KR20090046887A - 조절 핵산 요소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA-서열, 특히 전사- 또는 발현-향상 요소(TE 요소), 및 인핸서, 프로모터, 생성물 유전자 및 선별가능 마커와 결합된 발현 벡터상에서 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 서열번호 1 및 TE 요소 TE-01, -02, -03, -04, -06, -07, -08, -10, -11 또는 -12를 기술한다. 이들의 작은 크기로 인하여, TE-06, TE-07 또는 TE-08이 특히 바람직하다. 서열번호 1은 CHO 세포의 Ub/S27a 유전자의 암호화 영역의 상류에 위치한 서열 영역으로부터 기원한다. TE 요소는 진핵생물 게놈, 바람직하게는 CHO-DG44 게놈내로 안정하게 통합되는 경우 생성물 유전자 발현의 증가를 가져온다. 이로써, 염색체 위치 효과가 극복되거나, 차폐되거나 또는 제거된다. 이러한 방식으로, 형질감염 혼합물 중 고 생산자의 비율 및 또한 절대적인 발현 수준이 15배까지 증가된다.
Figure P1020097004079
전사 향상 요소, 발현 향상 요소, 시스-작용성 요소, TE 요소, 발현 벡터

Description

조절 핵산 요소{Regulatory nucleic acid elements}
본 발명은 시스-작용성 핵산 서열, 소위 TE 요소에 관한 것이다. TE 요소는 바람직하게는 CHO 게놈으로부터 기원한다. 발현 벡터내, 예를 들면, 안정한 세포 집단내에서 이들의 사용은 기존에 사용된 벡터와 비교하여 목적한 염색체 좌(locus)내 목적 유전자의 2배 이상 높은 발현을 허용한다.
포유동물 세포는, 해독후 변형이 기능적 및 약력학적 측면 둘다에서 사람-적합성이므로 복합 생약제 단백질의 생산용으로 바람직한 숙주 세포이다. 관련된 주요 세포 유형은 하이브리도마, 골수종, CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포 및 BHK(새끼 햄스터 신장) 세포이다. 숙주 세포는 점차 혈청- 및 단백질-미함유 생산 조건하에서 배양시킨다. 이러한 이유는 관련된 비용 절감, 재조합 단백질의 정제시 감소된 방해 및 병원체(예를 들면, 프리온 및 바이러스)의 도입 가능성의 감소이다. 숙주 세포로서 CHO 세포의 용도는, 이들 세포가 혈청- 및 단백질-미함유 배지내 현탁 성장에 적용되며, 또한 규제 기구에 의해 안전한 생산 세포로서 간주되고 허용 되므로 보다 더 광범위해지고 있다.
이종 목적 유전자를 발현하는 안정한 포유동물 세포주를 생산하기 위하여, 이종 유전자는 바람직한 세포주내에 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)와 같은 선별가능 마커 유전자와 함께, 형질감염에 의해 일반적으로 도입된다. 이종 유전자 및 선별가능 마커 유전자는 개개의 또는 별도의 공동-형질감염된 벡터로부터 시작하여, 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 형질감염 후 2 내지 3일째에, 형질감염된 세포는 선별제, 예를 들면, 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 유전자(NPT 유전자)를 사용하는 경우, G418를 함유하는 배지내로 형질감염시켜 이러한 선별 조건하에서 수주 동안 배양한다. 외인성 DNA가 통합된 출현하는 내성 세포를 분리하여 목적한 유전자 생성물(목적 유전자)의 발현에 대해 시험한다.
생약제 생산을 위해, 높고 안정한 생산성을 갖는 세포주가 요구된다. 생산 세포용 발현 벡터는 강력한, 일반적으로, CMV 인핸서 및 프로모터와 같이 구성적으로 발현하는 프로모터 및 인핸서를 지님으로써, 예를 들면, 높은 생성물 발현을 허용한다. 생성물의 발현은 가능한 장시간에 걸쳐 보증되어야 하므로, 이들의 게놈내에서 안정하게 통합된 생성물 유전자를 갖는 세포를 선별한다. 이는 예를 들면, 네오마이신-포스포트랜스퍼라제(NPT) 및 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)와 같은 선별가능 마커를 사용하여 수행한다.
숙주 세포 게놈내에서 발현 벡터의 우연한 통합에 의해, 목적한 유전자 생성물이 상이한 수준으로 발현되는 세포가 수득되는데, 이의 발현은 앞서의 프로모터 또는 프로모터/인핸서 조합의 강도에 의해서만 결정되는 것이 아니기 때문이다. 통합 부위에 존재하는 염색질 구조는 발현 수준에 부정적인 영향과 긍정적인 영향을 모두 미칠 수 있다. 따라서, 염색질 수준에서 발현에 긍정적인 영향을 미치는 시스-작용성 요소를 점차 발현 벡터내에 통합시킨다. 이들은 예를 들면, β-글로빈 유전자의 5' 영역(참조: Li et al., 2002) 및 TCRα 유전자의 3' 영역에 존재하는 유전자좌 조절 영역(LCR)을 포함한다. 이들은 염색질에 커플링된 도입유전자(transgene)의 높은 조직-특이적 발현을 유발하며, 이는 이의 위치 독립성 및 카피수 의존성에 의해 특징화된다. 이들 특성은, LCR이 이들의 천연 조직내에서 염색질을 개방할 수 있음을 나타낸다(참조: Ortiz et al., 1997). 이들은 β-탈라새미아의 다양한 형태이며, 여기서, β-글로빈 유전자좌는 온전하지만 발현되지 않는다. 발현 결여의 이유는 β-글로빈 유전자의 5' 방향에서의 주요 결실이다. 이러한 β-글로빈 LCR의 결실은 전체 유전자좌에 걸쳐 확장되는 폐쇄된 염색질 구조를 초래하고 유전자 발현의 억제를 초래한다(참조: Li et al., 2002). LCR은 발현하는 세포의 염색질내에 DNAse I-고감작 부위(HS)와 공동-존재한다. HS의 존재는 또한 개방된 염색질을 나타낸다. HS는 전사 인자에 대한 일련의 상이한 일반적인 및 조직-특이적인 결합 부위를 함유한다. 전사 인자와 DNA의 상호작용에 의해, HS의 개방 염색질 구조가 생성된다(참조: Li et al., 2002). 많은 LCR은, 이의 작용이 다른 것으로부터 다소 분리될 수 있는 다수의 HS로 구성되어 있음이 알려져 있다. 예를 들어, TCRα 유전자는 T-세포 조직에서만 내인성 조절하에 발현된다. 당해 유전자좌는 조직 및 발현 상태에 따라 각종 염색질 모드로 존재한다. 3' 영역에서 이는 8개의 HS를 갖는 유전자좌 조절 영역을 갖는다. LCR의 6 kb 부분적 단편인 HS 2 - 6은 염색질-개방 활성을 가지며 조직 특이적이지 않다. 조직 특이성은 HS7, 8 및 1(3 kb)에 의해 흉선에서 T-세포-특이적인 발현에 영향을 미친다. 모든 HS의 완전한 조합에서만 TCRαLCR이 기능적으로 완전하다(참조: Ortiz et al., 1997). TCRαLCR의 개개의 HS 기능의 보다 정확한 세분화 및 세부사항은 문헌(참조: Ortiz et al., 1999)에서 찾을 수 있다. 당해 예는, LCR이 기능적으로 매우 복잡하며 인핸서, 사일런서 및 분리인자(isolator)와 같은 상이한 조절 요소로 구성될 수 있음을 나타낸다. 각종 도메인사이의 LCR 작용의 분류의 다른 예는 TCRγ 유전자좌 및 β-글로빈 유전자좌이다. 전자는 DNAse I-고감작 부위 HsA 및 인핸서 3'ECγ 1으로 구성된다. TCRγ-LCR은 일반적인 기능을 가지는 것 외에도, 또한 TCRγ 유전자의 재조합에 관여하는 것으로 생각된다(참조: Baker et al., 1999). β-글로빈 유전자좌는 완전하게 작용하기 위한 조직-특이적인 프로모터를 또한 필요로 하는 구별가능한 작용을 갖는 5개의 HS를 갖는다. LCR은 DNA의 조직-특이적인 탈메틸화에 다른 중요한 역할을 할 수 있는데, 이는, DNA 메틸화가 폐쇄된 염색질 구조 및 유전자의 불활성화를 초래하기 때문이다. 증가된 히스톤 아세틸화에 의해 유전자 발현을 활성화시키는 활성의 메커니즘이 또한 가능할 수 있다(참조: Li et al., 2002).
스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR; Scaffold/Matrix Attachment Region)은 시험관내에서 매트릭스의 구성요소 또는 세포 핵의 스캐폴드(scaffold)에 고 친화성으로 결합하는 DNA 서열이다. 이들은 염색질 도메인의 구조적이고 아마도 또한 기능적인 경계를 형성한다(참조: Zahn-Zabal et al., 2001). S/MAR은 인핸서와 상 호작용하여 염색질에서 DNA의 접근성을 국지적으로 증가시키며 이러한 방식으로 세포주, 유전자도입(transgenic) 동물 및 식물내에서 안정하게 통합된 이종 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다(참조: Klehr et al., 1991; Stief et al., 1989; Jenuwein et al., 1997; Zahn-Zabal et al., 2001). 그러나, 이들은 위치-독립적 발현을 허용하기 위하여 근처 요소들로부터 염색체 좌를 전체적으로 보호할 수 없다(참조: Poljak et al., 1994). MAR의 효과를 사용하여 형질감염 실험에서 (고도로) 발현하는 세포 클론 또는 유전자도입 동물의 비율을 증가시킬 수 있다(참조: McKnight et al., 1992; Zahn-Zabal et al., 2001). 그러나, MAR은 높은 발현에 영향을 미치지 않으나 발생-특이적인 유전자의 정확한 조절에 중요한 역할을 함이 또한 보고되어 있다(참조: McKnight et al., 1992).
분리인자는 예를 들면, 활성 및 불활성 염색질(경계 요소)사이에서 서로 영향을 미치는 이웃하는 영역 사이의 중성 경계로서 정의된다. 이들은 인핸서의 효과를 제한하거나 이들에 대해 전체 DNA 도메인을 분리시키고 위치 효과로부터 안정하게 형질감염된 리포터 유전자를 보호한다(참조: Bell 및 Felsenfeld, 1999; Udvardy, 1999). 따라서, 이들 요소는 게놈 위치와는 별개로 발현이 되도록 한다. 이들은 또한 선택압의 부재하에서 도입유전자의 사일런싱(silencing)을 방지할 수 있다(참조: Pikaart et al., 1998). 분리인자의 다른 예측된 작용은 복제 영역의 제한이다(참조: Bell and Felsenfeld, 1999). 기술된 첫번째 분리인자는 드로소필라(Drosophila)로부터의 scs 및 scs'이다. 이들은 hsp70 열 쇼크 유전자에 대한 경계를 구성하며 위치 효과를 억제한다(참조: Udvardy et al., 1985).
분리 작용을 갖는 다른 요소로서, CpG 섬을 함유하는, dhfr 유전자(차이니즈 햄스터)로부터의 GC-풍부 단편이 밝혀졌다(참조: Poljak et al., 1994). 당해 단편은 자체로, 리포터 유전자 발현에 영향을 나타내지 않는다. 그러나, 발현 촉진 SAR 및 리포터 유전자사이에 위치하여, 당해 단편은 실질적으로 SAR 요소의 발현-향상 효과를 방지할 수 있다. 가능하게는, 당해 GC-풍부 단편은 SAR 요소의 염색질-개방 메커니즘을 차단하며 결과적으로 분리인자로서 작용한다. 연장된 CPG 섬을 갖는 요소는, 이들이 사이토신을 5-메틸사이토신으로 전환시키는 DNA 메틸트랜스퍼라제에 의해 인지되므로, 보다 높은 확률로 메틸화된다. 결과적으로, 불활성 염색질이 형성된다(참조: Poljak et al., 1994).
아로노우(Aronow)와 동료들은 유전자 카피 수에 의존적이지만 위치 독립성인 발현에 실질적으로 기여하는 새로운 조절 요소를 사람 ADA 유전자(아데노신 데아미나제)의 첫번째 인트론에서 정의하였다(참조: Aronow et al., 1995). 당해 요소는, 크기가 최대 1 kb이며 이것이 200 bp T-세포-특이적인 인핸서와 플랭킹되는 경우에만 기능성이다. 2개의 단편 중 단지 하나만이 존재하거나 단편들이 이들의 서열 및 배향에서 잘못 정렬되어 있는 경우, 상기 요소는 인핸서상에서 DNAse I-고감작성 부위의 형성을 방지하므로 비-기능성이다.
이들의 모 특허 제WO 02/081677호에서 코브라 쎄러퓨틱스(Cobra Therapeutics)사는 다른 염색질-영향 요소를 기술하고 있다. 편재하는 염색질 개방 요소(UCOE; Ubiquitous Chromatin Opening Element)는 편재적으로 발현되는 하 우스홀드(household) 유전자(사람 hnRNP A2 유전자, 사람 β-액틴 유전자, 사람 PDCD2 유전자)를 가진 염색체 영역내 개방 염색질 구조에 관여한다. 이들 유전자 모두는 상대적으로 약하게 메틸화된 비해독 영역내 CpG-풍부 섬을 갖는다. CpG 섬의 메킬화의 부재는, 이 지점에 활성 염색질이 있음을 나타낸다. UCOE는 게놈 환경 및 세포 또는 조직의 특성과는 독립적인 발현의 강도를 제공하는데 도움을 준다.
임뮤넥스(Immunex)사는 또한 발현의 증가를 가져오는 시스-작용성 DNA 서열을 기술한다(참조: 미국 특허 제6,027,915호 및 제6,309,851호). 발현 증강 서열 요소(EASE)로 언급된 요소는 포유동물 세포내에서 재조합 단백질의 높은 발현을 요구하며, 일시적인 발현 시스템에서는 활성이지 않고 LCR 및 S/MAR에서 발견되는 통상의 서열 특성을 갖지 않는다. 이는 또한 개방 판독 프레임을 함유하지 않으므로 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 서열이 아니다. 단편은, 길이가 14.5 kb이며, CHO 세포의 게놈 DNA로부터 기원하고 안정하게 통합된 리포터 유전자의 발현을 8배 증가시킬 수 있다. 요소의 활성의 50% 이상이 1.8 kb 길이의 단편에 제한되는 반면, 당해 단편의 첫번째 600개 염기쌍들은 정확한 작용에 필수적이다. 높은 EASE 활성을 갖는 서열 단편의 추가의 특성은 다수의 HMG-1(Y) 결합 부위의 존재이다. HMG-I(Y) 단백질은 고 이동성 그룹 비-히스톤 염색질 단백질의 계열에 속한다. 이들은 또한 "구조적(architechtonic) 전사 인자"로 언급되며 포유동물 유전자의 트랜스-조절인자의 새로운 범주를 형성한다. HMG-I(Y) 단백질은 80-풍부 서열을 인지하며 작은 DNA 포크(fork)내 이들의 소위 AT 후크(hook)(DNA-결합 도메인)에 결 합한다. 이는 DNA 위상의 국소 변화를 초래하여 결과적으로 변경된 유전자 발현을 초래할 수 있다.
미국 특허 제6,309,841호의 기술가들은, EASE의 효과가 통합된 플라스미드의 MTX-유도된 증폭와 연관된다고 예측하였다. MTX-유도된 유전자 증폭, 소위 파괴 융합 브릿지 주기(breakage fusion bridge cycle)가 일어난다. DNA 파괴의 형성 및 제거를 가져오는 DNA의 구조적 변경에 있어서 HMG-I(Y) 단백질에 대한 역할을 쉽게 상상할 수 있다.
포유동물 세포내에서 유전자 발현을 증가시키는 다른 요소는 문헌(참조: Kwaks et al., 2003)에 기술되어 있다. 이들 소위 STAR 요소(자극 및 항-리프레서 요소)는 500 내지 2100 bp DNA 단편을 갖는 사람 유전자 라이브러리의 스크리닝으로부터 기원한다. 스크리닝은 특별히 설계된 리포터 플라스미드를 사용하여 수행할 수 있었다. 리포터 유전자의 발현은, 이것이 사람 유전자 뱅크로부터의 항-리프레서 요소와 기능적으로 연결되어 있는 경우에만 가능하였다. 이렇게 수득된 STAR 요소를 사용하여 기술가들은 포유동물 세포의 게놈에서 위치 효과로부터 트랜스겐을 보호할 수 있었다. 마우스 게놈과의 비교는, 이들 STAR 요소의 대부분이 사람 및 쥐 게놈 둘다에서 존재하며 이들 2개 종에서 고도로 보존되어 있음을 나타내었다.
목적한 단백질의 높은 발현을 갖는 세포주를 확립하는데 있어서 주요 문제점은 숙주 세포 게놈의 전사-활성 또는 -불활성 유전자좌내 재조합 벡터의 무작위적 및 지시되지 않은 통합으로부터 발생한다. 그 결과, 이종 유전자에 대해 완전히 상이한 발현율을 나타내는 세포 집단이 수득되는 한편, 세포의 생산성은 일반적으로 정규 분포를 따른다. 따라서, 목적한 이종 목적 유전자의 매우 높은 발현을 갖는 세포 클론을 확인하기 위하여, 다수의 클론을 점검하고 시험하는 것이 요구되는데, 이는 많은 시간, 노동 및 비용의 소모를 초래한다. 따라서, 형질감염에 사용되는 벡터 시스템을 향상시키려는 시도는 적합한 시스-작용성 요소의 사용에 의해 안정하게 통합된 도입유전자의 전사를 허용하거나 또는 증가시키는데에 관련된다. 염색질 수준에서 작용하는 시스-작용성 요소는 예를 들면, 이미 기술된 유전자좌 조절 영역, 스캐폴드-매트릭스 부착 영역, 분리인자 등을 포함한다. 이들 요소 중 일부는 주변 염색질의 영향으로부터 특성 유전자를 보호한다. 다른 것은 인핸서-유사 활성을 나타내지만, 이는 안정하게 통합된 작제물에 제한된다. 또 다른 요소들은 자체로 몇가지 이들 작용을 결합한다. 종종, 이들을 특정 그룹으로 명확하게 지정하는 것은 분명히 불가능하다. 따라서, 안정한 세포주에서 유전자도입 생성물 유전자의 발현은 상당한 정도로 염색체 위치 효과의 기초가 된다. 이러한 현상은 염색질 구조 및/또는 외부 DNA의 통합 부위에서 고유의 조절 요소의 존재의 영향에 기초한다. 이는 매우 가변적인 발현 수준을 초래한다. 따라서, 세포 선별 동안, 생성물 발현의 매우 낮거나 또는 전혀 없는 클론이 흔히 생산된다. 이들 염색체 위치 효과는 또한, 높은 수준의 치료학적 단백질을 발현하는 안정한 생산 세포주의 생성이 일반적으로 시간 소모적이고, 고용량 및 고가의 과정이 되는 이유이다. 높은 생산성을 갖는 안정한 세포주는 일반적으로, 종종 제제-유도된 유전자 증폭(예를 들면, 디하이드로폴레이트 리덕타제/메토트렉세이트 또는 글루타민 신테타제/메 티오닌설폭스이민)과 결합된 양성 선별가능 마커를 사용한 선별에 의해 생산된다. 이러한 선별 방법으로 생성된 풀(pool) 및 클론은 복합 스크리닝 과정에서 높고 안정한 발현에 대해 시험된다. 대부분의 클론은 생성물을 생산하지 않거나 또는 단지 평균 양의 생성물을 생산하며 단지 소수만이 고 생산자(high producer)이다. 혼합된 집단에서 고 생산자의 비율을 예를 들면, 선별가능 마커내 돌연변이에 의해 증가시킬 수 있다(참조: Sautter und Enenkel, 2005, WO 2004/050884). 그러나, 각각의 개개 클론의 비생산성(specific productivity) 및 형질감염된 세포 집단내에서 고 생산자의 비율을 추가로 증가시키는 것이 바람직하다.
안정하게 형질감염된 세포, 특히 CHO- 또는 다른 생산-관련 세포의 비생산성, 및 형질감염 배치(batch)내 고 생산자의 비율을 증가시켜야 한다. 이는 보다 효율적인 세포주 개발에 있어서 마지막 분석을 초래할 것이다. 결과적으로 보다 더 많이 생산하는 세포주를 보다 단기간에 확립함으로써 노동, 시간 및 비용을 절약할 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 안정하게 형질감염된 세포내에서 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는, 조절 핵산, 특히, "TE 요소"로 공지된 서열번호 1의 핵산, 또는 이의 단편 또는 유도체에 관한 것이다. 놀랍게도, CHO-DG44 게놈과 같은 숙주 게놈내로의 안정한 통합시 발현 벡터상에서 이러한 종류의 TE 요소를, 프로모터, 생성물 유전자, 선별가능 마커 및 임의로 인핸서와 함께 사용하는 것은, 예를 들면, 염색체 위치 효과를 극복하거나, 보호하거나 또는 제거할 수 있음이 밝혀졌다. 그 결과, 형질감염 배치에서 고 생산자의 비율 및 또한 절대적인 발현 수준이 증가한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 전사- 또는 발현-증가 영역, 단편 또는 유도체, 바람직하게는, TE 요소 TE-00(서열번호 2), TE-01(서열번호 3), TE-02(서열번호 4), TE-03(서열번호 5), TE-04(서열번호 6), TE-06(서열번호 8), TE-07(서열번호 9), TE-08(서열번호 10), TE-10(서열번호 12), TE-11(서열번호 13), TE-12(서열번호 14), TE-13(서열번호 15), TE-14(서열번호 16), TE-15(서열번호 17), TE-16(서열번호 18), TE-17(서열번호 19), TE-18(서열번호 20) 및 TE-21(서열번호 21)을 함유하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이들의 작은 크기의 측면에서, TE-06, TE-07 및 TE-08 및 TE-13(서열번호 15)이 특히 바람직하다.
서열번호 1은 CHO- 세포로부터 분리된 유비퀴틴/S27a 유전자, 세포의 리보좀 대사에 있어 필수적인 단백질을 암호화하는 유전자의 암호화 영역의 상류에 위치한 서열 영역으로부터 기원한다.
지금까지 사용된 발현 벡터와 비교하여 발현 벡터내로의 시스-작용성 TE 요소의 추가의 도입은 안정하게 형질감염된 세포 풀, 특히 CHO-DG44 세포 풀의 최대 7배 더 높은 생산성을 초래한다. 한편, CHO-DG44 세포 풀의 일시적인 형질감염시, TE 요소를 도입시킴에 의해 생산성의 증가는 달성될 수 없다. 따라서, 안정한 세포 풀에서 관측된 생산성의 증가는 TE 요소내 존재하는 인핸서에 기초하지 않는다. 따라서, 염색체 통합은 TE 요소에 의해 유발된 생산성을 증가시키는데 있어 절대적 으로 필수적이다. 이는, TE 요소가 음성 염색체 위치 효과를 억제하거나, 보호하거나 또는 제거할 수 있음을 나타낸다. 그 결과, 시스-작용성 요소가 생성되어 확인되는데, 이는 고 생산 세포를 선별하고 풍부하게 하는 이들의 특정한 적합성에 의해 특징화되므로 고 생산 클론의 분리 및 확인시 시간, 비용 및 용량의 소비를 감소시킬 수 있다.
본 발명을 위한 가능한 적용은 예를 들면, 생약제의 제조, 분석적인 세포-계 검정, 물질의 고효율 스크리닝 또는 NMR 분광학을 위한 재조합 단백질 생성물의 생산, 기타 검정 등에서 요구되는 고 생산 세포주의 개발을 포함한다. 생성물을 거의 발현하지 않거나 또는 전혀 발현하지 않는 세포의 감소 및 높은 비생산성으로 인하여, 고 생산 세포주가 보다 짧은 시간에 확립될 수 있음으로써 노동 및 비용이 절감될 수 있다. 다른 가능한 적용은 강력한 개선된 숙주 세포주(예를 들면, 항-아폽토시스(anti-apoptosis) 또는 글리코실화 유전자의 도입), 유전자도입 동물 또는 식물의 생산 및 유전자 치료요법이다.
본 발명은 선행 기술로부터 유추되지 않는다.
서열번호 1의 핵산은 차이니즈 햄스터[크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)]의 게놈으로부터 분리된 핵산 서열이다. 이는 유비퀴틴/S27a 유전자의 암호화 영역의 상류에 위치한 서열 영역으로부터 유래된다.
서열번호 1의 핵산은, 평균 GC 함량이 44%이고 GC 반복부의 어떠한 길이의 부분도 함유하지 않는다. 당해 GC 함량은 포유동물의 게놈 DNA에 대해 기술된 약 40%의 평균 GC 함량과 비교될 수 있다(참조: Delgado et al., 1998). newcpgseek(EMBOSS 서열 분석 패키지)를 사용한 CpG-풍부 영역의 조사는 CpG 이량체의 절대적으로 증가된 횟수 및/또는 GpC : 서열번호 1의 뉴클레오타이드 2242-2259(18 bp), 3129-3146(18 bp), 3215-3240(26 bp), 3417-3461(44 bp) 및 3658-3788(131 bp)에 대한 CpG의 증가된 비율을 갖는 단지 5개의 매우 짧은 서열 영역을 생성하였다. 이러한 조사 결과는, 핵산 서열이 어떠한 연장된 CpG 섬도 함유하지 않음을 나타낸다. 또한, 서열번호 1은 EMBOSS 프로그램 이탠덤(etandem) 및 이인버티드(einverted)에 의해 확인된 2개의 연속 반복부(뉴클레오타이드 2179-2244 및 뉴클레오타이드 1027-1080) 및 2개의 역 반복부(뉴클레오타이드 8-47 및 뉴클레오타이드 1726-1766)를 함유한다. 따라서, TE-08은 역 반복부를 함유한다. 따라서, 1 bp와 1578bp 사이의 서열에서 하나의 무작위 반복부 및 하나의 역 반복부가 존재한다.
서열번호 1의 핵산의 부분은 제WO 97/15664호에 기술되어 있으며: 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1579 내지 3788는, 하나의 차이를 제외하고는, 제WO 97/15664호로부터의 서열번호 5의 뉴클레오타이드 1 내지 2201에 상응한다. 본 발명에 따른 서열번호 1의 생산 동안, 클로닝 과정의 결과로서, 존재하는 ECORI 절단 부위를 채우는 반응에 의해 형성된 4개의 추가의 뉴클레오타이드가 도입되었다. 추가의 4개의 뉴클레오타이드의 이러한 삽입은 제WO 97/15664호로부터의 서열번호 5의 뉴클레오타이드 357 및 358사이에 위치한다. 그러나, 본 발명으로부터의 서열번호 1의 핵산 서열의 뉴클레오타이드 1 내지 1578은 본 발명의 영역내에서 분리된 지금까지 공지되지 않은 새로운 서열 영역을 구성한다. 또한, 제WO 97/15664호는, 본 발명 으로부터의 서열번호 1 및 이의 단편 또는 유도체가 이들이 기능적으로 연결된 목적 유전자의 전사를 허용하는 프로모터/인핸서에 작동가능하게 연결된 경우 염색체 통합 부위와 관계없이 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시킴을 기술하지 않고 있다. 오히려, 제WO 97/15664호는, 프로모터로서 유비퀴틴/S27a 유전자의 5'UTR 서열의 용도를 기술하고 있으며, 제WO 97/15664호의 도 5에 따른 위치 -161 내지 -45의 서열 영역은 프로모터 활성에 필수적이다. 이러한 서열 영역은 본 발명에 따른 서열번호 1의 핵산 서열 및 서열번호 2(제WO 97/15664호에서 도 5에 따른 위치 -161 내지 -89)를 갖는 이로부터 기원한 단편에 단지 부분적으로 존재한다. 서열번호 1의 다른 단편 및 유도체는 이러한 서열 영역을 전혀 함유하지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 1의 핵산은, BLAST와 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하는 경우, 염색질 수준에서 시스(cis)로 발현에 긍정적인 영향을 미칠 수도 있는 다음 특허원에 기술된 핵산 서열과 서열 상동성을 나타내지 않는다:
a) 제WO 00/05393호로부터의 UCOE 핵산 서열
b) 제6,309,841호로부터의 EASE 핵산 서열
c) 제WO 03/004704호로부터의 STAR 핵산 서열
이러한 핵산 서열 a) 내지 c)에 대해 광범위한 서열 상동성은 보다 복잡한 정렬 방법을 사용하는 경우에도 발견할 수 없었다.
도 1: 기본 벡터의 개략적인 기술
A에 나타낸 벡터를 사용하여 CHO-DG44 세포내에서 재조합 모노클로날 IgG1 항체를 발현시켰다. 이 경우, "E/P"는 CMV 인핸서 및 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터의 조합이며, "P"는 단지 프로모터 요소이고 "T"는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화에 필수적인 전사용 종결 시그날이다. 각각의 전사 단위내에 전사 개시의 위치 및 방향은 화살표로 나타낸다. TE 요소의 클로닝을 위해 SpeI 절단 부위("SpeI")는 프로모터/인핸서 조합의 앞에 존재한다. 증폭가능한 선별가능 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 "DHFR"로 약술된다. 선별가능 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제는 점 돌연변이 D227G를 함유하며 도에서 상응하게 "D227G"로 약술된다. 뇌심근염 바이러스로부터 기원하는 "IRES" 요소는 바이시스트로닉(bicystronic) 전사 단위내에서 내부 리보좀 결합 부위로서 작용하며 다음의 녹색 형광 단백질 "GFP"의 해독을 허용한다. "HC" 및 "LC"는 사람화된 모노클로날 IgG1 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 암호화한다.
B에 나타낸 벡터를 사용하여 CHO-DG44내에서 재조합 단백질 MCP1을 발현시켰다. "E/P"는 CMV 인핸서 및 CMV 프로모터의 조합이고, "P"는 단지 프로모터 요소이며 "T"는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화에 요구되는 전사용 종결 시그날이다. 각각의 전사 단위내에서 전사 개시의 위치 및 방향은 화살표로 나타낸다. TE 요소의 클로닝을 위해, 제한 엔도뉴클레아제[어댑터(adapter)]에 대한 절단 부위를 갖는 서열 영역 "A"를 프로모터 앞에 삽입한다.
선별가능 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제는 점 돌연변이 F240I를 함유 하며 도에서 F240I로 약술된다. 뇌심근염 바이러스로부터 기원한 IRES 요소는 바이시스트로닉 전사 단위내에서 내부 리보좀 결합 부위로서 작용하고 이후의 적색 형광 단백질 "dsRed"의 해독을 허용한다. "MCP-1"은 사람 단핵구 화학유인물질 단백질-1을 암호화한다.
도 2: MCP-1 기본 벡터의 개략적인 기술
당해 도에 나타낸 벡터를 사용하여 CHO-DG44 세포내에서 재조합 단백질 MCP-1을 발현시켰다. "E/P"는 CMV 인핸서 및 CMV 프로모터의 조합이고, "P"는 단지 프로모터 요소이며 "T"는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화에 요구되는 전사용 종결 시그날이다. 각각의 전사 단위내 전사 개시 위치 및 방향은 화살표로 나타낸다. TE 요소의 클로닝을 위해, 제한 엔도뉴클레아제(어댑터)에 대한 절단 부위를 갖는 서열 영역 "A"를 프로모터 앞에 삽입한다. 선별가능 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 도에서 "dhfr"로 약술된다. 뇌심근염 바이러스로부터 기원하는 IRES 요소는 바이시스트로닉 전사 단위내에서 내부 리보좀 결합 부위로서 작용하며 이후의 적색 형광 단백질 "dsRed"의 해독을 허용한다. "MCP-1"은 사람 단핵구 화학유인물질 단백질-1을 암호화한다.
도 3: CHO 유비퀴틴/S27S 유전자의 5' 서열
3788 bp(서열번호 1)을 포함하는 서열 영역을 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포의 게놈으로부터 분리하고 유비퀴틴 단위(Ub)와 작은 리보좀 서브유닛의 리보좀 단백질(S27a)의 융합체인 Ub/S27a 유전자의 암호화 영역의 상류에 위치시킨다.
도 4: TE 요소 00 내지 12의 도식적 기술
당해 도는 CHO 유비퀴틴/S27a 유전자의 암호화 영역의 상류에 위치한, 플라스미드내 서브클로닝된 3788 bp의 게놈 서열 영역을 나타낸다. TE 요소 A로 또한 공지된 당해 게놈 서열(서열번호 1)로부터, 이하 TE 요소로 언급된 상이한 길이의 부분 단편을 제조하였다. TE 요소 00(서열번호 2)을 당해 서열의 서브클론으로부터 Sac II 제한 단편으로서 분리하고 표적 벡터 pBID-HC 및 pBING-LC의 SpeI 절단 부위내로 클로닝하였다. 이는 IgGI의 중쇄(HC) 또는 경쇄에 대한 유전자를 함유하였다(참조: 도 1A). 그 결과, 발현 벡터가 형성되었고, 여기서, TE 요소 00은 프로모터의 상류에 정방향 및 역방향 배향으로 위치한다. TE 요소 01 내지 12를 PCR에 의해 다양한 프라이머 쌍을 사용하여 생성시키고(참조: 도 5 및 6) 기본 플라스미드 pTE4/MCP-1(도 1B) 및 pTE5/MCP-1(도 2)내로 BamHI/BsrGI을 통해 클로닝한다.
도 5: TE 요소 00 내지 12
당해 표는 TE-A 서열(서열번호 1)로부터 생성된 TE 요소 00 내지 21의 시작 및 끝 위치와 크기를 나타낸다. PCR에 의해 생산된 단편의 경우, 사용된 프라이머를 추가로 정의한다. 요소의 크기 등급은 약 500 bp이고 출발 서열 TE-A(서열1)와 비교하여, 5' 또는 3' 말단에서 결실을 갖는다.
도 6: TE 요소 01 내지 12를 합성하기 위한 프라이머
프라이머는 5' 내지 3' 방향으로 나타낸다. 명칭에서 "정방향"을 갖는 프라이머는 서열번호 1의 정방향 배향의 프라이머이며, "역방향"을 갖는 프라이머는 역방향 배향인 것들이다. 각각의 프라이머는 6개 뉴클레오타이드의 5' 말단에 이은 BamHI 또는 BsrGI 절단 부위 및 서열번호 1의 서열 부위와 100% 상동성인 약 20 내지 30개 뉴클레오타이드의 서열로 이루어져 있다. 서열번호 1과 상동성인 프라이머의 영역은 굵은 글씨로 나타낸다. 하나의 정방향 프라이머 및 하나의 역방향 프라이머를 사용하여 서열번호 1의 서열 영역을 증폭시켰다. 수득되는 PCR 생성물을 기본 플라스미드 pTE4/MCP-1(도 1B) 또는 pTE5/MCP-1(도 2)내로 BamHI 및 BsrGI를 통해 클로닝하였다.
도 7: 형질감염 시리즈 B의 FACS 측정
당해 도는 TE 요소 00을 갖지 않은 세포와 비교하여 TE 요소 00을 갖는 세포내에서 GFP 발현의 상대적인 증가를 나타낸다. 이를 위해, TE 요소 00의 존재 및 배향에 있어서만 서로 상이한 CHO-DG4 세포를 플라스미드 조합물 pBING-LC 및 pBID-HC로 형질감염시켰다. 2 내지 3주 후, G418을 첨가하여 HT-미함유 배지내 형질감염된 세포 풀을 선별하여, GFP 형광을 FACS 분석으로 측정하였다. 각각의 그래프는, 형질감염되지 않은 CHO-DG44 세포(DG44)가 음성 대조군 역할을 하는 것을 제외하고는, 각각의 경우에 형질감염 시리즈 B의 10개의 풀로부터 GFP 형광의 평균을 구성한다. 풀 당 20000개의 세포를 연구하였다. "대조군"은 기본 플라스미드 pBING-LC 및 pBID-HC를 말하며, "역방향"은 기본 벡터내 TE 요소 00의 역방향 배향을 나타내는 한편, "정방향"은 기본 벡터내 TE 요소 00의 정방향 배향을 나타낸다.
도 8: 형질감염 시리즈 C의 FACS 측정
당해 도는 TE 요소를 함유하지 않는 세포 집단내 세포와 비교하여, TE 요소 01, 02, 05, 06, 08 또는 09를 함유하는 안정한 세포 집단내 dsRed2-발현 세포의 비율을 나타낸다. 이를 위해, CHO-DG44 세포를 상기 언급된 TE 요소중 하나를 추가로 함유하는 플라스미드 pTE4/MCP-1 또는 이로부터 수득된 유도체로 형질감염시켰다. 대략 3주 후, G418을 첨가하여 배지내 형질감염된 세포 풀을 선별하여, dsRed2 형광을 FACS 분석으로 측정하였다. 10000 세포를 풀당 측정하고 형질감염되지 않은 CHO-DG44 세포의 고유 형광을 감산하였다. 각각의 값은 형질감염 시리즈 C의 6개 풀로부터의 dsRed2-발현 세포의 비율 퍼센트의 평균이다.
도 9: 비생산성에 미치는 TE 요소의 영향
당해 도는 TE 요소를 포함하지 않는 대조군 풀과 비교하여 TE 요소의 존재하의 결과로서 수득된 IgG1 또는 MCP-1의 발현 수준의 변화를 그래프로(A) 또는 표 형태(B)로 나타낸 것이다. 세포 풀은, 각각 TE 요소(정방향 배향의 "00"("00 정방향") 및 역방향 배향("00 역방향"), "01" 내지 "12")를 추가로 함유하는 CHO-DG44 세포의 기본 플라스미드 pBING-LC 및 pBID-HC 또는 pTE4/MCP-1("대조군") 및 이로부터 수득된 유도체를 사용한 안정한 형질감염에 의해 생산하였다. 2 내지 3주 후, G418을 첨가하여 HT-미함유 배지내 (시리즈 A 및 B), 또는 G418을 첨가하여 HT-함유 배지내 (시리즈 C 및 D) 형질감염된 세포 풀을 선별하여 단백질 발현을 세포 배양 상청액 중에서 ELISA로 측정하고 세포당 1일 비생산성을 계산하였다. 안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 배양은 75 cm2 T 플라스크 안에서 2-2-3 일의 계대 리듬을 사용하여 수회 계대배양함으로써 수행하였다. 시리즈 A에서, 플라스미드 조합물 "00 역방향" 및 "00 정방향"으로부터 취한 4개의 풀을 시험하고 대조군 3개 풀을 배양시 8회의 계대배양에 걸쳐 시험하고, 시리즈 B에서는 각각의 플라스미드 조합물의 10개의 혼합물을 6회 계대배양에 의해 시험하고 시리즈 C 및 D에서는 각각의 유형의 플라스미드의 6개 풀을 6회의 계대배양을 통해 시험하였다. 플라스미드 조합물 및 시리즈의 풀의 비생산성을 평균내어 각각의 시리즈에서 대조군의 평균을 1로 설정하였다. TE 요소가 들어있는 풀의 평균 비생산성을 이와 비교하였다.
도 10: DHFR-선별된 세포 풀에서 비생산성에 미치는 TE 요소의 영향
당해 도는 TE 요소가 없는 대조군 풀과 비교하여, TE 요소의 존재하에 수득된 MCP-1의 발현 수준의 변화를 그래프 형태(A) 또는 표 형태(B)로 나타낸 것이다. 세포 풀은, 각각 TE 요소("01" 내지 "12")(시리즈 E)를 추가로 함유하는, 기본 플라스미드 pTE5/MCP-1("대조군") 또는 이로부터 수득된 유도체를 사용한 CHO-DG44 세포의 안정한 형질감염에 의해 생산되었다. 2 내지 3주 후, HT-미함유 배지내 형질감염된 세포 풀을 선별하여 단백질 발현을 세포 배양 상청액 중에서 ELISA로 측정하고 세포당 1일 비생산성을 계산하였다. 안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 배양은 75 cm2 T 플라스크 안에서 2-2-3 일의 계대배양 리듬으로 수회 계대배양하여 수행하였다. 6회 계대배양을 통한 각각의 플라스미드 변이체의 6개 풀을 배양하였다. 플라스미드 변이체의 풀의 비생산성을 평균내고 대조군의 평균을 1로 설정하였다. TE 요소가 들어있는 풀의 평균 비생산성을 이와 비교하였다.
도 11: 인핸서 활성에 대한 TE 요소의 시험
CHO-DG44 세포의 일시적인 형질감염은, TE 요소를 갖는 발현 벡터를 사용하는 경우, TE 요소가 없는 대조군 벡터와 비교하여 MCP-1 역가의 현저한 증가를 나타내지 않았다. 따라서, TE 요소 01 내지 12는 인핸서로서 작용하지 않으므로 단지 염색체내로 통합되는 경우 발현의 현저한 증가를 가져올 수 있다. 6개의 풀을 각각 추가로 aTE 요소("01" 내지 "12")를 함유한 pTE4/MCP-1(대조군) 및 이로부터 수득된 유도체로 형질감염시켰다. 동시에 SEAP 발현 플라스미드를 공동-형질감염시켜 형질감염 효율(SEAP = 분비된 알칼리성 포스파타제)을 측정하였다. 총 3ml의 용적으로 48시간 배양 후, 세포 배양 상청액을 제거하고 MCP-1 역가를 ELISA로 측정하여 SEAP 활성을 측정하였다. MCP-1 역가는 SEAP 발현에 의해 측정된, 형질감염 효율과 관련하여 교정하였다. 당해 도는 6개의 동등한 풀의 평균과 표준 편차 를 나타낸다.
도 12: 기타 TE 요소
따라서, 당해 결과는, 당해 도에 나타낸 서열번호 1의 단편의 선택이 또한 유전자 발현의 증가를 초래할 수 있었음을 나타낸다. 추가의 TE 요소의 클로닝 및 안정한 형질감염에 의해, 서열번호 1을 보다 명확하게 특징화함으로써 기능에 중요한 서열 영역을 보다 정확하게 국재화할 수 있다.
도 13: TE 요소의 상이한 위치 및 조합의 시험
당해 도는, TE 요소의 상이한 위치, 배향 및 조합을 사용하여, 발현의 추가의 증가가 이러한 방식으로 달성될 수 있는지를 시험하는 가능한 발현 벡터의 선택을 나타낸다. TE 요소에 의해 생성물 유전자를 플랭킹시킬 뿐만 아니라, 예를 들면 TE 요소 06 및 08 또는 새로운 TE 요소 13 및 14와 같은 다수의 동일하거나 또는 상이한 짧은 TE 요소를 또한 차례로 연결시킨다.
도 14: 특이적인 MCP-1 발현에 미치는 TE 요소 TE 13 내지 TE 18의 영향
당해 도는 TE 요소가 없는 대조군 풀과 비교하여 TE 요소의 존재하에 수득된 MCP-1의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸다. 세포 풀은 CHO-DG44 세포를 각각 TE 요소("13" 내지 "18")(시리즈 F)를 추가로 함유하는 기본 플라스미드 pTE4/MCP-1("대조군") 또는 이로부터 수득된 유도체를 사용한 안정한 형질감염에 의해 생산 하였다. 2 내지 3주 후, HT-보충된 배지 +G418(400 ㎍/ml) 중 형질감염된 세포 풀을 선별하여, 단백질 발현을 ELISA에 의해 세포 배양 상청액 중에서 측정하고 세포당 1일 비생산성을 계산하였다. 안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 배양은 75 cm2 T 플라스크 안에서 2-2-3 일의 계대배양 리듬으로 수회 계대배양하여 수행하였다. 각각의 플라스미드 변이체 중, 4개의 풀을 5 내지 6회의 계대배양에 걸쳐 배양하였다. 플라스미드 변이체의 풀의 비생산성을 평균내고 대조군의 평균을 1로 설정하였다. TE 요소가 들어있는 풀의 평균 비생산성을 이와 비교하였다.
도 15: MCP-1의 발현시 다양한 조합 및 다양한 위치에서 TE 요소의 영향
당해 도는 TE 요소가 없는 대조군 풀과 비교하여 상이한 TE 요소의 존재 및 조합으로부터 생성되는 MCP-1의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸다. 세포 풀은 CHO-DG44 세포를 1개 또는 2개의 TE 요소("06 및 08, 08역방향, 09역방향, A")(시리즈 G)를 추가로 함유하는 기본 플라스미드 pTE4/MCP-1("대조군") 또는 이로부터 수득된 유도체를 사용한 안정한 형질감염에 의해 생산되었다. 2 내지 3주 후, HT-보충된 배지 +G418(300 ㎍/ml) 중 형질감염된 세포 풀을 선별하여 단백질 발현을 ELISA로 세포 배양 상청액 중에서 측정하고 세포당 1일 비생산성을 계산하였다. 안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 배양을 6-웰 플레이트(MAT6) 안에서 2-2-3 일의 계대배양 리듬으로 수회 수행하였다. 각각의 플라스미드 변이체 중, 6개의 풀을 6회의 계대배양에 걸쳐 배양하였다. 플라스미드 변이체의 풀의 비생산성을 평균내고 대조군의 평균 값을 1로 설정하였다. TE 요소가 있는 풀의 평균 비 생산성을 이와 비교하였다.
도 16: TE 요소 TE-08과 IGG-4 항체의 시험
당해 도에서 나타낸 벡터를 사용하여 CHO-DG44 세포에서 재조합 모노클로날 IgG4 항체를 발현시켰다. 이 경우에 E/P는 CMV 인핸서 및 프로모터의 조합이며, P는 단지 프로모터 요소이고 T는 전사에 대한 종결 시그날이며, 이는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화에 요구된다. 각각의 전사 단위내 전사 개시의 위치 및 방향은 화살표로 나타낸다. 경쇄(LC2 또는 LC3) 및 중쇄(HC2 또는 HC3)에 대한 유전자를 MCP-1 - IRES - dsRed2 카세트(도 1B 및 2)에 대한 교환시 클로닝하였다. 이들은 각각 사람화된 모노클로날 IgG-4 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다. 증폭가능한 선별가능 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 "dhfr"로 축약된다. 선별가능 마커 네오마이신포스포트랜스퍼라제는 점 돌연변이 F240I를 함유하며 도에서 F240I로 축약된다.
본 발명의 본 설명의 범위내에서 사용된 용어들 및 정의들은 이후 정의된 다음 의미를 갖는다. 일반적인 용어 "함유하는" 또는 "함유하다"는 보다 특정한 용어인 "~로 이루어진"을 포함한다. 또한, 용어 "단일 수" 및 "다수"는 제한적으로 사용되지 않는다.
용어 "TE 요소"는 조절 핵산을 나타낸다.
용어 "TE 요소" 또는 "발현-향상 요소" 또는 "전사 향상 요소" 또는 "발현 또는 전사 향상 핵산 요소"는 시험에서 같은 뜻으로 사용된다. 이들 용어 모두는 조절 핵산 서열을 말한다.
"TE 요소" 또는 "발현 향상 요소" 또는 "전사 향상 요소" 또는 "발현 또는 전사 향상 핵산 요소"는 차이니즈 햄스터(크리세툴루스 그리세우스)의 게놈으로부터 분리된 이에 대한 상보적 서열을 포함하는, 특히 서열번호 1, 또는 서열번호 1의 특정 부분, 단편 또는 이의 영역 또는 유도체 또는 염색체내로 안정하게 통합되는 경우 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 초래하는 이의 부분, 단편 또는 영역들 중 하나를 의미한다. 또한, 최종적으로 어떠한 목적한 배향으로 및 서로에 대해 특정의 목적한 공간으로 배열될 수 있거나 또는 다른 조절 서열과 조합될 수 있고 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 서열번호 1의 다수의 동일하거나 또는 상이한 부분, 단편, 영역 또는 유도체들로 이루어진 서열번호 1의 부분, 단편, 영역 또는 유도체들의 임의의 목적한 조합을 의미한다. 용어 "TE 요소"는 서열번호 1 자체 및 이의 임의의 목적한 단편, 부분, 영역 또는 유도체를 말할 수 있다.
또한, 용어 "TE 요소", "전사 향상 또는 발현 향상 핵산 요소" 또는 단편, 부분, 영역 또는 이의 유도체는 차이니즈 햄스터(크리세툴루스 그리세우스)의 서열의 부분 외에도, 다른 유기체로부터의 상응하는 기능성 동종 뉴클레오타이드 서열에 상응한다. 이들 다른 유기체의 예는 사람, 마우스, 랫트, 원숭이 및 기타 포유동물 및 설치류, 파충류, 조류, 어류 및 식물을 포함한다.
"단편" 또는 "부분" 또는 "영역"(이들 용어들은 동의어로 사용된다)은 서열번호 1의 부분에 대한 이의 서열 또는 이의 상보적 서열과 100% 동일한 핵산 분자(일본쇄 또는 이본쇄)를 의미한다. 제한 효소를 사용한 분해 또는 PCR로 생산된 단편의 클로닝은 단편의 말단 영역에서 변형, 즉, 첨가 또는 부재하는 뉴클레오타이드 또는 충전 또는 파괴 반응의 결과로서 프라이머를 통해 추가로 도입된 뉴클레오타이드를 초래할 수 있다. 단편의 말단 영역내 이러한 변화는, 심지어 이들 서열 영역이 서열번호 1과 100% 미만의 동일성을 갖는 경우에도 단편의 정의에 포함된다. 서열번호 1의 "부분" 또는 "단편" 또는 "영역"은 예를 들면, TE-00(서열번호 2), TE-01(서열번호 3), TE-02(서열번호 4), TE-03(서열번호 5), TE-04(서열번호 6), TE-05(서열번호 7), TE-06(서열번호 8), TE-07(서열번호 9), TE-08(서열번호 10), TE-09(서열번호 11), TE-10(서열번호 12), TE-11(서열번호 13), TE-12(서열번호 14), TE-13(서열번호 15), TE-14(서열번호 16), TE-15(서열번호 17), TE-16(서열번호 18), TE-17(서열번호 19), TE-18(서열번호 20), TE-21(서열번호 21)을 포함한다. 바람직하게는, 안정한 염색체 통합을 사용하여, 단편은 기능적으로 연결된 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시킨다. 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키는 서열번호 1의 "부분" 또는 "단편" 또는 "영역"은 예를 들면, TE-00(서열번호 2), TE-01(서열번호 3), TE-02(서열번호 4), TE-03(서열번호 5), TE-04(서열번호 6), TE-06(서열번호 8), TE-07(서열번호 9), TE-08(서열번호 10), TE-10(서열번호 12), TE-11(서열번호 13), TE-12(서열번호 14), TE-13(서열번호 15), TE-14(서열번호 16), TE-15(서열번호 17), TE-16(서열번호 18), TE-17(서열번호 19), TE-18(서열번호 20) 및 TE-21(서열번호 21)이다. 그러나, 용어 "단편"은 또한 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키는 임의의 목적한 배향의 서열번호 1의 모든 가능한 다른 부분, 특히, TE-00(서열번호 2)의 5' 영역내에 전체적으로 또는 적어도 부분적으로 존재하는 것들을 포함한다. 이는 서열번호 1의 1 bp 내지 1578 bp사이의 부분 영역에 상응한다. 또한 단편 TE-08(서열번호 10)이 바람직하다.
"유도체"는 본 발명에서는, 서열번호 1 또는 이에 대한 상보적 서열 또는 서열번호 1의 부분 또는 단편 또는 영역 또는 이에 대한 상보적 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 85% 동일 상동성, 특히 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지며, 염색체 통합시 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 핵산 분자(일본쇄 또는 이본쇄)를 의미한다. 서열번호 1로부터의 서열 차이는 한편 다른 유기체로부터의 상동성 내인성 뉴클레오타이드 서열의 차이를 기준으로 할 수 있다. 다른 한편, 이들은 또한 핵산 서열의 의도적인 변형, 예를 들면, 하나 이상의 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 삽입 또는 결실을 기준으로 할 수 있다. 결실, 삽입 및 치환 돌연변이체는 "부위-특이적인 돌연변이유발" 및/또는 "PCR-기초 돌연변이유발 기술"로 생산할 수 있다. 상응하는 방법은 문헌[참조: Lottspeich and Zorbas(1998; Chapter 36.1 추가의 참조문헌과 함께)에 예시적으로 기술되어 있다. 서열 동일성은 예를 들면, "BLAST" [참조: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J.(1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J.(1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141; Zhang, J. & Madden, T.L.(1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7:649-656]와 같은 소위 표준 정렬 알고리즘을 사용하여, 참조 서열, 당해 경우에는 서열번호 1과 일치시킬 수 있다. 서열은, 이들이 연속성에 있어 상응하고 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 확인할 수 있는 경우 일치하는 것이다.
"유도체"는 또한 본 발명에 따라, 서열번호 1 또는 서열번호 1의 단편 또는 부분 또는 영역 또는 이에 대한 서열 상보성의 서열과 하이브리드화하는 핵산 분자(일본쇄 또는 이본쇄)를 의미한다. 바람직하게는, 하이브리드화는 엄중한(stringent) 하이브리드화 및 세척 조건(예를 들면, 5x SSC를 함유하는 완충액 속에서 65℃에서 하이브리드화; 42℃에서 0.2x SSC/0.1% SDS를 사용한 세척)하에 수행한다. 상응하는 기술은 예를 들면, 문헌(참조: Ausubel et al., 1994)에 기술되어 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 부분 또는 단편 또는 영역은 뉴클레오타이드 위치 1 bp 내지 1578 bp의 서열 영역의 전부 또는 적어도 일부분을 포함한다. 이는 TE-00 서열(서열번호 2)의 서열 영역 5'에 상응한다. 단편 TE-08(서열번호 10)이 또한 바람직하다.
용어 "변이체"는 특정 형질감염 혼합물에 사용되는 발현 벡터를 말한다. 이들은 기본 벡터(pTE4/MCP-1 또는 pTE5/MCP-1) 또는 기본 벡터 조합물(pBING-LC + pBID-HC)을 포함하며 또한 하나 이상의 TE 요소를 상이한 위치, 조합 및 배향으로 함유하는 기본 벡터를 포함한다.
프라이머의 경우, 용어 "배향"은 서열번호 1과 관련하여 프라이머의 정렬을 말한다. 서열 순서가 서열번호 1에 나타낸 5'-3' 순서의 서열에 상응하는 모든 프라이머(=정방향 프라이머)는 "정방향 배향"으로 또한 언급되는 당해 서열과 동일한 배향이다. 서열이 서열번호 1로 제공된 서열과 상보적인 프라이머(=역방향 프라이머)는 당해 서열과 반대 배향이며, 이는 또한 "역방향 배향"으로 언급된다. TE 요소와 관련하여, 본 발명에서, 용어 "배향"은 목적 유전자와 관련한 정렬을 말한다. 서열번호 1하에 제공된 서열은 유비퀴틴/S27a 유전자를 암호화하는 영역으로부터 5'에 위치한(이는 또한 "상류"로 언급된다) 게놈 서열을 나타낸다. 다음 유비퀴틴/S27a 유전자의 암호화 영역의 방향으로 서열번호 1에 나타낸 서열의 연속은 당해 유전자의 개시 코돈에 이를 것이다. 따라서, 이러한 정렬은 "정방향 배향"으로 언급된다. 유사하게, 본 발명에서, TE 요소는 서열번호 1에 나타낸 서열 또는 이의 임의의 목적한 부분, 단편, 영역 또는 유도체가 발현 벡터내에서 동일한 DNA 쇄 상에 목적 유전자의 개시 코돈으로서 존재하는 경우, 정방향 배향으로 존재한다. 대조적으로, 서열번호 1과 상보적인 서열, 또는 이의 임의의 목적한 부분, 단편, 영역 또는 유도체가 발현 벡터내에서 동일한 DNA 쇄 상에 목적 유전자의 개시 코돈으로서 존재하는 경우, TE 요소는 "역방향 배향"으로 존재한다. 달리 언급하지 않는 한, TE 요소가 언급되는 경우, 두 배향, 즉, 정방향 및 역방향 배향 둘다를 항상 포함하고/의미한다.
"염색체 통합"은 임의의 목적한 핵산 서열이 게놈내로, 즉, 세포의 염색체내로 통합되는 것을 의미하며, 이러한 통합은 임의로 하나 이상의 염색체내로 임의의 목적한 횟수, 위치 및 배향으로 이루어진다. 또한, 용어 "염색체 통합"은 임의의 목적한 핵산 서열의 합성, 인공 또는 미니-염색체내로의 통합을 포함한다.
목적 유전자:
본 발명에 따른 발현 벡터내에 함유된 목적 유전자는 목적 생성물을 암호화하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 유전자 생성물 또는 "목적 생성물"은 일반적으로 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체이다. 그러나, 이는 또한 RNA 또는 안티센스 RNA일 수 있다. 목적 유전자는 이의 완전한 길이로, 짧은 형태로, 융합 유전자로서 또는 표지된 유전자로서 존재할 수 있다. 이는 게놈 DNA 또는 바람직하게는 cDNA 또는 상응하는 단편 또는 융합체일 수 있다. 목적 유전자는 천연 유전자 서열일 수 있거나, 또는 이는 돌연변이되거나 또는 달리 변형될 수 있다. 이러한 변형은 특정 숙주 세포 및 사람화에 적용하기 위한 코돈 최적화를 포함한다. 목적 유전자는, 예를 들면, 분비되거나, 세포질에 존재하거나, 핵에 위치하거나, 막에 결합되거나 또는 세포 표면에 결합되는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
용어 "뉴클레오타이드 서열", "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편, 및 일본쇄 또는 이본쇄로 존재하는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 나타내며 유전자의 암호화 또는 비-암호화 쇄를 나타낼 수 있다. 핵산 서열은 부위-특이적인 돌연변이유발 또는 PCR-매개된 돌연변이유발(예를 들면, 문헌: Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1994에 기술됨)과 같은 표준 기술을 사용하여 변형시킬 수 있다.
"암호화"는 핵산, 예를 들면, 염색체내 유전자 또는 mRNA내 뉴클레오타이드의 특정 서열의, 예를 들면, 생물학적 과정에서 rRNA, tRNA, mRNA, 기타 RNA 분자, cDNA 또는 폴리펩타이드와 같은 거대 분자 및 다른 중합체의 합성용 매트릭스로서 작용하는 특성 또는 능력을 의미한다. 따라서, 목적한 단백질이 mRNA의 전사 및 후속적인 해독에 의해 다른 생물학적 시스템 또는 세포내에서 생산되는 경우 유전자는 단백질을 암호화하는 것이다. 이의 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 데이터뱅크, 예를 들면, EMBL 또는 GenBank에서 제공되는 암호화 쇄, 및 또한 전사용 매트릭스로서 작용하는 유전자 또는 cDNA의 비-암호화 쇄 둘다는 생성물 또는 단백질을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 축퇴 유전자 코드를 기준으로 상이한 순서의 뉴클레오타이드 서열을 가지나 단백질의 동일한 아미노산 서열을 초래하는 핵산을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 또한 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "cDNA"는 유전자로부터 생성된 mRNA 또는 기타 RNA로부터의 제2 DNA 쇄의 역 전사 및 합성에 의해 제조된 데옥시리보핵산을 나타낸다. cDNA가 이본쇄 DNA 분자로 존재하는 경우, 이는 암호화 및 비-암호화 쇄 둘다를 함유한다.
용어 "인트론"은 임의의 길이의 비-암호화 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이들은 다수의 진핵생물 유전자내에 자연적으로 존재하며 스플라이싱으로 공지된 과정에 의해 이미 전사된 mRNA 전구체로부터 제거된다. 이들은 성공적인 단백질 합성을 위한 정확한 판독 프레임을 갖는 성숙한 프로세싱된 mRNA를 생산하기 위해 5' 및 3' 말단에서 인트론의 정확한 절단 및 수득되는 mRNA 말단의 정확한 결합을 필요로 한다. 당해 스플라이싱 과정에 관련된 많은 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자 부위, 즉, 엑손-인트론 또는 인트론-엑손 경계면에 바로 위치한 서열은 현재 특성규명되어 있다. 이에 대한 고찰은 문헌(참조: Ohshima et al., 1987)을 참조한다.
목적 단백질/생성물
생약제학적 중요성을 갖는 단백질/폴리펩타이드는 예를 들면, 항체, 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 효능제 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료학적 또는 진단학적 적용성을 갖는 모든 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 다른 목적 단백질은, 예를 들면, 소위 "세포 조작"의 범위내에서 숙주 세포의 특성을 변화시키는데 사용되는, 항-아폽토시스 단백질, 샤페론, 대사 효소, 글리코실화 효소 및 이의 유도체 또는 단편과 같은 단백질/폴리펩타이드이지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "폴리펩타이드"는 아미노산 서열 또는 단백질에 대해 사용되며 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 말한다. 당해 용어는 또한 글리코실화, 인산화, 아세틸화 또는 단백질 프로세싱과 같은 반응에 의해 해독 후에 변형된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 구조는, 자체의 생물학적 활성을 유지하면서, 예를 들면, 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 및 다른 단백질과의 융합에 의해 변형될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 다량체화되어 호모머(homomer) 또는 헤테로머(heteromer)를 형성할 수 있다.
치료학적 단백질의 예는 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 사람 성장 호르몬(hGH) 및 기타 성장 인자, 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토카인, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18과 같은 인터루킨(IL), 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, TNF-알파, 베타 또는 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF를 포함한다. 다른 예는 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc' 단편, 면역글로불린 경쇄(L) 및 중쇄(H) 및 이의 불변, 가변 또는 초가변 영역, 및 Fv 및 Fd 단편(참조: Chamov et al., 1999)과 같은, 모노클로날, 폴리클로날 다특이적인 및 단일쇄 항체 및 이의 단편이다. 항체는 사람 또는 비-사람 기원일 수 있다. 사람화된 키메라 항체가 또한 가능하다.
Fab 단편(단편 항원 결합 = Fab)은 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지된 두 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 예를 들면, 파파인과 같은 프로테아제로 처리하거나 또는 DNA 클로닝함으로써 통상의 항체로부터 생산할 수 있다. 다른 항체 단편은 펩신을 사용한 단백질분해로 생산될 수 있는 F(ab')2 단편이다.
유전자 클로닝에 의해 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역만으로 이루어진 짧아진 항체 단편을 제조하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편(가변 단편 = 가변 부분의 단편)으로 공지되어 있다. 불변 쇄의 시스테인 그룹을 통한 공유 결합이 이러한 Fv 단편에서 불가능하므로, 이들은 흔히 다소 다른 방법으로 안정화된다. 이를 위해, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 흔히 약 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개 아미노산의 짧은 펩타이드 단편을 사용하여 함께 연결된다. 이는, VH 및 VL이 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 단일 폴리펩타이드 쇄를 생산한다. 이러한 항체 단편은 또한 단일쇄 Fv 단편(scFv)으로 언급된다. scFv 항체의 예는 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Huston et al., 1988]에 기술되어 있다.
과거 수년 동안 각종 방법이 다량체성 scFv 유도체를 생산하기 위해 개발되어왔다. 본 발명은 향상된 약력학적 특성 및 증가된 결합능을 갖는 재조합 항체를 생산하기 위한 것이다. scFv 단편의 다량체화를 달성하기 위하여, 이들은 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 생산된다. 다량체화 도메인은 예를 들면, 류신 지퍼(Leucine Zipper) 도메인과 같은 IgG 또는 나선 구조("코일형 코일 구조")의 CH3 영역일 수 있다. 다른 방법에서는 scFv 단편의 VH와 VL 영역 사이의 상호작용을 다량체화(예를 들면, 디아바디(diabody), 트리바디(tribody) 및 펜타바디(pentabody))에 사용한다.
용어 "디아바디(diabody)"는 당해 분야에서 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 나타내는데 사용된다. scFv 분자내에서 5 내지 10개 아미노산으로 짧아진 펩타이드 링커는 VH/VL 쇄를 겹침으로써 동종이량체를 형성시킨다. 디아바디는 또한 삽입된 이황화 브릿지에 의해 안정화될 수 있다. 디아바디의 예는 예를 들면, 문헌(Perisic et al., 1994)에서 찾을 수 있다.
용어 "미니바디(minibody)"는 당해 분야에서 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 나타내는데 사용된다. 이는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 이량체화 영역으로서 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 이는 scFv 단편을 또한 IgG의 힌지 영역, 및 링커 영역을 사용하여 연결한다. 이러한 미니바디의 예는 문헌(참조: Hu et al., 1996)에 기술되어 있다.
용어 "트리아바디(triabody)"는 3가의 동종삼량체 scFv 유도체(참조: Kortt et al., 1997)를 나타내는데 사용된다. 링커 서열의 사용없이 VH-VL의 직접적인 융합은 삼량체를 형성시킨다.
2가, 3가 또는 4가 구조를 갖는 미니 항체로 당해 분야에 공지된 단편은 또한 scFv 단편의 유도체이다. 다량체화는 이량체, 삼량체 또는 사량체의 코일형 코일 구조를 사용하여 달성된다(참조: Pack et al., 1993 및 1995; Lovejoy et al., 1993).
형광 단백질을 암호화하는 유전자:
다른 양태에서 본 발명에 따른 발현 벡터는 목적 유전자에 기능적으로 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 함유한다. 바람직하게는, 유전자 둘다는 단일의 이종 프로모터의 제어하에 전사됨으로써 목적 단백질/생성물이 바이시스트로닉 mRNA에 의해 암호화된다. 이는 목적 단백질/생성물을 다량으로 생산하는 세포를 형광 단백질의 발현율에 의해 확인할 수 있도록 한다. 또는, 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 전사는 자체의 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.
형광 단백질은 예를 들면, 녹색, 청녹색, 청색, 황색 또는 다른 색깔의 형광 단백질일 수 있다. 하나의 특정 예는 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 또는 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 및 이로부터 개발된 돌연변이체로부터 수득된 녹색 형광 단백질(GFP)이다[참조: 예를 들면 Bennet et al., 1998; Chalfie et al., 1994; WO 01/04306 및 여기에 인용된 문헌].
이들을 암호화하는 다른 형광 단백질 및 유전자는 본원에 참고로 인용된 제WO 00/34318호, 제WO 00/34326호, 제WO 00/34526호 및 제WO 01/27150호에 기술되어 있다. 이들 형광 단백질은 안토조아(Anthozoa) 종, 예를 들면, 아네모니아 마자노(Anemonia majano), 클라불라리아 종(Clavularia sp .), 조안투스 종(Zoanthus sp.) I, 조안투스 종(Zoanthus sp .) II, 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata), 디스코소마 종(Discosoma sp .) "레드(red)", 디스코소마 종 "그린(green)", 디스코소마 종 "마겐타(Magenta)", 아네모니아 술카타(Anemonia sulcata), 아에쿠오레아 코에룰레센스(Aequorea coerulescens)의 비-생발광 유기체의 형광단이다.
본 발명에 따라 사용된 형광 단백질은 야생형 단백질 외에도 천연적으로 또는 유전자 조작된 돌연변이체 및 예를 들면, 다른 단백질 또는 펩타이드와 융합된 이의 변이체, 단편, 유도체 또는 변이체를 함유한다. 사용된 돌연변이는 여기 또는 방사 스펙트럼, 발색단의 형성, 단백질의 발광 계수 또는 안정성을 변경시킬 수 있다. 또한, 포유동물 세포 또는 기타 종에서의 발현은 코돈 최적화로 향상시킬 수 있다. 본 발명에 따라서, 형광 단백질을 또한 선별가능 마커, 바람직하게는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)와 같은 증폭가능한 선별가능 마커와 융합시켜 사용할 수 있다.
형광 단백질에 의해 방사된 형광은 예를 들면, 형광-활성화된 세포 분류기(FACS)를 사용한 유세포 분석법 또는 형광 현미경에 의한 단백질 검출을 가능하게 한다.
기타 조절 요소:
발현 벡터는 목적 유전자 및 바람직하게는 형광 단백질의 발현을 허용하는 하나 이상의 이종 프로모터를 함유한다.
용어 "프로모터"는 이에 기능적으로 연결된 유전자 또는 서열의 전사를 허용하고 조절하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 프로모터는 RNA 폴리머라제를 결합시키기 위한 인식 서열 및 전사용 개시 부위(전사 개시 부위)를 함유한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포내에서 목적한 서열을 발현시키기 위해서는 적합한 기능성 프로모터를 선택해야 한다. 숙련자들은 구성적, 유도성 및 억제성 프로모터를 포함하는, 다양한 공급원으로부터의 각종 프로모터에 익숙할 것이다. 이들은 예를 들면, GenBank와 같은 데이터뱅크에 기탁되어 있으며, 시판되거나 개개의 공급원으로부터 폴리뉴클레오타이드 서열내에 클로닝된 별개의 요소 또는 요소들로서 입수할 수 있다. 유도성 프로모터에서 프로모터의 활성은 시그날에 반응하여 감소되거나 증가될 수 있다. 유도성 프로모터의 하나의 예는 테트라사이클린(tet) 프로모터이다. 이는 테트라사이클린-조절된 전사활성인자 단백질(tTA)에 의해 유도될 수 있는 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO)을 함유한다. 테트라사이클린의 존재하에서, tetO에 대한 tTA의 결합이 억제된다. 다른 유도성 프로모터의 예는 jun, fos, 메탈로티오네인 및 열 쇼크 프로모터이다(참조: Sambrook et al., 1989; Gossen et al., 1994).
진핵세포에서 고 발현용으로 특히 적합한 프로모터 중에서는, 예를 들면, 햄스터(WO 97/15664)의 유비퀴틴/S27a 프로모터, SV 40 얼리(early) 프로모터, 아데노바이러스 주요 레이트(major late) 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부 영역, 사람 사이토메갈로바이러스의 얼리 프로모터가 있다. 다른 이종의 포유동물 프로모터의 예는 액틴, 면역글로불린 또는 열 쇼크 프로모터(들)이다.
상응하는 이종 프로모터는 다른 조절 서열에 기능적으로 연결되어 발현 카세트내 전사 활성을 증가/조절할 수 있다.
예를 들면, 프로모터는 인핸서 서열에 기능적으로 연결되어 전사 활성을 증가시킬 수 있다. 이를 위해, 하나 이상의 인핸서 및/또는 인핸서 서열의 다수의 카피, 예를 들면, CMV 또는 SV40 인핸서를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 발현 벡터는, 다른 양태에서, 하나 이상의 인핸서/인핸서 서열, 바람직하게는 CMV 또는 SV40 인핸서를 함유한다.
용어 "인핸서"는, 시스 위치에서 프로모터의 활성에 작용함으로서 이러한 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자의 전사를 자극하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 프로모터와는 달리 인핸서의 효과는 위치 및 배향과는 독립적이므로 이들은 전사 단위의 앞 또는 뒤에, 인트론내에 또는 심지어 암호화 영역내에 위치할 수 있다. 인핸서는 전사 단위에 바로 근접한 위치 및 프로모터로부터 매우 떨어진 위치에 위치할 수 있다. 프로모터와 물리적 및 작용적 오버랩을 갖는 것 또한 가능하다. 숙련자들은 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들면 ATCC에 기탁되거나 시판되는 개개의 공급원으로부터 수득된)내 클로닝된 요소들 또는 독립적인 요소들로서 이용가능한 각종 공급원(및 GenBank와 같은 데이터뱅크에 기탁된, 예를 들면, SV40 인핸서, CMV 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서)으로부터의 다수의 인핸서를 인지할 것이다. 다수의 프로모터 서열은 또한 흔히 사용되는 CMV 프로모터와 같은 인핸서 서열을 함유한다. 사람 CMV 인핸서는 지금까지 확인된 가장 강력한 인핸서중 하나이다. 유도성 인핸서의 하나의 예는 글루코코르티코이드 또는 중금속에 의해 자극될 수 있는 메탈로티오네인 인핸서이다.
다른 가능한 변형은, 예를 들면, 다중 Sp1 결합 부위의 도입이다. 프로모터 서열은 또한 전사 활성의 제어/조절을 허용하는 조절 서열과 조합될 수 있다. 따라서, 프로모터는 억제성/유도성이 될 수 있다. 이는 예를 들면, 상향- 또는 하향-조절 전사 인자에 대한 결합 부위인 서열에 연결시켜 수행할 수 있다. 위에서 언급한 전사 인자 Sp1은, 예를 들면, 전사 활성에 긍정적인 효과를 갖는다. 다른 예는 전사에 긍정적 및 부정적 둘다로 작용할 수 있는 활성인자 단백질 AP1에 대한 결합 부위이다. AP1의 활성은 예를 들면, 성장 인자, 사이토카인 및 혈청과 같은 모든 종류의 인자에 의해 조절될 수 있다(참조: Faisst et al., 1992 및 이에 인용된 참조 문헌). 전사 효율은 또한 프로모터 서열을 1개, 2개, 3개 이상의 염기의 돌연변이(치환, 삽입 또는 결실)에 의해 변화시킨 후 리포터 유전자 검정에서 이들이 프로모터 활성을 증가시켰는지를 측정함으로써 증가시킬 수 있다.
기본적으로, 추가의 조절 요소는 이종 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날 및 기타 발현 조절 요소를 포함한다. 유도성 및 구성적 조절 서열은 각종 세포 유형에 대해 공지되어 있다.
"전사-조절 요소"는 일반적으로 발현될 유전자 서열의 프로모터 상류, 전사 개시 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.
용어 "전사 개시 부위"는 제1 전사체, 즉, mRNA 전구체에 혼입되는 제1 핵산에 상응하는 작제물내 핵산을 말한다. 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 오버랩될 수 있다.
용어 "전사 종결 부위"는 목적 유전자 또는 전사될 유전자 부분의 3' 말단에 일반적으로 존재하며, RNA 폴리머라제에 의한 전사의 종결을 가져오는 뉴클레오타이드 서열을 말한다.
"폴리아데닐화 시그날"은 진핵생물 mRNA의 3' 말단에서의 절단 및 절단된 3' 말단에서의 약 100 내지 200개 아데닌 뉴클레오타이드의 서열(폴리A 테일)의 전사후 혼입을 일으키는 시그날 서열이다. 폴리아데닐화 시그날은 절단 부위의 약 10 내지 30개 뉴클레오타이드 상류에 있는 서열 AATAAA 및 하류에 위치한 서열을 포함한다. tk polyA, SV40 레이트 및 얼리 폴리A 또는 BGH 폴리A(예를 들면, 미국 특허 제5,122,458호에 기술)와 같은 다양한 폴리아데닐화 요소가 공지되어 있다.
"해독 조절 요소"는 발현될 각각의 폴리펩타이드에 대한 해독 개시 부위(AUG), 종결 코돈 및 폴리A 시그날을 포함한다. 최적 발현을 위해서는, 전사 또는 발현 수준에서 발현에 영향을 줄 수 있는 임의의 잠재적으로 부적합한 추가의 해독 개시 코돈 또는 다른 서열을 제거하기 위하여, 발현될 핵산의 5'- 및/또는 3'-비해독 영역을 제거하거나, 첨가하거나, 또는 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 발현을 향상시키기 위해, 리포소옴 컨센서스(consensus) 결합 부위를 개시 코돈의 바로 상류에 추가로 삽입시킬 수 있다. 분비되는 폴리펩타이드를 생산하기 위해서는, 목적 유전자는 일반적으로 합성된 폴리펩타이드를 ER 막을 통해 수송하는 시그날 전구체 펩타이드를 암호화하는 시그날 서열을 함유한다. 시그날 서열은 분비된 단백질의 아미노 말단에 종종 위치하지만, 항상 그런 것은 아니며, 단백질이 ER 막을 통과한 후 시그날 펩티다제에 의해 절단된다. 유전자 서열은 일반적으로 자체의 시그날 서열을 함유할 것이지만, 반드시 그런 것은 아니다. 천연 시그날 서열이 존재하지 않는 경우, 이종 시그날 서열을 공지된 방식으로 도입시킬 수 있다. 이러한 유형의 많은 시그날 서열이 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며 GenBank 및 EMBL과 같은 서열 데이터뱅크에 기탁되어 있다.
다른 조절 요소는 내부 리보좀 진입 부위(IRES)이다. IRES 요소는 5'-말단 메틸구아노시늄 캡(CAP 구조) 및 상류 유전자와 독립적으로 해독 개시를 기능적으로 활성화시키며 동물 세포내에서 단일 전사체로부터의 2개의 시스트론(cistron)(개방 판독 프레임)의 해독을 허용하는 서열을 포함한다. IRES 요소는 바로 하류에 위치한 개방 판독 프레임의 해독을 위한 독립적인 리보좀 진입 부위를 제공한다. 멀티시스트로닉(multicistronic)일 수 있는, 즉, mRNA에 의해 차례로 해독되는 다수의 상이한 폴리펩타이드 또는 생성물을 암호화할 수 있는 세균 mRNA와는 대조적으로, 동물 세포로부터의 대부분의 mRNA는 모노시스트로닉(monocistronic)이며 단지 하나의 단백질 또는 생성물을 암호화한다. 진핵 세포내에서 멀티시스트로닉 전사체의 경우에, 해독은 가장 가까운 상류에 있는 해독 개시 부위로부터 개시될 것이며 첫번째 종결 코돈에 의해 종결된 후, 전사체가 리보좀으로부터 방출될 것이다. 따라서, mRNA에 의해 암호화된 첫번째 폴리펩타이드 또는 생성물만이 해독 동안 생성될 것이다. 대조적으로, 전사체내에서 제2 또는 후속적인 개방 판독 프레임에 기능적으로 연결된 IRES 요소를 지닌 멀티시스트로닉 전사체는 이의 하류에 위치한 개방 판독 프레임의 후속적인 해독을 허용함으로써, 동일한 전사체에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 생성물이 진핵 세포내에서 생산된다.
IRES 요소는 다양한 길이 및 다양한 기원일 수 있으며 예를 들면, 뇌척수심근염 바이러스(EMCV) 또는 다른 피코르나(Picorna) 바이러스로부터 기원할 수 있다. 다양한 IRES 서열 및 벡터의 작제시 이들의 용도는 문헌[참조: 예를 들면 Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996; Mosser et al., 1997]에 기술되어 있다.
하류에 위치한 유전자 서열은 IRES 요소의 3' 말단에 기능적으로 연결되는데, 즉, 스페이싱은, 유전자의 발현이 영향을 받지 않거나 단지 조금만 영향을 받거나 또는 의도된 목적을 위해 충분한 발현을 가지도록 선택된다. IRES 요소와 이의 하류에 위치한 유전자의 개시 코돈 사이의 허용가능한 최적 거리는, 스페이싱을 변화시키고 리포터 유전자 검정을 사용한 스페이싱의 함수로서 발현율을 측정함에 의해 결정할 수 있다.
상기한 수단에 의해, 이종 유전자 생성물의 발현에 매우 가치있는 최적 발현 카세트를 수득하는 것이 가능하다. 따라서, 하나 이상의 이러한 수단에 의해 수득한 발현 카세트는 본 발명의 추가의 대상이다.
햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터:
다른 양태에서 본 발명에 따른 발현 벡터는, 바람직하게는 목적 유전자에 기능적으로 연결된, 보다 바람직하게는 목적 유전자와 형광 단백질 또는 선별가능 마커를 암호화하는 유전자에 기능적으로 연결된 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터를 함유한다.
햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터는 제WO 97/15664호에 기술된 강력한 동종 프로모터이다. 이러한 프로모터는 바람직하게는 하나 이상의 다음 특징을 갖는다: GC-풍부 서열 영역, Sp1 결합 부위, 폴리피리미딘 요소, TATA 박스의 부재. Sp1 결합 부위를 갖지만 TATA 박스가 없는 프로모터가 특히 바람직하다. 또한, 구성적으로 활성화된 프로모터가 바람직하고, 혈청-함유, 저-혈청 및 혈청-미함유 세포 배양 조건하에서 동등하게 활성인 프로모터가 특히 바람직하다. 다른 양태에서, 이는 유도성 프로모터, 특히 혈청의 제거에 의해 활성화되는 프로모터이다.
특히 유리한 양태는 제WO 97/15664호의 도 5에 포함된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프로모터이다. 도 5의 위치 -161 내지 -45의 서열을 함유하는 프로모터 서열이 특히 바람직하다.
본 발명의 명세서의 실시예에 사용된 프로모터는 각각 제WO 97/15664호의 도 5로부터의 단편 -372 내지 +111에 상응하는 서열을 지닌 DNA 분자를 함유하며 바람직한 프로모터를 나타내는데, 즉, 바람직한 프로모터는 당해 서열 영역을 혼입하여야 한다.
본 발명에 따른 발현 벡터의 제조:
본 발명에 따른 발현 벡터는 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al.(1989)]에 기술된 바와 같이 당해 분야에 공지된 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 샘브룩(Sambrook)은 또한 벡터의 작용 요소, 예를 들면, 적합한 프로모터(햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 외에), 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날, 항생제 내성 유전자, 선별가능 마커, 복제 개시점 및 스플라이싱 시그날을 기술한다. 통상적인 클로닝 벡터는, 예를 들면, 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드, 코스미드 또는 바쿨로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)와 같은 바이러스 벡터, 및 합성 또는 인공 염색체/미니 염색체를 사용하여 이들을 생산할 수 있다. 진핵생물 발현 벡터는 통상적으로 또한 예를 들면, 세균내에서 벡터의 복제 및 선별을 허용하는 복제 오리진 및 항생제 내성 유전자와 같은 원핵생물 서열을 함유한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 도입을 위한 다수의 클로닝 부위를 함유하는 다수의 진핵생물 발현 벡터가 공지되어 있으며 일부는 스트라타젠(Stratagene, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); 인비트로겐(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); 프로메가(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 비디 바이오사이언시스 클론테크(BD Biosciences Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)와 같은 각종 회사로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
이종 프로모터, 목적 유전자(또는 유전자들), 선별가능 마커들 및 임의로 형광 단백질을 암호화하는 유전자, 내부 리보좀 진입 부위(IRES), 인핸서, 폴리아데닐화 시그날과 같은 추가의 조절 요소 및 TE 요소와 같은 기타 시스-작용성 요소를 당해 분야의 숙련자에게 익숙한 방식으로 발현 벡터내로 도입시킨다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 최소한 이종 프로모터, 목적 유전자 및 TE 요소를 함유한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 또한 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 함유한다. 본 발명에 있어서 이종 프로모터로서 유비퀴틴/S27a 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이종 프로모터, 바람직하게는 유비퀴틴/S27a 프로모터, 목적 유전자 및 TE 요소가 함께 기능적으로 연결되어 있거나 또는 기능적으로 연결된 발현 벡터가 특히 바람직하다.
본 설명의 범위내에서, 용어 "기능적 연결" 또는 "기능적으로 연결된"은 2개 이상의 핵산 서열 또는 부분 서열이 이들의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 위치하고 있음을 말한다. 예를 들면, 프로모터/인핸서, 프로모터/TE 요소 또는 프로모터/인핸서/TE 요소는, 연결된 유전자 서열의 전사를 시스 위치에서 제어하거나 조절할 수 있는 경우, 암호화 유전자 서열에 기능적으로 연결된 것이다. 일반적으로, 기능적으로 연결된 DNA 서열은 함께 근접하고 있으며, 2개의 암호화 유전자 서열이 연결되어 있거나 또는 분비 시그날 서열의 경우에는, 동일한 판독 프레임내에 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 기능적으로 연결된 프로모터는 일반적으로 암호화 유전자 서열의 상류에 위치하지만, 반드시 이에 근접해야하는 것은 아니다. 인핸서는 이에 근접할 필요가 없으며, 단, 이들이 유전자 서열의 전사 또는 발현을 보조한다. 이를 위하여, 이들은 아마도 서로로부터 일정 거리에서 유전자 서열의 상류 및 하류에 존재할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는, 유전자 서열의 3' 말단에 위치하여 전사가 암호화 서열을 통해 폴리아데닐화 시그날까지 진행되는 경우, 유전자 서열에 기능적으로 연결된 것이다. 연결은 통상적인 재조합 방법에 따라, 예를 들면, PCR 기술에 의해, 적합한 제한 절단 부위에서 연결에 의해 또는 스플라이싱에 의해 일어날 수 있다. 적합한 제한 절단 부위가 사용가능하지 않는 경우 합성 올리고뉴클레오타이드 링커 또는 어댑터를 공지된 방식 그 자체로 사용할 수 있다.
기술된 양태 중 하나에서, 이종 프로모터, 바람직하게는 유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 CMV 프로모터, 목적 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 함께 기능적으로 연결시킨다. 이는 예를 들면, 목적 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자가 동일한 이종 프로모터로부터 개시하여 발현됨을 의미한다. 특히 바람직한 양태에서, 기능적 연결은 IRES 요소를 통해 일어남으로써, 바이시스트로닉 mRNA가 유전자 둘다로부터 합성된다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 하나 이상의 프로모터에 의해 기능적으로 작용하는 인핸서 요소 및/또는 TE 요소를 추가로 함유할 수 있다. 이종 프로모터, 바람직하게는 유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 이의 변형된 형태 또는 CMV 프로모터가 인핸서 요소, 예를 들면, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서 요소, 및 TE 요소에 연결되어 있는 발현 벡터가 특히 바람직하다.
근본적으로, 발현 벡터내 유전자의 발현은 하나 이상의 전사 단위로부터 개시하여 일어날 수 있다. 용어 "전사 단위"는 전사될 하나 이상의 유전자를 함유하는 영역으로 정의된다. 전사 단위내 유전자는 서로에 대해 기능적으로 연결됨으로써 이러한 단위내 모든 유전자들은 동일한 프로모터, 프로모터/인핸서 또는 프로모터/인핸서/TE 요소의 전사적 조절하에 있다. 유전자의 이러한 전사적 연결의 결과로서, 하나 이상의 단백질 또는 생성물이 전사 단위로부터 전사됨으로써 발현될 수 있다. 각각의 전사 단위는 이에 함유된 유전자 서열의 전사 및 해독에 필요한 조절 요소를 함유한다. 각각의 전사 단위는 동일하거나 또는 상이한 조절 요소를 함유할 수 있다. IRES 요소 또는 인트론은 전사 단위내 유전자의 기능적 연결에 사용될 수 있다.
발현 벡터는 목적 유전자(또는 유전자들), 선별가능 마커 및 임의로 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하기 위한 단일 전사 단위를 함유할 수 있다. 또는, 이들 유전자들은 2개 이상의 전사 단위로 정렬될 수 있다. 전사 단위내 유전자의 다양한 조합이 가능하다. 본 발명의 다른 양태에서 1개, 2개 이상의 전사 단위로 이루어진 하나 이상의 발현 벡터를 공동형질감염 또는 연속 형질감염에 의해 숙주 세포내로 임의의 원하는 순서로 삽입할 수 있다. 각각의 벡터상의 조절 요소와 유전자의 어떠한 조합도 선택할 수 있으며 단, 전사 단위의 적절한 발현이 보증되어야 한다. 경우에 따라, TE 요소와 같은 다른 조절 요소, 및 유전자, 예를 들면, 추가의 목적 유전자들 또는 선별가능 마커들을 발현 벡터상에 위치시킬 수 있다.
또한 본 발명에 있어서 하나 이상의 TE 요소를 함유하고 목적 유전자 대신에 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 통해 목적 유전자의 클로닝을 허용하는 다중 클로닝 부위만을 갖는 발현 벡터가 바람직하다. 모든 종류의 제한 엔도뉴클레아제 및 관련된 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다수의 인식 서열이 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 6개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열을 인식 서열로서 사용한다. 적합한 인식 서열의 목록은 예를 들면, 문헌(참조: Sambrook et al., 1989)에서 찾을 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 목적 유전자 대신에, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 통해 목적 유전자의 클로닝을 허용하고 또한 발현 벡터의 상이한 위치에서 하나 이상, 바람직하게는 다수의 클로닝 부위를 가지며, 추가로 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 통해 TE 요소를 클로닝하는 것을 가능하도록 하는 다수의 클로닝 부위만을 갖는 발현 벡터가 바람직하다. 모든 종류의 제한 엔도뉴클레아제 및 관련 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다수의 인식 서열은 선행 기술에 공지되어 있다. 바람직하게는, 6개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열을 인식 서열로서 사용한다. 적합한 인식 서열의 목록은 예를 들면, 문헌(Sambrook et al., 1989)에서 찾을 수 있다.
숙주 세포:
본 발명에 따른 발현 벡터를 사용한 형질감염을 위해 진핵 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 및 보다 특히 마우스, 랫트 및 햄스터 세포주와 같은 설치류 세포를 사용한다. 본 발명에 따른 발현 벡터를 사용한 상응하는 세포의 성공적인 형질감염에 의해 유전자 변형된 재조합 또는 유전자도입 세포가 생성되며, 이는 또한 본 발명의 대상이다.
본 발명의 목적상 바람직한 숙주 세포는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44 세포와 같은 햄스터 세포 또는 이들 세포주의 유도체/자손이다. 특히, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21 세포, 특히 CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 바람직하다. 또한, 마우스로부터의 흑색종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 및 이들 세포주의 유도체/자손이 적합하다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 햄스터 및 마우스 세포의 예는 하기 표 1에 제공된다. 그러나, 이들 세포의 유도체 및 자손, 사람, 마우스, 랫트, 원숭이, 설치류의 세포주를 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 포유동물 세포, 또는 효모, 곤충, 조류 및 식물 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 진핵생물 세포가 또한 생약제 단백질의 생산을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다.
햄스터 및 마우스 생산 세포주
세포주 기탁 번호
NS0 ECASS No. 85110503
Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-1581
BHK21 ATCC CCL-10
BHK TK- ECACC No. 85011423
HaK ATCC CCL-15
2254-62.2(BHK-21-유도체) ATCC CRL-8544
CHO ECACC No. 8505302
CHO-K1 ATCC CCL-61
CHO-DUKX (= CHO duk- CHO/dhfr-) ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B1 ATCC CRL-9010
CHO-DG44 Urlaub et al; Cell 32[2], 405-412, 1983
CHO Pro-5 ATCC CRL-1781
V79 ATCC CCC-93
B14AF28-G3 ATCC CCL-14
CHL ECACC No. 87111906
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터중 하나를 사용한 진핵 숙주 세포의 형질감염은 통상적인 방법(참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994)으로 수행한다. 형질감염의 적합한 방법은 예를 들면, 리포좀-매개된 형질감염, 칼슘 포스페이트 공침전, 전기천공, 다가양이온-(예를 들면, DEAE 덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 미세주입 및 바이러스 감염을 포함한다. 본 발명에 따라, 적합한 형질감염을 바람직하게 수행하며, 여기서, 작제물은 숙주 세포 또는 인공 염색체/미니염색체의 게놈내로 통합되거나, 또는 숙주 세포내에서 적합한 방식으로 에피좀내에 함유된다. 당해 숙주 세포내에서 이종 유전자의 최적 형질감염율 및 발현을 제공하는 형질감염 방법이 바람직하다. 정의에 따라, 숙주 세포내 삽입된 모든 서열 또는 모든 유전자를, 숙주 세포와 관련하여, "이종 서열" 또는 "이종 유전자"라고 칭한다. 이는, 도입된 서열 또는 도입된 유전자가 숙주 세포의 이종 서열 또는 이종 유전자와 동일한 경우에도 적용된다. 예를 들어, 햄스터 숙주 세포내로 도입된 햄스터 액틴 유전자는 정의에 따르면 이종 유전자이다.
본 발명에 따라서, 재조합 포유동물 세포, 바람직하게는 설치류 세포, 가장 바람직하게는 본원에 기술된 본 발명에 따른 발현 벡터중 하나로 형질감염된 CHO 또는 BHK 세포와 같은 햄스터 세포가 바람직하다.
예를 들면, 모노클로날 항체(mAb)와 같은 헤테로머 단백질의 재조합 생산에서, 적합한 숙주 세포의 형질감염은 이론적으로 2개 이상의 상이한 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 종류의 mAb는 다수의 서브유닛, 중쇄 및 경쇄로 구성되어 있다. 이러한 서브유닛을 암호화하는 유전자는 이후에 숙주 세포를 형질감염시킬 단일 플라스미드상에 독립적인 또는 멀티시스트로닉 전사 단위내에 수용될 수 있다. 이는 숙주 세포의 게놈내로 통합된 후 유전자의 화학량론적 표시를 보증하기 위한 의도이다. 그러나, 독립적인 전사 단위의 경우에는, 이로써, 상이한 단백질을 암호화하는 mRNA가 동일한 안정성 및 전사 및 해독 효율을 나타내는 것이 보장되어야 한다. 두번째 경우에, 유전자의 발현은 단일 프로모터에 의해 멀티시스트로닉 전사 단위내에서 일어나며 단지 하나의 전사체가 형성된다. IRES 요소를 사용함에 의해, 유전자의 매우 효율적인 내부 해독 개시가 제2 및 후속적인 시스트론에서 수득된다. 그러나, 이들 시스트론에 대한 발현율은 제1 시스트론의 것보다 낮으며, 이의 해독 개시는 소위 "cap"-의존성 개시-전 복합체의 수단에 의해, IRES-의존성 해독 개시보다 실질적으로 더 효율적이다. 시스트론의 정확한 등몰 발현을 달성하기 위하여, 추가의 시스트론간(inter-cistronic) 요소를 도입시킬 수 있으며, 예를 들어, 이는 IRES 요소와 함께 단일형의 발현율을 보증한다(참조: 제WO 94/05785호).
본 발명에 따른 다수의 이종 단백질을 생산하는 다른 가능한 방법은 연속적인 형질감염이며, 여기서, 유전자는 상이한 시간에 형질감염되고 상이한 발현 벡터내에 통합된다. 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄는 두 형질감염 단계에서 차례로 세포내로 도입될 수 있다.
본 발명에 따라 바람직한 다수의 이종 단백질을 동시에 생산하는 다른 가능한 방법은 공동형질감염이며, 여기서, 유전자는 상이한 발현 벡터내에서 별개로 통합된다. 이는, 유전자들 및 유전자 생성물들 서로의 특정 비율을 조절함으로써 mRNA 안정성 및 전사 및 해독의 효율에 있어서의 어떠한 차이도 균형을 이루도록 할 수 있는 장점을 갖는다. 또한, 발현 벡터는 이들의 작은 크기로 인하여 보다 안정하고, 클로닝 및 형질감염동안 취급하기에 용이하다.
따라서, 본 발명의 하나의 특정 양태에서, 숙주 세포는 하나 이상의 목적한 다른 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 하나 이상의 벡터로 추가로 형질감염, 바람직하게는 공동형질감염된다. 공동형질감염에 사용된 다른 벡터 또는 벡터들은 예를 들면, 동일한 프로모터의 조절하에서, 바람직하게는 동일한 프로모터/인핸서 조합의 조절하에서 또는, 특히 바람직하게는, 동일한 프로모터/인핸서/TE 요소 조합의 조절하에서, 또는 동일한 프로모터/인핸서 조합 및 상이한 TE 요소의 조절하에서 다른 단백질 또는 목적 단백질을 암호화하고, 하나 이상의 선별가능 마커, 예를 들면, 디하이드로폴레이트 리덕타제를 암호화한다.
본 발명의 다른 양태에서, 형질감염에 사용된 벡터는 임의의 조합, 위치 및 배향으로 하나 이상의 TE-요소를 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 특정 양태에서, 숙주 세포는 2개 이상의 진핵생물 발현 벡터로 공동-형질감염되며, 2개의 벡터중 하나 이상은 적어도 목적 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유하는 반면, 다른 벡터는 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산을 임의의 조합, 위치 및 배향으로 함유하고, 임의로 또한 하나 이상의 목적 유전자를 암호화하며, 본 발명에 따른 이들 핵산은 다른 벡터와의 공동-통합에 의해 다른 공동-형질감염된 벡터상에 위치하는 목적 유전자에 전사- 또는 발현-향상 활성을 부여한다.
본 발명에 따라서, 숙주 세포는 바람직하게는 혈청-미함유 조건하에, 임의로 동물 단백질/펩타이드 미함유 배지 속에서 확립되고, 변화되고 배양된다. 시판되는 배지의 예는 Ham's F12[제조원: 시그마(Sigma), 독일 다이센호펜 소재], RPMI-1640(제조원: 시그마), 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium)(DMEM; 제조원: 시그마), 최소 필수 배지(MEM; 제조원: 시그마), 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's medium)(IMDM; 제조원: 시그마), CD-CHO[제조원: 인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재], CHO-S-SFMII(제조원: 인비트로겐), 혈청-미함유 CHO-배지(제조원: 시그마) 및 단백질-미함유 CHO-배지(제조원: 시그마)를 포함한다. 이들 배지 각각은 각종 화합물, 예를 들면, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자), 염(예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충액(예를 들면, HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들면, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코즈 또는 기타 등가의 영양물, 항체 및/또는 미량 성분으로 임의로 보충될 수 있다. 혈청-미함유 배지가 본 발명에 있어서 바람직하지만, 숙주 세포는 또한 적합한 양의 혈청과 혼합된 배지를 사용하여 배양할 수 있다. 하나 이상의 선별가능 마커 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포를 선별하기 위하여, 하나 이상의 선별제를 배지에 가한다.
용어 "선별제"는 당해 선별가능 마커 유전자가 결여된 숙주 세포의 성장 또는 생존에 영향을 미치는 물질을 말한다. 본 발명의 범위내에서, 제네티신(G418)이 야생형 또는 바람직하게는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 보유하는 이종 숙주 세포의 선별을 위한 배지 첨가물로서 바람직하게 사용된다. 바람직하게는, 배지중 100 내지 800 ㎍/ml의 G418 농도가 사용되며, 가장 바람직하게는 배지중 200 내지 400 ㎍ G418/ml의 G418 농도가 사용된다. 숙주 세포를 다수의 발현 벡터로 형질감염시키는 경우, 예를 들면, 몇몇 목적 유전자를 숙주 세포내로 별도로 도입시키는 경우, 이들은 일반적으로 상이한 선별가능 마커 유전자를 갖는다.
선별가능 마커 유전자는 배양 배지내로 상응하는 선별제를 첨가함에 의해 당해 유전자를 함유하는 세포의 특정한 선별을 허용하는 유전자이다. 예로서, 항생제 내성 유전자가 양성 선별가능 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 유전자로 형질감염된 세포만이 상응하는 항생제의 존재하에 성장하여 선별될 수 있다. 한편, 형질감염되지 않은 세포는 이러한 선별 조건하에서 성장하거나 생존할 수 없다. 양성, 음성 및 2기능성 선별가능 마커가 있다. 양성 성별가능 마커는 선별제에 내성을 부여하거나 숙주 세포내에서 대사 또는 이화작용 결함을 보충함에 의해 형질전환된 세포가 풍부해지도록 한다. 대조적으로, 선별가능 마커에 대한 유전자를 제공받은 세포는 음성 선별가능 마커에 의해 선택적으로 제거될 수 있다. 이의 예는 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자이며, 아시클로비르 또는 간시클로비르가 동시 첨가된 세포내에서 이의 발현은 이들의 제거를 가져온다. 증폭가능한 선별가능 마커를 포함하는, 본 발명에 사용되는 선별가능 마커는 유전자 변형된 돌연변이체 및 변이체, 단편, 기능적 등가물, 유도체, 동족체 및 다른 단백질 또는 펩타이드와의 융합체를 포함하며, 단, 선별가능 마커는 자체의 선별 품질을 유지한다. 이러한 유도체는 선택성인 것으로 고려되는 영역 또는 도메인내 아미노산 서열에서 상당한 상동성을 나타낸다. 문헌은, 2기능성(양성/음성) 마커를 포함하는 다수의 선별가능 마커 유전자를 기술하고 있다(참조: 예를 들면 제WO 92/08796호 및 제WO 94/28143호). 진핵 세포에서 일반적으로 사용되는 선별가능 마커의 예는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APH), 하이그로마이신 포스포스트랜스퍼라제(HYG), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 신테타제, 아스파라긴 신테타제에 대한 유전자 및 네오마이신(G418), 퓨로마이신, 히스티디놀 D, 블레오마이신, 플레오마이신 및 제오신에 대해 내성을 부여하는 유전자를 포함한다.
용어 "변형된 네오마이신-포스포트랜스퍼라제(NPT)"는 제WO2004/050884호에 기술된 모든 돌연변이체, 특히, 아미노산 위치 227에서 아스파르트산(Asp, D)의 글라이신(Gly, G)으로의 치환을 특징으로 하는 돌연변이체 D227G(Asp227Gly) 및 특히 바람직하게는 아미노산 위치 240에서 페닐알라닌(Phe, F)의 이소류신(Ile, I)으로의 치환을 특징으로 하는 돌연변이체 F240I(Phe240Ile)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 (i) 숙주 세포를 바람직하게는 변형된, 하나 이상의 목적 단백질/생성물 및 네오마이신-포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자로 형질감염시키는 단계(여기서, 전사 또는 발현을 향상시키기 위하여 적어도 목적 유전자(유전자들)는 하나 이상의 TE 요소에 기능적으로 연결된다); (ii) 상이한 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 세포를 배양하는 단계; 및 (iii) 예를 들면, G418과 같은 선별제의 존재하에 세포를 배양함으로써 이들 공동-통합된 유전자를 선별하는 단계를 포함하는, 재조합 포유동물 세포의 제조 및 선별 방법을 포함한다. 바람직하게는, 형질감염된 세포는 혈청의 부재하에서 배지에서 배양된다. 바람직하게는 G418의 농도는 200 ㎍/mL 이상이다. 그러나, 당해 농도는 또한 400 ㎍/mL 이상일 수 있다.
증폭가능한 선별가능 마커 유전자:
또한, 본 발명에 따른 세포는 또한 하나 이상의 유전자 증폭 단계에 임의로 적용시킬 수 있으며, 여기서, 이들은 증폭가능한 선별가능 마커 유전자의 증폭을 가져오는 선별제의 존재하에 배양된다.
사전필수사항은, 숙주 세포를 증폭가능한 선별가능 마커를 암호화하는 유전자로 추가로 형질감염시킨다는 것이다. 증폭가능한 선별가능 마커를 암호화하는 유전자가 본 발명에 따른 발현 벡터 중 하나에 존재하거나 또는 다른 벡터에 의해 숙주 세포내로 도입되는 것도 가능하다.
증폭가능한 선별가능 마커 유전자는 일반적으로 특정의 배양 조건하에서 진핵 세포의 성장에 요구되는 효소를 암호화한다. 예를 들면, 증폭가능한 선별가능 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 암호화할 수 있다. 이 경우에, 이 유전자는 이로 형질감염된 숙주 세포를 선별제 메토트렉세이트(MTX)의 존재하에 배양시키면 증폭된다.
다음 표 2는 문헌[참조: Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566(1990)]에 개괄적으로 기술된, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 증폭가능한 선별가능 마커 유전자 및 관련된 선별제의 예를 제공한다.
증폭가능한 선별가능 마커 유전자
증폭가능한 선별가능 마커 유전자 기탁 번호 선별제
디하이드로폴레이트 리덕타제 M19869(햄스터) E00236(마우스) 메토트렉세이트(MTX)
메탈로티오네인 D10551(햄스터) M13003(사람) M11794(랫트) 카드뮴
CAD(카바모일포스페이트 신테타제 : 아스파테이트 트랜스카바밀라제: 디하이드로오로타제) M23652(햄스터) D78586(사람) N-포스포아세틸-L-아스파테이트
아데노신-데아미나제 K02567(사람) M10319(마우스) Xyl-A- 또는 아데노신, 2'데옥시코포르마이신
AMP(아데닐레이트)-데아미나제 D12775(사람) J02811(랫트) 아데닌, 아자세린, 코포르마이신
UMP-신타제 J03626(사람) 6-아자우리딘, 피라조푸란
IMP 5'-데하이드로게나제 J04209(햄스터) J04208(사람) M33934(마우스) 마이코페놀산
크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라제 X00221(이.콜라이) 제한된 크산틴을 갖는 마이코페놀산
돌연변이 HGPRTase 또는 돌연변이 티미딘-키나제 J00060(햄스터) M13542, K02581(사람) J00423, M68489(마우스) M63983(랫트) M36160(헤르페스 바이러스) 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)
티미딜레이트-신테타제 D00596(사람) M13019(마우스) L12138(랫트) 5-플루오로데옥시우리딘
P-당단백질 170(MDR1) AF016535(사람) J03398(마우스) 몇가지 약물, 예를 들면, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 콜히친
리보뉴클레오타이드 리덕타제 M124223, K02927(마우스) 아피디콜린
글루타민-신테타제 AF150961(햄스터) U09114, M60803(마우스) M29579(랫트) 메티오닌 설폭스이민(MSX)
아스파라긴-신테타제 M27838(햄스터) M27396(사람) U38940(마우스) U07202(랫트) β-아스파르틸하이드록사메이트, 알비치인, 5' 아자사이티딘
아르기니노석시네이트-신테타제 X01630(사람) M31690(마우스) M26198(소) 카나바닌
오르니틴-데카복실라제 M34158(사람) J03733(마우스) M16982(랫트) α-디플루오로메틸오르니틴
HMG-CoA-리덕타제 L00183,M12705(햄스터) M11058(사람) 콤팍틴
N-아세틸글루코스아미닐-트랜스퍼라제 M55621(사람) 투니카마이신
트레오닐-tRNA-신테타제 M63180(사람) 보렐리딘
Na+K+-ATPase J05096(사람) M14511(랫트) 오우아바인
본 발명에 따라 사용된 증폭가능한 선별가능 마커 유전자는 바람직하게는 DHFR의 기능을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들면, DHFR 또는 형광 단백질과 DHFR로부터의 융합 단백질을 암호화하는 유전자이다. DHFR은 퓨린의 생합성에 필수적이다. DHFR 유전자가 결실된 세포는 퓨린-결핍 배지에서 성장할 수 없다. 따라서, DHFR 유전자는 퓨린-미함유 배지에서 배양된 세포내 유전자를 선별하고 증폭시키는데 유용한 선별가능 마커이다. DHFR 유전자와 함께 사용된 선별 배지는 메토트렉세이트(MTX)이다.
포유동물 세포, 바람직하게는 마우스 흑색종 및 햄스터 세포가 증폭가능한 선별가능 마커로서의 DHFR의 사용에 바람직한 숙주 세포이다. 세포주 CHO-DUKX(ATCC CRL-9096) 및 CHO-GD44(참조: Urlaub et al., 1983)는 돌연변이의 결과로서 자체의 DHFR 활성을 가지지 않으므로 특히 바람직하다. 자체의 내인성 DHFR 활성을 갖는 기타 세포 유형에서도 DHFR-유도된 증폭을 사용하기 위해, 형질감염 과정에서 메토트렉세이트에 대해 감소된 민감성을 갖는 단백질을 암호화하는 돌연변이된 DHFR 유전자를 사용하는 것이 가능하다(참조: Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982).
CHO-DG44 또는 CHO-DUKX와 같은 DHFR-음성 기본 세포는 내인성 DHFR을 발현하지 않으므로 퓨린-미함유 배지에서 성장하지 않기 때문에, 이들 세포를 사용하는 경우, DHFR 마커는 선별 및 후속적인 증폭에 특히 적합하다. 결과적으로, DHFR 유전자를 우성 선별가능 마커로서 본원에서 사용할 수 있으며, 형질전환된 세포는 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지에서 선별된다.
따라서, 본 발명은 (i) 숙주 세포를 하나 이상의 목적한 단백질/생성물 및 증폭가능한 선별가능 마커 DHFR을 암호화하는 유전자로 형질감염시키는 단계(여기서, 전사 또는 발현을 향상시키기 위하여, 적어도 목적 유전자(또는 유전자들)는 하나 이상의 TE 요소에 기능적으로 연결된다); (ii) 세포를 상이한 유전자의 발현이 가능하도록 하는 조건하에서 배양하는 단계; 및 (iii) 이러한 공동-통합된 유전자를, 세포를 메토트렉세이트와 같은 적어도 증폭가능한 선별가능 마커 유전자의 증폭을 허용하는 선별제의 존재하에 배양함으로써 증폭시키는 단계를 포함하는, 재조합 포유동물 세포를 제조 및 선별하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 형질감염된 세포는 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지 속에서 혈청의 부재하에 및 증가하는 농도의 MTX를 첨가하면서 배양한다. 바람직하게는, 제1 증폭 단계에서 MTX의 농도는 적어도 100 nM이다. 그러나, MTX의 농도는 또한 적어도 250 nM이고 단계적으로 1μM로 증가시킬 수 있다. 개개의 경우, 1μM 이상의 농도, 예를 들면, 2μM이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, (i) 숙주 세포를, 바람직하게는 변형된 하나 이상의 목적 단백질/생성물, 네오마이신-포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자, 및 증폭가능한 선별가능 마커 DHFR로 형질감염시키는 단계(여기서, 전사 또는 발현을 향상시키기 위하여, 적어도 목적 유전자(또는 유전자들)는 하나 이상의 TE 요소에 기능적으로 연결된다); (ii) 세포를 상이한 유전자의 발현을 가능하도록 하는 조건하에 배양하는 단계; (iii) 이러한 공동-통합된 유전자를, 세포를 예를 들면, G418과 같은 선별제의 존재하에, 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지속에서 배양하여 증폭시키는 단계; 및 (iv) 이들 공동-통합된 유전자를, 메토트렉세이트와 같은 적어도 증폭가능한 선별가능 마커 유전자의 증폭을 허용하는 선별제의 존재하에 배양함으로써 증폭시키는 단계를 포함하는, 재조합 포유동물 세포를 제조 및 선별하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 형질감염된 세포는 적어도 200 ㎍/mL G418, 바람직하게는 400 ㎍/mL 이상의 G418이 보충된 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지에서, 혈청의 부재하에 및 증가하는 농도의 MTX를 첨가하면서 배양된다. 바람직하게는, 제1 증폭 단계에서 MTX의 농도는 적어도 100 nM이다. 그러나, MTX의 농도는 적어도 250 nM일 수 있고 단계적으로 1μM로 증가될 수 있다. 개개의 경우, 1μM 이상의 농도, 예를 들면, 2μM이 사용될 수 있다.
형질감염된 세포를 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 선별하는 것 또한 가능하다. 이를 위해, 형질전환된 세포의 선별을 위한, 세균 β-갈락토시다제, 세포 표면 마커 또는 형광 단백질[예를 들면, 아에쿠오레아 빅토리아 및 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 또는 기타 종으로부터의 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이의 변이체; 예를 들면, 디스코소마 종, 아네모니아 종, 클라불라리아 종, 조안투스 종, 아에쿠오레아 코에룰레센스와 같은 비-생물발광 유기체로부터의 적색 형광 단백질 및 다른 색상으로 형광을 내는 단백질 및 이의 변이체]을 사용할 수 있다.
고-생산성 숙주 세포의 유전자 발현 및 선별:
용어 "유전자 발현"은 숙주 세포내에서 이종 유전자 서열의 전사 및/또는 해독에 관한 것이다. 발현율은 숙주 세포내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양을 기준으로 또는 목적 유전자에 의해 암호화된 유전자 생성물의 생산된 양을 기준으로 일반적으로 측정할 수 있다. 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전사로 생산된 mRNA의 양은 예를 들면, 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제-RNA-보호, 세포 RNA의 원위치(in situ) 하이브리드화 또는 PCR 방법(예를 들면, 정량적 PCR)(참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994)에 의해 측정할 수 있다. 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질은 또한 예를 들면, ELISA, 단백질 A HPLC, 웨스턴 블롯, 방사면역검정, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성의 측정, 단백질의 면역 염색에 이은 FACS 분석 또는 형광 현미경, FACS 분석 또는 형광 현미경에 의한 형광 단백질의 직접적인 검출(참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994)과 같은 각종 방법으로 측정할 수 있다. 이들 방법은 예를 들면, 본 발명에 따른 서열번호 1의 TE 요소, 또는 이의 임의의 부분, 단편 또는 영역, 또는 이의 유도체 또는 조합이 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시킬 수 있는지를 시험하는 것을 가능하도록 한다.
"향상된 발현, 전사 또는 생산성"은 숙주 세포내로 도입된 이종 서열, 예를 들면, 치료학적 단백질을 암호화하는 유전자가 대조군과 비교하여 발현 또는 합성이 향상됨을 의미한다. 본 발명에 따른 세포가 본 발명에 따라서 본원에 기술된 방법으로 배양되는 경우, 및 당해 세포가 비생산성에 있어서 적어도 1.3배 또는 1.5배 증가되거나 또는 바람직하게는 비생산성이 2배로 증가되는 경우 발현, 전사 또는 생산성이 향상된 것이다. 또한, 본 발명에 따른 세포가 비생산성이 적어도 3배인 경우 발현, 전사 또는 생산성이 향상된 것이다. 특히, 본 발명에 따른 세포가 비생산성이 적어도 4배인 경우 발현, 전사 또는 생산성이 향상된 것이다. 특히, 본 발명에 따른 세포가 비생산성이 적어도 5배인 경우 발현, 전사 또는 생산성이 향상된 것이다. 특히, 본 발명에 따른 세포가 비생산성이 적어도 6배인 경우 발현, 전사 또는 생산성이 향상된 것이다. 특히, 본 발명에 따른 세포가 비생산성이 적어도 7배인 경우 발현, 전사 또는 생산성이 향상된 것이다.
향상된 발현, 전사 또는 생산성은 본 발명에 따른 발현 벡터 중 하나를 사용하거나 또는 본 발명에 따른 방법 중 하나를 사용하여 달성할 수 있다.
상응하는 과정들은 추가의 선별가능 마커로서, 하나 이상의 형광 단백질(예: 를 들면, GFP) 또는 세포 표면 마커를 함유하는 재조합 숙주 세포의 FACS-보조된 선별과 결합될 수 있다. 또한 사용할 수 있는 증가된 발현을 수득하는 다른 방법 및 상이한 방법의 조합은 예를 들면, 염색질 구조(예를 들면, LCR, UCOE, EASE, 분리인자, S/MAR, STAR 요소)를 조작하기 위한 시스-작용성 요소의 사용, (인공) 전사 인자의 사용, 내인성 또는 이종 유전자 발현을 상향-조절하는 천연 또는 합성 제제를 사용한 세포의 처리, mRNA 해독 개시의 향상, 에피좀 플라스미드 사용으로 인한 유전자 용량의 증가(복제 오리진으로서의 바이러스 서열, 예를 들면, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, EBV 또는 BPV의 사용을 기준으로 함), 증폭-향상 서열(참조: Hemann et al., 1994) 또는 DNA 연쇄동일서열(concatemer)을 기준으로 한 시험관내 증폭 시스템(참조: Monaco et al., 1996)을 기초로 한다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 목적한 이종 유전자를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 수득하고 선별하는 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 (i) 재조합 포유동물 세포를 본 발명에 따른 발현 벡터 및 증폭가능한 선별가능 마커 유전자에 대한 유전자로 형질감염시키고; (ii) 포유동물 세포를 목적 유전자 또는 유전자들, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고; (iii) 포유동물 세포를 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하며 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 세포의 성장에 바람직한 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하며; (iv) 형광 단백질의 높은 발현을 나타내는 포유동물 세포를 유세포 분석으로 분류하고; (v) 분류된 세포를 증폭가능한 선별가능 마커 유전자가 발현되는 조건하에서 배양하고; (vi) 선별제를 증폭가능한 선별가능 마커 유전자의 증폭을 초래하는 배양 배지에 가함을 특징으로 한다.
또한, 생산 세포가 복제되어 목적한 암호화 유전자 생성물을 제조하는데 사용되는 방법이 바람직하다. 이를 위해, 선별된 고 생산성 세포는 바람직하게는 혈청-미함유 배양 배지 속에서 및 바람직하게는 목적 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 현탁 배양에서 배양된다. 목적 단백질/생성물은 바람직하게는 분비된 유전자 생성물로서 세포 배양 배지로부터 바람직하게 수득된다. 그러나, 단백질이 분비 시그날의 부재하에 발현되는 경우, 유전자 생성물은 또한 세포 용해물로부터 분리될 수 있다. 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질이 실질적으로 부재하는 순수한 동종 생성물을 수득하기 위하여, 통상의 정제 과정을 수행한다. 우선, 세포 및 세포 파괴물을 배양 배지 또는 용해물로부터 제거한다. 이후에, 목적 유전자 생성물을 예를 들면, 면역친화성 및 이온 교환 컬럼상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC 또는 세파덱스, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지상에서의 크로마토그래피에 의해 가용성 단백질 오염으로부터 분리시킬 수 있다. 재조합 숙주 세포에 의해 발현된 이종 단백질을 정제하는 방법은 숙련자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌(참조: Harris et al., 1995 및 Scopes 1988)에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 조성물
본 발명은 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-13(서열번호 15)의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 TE-13(서열번호 15)의 유도체 또는 이의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 염색체 통합시 발현 시스템내에서 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 TE-13(서열번호 15) TE-13(서열번호 15)의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 TE-13(서열번호 15)의 유도체 또는 이의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 염색체 통합시 발현 시스템내에서 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 핵산에 관한 것이며, 단, 상기 단편 또는 유도체는 1bp 내지 1578bp(서열번호 1과 관련하여)의 핵산 영역으로부터의 하나 이상의 서열 영역을 포함한다. 서열 영역은 적어도 10bp, 15bp, 20bp, 50bp, 100bp의 핵산 영역을 의미한다.
본 발명은 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-13(서열번호 15)의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 TE-13(서열번호 15)의 유도체 또는 이의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 염색체 통합시 발현 시스템내에서 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 핵산에 관한 것이며, 단, 상기 단편 또는 유도체는 TE-09(서열번호 11) 또는 TE-08(서열번호 11) 또는 TE-13(서열번호 15)의 하나 이상의 서열 영역을 포함한다. 서열 영역은 적어도 10bp, 15bp, 20bp, 50bp, 100bp의 핵산 영역을 의미한다.
목적 유전자의 향상된 발현은 예를 들면, ELISA에 의해 생성물 역가를 측정함으로써 측정할 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 TE-08(서열번호 10) 또는 TE-08(서열번호 10)의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 TE-08(서열번호 10)의 유도체 또는 이의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 염색체 통합시 발현 시스템내에서 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키는 핵산에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 핵산의 바람직한 양태에서, 단, 상기 단편 또는 유도체는 또한 1bp 내지 1578bp(서열번호 1과 관련하여)의 핵산 영역으로부터의 하나 이상의 서열을 포함하여야 한다.
본 발명에 따른 상기 핵산의 특히 바람직한 양태에서, 단, 상기 단편 또는 유도체는 또한 TE-09(서열번호 11) 또는 TE-08(서열번호 11) 또는 TE-13(서열번호 15)의 하나 이상의 서열 영역을 포함한다. 서열 영역은 적어도 10bp, 15bp, 20bp, 50bp, 100bp의 핵산 영역을 의미한다.
다른 양태에서, 본 발명은 염색체 통합시 발현 시스템내에서 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키는 서열번호 1 또는 서열번호 1의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1의 유도체 또는 이의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명에 따른 앞서 언급한 핵산의 바람직한 양태에서, 단, 상기 단편 또는 유도체는 또한 1bp 내지 1578bp(서열번호 1과 관련하여)의 핵산 영역으로부터의 하나 이상의 서열 영역을 포함한다. 본 발명에 따른 위에서 언급한 핵산의 특히 바람직한 양태에서, 단, 상기 단편 또는 유도체는 또한 TE-09(서열번호 11) 또는 TE-08(서열번호 10) 또는 TE-13(서열번호 15)의 하나 이상의 서열 영역을 포함한다. 서열 영역은 적어도 10bp, 15bp, 20bp, 50bp, 100bp의 핵산 영역을 의미한다.
본 발명은 또한 서열번호 1 또는 이의 단편 또는 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키기 위한 핵산(=TE 요소)에 관한 것이며, 이는 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시킨다.
목적 유전자의 발현의 증가는 예를 들면, ELISA에 의해 생성물 역가를 측정함으로써 측정할 수 있다.
본 발명은 특히
(a) 핵산 서열 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10)의 영역 또는
(b) 이의 상보적 핵산 서열 또는
(c) (a) 또는 (b)와 적어도 약 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80% 서열 동일성 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열과 엄중한 조건하에 하이브리드화하는 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명에 따른 핵산은, 길이가 적어도 511 bp(=길이 TE-13, 서열번호 15) 또는 적어도 1015 bp(=길이 TE-08, 서열번호 10)이다.
바람직한 양태에서 본 발명은 TE 요소 TE-00(서열번호 2)의 5' 단편에 관한 것이다. 이는 1 bp 내지 1578bp의 서열번호 1의 일부분 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
본 발명은 특히 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10) 또는 이의 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 함유하고, 염색체 통합시 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키는 핵산 또는 이의 전사-향상 또는 발현-향상 핵산 요소(TE 요소)에 관한 것이다.
본 발명은 바람직하게는 분리된 핵산 또는 분리된 핵산 분자 또는 분리된 핵산 서열 또는 분리된 전사-향상 핵산 요소 또는 분리된 TE 요소에 관한 것이다.
본 발명은 특히 TE-08(서열번호 10) 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 염색체 통합시 발현 시스템내에서 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키는 분리된 핵산에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 핵산 또는 전사-향상 핵산 요소 또는 분리된 핵산은 TE 요소 서열의 상응하는 부분 또는 이의 상보적 서열, 특히 TE-00 서열의 5' 서열 영역, 및 특히 바람직하게는 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10)에 상응하는 서열번호 1과 관련하여 뉴클레오타이드 위치 1bp 내지 1578bp의 서열 영역과 적어도 약 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80% 서열 동일성 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 TE 요소 또는 서열번호 1의 유도체를 함유한다.
바람직한 양태에서 핵산 또는 전사-향상 핵산 요소 또는 분리된 핵산은 TE 요소 서열 또는 이의 상보적 서열의 부분과 적어도 약 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80% 서열 동일성 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는, TE-08 핵산(서열번호 10) 또는 바람직하게는 TE-13 핵산(서열번호 15)의 유도체를 함유한다.
다른 양태에서 본 발명은 TE 요소의 서열 또는 TE 요소의 상보적 서열, 특히 TE-00 서열(서열번호 2)의 5' 서열 영역에 상응하는 서열번호 1과 관련하여 1bp 내지 1578bp의 뉴클레오타이드의 서열 영역과 하이브리드화하거나, 또는 TE-08 요소(서열번호 10)과 하이브리드화하는 TE 요소의 핵산, 또는 전사-향상 핵산 요소 또는 분리된 핵산 또는 유도체에 관한 것이다. 바람직하게는, 하이브리드화는 엄중한 하이브리드화 및 세척 조건하에 수행한다.
다른 바람직한 양태에서 본 발명에 따른 핵산 또는 전사-향상 요소(TE 요소)는 다음 중에서 선택된다: TE-00(서열번호 2), TE-01(서열번호 3), TE-02(서열번호 4), TE-03(서열번호 5), TE-04(서열번호 6), TE-06(서열번호 8), TE-07(서열번호 9), TE-08(서열번호 10), TE-10(서열번호 12), TE-11(서열번호 13), TE-12(서열번호 14), TE-13(서열번호 15), TE-14(서열번호 16), TE-15(서열번호 17), TE-16(서열번호 18), TE-17(서열번호 19), TE-18(서열번호 20) 및 TE-21(서열번호 21).
다른 양태에서, 핵산 또는 전사-향상 요소(TE 요소)는, 핵산이 TE-00(서열번호 2), TE-06(서열번호 8), TE-10(서열번호 12), TE-11(서열번호 13) 또는 TE-12(서열번호 14), 바람직하게는 TE-06(서열번호 8)임을 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 핵산 또는 전사-향상 요소(TE 요소)는, 핵산이 TE-01(서열번호 3), TE-02(서열번호 4), TE-03(서열번호 5),TE-07(서열번호 9), TE-08(서열번호 10)임을 특징으로 한다.
특히 바람직한 양태에서, 핵산 또는 전사-향상 요소는 TE-08(서열번호 10)이다.
특히 바람직한 양태에서, 핵산 또는 전사-향상 요소(TE 요소)는 TE-18(서열번호 20)이다.
다른 양태에서 핵산 또는 전사-향상 요소(TE 요소)는, TE-01(서열번호 3)의 단편 또는 유도체가 바람직하게는 TE-13(서열번호 15), TE-14(서열번호 16), TE-15(서열번호 17), TE-16(서열번호 18), TE-17(서열번호 19), TE-18(서열번호 20)의 단편 또는 유도체임을 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 핵산은 TE-13(서열번호 15)이다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 또는 단편 또는 유도체는 분리된 핵산이다.
본 발명은 또한 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10) 또는 TE-07(서열번호 9) 또는 TE-06(서열번호 8) 또는 이들 서열의 단편 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 이들 서열의 유도체 또는 이들 서열의 단편의 유도체, 바람직하게는 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10) 또는 이들 서열의 단편 또는 이들 서열의 유도체 또는 이들 서열의 단편의 유도체 또는 이의 상보적 뉴클레오타이드 서열이 이종 서열에 연결되어 있음을 특징으로 하는 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
이종 유전자 서열에 연결된 핵산은 바람직한 양태에서 발현 벡터, 예를 들면 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 벡터 또는 특히 표적화 벡터일 수 있다. 그러나, 이종 유전자 서열에 연결된 핵산은 예를 들면, 합성, 인공 또는 미니-염색체와 같은 임의의 다른 합성 핵산 분자일 수 있다.
본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 본 발명에 따른 하나 이상의 전사-향상 요소(TE 요소)를 함유함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터에 관한 것이다.
특정 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는 프로모터 및/또는 이종 목적 유전자 및/또는 선별가능 마커 및/또는 임의로 인핸서를 함유함을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 하나 이상의 전사-향상 요소(TE 요소) 및 프로모터 및/또는 이종 목적 유전자 및/또는 선별가능 마커 및/또는 임의로 인핸서를 함유함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터에 관한 것이다.
다른 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는 목적 유전자의 계획적 통합을 위한 표적화 벡터임을 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는, 프로모터가 사람 사이토메갈리 바이러스의 얼리 프로모터(CMV-프로모터), SV40 얼리 프로모터, 아데노바이러스 주요 레이트 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복부 영역, 액틴-, 면역글로불린 또는 열-쇼크-프로모터(들), 바람직하게는 CMV-프로모터와 같은 이종 프로모터임을 특징으로 한다.
다른 바람직한 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는, 프로모터가 이종 프로모터, 바람직하게는 유비퀴틴/S27a-프로모터, 가장 바람직하게는 햄스터 유비퀴틴/S27a-프로모터임을 특징으로 한다.
특정 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는 본 발명에 따른 몇가지의 동일하거나 또는 상이한 핵산 또는 TE-요소의 조합을 포함함을 특징으로 하며, 여기서, 하나 이상의 핵산 또는 TE-요소는 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 위치하고/하거나 하나 이상의 핵산 또는 TE-요소는 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 위치한다.
바람직한 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는, 결합된 핵산 또는 TE 요소가 TE-06(서열번호 8) 및 특히 바람직하게는 TE-08(서열번호 10)임을 특징으로 한다.
핵산 또는 TE 요소의 바람직한 조합은 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 TE-06 요소(서열번호 8)가 있고 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 TE-06 요소(서열번호 8)가 있고 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 3개의 TE-06-요소(서열번호 8)가 있는 것이다(참조: 또한 도 13).
특히 바람직한 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는, 하나 이상의 TE-08-핵산(들) 또는 요소(들)(서열번호 10)가 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 있고 하나 이상이 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 있으며, 바람직하게는 하나의 TE-08 요소(서열번호 10)가 목적 유전자의 앞에 있고 하나가 뒤에 위치함을 특징으로 한다(참조: 또한 도 13).
TE-핵산 또는 요소의 다른 바람직한 조합은 목적 유전자의 앞 및/또는 뒤에 2개의 TE-08 핵산/요소(서열번호 10)가 있는 것이다.
다른 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는, 다수의 TE-06-핵산 또는 요소(서열번호 8)가 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 위치하고, 바람직하게는 3개가 위치함을 특징으로 한다(참조: 도 13).
바람직한 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는 하나 이상의 TE-08-핵산(들) 또는 요소(들)(서열번호 10)와 하나 이상의 TE-06 핵산 또는 요소(들)(서열번호 8)가 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 위치하고/하거나 뒤(즉, 3')에 위치함을 특징으로 하며; 바람직한 조합은 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 TE-08 핵산 또는 요소(서열번호 10)에 이은 TE-06-핵산 또는 요소(서열번호 8)의 조합이다(참조: 도 13).
다른 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는, 하나 이상의 TE-13 핵산 또는 요소(서열번호 15)가 목적 유전자의 앞(즉, 5') 및/또는 뒤(즉, 3')에 위치함을 특징으로 한다.
바람직한 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는 인테그라제를 추가로 함유함을 특징으로 한다.
다른 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 2개 이상의 진핵생물 발현 벡터로 공동-형질감염되는 반면, 2개의 벡터 중 하나 이상은 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 함유하며 다른 벡터는 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산을 임의의 조합, 위치 및 배향으로 함유하며, 임의로 또한 하나 이상의 목적 유전자를 암호화하고, 본 발명에 따른 이들 핵산은 다른 벡터와의 공동-통합에 의해 다른 공동-형질감염된 벡터상에 위치하는 목적 유전자에 자체의 전사- 또는 발현-향상 효과를 제공한다.
특정 양태에서, 진핵생물 발현 벡터는, 선별가능 마커가 DHFR 또는 Neo, 예를 들면 Neo F240I임을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 발현 벡터내에서 본 발명에 따른 핵산의 통합에 의해 특징화된 진핵생물 발현 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 진핵생물 발현 벡터를 함유함을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포에 관한 것이다.
특정 양태에서, 진핵 숙주 세포는 고 생산자이며, 즉, 이것이 본 발명에 따른 TE 요소 또는 핵산없이 비교가능한 진핵 숙주 세포보다 높은 비생산성을 가짐을 특징으로 하며, 당해 숙주 세포는 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배 또는 10배가 증가된 발현 수준, 또는 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 7배 이상 또는 10배 이상, 바람직하게는 5배 이하 또는 3배 이상으로 증가된 발현 수준을 갖는다.
특히 바람직한 양태에서, 진핵 숙주 세포는, 발현 벡터가 게놈내로 안정하게 통합됨을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 진핵 숙주 세포는 예를 들면, CHO, NS0, Sp2/0-Ag14, BHK21, BHK TK-, HaK, 2254-62.2(BHK-21-유도체), CHO-K1, CHO-DUKX(= CHO duk-, CHO/dhfr-), CHO-DUKX B1, CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL 세포, 바람직하게는, CHO 세포 및 특히 바람직하게는 CHO-DG44 세포와 같은 햄스터 또는 마우스 세포이다.
다른 양태에서, 진핵 숙주 세포는 사람, 마우스, 랫트, 원숭이 또는 설치류 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는 포유동물 세포이다.
다른 양태에서, 숙주 세포는 효모, 곤충, 조류 및 식물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵 세포이다.
다른 특정 양태에서, 진핵 숙주 세포는 BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1, A1, MCL-1, BOO, BRAG-1, NR-13, CDN-1, CDN-2, CDN-3, BHRF-1, LMW5-HL 또는 CED-9, 바람직하게는 Bcl-xL 또는 BCL-2, 가장 바람직하게는 BCL-xL와 같은 항-아폽토시스 유전자를 추가로 함유함을 특징으로 한다.
본 발명은 또한
(a) 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 본 발명에 따른 하나의 TE 요소를 목적 유전자를 함유하는 진핵생물 발현 벡터내에서 통합시키는 단계;
(b) 진핵 숙주 세포를 당해 발현 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
(c) 형질감염된 고-생산성 숙주 세포를 선별하는 단계에 의해 특징화되는, 안정하게 형질감염된 진핵 숙주 세포주를 개발하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(a) 목적 유전자(유전자들)를 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 본 발명에 따른 TE 요소를 함유하는 진핵생물 발현 벡터내에 통합시키는 단계;
(b) 진핵 숙주 세포를 당해 발현 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
(c) 형질감염된 고-생산성 숙주 세포를 선별하는 단계에 의해 특징화되는, 안정하게 형질감염된 진핵 숙주 세포주를 개발하는 방법에 관한 것이다.
특정 양태에서, 당해 방법은 하나 이상의 추가의 증폭 단계를 특징으로 한다.
본 발명은 또한
(a) 숙주 세포를 바람직하게는 변형된, 목적 단백질/생성물 및 증폭가능한 선별가능 마커 DHFR을 암호화하는 유전자로 형질감염시키는 단계 [여기서, 전사 또는 발현을 향상시키기 위하여, 적어도 목적 유전자(유전자들)는 청구의 범위 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산과 기능적으로 연결되어 있다],
(b) 세포를 상이한 유전자가 발현하도록 하는 조건하에서 배양하는 단계,
(c) 세포를 예를 들면, G418과 같은 선별제의 존재하에 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지 속에서 배양함으로써 이들 공동-통합된 유전자를 선택하는 단계, 및
(d) 세포를 예를 들면, 적어도 메토트렉세이트와 같은 증폭가능한 선별가능 마커 유전자의 증폭을 허용하는 선별제의 존재하에서 배양함으로써 공동-통합된 유전자를 증폭시키는 단계에 의해 특징화되는, 재조합 포유동물 세포를 제조하고 선별하는 방법에 관한 것이다.
특정 양태에서, 당해 방법은, 형질감염된 세포를 적어도 200 ㎍/mL G418, 바람직하게는 400 ㎍/mL 이상의 G418가 보충되고 증가하는 농도의 MTX가 첨가된 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지 속에서 배양함을 특징으로 한다.
다른 특정 양태에서, 당해 방법은, 제1 증폭 단계에서 MTX의 농도가 적어도 100 nM 또는 적어도 250 nM이고 단계적으로 1 μM 이상으로 증가됨을 특징으로 한다. 개개의 경우, MTX 농도는 2μM일 수 있다.
다른 특정 양태에서, 당해 방법은 추가의 클로닝 단계에 의해 특징화된다.
본 발명에 따른 방법의 다른 양태에서, 숙주 세포는 예를 들면, CHO, NS0, Sp2/0-Ag14, BHK21, BHK TK-, HaK, 2254-62.2(BHK-21-유도체), CHO-K1, CHO-DUKX(= CHO duk-, CHO/dhfr-), CHO-DUKX B1, CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL 세포, 바람직하게는, CHO 세포 및 특히 바람직하게는 CHO-DG44 세포와 같은 설치류/햄스터 세포이다.
본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 발현 벡터는 DHFR 또는 NPT, 예를 들면 NPT F240I 또는 NPT D227G와 같은 선별가능 마커를 함유한다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 양태에서, 고 생산자의 비율은 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배 또는 10배 이상 또는 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 7배 이상 또는 10배 이상, 바람직하게는 5배 이하 또는 3배 이상 증가한다.
본 발명은 또한,
(a) 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 본 발명에 따른 하나의 TE 요소를 목적 유전자를 함유하는 진핵생물 발현 벡터 속에서 통합시키는 단계,
(b) 진핵 숙주 세포를 당해 발현 벡터로 형질감염시키는 단계,
(c) 고-생산성 형질감염된 숙주 세포를 선별하는 단계, 및
(d) 목적 유전자(들)의 발현을 허용하는 조건하에서 수득된 고-생산성 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계에 의해 특징화되는, 생약제 생성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(a) 목적 유전자(유전자들)를 본발명에 따른 하나 이상의 핵산 또는 본 발명에 따른 TE 요소를 함유하는 진핵생물 발현 벡터내에서 통합시키는 단계;
(b) 진핵 숙주 세포를 당해 발현 벡터로 형질감염시키는 단계;
(c) 고-생산성 형질감염된 숙주 세포를 선별하는 단계; 및
(d) 목적 유전자(들)의 발현을 허용하는 조건하에서 수득된 고-생산성 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계로 특징화되는, 안정하게 형질감염된 고-생산성 진핵 숙주 세포주를 개발하는 방법에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 추가의 증폭 단계로 특징화된다.
특정 양태에서, 본 발명에 따른 방법은
(e) 목적 단백질을 수거하고 정제하는 추가의 단계에 의해 특징화된다.
본 발명은 진핵 숙주 세포내 발현 시스템에서 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키거나 또는 생약제 생성물을 제조하기 위한, 진핵생물 발현 벡터에서의 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 전사-향상 요소(TE 요소)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전자도입 동물 또는 식물을 생산하기 위한 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 전사-향상 요소(TE 요소)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전자 치료요법에서 본 발명에 따른 핵산 또는 전사-향상 요소(TE 요소)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 특히 약제로서 또는 약제학적 조성물에서 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 전사-향상 요소(TE 요소)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 본 발명에 따른 TE 요소(들), 임의로 발현 벡터(들), 임의로 숙주 세포(들) 및 임의로 형질감염 시약(들)으로 이루어진 키트에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 염색체 통합시 TE 요소 TE-00(서열번호 2)을 제외하고, 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키는, 서열번호 1을 갖는 핵산, 특히 분리된 핵산, 보다 정확하게는, 전사-향상 또는 발현-향상 핵산 요소(TE 요소) 또는 이의 단편 또는 유도체에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은, TE 요소 TE-00(서열번호 2), TE-04(서열번호 6) 및 TE-06(서열번호 8)이 제외된 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은, TE 요소 TE-00(서열번호 2), TE-04(서열번호 6), TE-05(서열번호 7) 및 TE-06(서열번호 8)이 제외된 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
목적 유전자의 발현의 증가는 예를 들면, ELISA를 사용하여 생성물 역가를 측정함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 160 bp 길이에 걸쳐 있는, 바람직하게는 170 bp 길이에 걸쳐 있는 본 발명에 따른 TE 요소, 단편 또는 유도체에 관한 것이다. 특정 양태에서, TE 요소 단편은 160bp 내지 1.2 kb 또는 170 bp 내지 1 kb, 바람직하게는 200 bp에 걸쳐 있고 200 bp 내지 1 kb의 길이이다.
바람직한 양태에서, TE 요소 단편은 1 bp 내지 1578bp(이는 요소 TE-00(서열번호 2)의 단편 5'에 상응한다)의 서열번호 1의 부분내에 있고, 길이가 113 bp 또는 132 bp 또는 바람직하게는 160 bp 또는 170 bp에 걸쳐있다. 특정 양태에서, TE 요소 단편은 113 bp 내지 1.2 kb 또는 132 bp 내지 1.2 kb 또는 160 bp 내지 1.2 kb, 바람직하게는 200 bp에 걸쳐 있고 200 bp 내지 1 kb의 길이이다.
다른 양태에서, TE 요소 단편은 어떠한 인접한 서열없이 존재한다. 이는, 단편이 보다 큰 서열 또는 서열 영역의 일부가 아님을, 예를 들면, 다른 어떠한 서열도 이의 앞(5') 또는 뒤(3')에 부착되어 있지 않음을 의미한다.
다른 특정 양태에서, 본 발명은 어떠한 CpG 섬도 함유하지 않는 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
TE 요소가 있는 및 없는 진핵 숙주 세포와 비교하는 경우, 목적 유전자의 비생산성의 상대적 변화가 7배까지 증가될 수 있다는 것이 하기 실시예로부터 명백하다.
생성물 역가 및 비생산성에 관한 데이터의 수집은, 평균적으로 서열번호 1의 단편 또는 유도체인 TE 요소를 갖는 세포 풀 거의 모두가 TE 요소가 없는 세포 풀보다 목적 유전자를 더 많이 발현하였음을 나타내었다. TE-요소 01(서열번호 3), 02(서열번호 4) 및 08(서열번호 10)은, 상이한 선별가능 마커(NPT 또는 DHFR)를 각각의 경우에 사용하는 2개의 독립적인 형질감염 시리즈에서 가장 높은 생산성을 얻었다. 이들은 생산성을 4 내지 7배로 증가시킬 수 있다. 확실하게, 3 kb 및 2.5 kb의 TE 요소 01(서열번호 3) 및 02(서열번호 4)는 발현 벡터에 추가로 부착하기에는 매우 크다. 한편, 보다 흥미로운 것은 TE 요소 08(서열번호 10)이며, 이는 단지 크기가 1 kb이며, 발현을 5 내지 6배 증가시킬 수 있다. 2개의 형질감염 시리즈에서 TE 요소 06(서열번호 8)은 단지 381 bp의 크기로 비생산성이 3배가 되게 하였다. 발현 벡터를 가능한 작게 남기는 것이 매우 유리한데, 이는, 보다 작은 벡터가 일반적으로 보다 안정하며 클로닝 및 형질감염동안 취급하기 용이하기 때문이다. 따라서, TE-요소 06(서열번호 8) 및 08(서열번호 10) 및 13(서열번호 15)은 전사-향상 요소로서 사용하기에 특히 흥미롭다.
다음 실시예는 또한, TE 요소 03(서열번호 5), 04(서열번호 6) 또는 07(서열번호 9)을 함유한 세포 풀이 목적 유전자의 약 3 내지 3.5배 발현을 나타내었으며 TE 요소 10(서열번호 12), 11(서열번호 13) 또는 12(서열번호 14)를 갖는 세포 풀이 목적 유전자의 약 2배 발현을 나타내었음을 나타낸다.
선별가능 마커로서의 NPT F240I과 결합된 TE 요소 08(서열번호 10)은 TE 요소가 없는 대조군 풀과 비교하여 목적 유전자의 비생산성을 가장 크게 5배로 증가시킴이 입증되었다. 선별가능 마커로서의 DHFR과 함께, TE 요소 08(서열번호 10)은 약 6.0배의 보다 우수한 증가를 나타낸다.
또한, 선별가능 마커로서 DHFR을 사용한 시험 시리즈에서 TE 요소 02(서열번호 4)는 목적 유전자의 생산성의 6.8배의 증가를 나타낸다.
가장 큰 증가(15배)는 요소 13에 의해 일어난다.
하기 실시예는 또한, 하나의 시험 시리즈에서 TE 요소 05(서열번호 7) 및 09(서열번호 11)를 지닌 풀이 목적 유전자의 발현의 증가를 나타내지 않고 하나의 시험 시리즈에서 심지어 대조군 풀보다 보다 낮은 목적 유전자의 발현을 나타내었다. 따라서, 이들 서열 영역내 이들 2개의 요소 및 가능하게는 부분 단편은, 반드시 그런 것은 아니지만, 특정 환경 하에서 억제 효과를 가질 수 있다.
또한, 하기 실시예에서, 시험한 상이한 TE-요소에 대한 비생산성의 상대적 변화는 대부분 벡터 시스템과 독립적으로, 즉, 특정 목적 유전자와 독립적으로 또는 사용된 선별가능 마커와 독립적으로 달성된다.
하기 실시예는 또한, 마커 유전자의 발현의 변화가 목적 유전자의 발현의 변화와 관련되어 있음을 나타낸다.
하기 실시예로부터, 시험한 TE 요소의 어느 것도 향상 효과를 가지지 않음이 명백하다. 따라서, TE-요소는 단지 염색체 수준에서 목적 유전자의 발현의 증가를 유발한다.
다음 실시예는 또한, 예를 들면, TE 요소 06 및 08 또는 21과 같은 다수의 동일하거나 또는 상이한 짧은 TE-요소들의 조합 또는 연쇄(concatenation)가 추가의 발현-향상 효과를 가져올 수 있음을 나타낸다.
약어
AP: 알칼리성 포스파타제
Asp(=D): 아스파르트산
bp: 염기 쌍
CHO: 차이니즈 햄스터 난소
DHFR: 디하이드로폴레이트-리덕타제
ELISA: 효소-결합된 면역흡착 검정
FACS: 형광-활성화된 세포 분류기
GFP: 녹색 형광 단백질
Gly(=G): 글라이신
HT: 하이포크산틴/티미딘
IgG: 면역글로불린 G
Ile(=I): 이소류신
IRES: 내부 리보좀 진입 부위
kb: 킬로베이스
mAb: 모노클로날 항체
MCP-1: 단핵구 화학주성 단백질-1
MTX: 메토트렉세이트
NPT: 네오마이신-포스포트랜스퍼라제
PCR: 폴리머라제 연쇄 반응
Phe(=F): 페닐알라닌
SEAP: 분비된 알칼리성 포스파타제
Ub: 유비퀴틴
UTR: 비해독 영역
방법
세포 배양 및 형질감염
세포 CHO-DG44/dhfr-/-(참조: Urlaub et al., 1983)를 세포 배양 플라스크내 하이포크산틴 및 티미딘(HT)이 보충된 혈청-미함유 CHO-S-SFMII 배지(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE)에서 37℃에서 습한 대기 및 5% CO2에서 현탁 세포로서 영구적으로 배양하였다. 세포 수 및 생존성을 코울터 계수기(Coulter Counter) Z2[제조원: 베크만 코울터(Beckmann Coulter)] 또는 세덱스[제조원: 인노바티스(Innovatis)]를 사용하여 측정한 후 세포를 1 내지 3 x105/mL의 농도로 접종하고 2 내지 3일 마다 수행하였다. 리포펙타민 플러스 시약(Lipofectamine Plus Reagent)[제조원: 인비트로겐 게엠베하(Invitrogen GmbH)]을 CHO-DG44의 형질감염에 사용하였다. 각각의 형질감염 혼합물에 대해 총 1.0 내지 1.3㎍의 플라스미드-DNA, 4㎕의 리포펙타민 및 6㎕의 플러스 시약을 제조업자의 지시에 따라 함께 혼합하고 0.8 mL의 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지내 200㎕ 내지 6 x105개 세포의 용적으로 가하였다. 세포 배양기에서 37℃로 3시간 배양한 후, 2 mL의 HT-보충된 CHO-S- SFMII 배지를 가하였다. 48시간의 배양 시간 후, 형질감염 혼합물을 수거(일시적인 형질감염)하거나 또는 선별에 적용시켰다. NPT-기반 선별을 위해, 세포를 형질감염한지 2일 후 400 ㎍/mL의 G418(제조원: 인비트로겐)이 함유된 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지로 옮겼다. DHFR-기반 선별을 위해, 세포를 형질감염 후 2일째에 HT-미함유 CHO-S-SFMII 배지로 옮겼다. 하나의 발현 벡터가 DHFR을 함유하고 다른 발현 벡터가 NPT 선별가능 마커를 함유하는 공동-형질감염 상황에서의 DHFR- 및 NPT-기반 선별에서, 세포를 형질감염한지 2일째에 하이포크산틴 및 티미딘을 가하지 않은 CHO-S-SFMII 배지내로 옮기고 또한 G418(제조원: 인비트로겐)을 400 ㎍/mL의 농도로 배지에 가하였다.
통합된 이종 유전자의 DHFR-기반 유전자 증폭은 선별제 MTX(제조원: 독일 다이센호펜 소재의 시그마)를 5 내지 2000 nM의 농도로 HT-미함유 CHO-S-SFMII 배지에 가하여 수득할 수 있다.
발현 벡터
발현을 분석하기 위하여, pAD-CMV 벡터(참조: Werner et al., 1998)를 기반으로 하고 CMV 인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터(참조: 제WO 97/15664호) 또는 CMV 인핸서/CMV 프로모터의 조합에 의해 이종 유전자의 발현을 매개하는 진핵생물 발현 벡터를 사용하였다. 기본 벡터 pBID는 증폭가능한 선별가능 마커(참조: 예를 들면, 제EP-0-393-438호)로서 작용하는 dhfr-미니유전자(minigene)를 함유하지만, 벡터 pBING에서 dhfr-미니유전자는 변형된 NPT 유전자에 의해 대체되어 있 다. 이것이 NPT 변이체 D227G(Asp227Gly)이다. NPT 변이체 D227G 및 IRES-GFP 유전자 영역을 사용한 pBING의 클로닝을 문헌(참조: 제WO2004/050884호)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 기본 플라스미드 pTE4는 선별가능 마커로서 NPT 변이체 F240I(Phe240Ile)를 함유하며 플라스미드 pBING의 유도체이다. NPT 변이체 F240I에 의한 NPT 변이체 D227G의 치환과는 달리, GFP는 또한 벡터 pDsRed2[제조원: 클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재]로부터의 적색 형광 단백질 DsRed2에 의해 치환되었다. 기본 플라스미드 pTE5는 선별가능 마커로서 DHFR을 함유하며 벡터 pBIDG(참조: 제WO2004/050884호)의 유도체이고, 여기서, 다시, GFP는 벡터 pDsRed2(제조원: 클론테크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터의 적색 형광 단백질 DsRed2에 의해 치환되었다.
사람화된 모노클로날 IgG1 항체를 발현시키기 위해, 중쇄를 1.4 kb SalI/SpeI 단편으로서 XbaI 및 SalI로 분해된 플라스미드 pBID내로 클로닝하여, 플라스미드 pBID-HC(도 1A)를 수득하였다. 한편, 경쇄를 0.7 kb BamHI/HindIII 단편으로서 플라스미드 pBING의 절단 부위내로 클로닝하여, 플라스미드 pBING-LC(도 1A)를 생성시켰다. 사람 MCP-1 cDNA(참조: Yoshimura et al., 1989)를 벡터 pTE4 또는 pTE5의 상응하는 절단 부위내로 0.3 kb HindIII/EcoRI 단편으로서 클로닝하여 플라스미드 pTE4/MCP-1 및 pTE5/MCP-1(참조: 도 1B 및 도 2 각각)을 생성시켰다.
FACS (형광-활성화된 세포 분류기)
유세포 분석을 BD FACScalibur[제조원: 비디 바이오사이언스(BD Bioscience)]로 수행하였다. FACS를 헬륨-아르곤 레이저로 488 nm의 여기 파장으로 설정했다. 형광 강도는 특정 형광 단백질에 적합한 파장에서 흡수되고, 부착된 소프트웨어 셀 퀘스트 프로(Cell Quest Pro)에 의해 처리된다.
ELISA (효소- 결합된 면역흡착 검정)
안정하게 또는 일시적으로 형질감염된 CHO-DG44 세포의 상청액중 MCP-1 역가를 ELISA에 의해 OptEIA 사람 MCP-1 세트 키트를 사용하여 제조업자(제조원: 비디 바이오사이언시스 파밍젠, 미국 델라웨어주 하이델베르크 소재)의 지시에 따라서 정량하였다. 안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포로부터의 상청액중 IgG1 mAb를 ELISA에 의해 표준 과정(참조: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, 업데이트됨)에 따라, 한편으로는 염소 항-사람 IgG Fc 단편[제조원: 이아노바(Dianova), 독일 함부르크 소재)을 사용하고 다른 한편으로는 AP-접합된 염소 항-사람 카파 경쇄 항체(제조원: 시그마)를 사용하여 정량하였다. 정제된 IgG1 항체를 표준물로서 사용하였다. 생산성(pg/세포/일)을 하기의 식으로 계산하였다: pg/((Ct-Co)t/ln(Ct-Co)) (여기서, Co 및 Ct는 접종 및 수거 각각에서의 세포 수이고, t는 배양 시간이다)
SEAP 검정
일시적으로 형질감염된 CHO-DG44 세포로부터의 배양 상청액 중 SEAP 역가를 SEAP 리포터 유전자 검정을 사용하여 제조업자[제조원: 로슈 디아그노스틱스 게엠 베하(Roche Diagnotstics GmbH), 독일 만하임 소재]의 지시에 따라 정량하였다.
실시예 1: TE 요소 TE -A의 분리 및 클로닝
유비퀴틴/S27a 유전자에 대한 암호화 영역 외에도, Ub/S27a-프로모터를 포함하는 인접한 5'UTR 영역을 포함하는, 제WO97/15664호에 기술된 햄스터 게놈으로부터의 서열로부터 출발하여, 지금까지 알려지지 않은 서열 영역을 보다 상류로부터 분리하였다. 이를 위해, 어댑터-연결된 게놈 CHO-DG44 DNA를 "네스티드(nested) PCR"을 위한 매트릭스로서 사용하였다. 제1 PCR을 제WO97/15664호에 서열번호 5 하에 열거된 서열의 5' 영역내 햄스터 서열 또는 어댑터에 대해 상보성을 갖는 프라이머의 조합을 사용하여 수행하였다 (프라이머 Ub20: 5'-CTCCACACATTTACACATGGACAC-3'(서열번호 39); 제WO97/15664호로부터의 서열번호 5의 뉴클레오타이드 62 내지 85번(상보적 서열)에 상응함). 이후에, 제2 PCR을 내부 어댑터 프라이머 및 내부("네스티드") 햄스터-특이적인 프라이머로 이루어진, 제2 프라이머 조합을 사용하여 수행하였다 (프라이머 Ub21: 5'-GGGTTTCTCTGTGTAATAGCCATG-3'(서열번호 40); 제WO97/15664호로부터의 서열번호 5의 뉴클레오타이드 16 내지 39(상보적 서열)에 상응함). 공지된 서열을 갖는 햄스터-특이적인 프라이머에서 시작되어 상류에 위치한 새로운 미공지된 서열내로 합쳐진 수득되는 오버랩핑 DNA 단편을 pCR2.1 TOPO 벡터(제조원: 인비트로겐) 내로 서브클로닝하고 서열분석에 의해 분석하였다. 모든 348 bp의 새로운 지금까지 공지되지 않은 서열을 햄스터 Ub/S27a 유전자의 상류로부터 수득하였다.
당해 새로운 서열 정보를 기초로 하여, 다른 추가의 상류 DNA 영역을 위에서 기술한 "네스티드 PCR"을 사용하여 분리하였다. 이때, 제1 PCR을 어댑터 프라이머 및 프라이머 Ub33 (5'-ATCTCACTGTGTCTACCAACTTAG-3'(서열번호 41); 새로이 분리된 384 bp 서열의 5' 영역내에 위치함; 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1268 내지 1291(상보적 서열)에 상응함)을 사용하여 수행하고; 제2 PCR을 보다 내부에 위치한 내부 어댑터 프라이머 및 햄스터-특이적인 프라이머 Ub32a를 사용하여 수행하였다 (5'-TCTGCACCACCACTACCTGACT-3'(서열번호 42); 새로이 분리된 384 bp 서열내 프라이머 Ub33으로부터 상류에 위치함; 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1243 내지 1264(상보적 서열)에 상응함). 수득된 증폭된 물질을 pCR2.1 TOPO 벡터(제조원: 인비트로겐)내로 서브클로닝하고 서열분석하였다. 이는 햄스터 Ub/S27a-유전자의 상류의 새로운 지금까지 알려지지 않은 서열의 다른 1239 bp를 함유하였다. 오버랩핑 PCR 단편으로부터의 서열 정보를 사용하여, 프라이머
a) Ub34 (5'-CTAAGAGTACTTGCCATGAGAGCCTGAA-3'(서열번호 43); 새로이 분리된 1239 bp 서열의 가장 바깥쪽 5' 말단에 위치함; 서열번호 1에 단지 부분적으로 존재함(뉴클레오타이드 1 내지 14번)) 및
b) Ub35 (5'-CATTGATACACCACCAAAGAACTTG-3'(서열번호 44); 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1941 내지 1965(상보적 서열)에 상응함)
를 사용하여, 지금까지 분리된 부분적 단편 모두를 포함하고 제WO97/15664호로부터의 서열번호 5의 5' 서열 영역내로 383 bp 연장된, CHO-DG44의 게놈 DNA로부터의 점착성 서열 영역을 PCR에 의해 증폭시켰다.
수득되는 2 kb DNA 단편을 내인성 EcoRI 절단 부위(위치 353 내지 358)를 통해 제WO 97/15664호에 기술된 서열번호 5의 5' UTR 영역과 연결시켰지만, 상기 절단 부위는 클레노우(Klenow) DNA 폴리머라제를 사용한 충전 반응에 의해 제거되었다. 새로이 분리된 게놈 영역내 제2 내인성 EcoRI 절단 부위를 동일한 방법으로 제거하여, 본래의 게놈 서열에 추가적인 서열번호 1내 뉴클레오타이드 326 내지 329를 생성시켰다. 당해 방법으로, 모든 8개의 추가적인 뉴클레오타이드를 내인성 햄스터 서열과 비교하여 서열번호 1내로 삽입하였다. 햄스터 Ub/S27a 유전자로부터 상류에 위치한 서열 영역으로부터 수득되는 3788 bp DNA 단편을 서열번호 1을 갖는 TE 요소 A로 명명하고 벡터 pBluescript SKM[제조원: 스트라타젠(Stratagene) 캘리포니아주 라 졸라 소재]내로 서브클로닝하였다.
실시예 2: 다양한 TE 발현 벡터의 생성
CHO 게놈으로부터의 3.8 kb TE-요소 TE-A(도 3, 서열번호 1)로부터 출발하여, TE 요소 TE-A과 비교하여 5'- 또는 3'-말단에 결실을 갖는 각종 단편을 PCR로 생산하였다(참조: 도 4 및 도 5). 이들 단편을 합성하기 위하여 정방향 프라이머 및 하나의 역방향 프라이머의 조합을 사용하였다(참조: 도 5 및 도6). 클로닝 목적을 위해, BamHI 절단 부위를 단편의 5' 말단에 부착시키고 BsrGI 절단 부위를 프라이머에 의해 단편의 3'-말단에 부착시켰다. 이러한 방법으로 TE-01 내지 TE-12로 명명된 상이한 길이의 12개 TE-요소를 생성시켰다(참조: 도 4 및 5). BsrGI 및 BamHI로 분해한 후, 이들을 정방향 배향으로 기본 플라스미드 pTE4/MCP-1(도 1B) 또는 pTE5/MCP-1(도 2)의 어댑터 영역내로 클로닝하였다. 단편 TE-00(서열번호 2)를 TE-A의 서브클론으로부터 SacII-제한 효소 분해에 의해 분리하고 기본 벡터 pBING-LC(도 1A) 또는 pBID-HC(도 1A)내로 정방향 배향 및 역방향 배향 둘 모두로 프로모터/인핸서 요소의 5'에 위치한 SpeI 절단 부위를 통해 클로닝하였다.
TE -요소의 서열
TE-A (서열번호 1)
Figure 112009012054757-PCT00001
Figure 112009012054757-PCT00002
TE 요소 00 (서열번호 2)
Figure 112009012054757-PCT00003
TE 요소 01 (서열번호 3)
Figure 112009012054757-PCT00004
Figure 112009012054757-PCT00005
TE 요소 02 (서열번호 4)
Figure 112009012054757-PCT00006
TE 요소 03 (서열번호 5)
Figure 112009012054757-PCT00007
TE 요소 04 (서열번호 6)
Figure 112009012054757-PCT00008
TE 요소 05 (서열번호 7)
Figure 112009012054757-PCT00009
TE 요소 06 (서열번호 8)
Figure 112009012054757-PCT00010
TE 요소 07 (서열번호 9)
Figure 112009012054757-PCT00011
TE 요소 08 (서열번호 10)
Figure 112009012054757-PCT00012
TE 요소 09 (서열번호 11)
Figure 112009012054757-PCT00013
TE 요소 10 (서열번호 12)
Figure 112009012054757-PCT00014
TE 요소 11 (서열번호 13)
Figure 112009012054757-PCT00015
TE 요소 12 (서열번호 14)
Figure 112009012054757-PCT00016
Figure 112009012054757-PCT00017
실시예 3: GFP 및 면역글로불린 G1 ( IgG1 )의 발현에 미치는 TE 요소 변이체 TE -00의 영향
세포질에 위치한 GFP(녹색 형광 단백질) 및 분비된 모노클로날 IgG1-항체의 발현에 미치는 TE 요소 TE-00의 효과를 CHO-DG44 세포를 사용한 2개의 별개의 안정한 형질감염 시리즈에서 시험하였다. 이를 위해, CHO-DG44 세포를 다음의 플라스미드 조합 또는 플라스미드 변이체를 사용하여 공동-형질감염시켰다:
a) TE 요소가 없는 대조군 플라스미드 pBING-LC(도 1A) 및 pBID-HC(도 1A)
b) 정방향 배향으로 프로모터/인핸서로부터 상류에 통합된 TE 요소 TE-00을 갖는 pBING-LC 및 pBID-HC
c) 역방향 배향으로 프로모터/인핸서로부터 상류에 통합된 TE 요소 TE-00을 갖는 pBING-LC 및 pBID-HC
형질감염 시리즈 A에서 4개의 풀을 생산하고, 형질감염 시리즈 B에서 10개의 풀을 변이체당 생산하였다. 등몰량의 2개의 플라스미드를 사용하였다. 동일한 총 분자수에 도달하기 위하여, 시리즈 A에서 대조군 혼합물에 사용된 DNA의 총량은 1 ㎍인 반면, TE 요소를 함유하는 혼합물에서 당해 양은 1.3㎍이었다. 이러한 차이는 상이한 플라스미드 크기로부터 초래되었는데, TE 요소를 갖는 플라스미드는 대조군 플라스미드보다 1.3배 크기 때문이다. 형질감염 혼합물에 사용된 DNA의 양은 형질감염 효율에 영향을 미칠 수 있으므로, 시리즈 B에서 DNA의 총량은 300 ng의 "모크(mock) DNA"(= 생성물 유전자, TE 요소 및 진핵세포 선별가능 마커가 없는 벡터)로 균형을 맞추어, 대조군 플라스미드를 갖는 혼합물은 또한 총 1.3㎍의 DNA를 함유하였다. 음성 대조군으로서, 모크-형질감염된 풀을 또한 각각의 형질감염 시리즈에서 수행하였는데, 즉, 동일한 방법으로 처리하였지만, 형질감염 혼합물에 DNA는 첨가하지 않았다. 안정하게 형질감염된 세포의 선별은 -HTT/+G418(400 ㎍/mL)을 사용한 형질감염 후 2일째에 수행하였다. 선별 후, GFP-발현 세포를 FACS로 측정하였다. 형질감염 시리즈 둘다에서 플롯 오버레이에 있어 변이체의 비교는 대조군 플라스미드를 갖는 풀에서 보다 TE 요소 00을 갖는 풀의 경우 GFP-발현 세포의 보다 높은 비율을 얻었다 (도 7). TE 요소가 정방향 배향 또는 역방향 배향으로 플라스미드내에 존재하는 풀 사이에, 어떠한 종류의 차이도 발견할 수 없었다. TE 요소 00의 효과, 즉 혼합된 집단에서 보다 높은 생산성을 갖는 세포 비율의 증가는 결과적으로 이의 배향과 무관하였다. 또한, 풀의 IgG1 역가 및 비생산성은 6 내지 8개의 계대배양(계대배양 리듬 2-2-3 일)의 기간에 걸쳐 측정하였다. 여기서 다시, TE 요소 00을 함유하는 세포 풀은 TE 요소를 갖지 않은 세로 풀보다 평균적으로 더 많이 발현하였음을 입증하였다(도 9, 시리즈 A 및 B). 시리즈 둘다에서, 풀 생산성이 2배가 된 것은 TE 요소의 존재의 결과로 입증될 수 있는 반면, 상기 요소가 발현 플라스미드내에서 클로닝된 배향은 관련성이 없었다.
실시예 4: MCP -1의 발현에 미치는 TE 요소 TE -01 내지 TE -12의 영향
분비된 MCP-1의 발현에 미치는 TE 요소 TE-01 내지 TE-12의 효과를 TE 요소가 없는 발현과 비교하여 CHO-DG44 세포의 3개의 안정한 형질감염 시리즈(시리즈 C, D 및 E)에서 시험하였다. 모든 3개의 시리즈에서, 6개의 풀이 플라스미드 변이체당 생산되었다. 기본 플라스미드는 시리즈 C 및 D에서 pTE4/MCP-1(도 1B; 선별가능 마커 NPT - 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 F240I), 시리즈 E에서 pTE5/MCP-1(도 2; 선별가능 마커 DHFR = 디하이드로폴레이트-리덕타제)이었다. 이들은 TE 요소를 함유하지 않거나(= 대조군 혼합물) 또는 프로모터/인핸서의 상류에 정방향 배향으로 TE 요소 TE-01 내지 TE-12 중 하나를 함유하였다. 형질감염 혼합물내 DNA의 상이한 양에 의해 유발된 형질감염 효율에 미치는 영향을 최소화하기 위하여, 총 1.2㎍의 플라스미드 DNA를 사용하였다. 도입된 TE 요소의 크기에 따라, 플라스미드 크기는 6.7 kb 내지 10.7 kb로 변하였다. 그러나, 시험 플라스미드의 분자의 총 수가 모든 혼합물에서 일정하게 유지될 수 있음을 보증하기 위하여, 보다 작은 플라스미드 분자를 갖는 혼합물에서 DNA의 총량을 임의의 진핵생물 선별가능 마커와 생성물 유전자 및 TE 요소를 함유하지 않는 소위 모크 플라스미드를 사용하여 균형을 맞추었다. 음성 대조군으로서, 각각의 형질감염 시리즈에 대해, 모크-형질감염된 풀을 또한 수행하였는데, 즉, 동일한 방법으로, 그러나 DNA를 형질감염 혼합물에 첨가하지 않고 처리하였다. 안정하게 형질감염된 세포의 선별은 형질감 염 후 2일째에 시리즈 C 및 D에서 HT-보충된 CHO-S-SFMII +G418(400 ㎍/mL) 및 시리즈 E에서 HT-미함유 CHO-S-SFMII를 사용하여 수행하였다.
선별 후, dsRed2-발현 세포를 FACS로 측정하였다. 도 8은 시리즈 C로부터 살아있는 형질감염된 세포의 상대적인 형광 퍼센트를 나타낸다. 대조군 풀과 비교하여, TE 요소 TE-01, TE-02 또는 TE-08을 함유하는 풀은, 약 3 내지 3.5배 이상의 dsRed2-발현 세포를 함유하였고 요소 TE-06를 갖는 풀은 dsRed2-발현 세포를 대략 2배 함유하였다. 한편, 단편 TE-05 및 TE-09를 갖는 풀에서, 대조군과 비교하여 dsRed2-발현 세포의 비율에 있어 명백한 증가는 없었다.
또한, MCP-1 생성물 역가 및 비생산성은 6회의 게대배양(계대배양 리듬 2-2-3일)의 기간에 걸쳐 상승되었다. 도 9(시리즈 C 및 D) 및 도 10(시리즈 E)는 상대적인 MCP-1 비생산성을 나타낸다. 선별가능 마커로서 NPT-F240I과 결합된 요소 TE-08은 TE 요소가 없는 대조군 풀과 비교하여 MCP-1 비생산성에 있어 5.3배의 최대 증가를 나타내었다(도 9). 선별가능 마커로서 DHFR과 결합되면, 6배 증가가 당해 변이체를 사용하여 달성되었다(도 10). TE 요소 01, 02 및 03은 NPT-선별된 풀에서 생산성의 4 내지 4.5배 증가를 초래하였고(도 9) 대조군 풀과 비교하여 DHFR-선택된 풀에서 생산성의 2.6 내지 6.8배 증가를 초래하였다(도 10). 단지 300 bp 길이인 TE 요소 06은 또한 모든 시리즈에서 2.5 내지 3.2배로 생산성을 증가시킬 수 있었다(도 9 및 10). 단편 TE-04 및 TE-07을 사용하여 달성된 증가도 이러한 크기였다(도 10). 다소 더 긴 단편 TE-10, TE-11 및 TE-12가 사용된 풀은 MCP-1 발현이 2배가 되었다(도 9 및 10). 명백하게, 모든 이러한 풀에서, 생성물을 거의 또는 전혀 발현하지 않는 세포의 수가 감소하였고, 따라서 세포 집단에서 고 생산자의 전체 비율이 증가하였다. 이는, TE 요소가 음성 염색체 위치 효과를 억제하거나, 차폐하거나 또는 제거할 수 있음을 나타낸다.
대조적으로, 발현은 dsRed2-발현에서 이미 관측된 바와 같이(도 8), 단편 TE-05 및 TE-09의 사용에 의한 조절과 비교하여 증가될 수 없었고 일부 경우에는 더 낮았다(도 9 및 10). 따라서, 이들 서열 영역내 이들 요소 또는 부분 단편은 아마도 억제 효과도 지닐 수 있을 것이다.
전체적으로, 관측된 MCP-1 발현의 변화는 안정한 세포 풀내 dsRed2-발현 세포의 비율과 관련이 있었다.
실시예 5: 인핸서 활성에 미치는 TE 요소 TE -01 내지 TE -12의 시험
CHO-DG44 세포의 일시적인 형질감염에 의해 시험을 수행하여 생성물 발현에 있어 관측된 증가가 TE 요소의 염색질-개방 효과에 실질적으로 기초하는지, 또는 이것이 인핸서 활성에 기초하는지를 시험하였다. 플라스미드는 일시적인 형질감염시 게놈내로 통합되지 않으므로, 유전 정보는 플라스미드로부터 직접적으로 판독된다. 따라서, 어떠한 염색체 위치 효과도 발생할 수 없다. 그럼에도 불구하고 유전자 발현에 있어 긍정적인 효과가 있는 경우, 이들은 TE 요소에 존재하는 인핸서에 놓일 수 있다. 이러한 인핸서는 위치 및 배향에 상관없이 시스 위치에서 프로모터의 활성에 작용하여 기능적으로 연결된 유전자의 전사를 자극할 수 있다.
도 11에 나타낸 일시적인 발현 연구에서, 6개의 풀을 기본 플라스미드 pTE4/MCP-1(= 제어; 도 1B) 또는 이의 유도체로 형질감염시켰으며, 이들 각각은 프로모터/인핸서의 상류에 TE 요소 TE-01 내지 TE-12 중 하나를 추가로 함유하였다. 총 3mL의 용적에서 48시간 배양 후, 수거 및 MCP-1 역가의 측정을 ELISA에 의해 세포 배양 상청액 속에서 수행하였다. 형질감염 효율의 차이는 SEAP 발현 플라스미드를 사용한 공동-형질감염(형질감염 혼합물당 100 ng의 플라스미드 DNA의 첨가) 및 SEAP 활성의 후속적인 측정에 의해 교정되었다. 도 11은 6개의 동등한 풀로부터의 평균을 나타낸다. 당해 데이터는, 세포 배양 상청액내 MCP-1 역가가 모든 풀에서 매우 유사하였으며, TE 요소가 없는 대조군 플라스미드 pTE4/MCP-1과 발현에 있어서 유의적인 차이가 없었음을 나타낸다. 따라서, 안정하게 형질감염된 세포 풀에서 일부 TE 요소에 의한 생산성의 2배 이상의 증가는 TE 서열내 인핸서의 존재에 기초하지 않는다. 따라서, TE 요소에 의해 얻어진 향상된 발현의 경우 염색체 통합은 절대적으로 필수적이다.
실시예 6: 기타 TE 요소의 생산 및 상이한 TE 요소 위치 및 조합의 시험
실시예 2에 기술된 방법과 유사하게, 서열번호 1의 다른 부분적 단편 또는 이의 유도체를 생성시키고 실시예 3 및 5에서 기술된 바와 같은 생산성에 미치는 긍정적인 효과에 대해 시험할 수 있다. 가능한 단편의 일부 예는 도 12에 나타낸다. 지금까지 얻어진 결과는 에를 들면, 도 12에 나타낸 서열번호 1의 영역이 또한 유전자 발현의 증가를 가져올 수 있음을 나타낸다. 안정한 형질감염 시리즈에서, 이러한 새로운 TE 요소는, 기능에 중요한 서열 영역을 위치시키고 더욱 한정하 기 위하여 비생산성에 미치는 이들의 효과와 관련하여 보다 면밀하게 특성규명되어야 한다. 기능의 특정 서열 영역으로의 한정 및 단편 길이에 있어서 관련된 가능한 감소는 발현 벡터에서 효율적인 사용에 유리한데, 이는 보다 작은 발현 플라스미드가 보다 안정하고 클로닝 및 형질감염 동안 조작하기에 보다 용이하기 때문이다.
또한, 유사하거나 또는 상이한 단편 영역을 플라스미드에서 서로에 대해 임의의 배향으로 및 또한 임의의 위치에 배열시키는 것이 가능하다. 발현에 있서 가장 우수한 가능한 증가를 초래하는 조합에 대한 조사를 또한 안정한 형질감염 시리즈에서 수행할 수 있다. 제한되지 않는, 일부 양태를 도 13에 나타낸다. 따라서, 조사는, 예를 들면, TE 요소 TE-06 및 TE-08이 양쪽 측면에서 생성물 유전자를 플랭킹하거나 순서대로 배열되는 경우 발현의 추가의 증가를 가져올 수 있는지를 측정할 수 있다. 또한, 예를 들면, TE 요소 06 및 08과 같은, 동일하거나 상이한 짧은 TE 요소의 연쇄(concatenation)는 추가의 발현-향상 효과를 가져올 것으로 생각된다.
추가의 TE 요소
TE 요소 13 (서열번호 15)
Figure 112009012054757-PCT00018
TE 요소 14 (서열번호 16)
Figure 112009012054757-PCT00019
TE 요소 15 (서열번호 17)
Figure 112009012054757-PCT00020
TE 요소 16 (서열번호 18)
Figure 112009012054757-PCT00021
TE 요소 17 (서열번호 19)
Figure 112009012054757-PCT00022
TE 요소 18 (서열번호 20)
Figure 112009012054757-PCT00023
TE 요소 21 (서열번호 21)
Figure 112009012054757-PCT00024
실시예 7: MCP -1의 발현에 미치는 TE 요소 TE -13 내지 TE -18의 영향
분비된 MCP-1의 발현에 미치는 TE 요소 RE-13 내지 TE-18의 영향을 TE 요소가 없는 발현과 비교하여 CHO-DG44 세포의 안정한 형질감염 시리즈(시리즈 F)에서 시험하였다. 4개의 풀을 플라스미드 변이체당 생산하였다. 기본 플라스미드는 모 든 시리즈에서 pTE4/MCP-1이었다(도 1B; 선별가능 마커 NPT - 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 F240I). 각종 플라스미드 변이체는, TE 요소를 함유하지 않거나(= 대조군 혼합물) 또는 TE 요소 TE-13 내지 TE-18 중 하나를 프로모터/인핸서로부터 상류에 정방향 배향으로 함유하였다(도 12). 형질감염 혼합물내 상이한 양의 DNA에 의해 유발된 형질감염 효율에 미치는 어떠한 영향도 최소화시키기 위하여, 총 1.2 ㎍의 플라스미드 DNA를 각각의 경우에 사용하였다. 도입된 TE 요소의 크기에 따라, 플라스미드 크기는 6.7　kb 내지 8.2 kb에서 변하였다. 음성 대조군으로서, 모크-형질감염된 풀을 각각의 형질감염 시리즈에서 동시에 수행하였는데, 즉, 동일하게, 그러나 형질감염 혼합물에 DNA를 첨가하지 않고 처리하였다. 안정하게 형질감염된 세포의 선별은 HT-보충된 CHO-S-SFMII+G418 (400 ㎍/mL)을 사용하여 형질감염 후 2일째에 수행하였다. MCP-1 생성물 역가 및 비생산성을 5 내지 6회 계대배양(계대배양 주기 2-2-3 일)의 기간에 걸쳐 얻었다. 도 14(시리즈 F)는 상대적인 MCP-1 비생산성을 나타낸다. 각각의 요소들은 평균 MCP-1 발현의 증가를 가져온다. 최대 증가(15배)는 요소 13을 사용하여 달성되었으며, 이는 심지어 요소 08에 의해 생산된 10배 증가를 초과한다.
실시예 8: MCP -1의 발현에 미치는 다양한 위치 및 다양한 조합의 TE 요소의 영향
분비된 MCP-1의 발현에 미치는 발현 플라스미드내 다양한 조합 및 다양한 위치의 TE 요소 TE-06 및 TE-08의 효과를 TE 요소의 부재하에서의 발현과 비교하여 CHO-DG44 세포의 2개의 안정한 형질감염 시리즈(시리즈 G 및 H)에서 시험하였다. 시리즈 둘다에서 6개의 풀을 플라스미드 변이체당 생산한다. 기본 플라스미드는 pTE4/MCP-1(도 1B; 선별가능 마커 NPT = 네오마이신 = 포스포트랜스퍼라제 F240I)이다. 상이한 플라스미드 변이체는 TE 요소를 함유하지 않거나(= 대조군 혼합물) 또는 인핸서/프로모터 요소 앞에 TE-08 또는 TE-A를 함유하거나 인핸서/프로모터 요소 앞에 TE-06 및 TE-08의 조합을 함유하거나 인핸서/프로모터 요소 앞에 역방향 배향으로 TE-08 또는 TE-09의 조합을 함유하였다(시리즈 G). 시리즈 H에서 요소 TE-06 및 TE-21 또는 TE-08은 인핸서/프로모터 요소(E/P)의 앞에서 및 추가로 종결 시그날(T) 뒤에서 사용된다(도 13). 형질감염 혼합물중 상이한 양의 DNA에 의해 유발된 형질감염 효율에 미치는 어떠한 효과도 최소화시키기 위해, 총 1.2 ㎍의 플라스미드 DNA를 각각의 경우에 사용한다. 도입된 TE 요소의 크기에 따라, 플라스미드 크기는 6.7 kb 내지 10.2 kb로 변한다. 음성 대조군으로서, 모크-형질감염된 풀은 각각의 형질감염 시리즈와 동시에 수행하는데, 즉, 동일하게, 그러나 형질감염 혼합물에 DNA를 첨가하지 않고 처리한다. 안정하게 형질감염된 세포의 선별은 HT-보충된 CHO-S-SFMII+G418 (300 ㎍/mL)을 사용하여, 형질감염 후 2일 째에 수행한다.
MCP-1 생성물 역가 및 비생산성을 6회의 계대배양(계대배양 주기 2-2-3일)의 기간에 걸쳐 얻었다. 도 15는 시리즈 G의 상대적 MCP-1 비생산성을 나타낸다. 모든 요소들은 평균 MCP-1 발현의 증가를 가져왔다. 최대 증가(4배)는 요소 TE-A에 의해 달성된다. 발현 카세트의 앞과 뒤에 요소 TE-06 및 TE-21 또는 TE-08의 사용 은 또한 증가를 가져온다.
실시예 9: 2개의 면역글로불린 G-4( IgG -4)의 발현에 미치는 TE 요소 TE -08의 영향
2개의 IgG-4 항체의 발현에 미치는 TE 요소 TE-08의 효과를 TE 요소가 없는 발현과 비교하여 CHO-DG44 세포의 안정한 형질감염 시리즈(시리즈 J)에서 시험한다. 24개 풀을 기본 플라스미드 pBIN-LC2 또는 pBIN-LC3 및 pBID-HC2 또는 pBID-HC3을 사용하여 생산하고 24개 풀을 pBIN-LC2/TE08 또는 pBIN-LC3/TE08 및 pBID-HC2/TE08 또는 pBID-HC3/TE08을 사용하여 생산한다(도 16; 선별가능 마커 NPT = 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 F240I 및 dhfr = 디하이드로폴레이트-리덕타제). 형질감염 혼합물 중 다양한 양의 DNA에 의해 유발된 형질감염 효율에 미치는 어떠한 영향도 최소화시키기 위하여, 총 1.2 ㎍의 플라스미드 DNA를 각각의 경우에 사용한다. 도입된 TE 요소의 크기에 따라, 플라스미드 크기는 6.1 kb 내지 7.5 kb에서 변한다. 음성 대조군으로서, 모크-형질감염된 풀을 각각의 형질감염 시리즈를 사용하여 동시에 수행하는데, 즉, 동일하게, 그러나 형질감염 혼합물에 DNA를 첨가하지 않고 처리한다. 안정하게 형질감염된 세포의 선별은 HT-미함유 CHO-S-SFMII+G418 (400 ㎍/mL)을 사용하여, 형질감염 후 2일째에 수행한다. IgG-4 생성물 역가 및 비생산성을 4회 계대배양(계대배양 주기 2-2-3 일)의 기간에 걸쳐 얻는다. 요소 08은 IgG4 항체의 발현에 있어 평균 발현율의 증가를 가져온다. 또한, 고 생산성 세포 풀이 발견될 기회는 요소 TE-08의 존재에 의해 증가될 수 있다.
실시예 10: 293F 세포에서 단백질 발현에 미치는 TE 요소의 영향
분비된 MCP-1의 발현에 미치는 다양한 TE 요소의 효과를 TE 요소가 없는 MCP-1 발현과 비교함으로써 HEK293 프리스타일(freestyle) 세포의 안정한 형질감염 시리즈(시리즈 K)에서 시험한다. 기본 플라스미드는 pTE-4/MCP-1(도 1B; 선별가능 마커 NPT = 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 F240I)이다. 요소 TE-08, TE-13 및 TE-A를 인핸서/프로모터로부터 상류에서 정방향 배향으로 사용하고 7 내지 10개의 풀을 플라스미드 변이체당 생산한다. 형질감염 혼합물 중 DNA의 상이한 양에 의해 유발된 형질감염 효율에 미치는 어떠한 효과도 최소화시키기 위하여, 총 1.2 ㎍의 플라스미드 DNA를 각각의 경우에 사용한다. 도입된 TE 요소의 크기에 따라, 플라스미드 크기는 6.7 kb 내지 10.2 kb에서 변한다. 음성 대조군으로서, 모크-형질감염된 풀을 각각의 형질감염 시리즈로서 동시에 수행하는데, 즉, 동일하게, 그러나 형질감염 혼합물에 DNA를 첨가하지 않고 처리한다. 안정하게 형질감염된 세포의 선별은 293 SFM II 배지 + 4 mM 글루타민 + G418 (100 mg/ml)을 사용하여 형질감염 후 2일째에 수행한다.
MCP-1 생성물 역가 및 비생산성을 5 내지 6회 계대배양(계대배양 주기 2-2-3 일)의 기간에 걸쳐 얻는다.
실시예 11: 효소( SEAP )의 발현에 미치는 TE 요소 TE -08의 영향
효소(SEAP)의 발현에 미치는 TE 요소 TE-08의 효과를 TE 요소가 없는 SEAP 발현과 비교하여 CHO-DG44 세포의 안정한 형질감염 시리즈(시리즈 L)에서 시험하였다. 6개의 풀을 플라스미드 변이체당 생산하였다. 기본 플라스미드는 pTE-4/SEAP이다. 이는 MCP-1-IRES-DsRed2-발현 카세트를 SEAP로 교환하여 생성된다. 요소 TE-08을 어댑터 A내로 클로닝한다(도 1B; 선별가능 마커 NPT = 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 F240I). 형질감염 혼합물에서 DNA의 양을 변화시켜 유발된 형질감염 효율에 미치는 어떠한 효과도 최소화시키기 위하여, 총 1.2 ㎍의 플라스미드 DNA을 각각의 경우에 사용한다. 도입된 TE 요소의 크기에 따라, 플라스미드 크기는 6.6 kb 내지 7.6 kb에서 변한다. 음성 대조군으로서, 모크-형질감염된 풀을 각각의 형질감염 시리즈와 동일한 시간에 수행하는데, 즉, 동일하게, 그러나 형질감염 혼합물에 DNA를 첨가하지 않고 처리한다. 안정하게 형질감염된 세포의 선별은 HT-보충된 CHO-S-SFMII+G418 (400 ㎍/mL)을 사용하여, 형질감염 후 2일째에 수행한다.
상대적인 SEAP 발현은 시판되는 SEAP 검정(제조원: 클론테크)을 사용하여 측정하고 6회 계대배양(계대배양 주기 2-2-3 일)의 기간에 걸쳐 얻는다.
참고문헌 목록
Figure 112009012054757-PCT00025
Figure 112009012054757-PCT00026
Figure 112009012054757-PCT00027
<110> Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG <120> Regulatory nucleic acid elements <130> P01-2092 <150> EP 06117862.0 <151> 2006-07-26 <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3788 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cricetulus griseus derivative, additional 8 nucleotides <400> 1 ccatgagagc ctgaagacct gagttgatac ccagaaccca gatcaagatg gaggagagaa 60 ccagccccac taagctgtcc cctgaccccc ataaatgcct ccctgtccag ttatgccaca 120 caatgatagg tgaatacaga aaaacaccct tcctttagac actaagcgga ttcctcttac 180 gcataccagt taagtgatag ttcttaggct tcaactcagc actttaaaaa gtttatattt 240 tgcaatgctg gggactaaat tagggttgtg cacatgctaa gtaagcactc tacttttgta 300 tcacatttta ataattgtaa gaattaattc gtgaaatagt agctgagaca atagatttgt 360 ttctttcatg tgggaactgc tgtgtgtgct tcttgctgat gcaaacaagg tcaaatactt 420 tattccccag tgtctgccta gccctgtaac acttctctat tatacaatga ccacaaataa 480 ttaggtgagt gggttttgtt tcattttaaa ttgttgctat tttagagaca ggatttcttg 540 caaacctggt tggtcttaaa ctccgtatgt agctgagaat gaccttgaaa accttcctgt 600 cccacccctc aaattccaga attatagaca cccaccacat ggcttaataa gtaaacaaca 660 acaataaaag catgacttct gggtctggag ggagggcttg ccagttaaga gcaatggata 720 ctttcccata gaacctgggt ttgactccca gcactaacct acatggtgat agtgatgcag 780 cagacataca tgagggcaac acacacatgg gcacatacac acgcacccgc ccaccatggc 840 ttttccccca tcacttagac agccatattt aaacgtagtg gagccaggct ggggtggtgg 900 cccacacctt taatcccagc actccagaag gcagaggtag gcggatctct gtgggtttga 960 gaccagcctg gtctacaaga gctagttcca ggacagcctc caaagccata gagaaaccct 1020 atctcaaaaa actgaaacaa caacaacaac aaaacaaaat aaaaaaacaa caaaagaatc 1080 ttagtggttc agtggttcca cacacaggaa agtagaaagg gccttgatgg gaaggttttc 1140 agagggagga gtatggatga gacaggatga tagtgaaaag aactcaaatt aattaaatat 1200 ttgaaactat ctaagaataa aagctaaaat atttaaaatt acagtcaggt agtggtggtg 1260 cagagggcta agttggtaga cacagtgaga tccaggccag ccagggctac ctagtgagac 1320 cttgttcaaa taactaataa aatatacaaa ataaaggaga caccacaata attttgaaat 1380 gtaaaagact aaatttacct tttatattga tgagttggat aaaaaaatca atttaccaga 1440 gaacataaag tagtcccatc aaagacaaaa gcaatatatg attaaactct aatttaaaag 1500 tttgttagag cctggcaacg tggcacatac ctttaatccc agcaccaggg agacagaggc 1560 catcctggtc taaaaagtga tctccaggac agccatggct attacacaga gaaaccctgt 1620 ctggaaaaac aaaaaattag tgtccatgtg taaatgtgtg gagtatgctt gtcatgccac 1680 atacagaggt agagggcagt ttatgggagt cagttcctat tcttccttta tgggggacct 1740 ggggactgaa ctcaggtcat caggcttggc agaaagtgca ttagctcacg gagccttatc 1800 attggcgaaa gctctctcaa gtagaaaatc aatgtgtttg ctcatagtgc aatcattatg 1860 tttcgagagg ggaagggtac aatcgttggg gcatgtgtgg tcacatctga atagcagtag 1920 ctccctagga gaattaattc caagttcttt ggtggtgtat caatgccctt aaaggggtca 1980 acaacttttt ttccctctga caaaactatc ttcttatgtc cttgtccctc atatttgaag 2040 tattttattc tttgcagtgt tgaatatcaa ttctagcacc tcagacatgt taggtaagta 2100 ccctacaact caggttaact aatttaattt aactaattta accccaacac tttttctttg 2160 tttatccaca tttgtggagt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2220 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcgcgcgcgc gcgcgctcgg atcattctac cttttgttta 2280 aaaaatgtta gtccaggggt ggggtgcact gtgaaagtct gagggtaact tgctggggtc 2340 agttctttcc actataggac agaactccag gtgtcaactc tttactgaca gaaccatcca 2400 aatagcccta tctaatttta gttttttatt tatttatttt ttgtttttcg agacagggtt 2460 tctctgtggc tttggaggct gtcctggaac tagctcttgt agaccaggct ggtctcgaac 2520 tcagagatcc acctgcctct gcctcctgag tgctgggatt aaaggcatgc gccaccaacg 2580 cttggctcta cctaatttta aaagagattg tgtgtcacaa gggtgtcatg tcgccctgca 2640 accacccccc ccccaaaaaa aaaaaaaaaa aaacttcact gaagctgaag cacgatgatt 2700 tggttactct ggctggccaa tgagctctag ggagtctcct gtcaaacaga atctcaacag 2760 gcgcagcagt cttttttaaa gtggggttac aacacaggtt tttgcatatc aggcatttta 2820 tctaagctat ttcccagcca aaaatgtgta ttttggaggc agcagagcta atagattaaa 2880 atgagggaag agcccacaca ggttattagg aagataagca tcttctttat ataaaacaaa 2940 accaaaccaa actggaggag gtctaccttt agggatggaa gaaaagacat ttagagggtg 3000 caatagaaag ggcactgagt ttgtgaggtg gaggactggg agagggcgca accgctttaa 3060 ctgtcctgtt ttgcctattt tttggggaca gcacatgttc ctatttttcc caggatgggc 3120 aatctccacg tccaaacttg cggtcgagga ctacagtcat tttgcaggtt tccttactgt 3180 atggctttta aaacgtgcaa aggtgaccat taaccgtttc acgctgggag ggcacgtgcg 3240 gctcagatgc ttcctctgac tgagggccag gagggggcta cacggaagag gccacacccg 3300 cacttgggaa gactcgattt gggcttcagc tggctgagac gccccagcag gctcctcggc 3360 tacaccttca gccccgaatg ccttccggcc cataaccctt cccttctagg catttccggc 3420 gaggacccac cctcgcgcca aacattcggc cccatccccc ggtcctcacc tgaatctcta 3480 actctgactc cagagtttag agactataac cagatagccc ggatgtgtgg aactgcatct 3540 tgggacgagt agttttagca aaaagaaagc gacgaaaaac tacaattccc agacagactt 3600 gtgttacctc tcttctcatg ctaaacaagc cccctttaaa ggaaagcccc tcttagtcgc 3660 atcgactgtg taagaaaggc gtttgaaaca ttttaatgtt gggcacaccg tttcgaggac 3720 cgaaatgaga aagagcatag ggaaacggag cgcccgagct agtctggcac tgcgttagac 3780 agccgcgg 3788 <210> 2 <211> 2210 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 2 gatctccagg acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt 60 agtgtccatg tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca 120 gtttatggga gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc 180 atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc 240 aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt 300 acaatcgttg gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattaat 360 tccaagttct ttggtggtgt atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt ttttccctct 420 gacaaaacta tcttcttatg tccttgtccc tcatatttga agtattttat tctttgcagt 480 gttgaatatc aattctagca cctcagacat gttaggtaag taccctacaa ctcaggttaa 540 ctaatttaat ttaactaatt taaccccaac actttttctt tgtttatcca catttgtgga 600 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 660 gtgcgcgcgc gcgcgcgctc ggatcattct accttttgtt taaaaaatgt tagtccaggg 720 gtggggtgca ctgtgaaagt ctgagggtaa cttgctgggg tcagttcttt ccactatagg 780 acagaactcc aggtgtcaac tctttactga cagaaccatc caaatagccc tatctaattt 840 tagtttttta tttatttatt ttttgttttt cgagacaggg tttctctgtg gctttggagg 900 ctgtcctgga actagctctt gtagaccagg ctggtctcga actcagagat ccacctgcct 960 ctgcctcctg agtgctggga ttaaaggcat gcgccaccaa cgcttggctc tacctaattt 1020 taaaagagat tgtgtgtcac aagggtgtca tgtcgccctg caaccacccc ccccccaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaacttca ctgaagctga agcacgatga tttggttact ctggctggcc 1140 aatgagctct agggagtctc ctgtcaaaca gaatctcaac aggcgcagca gtctttttta 1200 aagtggggtt acaacacagg tttttgcata tcaggcattt tatctaagct atttcccagc 1260 caaaaatgtg tattttggag gcagcagagc taatagatta aaatgaggga agagcccaca 1320 caggttatta ggaagataag catcttcttt atataaaaca aaaccaaacc aaactggagg 1380 aggtctacct ttagggatgg aagaaaagac atttagaggg tgcaatagaa agggcactga 1440 gtttgtgagg tggaggactg ggagagggcg caaccgcttt aactgtcctg ttttgcctat 1500 tttttgggga cagcacatgt tcctattttt cccaggatgg gcaatctcca cgtccaaact 1560 tgcggtcgag gactacagtc attttgcagg tttccttact gtatggcttt taaaacgtgc 1620 aaaggtgacc attaaccgtt tcacgctggg agggcacgtg cggctcagat gcttcctctg 1680 actgagggcc aggagggggc tacacggaag aggccacacc cgcacttggg aagactcgat 1740 ttgggcttca gctggctgag acgccccagc aggctcctcg gctacacctt cagccccgaa 1800 tgccttccgg cccataaccc ttcccttcta ggcatttccg gcgaggaccc accctcgcgc 1860 caaacattcg gccccatccc ccggtcctca cctgaatctc taactctgac tccagagttt 1920 agagactata accagatagc ccggatgtgt ggaactgcat cttgggacga gtagttttag 1980 caaaaagaaa gcgacgaaaa actacaattc ccagacagac ttgtgttacc tctcttctca 2040 tgctaaacaa gcccccttta aaggaaagcc cctcttagtc gcatcgactg tgtaagaaag 2100 gcgtttgaaa cattttaatg ttgggcacac cgtttcgagg accgaaatga gaaagagcat 2160 agggaaacgg agcgcccgag ctagtctggc actgcgttag acagccgcgg 2210 <210> 3 <211> 3005 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cricetulus griseus with manipulation of the endogenous EcoR1 site by substitution of 4 bases <400> 3 gttgctattt tagagacagg atttcttgca aacctggttg gtcttaaact ccgtatgtag 60 ctgagaatga ccttgaaaac cttcctgtcc cacccctcaa attccagaat tatagacacc 120 caccacatgg cttaataagt aaacaacaac aataaaagca tgacttctgg gtctggaggg 180 agggcttgcc agttaagagc aatggatact ttcccataga acctgggttt gactcccagc 240 actaacctac atggtgatag tgatgcagca gacatacatg agggcaacac acacatgggc 300 acatacacac gcacccgccc accatggctt ttcccccatc acttagacag ccatatttaa 360 acgtagtgga gccaggctgg ggtggtggcc cacaccttta atcccagcac tccagaaggc 420 agaggtaggc ggatctctgt gggtttgaga ccagcctggt ctacaagagc tagttccagg 480 acagcctcca aagccataga gaaaccctat ctcaaaaaac tgaaacaaca acaacaacaa 540 aacaaaataa aaaaacaaca aaagaatctt agtggttcag tggttccaca cacaggaaag 600 tagaaagggc cttgatggga aggttttcag agggaggagt atggatgaga caggatgata 660 gtgaaaagaa ctcaaattaa ttaaatattt gaaactatct aagaataaaa gctaaaatat 720 ttaaaattac agtcaggtag tggtggtgca gagggctaag ttggtagaca cagtgagatc 780 caggccagcc agggctacct agtgagacct tgttcaaata actaataaaa tatacaaaat 840 aaaggagaca ccacaataat tttgaaatgt aaaagactaa atttaccttt tatattgatg 900 agttggataa aaaaatcaat ttaccagaga acataaagta gtcccatcaa agacaaaagc 960 aatatatgat taaactctaa tttaaaagtt tgttagagcc tggcaacgtg gcacatacct 1020 ttaatcccag caccagggag acagaggcca tcctggtcta aaaagtgatc tccaggacag 1080 ccatggctat tacacagaga aaccctgtct ggaaaaacaa aaaattagtg tccatgtgta 1140 aatgtgtgga gtatgcttgt catgccacat acagaggtag agggcagttt atgggagtca 1200 gttcctattc ttcctttatg ggggacctgg ggactgaact caggtcatca ggcttggcag 1260 aaagtgcatt agctcacgga gccttatcat tggcgaaagc tctctcaagt agaaaatcaa 1320 tgtgtttgct catagtgcaa tcattatgtt tcgagagggg aagggtacaa tcgttggggc 1380 atgtgtggtc acatctgaat agcagtagct ccctaggaga attaattcca agttctttgg 1440 tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aacttttttt ccctctgaca aaactatctt 1500 cttatgtcct tgtccctcat atttgaagta ttttattctt tgcagtgttg aatatcaatt 1560 ctagcacctc agacatgtta ggtaagtacc ctacaactca ggttaactaa tttaatttaa 1620 ctaatttaac cccaacactt tttctttgtt tatccacatt tgtggagtgt gtgtgtgtgt 1680 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc gcgcgcgcgc 1740 gcgctcggat cattctacct tttgtttaaa aaatgttagt ccaggggtgg ggtgcactgt 1800 gaaagtctga gggtaacttg ctggggtcag ttctttccac tataggacag aactccaggt 1860 gtcaactctt tactgacaga accatccaaa tagccctatc taattttagt tttttattta 1920 tttatttttt gtttttcgag acagggtttc tctgtggctt tggaggctgt cctggaacta 1980 gctcttgtag accaggctgg tctcgaactc agagatccac ctgcctctgc ctcctgagtg 2040 ctgggattaa aggcatgcgc caccaacgct tggctctacc taattttaaa agagattgtg 2100 tgtcacaagg gtgtcatgtc gccctgcaac cacccccccc ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 acttcactga agctgaagca cgatgatttg gttactctgg ctggccaatg agctctaggg 2220 agtctcctgt caaacagaat ctcaacaggc gcagcagtct tttttaaagt ggggttacaa 2280 cacaggtttt tgcatatcag gcattttatc taagctattt cccagccaaa aatgtgtatt 2340 ttggaggcag cagagctaat agattaaaat gagggaagag cccacacagg ttattaggaa 2400 gataagcatc ttctttatat aaaacaaaac caaaccaaac tggaggaggt ctacctttag 2460 ggatggaaga aaagacattt agagggtgca atagaaaggg cactgagttt gtgaggtgga 2520 ggactgggag agggcgcaac cgctttaact gtcctgtttt gcctattttt tggggacagc 2580 acatgttcct atttttccca ggatgggcaa tctccacgtc caaacttgcg gtcgaggact 2640 acagtcattt tgcaggtttc cttactgtat ggcttttaaa acgtgcaaag gtgaccatta 2700 accgtttcac gctgggaggg cacgtgcggc tcagatgctt cctctgactg agggccagga 2760 gggggctaca cggaagaggc cacacccgca cttgggaaga ctcgatttgg gcttcagctg 2820 gctgagacgc cccagcaggc tcctcggcta caccttcagc cccgaatgcc ttccggccca 2880 taacccttcc cttctaggca tttccggcga ggacccaccc tcgcgccaaa cattcggccc 2940 catcccccgg tcctcacctg aatctctaac tctgactcca gagtttagag actataacca 3000 gatag 3005 <210> 4 <211> 2517 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 4 caaagccata gagaaaccct atctcaaaaa actgaaacaa caacaacaac aaaacaaaat 60 aaaaaaacaa caaaagaatc ttagtggttc agtggttcca cacacaggaa agtagaaagg 120 gccttgatgg gaaggttttc agagggagga gtatggatga gacaggatga tagtgaaaag 180 aactcaaatt aattaaatat ttgaaactat ctaagaataa aagctaaaat atttaaaatt 240 acagtcaggt agtggtggtg cagagggcta agttggtaga cacagtgaga tccaggccag 300 ccagggctac ctagtgagac cttgttcaaa taactaataa aatatacaaa ataaaggaga 360 caccacaata attttgaaat gtaaaagact aaatttacct tttatattga tgagttggat 420 aaaaaaatca atttaccaga gaacataaag tagtcccatc aaagacaaaa gcaatatatg 480 attaaactct aatttaaaag tttgttagag cctggcaacg tggcacatac ctttaatccc 540 agcaccaggg agacagaggc catcctggtc taaaaagtga tctccaggac agccatggct 600 attacacaga gaaaccctgt ctggaaaaac aaaaaattag tgtccatgtg taaatgtgtg 660 gagtatgctt gtcatgccac atacagaggt agagggcagt ttatgggagt cagttcctat 720 tcttccttta tgggggacct ggggactgaa ctcaggtcat caggcttggc agaaagtgca 780 ttagctcacg gagccttatc attggcgaaa gctctctcaa gtagaaaatc aatgtgtttg 840 ctcatagtgc aatcattatg tttcgagagg ggaagggtac aatcgttggg gcatgtgtgg 900 tcacatctga atagcagtag ctccctagga gaattaattc caagttcttt ggtggtgtat 960 caatgccctt aaaggggtca acaacttttt ttccctctga caaaactatc ttcttatgtc 1020 cttgtccctc atatttgaag tattttattc tttgcagtgt tgaatatcaa ttctagcacc 1080 tcagacatgt taggtaagta ccctacaact caggttaact aatttaattt aactaattta 1140 accccaacac tttttctttg tttatccaca tttgtggagt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1200 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gcgcgcgcgc gcgcgctcgg 1260 atcattctac cttttgttta aaaaatgtta gtccaggggt ggggtgcact gtgaaagtct 1320 gagggtaact tgctggggtc agttctttcc actataggac agaactccag gtgtcaactc 1380 tttactgaca gaaccatcca aatagcccta tctaatttta gttttttatt tatttatttt 1440 ttgtttttcg agacagggtt tctctgtggc tttggaggct gtcctggaac tagctcttgt 1500 agaccaggct ggtctcgaac tcagagatcc acctgcctct gcctcctgag tgctgggatt 1560 aaaggcatgc gccaccaacg cttggctcta cctaatttta aaagagattg tgtgtcacaa 1620 gggtgtcatg tcgccctgca accacccccc ccccaaaaaa aaaaaaaaaa aaacttcact 1680 gaagctgaag cacgatgatt tggttactct ggctggccaa tgagctctag ggagtctcct 1740 gtcaaacaga atctcaacag gcgcagcagt cttttttaaa gtggggttac aacacaggtt 1800 tttgcatatc aggcatttta tctaagctat ttcccagcca aaaatgtgta ttttggaggc 1860 agcagagcta atagattaaa atgagggaag agcccacaca ggttattagg aagataagca 1920 tcttctttat ataaaacaaa accaaaccaa actggaggag gtctaccttt agggatggaa 1980 gaaaagacat ttagagggtg caatagaaag ggcactgagt ttgtgaggtg gaggactggg 2040 agagggcgca accgctttaa ctgtcctgtt ttgcctattt tttggggaca gcacatgttc 2100 ctatttttcc caggatgggc aatctccacg tccaaacttg cggtcgagga ctacagtcat 2160 tttgcaggtt tccttactgt atggctttta aaacgtgcaa aggtgaccat taaccgtttc 2220 acgctgggag ggcacgtgcg gctcagatgc ttcctctgac tgagggccag gagggggcta 2280 cacggaagag gccacacccg cacttgggaa gactcgattt gggcttcagc tggctgagac 2340 gccccagcag gctcctcggc tacaccttca gccccgaatg ccttccggcc cataaccctt 2400 cccttctagg catttccggc gaggacccac cctcgcgcca aacattcggc cccatccccc 2460 ggtcctcacc tgaatctcta actctgactc cagagtttag agactataac cagatag 2517 <210> 5 <211> 1989 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 5 acctttaatc ccagcaccag ggagacagag gccatcctgg tctaaaaagt gatctccagg 60 acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt agtgtccatg 120 tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca gtttatggga 180 gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc atcaggcttg 240 gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc aagtagaaaa 300 tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt acaatcgttg 360 gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattaat tccaagttct 420 ttggtggtgt atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt ttttccctct gacaaaacta 480 tcttcttatg tccttgtccc tcatatttga agtattttat tctttgcagt gttgaatatc 540 aattctagca cctcagacat gttaggtaag taccctacaa ctcaggttaa ctaatttaat 600 ttaactaatt taaccccaac actttttctt tgtttatcca catttgtgga gtgtgtgtgt 660 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgcgcgcgc 720 gcgcgcgctc ggatcattct accttttgtt taaaaaatgt tagtccaggg gtggggtgca 780 ctgtgaaagt ctgagggtaa cttgctgggg tcagttcttt ccactatagg acagaactcc 840 aggtgtcaac tctttactga cagaaccatc caaatagccc tatctaattt tagtttttta 900 tttatttatt ttttgttttt cgagacaggg tttctctgtg gctttggagg ctgtcctgga 960 actagctctt gtagaccagg ctggtctcga actcagagat ccacctgcct ctgcctcctg 1020 agtgctggga ttaaaggcat gcgccaccaa cgcttggctc tacctaattt taaaagagat 1080 tgtgtgtcac aagggtgtca tgtcgccctg caaccacccc ccccccaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaacttca ctgaagctga agcacgatga tttggttact ctggctggcc aatgagctct 1200 agggagtctc ctgtcaaaca gaatctcaac aggcgcagca gtctttttta aagtggggtt 1260 acaacacagg tttttgcata tcaggcattt tatctaagct atttcccagc caaaaatgtg 1320 tattttggag gcagcagagc taatagatta aaatgaggga agagcccaca caggttatta 1380 ggaagataag catcttcttt atataaaaca aaaccaaacc aaactggagg aggtctacct 1440 ttagggatgg aagaaaagac atttagaggg tgcaatagaa agggcactga gtttgtgagg 1500 tggaggactg 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<210> 16 <211> 549 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 16 caaagccata gagaaaccct atctcaaaaa actgaaacaa caacaacaac aaaacaaaat 60 aaaaaaacaa caaaagaatc ttagtggttc agtggttcca cacacaggaa agtagaaagg 120 gccttgatgg gaaggttttc agagggagga gtatggatga gacaggatga tagtgaaaag 180 aactcaaatt aattaaatat ttgaaactat ctaagaataa aagctaaaat atttaaaatt 240 acagtcaggt agtggtggtg cagagggcta agttggtaga cacagtgaga tccaggccag 300 ccagggctac ctagtgagac cttgttcaaa taactaataa aatatacaaa ataaaggaga 360 caccacaata attttgaaat gtaaaagact aaatttacct tttatattga tgagttggat 420 aaaaaaatca atttaccaga gaacataaag tagtcccatc aaagacaaaa gcaatatatg 480 attaaactct aatttaaaag tttgttagag cctggcaacg tggcacatac ctttaatccc 540 agcaccagg 549 <210> 17 <211> 1037 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 17 gttgctattt tagagacagg atttcttgca aacctggttg gtcttaaact ccgtatgtag 60 ctgagaatga ccttgaaaac cttcctgtcc cacccctcaa attccagaat tatagacacc 120 caccacatgg cttaataagt aaacaacaac aataaaagca tgacttctgg gtctggaggg 180 agggcttgcc agttaagagc aatggatact ttcccataga acctgggttt gactcccagc 240 actaacctac atggtgatag tgatgcagca gacatacatg agggcaacac acacatgggc 300 acatacacac gcacccgccc accatggctt ttcccccatc acttagacag ccatatttaa 360 acgtagtgga gccaggctgg ggtggtggcc cacaccttta atcccagcac tccagaaggc 420 agaggtaggc ggatctctgt gggtttgaga ccagcctggt ctacaagagc tagttccagg 480 acagcctcca aagccataga gaaaccctat ctcaaaaaac tgaaacaaca acaacaacaa 540 aacaaaataa aaaaacaaca aaagaatctt agtggttcag tggttccaca cacaggaaag 600 tagaaagggc cttgatggga aggttttcag agggaggagt atggatgaga caggatgata 660 gtgaaaagaa ctcaaattaa ttaaatattt gaaactatct aagaataaaa gctaaaatat 720 ttaaaattac agtcaggtag tggtggtgca gagggctaag ttggtagaca cagtgagatc 780 caggccagcc agggctacct agtgagacct tgttcaaata actaataaaa tatacaaaat 840 aaaggagaca ccacaataat tttgaaatgt aaaagactaa atttaccttt tatattgatg 900 agttggataa aaaaatcaat ttaccagaga acataaagta gtcccatcaa agacaaaagc 960 aatatatgat taaactctaa tttaaaagtt tgttagagcc tggcaacgtg gcacatacct 1020 ttaatcccag caccagg 1037 <210> 18 <211> 500 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 18 acctttaatc ccagcaccag ggagacagag gccatcctgg tctaaaaagt gatctccagg 60 acagccatgg ctattacaca gagaaaccct gtctggaaaa acaaaaaatt agtgtccatg 120 tgtaaatgtg tggagtatgc ttgtcatgcc acatacagag gtagagggca gtttatggga 180 gtcagttcct attcttcctt tatgggggac ctggggactg aactcaggtc atcaggcttg 240 gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc aagtagaaaa 300 tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt acaatcgttg 360 gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattaat tccaagttct 420 ttggtggtgt atcaatgccc ttaaaggggt caacaacttt ttttccctct gacaaaacta 480 tcttcttatg tccttgtccc 500 <210> 19 <211> 1028 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 19 caaagccata gagaaaccct atctcaaaaa actgaaacaa caacaacaac aaaacaaaat 60 aaaaaaacaa caaaagaatc ttagtggttc agtggttcca cacacaggaa agtagaaagg 120 gccttgatgg gaaggttttc agagggagga gtatggatga gacaggatga tagtgaaaag 180 aactcaaatt aattaaatat ttgaaactat ctaagaataa aagctaaaat atttaaaatt 240 acagtcaggt agtggtggtg cagagggcta agttggtaga cacagtgaga tccaggccag 300 ccagggctac ctagtgagac cttgttcaaa taactaataa aatatacaaa ataaaggaga 360 caccacaata attttgaaat gtaaaagact aaatttacct tttatattga tgagttggat 420 aaaaaaatca atttaccaga gaacataaag tagtcccatc aaagacaaaa gcaatatatg 480 attaaactct aatttaaaag tttgttagag cctggcaacg tggcacatac ctttaatccc 540 agcaccaggg agacagaggc catcctggtc taaaaagtga tctccaggac agccatggct 600 attacacaga gaaaccctgt ctggaaaaac aaaaaattag tgtccatgtg taaatgtgtg 660 gagtatgctt gtcatgccac atacagaggt agagggcagt ttatgggagt cagttcctat 720 tcttccttta tgggggacct ggggactgaa ctcaggtcat caggcttggc agaaagtgca 780 ttagctcacg gagccttatc attggcgaaa gctctctcaa gtagaaaatc aatgtgtttg 840 ctcatagtgc aatcattatg tttcgagagg ggaagggtac aatcgttggg gcatgtgtgg 900 tcacatctga atagcagtag ctccctagga gaattaattc caagttcttt ggtggtgtat 960 caatgccctt aaaggggtca acaacttttt ttccctctga caaaactatc ttcttatgtc 1020 cttgtccc 1028 <210> 20 <211> 1516 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 20 gttgctattt tagagacagg atttcttgca aacctggttg gtcttaaact ccgtatgtag 60 ctgagaatga ccttgaaaac cttcctgtcc cacccctcaa attccagaat tatagacacc 120 caccacatgg cttaataagt aaacaacaac aataaaagca tgacttctgg gtctggaggg 180 agggcttgcc agttaagagc aatggatact ttcccataga acctgggttt gactcccagc 240 actaacctac atggtgatag tgatgcagca gacatacatg agggcaacac acacatgggc 300 acatacacac gcacccgccc accatggctt ttcccccatc acttagacag ccatatttaa 360 acgtagtgga gccaggctgg ggtggtggcc cacaccttta atcccagcac tccagaaggc 420 agaggtaggc ggatctctgt gggtttgaga ccagcctggt ctacaagagc tagttccagg 480 acagcctcca aagccataga gaaaccctat ctcaaaaaac tgaaacaaca acaacaacaa 540 aacaaaataa aaaaacaaca aaagaatctt agtggttcag tggttccaca cacaggaaag 600 tagaaagggc cttgatggga aggttttcag agggaggagt atggatgaga caggatgata 660 gtgaaaagaa ctcaaattaa ttaaatattt gaaactatct aagaataaaa gctaaaatat 720 ttaaaattac agtcaggtag tggtggtgca gagggctaag ttggtagaca cagtgagatc 780 caggccagcc agggctacct agtgagacct tgttcaaata actaataaaa tatacaaaat 840 aaaggagaca ccacaataat tttgaaatgt aaaagactaa atttaccttt tatattgatg 900 agttggataa aaaaatcaat ttaccagaga acataaagta gtcccatcaa agacaaaagc 960 aatatatgat taaactctaa tttaaaagtt tgttagagcc tggcaacgtg gcacatacct 1020 ttaatcccag caccagggag acagaggcca tcctggtcta aaaagtgatc tccaggacag 1080 ccatggctat tacacagaga aaccctgtct ggaaaaacaa aaaattagtg tccatgtgta 1140 aatgtgtgga gtatgcttgt catgccacat acagaggtag agggcagttt atgggagtca 1200 gttcctattc ttcctttatg ggggacctgg ggactgaact caggtcatca ggcttggcag 1260 aaagtgcatt agctcacgga gccttatcat tggcgaaagc tctctcaagt agaaaatcaa 1320 tgtgtttgct catagtgcaa tcattatgtt tcgagagggg aagggtacaa tcgttggggc 1380 atgtgtggtc acatctgaat agcagtagct ccctaggaga attaattcca agttctttgg 1440 tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aacttttttt ccctctgaca aaactatctt 1500 cttatgtcct tgtccc 1516 <210> 21 <211> 381 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 21 cttgcggtcg aggactacag tcattttgca ggtttcctta ctgtatggct tttaaaacgt 60 gcaaaggtga ccattaaccg tttcacgctg ggagggcacg tgcggctcag atgcttcctc 120 tgactgaggg ccaggagggg gctacacgga agaggccaca cccgcacttg ggaagactcg 180 atttgggctt cagctggctg agacgcccca gcaggctcct cggctacacc ttcagccccg 240 aatgccttcc ggcccataac ccttcccttc taggcatttc cggcgaggac ccaccctcgc 300 gccaaacatt cggccccatc ccccggtcct cacctgaatc tctaactctg actccagagt 360 ttagagacta taaccagata g 381 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 22 ctatgaggat ccgcctgaag acctgagttg atac 34 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 23 tatgcaggat ccgttgctat tttagagaca ggatttc 37 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 24 tatgcaggat cccaaagcca tagagaaacc ctatc 35 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 25 tatgcaggat ccacctttaa tcccagcacc agg 33 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 ctatgaggat ccctatcttc ttatgtcctt gtccc 35 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 tatgcaggat cccaggctgg tctcgaactc ag 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 ctatgaggat cccttgcggt cgaggactac ag 32 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 ctatgatgta cagcctgaag acctgagttg atac 34 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 attgcatgta cactatctgg ttatagtctc taaactctg 39 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 atagcatgta cagaaatcct gtctctaaaa tagcaac 37 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 atagcatgta cagatagggt ttctctatgg ctttg 35 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 atacgatgta cacctggtgc tgggattaaa ggt 33 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 atagcatgta cagggacaag gacataagaa gatag 35 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 tagttatgta cactgagttc gagaccagcc tg 32 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 atagcatgta cactgtagtc ctcgaccgca ag 32 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 37 atacgaggat cccctggtgc tgggattaaa ggt 33 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 38 atagcaggat ccgatagggt ttctctatgg ctttg 35 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 39 ctccacacat ttacacatgg acac 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 40 gggtttctct gtgtaatagc catg 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 41 atctcactgt gtctaccaac ttag 24 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 42 tctgcaccac cactacctga ct 22 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 43 ctaagagtac ttgccatgag agcctgaa 28 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 44 cattgataca ccaccaaaga acttg 25

Claims (45)

  1. TE-13(서열번호 15) 또는 TE-13(서열번호 15)의 단편 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 TE-13(서열번호 15)의 유도체 또는 이의 단편 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 염색체 통합시 발현 시스템내 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 핵산.
  2. TE-08(서열번호 10) 또는 TE-08(서열번호 10)의 단편 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 TE-08(서열번호 10)의 유도체 또는 이의 단편 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 염색체 통합시 발현 시스템내 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 핵산.
  3. 서열번호 1 또는 서열번호 1의 단편 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1의 유도체 또는 이의 단편 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 염색체 통합시 발현 시스템내 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를 가져오는 핵산으로서, 여기서 상기 단편 또는 유도체는 1 bp 내지 1578 bp의 핵산 영역으로 이루어진 하나 이상의 서열 영역을 갖는 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TE 요소를 포함하지 않는 대조군과 비교한 발현 시스템내 목적 유전자의 전사 또는 발현의 증가를, 예를 들면, ELISA에 의해 생성물 역가를 측정함으로써 측정함을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 핵산 서열 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10)의 영역 또는
    (b) 이들의 상보적 핵산 서열 또는
    (c) 상기 (a) 또는 (b)와 적어도 약 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 85%의 서열 동일성, 특히 바람직하게는 적어도 약 90%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열과
    엄중한 조건(stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산의 길이가 511 bp(= TE-13, 서열번호 15의 길이) 이상이거나 1015 bp(= TE-08, 서열번호 10의 길이) 이상임을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 TE-00(서열번호 2), TE-01(서열번호 3), TE-02(서열번호 4), TE-03(서열번호 5), TE-04(서열번호 6), TE-06(서열번호 8), TE-07(서열번호 9), TE-08(서열번호 10), TE-10(서열번호 12), TE-11(서열번호 13), TE-12(서열번호 14), TE-13(서열번호 15), TE-14(서열번호 16), TE-15(서열번호 17), TE-16(서열번호 18), TE-17(서열번호 19), TE-18(서열번호 20) 및 TE-21(서열번호 21) 중에서 선택되는 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 TE-00(서열번호 2), TE-06(서열번호 8) 또는 TE-21(서열번호 21), TE-10(서열번호 12), TE-11(서열번호 13) 또는 TE-12(서열번호 14), 바람직하게는 TE-06(서열번호 8)임을 특징으로 하는 핵산.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 TE-01(서열번호 3), TE-02(서열번호 4), TE-03(서열번호 5), TE-07(서열번호 9) 또는 TE-08(서열번호 10)임을 특징으로 하는 핵산.
  10. 제9항에 있어서, 핵산이 TE-08(서열번호 10)인 핵산.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 TE-01(서열번호 3), 바람직하게는 TE-13(서열번호 15), TE-14(서열번호 16), TE-15(서열번호 17), TE-16(서열번호 18), TE-17(서열번호 19), TE-18(서열번호 20)의 단편 또는 유도체인 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 핵산이 TE-13(서열번호 15)인 핵산.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 또는 단편 또는 유도체가 분리된 핵산인 핵산.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10) 또는 TE-07(서열번호 9) 또는 TE-06(서열번호 8) 또는 TE-21(서열번호 21) 또는 이들 서열의 단편 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열 또는 이들 서열의 유도체 또는 이들 서열의 단편의 유도체 또는 이들의 상보적 뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 TE-13(서열번호 15) 또는 TE-08(서열번호 10) 또는 이들 서열의 단편 또는 이들 서열의 유도체 또는 이들 서열의 단편의 유도체를 포함하는 핵산이 이종 서열에 연결되어 있는 핵산.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 프로모터 및/또는 이종의 목적 유전자 및/또는 선별가능 마커 및/또는 임의로 인핸서를 포함함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 제1항 내지 제14항 중 하나 이상의 항에 따른 다수의 동일하거나 또는 상이한 핵산의 조합을 포함하며, 여기서, 하나 이상의 핵산이 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 위치하고/하거나 하나 이상의 핵산이 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 위치함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 조합되는 핵산이 TE-06(서열번호 8) 및 바람직하게는 TE- 08(서열번호 10)임을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 하나 이상의 TE-08 핵산(들)(서열번호 10)과 하나 이상의 TE-06 핵산(들)(서열번호 8) 또는 TE-21 핵산(들)(서열번호 21)의 조합이 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 위치하고/하거나 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 위치하지만, 하나의 TE-08 핵산(서열번호 10)에 이은 하나의 TE-06-핵산(서열번호 8) 또는 하나의 TE-21 핵산(서열번호 21)의 조합이 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 위치하는 것이 바람직함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  20. 제17항에 있어서, 하나 이상의 TE-08-핵산(들)(서열번호 10)이 목적 유전자의 앞(즉, 5')에 위치하고 하나 이상의 TE-08-핵산(들)(서열번호 10)이 목적 유전자의 뒤(즉, 3')에 위치하며, 바람직하게는 하나의 TE-08-핵산이 목적 유전자의 앞에 위치하고 하나의 TE-08-핵산이 목적 유전자의 뒤에 위치함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 플라스미드에 걸쳐서 분산된 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산을 포함함을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 선별가능 마커가 DHFR이거나, 예를 들면, Neo F240I와 같은 Neo임을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  23. 발현 벡터에 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 통합시킴을 특징으로 하는, 진핵생물 발현 벡터의 생산 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 진핵생물 발현 벡터를 포함함을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
  25. 제24항에 있어서, 고 생산자(high producer)이며, 즉, TE 요소가 없는 비교가능한 진핵 숙주 세포보다 더 높은 비생산성(specific productivity)을 가지며, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배 또는 10배까지 증가된 발현 수준을 갖거나 또는 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 7배 이상 또는 10배 이상, 바람직하게는 5배 이하 또는 3배 이상 증가된 발현 수준을 갖는 것을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 발현 벡터가 게놈에 안정하게 통합됨을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 예를 들면, CHO, NS0, Sp2/0-Ag14, BHK21, BHK TK-, HaK, 2254-62.2(BHK-21-유도체), CHO-K1, CHO- DUKX(= CHO duk-, CHO/dhfr-), CHO-DUKX B1, CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 특히 바람직하게는 CHO-DG44 세포와 같은 포유동물 세포인 진핵 숙주 세포.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1, A1, MCL-1, BOO, BRAG-1, NR-13, CDN-1, CDN-2, CDN-3, BHRF-1, LMW5-HL 또는 CED-9, 바람직하게는 Bcl-xL 또는 BCL-2, 가장 바람직하게는 BCL-xL과 같은 항-아폽토시스(anti-apoptosis) 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 진핵 숙주 세포.
  29. (a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산을 목적 유전자를 포함하는 진핵생물 발현 벡터내에 통합시키는 단계;
    (b) 진핵 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
    (c) 형질감염된 고-생산성 숙주 세포를 선별하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는, 안정하게 형질감염된 고-생산성 진핵 숙주 세포주의 개발 방법.
  30. 제29항에 있어서, 추가의 증폭 단계를 특징으로 하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 추가의 클로닝 단계를 특징으로 하는 방법.
  32. (a) 숙주 세포를, 바람직하게는 변형된, 목적 단백질/생성물, 네오마이신-포스포트랜스퍼라제, 및 증폭가능한 선별가능 마커 DHFR을 적어도 암호화하는 유전자로 형질감염시키는 단계(여기서, 전사 또는 발현을 향상시키기 위하여 적어도 목적 유전자(또는 유전자들)는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결되어 있다);
    (b) 상이한 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 세포를 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지에서, 예를 들면, G418과 같은 선별제의 존재하에 배양함으로써 상기 공동-통합된 유전자를 선별하는 단계; 및
    (d) 상기 세포를, 예를 들면, 메토트렉세이트와 같은 적어도 증폭가능한 선별가능 마커의 증폭을 허용하는 선별제의 존재하에 배양함으로써 상기 공동-통합된 유전자를 증폭시키는 단계
    를 특징으로 하는, 재조합 포유동물 세포의 제조 및 선별 방법.
  33. 제32항에 있어서, 형질감염된 세포를, 적어도 200 ㎍/mL의 G418, 바람직하게는 400 ㎍/mL 이상의 G418이 보충된 하이포크산틴/티미딘-미함유 배지에서, 혈청의 부재하에 그리고 MTX의 첨가 농도를 증가시키면서 배양함을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 제1 증폭 단계에서 MTX의 농도가 적어도 100nM 또는 적어도 250nM이고 단계적으로 1μM 이상으로 증가시키는 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질의 글리코실화를 향상시키는 방법과 결합되는 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 예를 들면, CHO, NS0, Sp2/0-Ag14, BHK21, BHK TK-, HaK, 2254-62.2 (BHK-21-유도체), CHO-K1, CHO-DUKX (= CHO duk-, CHO/dhfr-), CHO-DUKX B1, CHO-DG44, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, CHL 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 특히 바람직하게는 CHO-DG44 세포와 같은 포유동물 세포인 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터가 DHFR 또는 Neo, 예를 들면, Neo F240I과 같은 선별가능 마커를 포함하는 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 고 생산자의 비율이 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배 또는 10배까지 또는 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 7배 이상 또는 10배 이상, 바람직하게는 5배 이하 또는 3배 이상 증가되는 방법.
  39. (a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 핵산을 목적 유전 자를 포함하는 진핵생물 발현 벡터내에 통합시키는 단계;
    (b) 진핵 숙주 세포를 상기 발현 벡터로 형질감염시키는 단계;
    (c) 형질감염된 고-생산성 숙주 세포를 선별하는 단계; 및
    (d) 목적 유전자(들)의 발현을 허용하는 조건하에 수득한 형질감염된 고-생산성 숙주 세포를 배양하는 단계
    를 특징으로 하는, 생약제 생성물의 제조 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    (e) 목적 단백질을 수거하고 정제하는 단계
    를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  41. 진핵 숙주 세포내 발현 시스템에서 목적 유전자의 전사 또는 발현을 증가시키거나 또는 생약제 생성물을 제조하기 위한, 진핵생물 발현 벡터내 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
  42. 유전자도입(transgenic) 동물 또는 식물을 생산하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
  43. 유전자 치료요법에 있어서의, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
  44. 약제 또는 약제학적 조성물로서의, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산 요소의 용도.
  45. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산(들), 발현 벡터(들), 숙주 세포(들) 및 임의로 형질감염 시약(들)으로 이루어진 키트.
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