аПасаса}8^а8^{ааассс1}ё^88^{ааааасааааааМа}8¹8^1сса18^,8<^ааа{8¹ё^1;8 8а81а18си81са1£Ссаса1аса8а881^а8^а888^са81На1888а81са811сс1а1{с11сс(йа18888Ё^а<:с1£8£ 8ас18аас1саё81са(са§ёси8ёса§ааа818са11аёс1сас88а§сс11а1сай88с8ааа8с1с*с1саа£(а8а ааа1саа1Щ8^гй8^с1^еа^^а8^,8^саа1^сай^аЩй^с8^а8^а8888^аа8881^асаа(^с8Ц888£^с;й818¹88^,'^саса1'^с1-Ё аа1а8са81а8с1ссс(а££аёаайааиссаа81(сШ88(е§1£Шсаа1§ссс11^ааа£8881саасаасШ1Шссс 1с18асаааас1а1сис11а18гссНё1ссс1са1аи18аа81аШ1а11сШ8са§18118^{аа1а1сааИс1а}В^{сасс1са}8^а са18йа§£1аа£1ассс1асаас1са88йаас1аагааа(иаас1ааШаассссаасасХййс111§Ша1ссаса1Н£1 88Β8ΐ8ί8ί8ΐ8ί818ί8ί8ϊ8ΐ8<8ί8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8<8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8ί8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8ΐ8ε8ε8ε8ε8ε8ε8ε8<:Ιθ8 8а1са11с1ассй1181йаааааа1811а81сс১881888§(8сас(818ааа81с18а88ё^^аасй8^с*ё888*^;са8Ч сй1ссас1а1ав£аса8аас1сса££1£1саас1сй1ас1еаса£аасса1ссааа1а£ссс1а1с1ааш1а£111ша111а й1а11Ий81Ш1с£а8аса§8£Шс1с18188сШ88а£8с18Гсс188аас1а8с1с(1£1а§асса88с18£Хс1С£аа с1са8а8а1ссасс18сс1с18сс1сс18а81£с1888айааа£§са18с£ссассаас8сй88с1с1асс1аай11ааа а£а8а11£181:81са<:^аа888181са1£1с8ссс1£саассассссссссссааааааааааааааааааасйсас18аа 8с18аа8сас8а18ай188йас1с18§с188ссаа18а8с1с1а888а81с(сс1£1саааса§аа(с1сааса88с8са 8са81сШШааа818В88йасаасаса881йй8са1а1са88са1Ша1с1аа8с1аШссса§ссааааа1£181аШ 188^а88^са8^са8^а8а1^аа1^а8^айаааа1в^а£88аа8а8сссасаса£8йа11а88аа8а1аа8са1сйсй1а1а1ааа асаааассааассааас18£а£8^а881<й^ассй1^а888^а(88^аа8^аааа8^асай1а§а£8£1£саа1а£ааа888^сас 18ацш8(ца£г(8£аа£ас1§£8а§а888с8саассдстаасг81сс(8((пдссгатт0е£аасагсаса1£и сс1айШссса88аг8££саа1с1ссас£ХссааасП§е££!С8а8вас1аса81саП1<£сав£ШссПас181а18£ с1111аааас818сааа££1£ассаиаасс8111сас£с1£§8а888^са1;8¹8^с88^с1сава18сйес1с48ас1£а£88 сса88а88888с1асас8ваа8а88ссасассс8сасй888^аа8^ас'^;с8^а1и888^сй^са8^с1ё8^с18^а8^ас8с^ссс а8са88с1сс1с88с1асассйса8сссс8аа(8сснсс8§ссса1аасссйссс11с1а8£сашсс88^с8^а88^асс сассс£с8сцссааасаис88сссса(ссссс£8(сс1сасс18аагссс1аасгсг8ас!ссад^авй1а£агасга1аас садатав

- 37 016880

ТЕ-элемент 03 (8ЕЦ ΙΌ N0: 5) ассШаа1ссса8сасса§8§а8аса8а88сса1сс1§ё1сиаааа818а1с1сса£§асайсса188с1аиасаса8 аёааассс1ё1с1ё§ааааасаааааа11а§1§1сса1§1§1ааа1§1§1§§а§1а1§с1121са1§ссаса1аса§а§§и§ а888^са8И1^а1888^а8£^са8йес1аисйсс1йа188888^асс18888^ас£В^аас1са881^са,са88^сН88^са8а^аа В1§са11а8с1сас£8^а8сс41^а1с^аЙ8В^с8^аааё^с1с1с1саа§4а8аааа1саа1§18Н:18с1са1а818саа1саНа18 й1с£а8а8888^аа888^^асаа4с8Н8888^саЧб8188й^;ас^а1<й8^аа1^а8^са8£а8с1ссс1а88а8аай:аайсса а8Нс1й88188181^а1^саа1В^сссй^ааа8В88(^саасаас1йййссс1с18асаааас1а1сНсйа181сс1181ссс1с а(аШ8аа(5(аНиайсй1§са81гй8аа(а1саайс1а8сасс£са§асаГ8Па82£аае1ассс1асаас1сад21Га ас1ааШааШаас1ааШаассссаасас1ййс11(§й1а1ссасаШ8188аё181ё181ё£8181в1818^1;8¹8¹8¹8¹8 18(81§181818(р§£8£8(8£§£818£8£8£ё^с8^с8^сВ^сВ^с8С8С8с1с82а£сапс1ассШ18ГйааааааГ8йа8£с са8888⁴888В1ё^сас^ё¹8^аааВ^1с18^аёё8^1аас118^с18888^1са8И^с1И^{ссас1а1а}8ё^аса8^{аас1сса}8ё181^с аас1сшас£еаса§аассагссааа1а§ссс1а1с1ааййа81йй1а1йа111ай1й18йшс8аёаса888^111с1с18¹ 88с1118ва88с1ё1сс1в8аас1а8с1си81аёасса8£с18в4с1с8аас1са8а8а(ссасс1§сс1с18сс1сс18а8 (8с1888а11ааа8§са18сёссассаасёсн8§с1с1ассхаа11иаааа§а8аи8г8181сасаа§881§1са1@1с8 ссс18саассассссссссссааааааааааааааааааасНсас18аа8с18аа£сас8а1£аШ88иас1с1£8с1 8ёссааг8а8с1с1а8§§а81с1сс181саааса8аа1с1сааса§8с§са§са81сйй11ааа81§§§@насаасаса £8й1Й8с^а1а1са88саййа1с(аа8С1ай1ссса8ссааааа£8181^айН88^аё8^са8^саВ^аВ^с1аа4а8^айаааа1 8а88§аа8а8сссасаса8§НаИа88аа8а1аа§са1с11сй1а1а1аааасаааассааассааас1§8а88а884с 1ассШа888^а188^аа8^аааа8асаШа8а8В81Всаа1а8ааа888сас18айШ818^а88<^;88^а88^ас1888^аВ^а 888^с8^саасс8стаас181сс18Чи8Сс1аШШ8888^аса8^саса18¹*сс1а11Шссса8§а1888саа1с1ссас 81ссааасй8С881с8а88ас4аса81саШ18са881(1ссиас181а188^сПИ^аааас818^сааа88<8^ассаНаас с81Исас8с1888^а8В8сас818С88с1са8а18сПсс1с18ас18а888^сса8ё^а88ВВВ^с1асасВВ^аа8^а88^сс асассс8сас11§88аа8ас1с8ат888с11^са8с1ё§с18а8ас§сссса8са88с1сс1с88с1асасспса§ссс с8аа1§ссйссв8ссса(аассснссс1(с1а88са1:йсс88с8а88асссассс1с8сёссаааса11:с8§сссса1:с сссс881сс(сасс18аа1с1с1аас1с18^ас1сса8а8Ша8а8ас(а1аасса§а1а8

ТЕ-элемент 04 (8ЕЦ ΙΌ N0: 6) с1а1с11с11а181сси81ссс1са1аШ8аа81а11На11сШ8^1;а818Ч8^{аа1а1саа11с1а}В^саос4^са8^аса1ВКа881 аа81ассс1асаас(са§8йаас(аа1йаа111аас1аай1аассссаасасйШсй18Ша1ссаса1й8¹8В^а8¹В181 2181В'8'е1й1ё1&Ш*8к1ё<81ё(8Й<В181ё^В1В1е*818^18¹818⁽8^сВ^с8С8С8С2С8С8с(С88аТсаПс(а ссйН81йаааааа18йа81сса§8ВВ¹ВЕВВ¹В^сас1В¹8^аааВ^1сШ^а8881^аасН8^с188881^са8«^с1И^сса^^а 1а£8аса8аас1ссад£181саас1сГПас(:8а^са8^{аасса1с}сааа:а8с^ссга1с(ааййа£(йШаШа(йаШШй Йис8а8^аса888й1с1с18188сй188^а88^с181^сс188^аас1а8^с1^сй8^^а8^асса88^<:188'^:с1^с8^аас1са8^а8^а1 ссасс18сс1с18сс1сс18^а8¹8^с1888^айааа8вса18с8ссассаас8сй88с1с1асс1аайй:аааа8а8ай81 8(81сасаа8881в1^са181с8ссс18саассассссссссссааааааааааааааааааасйсасХ8аа8с1ваа8С ас8а18а1й881*^ас<:с*88^с*В8^ссаа18^а8^с4с,аВ8В^а8^1;с^^сс*8^{4саааса}8^аа1*^;1сааса88^<:8^са8^са8^^с*® йааа8188ё8^{11асаасаса}88^шИё^са1а1^са88^са1«^1а(сгаа8с1^атссса8^{ссааааа1}8¹8^1аПП88^а88^са 8са8а8с1аа£а8айаааа18а88Ваа8^а8^сссасаса8Вйа11а88^аа8^а1^аа8^са£сйс1йа1а1аааасаааасс ааассааас(88^аё8^аВ81^с1^ассй1^а8В8^а188^аа8^аааа8^асаЧ^,а8^а8Е8¹Е^саа1а8ааа8ВВсас<:8а81й81 8а88188^а88^ас1888^а8^а888^с8^саасс8^сй1аас18<сс18йй8сс1аййй888васа8саса18йсс1айй(с сса88а£ввв^саа1^с1ссас81ссааас118с881с8а88ас4аса81са(й18са88й1ссиас181а188сййаааа с§£§сааа8§18ассайаасс8й1сас8С(888а888^сас8¹8^с8В^с1са8^а18^сИ^сс1с18^ас*8^а888^ссаё8^а8 8888^с1^асас8ёаа8а8£ссасасес8сасй|>88аа£ас(сёа1й£88^сйса8с188с18а8ас8сссса8са88с 1сс£с8£с1асасс11са8сссс8аа18сс11сс88ссса1аасссйсссйс1а8£сай1сс88св^а88^{асссассс}1^с 8с8ссааасайс8всссса1ссссс881сс1сасс18аа1с1с1аас1с1@ас1сса8а81йа8а8ас1а1аасса8а1ац

- 38 016880

ТЕ-элемент 05 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 7)

Са55с1881с1с§аас1са§а§а1ссасс1цсс1с1§сс1сс1§а§1§с1§2Ёа11ааа8йса18С8ссассаас£сИ8;в с1с1асс1ааикаааа8а8ай§1ё1@(сасаа§@§(ё1са1ё1сёссс1ё^саассассссссссссааааааааааааа аааааасисас18ааес12аавсас8а1ёаШ§8Нас1с188с18ёссаа1§а8с1с1а§88а81с1сс1§1саааса§а а(с1сааса»1;сдсае.са81сЩ1иааа1;игцц2Г1асаасаса1>£:Ш11цса1а1.са£{;саШ.1а1с1аа£;с1а(11ссса §ссааааа(§181а(Ш58১са§са8а§с1аа1а8аиаааа1§а8§8ааёа8сссасаса8§11а11১аа§а1аа 8са1с11сШа1а1аааасаааассааассааас(:|;ёаё8аё81с1ассШа(>§£а1§|>аа§ааааёасай1а!’а§££1 8саа1а£ааа88Всас18а8й1ё1£а§§1£8а££ас1888а8аёЙ8С£^саасс8^сТМаайё^1сс(е^Ш(£!^сс1а1м*¹ Ц;£§§аса£саса1§1(сс1айй(ссса!’8а1|’§|’саа1с1ссас81с^сааас1({>с801с8аё£ас1аса£(саш18са 8§гйссйас1§их§8Сййааааср§саа১!§ассайаасс§1йсасвс1вВё^а888^сасВ18^с88^с1^са8^а18 сйсс(с18ас1ё^а888сс^а88^а88888^с,асасёё^аа§^аё8^{ссасассс}8^сасп8её^аа8^ас1с8^а1,1888‘^:нс^а8 с1ввс1ёа8ас8сссса8са§8с1сс1с88^{с4асасс}й^са8^сссс8^аа18^сс11сс88^{ссса1аасссИсссМс1а}88^с атсс88с§а8§асссассс1с§с§ссааасайс§8сссса1ссссс8в1сс1сасс1@аа1с1с1аас1с1£ас1сса8 аз1йа8а£ас1а1аасса£а(а£

ТЕ-элемент 06 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 8)

С11§с881с8а£8ае1асае1сайиёсавётссйас1§1а188снйаааас§12сааа§е1еасса11аасс8й1са с8с1888^а888^сас8¹8^с88«1^аа8^а(8^акс^а‘^а*8^ас*ё^а88ё^сса88^а888ё8^с1асас88^аа8^а88^{ссасассс} §саси£§§аа£ас1с§аШ§£§сМса§с1§§с1£а§ас£сссса§са§£с1сс1с§£с1асассНс^а£;^ссссёаа1е; сснссё£сссашасссисссисщ£ёсашссё£с£а§§асссассс1:с§с£ссааасаисё£сссса1ссссс£ §1сс1сасс1§аа1с1с1аас1с1ёас1ссаёа§Ша§с§ас1аиассаёа1аё

ТЕ-элемент 07 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 9)

Осс1£йаёасс1§аёП8а1ассса§аассса8а1саа8а1§8^а88^а8^а8^аасса8^ссссас1^аа8^с18^1ссса18^асс ссса1ааа18сс1ссс181сса811а1дссасасаа18^а1^а88(8^аа1^асаё^{ааааасассс}11^сс(й^а8^{асас1аа}8^с88^а йсс1сиас8са1асса£йаа81£а1а8йс1(а§2сНсаас(савсасШааааа8Ша1аШ1§саа1£с1888В^ас1^а аайа@881¹81ёсаса1ёс1аае1аа2сас1с1асйй21а1сасаййаа1аа11@1аа2аайааис§1§ааа1а81а§с1 §а§асаа*а§а1й§й*сш:са1§18§§ааог§с1£(:84518^сйсй8с1§а1£сааасаа§рсааа1^асй1^а1й:ссса;з1 §1с18СС(а§ссс1§1а^асасйс(с1айа1асаа1Ёассасааа1аай১1§^аё18£ёт18й1са1й1ааай8й§с1а ййа§а§аса8£ай1с

ТЕ-элемент 08 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 10)

Осс1§аа8^асе18авй8агассса§аассса8а1сааёа1§ёа§§а§адаасса§ссссас1аа8с181сссс18асс ссса1ааа1ЁСс1ссс181сса£йа1§ссасасаа18^а(^а8ё18^аа(^аса8ааааасасссйсс1й^а8^асас1аа§с§@а йсс1сиасЕса1ассавиаа81ёа1а§исй১сйсаас1са§сас1йааааа§1йа1а1й1§саа1§с1§д§в^ас(^а ааиай88118(8^саса18^с1^аа81^аа8^сас1^с1асНйб1а1сасай11аа1^аайё1аа£аайаайсй1ёааа1аё1а§с1 £адасаа1адай1дй1сШса1<йд£даасге.с1:£1дТ£(£спсй£с11>а1£сааасаа££1сааа1асШайсссса;й £1с1£сс1а£ссс1£1аасасйс1с1айа1асаа1@ассасааа1аайа§£1£а£(§££ий§Шсаййааай£й£с1а ййа8а£асаё§аШс11£саа^асс1§$’й881с11ааае1ссёШ;’1а8с1(’а§аа18ассН(;аааасс11сс1ё1ссса сссс(сааайсса§ааНа1а§асасссассаса(§8сйаа1аа§1ааасаасаасаа1аааа§са18^асН^с1888^1с48 8а§88^а888^аИ8^сса8¹1^ааё^а8^саа1ё8^а^^ас1Ч^ссса1^а8^аа<;с188ёЧ¹ё^ас(^сссаё^{сас1аасс}1^аса1ё818^а 1а§18а1§са8саваса1аса1ёа££8^саааа<^:а<^:аса18ё8^оа<^!а1^ааас^аа8^сассс8^{сссасса}188^сНйссссс а(сасйа§аса§сса1а1йааасё1а§1ё§а§сс১с(ё§@ё18ё128сссасасстаа1ссса§сас(сса§аа§ §са§а§§1১с@§а1с1с1Ё1§§§1й8а@асса§сс1з§1с1асаа§а§с1а§йсс১аса@сс1ссааа§сса1аз а§ааассс1а1с

ТЕ-элемент 09 (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 11)

ВСС(§аа2асс18аЁйёа1ассса§аассса§а1саа5а1е8^а88^аё^а8^аасс^а8^аас^ааа1^аа8^с1ё^(сссс(8^аесс сса1а^аа18сс1ссс1Ё4сса2йа12ссасасаа1§а1а§8(£аа1аса8а^аааасасесйсс1йа§асас1аа§с8да1

- 39 016880

1сс1с11ас(>са1асса(’11аа§1£а1а8НсНа£§с1(саас«:а§сасШааааа§Шаи1и(8саа1§с1|1|3£§асхаа аХ1а8§8И@Х§саса1§с1аа8Таа§сас1с1асПН§Ха1саса1И1аа1ааП81аа§аайаа11с818ааа1а81а8с18 а§асаа1а8аН1£1йсН1са1в18ё£аас14;с1§181818с11с11£с1§^а1§сааасаа£е1сааа1асШа11сссса(>1£ 1с1ёсс1а2ссс1д1аасас(1с(с1аНа1асаахдассасааа1ааиа£о(яадТ§1>£>Ш1<>Шса1таааиоН8С(аи хХа^авасавйаХХХсИвсааассХввйввХсХХааасХссвХаХвХавсХвавааХвассИваааассХХссХвХсссасс сс1сааа(1сса£аа11а1а£асасссассаса1§(’сиаа1аа(з1ааасаасаасаа1аааа§са1§ас11с1⧧(сХ8£а е£8^а88Е^си8^ссадиаададсаа1ё£а1аеШссса1аваасс1£;дй111вас1ссса»сас1.аа<х1аса1Вё1ёа1а 81£а1§савса8аса1^аса1£а88всаасасасаса1в§(>саса1асасас8сассс£сссасса(£{5сН11ссссса1 сасиа8асавсса1ашааас81а818вавссав8с1в8881881§8сссасассхнаа1ссса§сас1сса£а১с ава§е1১с§§а1с1с1@1@е§1Х(еа@асса£сс1§е(с1асаа£а8сХавХ1ссавваса8Сс1ссааавсса1а§а§ ааассс1а1сХсаааааасХ8ааасаасаасаасаасаааасааааХааааааасаасаааавааХсйа£Х£вИсав1в ВПссасасасавеааавХаваааёввссиваХвввааёрШсазаеэдавеараХ^аХдавасавваХеаХавХ §аааа§аас1сааайаанааа1аН(8ааасХа1с1ааеаа1аааавс1аааа1аИ(аааайасав1еавв1^аВХ88^,:ё81 8са8ае8ёС1аа811881^а8асасац1вай^а1сса88^сса8^ссаЁё8^с1^а1:с1а8^|-8^а8^асс11ёЧс^ааа1аас1^аа1^аа ааХа1асаааа1ааав8^а8^асассасаа1ааШ1вааа1в1аааа8ас1ааа1ПассйПа1аИ@а1§адНв§а1ааааа аа1сааШасса£а8ааса1ааавХав1ссса(сааавасаааавсаа1а1а18аиааас1с(аа1Иаааа§Ш8На§ав ссХввсаас81£8саса1ассШаа1ссса§сасса8в

ТЕ-элемент 10 (81Т) ГО N0: 12)

8сс(8аавасс(га81(2^агассса8аасссайассаа8а188а8йа8аваасс^а8сссс^ас1аавс1и1сссс18ассс сса1ааа1всс1ссс1§*сса8йа18ссасасаа1§а1১48ааХаса8ааааасасссХ(сс111а@асасХаа§с8ва1 1сс1сХХас8са(ассав11аа818^а1ав11с11а8£СХ1саасХса£сасШааааа£П1а1а1111всаа18с1в£ввас1аа аХОДввХХвХвсасаХвсхаавХаазсасХсХасХПХвХаХсасаХХПааХааХХвХаавааИааХХсОДаааХавХавсХв а£асаа1аца111цШс(11са(ц1£££аас1вс181£181£сис(18с18^а18^сааасаа88*саа^а1асШ^а11^сссса81£ хсхвссхавсссхбхаасасххсхсхаххагасаахвассасааахааххаввхвавхввёййвхйсаиххааайвйвсхахх Х1а8а8аса8ваШс11§сааасс18£1188Хс11ааас1сс81а181а£с(§а8ааХ8ассХ18аааассйсс18(сссасс ссХсааайсса£аа11а1а8асасссассаса1ввсйаа1аа§1ааасаасаасаа1аааа8са1васйс1£В£1с188^а ёёё^аё88^оИё^ссаёИ^ааё^аё^1:!аа1ё8^а1ас1Ч^сеса1аё^аасс1ёёё1Ч8^{ас1ссса}ё^{сас1аасс,:аса}<^;ёё1^:ё^а1а §Х8а1вса8са£аса1аса18а88£саасасасаса188£саса1асасас§сассс£сссасса188сййссссса1 сас11а8аса8ссаХаШааас81а81£ва£Сса88с1£В881ё8188^{сссасасс}1И^аа4^ссса8^сас*а<^:а8^аа88^с а8а§81^а88^с8ё^а<;с1с18¹888¹¹¹8^аё^асса8^сс18ё^1с1асаа8^а8^с1^а8Исс^аВ8^ас^а8^{сс1ссааа}ё^сса1а8^а8 ааасссХаХсХсаааааасХвааасаасаасаасаасаааасааааХааааааасаасаааавааХсйавХввйсавХв 8йссасасаса88ааа£1а8ааа888^ссН8^а1ёёё^ааёё1«1^саё^а8ё8^аёё^а8^1а(8ё^аи^аё^асаёё^а1ё^а1^аё¹ Ваааа8^аас1сааайааХ1ааа(аХй8ааас1а1с1ааваа1аааа§с(аааа1а(йаааайаса£1са££1а§1в£18в1 8еа8а§В8с1аа£й§§1а£асасав18а8а(сса8£сса£сса8££с1асс1а§г£а£ассй£йсааа1аас1аа1аа аа1а1асаааа1ааав8а£асассасаа1аайй8^ааа181^аааа8^а‘^{;1аааИ1асс1}Ч^1а1^аИё^а1ё^аёйёё^а*^ааааа аа1саа1йасса£а8ааса1ааа81ав1ссса1сааавасаааа£саа1а1аХ£айааасХс1аайХаааа8Й1вйа£а£ ссХ§8саас81§8сасаХассХйаа1ссса§сасса888а8аса8а8£ссаХсс1881сХааааа£1£а1сХсса££аса ВСса1ё£с1айасаса§а8аа^асссХв1с188^{ааааасаааааа1}*^аё¹ё^1сса1ё181^ааа181ё¹ёё^аё1^а18^с1⁽ё^1са1 £ссаса1^аса8а881^аё^аёёё^саёХй^аХ8ё8^а8Х^саёХ1ссХ^айсХХесХХХа(£й£ё8ассГ£8ё8асХ8аас(саийГ^с аХса8§сХХ£8са8ааа£1£сайа8с(сас88^аёССйа1саХХ88С8ааа£с1сХс1саа8Ха£ааааХсааХ£1вХй8С1 са1а£18саа1са11а181йсва§^а88£8аа888Д^асааХ^с8^,1ёёё8^са<ё¹8^,8ё^{,саса1с1}ё^аа1а8^са81^а8^е1ссс ХаВВавааиаайссаавХХсШввХв^ХйШХсааХвсссйаааввв^Хсаасаасйшисеск'ХйасаааасХаии сйаХ£Хссй§хссс

- 40 016880

ТЕ-элемент 11 (8ЕО ГО N0: 13) §ссг8аа8асс18а8и§а1асссаёаасссаёа1сааёа188айваёаёаасса§ссссас1ааёс1е1сссс18ассс сса1ааа1£сс(ссс1£1сса£11а1£ссасасаа1£а1а££1£аахасавааааасассс1хсс1йа£асас(аа8с££а1 (сс(сПас8са*ассаеКаа21Еа1аЁ11с11а§есПсаас4саесасШааааарПахайй§саа(8с1ёёёё^ас1аа а11ав££й£(:£саса18С1аа8Хаа8сас1с1ас1й1£1а1сасаййаа1аай81ааваа11аа11с818аааХа81а8С18 а8асаа1а{>аШ(;тсШса1в1(’ё8аас1|5с1£18181!5сНс118с1|за18сааасаа§ё1саааХас111аисссса81§ Хс18сс1авссс1£1аасасНс1с1айаХасаа1£ассасаааХаайа£в1£а£Х£8£й(1£1йсайИааай£й§с1ай йаёаёаса88аШс118сааасс(ё£11Ё81с11ааас1сс81а(81а£е1ёаёаа1ёассХ1§аааасс11сс1§1сссасс ссХсаааНссаваайаХавасасссассасаХввсйааХаавХааасаасаасааХаааавсаХвасйсХвввХсХвва ё8§а8В8сИ8сса811аа8а8саа188а1ас1йсссаХа£аасс18881й§ас(ссса8сас1аасс1аса18818а1а 8(Ёа18са8са8аса1аса1§а8§8саасасасаса188§саса1асасас@сассс§сссасса1§8с1йХсссссаХ сасйа§аса£ссаХаШааас£Ха81ё8^а8^осаёё°18888¹8818ё^оссао^ассйХаа1ссса8сас1сса8^аа88С аёа88Ха88С88аХс1сХ8Х88§1ХХ8а8^асса8СС1881с1асаа§а8сХа8исса88аса8сс1ссааа8сса1а8ав ааассс1а1с1саааааас1£ааасаасаасаасаасаааасаааа1ааааааасаасаааа8аа1сХ1а£Хв£йса£1£ §йссасасаса88аааёга§ааа88ёСС1Г8а1£ё8аа8811Йса8а888а88а81а188аТ8а8аса88аХ8а1а8( 8аааа8аас1сааа11аа11ааа1аШ8ааасШс1аа8ааХаааа£с(аааа1ай1ааааиаса81са8§1а81881881 8са8а888с1аа8(18ё1^а8^асаса8¹ё^аё^а1с^са88^1:са8сса888^с<^ассХа£18а8асси.8йсаааХаас1аа1аа аа1а1асаааа1ааа88а8асассасааХаа1й18ааа181аааа8ас1ааа1Иасс1й1а1а118аХ§а8й88а1ааааа ааХсаай1асса§а£ааса1ааа81а(’1ссса1сааа8асаааа8саа(а1а18айааас1с1ааП1аааа81й8йа8^а£ ссХ88с^аас8188^оаса1ас^сйХаа1ссса8сасса88£а8аса8а88сеа1сс188ХсХааааа81£аХс1сса88^аса 8сса188с1а11асаса8а8ааассс18Хс188^ааааасаааааа11а8181сса18181ааа181в188а81а18с1181са( 8Ссаса1аса8а£81а8а££8са£й1а1££§а81са{;йсс1айсйсс111а1£88£8асс188В8ас18аасХсав81с а1са88сйв8са8ааа§х£сайа8с1сас8£а§ссйа1сай88с£ааа§с1с1с1саа§1а§аааа(саа18181й8сх са1а£1£саа1сайа(£й(с£а£а£££8аа££81асаа1с£П88££са1£1в1££(с^аса1с(£аа1а£са£1а£с1ссс 1а££а£аа11аа11ссаа£йсй1££1в£(£1а1саа1£сссйааа88881саасаасй1ЙйсссХс18асаааас1а1сй сИ^а1£1ссй81ссс1са1ай1£аа£1а1Хйайс1й8са8(8й8^аа1^а1с^ааНс1^а8^еасс1^саё^аса18йа881аа81ас сс1асаас1са2Ейаас1аа(ПааЙ(аас1аахйаассссааса<.'1йисШйй1ахссаса1(181££а£1£121£Х8(е.х 818<81818181818181818Ш¹8¹81б1818¹8¹8¹818¹8¹8¹ё^8¹8^с8^с8^с8^сё^с8^с8^с8^с1с88^а1^{саМс1асс1Ш}8 ХйааааааГ£йа£(сса£££8*88ё8⁽8^сас18¹8^ааа8^(с,:8^а888^1аас118^с18888^,:са8^{11с,:Г(ссас1аГг1}88^ас а£аас1сса££Х£1саас1с1йасХ8аса£аасса1ссааа1а£ссс(а1с1аай11а£йййай1а1йа1ййХ£йй(с£а 8аса8881Пс1с1в188с1й88^а88^с181^сс188^аас1а8^с1^с1^,8^1а8^асса88^с1884^с^^с8^аас^^са8

- 41 016880

ТЕ-элемент 12 (8ЕО ΙΌ N0: 14) §сс1§аа§асс15аёЙ§а1асссаёаасссаеаХсаа§а1@еа§ёа8а§аасса§ссссас1аа§сГ81сссс1£ассс сса1ааа1£сс1ссс18Хсса§На18ссасасаа18а1ац§18аа1асаЁааааасасссассШавасас1аа8С88а1 1сс1сиас8са1ассаёНаа818й1^а8й^сй^а8ё^сЙсаас1са§сасЙ(ааааа8Ша1а1и18саа1йс1ёёё§ас1аа аНа§8§11§1§саса18с1аа§1аа§сас(с1асШ1§1а1сасаИ11аа1аа1181аа§ааиаа11сё1ваааГар(а§сГ§ а8асаа1а8аШ81НсШса1§1888аа^с(8^с181848⁽8^сП^с^8^с18^а(8^сааа^саа881^сааа4асШаисссса81:8 1с4|;сс1а£ссс1;’1аасас1:(с1с1а11а(асаа(8ассасааа1аа14а£(’1§а(;1(>§(»1Ш8Шса1Шаааи811@с1а11 Ка8а8аса88аШсП8сааасс188К881сКааас1сс81а18Ха8с1§а8аа18ассК8аааасс11сс181сссасс сс1сааа11сса§ааЦа1а§асасссассаса188с11аа1аа§1ааасаасаасаа1аааа§са1@асис1§884^а18ё^а 888^а888^сМ8^сса811^аа§а8саа188^а1^ас1Нссса1а8аасс1888Ш8ас1ссса8сас1аасс1аса18818^а^^а §1§а1Еса§са§аса1аса1ёаё88саасасасаса1§8ёсаса1асасас§сассс§сссасса1§ёсииссссса1 сасиа8аса8сса1аШааас81ав1два£сса§8с1§§§818§1§§сссасасси1аа1ссса8сас1сса8аав8^{с а}8^аё81^а8ё^с88^а(с^^с1ё¹68ёН^г8а8асса8Сс188^1с<^;асаа8^а8^с1^а8*¹сс^а88^аса8^{сс1ссааа}ё^сса^^аё^а8 ааасссГа(с1саааааасГ8ааасаасаасаасаасаааасаааа1ааааааасаасаааа8аа1сС1а8188Нса8(8 8ассасасаса8£ааа81аеааа888С«¹<8^а1888^аа88««с^а8^а888^а88^а81^а4ёё^а1ё^а8^ас^а88^а<8^а^^а81 8аааа8аас{саааиааЦаааГаи(8ааас1а{с1аа8аа{аааа8с1аааа(аШааааКаса81са88(а8¹88⁽88^ 8са@а8§§с1аа8иё81^а8^асаса818^а8^а1^сса88^сса8^сса888^с1^асс1а818^а8^ассй8йсааа1аас1аа1аа аа1а1асаааа1ааа88^а8асассасаа1ааШ18ааа(81аааа§ас1аааШассйИа(аи8а18а8й88а1ааааа аагсааШасса§а£аас.цааа8и»гссса1сааа§асаааа8саа1а1а18аКааас1с1ааШааааеШ811а§а£> сс1;в8саас818§саса1ассШаа1с<:са8сасса£88а8ас^а8а88ссаГсс1£§1:с1ааааа818а1:с1сса88аса 8сса(88^{с(апасаса}8^а8^ааассс181с188ааааасааааааиа8181ссас8£8(ааа(818188^а8^1а(8^с«8^{са( 8ссасз1аса8а88^1;а8^а88ё^са81На1888аё1са811сс1аИсИссй1а188888асс18888^ас18^аас,;са881^с а1са88си88са8^ааа81всаи^а8с1сас88^а8^ссЧ^а1^саЧ88^с8^ааа8^с1^с1с1^саа81^а8^{аааа1;саа}1818й18^с1 са1^а818са^а1с^аиа18тс8^а8^а8888^аа88§1^ас^аа1с8118888^са1ё181881^саса,с18^аа1а8^саё^1а8^с1^ссс (адзайааиааиссаазисШвйЦцЦвЫГсааГзсссИааацё^с^сзасЧШНсссГСГВасааааеГаГСИ

С11а181сс1181ссс1са1а1112аа21а(111а11с1118сац1циоаа1а1саа11е1а8сасс1сае,асси8иацё1ааё1ас сс1асаас1са88йаас1ааШааШаас1ааН4аассссаасасйИ1с1118(иа1ссасаШ§1§8а818{81@1§Е81 81а18181ёЧ:1ё®®18Ш18®®8^8®й®1ё®®8®®с2С8еесессе8С8^с1С8йа1са[1с1ассШ1й 1йаааа^аа18И^а81сс^а88881888818^еас1818^ааа8^,с¹8^а888^1аасЧ8С(8ё88^1са8й^си1ссас1а1১^ас а8аас1ссаё8181саас1сШас18аса8аасса1ссааа1а8Ссс1а1с1аа1и1а8ШШа111а1иаК11и8Ш11с8а 8аса888^тс1с18188СН(8Е^а88^с18^гсс188^аас(а8^сХсЧ8^1а8^асса88⁰<88'с<^а8^аас1^са8^а8^аЧ^:сасс1 8сс1с1§сс1сс18а818с4д8§апааа88са1§с8ссассаас8сн88с1с1асс1аа«4аааа8а§а118181§1сас ^аа888181^са181^сё^ссс18^{саассасоссссссссааааааааааааааааааас11сас1}8^аа8^с18^аа8^сасё^а18^а 1Н8§11ас1с188с18£ссаа12а£;с1с1а888а§1е1сс181саааса8аа1е1сааса88С8савса81с11й<1ааа8Х 8В88И^асаасаса881Ч118са1а1са88саииа1с1аа8с1а1(1ссса8Ссааааа1§1§1а1П188^а88^са8^са8^а8 сЛаагацаиааааГбаЁдёаай.ацсссасасаЁёиапабЁааааГаабсайПсшаШаааасаааассшассаа ас1ц8а8ца^1с1асс1Иа88ца(и8аа£а^ааа8^асаШааа28818саа1айааау;дцс^ас18а81и818а881.£;(5 а§8ас1888^а8^а888^с8^саасс8^сЧ1:аасТ81сс18Ш18Сс1^аИ11«8888^аса8^саса18Ч^сс1^аЧЧ1:ссса88а1 8Р8саа1с1ссас(Цссааас(18суй1срае2ас1асац

Пример 3. Влияние варианта ТЕ-элемента ТЕ-00 на экспрессию ОРР и иммуноглобулина О1 (1дО1).

Влияние ТЕ-элемента ТЕ-00 на экспрессию локализованного в цитоплазме ОРР (зеленый флуоресцентный белок) и секретируемого моноклонального антитела 1дО1-типа исследовали в двух независимых сериях опытов по стабильной трансфекции клеток линии СНО-ОО44. Для этого клетки линии СНОБС44 котрансфектировали следующими комбинациями плазмид или вариантами плазмид:

а) контрольными плазмидами рВГЫО-ЬС (фиг. 1А) и рВЮ-НС (фиг. 1А), не содержащими ТЕэлемент;

б) рВГЫО-ЬС и рВГО-НС. каждая из которых содержала ТЕ-элемент ТЕ-00, интегрированный в прямой ориентации против хода транскрипции относительно промотора/энхансера;

в) рВШО-ЬС и рВГО-НС, каждая из которых содержала ТЕ-элемент ТЕ-00, интегрированный в обратной ориентации против хода транскрипции относительно промотора/энхансера.

В сериях опытов А по трансфекции создавали по четыре пула, в сериях опытов Б по трансфекции создавали по десять пулов на вариант. При этом каждый раз использовали обе плазмиды в эквимолярных количествах. Для обеспечения одинакового общего количества молекул общее количество ДНК, применявшееся для трансфекции в сериях опытов А в контрольных смесях составляло 1 мкг, а в смесях, содержащих ТЕ-элемент, оно составляло 1,3 мкг. Указанное различие было обусловлено различием размеров плазмид, поскольку плазмиды, несущие ТЕ-элемент, были в 1,3 больше, чем контрольные плазмиды.

- 42 016880

Поскольку количество ДНК, используемое в смеси для трансфекции, может оказывать влияние на эффективность трансфекции, то в сериях Б общее количество ДНК доводили до 300 нг с использованием (ДНК-имитатора) (вектор, не содержащий ген продукта, ТЕ-элемент и эукариотический селектируемый маркер), так что смесь, в которую входили контрольные плазмиды, также содержала в сумме 1,3 мкг ДНК. В качестве отрицательного контроля в каждую серию опытов по трансфекции включали пул, трансфектированный имитатором, т.е. проводили его обработку таким же образом, но без добавления ДНК в смесь для трансфекции. Отбор стабильно трансфектированных клеток осуществляли через два дня после трансфекции с использованием среды -НТ/+С418 (400 мкг/мл).

После отбора определяли с помощью ЕАС8 долю экспрессирующих СЕР клеток. Сравнение вариантов, проведенное путем наложения графиков, показало, что в обеих сериях опытов в пулах, содержащих ТЕ-элемент 00, доля клеток, экспрессирующих СЕР, была более высокая, чем в пулах, трансфектированных контрольными плазмидами (фиг. 7). Не было выявлено никакой разницы между пулами, трансфектированными плазмидами, в которых присутствовал ТЕ-элемент в прямой или обратной ориентации. Таким образом, влияние ТЕ-элемента 00, заключающееся в увеличении доли клеток, обладающих более высокой продуктивностью, не зависело от указанной ориентации.

Кроме этого проводили определение титра 1дС1 и удельной продуктивности пулов в течение периода времени, требуемого для осуществления шести-восьми пересевов (цикличность пересевов 2-2-3 дня). И в этом случае также было установлено, что пулы клеток, содержащих ТЕ-элемент 00, в среднем характеризовались более высоким уровнем экспрессии, чем пулы клеток, не содержащих ТЕ-элемент (фиг. 9, серии А и Б). В обеих сериях можно было выявить удвоение продуктивности пула, обусловленное присутствием ТЕ-элемента, независимо от того, в какой ориентации элемент был клонирован в экспрессионной плазмиде.

Пример 4. Влияние ТЕ-элементов ТЕ-01-ТЕ-12 на экспрессию МСР-1.

Влияние ТЕ-элементов ТЕ-01-ТЕ-12 на экспрессию секретируемого МСР-1 исследовали в 3 сериях опытов по стабильной трансфекции (серии В, Г и Д) на клетках линии СН0-ЭС44 в сравнении с экспрессией без использования ТЕ-элемента. Во всех трех сериях создавали по шесть пулов на один вариант плазмиды. В качестве базовой плазмиды в сериях В и Г применяли рТЕ4/МСР-1 (фиг. 1Б; селектируемый маркер №Т - неомицинфосфотрансфераза Е2401), в серии Д - рТЕ5/МСР-1 (фиг. 2; селектируемый маркер ИНЕК - дигидрофолатредуктаза). Эти плазмиды либо не содержали ТЕ-элемент (контрольная смесь), либо содержали один из ТЕ-элементов ТЕ-01-ТЕ-12 в прямой ориентации против хода транскрипции относительно промотора/энхансера. Для минимизации влияния различий в количестве ДНК в смеси для трансфекции на эффективность трансфекции каждый раз использовали в целом по 1,2 мкг ДНК плазмиды. В зависимости от размера встроенного ТЕ-элемента размер плазмид варьировался от 6,7 т.п.н. до 10,7 т.п.н. Однако для того, чтобы во всех смесях общее количество молекул тестируемых плазмид было постоянным, в смесях, содержащих молекулы плазмид меньшего размера, общее количество ДНК выравнивали с помощью так называемой плазмиды-имитатора, которая не содержала ни ген продукта, ни ТЕ-элемент, ни эукариотический селектируемый маркер. В качестве отрицательного контроля в каждую серию опытов по трансфекции включали пул, трансфектированный имитатором, т.е. проводили его обработку таким же образом, но без добавления ДНК в смесь для трансфекции. Отбор стабильно трансфектированных клеток осуществляли через два дня после трансфекции с использованием в сериях В и Г дополненной НТ среды СН0-8-8ЕМП +С418 (400 мкг/мл), в серии Д - среды СН0-8-8ЕМП, не содержащей НТ.

После отбора определяли с помощью ЕАС8 долю клеток, экспрессирующих б§Кеб2. На фиг. 8 представлена относительная (выраженная в процентах) флуоресценция, испускаемая живыми трансфектированными клетками, в серии опытов В. По сравнению с контрольными пулами пулы, несущие ТЕэлементы ТЕ-01, ТЕ-02 или ТЕ-08, содержали примерно в 3-3,5 раза больше клеток, экспрессирующих б§Кеб2, а пулы, несущие элемент ТЕ-06, содержали примерно в два раза большее количество клеток, экспрессирующих б§Кеб2. В отличие от этого, в пулах, несущих фрагменты ТЕ-05 и ТЕ-09, не было выявлено увеличения доли клеток, экспрессирующих И8Кеб2, по сравнению с контролем.

Кроме того, в течение периода времени, необходимого для осуществления 6 пересевов (цикличность пересевов 2-2-3 дня), повышались также титр продукта МСР-1 и удельная продуктивность. На фиг. 9 (серии В и Г) и фиг. 10 (серия Д) представлены относительные уровни удельной продуктивности в отношении МСР-1. Для элемента ТЕ-08 при использовании №Т Е2401 в качестве селектируемого маркера было выявлено повышение удельной продуктивности в отношении МСР-1 в 5,3 раза по сравнению с контрольными пулами, не содержащими ТЕ-элемент (фиг. 9). Для этого варианта при использовании ИНЕК в качестве селектируемого маркера было достигнуто 6-кратное увеличение (фиг. 10). ТЕ-элементы 01, 02 и 03 в отобранных с использованием NРΤ пулах приводили к 4- или 4,5-кратному увеличению (фиг. 9), а отобранные с использованием ИНЕК пулы - к 2,6-6,8-кратному увеличению продуктивности (фиг. 10) по сравнению с контрольными пулами. ТЕ-элемент 06 длиной лишь 300 пар оснований также обладал способностью повышать продуктивность в 2,5-3,2 раза во всех сериях опытов (фиг. 9 и 10). Повышение продуктивности, достигаемое при использовании фрагментов ТЕ-04 и ТЕ-07, имело такой же порядок величины (фиг. 10). Пулы, в которых применяли немного более длинные фрагменты ТЕ-10, ТЕ

- 43 016880 и ТЕ-12, характеризовались удвоенным уровнем экспрессии МСР-1 (фиг. 9 и 10). Очевидно, что в этих пулах количество клеток, которые не экспрессировали продукт или обладали низким уровнем экспрессии, было снижено, и за счет этого увеличивалась доля высокопродуктивных клеток в клеточной популяции. Это свидетельствует о том, что ТЕ-элементы обладают способностью подавлять негативные хромосомальные позиционные влияния, защищать от них или устранять их.

В отличие от этого использование фрагментов ТЕ-05 и ТЕ-09 не приводило к усилению экспрессии по сравнению с контролем, как это уже было продемонстрировано на примере экспрессии О§Ке62 (фиг. 8) и в отдельных случаях даже приводило к ее снижению (фиг. 9 и 10). Таким образом, эти элементы или частичные фрагменты в этих областях последовательности, по-видимому, могут даже оказывать подавляющее воздействие.

В целом выявленное изменение уровня экспрессии МСР-1 коррелирует с долей экспрессирующих О&Ке62 клеток в стабильных пулах клеток.

Пример 5. Тестирование ТЕ-элементов ТЕ-01-ТЕ-12 в отношении энхансерной активности.

С использованием кратковременной трансфекции клеток линии 6Η0-Ό644 проводили исследование того, действительно ли наблюдаемое усиление экспрессии продукта обусловлено открывающим хроматин воздействием ТЕ-элементов или оно основано на энхансерной активности. Поскольку при кратковременной трансфекции не происходит интегрирование плазмиды в геном, то генетическая информация считывается непосредственно с плазмиды. При этом не должны иметь место хромосомальные позиционные воздействия. Если, тем не менее, возникают положительные воздействия не экспрессию гена, то они могут быть обусловлены энхансерами, присутствующими в ТЕ-элементе. Такие энхансеры могут воздействовать на активность промотора в цис-положении независимо от локализации и ориентации и стимулировать транскрипцию функционально связанного гена.

В опыте по кратковременной экспрессии, результаты которого представлены на фиг. 11, осуществляли трансфекцию 6 пулов базовой плазмидой рТЕ4/МСР-1 (контроль; фиг. 1Б) или ее производными, каждое из которых дополнительно содержало один из ТЕ-элементов ТЕ-01-ТЕ-12, расположенный против хода транскрипции относительно промотора/энхансера. После культивирования в течение 48 ч в общем объеме 3 мл осуществляли сбор МСР-1 и определение его титра в супернатанте клеточной культуры с помощью ЕЫ8А. Различия в эффективности трансфекции корректировали на основе данных, полученных с помощью котрансфекции с использованием экспрессирующей 8ЕАР плазмиды (путем добавления по 100 нг плазмидной ДНК на партию смеси для трансфекции) и последующего измерения активности 8ЕАР. На фиг. 11 представлены средние значения, полученные для 6 параллельных пулов. Результаты свидетельствуют о том, что титры МСР-1 в супернатантах клеточной культуры для всех пулов были очень близкими и не было выявлено достоверных отличий уровней экспрессии от варианта с использованием контрольной плазмиды рТЕ4/МСР-1, не содержащей ТЕ-элемент. Поэтому вызываемое некоторыми ТЕ-элементами повышение продуктивности стабильно трансфектированных пулов более чем в два раза не обусловлено присутствием энхансера в ТЕ-последовательности. Таким образом, для опосредуемого ТЕ-элементами усиления экспрессии абсолютно необходима их интеграция в хромосому.

Пример 6. Создание других ТЕ-элементов и тестирование различных положений и комбинаций ТЕэлементов.

Ааналогично методу, описанному в примере 2, можно создавать другие частичные фрагменты 8ЕО ΙΌ N0: 1 или ее производных и, как это описано в примерах 3 и 4, тестировать их в отношении положительного воздействия на продуктивность. Некоторые примеры возможных вариантов фрагментов представлены на фиг. 12. Полученные к настоящему времени результаты свидетельствуют, например, о том, что представленные на фиг. 12 области 8Е0 ΙΌ N0: 1 также могут приводить к усилению экспрессии гена. Эти новые ТЕ-элементы должны быть более подробно изучены в сериях опытов по стабильной трансфекции с точки зрения их воздействий на удельную продуктивность, чтобы более точно определить положение и границы важных для указанной функции областей последовательности. Определение того, что функция обусловлена конкретными областями последовательности и связанное с этим возможное уменьшение длины фрагментов является важным для эффективного применения экспрессионных векторов, поскольку имеющие меньший размер экспрессионные плазмиды являются более стабильными и ими проще манипулировать при осуществлении клонирования и трансфекции.

Кроме того, можно располагать в любой ориентации, а также в любом положении в плазмиде одинаковые или различные области фрагментов. Исследование того, какие комбинации приводят к наибольшему возможному усилению экспрессии, можно также проводить в сериях опытов по стабильной трансфекции. Некоторые варианты осуществления изобретения, которые никоим образом не ограничивают его объем, представлены на фиг. 13. Так, например, следует исследовать, могут ли ТЕ-элементы ТЕ-06 и ТЕ-08 приводить к дополнительному усилению экспрессии в том случае, когда они фланкируют ген продукта с обеих сторон или расположены один за другим. Кроме того, теоретически допустимо, что последовательное встраивание коротких одинаковых или различных ТЕ-элементов, таких, например, как ТЕ-элементы 06 и 08, также может приводить к дополнительному усиливающему экспрессию воздействию.

Другие ТЕ-элементы.

- 44 016880

ТЕ-элемент (8Еф ΙΌ ΝΟ: 15)

0П£си1Шада2ас১аШсПдсааасс1£§и£ё£сиааас1сс£1а1£(аос1£а§аа1.§ассЦёаааассП.сс

1§1сссасссс1сааайсса§ааИа1а8асасссассаса1§§сйаа1ааё1ааасаасааоаа1аааа§са18ас11с1

888^1с188^а888^а888^сИ8^сса8Н^аа8^а8^саа188^а1^ас1й^ссса1^а8^аасс1888^ш8^ас^^сса8^0ас1^аасс1^ас а1ё818^а1^а818^а18^са8^са8^{аса1асаг}ё^а888^{саасасасаса,}888^{саса1асасао}8^сассс8^{сссасса1}88^сП

Нссссса1сасиа8аса8сса4аШааас81а81§ёа8сса88с18£ё81Е8188^{сссасасс}1Иаа1ссса£сас1с са8аа88са8а881^а8ё^<588а4с1с(8>§881^(,;8^аёасса8сс1881с1асаа8а8си8исса88аса8сс<ссааа

ТЕ-элемент

0сса1а§а[>ааассс1агс (8Еф ΙΌ ΝΟ: 16)

Сааа§сса1а8а8ааассс1а1с1саааааас1вааасаасаасаасаасаааасаааа1ааааааасаасаааа8аа1

Сгга§18ё«саё18ёг1ссасасасаё8ааа81а8ааа888сс118а1§88аа884кса8а888а88а81а188а18а

8аса§8а1Е^а(а8¹8^ааааЁ^аасКаааПааКааа1аИ(§ааас1а1с1аа8аа1аааазс1аааа1аШаааа«аса§1 с১1ае1ее1е§1§саёав88С1аа§Н§§1а§асаса§18а§а1сса§есса§сс১ес1асс1а§1§а§ассН8(

1сааа(аас1аа1аааа1а1асаааа{ааа88а8асассасаа1аа11Н{>ааа181аааа8ас1аааи(асс1Ша1а11£а1 £а@11££а1ааааааа1сааЩасса£а@ааса1ааа£1а£№сса1сааа8асаааа§сааша18аиааас1с1:ааи1

ТЕ-элемент аааао(п8йа8а8сс18§саас8т§8с^аса1асстоаасссса8сассад§ (8Еф ΙΌ ΝΟ: 17)

Ой8с1аййа8а8аса§£ай4сй£сааасс188й§81сйааас4сс8й1181а8с18а8аа1§ас^с118аааассйсс (81сссасссс1сааа«сса8ааНа1аёасасссассаса188сиаа1аа81ааасаасаасааГаааа8са(8ас11с4

88£1с188^а88ё^а88®^с118^соа811^аа8^а8^саа188^а1^ас111^есса1аё^аасс18881118^ас1^ссса8^сас1^аасс1^ас а1§81§а1а818а18са8са8аса1аса18^а88В^{саасасасаса}18ёёсаса1асасас8сассс8сссасса188си

Йссссса1сас11а8аса8сса1ашааас§1а8188а8сса88с18§881§8188сссасассн1аа1ссса@сас1с са8аа88са8а881^а88^е88^а*^с1^с181888Ш8^а8^ас0а8^сс1881^с1^асаа8^а8^с1^а811^сса88^а<;а8^сс1^ссааа

8сса(а8а§ааассс1а1:с1саааааас(8ааасаасаасаасаасаааасаааа1ааааааасаасаааа8аа1с1и@1 £8йса8188Нссасасаса88ааа81а8ааа®£вссП§а1£даа881тса8а888а88а81а1в8а18а§аса8

8а(еа(ад1£аааа0аасйаааиааиааа1аШ{1аааиа1маа2аа1аааадс1аааа1атаааайаса£(сад8( ^а8188188¹8^са8^а888^с1аа8и881^а8^асаеа818^а8^а*^сса88с^са8сс^а888^с1^асс(^а818^аё^асс118^(1сааа1 аас1аа(аааа1а1асаааа1ааа££а£асассасаа1ааШ1£ааа(81аааа£ас1аааи1ассШ1а1а11£а{@а@11£ £а(ааааааа1сааН1асса§а8ааса1ааа§1а£1ссса1сааа8асаааа8саа1аШ8^аНааас(:с(аай1аа^аа81

ТЕ-элемент

Н£Паоа£сс1§£саас£Т§£саса1ассШаа1,ссса£сасса£§ (8Еф ΙΌ ΝΟ: 18)

АссШаа1сссаёсассаёё§а8асаёаё8сса1ес18£1с1ааааае18а1с1сс১аса8сса1§8с1аиасаса

Яа£ааассс1£1с1яеааааасаааааа11а§1§(:сса18181ааа1£Ц>1ё£а81а18с11£(:са18ссасаТасаеаёёШ £а£ё£са£та18§&а8(:са§исс1аисисс1иа1£££8ё^асс1888£ас1£аас1са2£1:са1са88с1(88са§аа а§18саиа§с1сас88а§сс1:1а1са11ё8с§ааа8с1с1с1сааё1а§аааа1саа181:8ш8с1са1а818саа1саиа1 еШсваёа§(5§§ааЕ£81асаа1с£Н:£§88са1£181£§1саса1:с1§аа1а§са(51а(1С1ссс1а(58аёаа11аа1:1сс

ТЕ-элемент аа§йсш§£1££1§1а1:саа1:£сссйааа£88§1саасаасййшссс1с18асаааас(а1сйс11а1ё1ссй81ссс (8Еф ΙΌ ΝΟ: 19)

Сааа§сса1а8а8ааассс(агс1саааааас18ааасаасаасаасаасаааасаааа1ааааааасаасаааа8аа1

С«а8188иса81е8иссасасаса88ааа§1а§ааа88§ссиеа1е8§аа08т1са8а888а88а81а1§§а1£а

8аса88а18а1а§(§аааа8аас1сааайаа11ааа1а1Н8ааас1а1с1аа£аа1аааа8с1аааа1аШаааайаса81 са8в1а818818ё¹8^са8^а8ё8^с1^ааё¹¹В8^1а8^асасаЙ8^а8^а1ссав8ссавссав88с1^асс1а818^а8^ас<^:118*

1сааа1аас1аа1аааа1а1асаааа1ааа88а§асассасаа1ааий§ааа18(аааа8ас1аааШасс1иШай£а1

8адй(г.<га1ааааааатсаашасса2а£ааса(ааад1а01сеса1сааадасаааа(;саа1а1а(8аНааас1аааШ аааа8Ш811а8а8сс188саас8^1;88^{саса,:асс11}*^{аа1ссса}8^сасса888^а8^асаё^аё8^{сса1сс,;}88*^с1^ааааа

818а1с1сса88аса8сса188с1айасаса8а8ааассс181с188^ааааас^{аааааа,:,;а}8⁽8^,сса18*ё^1ааа181ё* 88а81а(8с1(81са48ссаса1аса8а881а8а§88^са814^а1888^а81^са84^сс*^:а4^с4^сс,;11;а*^;88888^асс18ё

В£ас18аас1са881са1са88сй88са8ааа818сайа8с1сас8ё^а8ссйа4сай88с8^ааа§с1с1с1саа§1а8 аааа1саа1ё181й§с1са1а81§саа(саИа181йС8^а8^а8888^аа888^{(;асаа1с}8М8888^са18^,;8⁽881^саса1с1

8аа1а§са84^а8С1ссс1а8£а8аа11аа11ссаа8йс(:11§8188181^а1^саа18^{ссс1(ааа}88ё81^{саасаас1}НЙ1^1ес

ТЕ-элемент с(с!§асаааас1а1сисйа1§£сси§1ссс (8Еф ΙΌ ΝΟ: 20)

- 45 016880

8Иёс1аииа§а§аса£§аи1сП8сааасс(ё§1(§8(с11ааас1сс§1а181а8С1§а§аа18ассН8аааасс(1сс( £1сссасссс1сааа11сса(’ааиа1а!’асасссассаса1|Т8сйаа1аа81ааасаасаасаа1аааа8са18асис1ё д@1с1дёасдсаё2цси5сса(тнаада2саа1§ёагасшссса1аяаасс1[т5д111цас1сссацсас1аасс1аса 18§1£а1а£1ва1£са§саваса1аса18а§88^{саасасасаса}1В88^саса1^асаеас8^сассс8^{сссасса}188^сЧН ссссса(саспа8аса5сса1ан1ааас§1а§(е8^аё^ссаё8^с1888®^,;881ё8^{сссасасс}и^{1аа1ссса}8^{сас1:сса} даац^сасаццицасдцаШсЩХццЩисаааеезцсеЦаЕШасаэа.аесиаЦссац.цаааассСссааадс са1а§а§ааассс(а(с1саааааас1§ааасаасаасаасаасаааасаааа1аа^аааа^асаасаааа§аа1сйа§(§§ йсае1§еПссасасасаедааа§1а§ааа§8§сс11§а1§едааееШ1саёа§88^а88^а81^а188^а18^а8^ас^а88^а (§а1а81£аааа8аас1сааа11аайааа1^ай1§ааас1а1с(^аа§аа1аааа8с1аааа1ай1аааайаса§1с১1а@1 88Х88(@саёа§8ёс1аа8118ё1а§асаса§1§а§а1сса88Сса8Сса288^с1^асМаё¹8^аё^асс1,8^{11сааа1аа} с1аатаааага1асаааагааа2ёа{;асас1:асаа1аа1гпдаа^а(£1аааа!’ас1ааа1Г1ассййа1а11ца1цацй2,аа тааааааа1сааи1ассаёа£ааса1аааЩа£(ссса(саааа;асаааацсаа(а1а1дайааас1с1ааШаа^аа£11(ц йа8а§ссГ2йсаас81е.цсаса1ассШаагссса£са^ссас§§а8аса8ад£;сса(сИ£агс1ааааа!Л§а1с(с^с аё§ас^а8ссаг5ёс1айас^ас^а§^аёааассс18<^с188^{ааааасаааааа}1^,;а8¹ё1^сса(ё¹ё1^ааа18^,8¹8§^аё^1а1ё сйц1саГ8ссаса1ас^а8аб§1ае^аса81йа{в£даегса811сс1аис11ссШа1§82.88^асс188е8^аиЗ^аа с1с^а881са1са§ёс1(§ёса§ааа818сайа8с1сасё8а8ссйа1са駧с§ааа§с1с1с1саа§1а8аа^аа1с^аа1 я:§гп§сгса1а£Гссаа(саиаг2Шсда§а8ё2!’аа2е;§1асаа(с[2йд2!г:1са(д:1д㧧1саса1с11;аа1^а[«:а 81а§с1ссс1а§8аЕаай^аайссаа£йс1й§ё18818^,а1саа18^сссК^ааа8888^{<;саасаасК,,1Пссс1с1}8^аеа ааас1а1с11сНа(£1ссП£1ссс

ТЕ-элемент 21 (%1Т) ΙΌ N3: 21)

Си8С8с^,С8а88^асгаса8^1саЧ11усацЕШссйа^с1д1аЩ£С1Ш^аааа<'|т1£са^аасс(да<ха(1а^ассдШс^а

Сёс(§е§а姧сас8{8С8ес1саеа1ес«ссЩ(§ас1е^аё8ёсса8§а88888^^асас88^аа8^а88^{ссасассс} £сасп888^аа8^ас1с8^ахй888с«с^а8с188с18а§ас8сссса8са§8с1сс(с8ёс1ас^асс«са8сссс8аа(8 сс1хсс88сеса1аассс11ссс11с1^а88саи1сс88с8^а88ассс^ассс(с§с§ссаааса11с88сссса1ссссс8 В1сс1сассХ8аа1с1с1аас1сХвас1ссававШ^а£а8ас1а1аасса§а1а8

Пример 7. Влияние ТЕ-элементов ТЕ-13-ТЕ-18 на экспрессию МСР-1.

Влияние ТЕ-элементов ТЕ-13-ТЕ-18 на экспрессию секретируемого МСР-1 оценивали в сериях опытов по стабильной трансфекции (серия Е) на клетках линии СНО-ЭС44 в сравнении с экспрессией в клетках, не содержащих ТЕ-элемент. Создавали по четыре пула для каждого варианта плазмиды. В качестве базовой плазмиды во всех сериях применяли рТЕ4/МСР-1 (фиг. 1Б; селектируемый маркер №Т неомицинфосфотрансфераза Ε240Ι). Различные варианты плазмид либо не содержали ТЕ-элемент (контрольная смесь), либо содержали каждый раз один из ТЕ-элементов ТЕ-13-ТЕ-18, встроенный в прямой ориентации против хода транскрипции относительно промотора/энхансера (фиг. 12). Для минимизации влияния различий в количестве ДНК в смеси для трансфекции на эффективность трансфекции каждый раз использовали в целом по 1,2 мкг плазмидной ДНК. В зависимости от размера встроенного ТЕэлемента размер плазмид варьировался от 6,7 до 8,2 т.п.н. В качестве отрицательного контроля в каждую серию опытов по трансфекции включали пул, трансфектированный имитатором, т.е. проводили его обработку таким же образом, но без добавления ДНК в смесь для трансфекции. Отбор стабильно трансфектированных клеток осуществляли через два дня после трансфекции с использованием дополненной НТ среды СНО-8-8ЕМП +О418 (400 мкг/мл).

Титры продукта МСР-1 и удельную продуктивность оценивали в течение периода времени, необходимого для осуществления 5-6 пересевов (цикличность пересевов 2-2-3 дня). На фиг. 14 (серия Е) представлены относительные уровни удельной продуктивности в отношении МСР-1. Каждый элемент приводил к увеличению среднего уровня экспрессии МСР-1. Наибольшее увеличение (15-кратное) достигалось при использовании элемента 13, которое даже превышало 10-кратное повышение, вызываемое элементом 08.

Пример 8. Влияние ТЕ-элементов, встроенных в различных положениях и в различных комбинациях, на экспрессию МСР-1.

Влияние ТЕ-элементов ТЕ-06 и ТЕ-08, встроенных в экспрессионную плазмиду в различных комбинациях и различных положениях, на экспрессию секретируемого МСР-1 исследовали в 2 сериях опытов по стабильной трансфекции (серии Ж и З) на клетках линии СНО-ЭС44 в сравнении с экспрессией в клетках, не содержащих ТЕ-элемент. В обеих сериях создавали по шесть пулов на один вариант плазмиды. В качестве базовой плазмиды применяли рТЕ-4/МСР-1 (фиг. 1Б; селектируемый маркер №Т - неомицинфосфотрансфераза Ε240Ι). Различные варианты плазмид либо не содержали ТЕ-элемент (контрольные смеси), либо содержали ТЕ-08 или ТЕ-А, встроенный перед энхансерным/промоторным элементом, либо комбинацию ТЕ-06 и ТЕ-08, встроенную перед энхансерным/промоторным элементом, либо ТЕ-08 или ТЕ-09, встроенный в обратной ориентации перед энхансерным/промоторным элементом (серия Ж). В серии З применяли элементы ТЕ-06 и ТЕ-21 или ТЕ-08, встроенные перед энхансер

- 46 016880 ным/промоторным элементом (Е/Р) и дополнительно после сигнала териминации (Т) (фиг. 13). Для минимизации влияния различий в количестве ДНК в смеси для трансфекции на эффективность трансфекции каждый раз использовали в целом по 1,2 мкг плазмидной ДНК. В зависимости от размера встроенного ТЕ-элемента размер плазмид варьировался от 6,7 т.п.н. до 10,2 т.п.н. В качестве отрицательного контроля в каждую серию опытов по трансфекции включали пул, трансфектированный имитатором, т.е. проводили его обработку таким же образом, но без добавления ДНК в смесь для трансфекции. Отбор стабильно трансфектированных клеток осуществляли через два дня после трансфекции с использованием дополненной НТ среды СН0-Б-БЕМ11 +6418 (300 мкг/мл).

Титры продукта МСР-1 и удельную продуктивность оценивали в течение периода времени, необходимого для осуществления 6 пересевов (цикличность пересевов 2-2-3 дня). На фиг. 15 представлены относительные уровни удельной продуктивности в отношении МСР-1. Все элементы приводил к увеличению среднего уровня экспрессии МСР-1. Наибольшее увеличение (4-кратное) достигалось при использовании элемента ТЕ-А. Применение элементов ТЕ-06 ТЕ-21 или ТЕ-08, встроенных до и после кассеты экспрессии, также приводило к усилению экспрессии.

Пример 9. Влияние ТЕ-элемента ТЕ-08 на экспрессию двух иммуноглобулинов 64 (1д64).

Влияние ТЕ-элемента ТЕ-08 на экспрессию двух антител 1д64-типа исследовали в серии опытов по стабильной трансфекции (серия К) клеток линии СН0-Э644 в сравнении с экспрессией в клетках, не содержащих ТЕ-элемент. Создавали 24 пула с использованием базовых плазмид рВШ-БСЗ или рВГЫЬС3 и рВГО-НС2 или рВГО-НС3 и 24 пула с использованием рВШ-ЕСЛ/ТЕ!^ или РВIN-^С3/ТЕ08 и рВГО-НС2/ТЕ08 или рВГО-НС3/ТЕ08 (фиг. 16; селектируемый маркер ЕРТ - неомицинфосфотрансфераза Е2401 и йМг - дигидрофолатредуктаза). Для минимизации влияния различий в количестве ДНК в смеси для трансфекции на эффективность трансфекции каждый раз использовали в целом по 1,2 мкг ДНК плазмиды. В зависимости от размера встроенного ТЕ-элемента размер плазмид варьировался от 6,1 до 7,5 т.п.н. В качестве отрицательного контроля в каждую серию опытов по трансфекции включали пул, трансфектированный имитатором, т.е. проводили его обработку таким же образом, но без добавления ДНК в смесь для трансфекции. Отбор стабильно трансфектированных клеток осуществляли через два дня после трансфекции с использованием не содержащей НТ среды СН0-Б-БЕМ11 +6418 (400 мкг/мл).

Титр продукта, т.е. 1д64, и удельную продуктивность оценивали в течение периода времени, необходимого для осуществления 4 пересевов (цикличность пересевов 2-2-3 дня). Элемент 08 в случае экспрессии антитела 1д64-типа приводил к увеличению среднего уровня экспрессии. В дальнейшем путем применения элемента ТЕ-08 можно повышать шансы на выявление высокопродуктивного пула клеток.

Пример 10. Влияние ТЕ-элементов на экспрессию белка в клетках линии 293Е.

Влияние различных ТЕ-элементов на экспрессию секретируемого МСР-1 исследовали в сериях опытов по стабильной трансфекции (серия Л) клеток линии НЕК293 Егеейу1е в сравнении с экспрессией в клетках, не содержащих ТЕ-элемент. В качестве базовой плазмиды применяли рТЕ-4/МСР-1 (фиг. 1Б; селектируемый маркер №Т - неомицинфосфотрансфераза Е2401). Элементы ТЕ-08, ТЕ-13 и ТЕ-А встраивали в прямой ориентации против хода транскрипции относительно энхансера/промотора и создавали по 7-10 пулов на один вариант плазмиды. Для минимизации влияния различий в количестве ДНК в смеси для трансфекции на эффективность трансфекции каждый раз использовали в целом по 1,2 мкг ДНК плазмиды. В зависимости от размера встроенного ТЕ-элемента размер плазмид варьировался от 6,7 до 10,2 т.п.н. В качестве отрицательного контроля в каждую серию опытов по трансфекции включали пул, трансфектированный имитатором, т.е. проводили его обработку таким же образом, но без добавления ДНК в смесь для трансфекции. Отбор стабильно трансфектированных клеток осуществляли через два дня после трансфекции с использованием среды 293 БЕМ 11+4мМ глутамин+6418 (100 мкг/мл).

Титр продукта, т.е. МСР-1, и удельную продуктивность оценивали в течение периода времени, необходимого для осуществления 5-6 пересевов (цикличность пересевов 2-2-3 дня).

Пример 11. Влияние ТЕ-элемента ТЕ-08 на экспрессию фермента (БЕАР).

Влияние ТЕ-элемента ТЕ-08 на экспрессию фермента (БЕАР) исследовали в сериях опытов по стабильной трансфекции (серия М) клеток линии СН0-Э644 в сравнении с экспрессией БЕАР в клетках, не содержащих ТЕ-элемент. Создавали по шесть пулов на один вариант плазмиды. В качестве базовой плазмиды применяли рТЕ-4/БЕАР. Ее создавали путем замены кассеты экспрессии МСР-1-1ЕЕБ-О8Вей2 на БЕАР. Элемент ТЕ-08 клонировали в адаптере А (фиг. 1Б; селектируемый маркер НРТ - неомицинфосфотрансфераза Е2401). Для минимизации влияния различий в количестве ДНК в смеси для трансфекции на эффективность трансфекции каждый раз использовали в целом по 1,2 мкг плазмидной ДНК. В зависимости от размера встроенного ТЕ-элемента размер плазмид варьировался от 6,6 до 7,6 т.п.н. В качестве отрицательного контроля в каждую серию опытов по трансфекции включали пул, трансфектированный имитатором, т.е. проводили его обработку таким же образом, но без добавления ДНК в смесь для трансфекции. Отбор стабильно трансфектированных клеток осуществляли через два дня после трансфекции с использованием дополненной НТ среды СН0-Б-БЕМ11 +6418 (400 мкг/мл).

Относительный уровень экспрессии БЕАР определяли с помощью поступающего в продажу набора для анализа БЕАР (фирма С1оп1ес11) и оценку проводили в течение периода времени, необходимого для осуществления 5-6 пересевов (цикличность пересевов 2-2-3 дня).

- 47 016880

Перечень ссылок.

Абат М.А. и др., 1. У1го1., 65, 1991, с. 4985-4990

А11кс1ш1 8.Ρ. и др., М.1с1е1с Ас1бк Кек. 25, 1997, с. 3389-3402

А11кс1ш1 8.Ρ. и др., 1. Мо1. Вю1., 215, 1990, с. 403-410

Агопои В.к и др., Мо1. Се11. Вю1., 15, 1995, с. 1123-1135

АикиЬе1 Ρ.Μ. и др., Сштеп! Рго1осо1к т то1еси1аг Ью1оду, изд-во №\ν Уогк: Сгеепе РиЬбкЫпд Аккоаа!ек апб №беу-1п!егкс1епсе (доп. и перераб. изд.), 1994

Вакег 1.Е., 1оита1 о£ Е.хрептеп1а1 Мебкте 190, 1999, с. 669-679

Ве11 А.С. и Ρе1κепίе1б С., Сиггеп! 0р1шоп ш Сепебск & Оеуе1ортеп1, 9, 1999, с. 191-198

Веппеб К.Р. и др., ВюТесЬтциек, 24, 1998, с. 478-482

Сба1йе М. и др., 8аепсе, 263, 1994, с. 802-805

Сбатоу 8.М. и др., АпбЬобу Еибоп Рго1ешк, изд-во №11еу-Ь1кк 1пс., 1999

Оамек М.У. и др., 1. У1го1., 66, 1992, с. 1924-1932

Эе1дабо 8. и др., ЕМВО 1оита1 17, 1998, с. 2426-2435

Еабк! 8. и др., №.1с1е1с Ас1бк КекеагсЬ, 20, 1992, с. 3-26

Соккеп М. и др., Сигг. 0ρί Вю1есЬ., 5, 1994, с. 516-520

ШЬег О.А. и др., 8отабс Се11 Сепебск, 8, 1982, с. 499-508

Иагпк и др., Рго1еш Рипйсабоп: А Ргасбса1 АрргоасЬ, под ред. Рккиооб и Ηатек, изд-во 1КЬ Ргекк, 1995

Иетапп С. и др., ОХА Се11 Вю1., 13(4), 1994, с. 437-445

Ни 8. и др., Сапсег Кек., 56(13), 1996, с. 3055-3061

ИпПои С. и др., Ргос. N311. Асаб. 8с И8А, 85(16), 1988, с. 5879-5883

1апд 8.К. и др., 1. У1го1., 63, 1989, с. 1651-1660

1епи\\'еб1 Т. и др., №1иге, 385, 1997, с. 269-272

КаиТтап К.1., Мебюбк т Еп/уто1оду, 185, 1990, с. 537-566

К1еЬг Ό. и др., В1осЬет1кбу, 30, 1991, с. 1264-1270

Когб А.А. и др., Рго1еш Епдшеебпд, 10(4), 1997, с. 423-433

Киакк ΈΗ.1. и др., №1иге Вю1есбпо1оду, 21, 2003, с. 553-558

Ь1 О. и др., В1ооб, 100, 2002, с. 3077-3086

Вюапа1убс, под ред. Ьобкрекб Ρ. и 2огЬак Η., изд-во 8рек1гпт Акаб. Уег1., 1998

Ьоуеру В. и др., 8с1епсе, 259, 1993, с. 1288-1293

МсКшдЫ К.А. и др., Р^8, 89, 1992, с. 6943-6947

Мопасо Ь. и др., Сепе, 180, 1996, с. 145-15

Могдап К.А. и др., №1с1ею Ас1бк КекеагсЬ, 20, 1992, с. 1293-1299

Моккег Ό.Ό. и др., ВюТесЬтциек, 22, 1997, с. 150-161

0γ6ζ В.Э. и др., Мо1еси1аг & Се11и1аг В1о1оду, 19, 1999, с. 1901-1909

0γ6ζ В.О. и др., ЕМВО 1., 16, 1997, с. 5037-5045

0ЬкЫта Υ. и др., 1. Мо1. Вю1., 195, 1987, с. 247-259

Раск Р. и др., Вю1есбпо1оду, 11, 1993, с. 1271-1277

Раск Р. и др., 1. Мо1. Вю1., 246(11), 1995, с. 28-34

Ребебег 1. и др., Шипе, 334, 1988, с. 320-325

Реббс О. и др., 8бис1иге, 2, 1994, с. 1217-1226

Р1кааб М.1. и др., Сепек Оеу., 12, 1998, с. 2852-2862

РоЦак Ь. и др., №с1. Ас1бк. Кек., 22, 1994, с. 4386-4394

КатекЬ N. и др., №с1е1с Ас1бк КекеагсЬ, 24, 1996, с. 2697-2700

8атЬгоок 1. и др., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 Со1б 8рппд ИагЬог ЬаЬога1огу, изд-во Со1б 8рппд ИагЕог, №\ν Υо^к, 1989

8аибег К. и Епепке1 В., Вю1есбпо1оду апб Вюепдшеебпд, 89, 2005, с. 530-538

8сорек К., Рго1еш Рипйсабоп, изд-во 8рппдег Уег1ад, 1988

81топкоп С.С. и др., Ргос. №111. Асаб. 8а И8А, 80, 1983, с. 2495-2499

8бе£ А. и др., №1иге, 341, 1989, с. 343-345

8ид1то1о и др., В1о1есбпо1оду, 12, 1994, с. 694-698

Ибуагбу А. и др., 1оита1 о£ Мо1еси1аг Вю1оду, 185, 1985, с. 341-358

Ибуагбу А., ЕМВ0 1., 18, 1999, с. 1-8

Иг1аиЬ С. и др., Се11, 33, 1983, с. 405-412

Иг1аиЬ С. и др., 8отабс Се11 & Мо1еси1аг Сепебск, 12, 1986, с. 555-566 №егпег К.С. и др., А^ζпе^т^бе1-Ρо^ксЬипд, 48, 1998, с. 870-880 №1д1ег М. и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с И8А, 77, 1980, с. 3567-3570

ΥокЬ^ти^а Т., ΡЕВ8 Ьебегк, 244, 1989, с. 487-493

2абп-2аЬа1 М. и др., 1оигпа1 о£ Вю1есбпо1оду, 87, 2001, с. 29-42 №0 97/15664, ЕР-0-393-438, №0 2004/050884, №0 02/081677, И8 6027915, И8 6309851, №0 01/04306, №0 00/34318, №0 00/34326, №0 00/34526, №0 01/27150, И8 5122458, №0 94/05785, №0

- 48 016880

92/08796, №0 94/28143, №0 03/004704

Claims (24)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Нуклеиновая кислота, которая содержит ТЕ-13 (8Е0 ΙΌ N0: 15), или фрагмент ТЕ-13 (8Е0 ГО N0: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное ТЕ-13 (8Е0 ГО N0: 15), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе, причем производное характеризуется степенью идентичности последовательности, которая составляет по крайней мере 85%.
2. 2. Нуклеиновая кислота, которая содержит ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10), или фрагмент ТЕ-13 (8Е0 ГО N0: 10), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10), или комплементарные им нуклеотидные последовательности, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе, причем производное характеризуется степенью идентичности последовательности, которая составляет по крайней мере 85%.
3. 3. Нуклеиновая кислота, которая содержит 8Е0 ГО N0: 1, или фрагмент 8Е0 ГО N0: 1, или комплементарные им нуклеотидные последовательности, или производное 8Е0 ГО N0: 1, или комплементарные им нуклеотидные последовательности, и которая при интеграции в хромосому приводит к усилению транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе, причем фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну область последовательности из области нуклеиновой кислоты, расположенной между 1 и 1578 парой оснований, причем производное характеризуется степенью идентичности последовательности, которая составляет по крайней мере 85%.
4. 4. Нуклеиновая кислота по одному из пп.1-3, отличающаяся тем, что усиление транскрипции или экспрессии представляющего интерес гена в экспрессионной системе по сравнению с контролем, который не содержит ТЕ-элемент, определяют, например, путем измерения титра продукта с помощью ЕЫ8А.
5. 5. Нуклеиновая кислота по п.4, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота имеет длину, составляющую по меньшей мере 511 пар оснований (длина ТЕ-13, 8Е0 ГО N0: 15) или по меньшей мере 1015 пар оснований (длина ТЕ-08, 8Е0 ГО N0: 10).
6. 6. Нуклеиновая кислота по одному из пп.1-5, где нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей ТЕ-00 (8ЕЕ) ГО N0: 2), ТЕ-01 (8ЕЕ) ГО N0: 3), ТЕ-02 (8ЕЕ) ГО N0: 4), ТЕ-03 (8ЕЕ) ГО N0: 5), ТЕ04 (8ЕЕ) ГО N0: 6), ТЕ-06 (8ЕЕ) ГО N0: 8), ТЕ-07 (8ЕЕ) ГО N0: 9), ТЕ-08 (8ЕЕ) ГО N0: 10), ТЕ-10 (8ЕЕ) ГО N0: 12), ТЕ-11 (8ЕЕ) ГО N0: 13), ТЕ-12 (8ЕЕ) ГО N0: 14), ТЕ-13 (8ЕЕ) ГО N0: 15), ТЕ-14 (8ЕЕ) ГО N0: 16), ТЕ-15 (8ЕЕ) ГО N0: 17), ТЕ-16 (8ЕЕ) ГО N0: 18), ТЕ-17 (8ЕЕ) ГО N0: 19), ТЕ-18 (8ЕЕ) ГО N0: 20).
7. 7. Нуклеиновая кислота по п.6, где нуклеиновая кислота представляет собой ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10).
8. 8. Нуклеиновая кислота по п.6, где нуклеиновая кислота представляет собой ТЕ-13 (8Е0 ГО N0: 15).
9. 9. Эукариотический экспрессионный вектор, отличающийся тем, что указанный экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту по одному из пп.1-8.
10. 10. Эукариотический экспрессионный вектор по п.9, отличающийся тем, что он содержит комбинацию нескольких одинаковых или различных нуклеиновых кислот по п.1 до 7-8, где одна или несколько нуклеиновых кислот расположены перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и/или одна или несколько нуклеиновых кислот расположены после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него).
11. 11. Эукариотический экспрессионный вектор по п.10, отличающийся тем, что одна нуклеиновая кислота или несколько нуклеиновых кислот ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10) расположена(ы) перед представляющим интерес геном (т.е. в 5'-направлении относительно него) и одна нуклеиновая кислота или несколько нуклеиновых кислот ТЕ-08 (8Е0 ГО N0: 10) расположена(ы) после представляющего интерес гена (т.е. в 3'-направлении относительно него), предпочтительно одна нуклеиновая кислота ТЕ-08 расположена перед геном и одна после гена.
12. 12. Способ создания эукариотического экспрессионного вектора, отличающийся тем, что интегрируют нуклеиновую кислоту по одному из пп.1-8 в экспрессионный вектор.
13. 13. Эукариотическая клетка-хозяин, отличающаяся тем, что она содержит эукариотический экспрессионный вектор по пп.9-11.
14. 14. Эукариотическая клетка-хозяин по п.13, отличающаяся тем, что она обладает высокой продуктивностью, т.е. она обладает более высокой удельной продуктивностью по сравнению с сопоставимой эукариотической клеткой-хозяином, не содержащей ТЕ-элемент, причем указанная клетка-хозяин характеризуется повышенным вплоть до двух раз, вплоть до трех раз, вплоть до четырех раз, вплоть до пяти раз, вплоть до шести раз, вплоть до семи раз или вплоть до десяти раз или повышенным более чем в два раза, более чем в три раза, более чем в четыре раза, более чем в пять раз, более чем в шесть раз, более

    - 49 016880 чем в семь раз, более чем в десять раз уровнем экспрессии, предпочтительно повышенным вплоть до пяти раз или более чем в три раза уровнем экспрессии.
15. 15. Способ создания высокопродуктивной стабильно трансфектированной линии эукариотических клеток-хозяев, отличающийся тем, что осуществляют стадии, на которых:

    (а) интегрируют нуклеиновую кислоту по одному из пп.1-8 в эукариотический экспрессионный вектор, содержащий представляющий интерес ген;

    (б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором, (в) отбирают высокопродуктивные трансфектированные клетки-хозяева.
16. 16. Способ создания и отбора рекомбинантных клеток млекопитающих, отличающийся тем, что осуществляют стадии, на которых:

    (а) трансфектируют клетки-хозяева генами, которые кодируют, по меньшей мере, представляющий интерес белок/продукт, неомицинфосфотрансферазу, предпочтительно модифицированную, и амплифицируемый селектируемый маркер ΌΗΕΚ, причем для усиления транскрипции или экспрессии, по меньшей мере, представляющий(ие) интерес ген (или гены) функционально связывают по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой по одному из пп.1-8, (б) культивируют клетки в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию различных генов, (в) отбирают такие коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как С418, в не содержащей гипоксантин/тимидин среде, и (г) амплифицируют эти коинтегрированные гены путем культивирования клеток в присутствии селектирующего агента, такого, например, как метотрексат, который позволяет амплифицировать, по меньшей мере, амплифицируемый селектируемый маркерный ген.
17. 17. Способ по п.15 или 16, в котором долю высокопродуктивных клеток увеличивают вплоть до двух раз, вплоть до трех раз, вплоть до четырех раз, вплоть до пяти раз, вплоть до шести раз, вплоть до семи раз или вплоть до десяти раз, или увеличивают более чем в два раза, более чем в три раза, более чем в четыре раза, более чем в пять раз, более чем в шесть раз, более чем в семь или более чем в десять раз, предпочтительно вплоть до пяти раз или более чем в три раза.
18. 18. Способ получения биофармацевтического продукта, отличающийся тем, что осуществляют стадии, на которых:

    (а) интегрируют нуклеиновую кислоту по одному из пп.1-9 в эукариотический экспрессионный вектор, содержащий представляющий интерес ген, (б) трансфектируют эукариотическую клетку-хозяина указанным экспрессионным вектором, (в) отбирают высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина и (г) культивируют полученную высокопродуктивную трансфектированную клетку-хозяина в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию представляющего(их) интерес гена (генов), (д) собирают и очищают представляющий интерес белок.
19. 19. Применение нуклеиновой кислоты по одному из пп.1-8 в качестве лекарственного средства.
20. 20. Применение нуклеиновой кислоты по одному из пп.1-8 для получения лекарственного средства.
21. 21. Применение по п.20, при котором нуклеиновая кислота применяется в качестве элемента, усиливающего транскрипцию при получении биофармацевтического продукта.
22. 22. Применение по п.21, при котором биофармацевтическим продуктом является моноклональное антитело.
23. 23. Применение по п.20, при котором нуклеиновая кислота по одному из пп.1-8 применяется для получения лекарственного средства в генной терапии.
24. 24. Применение нуклеиновой кислоты по одному из пп.1-8 для создания трансгенных животных, которые не являются человеком, или растений.