KR101149777B1 - 신규한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 고생산성 재조합 세포의 선별 방법 - Google Patents

신규한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 고생산성 재조합 세포의 선별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 고-생산성 재조합 세포의 선별 방법에서 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 관심대상의 유전자를 함유하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 사용하여 이종 유전자 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
Figure R1020057009681
변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 관심대상의 유전자, 이종 프로모터, 선별제

Description

신규한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 고 생산성 재조합 세포의 선별 방법{Novel neomycin phosphotransferase genes and method for the selection of high-producing recombinant cells}
본 발명은 신규한 변형된 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 유전자 및 고-생산성 재조합 세포의 선별 방법에서 이의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한, 바람직하게는 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 관심대상의 유전자와 조합된 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 신규한 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상응하는 고-생산성 재조합 세포를 사용한 이종 유전자 산물의 제조 방법에 관한 것이다.
포유동물 세포는 해독후 수행되는 변형이 기능면 및 약동학면 둘다에서 사람에 적합하기 때문에 복잡한 생물약제학적 단백질의 생산에 바람직한 숙주 세포이다. 주요한 관련 세포 유형은 하이브리도마, 골수종 CHO(중국 햄스터 난소) 세포 및 BHK(어린 햄스터 신장) 세포이다. 숙주 세포의 배양은 점점 무혈청 및 단백질 비함유 생산 조건하에 수행되고 있다. 이러한 이유는 부수적 비용 감소, 재조합 단백질의 정제시 감소된 간섭 및 병원체(예: 프리온 및 바이러스)가 도입될 가능성의 감소 때문이다. 숙주 세포로서 CHO의 사용은, 이들 세포가 무혈청 및 단백질 비함유 배지 내의 현탁액 성장에 맞게 변용되고 또한 규제 기관에 의해 안전한 생산 세포로서 간주되고 인정됨에 따라 보다 널리 보급되고 있다.
관심대상의 이종 유전자(GOI)를 발현하는 안정한 포유동물 세포주를 생산하기 위해, 이종 유전자는 일반적으로 형질감염에 의해 선별 마커 유전자, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT)와 함께 목적하는 세포주내로 삽입된다. 이종 유전자 및 선별 마커 유전자는 하나의 개별적 또는 별도의 공형질감염된 벡터로부터 출발하여 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 형질감염 2 내지 3일 후, 형질감염된 세포는 선별제, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제-유전자(NPT 유전자)를 사용한 경우에 G418을 함유하는 배지로 옮기고 이러한 선별 조건하에 수주 동안 배양한다. 외인성 DNA가 통합되어진 새로운 내성 세포를 분리하여 (GOI의) 목적하는 유전자 산물의 발현에 대해 조사할 수 있다.
목적하는 단백질을 고수준으로 발현하는 세포주를 확립하는데 있어서의 주된 문제는 재조합 벡터가 숙주 세포 게놈내의 전사적 활성 또는 불활성 유전자좌로 무작위적이고 지시되지 않게 통합됨으로써 유발된다. 그 결과, 이종 유전자의 발현율이 완전히 상이하고 세포의 생산성이 일반적으로 정규분포에 따르는 세포 집단이 수득된다. 따라서, 관심대상의 이종 유전자의 매우 높은 발현을 갖는 세포 클론을 확인하기 위해, 다수의 클론을 검사하고 시험하는 것이 필수적인데, 이는 시간 소모적이고 노동 집약적이며 많은 비용이 소모된다. 따라서, 형질감염을 위해 사용되는 벡터 시스템을, 적합한 선별 전략에 의해 형질감염된 세포 집단내의 고생산자의 비율을 증가시키고 이로써 클론 확인과 관련되는 비용과 노력을 감소시키도록 개선시킨다. 이러한 발현 시스템의 개발이 본 발명의 주제이다.
아미노 글루코시드-3'-포스포트랜스퍼라제 II 효소(네오마이신-포스포트랜스퍼라제)(EC27195)(이의 유전자는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 트랜스포존 5에 연합되어 있다)는 수많은 유기체(예: 세균, 효모, 식물 및 포유동물 세포)에서 선별 마커로서 사용된다. 상기 효소는 말단 포스페이트를 ATP로부터 아미노헥소스 환 I의 3' 하이드록실 그룹에 전달함에 의해 항생제를 불활성화시킴으로써 네오마이신, 카나마이신 및 G418과 같은 다양한 아미노글리코시드 항생제에 대한 내성을 부여한다. 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 이외에, 세균[참조: Blaquez et al., 1991; Kocabiyik et al., 1992; Yenofsky et al., 1990] 및 담배 잎의 절편[참조: Yenofsky et al., 1990]에서 포스포트랜스퍼라제 활성이 감소되어 아미노글리코시다제 항생제에 대한 내성이 감소된 일부 돌연변이체가 공지되어 있다.
이러한 돌연변이체 중 하나(Glu182Asp)는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 표적화된 상동성 재조합(유전자 표적화)에 의해 c-myc 유전자내로 통합되어진 배아줄기 세포를 선별하기 위한 마커로서 사용되었다[참조: Hanson et al., 1995]. 이 저자는 이들 자체를 유전자 표적화를 위한 변형된 효소의 용도로 제한하고 있다.
특허원 제WO 99/53046호에는 생산-관련 포유동물 세포에서의 변형된 네오마 이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(Asp261Asn)의 발현이 기재되어 있다. 저자는 포유동물 세포에서의 관심대상의 유전자의 발현을 위한 비-클로닝 방법을 기술하고 있다. 세포를 프로모터 요소, 관심대상의 유전자 및 IRES("내부 리보솜 진입 부위") 요소와 커플링된 선별 마커를 암호화하는 3개의 개별적 DNA 단편으로 공형질감염시킴으로써, 모든 3개의 DNA 단편이 기능적 이시스트론성(bicistronic) 전사 단위(관심대상의 유전자-IRES-네오마이신-포스포트랜스퍼라제 유전자)로서 조합된 세포를 선별 압력하에 계획적으로 성장시킬 수 있다. 요소의 배열은 형질감염된 세포에서만 일어나서, 오직 소수의 세포만이 요소의 정확한 배열을 나타낸다. 게다가, 유전자 증폭 후, 증폭가능한 선별 마커를 사용하는 경우 고-생산성 클론이 생성되지 않을 수 있다. 반복적 선별 및 유전자 증폭 후, 생성된 세포는 1일당 세포당 단백질 최대 6pg(6pg/세포/일)을 나타냈다.
어떠한 문헌에도, 하나 이상의 관심대상의 유전자 및 또한 항생제 내성이 감소된 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 대한 하나 이상의 완전한 기능적 전사 단위를 함유하는 재조합 생물약제학적 단백질을 제조하기 위해 고 생산성 세포를 개발할 수 있도록 하는, 포유동물 세포용 고 발현 벡터 시스템의 제조에 대한 특정한 적합성을 갖는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 기재되어 있지 않다. 제WO 99/53046호에 기재된 DNA 작제물은 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자에 기능적으로 연결된, 프로모터 부재 네오마이신 유전자만을 함유한다.
따라서, 특히 생물약제학적 방법을 위한 상응하는 고 발현 벡터 시스템의 개 발에 유용한 적합한 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 제조해야할 필요가 있다. 따라서, 본 발명의 문제는 상응하는 신규한 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 관심대상의 유전자를 함유하는 발현 벡터, 고 생산성 재조합 세포, 바람직하게는 포유동물 세포의 선별 방법 및 이종 유전자 산물의 생산 방법을 제공하는 것이었다.
놀랍게도, 본 발명의 범주내에서, 고 생산성 세포의 선별에 대한 특정한 적합성을 특징으로 하는 신규한 변형된 고 선택성 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 생산하고 확인할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
발명의 요지
본 발명은 신규한 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 제공한다. 놀랍게도, 공동 통합된 관심대상의 유전자의 발현율이 높은 형질감염된 포유동물 세포의 증대는 하기하는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 선별 마커로서 사용함으로써 달성할 수 있다.
선별 마커로서 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 사용과 비교하여, 본 발명에 따른 신규한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 중 하나로 형질감염시킨 후, 세포는 1.4 내지 14.6의 인자만큼 증가된 단백질(항체) 생산성을 나타냈다.
본 발명에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자는 바람직하게는 91, 182, 198, 227, 240 또는 261번 아미노산 위치에서 야생형 유전자와 상이한 아미노산을 암호화하는 돌연변이체이다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자는 돌연변이체 Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Asn, Asp261Gly 또는 Phe240Ile이다. 고 생산성 포유동물 세포를 선별하기 위해, 돌연변이체 Trp91Ala, Asp227Val, Asp261Asn, Asp261Gly 및 Phe240Ile를 사용하는 것이 특히 적합한 것으로 입증된 한편, 돌연변이체 Asp227Val 및 Asp261Gly는 세포에 가장 높은 생산성을 제공하므로 특히 바람직한 것으로 입증되었다.
고-생산성 세포는 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 관심대상의 이종 유전자와 본 발명에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 진핵 발현 벡터를 사용하여 수득되었다. 상기 발현 벡터는 바람직하게는 다른 조절 요소, 예를 들어, 프로모터 또는 프로모터들에 기능적으로 연결된 하나 이상의 인핸서를 함유한다. 이종 프로모터의 제어하에, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 관심대상의 단백질/산물을 암호화하는 유전자의 이시스트론성 발현을 가능하게 하는, 바람직하게는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 통해 관심대상의 유전자와 이종 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 형광 단백질에 대한 유전자를 함유하는 발현 벡터가 또한 바람직하다. 관심대상의 이종 유전자가 유비퀴틴/S27a 프로모터의 제어하에 있는 발현 벡터가 특히 적합하다.
본 발명은 또한 관심대상의 유전자 대신에, 이러한 유전자를 혼입시키기 위한 다중 클로닝 부위, 즉 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다수의 인식 서열을 갖는 서열 부분을 함유하는 발현 벡터에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급한 본 발명에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 중 하나를 함유하는 재조합 포유동물 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터 중 하나로 형질감염된 재조합 포유동물 세포에 관한 것이다. 이들 세포는 바람직하게는 재조합 설치류 세포로서, 이 중 재조합 햄스터 세포, 예를 들어, CHO 또는 BHK 세포가 특히 바람직하다. 다른 바람직한 양태에서, 상기 재조합 세포는 증폭가능한 선별 마커에 대한 유전자, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 유전자로 추가로 형질감염된다.
본 발명은 또한 (i) 포유동물 세포의 풀(pool)을, 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 단지 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 단지 1.5 내지 26%의 활성만을 갖고/갖거나 상기한 변형 중 하나를 갖는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 유전자로 형질감염시키고; (ii) 상기 포유동물 세포를 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있도록 하는 조건하에 배양하고; (iii) 상기 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양함을 특징으로 하여, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 증대시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (i) 포유동물 세포의 풀을 하나 이상의 관심대상의 유전자 및 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 단지 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 단지 1.5 내지 26%의 활성만을 갖고/갖거나 상기한 변형 중 하나를 갖는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 하나의 유전자로 형질감염시키고; (ii) 세포를 상기 관심대상의 유전자 또는 유전자들 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있도록 하는 조건하에 배양하고; (iii) 상기 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고; (iv) 관심대상의 단백질 또는 단백질들을 포유동물 세포 또는 배양 상청액으로부터 수득함을 특징으로 하여, 재조합 포유동물 세포에서 하나 이상의 관심대상의 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 (i) 재조합 포유동물 세포를, 관심대상의 유전자와 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 이외에 형광 단백질을 암호화하는 본 발명의 발현 벡터로 형질감염시키고; (ii) 포유동물 세포를 관심대상의 유전자, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에 배양하고; (iii) 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고; (iv) 포유동물 세포를 유세포 측정 분석법으로 분류함을 특징으로 하여, 하나 이상의 관심대상의 이종 유전자를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 수득 및 선별하는 방법에 관한 것이다.
포유동물 세포가 증폭가능한 선별 마커 유전자, 예를 들어, DHFR 유전자로 추가로 형질감염된 경우, 증폭가능한 선별 마커 유전자도 또한 발현되는 조건하에 포유동물 세포를 배양하고, 증폭가능한 선별 마커 유전자의 증폭을 유발하는 선별제를 배양 배지에 첨가할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 현탁액 중 성장에 맞게 변용된 포유동물 세포, 즉 현탁액 배양물 중에서 배양된 포유동물 세포로 수행한다. 다른 양태는 포유동물 세포, 바람직하게는 현탁액 중 성장에 적합한 포유동물 세포를 무혈청 조건하에 배양하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 CHO-DG44 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는데 사용되는 기본 벡터의 도식적 설명을 나타낸 것이다. "P/E"는 CMV 인핸서와 햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터의 조합물이다. "P"는 그자체로 프로모터 요소를 나타내고, "T"는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화를 위해 필요한 전사 종결 시그날이다. 각각의 전사 단위내에서 전사 개시의 위치 및 방향은 화살표로 표시한다. 이종 유전자의 클로닝을 위해, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 다중 절단 부위(다중 클로닝 부위-MCS)를 갖는 서열 영역이 프로모터 요소 다음에 삽입된다. 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 "dhfr"로 약칭되며, 선별 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제는 "npt"(npt 야생형 또는 npt 돌연변이체)로 약칭된다. 뇌심근염 바이러스로부터 유래된 "IRES" 요소는 이시스트론성 전사 단위 내의 내부 리보솜 진입 부위로서 작용하며 다음의 녹색 형광 단백질 "GFP"의 해독을 가능하게 한다.
도 2는 일본쇄 단백질(도 2A) 또는 모노클로날 항체의 서브유닛(도 2B)을 암호화하고 CHO-DG44 세포를 형질감염시키는데 사용되는 진핵 발현 벡터의 도식적 도면을 나타낸 것이다. "P/E"는 CMV 인핸서와 햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터의 조합물이다. "P"는 그자체로 프로모터 요소를 나타내고, "T"는 전사된 mRNA의 폴리아데닐화를 위해 필요한 전사 종결 시그날이다. 각각의 전사 단위내에서 전사 개시의 위치 및 방향은 화살표로 표시한다. 증폭가능한 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 "dhfr"로 약칭되며, 선별 마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제는 "npt"로 약칭된다. NPT 돌연변이체 E182G(서열 번호 3), E182D(서열 번호 19), W91A(서열 번호 5), D190G(서열 번호 23), V198G(서열 번호 7), D208G(서열 번호 25), D227A(서열 번호 9), D227V(서열 번호 11), D227G(서열 번호 21), D261G(서열 번호 13), D261N(서열 번호 15) 및 F240I(서열 번호 17)은 표시된 위치에서 변형된 아미노산(1-문자 코드로 기재함)을 야기하는 점 돌연변이를 함유한다. 뇌심근염 바이러스로부터 유래된 IRES 요소는 이시스트론성 전사 단위 내의 내부 리보솜 진입 부위로서 작용하며 다음의 녹색 형광 단백질 "GFP"의 해독을 가능하게 한다. "MCP-1"은 단핵구 화학주성 단백질-1(Monocyte Chemoattractant Protein-1)을 암호화하며, "HC" 및 "LC"는 각각 사람화 모노클로날 IgG2 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다.
도 3은 점 돌연변이가 돌연변이유발성 프라이머를 이용한 PCR에 의해 삽입되어진 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt) 유전자의 서열의 일부분을 나타낸 것이다. 대문자는 npt 암호화 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 반면에, 소문자는 플랭킹 비-암호화 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열로부 터 추정되는 아미노산 서열(3문자 코드)은 암호화 뉴클레오타이드 서열 위에 나타낸다. 화살표는 사용된 프라이머의 방향, 길이 및 위치를 나타내고, 실선 화살표는 돌연변이유발성 정방향 프로라이머를 나태내고, 파선은 돌연변이유발성 역방향 프라이머를 나타내고, 점선은 각각 npt 유전자 또는 돌연변이 부위의 상부에 위치하는 프라이머 Neofor5(서열 번호 27) 또는 Neofor2(서열 번호 29)를 나타내고, ._._._ 선은 npt 유전자 또는 돌연변이 부위의 하부에 위치하는 프라이머 Neorev5(서열 번호 28) 또는 IC49(서열 번호 30)를 나타낸다. 야생형 서열에 관해서 변경된 뉴클레오타이드는 화살표 위와 아래에 강조되어 있다.
도 4는 NPT 아미노산 서열내의 보존된 도메인 및 삽입된 NPT 돌연변이의 위치를 나타낸 것이다. 상이한 아미노글리코시드-변형된 효소의 서열 상동성을 토대로 하여, 상이한 보존된 도메인을 NPT 단백질 서열내에서 확인되었다(회색으로 나타냄). 효소의 C-말단 영역내의 3개의 모티프는 명백하게 특수한 기능을 지닌다. 모티프 1 및 2는 ATP 촉매 또는 뉴클레오타이드 결합에서 말단 포스페이트의 촉매적 전달에 관여하는 것으로 가정되는 반면에, 모티프 3은 ATP 가수분해 및/또는 효소-아미노글리코시드 복합체의 입체형태 변화에 작용하는 것으로 사료된다. 70% 이상의 아미노글리코시드-변형 효소에 존재하는 아미노산은 볼드체로 강조한다. 한줄로 밑줄 친 아미노산은 이의 유사성에 기초하여 동일한 그룹으로 분류되며 70% 이상의 아미노글리코시드-변형 효소에 존재한다. *로 표시한 아미노산은 돌연변이 부위의 위치를 나타낸다.
도 5는 안정하게 형질감염된 MCP-1-발현 세포의 선별에 대한 NPT 돌연변이의 영향을 나타낸 것이다. 이를 위해, CHO-DG44 세포를 선별 마커로서 NPT 야생형(WT) 또는 NPT 돌연변이체 Glu182Asp 및 Asp227Gly를 함유하는 벡터 pBIN-MCP1, pKS-N5-MCP1및 pKS-N8-MCP1(도 2A)로 형질감염시켰다. 안정하게 형질감염된 세포를 선별하기 위해, G418 400㎍/mL 또는 800㎍/mL를 선별제로서 배지에 첨가하였다. 생산된 재조합 단백질 MCP-1의 세포 배양 상청액 중의 농도를 ELISA로 측정하고, 세포당 및 1일당 비생산성(specific productivity)을 계산하였다. 막대는 6웰 디쉬내에서 6회의 배양으로부터의 18개의 풀의 비생산성(specific productivity) 또는 역가의 평균을 나타낸다.
도 6에서는, 안정하게 형질감염된 mAb 발현 세포의 선별에 대한 NPT 돌연변이의 영향이 조사되었다. 이를 위해, CHO-DG44 세포를, 선별 마커로서 사용되는 NPT 유전자(야생형 또는 돌연변이체)만이 서로 상이한 플라스미드 조합물 pBIDG-HC/pBIN-LC(NPT-야생형), pBIDG-HC/pKS-N5-LC(NPT 돌연변이체 Glu182Asp) 또는 pBIDG-HC/pKS-N8-LC(NPT 돌연변이체 Asp227Gly)(도 6A) 또는 조합물 pBIDG-HC/pBIN-LC(NPT-야생형), pBIDG-HC/pBIN1-LC (NPT 돌연변이체 Glu182Gly), pBIDG-HC/pBIN2-LC (NPT 돌연변이체 Trp91Ala), pBIDG-HC/pBIN3-LC (NPT 돌연변이체 Val198G), pBIDG-HC/pBIN4-LC (NPT 돌연변이체 Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC (NPT 돌연변이체 Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (NPT 돌연변이체 Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC(NPT 돌연변이체 Asp261Asn) 또는 pBIDG-HC/pBIN8-LC(NPT 돌연변이체 Phe240Ile)(도 6B)로 형질감염시켰다. 생산된 재조합 모노클로날 IgG2의 세포 배양 상청액 중의 농도를 ELISA로 측정하고, 세포당 및 1일당 비생산성(specific productivity)을 계산하였다. 전부 5 내지 9개의 풀을 각각의 벡터 조합물에 대해 설정하였다. 막대는 75cm2 플라스크내에서 6회의 배양 수행으로부터 시험 중인 모든 풀의 비생산성(specific productivity) 또는 역가의 평균을 나타낸다. 상대적 역가 또는 상대적 비생산성(specific productivity)을 계산하기 위해, NPT 야생형 유전자를 사용하여 선별한 풀의 평균을 1로 고려하였다.
도 7은 선별 마커로서 본 발명에 따른 NPT 돌연변이체를 사용하여 형질감염된 세포 풀 중에서 GFP 발현이 보다 높은 세포의 증대를 나타낸 것이다. 이를 위해, CHO-DG44 세포를, 선별 마커로서 사용되는 NPT 유전자(야생형 또는 돌연변이체)만이 서로 상이한 플라스미드 조합물 pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-야생형), pBIDG-HC/pKS-N5-LC (NPT 돌연변이체 Glu182Asp), pBIDG-HC/pKS-N8-LC (NPT 돌연변이체 Asp227Gly), pBIDG-HC/pBIN1-LC (NPT 돌연변이체 Glu182Gly),pBIDG-HC/pBIN1-LC (NPT 돌연변이체 Glu182Gly), pBIDG-HC/pBIN2-LC (NPT 돌연변이체 Trp91Ala), pBIDG-HC/pBIN3-LC (NPT 돌연변이체 Val198G), pBIDG-HC/pBIN4-LC (NPT 돌연변이체 Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC (NPT 돌연변이체 Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC (NPT 돌연변이체 Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC (NPT 돌연변이체 Asp261Asn) 또는 pBIDG-HC/pBIN8-LC(NPT 돌연변이체 Phe240Ile)(각 경우에 5 내지 9개의 풀)로 형질감염시켰다. 또한, pBIDG 벡터는 마커 유전자로서 GFP를 또한 함유하였다. G418를 첨가한 HT 비함유 배지내에서 형질감염된 세포 풀을 2 내지 3주 동안 선별한 후에, GFP 형광을 FACS 분석으로 측정하였다. 음성 대조군으로서 사용된 비-형질감염된 CHO-DG44 세포를 제외한 모든 그래프는 동일한 플라스미드 조합물로 형질감염된 풀로부터의 평균 GFP 형광을 나타낸다.
도 8은 CHO-DG44를 벡터 조합물 pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT-야생형) 또는 pBIDG-HC/pBIN5-LC(NPT 돌연변이체 D227V)로 형질감염시켜 수득한 세포 풀을 예로 하여dhfr-매개된 유전자 중폭에 의해 달성된 mAb 생산성의 증가를 나타낸 것이다. G418의 존재하에 하이포크산틴/티미딘-비함유 CHO-S-SFMII 배지에서의 제1 선별 후, dhfr-매개된 유전자 증폭을 배양 배지에 MTX 100nM에 이어서 MTX 500nM를 첨가하여 수행하였다. 풀의 세포 배양 상청액 중의 mAb의 농도를 ELISA로 측정하고, 세포당 및 1일당 비생산성(specific productivity)(pg/세포*일)을 계산하였다. 각각의 데이터 점은 75cm2 플라스크내에서의 6회의 배양 수행의 평균을 나타낸다.
도 9는 돗트 검정에서 NPT 야생형과 비교한 본 발명에 따른 NPT 돌연변이체의 효소 활성을 나타낸 것이다. 이를 위해, 세포 추출물을 NPT 야생형 유전자(서열 번호 1) 또는 NPT 돌연변이체 E182G(서열 번호 3), E182D(서열 번호 19), W91A(서열 번호 5), V198G(서열 번호 7), D227A(서열 번호 9), D227V(서열 번호 11), D227G(서열 번호 21), D261G(서열 번호 13), D261N(서열 번호 15) 및 F240I(서열 번호 17), Glu182Asp 또는 Asp227Gly로 형질감염시켜 선별한, mAb를 발현하는 2개의 상이한 세포 풀(풀 1 및 2)로부터 제조하였다. 비-형질감염된 CHO-DG44 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. G418은 인산화 검정에서 기질로서 사용하였다. 추출물을 96웰 진공 매니폴드(manifold)내에서 P81 포스포셀룰로스와 니트로셀룰로스 막의 샌드위치를 통해서 여과하였다. 단백질 키나제에 의해 인산화된 단백질 및 비-인산화된 단백질은 니트로셀룰로스에 결합되는 반면에, 인산화된 및 비인산 화된 G418은 니트로셀룰로스를 통과하여 포스포셀룰로스에 결합된다(도 9A). 방사성 시그날을 검출하고 방사형광분석기(phosphoimager)를 사용하여 정량화하였다. 추출물 5㎍에서 수득된 시그날을 사용하여 효소 활성%를 계산하였다. 효소 활성%는 mAb를 발현하는 2개의 세포 풀로부터의 NPT 돌연변이체의 평균을 나타내며, 이때 야생형 NPT의 효소 활성을 100%로 고려하였다(도 9B).
도 10은 NPT 발현의 노던 블롯 분석 및 형질감염된 세포 풀내의 NPT 유전자 카피의 수를 나타낸 것이다. 이를 위해, 전체 RNA를 NPT 야생형 유전자(서열 번호 1) 또는 NPT 돌연변이체 E182G(서열 번호 3), E182D(서열 번호 19), W91A(서열 번호 5), V198G(서열 번호 7), D227A(서열 번호 9), D227V(서열 번호 11), D227G(서열 번호 21), D261G(서열 번호 13), D261N(서열 번호 15) 및 F240I(서열 번호 17)로 형질감염되고 선별된, mAb를 발현하는 2개의 상이한 세포 풀로부터 제조하였다. 비형질감염된 CHO-DG44 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. RNA 30㎍을 NPT 유전자의 암호화 영역을 포함하는 FITC-dUTP-표지된 PCR 산물과 하이브리드화시켰다. 모든 형질감염된 세포에서, 약 1.3kb의 특정한 단일 NPT 전사체가 검출되었다. npt 유전자 카피 수를 측정하기 위해, 돗트 블롯 분석으로 게놈 DNA를 mAb를 발현하는 상기한 세포 풀로부터 분리하였다.
게놈 DNA 10㎍, 5㎍, 2.5㎍, 1.25㎍, 0.63㎍ 및 0.32㎍를 NPT 유전자의 암호화 영역을 포함하는 FITC-dUTP-표지된 PCR 산물과 하이브리드화시켰다. 비형질감염된 CHO-DG44 세포를 음성 대조건으로서 사용하였다. 플라스미드 pBIN-LC를 표준(320pg, 160pg, 80pg, 40pg, 20pg, 10pg, 5pg, 2.5pg)으로서 사용하였다. 세포 풀 내의 npt 유전자의 카피 수는 역가측정된 플라스미드-DNA에 대해 측정된 시그날 강도로부터 측정된 표준 연속물을 사용하여 계산하였다.
도 11은 2개의 세포 풀(세포 풀 5 및 8)을 예로 하여 FACS를 사용한 GFP-기본 선별에 의한 고-발현성 mAb 세포의 분리를 나타낸 것이다. 벡터 pBID-HC 및 pBING-LC로의 공형질감염으로부터 수득된 이들 세포 풀을 순차적 GFP-기본 FACS 분류에 적용시켰다. 풀의 세포 배양 상청액 중의 IgG2 항체의 농도는 각 분류 단계 후에 ELISA로 측정하고, 세포당 및 1일당 비생산성(specific productivity)(pg/세포*일)을 계산하였다. 전부 6회의 분류를 수행하고, 각 경우에 가장 높은 GFP 형광을 갖는 5%의 세포를 분류해냈다. 각 데이터 점은 75cm2 플라스크내에서 6회 이상의 배양 수행의 평균을 나타낸다.
도 12는 세포 풀 5 및 8을 예로 하여 GFP-기본 선별과 MTX 증폭 단계를 병용하여 달성된 mAb 생산성의 증가를 나타낸 것이다(도 11 참조). CHO-DG44를 벡터 pBID-HC 및 pBING-LC로 공형질감염시킨지 2주 후에, 가장 높은 GFP 형광을 갖는 5%의 세포를 풀 5 및 8로부터 분류해냈다. 이어서, dhfr-매개된 유전자 증폭을 100nM의 메토트렉세이트(MTX)를 배양 배지에 첨가하여 수행하였다. 당해 풀의 세포 배양 상청액 중의 mAb의 농도를 ELISA로 측정하고, 세포당 및 1일당 비생산성(specific productivity)(pg/세포*일)을 계산하였다. 각 데이터 점은 75cm2 플라스크내에서 6회 이상의 배양 수행의 평균을 나타낸다.
도 13은 세포 풀 5 및 8을 예로 하여 항체 생산성과 GFP 형광 간의 상관관계를 나타낸 것이다(도 11 참조). 이들 세포 풀은 CHO-DG44를 벡터 조합물 pBID-HC 및 pBING-LC로 공형질감염시켜 수득하였다. 이들을 순차적 GFP-기본 FACS 분류에 적용시키고 가장 높은 GFP 형광을 갖는 5%의 세포를 풀 5 및 8로부터 분류해냈다. 당해 풀의 세포 배양 상청액 중의 IgG2의 농도를 각 분류 단계 후에 ELISA로 측정하고, 세포당 및 1일당 비생산성(specific productivity)(pg/세포*일)을 계산하였다. 각 데이터 점은 75cm2 플라스크내에서 6회 이상의 배양 수행의 평균을 나타낸다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 양태
아미노산 위치에 관한 다음 정보는 각각의 경우에 서열 번호 1을 갖는 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 의해 암호화되는 아미노산의 위치에 관한 것이다. "변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자"란, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 의미하는 것으로, 당해 폴리펩타이드는 서열 번호 2를 갖는 야생형 단백질에 상동인, 본 명세서에서 보다 충분히 설명하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 야생형 단백질과 상이한 아미노산을 갖는다. 이러한 맥락에서, "상동"이란 용어는 소위 "정렬 알고리듬", 예를 들어, "BLAST[참조: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. (1993) "Identification of protein coding regions by database similarity search." Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) "Applications of network BLAST server" Meth. Enzymol. 266:131-141; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Res. 7:649-656; Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]를 사용하여, 돌연변이를 보유하는 서열 영역이 기준 서열, 이 경우에는 서열 번호 2에 따른 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 서열에 대응될 수 있도록 함을 의미한다. 서열은 이의 서열 순서로 대응되는 경우에 대응되며 표준 "정렬" 알고리듬을 사용하여 확인할 수 있다.
본 발명은 신규한 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 이종 유전자 산물, 바람직하게는 생물학적으로 관련되는 폴리펩타이드 또는 단백질의 고 발현이 가능한 포유동물 세포주를 제조 및 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 우선적으로 관심대상의 유전자 이외에, 비-형질감염된 세포보다 많은 선택적 잇점을 형질감염된 세포에 제공하는 본 발명에 따른 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 세포의 선별에 기초한다. 놀랍게도, 본원에서 기술하는 본 발명에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(mNPT 유전자)의 사용은 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(wtNPT 유전자)보다 많은 실질적인 선택적 잇점을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 이는 특히 wtNPT와 비교하여 낮은 효소 활성을 갖는 돌연변이체의 사용과 관련된다.
본 발명에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자
wtNPT의 효소 활성의 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%만을 갖는 NPT를 암호화하는 변형된 NPT 유전자를 사용하는 것이 특히 적합한 것으로 입증되었다. 바람직한 NPT 돌연변이체는 wtNPT의 효소 활성의 단지 1 내지 30%만을 갖는 돌연변이체이며, wtNPT의 효소 활성의 단지 1.5 내지 26%만을 갖는 돌연변이체가 특히 바람직하다. NPT의 효소 활성은 예를 들어, 실시예 4에 기술된 바와 같으며 방법 5로서 제공된 돗트 검정으로 측정할 수 있다.
야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제라는 용어는 아미노 글루코시드-3'-포스포트랜스퍼라제 II 효소(네오마이신-포스포트랜스퍼라제)(EC2.7.1.95)(이의 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 천연적으로 트랜스포존 5에 연합되어 있다)를 암호화하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 의미하고, 예를 들어, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 함유하거나 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 상기 효소는, 아미노 헥소스 환 I의 3' 하이드록실 그룹에 ATP의 말단 포스페이트를 전달시켜 항생제를 불활성화시킴에 의해 네오마이신, 가나마이신 및 G418과 같은 다양한 아미노글리코시드 항생제에 대한 내성을 제공한다. wtNPT란 용어는 또한 서열 번호 1에 의해 암호화되는 NPT에 필적하는 효소 활성을 갖는 모든 NPT를 의미한다. 이 용어에는 특히 ATP로부터 기질로의 말단 포스페이트의 전달을 촉매하는 효소적 활성 중심[참조: Shaw et al., 1993; Hon et al; 1997; Burk et al., 2001]이 동일하거나 거의 동일한 입체형태로 존재하고 따라서 서열 번호 2의 아미노산 서열을 함유하는 효소에 필적하는 효소 활성을 갖는 NPT가 포함된다. wtNPT는 서열 번호 2로 정의된 NPT에 의해 나타나는 효소 활성의 약 81 내지 150%, 바람직하게는 90 내지 120%를 나타낼 경우에 필적하는 효소 활성을 가지며, 이러한 활성은 실시예 4에 기술되어 있으며 방법 5로서 지칭되는 돗트 검정으로 측정할 수 있다.
wtNPT와 비교한 효소 활성의 감소가 아미노산 서열의 변형, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 기초하는 돌연변이체가 근본적으로 바람직하다. 결실, 삽입 및 치환 돌연변이체는 "부위-특이적 돌연변이유발" 및/또는 "PCR-기본 돌연변이유발 기법"으로 제조할 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Lottspeich and Zorbas (1998)(Chapter 36.1 with other references)]을 참고한다.
놀랍게도, 적어도 아미노산 91번의 아미노산 트립토판, 아미노산 182번의 아미노산 글루탐산, 아미노산 198번의 아미노산 발린, 아미노산 227번의 아미노산 아스파르트산, 아미노산 261번의 아미노산 아스파르트산 또는 아미노산 240번의 아미노산 페닐알라닌이 wtNTP와 비교하여 변경된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 돌연변이체를 선별 마커로서 사용하는 경우에, 공동 통합된 관심대상의 유전자의 발현율이 높은 형질감염된 포유동물 세포의 특히 효과적 증대를 달성할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 91, 182, 198, 227 및/또는 240번 위치에서의 아미노산에 영향을 주는 돌연변이체가 바람직하다. 치환 돌연변이체, 즉 야생형에서 상기 위치에 존재하는 아미노산이 다른 아미노산으로 대체된 돌연변이체가 특히 유리하다. 상응하는 아미노산의 변화로 인해, 효소의 활성이 wt-NPT와 비교하여 1 내지 80%, 바람직하게는 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 1.5% 내지 26%로 감소된 상응하는 치환 돌연변이체가 보다 더욱 바람직하다. 아미노산 91, 227, 261 및/또는 240번이 적절히 변형되어 wt-NPT와 비교한 효소 활성이 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 단지 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 단지 1.5% 내지 26%인 변형된 NPT 유전자가 특히 바람직하다. 아미노산 227번의 아미노산이, 변형된 NPT의 효소 활성이 wt-NPT와 비교하여 26% 미만, 바람직하게는 1 내지 20%, 보다 바람직하게는 1 내지 16% 형태로 변형된 치환 돌연변이체가 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, 유리한 돌연변이체는 wtNPT와 비교하여, 아미노산 91, 182 또는 227번에서 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 또는 티로신을 암호화하는 돌연변이체이다. 또한, 아미노산 182번 위치의 글루탐산이 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민 또는 임의의 다른, 바람직하게는 음으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있다. wtNPT와 비교하여, 아미노산 198번 위치에서 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 암호화하는 변형된 NPT 유전자가 또한 바람직하다. wtNPT와 비교하여, 아미노산 261번 위치에서 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 글루타민 또는 아스파르트산을 암호화하는 변형된 NPT 유전자가 또한 바람직하다. 특히, 선별 마커로서 돌연변이체 Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn 및 Phe240Ile를 사용하여, 공동 통합된 관심대상의 유전의 발현율이 높은 형질감염된 포유동물 세포의 증대를 달성할 수 있었고, 그 결과로 이들 돌연변이체가 특히 바람직함이 밝혀졌다. 돌연변이체 Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn, Phe240Ile 및 Trp91Ala를 사용하여 최대의 증대율이 달성되었기 때문에, 이들 돌연변이체가 보다 더욱 바람직하다. 돌연변이체 Asp227Val이 특히 바람직하다.
대조적으로, Asp190Gly 및 Asp208Gly 돌연변이체는 무혈청 배양 조건하에 형질감염된 CHO-DG44 세포를 선별하기에 적합하지 않은 마커임이 입증되었다. 이러한 돌연변이체(Asp190Gly, Asp208Gly)의 크게 감소된 효소 기능의 결과로서, 선별 기간 후에, 단지 소수의 세포만이 수득되었으며, 이들 세포는 게다가 성장 및 생존성이 심하게 손상되었다.
야생형에 기초하여 182 및 227번 위치의 아미노산은 아미노글리코시드-3'-포스포트랜스퍼라제의 C-말단 영역내에서 3개의 보존된 모티프 외부에 위치하는 비-보존된 아미노산이다. 91번 위치의 아미노산도 비-보존된 아미노산에 속하며 아미노글리코시드-3'-포스포트랜스퍼라제의 N-말단 영역내에서 보존된 모티프 중 하나의 외부에 위치한다. 대조적으로, 198 및 240번 위치의 아미노산은 NPT의 C-말단 영역내에서 보존된 아미노산이지만, 그럼에도 불구하고 보존된 모티프의 외부에 존재한다. 대조적으로, 261번 위치의 아미노산은 C-말단의 제3 보존된 모티프내에서 보존된 아미노산이다[참조: Shaw et al., 1993; Hon et al., 1997; Burk et al., 2001].
선별 마커로서 wtNPT의 사용과 비교하여, Glu182Gly, Glu182Asp 및 Val198Gly 돌연변이체의 경우에 세포는 1.4 내지 2.4의 인자만큼 증가된 생산성을 나타냈으며, Asp227Gly 돌연변이체의 경우에 생산성은 1.6 내지 4.1의 인자만큼 증가되었으며, Asp227Ala 또는 Trp91Ala 돌연변이체의 경우에 생산성은 2.2 또는 4의 인자만큼 증가되었고, Phe240Ile 또는 Asp261Asn 돌연변이체의 경우에 생산성은 5.7 또는 7.3의 인자만큼 증가되었으며, Asp261Gly 또는 Asp227Val 돌연변이체의 경우에 생산성은 9.3 또는 14.6의 인자만큼 더욱 증가되었다. 다중쇄 단백질(항체)를 발현하기 위해, 공형질감염을 수행하였다. 2개의 단백질 쇄는 각각 이의 자체 벡터에 의해 발현되었는데, 한 벡터는 NPT 유전자를 추가로 암호화하며, 나머지 벡터는 증폭가능한 선별 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자를 암호화한다.
따라서, 본 발명은 (i) 포유동물 세포 풀(pool)을, 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 단지 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 단지 1.5 내지 26%의 활성만을 갖고/갖거나 상기한 변형 중 하나를 갖는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 유전자로 형질감염시키고; (ii) 포유동물 세포를 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에 배양하고; (iii) 상기 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양함을 특징으로 하여, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 증대시키는 방법에 관한 것이다.
특히, 사용되는 변형된 NPT 유전자가 야생형 유전자와 비교하여, 아미노산 91번 위치에서 알라닌을 암호화하거나, 아미노산 182번 위치에서 글리신 또는 아스파르트산을 암호화하거나, 아미노산 198번 위치에서 글리신을 암호화하거나, 아미노산 227번 위치에서 알라닌, 글리신 또는 발린을 암호화하거나, 아미노산 261번 위치에서 글리신 또는 아스파라긴을 암호화하거나, 아미노산 240번 위치에서 이소류신을 암호화하는 경우에, 본 출원에서 보다 상세히 기술하는 변형된 NPT 유전자를 사용하는 상응하는 방법이 특히 바람직하다. 야생형 유전자와 비교하여, 아미노산 227번 위치에서 발린을 암호화하고/하거나 아미노산 261번 위치에서 글리신 및/또는 아스파라긴을 암호화하는 NPT 유전자가 보다 더욱 바람직하다. 야생형 유전자와 비교하여, 아미노산 240번 위치에서 이소류신을 암호화하거나 아미노산 227번 위치에서 발린을 암호화하는 NPT 유전자가 특히 바람직하며, 야생형 유전자와 비교하여 아미노산 227번 위치에서 발린을 암호화하는 NPT 유전자가 특히 바람직하다. 당연히, 본 발명은 변형된 NPT 유전자 및 상응하는 아미노산 변경의 조합을 포함하는 본 발명에 따라 변형된 NPT 유전자의 용도를 또한 포함한다.
본 발명은 추가로 (i) 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 관심대상의 이종 유전자 및 (ii) 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 비교하여 효소 활성이 낮은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 본 발명에 따른 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 진핵 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 목적상 "낮은" 또는 "보다 낮은" 효소 활성은 wtNPT의 효소 활성의 최대 80%, 바람직하게는 1 내지 80%, 보다 바람직하게는 단지 1 내지 60%에 상응하는 효소 활성을 의미한다. 본 발명의 하나의 양태에 따라서, "보다 낮은 효소 활성"은 야생형 네 오마이신 포스포트랜스퍼라제와 비교하여 1 내지 30%, 바람직하게는 1.5 내지 26%의 효소 활성을 의미한다.
바람직한 발현 벡터는 wtNPT의 효소 활성의 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%만을 갖는 변형된 NPT를 암호화하는 변형된 NPT 유전자를 함유한다. 또한, wtNPT의 효소 활성의 단지 1 내지 30% 만을 갖는 돌연변이체를 암호화하는 변형된 NPT 유전자를 갖는 발현 벡터가 바람직하다. wtNPT의 효소 활성의 단지 1.5 내지 26%만을 갖는 돌연변이체를 암호화하는 변형된 NPT 유전자를 함유하는 발현 벡터가 특히 바람직한데, 이러한 활성은 실시예 4에 기술되어 있고 방법 5로서 지칭되는 돗트 검정으로 측정한다.
본 발명의 다른 양태에서, 발현 벡터는 wtNPT와 비교하여, 아미노산 위치Trp91, Glu182, Val198, Asp227, Phe240 또는 위치 Asp261가 변형된, 변형된 NPT의 유전자를 함유한다. 이러한 맥락에서, 위치 Trp91, Glu182, Val198, Asp227, Phe240 또는 Asp261가 변형되고 wtNPT의 효소 활성의 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 단지 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 단지 1.5 내지 26%만을 갖는 NPT 돌연변이체가 바람직하다. 바람직하게는 아미노산 Tryp91, Glu182 또는 Asp227은 각각 해당 위치에서 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 또는 티로신으로 대체될 수 있다. 바람직하게는, 182번 위치의 글루탐산이 또한 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민 또는 다른, 바람직하게는 음으로 하전된 아미노산으로 대체될 수 있다. wtNPT와 비교하여 198번 위치에서 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 암호화 하는 변형된 NPT 유전자도 또한 바람직하다. 또한, wtNPT와 비교하여 240번 위치에 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 티로신 또는 트립토판을 암호화하는 변형된 NPT 유전자가 바람직하다. wtNPT와 비교하여 261번 위치에서 글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파라긴, 글루타민 또는 아스파르트산을 암호화하는 변형된 NPT 유전자도 또한 바람직하다. 227번 위치의 아스파르트산이 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신으로 대체되고, 261번의 아스파르트산이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 또는 글루타민, 바람직하게는 글리신 또는 아스파라긴으로 대체된 돌연변이체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn 또는 Phe240Ile 돌연변이체를 암호화하는 변형된 NPT 유전자를 함유하는 발현 벡터가 특히 바람직한데, 이때 Glu182Gly의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 함유하고, Glu182Asp의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 함유하고, Trp91Ala의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 함유하고, Val198Gly의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 함유하고, Asp227Ala의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 함유하고, Asp227Val의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 함유하고, Asp227Gly의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 함유하고, Asp261Gly의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 함유하고, Asp261Asn의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 함유하고, Phe240Ile의 경우에 돌연변이체는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 함유한다. Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn, Phe240Ile 또는 Trp91Ala 돌연변이체가 서열 번호 12, 서열 번호 22, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18 또는 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 경우 또는 서열 번호 11, 서열 번호 21, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17 또는 서열 번호 5에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되거나 이를 함유하는 경우, 이러한 돌연변이체를 사용한 발현 벡터가 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 wtNPT와 비교하여 아미노산 위치 Trp91, Val198 또는 Phe240에 wt 아미노산이 아닌 상이한 아미노산을 암호화하는 이의 유전자 산물을 최초로 제공한다. 본 발명은 특히 wtNPT와 비교하여 효소 활성이 감소된 Trp91, Val198 또는 Phe240 돌연변이체를 최초로 제공한다. 본원에서 기술하고 본 발명의 범주내에서 이용가능한 변형된 NPT는 바람직하게는 아미노산 91번 위치에서 알라닌을 암호화하고, 198번 위치에서 글리신을 암호화하고, 240번 위치에서 이소류신을 암호화한다. 게다가, 본 발명은 wtNPT와 비교하여, 182번 위치에서 글리신을 암호화하고, 227번 위치에서 알라닌 또는 발린을 암호화하고, 261번 위치에서 글리신을 암호화하는 NPT 돌연변이체를 최초로 제공한다. 유전자와 유전자 산물(효소)는 둘다 본 발명의 범주내에서 최초로 제공된다. 이러한 맥락에서, 본 발명은 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 18에 따른 아미노산 서열을 갖는 변형된 NPT를 최초로 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13 및 서열 번호 17에 따른 DNA 서열을 갖는 변형된 NPT 유전자를 제공한다.
관심대상의 유전자
본 발명에 따른 발현 벡터에 함유되는 관심대상의 유전자는 관심대상의 산물을 암호화하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 유전자 산물 또는 "관심대상의 산물"은 일반적으로 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체이다. 그러나, 이것은 또한 RNA 또는 안티센스 RNA일 수 있다. 관심대상의 유전자는 전체길이, 단축된 형태, 융합 유전자 또는 표지된 유전자로서 존재할 수 있다. 이는, 게놈 DNA 또는 바람직하게 cDNA 또는 융합체의 상응하는 단편일 수 있다. 관심대상의 유전자는 천연 유전자 서열이거나 돌연변이되거나 또는 변형될 수 있다. 이러한 변형은 특정 숙주 세포 및 사람화에 맞게 변용하기 위한 코돈 최적화를 포함한다. 관심대상의 유전자는 예를 들어, 분비되는 세포질 핵 위치된 막-결합형 또는 세포 표면-결합형 폴리펩타이드를 암호화한다.
용어 "뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 일본쇄 또는 이본쇄로서 존재하고 유전자의 암호화 쇄 또는 비암호화 쇄일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA 뿐만 아니라 이의 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편을 의미한다. 핵산 서열은 부위-특이적 돌연변이유발 또는 PCR-매개된 돌연변이 유발(예를 들어, 문헌[참조; Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1994]에 기재되어 있음)과 같은 표준 기법을 사용하여 변형될 수 있다.
"암호화"란 기타 중합체 및 거대 분자, 예를 들어, 생물학적 과정에서 rRNA, tRNA, mRNA, 기타 RNA 분자, cDNA 또는 폴리펩타이드의 합성을 위해 매트릭스로서 작용하는, 염색체내 유전자 또는 mRNA와 같은 핵산내 특정 뉴클레오타이드 서열의 성질 또는 능력을 의미한다. 따라서, 유전자는, 목적하는 단백질이 mRNA의 전사 및 이어서 해독에 의해 세포 또는 기타 생물학적 시스템내에서 제조되는 경우 단백질을 암호화한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 또한 일반적으로 서열 데이타뱅크, 예를 들어, EMBL 또는 GenBank에 제공되어 있는 암호화 쇄, 및 전사를 위한 매트릭스로서 작용하는 유전자 또는 cDNA의 비암호화 쇄는 산물 또는 단백질을 암호화하는 것으로서 언급될 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산은 또한 축퇴성 유전자 코드에 기초하여 상이한 순서의 뉴클레오타이드 서열을 갖지만 단백질의 아미노산 서열이 동일한 핵산을 포함한다. 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 또한 인트론을 포함할 수 있다.
cDNA란 용어는 mRNA 또는 유전자로 부터 생성된 기타 RNA 기원의 제2 DNA 쇄의 역전사 및 합성에 의해 생성되는 데옥시리보핵산을 의미한다. cDNA가 이본쇄 DNA 분자로서 존재하는 경우, 이는 암호화 및 비암호화 쇄 둘다를 포함한다.
인트론이란 용어는 임의의 길이의 비암호화 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이들은 천연적으로, 수많은 진핵 유전자에 존재하고 스플라이싱으로서 공지된 과정에 의해 이전에 전사된 mRNA 전구체로부터 제거된다. 이것은 5' 및 3' 말단에서 인트론이 정확하게 절단되고 수득한 mRNA가 정확히 연결되어 성공적인 단백질 합성을 위해 정확한 판독 프레임을 갖는 성숙한 가공된 mRNA가 생성되어야만 한다. 이러한 스플라이싱 과정에 관여하는 많은 스플라이싱 공여체 및 스플라이싱 수용체 부위, 즉, 엑손-인트론 또는 인트론-엑손 접촉면에 위치한 서열의 특징이 분석되었다[참조: Ohshima et al., 1987].
관심대상의 단백질/산물
생물약제학적으로 중요한 단백질/폴리펩타이드는 예를 들어, 항체, 효소, 사이토킨, 림포킨, 접착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 효능제 또는 길항제로서 작용하고/하거나 치료학적 또는 진단학적 용도를 갖는 모든 폴리펩타이드는 유용하다.
"폴리펩타이드"란 용어는 아미노산 서열 또는 단백질에 대해 사용되고 임의의 길이의 아미노산 중합체를 의미한다. 당해 용어는 또한 글리코실화, 인산화, 아세틸화 또는 단백질 프로세싱과 같은 반응에 의해 해독후 변형된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 구조는 이의 생물학적 활성을 유지하는 한편, 예를 들어, 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 및 기타 단백질과 융합으로 변형될 수 있다. 따라서, "폴리펩타이드"란 용어는 예를 들어, 면역글로불린 성분, 예를 들어, Fc 성분 및 성장 인자, 예를 들어, 인터류킨으로 이루어진 융합 단백질을 또한 포함한다.
치료학적 단백질의 예에는 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 사람 성장 호르몬(hGH) 및 기타 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토킨, 예를 들어, 인터류킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, 종양 괴사인자(TNF), 예를 들어, TNF-알파, 베타 또는 감마, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF가 있다. 다른 예에는 모노클로날, 폴리클로날, 다중특이적 및 일본쇄 항체 및 이의 단편, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc' 단편, 면역글로불린 경쇄(L) 및 면역글로불린 중쇄(H) 및 이의 불변, 가변 또는 초가변 영역 뿐만 아니라 Fv 및 Fd 단편이 있다[참조: Chamov et al., 1999]. 항체는 사람 또는 비-사람 기원의 것일 수 있다. 사람화 항체 및 키메라 항체가 또한 가능하다.
Fab 단편(단편 항원 결합 = Fab)은 서로 인접한 불변 영역에 의해 유지되고 있는 양 쇄의 가변영역으로 이루어진다. 이들은 예를 들어, 파파인과 같은 프로테아제로 처리하거나 DNA 클로닝에 의해 통상적인 항체로부터 제조될 수 있다. 기타 항체 단편은 펩신에 의한 단백질 분해에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편이다.
또한 유전자 클로닝에 의해, 단지 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역으로만 이루어진 단축된 항체 단편을 제조할 수 있다. 이들은 Fv 단편(가변 단편 = 가변 부분의 단편)으로서 공지되어 있다. 불변 쇄의 시스테인 그룹을 통한 공유 결합은 이들 Fv 단편에서 가능하지 않기 때문에, 이들은 흔히, 몇몇 기타 방법에 의해 안정화된다. 이러한 목적상, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 흔히 약 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 단축 펩타이드 단편에 의해 함께 연결되 어 있다. 이것은 VH 및 VL이 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 단일 폴리펩타이드 쇄를 생성시킨다. 당해 항체 단편은 또한 단일 쇄 Fv 단편(scFv)로서 지칭된다. scFv 항체의 예는 공지되어 있으며 예를 들어, 문헌[참조: Huston et al., 1988]에 기재되어 있다.
과거에, 다량체성 scFv 유도체를 제조하기 위한 다양한 전략이 개발되어 왔다. 이러한 의도는 약리역학적 성질이 개선되고 결합 친화성(avidity)이 증가된 재조합 항체를 제조하기 위함이다. scFv 단편의 다량체화를 달성하기 위해, 이들을 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조한다. 다량체화 도메인은 예를 들어, IgG의 CH3 영역 또는 류신 지퍼 도메인과 같은 나선형 구조("코일드 코일(coiled coil) 구조")일 수 있다. 다른 전략에서, scFv 단편의 VH와 VL 영역간의 상호작용은 다량체화(예를 들어, 이원체, 삼원체 및 오원체)를 위해 사용된다.
이원체(diabody)란 용어는 당해 분야에 2가의 동종이량체 scFv 유도체를 지칭하기 위해 사용된다. scFv 분자내 펩타이드 링커는 5 내지 10개의 아미노산으로 단축되면 VH/VL 쇄가 서로 포개지면서 동종이량체를 형성한다. 이원체는 삽입된 디설파이트 브릿지에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 이원체의 예는 문헌[참조: Perisic et al., 1994]에서 찾아볼 수 있다.
"소형체(minibody)"란 용어는 당해 분야에서 2가의 동종 이량체 scFv 유도체를 지칭하기 사용된다. 이는 이량체화 영역으로서 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 함유하는 융합 단백질로 구성된다. 이는 또한 힌지 영역을 통해 IgG의 scFv 단편과 링커 영역을 연결시킨다. 이러한 소 형 항체의 예는 문헌[참조: Hu et al., 1996]에 기재되어 있다.
"삼원체(triabody)"란 용어는 당해 분야에서 3가의 동종삼량체 scFv 유도체를 지칭하기 위해 사용된다[참조: Kortt et al., 1997]. 링커를 사용하지 않고 VH VL을 직접 융합시켜 삼량체를 형성한다.
2가, 3가 또는 4가의 구조를 갖는 소형 항체로서 당해 분야에 공지된 단편도 scFv 단편의 유도체이다. 다량체화는 2가, 3가 또는 4가의 코일드 코일 구조에 의해 달성된다[문헌참조: Pack et al., 1993 and 1995; Lovejoy et al., 1993].
형광 단백질을 암호화하는 유전자
다른 양태에서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 바람직하게는 관심대상의 유전자에 기능적으로 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 함유한다. 바람직하게는, 두 유전자 모두 단일 이종 프로모터의 제어하에 전사되어, 관심대상의 단백질/산물 및 형광 단백질이 이시스트론성 mRNA에 의해 암호화된다. 이로써 관심대상의 단백질/산물을 생산하는 세포를 형광 단백질의 발현율에 의해 대량으로 확인할 수 있다.
형광 단백질은 예를 들어, 녹색, 청녹색, 청색, 황색 또는 기타 색상의 형광 단백질일 수 있다. 하나의 특정 예는 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) 또는 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 및 이들로부터 생성된 돌연변이체로부터 수득된 녹색 형광 단백질(GFP)이다[참조: Bennet et al., 1998; Chalfie et al., 1994; WO 01/04306 및 본원에서 인용된 문헌].
기타 형광 단백질 및 이들을 암호화하는 유전자는 본원에서 참조로 인용되는 WO 00/34318, WO 00/34326, WO 00/34526 및 WO 01/27150에 기재되어 있다. 이들 형광 단백질은 안토조아(Anthozoa) 종의 비-생물발광 유기체, 예를 들어, 아네모니아 마야노(Anemonia majano), 클라불라리아 종(Clavularia sp)., 조안투스 종 I(Zoanthus sp. I), 조안투스 종 II(Zoanthus sp. II), 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata), 디스코소마 종(Discosoma sp). "레드", 디스코소마 종 "그린", 디스코소마 종. "마겐타(Magenta)", 아네모니아 슐카타(Anemonia sulcata)의 형광발색단이다.
본 발명에 따라 사용되는 형광 단백질은 천연 야생형 단백질 또는 유전학적으로 조작된 돌연변이체 및 변이체 뿐만 아니라 예를 들어, 기타 단백질 또는 펩타이드와 융합된 유도체 또는 변이체를 포함한다. 사용되는 돌연변이체는 예를 들어, 여기 또는 방출 스펙트럼, 형광발색단의 형성, 흡광 계수 또는 단백질의 안정성을 변화시킬 수 있다. 게다가, 포유동물 세포 또는 기타 종에서의 발현은 코돈 최적화에 의해 개선될 수 있다. 본 발명에 따라, 형광 단백질은 또한 선별 마커, 바람직하게는, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)과 같은 증폭가능한 선별 마커와 융합하여 사용될 수 있다.
형광 단백질에 의해 방출되는 형광으로, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류장치(FACS)를 갖는 관통류 세포측정기(throughflow cytometry) 또는 형광 현미경에 의해 단백질을 검출할수 있다.
기타 조절 요소
당해 발현 벡터는 관심대상의 유전자 및 바람직하게는 또한 형광 단백질이 발현될 수 있도록 하는 하나 이상의 이종 프로모터를 함유한다.
프로모터란 용어는 유전자를 전사시키고 이를 제어하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이와 기능적으로 결합된 서열을 언급한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제에 결합하기 위한 인식 서열 및 전사를 위한 개시 부위(전사 개시 부위)를 함유한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포에서 목적하는 서열을 발현하기 위해, 적합한 기능성 프로모터가 선택되어야만 한다. 당해 분야의 숙련가는 항상성, 유도성 및 억제성 프로모터를 포함하여, 다양한 공급원으로부터의 다양한 프로모터에 친숙할 것이다. 이들은 예를 들어, 진뱅크와 같은 데이타뱅크에 기탁되고 개별적 요소들 또는 상업적 공급원 또는 개인 공급원으로부터의 폴리뉴클레오타이드 서열내에 클로닝된 요소들로서 수득될 수 있다. 유도성 프로모터에서, 프로모터의 활성은 시그날에 반응하여 감소되거나 증가될 수 있다. 유도성 프로모터의 한 예는 테트라사이클린(tet) 프로모터이다. 이는 테트라사이클린 조절된 트랜스활성화인자 단백질(tTA)에 의해 유도될 수 있는 테트라사이클린 작동인자 서열(tetO)을 포함한다. 테트라사이클린 존재하에, tTA의 tetO로의 결합은 억제된다. 기타 유도성 프로머터의 예는 jun, fos, 메탈로티오네인 및 열 쇼크 프로모터[참조: Sambrook et al., 1989; Gosen et al., 1994]이다.
진핵 세포에서 고 발현에 특히 적합한 프로모터 중에는 예를 들어, SV40 조기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종바이러스의 긴 말단 반복 영역 및 사람 사이토메갈로바이러스의 조기 프로모터가 있다. 기타 이종성 포유동물 프로모터의 예에는 액틴, 면역글로 불린 또는 열 쇼크 프로모터(들)가 있다.
상응하는 이종 프로모터는 발현 카세트에서 전사 활성을 증가/조절하기 위해 다른 조절 서열에 기능적으로 연결될 수 있다.
예를 들어, 프로모터는 인핸서 서열과 기능적으로 연결되어 전사 활성을 증가시킬 수 있다. 이를 위해, 하나 이상의 인핸서 및/또는 인핸서 서열의 몇몇 카피, 예를 들어, CMV 또는 SV40 인핸서를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 다른 양태에서, 하나 이상의 인핸서/인핸서 서열, 바람직하게는 CMV 또는 SV 인핸서를 함유한다.
인핸서란 용어는 시스 위치에서 프로모터의 활성에 작용하여 이 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자의 전사를 자극하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 프로모터와는 달리, 인핸서의 효과는 위치 및 배향과 무관하고 따라서 인트론 또는 심지어 암호화 영역내의 전사 단위체의 전방 또는 후방에 위치할 수 있다. 인핸서는 전사 단위에 바로 인접한 영역 및 프로모터에서 상당히 떨어진 영역 둘다에 위치할 수 있다. 또한, 물리적으로 및 기능적으로 프로모터와 중복될 수도 있다. 당해 분야의 숙련가는 독립적인 요소로서 또는 폴리뉴클레오타이드 서열내에 클로닝된 요소로서 이용가능한(예를 들어, ATCC에 기탁되어 있거나 상업적 및 개인 공급원으로부터) 다양한 공급원으로부터 다수의 인핸서(진뱅크와 같은 데이타뱅크에 기탁된 인핸서, 예를 들어, SV40 인핸서, CMV 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서)를 인지할 것이다. 다수의 프로모터 서열은 또한 흔히 사용되는 CMV 프로모터와 같은 인핸서 서열을 포함한다. 사람 CMV 인핸서는 지금까지 확인 된 가장 강력한 인핸서 중 하나이다. 유도성 인핸서의 한 예는 글루코코르티코이드 또는 중금속에 의해 자극될 수 있는 메탈로티오네인 인핸서이다.
또 다른 가능한 변형은 예를 들어, 다수의 Sp1 결합 부위의 도입이다. 프로모터 서열은 또한 전사 활성을 제어하고 조절하는 조절 서열과 조합될 수 있다. 따라서, 프로모터는 억제성/유도성일 수 있다. 이는 예를 들어, 상향 조절 또는 하향 조절 전사 인자에 대한 결합 부위인 서열과 연결시켜 수행할 수 있다. 상기 언급된 전사 인자 Sp1은 예를 들어, 전사 활성에 양성 효과를 갖는다. 다른 예는 전사에 양성적으로 및 음성적으로 모두 작용할 수 있는 활성화인자 단백질 AP1에 대한 결합 부위이다. AP1의 활성은 모든 종류의 인자, 예를 들어, 성장 인자, 사이토킨 및 혈청에 의해 제어될 수 있다[참조: Faisst et al., 1992 및 본원에서 인용되는 참조문헌]. 전사 효율은 또한 하나 이상의 염기의 치환, 삽입 또는 결실에 의한 돌연변이에 의해 프로모터 서열을 변화시킨 다음, 리포터 유전자 검정에서 이것이 프로모터 활성을 증가시키는지의 여부를 결정함으로써 증가될 수 있다.
기본적으로, 추가의 조절 요소들은 이종 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 유도성 및 항상성 조절 서열은 둘다 다양한 세포 유형에 대해 공지되어 있다.
"전사-조절 요소"는 일반적으로 발현될 유전자 서열의 프로모터 상부, 전사 개시 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.
"전사 개시 부위"란 용어는 1차 전사체, 즉, mRNA 전구체에 삽입된 제1 핵산에 상응하는 작제물내 핵산을 의미한다. 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 중첩 될 수 있다.
"전사 종결 부위"란 용어는 전사될 유전자 부분 또는 관심대상의 유전자의 3' 말단에 보통 존재하고 RNA 폴리머라제에 의한 전사 종결을 야기하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"폴리아데닐화 시그날"은 진핵 mRNA의 3' 말단에서 특정 부위를 절단시키고 절단된 3' 말단에 약 100 내지 200개의 아데닌 뉴클레오타이드(폴리A 테일)의 서열을 해독후 도입시키는 시그날 서열이다. 폴리아데닐화 시그날 서열은 절단 부위의 약 10 내지 30 뉴클레오타이드 상부에 있는 서열 AATAAA 및 하부에 있는 서열을 포함한다. tk 폴리A, SV40 후기 및 조기 폴리A 또는 BGH 폴리A(예를 들어, 미국 특허 제5,122,458호에 기재되어 있음)와 같은 다양한 폴리아데닐화 요소가 공지되어 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 각각의 전사 단위는 프로모터 또는 프로모터/인핸서 요소, 관심대상의 유전자 및/또는 마커 유전자 뿐만 아니라 전사 종결 요소를 갖는다. 다른 바람직한 양태에서, 전사 단위는 2개의 추가의 해독 조절 단위를 포함한다.
"해독 조절 요소"는 발현될 각각의 폴리펩타이드에 대한 해독 개시 부위(AUG), 종결 코돈 및 폴리A 시그날을 포함한다. 최적의 발현을 위해, 발현될 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 비해독 영역을 제거하거나 첨가하거나 변화시켜 전사 또는 발현 단계에서 발현에 영향을 미칠 수 있는 임의의 잠재적으로 적합하지 않은 추가의 해독 개시 코돈 또는 기타 서열을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 발현을 촉 진시키기 위해, 리보솜 컨센서스 결합 부위를 또한 개시 코돈의 바로 상부에 삽입시킬 수 있다. 분비된 폴리펩타이드를 생산하기 위해, 관심대상의 유전자는 통상 합성된 폴리펩타이드를 ER 막으로 및 ER을 통과하여 운반하는 시그날 전구체 펩타이드를 암호화하는 시그날 서열을 포함한다. 시그날 서열은 흔히 분비된 단백질의 아미노 말단에 위치하지만 항상 그렇지만은 않고 단백질이 ER 막을 통해 여과된 후 시그날 펩티다제에 의해 절단된다. 유전자 서열은 일반적으로 자체의 시그날 서열을 포함하지만 반드시 그렇지만은 않다. 천연 시그날 서열이 존재하지 않는 경우, 이종 시그날 서열을 공지된 방식으로 도입시킬 수 있다. 이러한 종류의 수많은 시그날 서열들이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 진뱅크 및 EMBL과 같은 서열 데이타뱅크에 기탁되어 있다.
본 발명에 따른 한가지 중요한 조절 요소는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이다. IRES 요소는 유전자의 5'말단 메틸구아노시늄 캡(CAP 구조) 및 상부 유전자와 독립적으로 해독 개시를 기능적으로 활성화시키고 동물 세포에서는 단일 전사체로부터 2개의 시스트론(개방 판독 프레임)을 해독할 수 있는 서열을 포함한다. IRES 요소는 바로 하부에 위치하는 개방 판독 프레임의 해독을 위한 독립적인 리보솜 진입 부위를 제공한다. 다중시스트론, 즉, mRNA에 의해 차례로 해독되는 수많은 상이한 폴리펩타이드 또는 생성물을 암호화할 수 있는 세균 mRNA와 대조적으로, 동물 세포로부터의 다수의 mRNA는 일시스트론이고 단지 하나의 단백질 또는 생성물을 암호화한다. 진핵 세포에서 다중시스트론 전사체의 경우, 해독은, 상부에 가장 근접한 해독 개시 부위로부터 개시되고 제1 종결 코돈에 의해 종결되며 이후에 전사체는 리보솜으로부터 방출될 수 있다. 따라서, mRNA에 의해 암호화된 단지 1개의 폴리펩타이드 또는 생성물만이 해독 동안에 생산된다. 대조적으로, 전사체에서 제2 또는 후속적 개방 판독 프레임과 기능적으로 연결된 IRES 요소를 갖는 다중시스트론 전사체는 하부에 위치한 개방 판독 프레임을 후속적으로 해독하여, 동일한 전사체에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 생성물이 진핵 세포에서 생산되도록 한다.
IRES 요소는 길이 및 공급원이 다양할 수 있고 예를 들어, 뇌심근염 바이러스(EMCV) 또는 기타 피코르나 바이러스로부터 기원할 수 있다. 벡터의 작제시 다양한 IRES 서열 및 이의 용도는 문헌[참조: Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996; Mosser et al., 1997]에 기재되어 있다.
하부에 위치한 유전자 서열은 IRES 요소의 3' 말단에 기능적으로 연결되는데 즉, 유전자의 발현이 영향받지 않거나 단지 최소로만 영향을 받거나 의도된 목적을 위해 충분히 발현될 수 있는 간격이 선택된다. 충분한 발현을 위한 IRES 요소와 이의 하부에 위치한 유전자의 개시 코돈 간의 최적의 허용 거리는 간격을 다양화하고 리포터 유전자 검정을 사용한 간격의 함수로서 발현율을 측정함으로써 측정할 수 있다.
상기한 방식으로, 이종 유전자 산물의 발현을 위해 상당히 유용한 최적의 발현 카셋트를 수득할 수 있다. 이러한 하나 이상의 수단에 의해 수득된 발현 카세트는 따라서 본 발명의 추가의 목적이다.
햄스터-유비퀴틴/S27a 프로모터
다른 양태에서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 바람직하게는 관심대상의 유전자에 기능적으로 연결된, 보다 바람직하게는 관심대상의 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자에 기능적으로 연결된 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터를 함유한다.
햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터는 강력한 이종 프로모터로서 WO 97/15664에 기재되어 있다. 이러한 프로모터는 바람직하게 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: GC-풍부 서열 영역, Sp1 결합 부위, 폴리피리미딘 요소, TATA 박스의 부재. 특히, Sp1 결합 부위를 갖지만 TATA 박스를 갖지 않는 프로모터가 바람직하다. 또한, 항상성으로 활성화되고 특히 혈청 함유, 저농도 혈청 함유 및 무혈청 세포 배양 조건하에서도 동등하게 활성인 프로모터가 바람직하다. 다른 양태에서, 이는 유도성 프로모터, 특히, 혈청을 제거하여 활성화되는 프로모터이다.
특히 유리한 양태는 WO 97/15664의 도 5에 포함된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프로모터이다. 도 5의 -161번 내지 -45번 위치의 서열을 함유하는 프로모터 서열이 특히 바람직하다.
본 특허 명세서의 각각의 실시예에서 사용된 프로모터는 첨부된 서열 목록의 서열 번호 55의 1923번 내지 2406번 위치의 서열을 갖는 DNA 분자를 포함한다. 상기 서열은 WO 97/15664의 도 5로부터 단편 -372번 내지 +111번에 상응하고 바람직한 프로모터를 대표한다. 즉 바람직한 프로모터는 상기 서열 영역이 도입된 것이 다. 다른 적합한 프로모터 단편은 2134번 내지 2406번 위치의 서열(WO 97/15664의 도 5에서 -161번 내지 +111번에 상응함)을 포함한다. 2251번 내지 2406번의 서열만을 포함하는 프로모터는 더 이상 기능적이 아니다. 프로모터 서열은 2134번으로부터 출발하여 5' 방향으로 신장될 수 있다.
또한, 완전한 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 서열의 기능성 서브단편 뿐만 아니라 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변형된, 서브단편의 완전한 서열의 기능성 돌연변이/변이체를 사용할 수 있다. 상응하는 서브단편, 돌연변이 또는 변이체는 또한 이후에 "변형된 프로모터"로서 지칭된다.
임의로 기타 조절 요소들과 조합된 변형된 프로모터는 바람직하게는 서열번호 55에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 1923번 내지 2406번 위치(WO 97/15664의 도 5에 기재된 -372번 내지 +111번 위치)의 프로모터 단편의 활성에 상응하는 전사 활성을 갖는다. 변형된 프로모터는 비교 리포터 유전자 분석에서 1923번 내지 2406번 단편(-372번 내지 +111번의 단편)의 활성의 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 100% 이상을 갖는 전사 활성을 갖는 경우, 본 발명의 목적을 위해 유용한 것으로 입증된다. 특히, 햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터의 야생형 서열 서열번호 55와 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 97%이상의 최소 서열 상동성을 갖고 비교 리포터 유전자 분석에서 상응하는 프로모터 활성을 갖는 변형된 프로모터가 바람직하다.
상응하는 비교 리포터 유전자 분석에서, 참조 서열을 포함하여, 시험될 프로 모터 단편은 예를 들어, 루시퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광성 단백질(GFP)을 암호화하는 프로모터 부재 리포터 유전자의 전방에 클로닝된다. 이어서, 이들 작제물(프로모터 서열 + 리포터 유전자)을 형질감염에 의해 시험 세포, 예를 들어, CHO-DG44에 도입시키고, 해당 프로모터 단편에 의한 리포터 유전자 발현의 유도는 리포터 유전자의 단백질 함량을 측정함에 의해 측정한다. 상응하는 시험은 예를 들어, 문헌[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1994, updated]에 기재되어 있다.
햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 및 변형된 프로모터의 프로모터 서열은 또한 예를 들어, 5' 비해독되는 영역 또는 이의 선택된 단편 및 유비퀴틴/S27a 유전자 또는 이의 선택된 단편의 암호화 영역을 포함할 수 있고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994]에 기재된 바와 같은 다양한 표준 방법을 사용하여 WO 97/15664에 기재된 바와 같은 서열을 인지하는 당해 분야의 숙련가에 의해 수득될 수 있다. WO 97/15664에 기재된 서열로부터 출발하여, 예를 들어, 적합한 단편이 선별할 수 있고 이러한 부분적 서열을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 종류의 프로브는 예를 들어, 햄스터 게놈의 라이브러리로부터 하이브리드화함으로써 유비퀴틴/S27a 유전자 또는 5' 비해독 영역 또는 이의 다른 단편을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 상기한 리포터 유전자 분석을 사용하여, 당해 분야의 숙련가라면 큰 노력 없이도 프로모터-활성 단편을 확인하고 본 발명의 목적을 위해 이들을 사용할 수 있다. 5' 비해독 영역 또는 이의 특정 단편은 게놈 DNA 또는 게놈 라이브러리 기원의 상응하는 프라 이머를 사용하여 PCR을 증폭시켜 용이하게 수득할 수 있다. 5' 비해독 영역의 단편은 또한 보다 큰 DNA 단편으로부터 제한 엔도뉴클레아제 III 분해에 의해 수득할 수 있다. 이러한 DNA 분자는 또한 화학적으로 합성된 단편을 연결시켜 화학적으로 합성되거나 제조될 수 있다.
결실, 삽입 및 치환 돌연변이는 "부위-특이적 돌연변이 유발" 및/또는 "PCR 기본 돌연변이 유발 기법"으로 생성시킬 수 있다. 상응하는 방법은 예를 들어, 추가의 참조와 함께 문헌[참조: Lottspeich and Zorbas 1998 Chapter 36.1]에 기재되어 있다.
햄스터 유비퀴틴/S27a 유전자의 5' 비해독 영역 또는 햄스터 유비퀴틴 S27a 유전자 기원의 프로브와 교차 하이브리드화시켜, 바람직하게는 기타 포유동물 종의 상응하는 상동성 유전자로부터 적합한 프로모터 서열을 확인하고 분리시킬 수 있다. 적합한 기법은 문헌[참조: Lottspeich and Zorbas 1998 Chapter 23]에서 예를 들어서 기재되어 있다. 유전자는, 이의 뉴클레오타이드 서열이 상동 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 및 가장 바람직하게는 97% 이상 일치하는 경우 본 발명의 목적을 위해 "상동"이다.
상기한 수단을 사용하여 이종 유전자 산물의 발현을 위해 매우 유용한 최적화된 발현 카셋트를 수득할 수 있다. 따라서, 이러한 수단 하나 이상에 의해 수득된 발현 카셋트는 본 발명의 추가의 목적이다.
본 발명에 따른 발현 벡터의 제조
본 발명에 따른 발현 벡터는 이론상, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al. (1989)]에 기재되어 있는 바와 같은 당해 분야에 공지된 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 상기 문헌에는 또한 벡터의 기능적 성분, 예를 들어, 적합한 프로모터(햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 이외에), 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날, 항생제 내성 유전자, 선별 마커, 복제 개시점 및 스플라싱 시그날이 기재되어 있다. 통상의 클로닝 벡터를 사용하여, 성분들, 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드, 코스미드 또는 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) 및 단순포진 바이러스와 같은 바이러스 벡터 뿐만 아니라, 인공 염색체/미소염색체를 제조할 수 있다. 진행색물 발현 벡터는 통상 원핵생물 서열, 예를 들어, 복제 오리진 및 세균내에서의 벡터의 복제 및 선별을 가능하게 하는 항생제 내성 유전자를 또한 함유한다. 폴리뉴클레오타이이드 서열의 도입을 위한 다중 클로닝 부위를 함유하는 수많은 진핵 발현 벡터가 공지되어 있으며, 일부는 다양한 회사, 예를 들어, 스트라타젠(Stratagene, La Jolla, CA, USA); 인비트로겐(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); 프로메가(Promega, Madison, WI, USA) 또는 BD 바이오사이언시스 클론텍(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
이종 프로모터, 관심대상의 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 임의로 형광 단백질을 암호화하는 유전자, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 같은 추가의 조절 요소, 인핸서 또는 폴리아데닐화 시그날를 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 방법으로 발현 벡터에 도입시킨다. 본 발명에 따른 발현 벡터는, 최소한 이종 프로모터, 관심대상의 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 또한 함유한다. 본 발명에 따라서, 이종 프로모터로서 유비퀴틴/S27a 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이종 프로모터, 바람직하게는 유비퀴틴/S27a 프로모터, 관심대상의 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자가 함께 기능적으로 연결되어 있거나 기능적으로 연결되어 있고 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 동일한 전사 단위로서 또는 개별적 전사 단위로서 위치하는 발현 벡터가 특히 바람직하다.
본 설명의 범주내에서, "기능적 연결" 또는 "기능적으로 연결된"이란 용어는 의도한 기능을 수행할 수 있도록 배치된 2개 이상의 핵산 서열 또는 부분적 서열을 의미한다. 예를 들어, 프로모터/인핸서는 시스(cis) 위치에서 연결된 유전자 서열의 전사를 제어하거나 조절할 수 있다면 암호화 유전자 서열에 기능적으로 연결되어 있다. 반드시는 아니지만, 일반적으로, 기능적으로 연결된 DNA 서열은 서로 근접해 있으며, 2개의 암호화 유전자 서열이 연결되거나 분비성 리더의 경우에 연속적이며 판독 프레임내에 있다. 기능적으로 연결된 프로모터가 일반적으로 암호화 유전자 서열의 상부에 위치한다 해도, 이러한 프로모터가 반드시 암호화 유전자 서열에 근접해 있는 것은 아니다. 인핸서는 이들이 유전자 서열의 전사를 증가시키는 한 서로 근접해 있을 필요는 없다. 이러한 목적상, 인핸서는 유전자 서열의 상부 또는 하부에 위치할 수 있으며, 유전자 서열에서 약간만 떨어져 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는, 전사가 암호화 서열을 통해 폴리아데닐화 시그날로 진행되게 하는 방식으로 유전자 서열의 3' 말단에 위치한다면, 이러한 유전자 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 연결은 예를 들어, PCR 기법, 적합한 제한 절단 부위에서의 연결 또는 스플라싱에 의해 통상의 재조합 방법에 따라 달성할 수 있다. 적합한 제한 절단 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 링커 또는 어댑터를 통상적 관행에 따라 사용할 수 있다. 본 발명에 따라서, 기능적 연결은 바람직하게는 인트론 서열을 통해 일어나지 않는다.
기술한 양태의 하나에서, 이종 프로모터, 바람직하게는 유비퀴틴/S27a 프로모터, 관심대상의 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자는 함께 기능적으로 연결된다. 이는, 예를 들어, 관심대상의 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자가 둘다 동일한 이종 프로모터로부터 출발하여 발현됨을 의미한다.
특히 바람직한 양태에서, 기능적 연결은 IRES 요소를 통해 일어나서, 이시스트론성 mRNA는 두 유전자 모두로부터 합성된다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 하나 이상의 프로모터에 기능적으로 작용하는 인핸서를 추가로 함유할 수 있다. 이종 프로모터, 바람직하게는 유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 이의 변형된 형태가 인핸서 요소, 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서 요소에 연결되어 있는 발현 벡터가 특히 바람직하다.
근본적으로, 발현 벡터내 유전자의 발현은 하나 이상의 전사 단위로부터 출발하여 일어날 수 있다. 전사 단위란 용어는 전사될 하나 이상의 유전자를 함유하는 영역으로서 정의된다. 전사 단위내의 유전자는 이러한 단위내의 모든 유전자가 동일한 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 전사적 제어하에 있게 되도록 서로 기능적으로 연결된다. 이와 같은 유전자의 전사적 연결의 결과로서, 하나 이상의 단백질 또는 산물이 전사 단위로부터 전사되고 발현될 수 있다. 각각의 전사 단위는 이러한 단위내에 함유된 유전자 서열의 전사 및 해독을 위해 필수적인 조절 요소를 함유한다. 각각의 전사 단위는 동일하거나 상이한 조절 요소를 함유할 수 있다. IRES 요소 또는 인트론은 전사 단위내에서 유전자의 기능적 연결을 위해 사용할 수 있다.
발현 벡터는 관심대상의 유전자, 변형된 NPT 유전자 및 임의로 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하기 위한 단독의 전사 단위를 함유할 수 있다. 또는, 이러한 유전자들은 2개 이상의 전사 단위내에 배열될 수도 있다. 전사 단위내의 유전자의 다양한 조합이 가능하다. 본 발명의 다른 양태에서, 1개, 2개 또는 그 이상의 전사 단위로 이루어진 하나 이상의 발현 벡터를 공형질감염에 의해 또는 연속적 형질감염에 의해 어떠한 목적하는 순서로도 숙주 세포에 삽입시킬 수 있다. 각각의 벡터 상의 조절 요소와 유전자의 어떠한 조합이라도 선택할 수 있는데, 단 전사 단위의 적절한 발현이 보장되어야 한다. 필요에 따라, 다른 조절 요소 및 유전자, 예를 들어, 추가의 관심대상의 유전자 또는 선별 마커를 발현 벡터에 배치시킬 수 있다.
따라서, 관심대상의 유전자와 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터는 이 두 유전자를 1개 또는 2개의 개별적 전사 단위내에 함유할 수 있다. 각각의 전사 단위는 하나 이상의 유전자 산물을 전 사시키고 발현시킬 수 있다. 두 유전자 모두가 하나의 전사 단위에 함유된 경우, 이들은 동일한 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 제어하에 있으며, 바람직하게는 IRES 요소를 사용하여 모든 성분들의 기능적 연결을 보장한다. 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자 및 관심대상의 유전자가 2개의 개별적 단위내에 함유되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 프로모터/인핸서의 제어하에 있을 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 보다 약한 이종 프로모터, 예를 들어, SV40 조기 프로모터를 변형된 NPT 유전자에 대해 사용하고 바람직하게는 인핸서를 사용하지 않는다. 본 발명이 범주내에서 2개의 개별적 전사 단위를 갖는 발현 벡터가 바람직하다. 하나(이시스트론성) 전사 단위는 관심대상의 유전자 및 임의로 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 반면, 다른 전사 단위는 변형된 NPT 유전자를 함유한다. 바람직하게는, 각각의 전사 단위는 폴리A 시그날, 바람직하게는 BGH 폴리A 또는 SV40 폴리A를 암호화하는 서열에 의해 3' 말단으로 한정된다.
본 발명에 따라서, 관심대상의 유전자 대신에, 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 통해 관심대상의 유전자의 클로닝을 가능하게 하는 다중 클로닝 부위만을 갖는 벡터가 또한 바람직하다. 모든 종류의 제한 엔도뉴클레아제 뿐만 아니라 관련 인식 엔도뉴클레아제에 대한 수많은 인식 서열이 선행 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 인식 서열로서 6개 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진 서열을 사용한다. 적합한 인식 서열의 목록은 문헌[참조: Sambrook et al., 1989]에서 찾아볼 수 있다.
숙주 세포
본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염시키기 위해, 진핵 숙주 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 및 보다 특히 마우스, 랫트 및 햄스터 세포주와 같은 설치류 세포를 사용한다. 해당 세포를 본 발명에 따른 발현 벡터로 성공적으로 형질감염시키면, 형질전환된, 유전자 변형된 재조합 또는 유전자전이된(transgenic) 세포가 수득되며, 이 또한 본 발명의 목적이다.
본 발명의 목적상 바람직한 숙주 세포는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44와 같은 햄스터 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/자손이다. CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21이 특히 바람직하며, CHO-DG44 및 CHO-DUKX가 보다 특히 바람직하다. 마우스로부터의 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 및 이러한 세포주의 유도체/자손이 또한 적합하다.
본 발명에 따라 사용할 수 있는 햄스터 및 마우스 세포의 예는 하기 표 1에 기재한다. 그러나, 이러한 세포의 유도체/자손, 사람, 마우스, 랫트, 원숭이, 설치류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 기타 포유동물 세포 또는 효모, 곤충 및 식물 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 진핵 세포를 생물약제학적 단백질의 제조를 위해 본 발명의 의미내에서 사용할 수도 있다.
햄스터 및 마우스의 생산 세포주
세포주 수탁 번호:
NS0 ECASS No. 85110503
Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-1581
BHK21 ATCC CCL-10
BHK TK- ECACC No. 85011423
HaK ATCC CCL-15
2254-62.2
(BHK-21-유도체)		 ATCC CRL-8544
CHO ECACC No. 8505302
CHO-K1 ATCC CCL-61
CHO-DUKX
(= CHO duk- CHO/dhfr-)		 ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B1 ATCC CRL-9010
CHO-DG44 Urlaub et al;
Cell 32[2], 405-412, 1983
CHO Pro-5 ATCC CRL-1781
V79 ATCC CCC-93
B14AF28-G3 ATCC CCL-14
CHL ECACC No. 87111906
진핵 숙주 세포의 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터 중 하나로의 형질감염은 통상의 방법[참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994]으로 수행할 수 있다. 적합한 형질감염 방법에는 리포좀-매개된 형질감염, 인산칼슘 공침전, 전기천공, 다양이온(예: DEAE 덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 마이크로주사(microinjection) 및 바이러스 감염이 포함된다. 본 발명에 따라서, 작제물이 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/미소염색체내로 통합되거나 안정한 방식으로 에피좀으로서 숙주 세포내에 함유되는 안정한 형질감염을 수행하는 것이 바람직하다. 해당 숙주 세포에서 최적의 형질감염 횟수와 이종 유전자 발현을 제공하는 형질감염 방법이 바람직하다.
정의상, 숙주 세포에 삽입된 모든 서열 또는 모든 유전자는 도입된 서열 또는 유전자가 숙주 세포내의 내인성 서열 또는 유전자와 동일한 경우라도 숙주 세포와 관련하여 "이종 서열" 또는 "이종 유전자"로 지칭된다. 이는 도입하고자 하는 서열 또는 도입하고자 하는 유전자가 숙주 세포의 내인성 서열 또는 내인성 유전자와 동일한 경우라도 마찬가지이다. 예를 들어, 햄스터 숙주 세포내로 도입된 햄스터 액틴 유전자는 정의상 이종 유전자이다.
본 발명에 따라서, 본원에서 기술하는 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염된, 재조합 포유동물 세포, 바람직하게는 설치류 세포, 가장 바람직하게는 CHO 또는 BHK 세포와 같은 햄스터 세포가 바람직하다.
예를 들어, 모노클로날 항체(mAb)와 같은 이형 단백질의 재조합 생산시, 적합한 숙주 세포의 형질감염은 이론상 2개의 상이한 방법으로 수행할 수 있다. 이러한 종류의 mAb는 다수의 서브유닛, 중쇄 및 경쇄로 이루어진다. 이들 서브유닛을 암호화하는 유전자는 단일 플라스미드상에 독립적 또는 다시스트론성 전사 단위내에 수용되어 있을 수 있으며, 이러한 플라스미드로 숙주 세포를 후속적으로 형질감염시킨다. 이는 숙주 세포의 게놈내로 통합된 후 유전자의 화학량론적 표시를 보증하기 위함이다. 그러나, 독립적 전사 단위의 경우, 이로써 상이한 단백질을 암호화하는 mRNA들이 동일한 안정성과 전사 및 해독 효율성을 나타내야어함이 보장되어야 한다. 두번째 경우, 유전자의 발현은 단일 프로모터에 의해 다시스트론성 전사 단위내에서 일어나며 오직 하나의 전사체만이 형성된다. IRES 요소를 사용함으로써, 제2 및 후속적 시스트론에서 유전자의 매우 효율적인 내부 전사 개시가 수득된다. 그러나, 이러한 시스트론의 발현율은 제1 시스트론의 전사율보다 낮으며, 제1 시스트론의 해독 개시는 소위 "캡"-의존적 전개시 복합체에 의해 이루어지며, IRES-의존적 해독 개시에 비해 실질적으로 보다 효율적이다. 시스트론의 진정한 등몰(equimolar) 발현을 달성하기 위해, 예를 들어, IRES 요소와 함께 균일한 발현율을 보장하는 추가의 시스트론간 요소를 도입시킬 수 있다(WO 94/05785).
본 발명에 따라 바람직한, 수많은 이종 단백질을 동시에 생산하는 다른 가능한 방식은 공형질감염으로서, 유전자를 상이한 발현 벡터내로 개별적으로 통합시키는 것이다. 이는 특정 비율의 유전자 및 유전자 산물이 서로 조정될 수 있어 mRNA 안정성의 차이 및 전사 및 해독 효율의 차이에 균형이 잡힌다는 잇점을 갖고 있다. 또한, 발현 벡터는 이의 크기가 작기 때문에 보다 안정하며 클로닝 동안 및 형질감염 동안 취급하기가 용이하다.
따라서, 본 발명의 하나의 특정 양태에서, 숙주 세포는 다른 관심대상의 단백질 하나 이상을 암호화하는 유전자를 갖는 하나 이상의 벡터로 추가로 형질감염, 바람직하게는 공형질감염시킨다. 공형질감염에 사용되는 다른 벡터 또는 벡터들은 예를 들어, 동일한 프로모터/인핸서 조합의 제어하에 있는 다른 관심대상의 단백질 또는 단백질들을 암호화하고 하나 이상의 선별 마커, 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제를 암호화한다.
본 발명에 따라서, 숙주 세포는 바람직하게는 무혈청 조건하에, 임의로 동물 단백질/펩타이드를 함유하지 않는 배지내에서 확립시키고, 적응시키고 배양한다. 시판되는 배지의 예로는 햄스 F12(제조원: Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640(제조원: Sigma), 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM, 제조원: Sigma), 최소 필수 배지(MEM; 제조원: Sigma), 이소코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM, 제조원: Sigma), CD-CHO (제조원: Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S(제조원: Invtirogen), 무혈청 CHO 배지(제조원: Sigma) 및 단백질 비함유 CHO 배지(제조원; Sigma)가 포함된다. 이들 배지 각각에는 임의로 다양한 화합물, 예를 들어, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예: 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린 유사성장 인자), 염(예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산염), 완충액(예: HEPES), 뉴클레오시드(예: 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코즈 또는 기타 동등한 에너지 공급원, 항생제, 미량원소와 같은 다양한 화합물을 보충시킬 수 있다. 본 발명에 따라서 무혈청 배지가 바람직하나, 숙주 세포를 적당량의 혈청과 혼합된 배지를 사용하여 배양하고 후속적으로 단백질을 생산할 수도 있다. 하나 이상의 선별 마커 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포를 선별하기 위해, 하나 이상의 선별제를 배지에 첨가한다.
"선별제"란 용어는 해당 선별 마커 유전자가 결실된 숙주 세포의 성장 또는 생존에 영향을 주는 물질을 지칭한다. 본 발명의 범주내에서, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 보유한 이종 숙주 세포의 선별을 위한 배지 첨가제로서 바람직하게는 제네티신(G418)을 사용한다. 바람직하게는, 100 내지 800g/배지 ml, 가장 바람직하게는 300 내지 400g/배지 ml의 G418 농도를 사용한다. 숙주 세포를 다수의 발현 벡터로 형질감염시키고자 할 경우, 예를 들어, 몇가지 관심대상의 유전자를 숙주 세포내로 개별적으로 도입시키고자 할 경우, 이들은 일반적으로 상이한 선별 마커 유전자를 갖는다.
선별 마커 유전자란, 상응하는 선별제를 배양 배지에 첨가함으로써 이러한 유전자를 보유한 세포만을 특이적으로 선별할 수 있도록 하는 유전자이다. 예로서, 항생제 내성 유전자를 양성 선별 마커 유전자로서 사용할 수 있다. 이러한 유전자로 형질전환된 세포만이 상응하는 항생제의 존재하에 성장할 수 있고 따라서 선별될 수 있다. 반면에, 형질전환되지 않은 세포는 선별 조건하에 성장 또는 생존할 수 없다. 양성, 음성 또는 2기능성 선별 마커가 있다. 양성 선별 마커는 숙주 세포에서 선별제에 대한 내성 또는 대사작용 또는 이화작용 결함에 대한 보상을 부여함으로써 형질전환된 세포를 선별하여 증대시킬 수 있도록 한다. 대조적으로, 선별 마커에 대한 유전자를 보유한 세포는 음성 선별 마커에 의해 선택적으로 제거할 수 있다. 이의 예로는 단순포진 바이러스의 유전자로서, 아시클로버 또는 간시클로버가 동시에 첨가된 세포내에서 이 유전자의 발현은 이 세포의 제거를 유도한다. 증폭가능한 선별 마커를 포함하여 본 발명에서 사용되는 선별 마커 유전자에는 유전자 변형된 돌연변이체 및 변이체, 단편, 기능적 등가물, 유도체, 상동체 및 다른 단백질 또는 펩타이드와의 융합체가 포함되는데, 단 선별 마커는 이의 선별적 특성을 보유해야 한다. 이러한 유도체는 일반적으로 선별적일 것으로 간주되는 영역 또는 도메인내의 아미노산 서열의 상당한 상동성을 나타낸다. 문헌에는 2기능성(양성/음성) 마커[참조: WO 92/08796 및 WO 94/28143]를 포함하는 다수의 마커 유전자가 기재되어 있다. 진핵 세포에서 통상 사용되는 선별 마커의 예에는 예를 들어, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APH), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HYG), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 티미딘 키나제(TK), 글루타민 신테타제, 아스파라긴 신테타제에 대한 유전자 및 네오마이신(G418), 푸로마이신, 히스티디놀 D, 블레오마이신, 플레오마이신 및 제오신에 대한 내성을 부여하는 유전자가 포함된다.
또한, 형광-활성화 세포 분류법(fluorescence-activated cell sorting; FACS)를 이용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 이를 위해, 형질전환된 세포 선별용 세균 β-갈락토시다제, 세포 표면 마커 또는 형광 단백질(예: 에쿼레아 빅토리아(Aequorea victoria) 및 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 또는 기타 종으로부터의 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이의 변이체; 비-생물발광 유기체, 예를 들어, 디스코소마 종(Discosoma sp.), 아네모니아 종(Anemonia sp.), 클라불라리아 종(Clavularia sp.), 조안투스 종(Zoanthus sp.)으로부터 적색 형광 단백질 및 다른 색상의 형광을 발하는 단백질 및 이의 변이체)를 이용할 수 있다.
유전자 발현 및 고-생산성 숙주 세포의 선별
유전자 발현이란 용어는 숙주 세포에서의 이종 유전자의 전사 및/또는 해독에 관한 것이다. 발현율은 일반적으로, 숙주 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양에 기초하거나 관심대상의 유전자에 의해 암호화되는, 생산된 유전자 산물의 양에 기초하여 측정할 수 있다. 선별된 뉴클레오타이드 서열의 전사에 의해 생산된 mRNA의 양은 예를 들어, 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포성 RNA의 동일계내(in situ) 하이브리드화 또는 PCR 방법에 의해 정량화할 수 있다[참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994]. 선별된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 단백질은 또한 다양한 방법, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사성면역검정, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성의 검출 또는 단백질의 면역 염색 후의 FACS 분석으로 측정할 수 있다[참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994].
"고 발현 수준(또는 발현율), 고 발현, 증가된 발현 또는 고 생산성"은 숙주 세포내로 도입된 이종 서열, 예를 들어, 치료학적 단백질을 암호화하는 유전자의 장기간 지속되고 충분히 높은 발현 또는 합성을 의미한다. 증가된 또는 고 발현 또는 고 발현 수준 또는 발현율 또는 고 생산성은 본 발명에 따른 세포가 유전자 증폭 없이 본원에서 기술하는 방법 중 하나에 의해 배양되는 경우 및 이러한 세포가 1일당 목적하는 유전자 산물 약 0.5pg(0.5pg/세포/일)를 초과하여 생산하는 경우에 존재한다. 또한, 증가된 또는 고 발현 또는 고 발현 수준 또는 발현율 또는 고 생산성은 사전에 유전자 증폭시키지 않고 본 발명에 따른 세포가 1일당 목적하는 유전자 산물 약 1.0pg(1.0pg/세포/일)을 초과하여 생산하는 경우에 존재한다. 증가된 또는 고 발현 또는 고 발현 수준 또는 발현율 또는 고 생산성은 특히 사전에 유전자 증폭시키지 않고 본 발명에 따른 세포가 1일당 목적하는 유전자 산물 약 1.5pg(1.5pg/세포/일)을 초과하여 생산하는 경우에 존재한다. 증가된 또는 고 발현 또는 고 발현 수준 또는 발현율 또는 고 생산성은 특히 사전에 유전자 증폭시키지 않고 본 발명에 따른 세포가 1일당 목적하는 유전자 산물 약 2.0pg(2.0pg/세포/일)을 초과하여 생산하는 경우에 존재한다. 특히, 증가된 또는 고 발현 또는 고 발현 수준 또는 발현율 또는 고 생산성은 특히 사전에 유전자 증폭시키지 않고 본 발명에 따른 세포가 1일당 목적하는 유전자 산물 약 3.0pg(3.0pg/세포/일)을 초과하여 생산하는 경우에 존재한다. 예를 들어, 이후에 기술하는 DHFR/MTX 증폭 시스템을 사용한 단순한 유전자 증폭 단계에 의해 2 내지 10 이상의 인자만큼 증가시킬 수 있어, "고 발현", "증가된 발현" 또는 "고 생산성"이란 용어를 유전자 증폭 단계에 적용시킨 세포가 1일당 목적하는 유전자 산물 약 5pg(5pg/세포/일) 초과, 바람직하게는 약 10pg/세포/일 초과, 보다 바람직하게는 약 15pg/세포/일 초과, 보다 더욱 바람직하게는 약 20pg/세포/일 초과 또는 약 30pg/세포/일을 초과하여 생산하는 경우에 이러한 세포와 관련하여 사용한다.
높은 또는 증가된 발현, 높은 생산성 또는 높은 발현 수준 또는 발현율은 본 발명에 따른 발현 벡터 중 하나를 사용하고 본 발명에 따른 방법 중 하나를 사용함으로써 달성할 수 있다.
예를 들어, 관심대상의 유전자와 변형된 NPT 유전자의 공발현에 의해, 이종 유전자를 높은 수준으로 발현하는 세포를 선별하고 확인할 수 있다. wtNPT와 비교하여, 변형된 NPT는 관심대상의 이종 유전자의 발현이 높은 안정하게 형질감염된 숙주 세포를 보다 효율적으로 선별할 수 있도록 한다.
따라서, 본 발명은 또한, (i) 포유동물 세포의 풀을, 하나 이상의 관심대상의 유전자 및 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 비교하여 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 단지 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 단지 1.5 내지 26%의 활성만을 갖는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 하나의 유전자로 형질감염시키고; (ii) 상기 세포를 관심대상의 유전자 또는 유전자들 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에 배양하고; (iii) 상기 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고; (iv) 관심대상의 단백질 또는 단백질들을 포유동물 세포 또는 배양 상청액으로부터 수득함을 특징으로 하여, 재조합 포유동물 세포에서 하나 이상의 관심대상의 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염된 재조합 포유동물 세포를 사용한다.
본 발명은 또한 (i) 포유동물 세포의 풀을, 하나 이상의 관심대상의 유전자 및 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 비교하여 단지 1 내지 80%, 바람직하게는 단지 1 내지 60%, 보다 바람직하게는 단지 1.5 내지 30%, 가장 바람직하게는 단지 1.5 내지 26%의 활성만을 갖는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 하나의 유전자로 형질감염시키고; (ii) 상기 포유동물 세포를 관심대상의 유전자 또는 유전자들 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에 배양하고; (iii) 상기 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장 에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제, 바람직하게는 G418의 존재하에 배양하는, 하나 이상의 관심대상의 유전자를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 선별하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 보다 상세히 기술하는 변형된 NPT 유전자가 사용된 경우, 특히 야생형 유전자와 비교하여 아미노산 182번 위치에서 글리신 또는 아스파르트산을 암호화하거나, 아미노산 91번 위치에서 알라닌을 암호화하거나, 아미노산 198번 위치에서 글리신을 암호화하거나, 아미노산 227번 위치에서 알라닌, 글리신 또는 발린을 암호화하거나, 아미노산 261번 위치에서 글리신 또는 아스파라긴을 암호화하거나, 아미노산 240번 위치에서 이소류신을 암호화하는 경우에, 하나 이상의 관심대상의 유전자를 발현시키고 상응하는 관심대상의 유전자를 발현하는 재조합 세포를 선별하는 방법이 특히 바람직하다. Asp227Val, Asp227Gly, Asp261Gly, Asp261Asn, Phe240Ile 또는 Trp91Ala 돌연변이체를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 일반적으로, 본 출원 명세서에서 언급되는 본 발명에 따른 모든 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 이러한 방법에 적합하다. 바람직한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 대해서는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 대한 선별을 참조한다.
관심대상의 유전자와 변형된 NPT 유전자를 발현하는 세포의 선별은 예를 들어, 선별제로서 G418를 첨가하여 수행한다. 그러나, 네오마이신 또는 가나마이신과 같은 기타 아미노글리코시드 항생제를 사용할 수도 있다. 본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 배양 배지 mL당 G418 200㎍ 내지 800㎍에서 배양하고 선별한다. 배양 배지 mL당 G418 300㎍ 내지 700㎍을 첨가하는 것이 특히 바람직한 것으로 입증되었다. 배양 배지 mL당 G418 약 400㎍을 첨가하는 것이 가장 바람직한 양태이다. 이러한 방법을 사용함으로써 발현율이 특히 높은 재조합 세포를 선별할 수 있다. wtNPT의 사용과 비교하여, 선별 마커로서 배양 배지 ml당 G418 400㎍으로 선별한 후에, 세포는 Glu182Gly, Glu182Asp 및 Val198Gly 돌연변이체의 경우에 1.4 내지 2.4의 인자만큼, Asp227Gly 돌연변이체의 경우에 1.6 내지 4.1의 인자만큼, Asp227Ala 또는 Trp91Ala 돌연변이체의 경우에 2.2 또는 4의 인자만큼, Phe240Ile 또는 Asp261Asn 돌연변이체의 경우에 5.7 또는 7.3의 인자만큼, Asp261Gly 또는 Asp227Val 돌연변이체의 경우에 심지어 9.3 또는 14.6의 인자만큼 증가된 생산성을 나타냈다. 다양한 변형된 NPT 유전자에 대한 비생산성(specific productivity)은 도 6에 제시한다.
상응하는 방법을 추가의 선별 마커로서 하나 이상의 형광 단백질(예: GFP) 또는 세포 표면 마커를 함유하는 재조합 숙주 세포의 FACS-보조된 선별과 병용할 수 있다. 또한 사용될 수 있는, 증가된 발현을 수득하는 다른 방법 및 병용된 상이한 방법들은 예를 들어, (인공) 전사 인자의 사용, 내인성 또는 이종 유전자 발현을 상향조절하는 천연 또는 합성 제제에 의한 세포 처리, mRNA 또는 단백질의 안정성 개선, mRNA 해독 개시의 개선, 에피좀 플라스미드(복제 오리진으로서 바이러스 서열, 예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, EBV 또는 BPV의 사용에 기초함), 증폭-촉진 서열[참조: Hemann et al., 1994] 또는 DNA-콘카타머에 기초한 시험관내 증폭 시스템[참조: Monaco et al., 1996]의 사용에 의한 유전자 용량의 증가를 토대로 한다.
관심대상의 유전자와 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 커플링된 전사가 선별 마커로서 변형된 NPT 유전자의 사용과 함께 특히 효과적인 것으로 입증되었다. 생성된 이시스트론성 mRNA는 관심대상의 단백질/산물과 형광 단백질 둘다를 발현한다. 이러한 관심대상의 단백질과 형광 단백질의 발현의 커플링에 기초하여, 본 발명에 따라서, 형광 단백질 발현, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류 장치(FACS)를 사용하여 고-생산성 재조합 숙주 세포를 용이하게 확인하고 분시시킬 수 있다.
높은 생존성 및 목적하는 유전자 산물의 증가된 발현율을 나타내는 재조합 숙주 세포의 선별은 다단계 과정이다. 본 발명에 따른 벡터로 형질감염된 또는 임의로 다른 벡터와 함께 공형질감염된 숙주 세포는 예를 들어, G418을 100, 200, 400, 600 또는 800㎍ 이상/배양 배지 mL과 같은 선별제의 존재하에 배양함으로써, 변형된 NPT를 발현하는 세포를 선별할 수 있도록 하는 조건하에 배양한다. 이어서, 형광 단백질의 가장 높은 발현율을 나타내는 세포/세포 집단을 확인하고 분류해내기 위해, 상응하는 세포를 적어도 형광 단백질을 암호화하고 관심대상의 유전자와 커플링되어 있는 유전자가 발현었는지에 대해 조사한다. 바람직하게는, 형광 단백질의 발현율이 가장 높은 10 내지 20%의 세포에 속하는 세포만이 분류되고 추가로 배양된다. 실제로, 이는 가장 명백한 10%의 형광성 세포만이 분류되고 추가로 배양됨을 의미한다. 따라서, 세포 혼합물 중 명백한 5%, 바람직하게는 보다 명백한 3% 또는 가장 명백한 1%의 형광성 세포만이 분류되고 복제된다. 특히 바람직한 양태에서, 가장 명백한 0.5% 또는 가장 명백한 0.1%의 세포만이 분류되고 복제된다.
선별 단계는 세포 풀에서 수행하거나 예비-분류된 세포 풀/세포 클론을 사용하여 수행할 수 있다. 1가지 이상, 바람직하게는 2가지 이상, 특히 3가지 이상의 분류 단계를 수행할 수 있으며, 각각의 분류 단계 사이에 세포가 배양되고 특정 기간, 예를 들어, 풀의 경우에 약 2주 동안 복제될 수 있다. 도 11 및 12는 예를 들어, 돌연변이체 Asp227Gly에 있어 유전자 증폭 단계의 존재 및 부재하에 FACS-기본 분류법 후에 비생산성(specific productivity)을 도시한 것이다.
따라서, 본 발명은 (i) 재조합 포유동물 세포를 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질감염시키고; (ii) 형질감염된 세포를 관심대상의 유전자 또는 유전자들, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있도록 하는 조건하에 배양하고; (iii) 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고; (iv) 특별히 형광 유전자의 고 발현을 나타내는 포유동물 세포를 유세포 측정 분석법으로 분류함을 특징으로 하여, 하나 이상의 관심대상의 이종 유전자를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 수득하고 선별하는 방법에 관한 것이다. 경우에 따라, 단계 (ii) 내지 (iv)를 1회 또는 수회 반복할 수 있는 경우, 세포는 단계(iv)에서 수득된다.
분류된 포유동물 세포가 추가의 유전자 증폭 단계 없이, 1일당 및 세포당 목적하는 유전자 산물 또는 산물들 0.5pg(0.5pg/세포/일) 초과, 바람직하게는 1pg/세포/일 초과, 보다 바람직하게는 2pg/세포/일 초과, 보다 더욱 바람직하게는 3pg/세포/일 초과, 보다 더욱더 바람직하게는 4pg/세포/일 초과, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등, 15, 20, 25pg/세포/일 초과의 평균 비생산성(specific productivity)을 가짐을 특징으로 하는 상응하는 방법이 바람직하다. 상기 언급한 바와 같이, 이들 세포의 생산성은 단순 유전자 증폭 단계, 예를 들어, DHFR/MTX 증폭 시스템을 사용한 단순한 유전자 증폭 단계에 의해 2 내지 10 이상의 인자만큼 증가될 수 있다. 이는 예를 들어, NTP 돌연변이체 Asp227Gly를 사용한 선별에 대해 도 12에 제시한다. 비생산성(specific productivity)은 20 내지 25pg/세포/일이었다.
본 발명에 따라서, 적합하게 분류된 세포를 복제하고, 암호화된 관심대상의 유전자 산물을 제조하는데 사용하는 방법이 또한 바람직하다. 이를 위해, 선별된 고 생산성 세포를 관심대상의 유전자가 발현될 수 있는 조건하에 바람직하게는 무혈청 배양 배지 및 바람직하게는 현탁 배양물 중에서 배양한다. 관심대상의 단백질/산물은 바람직하게는 분비된 유전자 산물로서 세포 배양 배지로부터 수득한다. 단백질이 분비 시그날이 없이 발현되는 경우, 유전자 산물은 세포 용해물로부터 분리될 수도 있다. 다른 재조합 단백질과 숙주 세포 단백질을 함유하지 않는 순수한 균질 산물을 수득하기 위해, 통상의 정제 공정을 수행한다. 먼저, 세포 및 세포 파편을 배양 배지 또는 용해물로부터 제거한다. 이어서, 목적하는 유전자 산물을, 면역친화성 및 이온 교환 컬럼 상에서 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC 또는 세파덱스, 실리카 또는 양이온 교환 수지(예: DEAE)상에서의 크로마토그래피에 의해 오염물질 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터 분리시킬 수 있다. 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 이종 단백질을 정제하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Harris et al., 1995 and Scopes 1988]에 기재되어 있다.
증폭가능한 선별 마커 유전자
또한, 본 발명에 따른 세포는 임의로 1회 이상의 유전자 증폭 단계에 적용시킬 수도 있는데, 여기서 세포는 증폭가능한 선별 마커 유전자의 증폭을 유도하는 선별제의 존재하에 배양한다. 상기 단계는 형광 단백질을 발현하고 바람직하게는 FACS(바람직하게는 본원에서 기술하는 방식 중 하나로)에 의해 1회 이상 예비-분류되어진 세포 및 아직 분류되지 않은 세포 둘다로 수행할 수 있다.
숙주 세포를 증폭가능한 선별 마커를 암호화하는 유전자로 추가로 형질전환시켜야함이 필수조건이다. 본 발명에 따른 벡터 중 하나에 존재하거나 다른 벡터에 의해 숙주 세포로 도입되는 증폭가능한 선별 마커를 암호화하는 유전자를 생각할 수 있다.
증폭가능한 선별 마커는 통상 특정한 배양 조건하에 진핵 세포의 성장을 위해 필요한 효소를 암호화한다. 예를 들어, 증폭가능한 선별 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)을 암호화할 수 있다. 이러한 경우에, 이러한 유전자는, 이러한 유전자로 형질감염된 숙주 세포를 선별제 메토트렉세이트(MTX)의 존재하에 배양하는 경우에 증폭된다.
하기 표 2A 및 2B에는 본 발명에 따라 사용할 수 있는 기타 증폭가능한 선별 마커 및 관련 선별제가 기재되어 있으며, 이는 문헌[참조: Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990)]에 기재되어 있다.
선별가능한 증폭가능한 마커 유전자
선별가능한 증폭가능한 마커 유전자 승인번호 선별제
디하이드로폴레이트 리덕타제 M19869 (햄스터)
E00236 (마우스)		 메토트렉세이트(MTX)
메탈로티오네인 D10551 (햄스터)
M13003 (사람)
M11794 (랫트)		 카드뮴
CAD (카바모일-포스페이트 신테타제:아스파르테이트 트랜스카바밀라제: 디하이드로오로타제) M23652 (햄스터)
D78586 (사람)		 N-포스포아세틸-L-아스파르테이트
아데노신 데아미나제 K02567 (사람)
M10319 (마우스)		 Xyl-A- 또는 아데노신, 2'데옥시코포르마이신
AMP (아데닐레이트) 데아미나제 D12775 (사람)
J02811 (랫트)		 아데닌, 아자세린, 코포르마이신
UMP 신테타제 J03626 (사람) 6-아자우리딘, 피라조푸란
IMP 5'데하이드로게나제 J04209 (햄스터)
J04208 (사람)
M33934 (마우스)		 미코페놀산
크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 X00221 (E. coli) 크산틴을 제한하면서 미코페놀산
돌연변이 HGPRTase 또는 돌연변이 티미딘 키나제 J00060 (햄스터)
M13542, K02581 (사람)
J00423, M68489(마우스)
M63983 (랫트)
M36160 (herpesvirus)		 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)
티미딜레이트 신테타제 D00596 (사람)
M13019 (마우스)
L12138 (랫트)		 5-플루오로데옥시우리딘
P-당단백질 170 (MDR1) AF016535 (사람)
J03398 (마우스)		 다수의 약물, 예를 들어, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 콜리신
리보뉴클레오타이드 리덕타제 M124223, K02927 (마우스) 아피도콜린
글루타민 신테타제 AF150961 (햄스터)
U09114, M60803 (마우스)
M29579 (랫트)		 메티오닌 설폭스이민(MSX)
아스파라긴 신테타제 M27838 (햄스터)
M27396 (사람)
U38940 (마우스)
U07202 (랫트)		 β-아스파르틸 하이드록사메이트, 알비지인, 5'아자시티딘
아르기니노석시네이트 신테타제 X01630 (사람)
M31690 (마우스)
M26198 (소)		 카나바닌
오르니틴 데카복실라제 M34158 (사람)
J03733 (마우스)
M16982 (랫트)		 α-디플루오로메틸오르니틴
HMG-CoA 리덕타제 L00183, M12705 (햄스터)
M11058 (사람)		 콤팍틴
N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 M55621 (사람) 투니카마이신
트레오닐-tRNA 신테타제 M63180 (사람) 보렐리딘
Na+K+-ATPase J05096 (사람)
M14511 (랫트)		 우아바인
본 발명에 따라서 사용되는 증폭가능한 선별 마커 유전자는 바람직하게는 DHFR의 기능을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들어, DHFR 또는 형광 단백질과 DHFR로부터의 융합 단백질을 암호화하는 유전자이다. DHFR는 푸린의 생합성에 필수적이다. DHFR 유전자가 결여된 세포는 푸린이 결여된 배지에서 성장할 수 없다. 따라서, DHFR 유전자는 푸린 비함유 배지에서 배양된 세포에서 유전자를 선별하고 증폭시키는데 유용한 선별 마커이다. DHFR 유전자와 함께 사용되는 선별제가 메토트렉세이트(MTX)이다.
따라서, 본 발명은 (i) 숙주 세포를, 하나 이상의 관심대상의 단백질/산물, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 및 DHFR을 암호화하는 유전자로 형질감염시키는 단계; (ii) 상기 세포를 다양한 유전자들이 발현될 수 있도록 하는 조건하에 배양하는 단계; 및 (iii) 상기 세포를 메토트렉세이트와 같은 하나 이상의 증폭가능한 선별 마커 유전자의 존재하에 배양하여, 공동 삽입된 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는, 재조합 포유동물 세포의 제조 및 선별 방법을 포함한다. 바람직하게는, 형질감염된 세포는 MTX의 농도를 증가시키면서 하이포크산틴/티미딘 비함유 배지에서 배양한다. 바람직하게는, 제1 증폭 단계에서 MTX의 농도는 5nM 이상이다. 그러나, MTX의 농도는 20nM 또는 100nM 이상일 수 있으며 1μM으로 점차 증가시킬 수 있다. 각각의 경우에, 1μM 이상의 농도, 예를 들어, 2μM을 사용할 수 있다.
상응하는 세포를 형광 단백질에 대한 유전자로 추가로 형질전환시키는 경우, 이러한 세포는 동일할 수 있으며 형광 활성화 세포 분류 장치(FACS)를 사용하여 분류한 다음, 20nM 이상의 MTX의 존재하에, 바람직하게는 50 또는 100nM의 MTX의 존재하에 유전자 증폭 단계에서 배양할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포당 및 1일당 유전자 산물 20pg 이상, 바람직하게는 세포당 및 1일당 목적하는 유전자 산물 21, 22, 23, 24, 25 등, 30, 35, 40 등 이상으로 생산성을 실질적으로 증가시킬 수 있다. 숙주 세포는 적어도 관심대상의 유전자 및 증폭가능한 선별 마커의 카피수를 증가시키기 위해 1회 이상의 유전자 증폭 단계에 적용시킬 수 있다. 본 발명에 따라서, 달성될 수 있는 고 생산성은 네오마이신, 가나마아신 및 G418과 같은 아미노글리코시드 항생제에 대한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제-매개된 내성에 의한 효율적 예비-선별과 연관된다. 따라서, 필요한 유전자 증폭 단계의 횟수를 감소시키고 예를 들어, 단지 1회의 유전자 증폭 단계만을 수행할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 (i) 재조합 포유동물 세포를, 본 발명에 따른 발현 벡터 및 증폭가능한 선별 마커 유전자로 형질감염시키고; (ii) 상기 포유동물 세포를 관심대상의 유전자 또는 유전자들, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 가능하게 하는 조건하에 배양하고; (iii) 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고; (iv) 형광 단백질의 고 발현을 나타내는 포유동물 세포를 유세포 측정 분석법으로 분류하며; (v) 분류된 세포를 증폭가능한 선별 마커 유전자가 발현되는 조건하에 배양하고; (vi) 선별제를 상기 배양 배지에 첨가하여 증폭가능한 선별 마커 유전자가 증폭되도록 함을 특징으로 하여, 하나 이상의 관심대상의 이종 유전자를 발현하는 재조합 포유동물 세포를 수득 및 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 기술하는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 사용하는 상응하는 방법이 특히 바람직하다.
또한, 1회의 증폭 단계만을 수행하는 방법이 바람직하다. 또한, 세포당 및 1일당 20pg을 초과, 바람직하게는 21, 22, 23, 24, 25 등, 30, 35, 40 등 이상을 초과하는 목적하는 유전자 산물 또는 산물들의 평균 비생산성(specific productivity)을 나타내는 재조합 포유동물 세포를 유도하는 상응하는 방법이 바람직하다.
포유동물 세포, 바람직하게는 마우스 골수종 및 햄스터 세포가 증폭가능한 선별 마커로서 DHFR을 사용하기에 바람직한 숙주 세포이다. 세포주 CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) 및 CHO-GD44[참조: Urlaub et al., 1983]가 특히 바람직한데, 이는 돌연변이의 결과로서 이들이 자체의 DHFR 활성을 갖지 않기 때문이다. 자체의 내인성 DHFR 활성을 갖는 다른 세포 유형에서 DHFR-유도된 증폭을 사용할 수 있기 위해서, 형질감염 방법에서 메토트렉세이트에 대한 활성이 감소된 단백질을 암호화하는 돌연변이된 DHFR 유전자를 사용할 수 있다[참조; Simonson et al., 1983; Wigler et al., 1980; Haber et al., 1982].
CHO-DG44 또는 CHO-DUKX와 같은 DHFR 음성 기본 세포를 사용하는 경우 DHFR 마커가 선별 및 후속적 증폭에 특히 적합한데, 이는 이러한 세포들이 내인성 DHFR를 발현하지 않아서 푸린 비함유 배지에서 성장하지 못하기 때문이다. 따라서, 본원에서 DHFR 유전자를 우성 선별 마커로서 사용하고, 형질전환된 세포를 하이포크산틴/티미딘 비함유 배지에서 선별한다.
본 발명은 일부 비제한적 실시예를 참조로 하여 하기에서 보다 충분히 설명된다.
약어
Ala (=A) 알라닌
AP: 알칼리성 포스파타제
Asn (=N) 아스파라긴
Asp (=D): 아스파르트산
bp: 염기쌍
BSA: 소 혈청 알부민
CHO: 중국 햄스터 난소
dhfr: 디하이드로폴레이트-리덕타제
DMSO: 디메틸설폭사이드
ELISA: 효소-연관 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay)
FACS: 형광-활성화 세포 분류 장치
FITC: 플루오레세인-이소티오시아네이트
GFP: 녹색 형광 단백질
Glu (=E): 글루탐산
Gly (=G): 글리신
HBSS: 행크스 균염 용액(Hanks Balanced Salt Solution)
HT: 하이포크산틴/티미딘
Ile (=I): 이소류신
IRES: 내부 리보좀 진입 부위
kb: 킬로베이스
mAb: 모노클로날 항체
MCP-1: 단핵구 화학주성 단백질-1
MTX: 메토트렉세이트
MW: 평균값
NPT: 네오마이신-포스포트랜스퍼라제
PCR: 폴리머라제 연쇄 반응
PBS: 포스페이트 완충된 염수
Phe (=F): 페닐알라닌
Trp (=W): 트립토판
Val (=V): 발린
WT: 야생형
방법
1. 세포 배양 및 형질감염
세포 CHO-DG44/dhfr-/-[참조: Urlaub et al., 1983]를 습윤한 대기 및 5% CO2하에 세포 배양 플라스크내에서 하이포크산틴 및 티미딘(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE)이 보충된, 무혈청 CHO-S-SFMII 배지에서 현탁액 세포로서 영구 배양하였다. 세포 계수 및 생존성을 CASY1 세포 계수기(Schaerfe System, DE)를 사용하거나 트립탄 블루 염색에 의해 측정한 다음, 세포를 1 내지 3x105/mL의 농도로 씨딩하고 2 내지 3일마다 수행하였다.
리포펙타민 플러스 시약(Lipofectamine Plus Reagent, 제조원: Invitrogen GmbH)을 CHO-DG44의 형질감염을 위해 사용하였다. 각각의 형지감염 혼합물의 경우, 플라스미드-DNA 1㎍, 리포펙타타민 4㎕ 및 플러스 시약 6㎕를 제조업자의 지시에 따라서 전부 함께 혼합하고, 200㎕의 용적으로 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지 0.8mL 중의 대수적으로 증식하는 6 x105개의 CHO-DG44 세포에 첨가하였다. 37℃에서 세포 항온처리기에서 3시간 동안 항온처리한 후, HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지 2mL를 첨가하였다. NPT-기본 선별을 위해, 세포를 형질전환 2일 후 G418을 함유한 HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지로 옮기고 배지를 3 내지 4일마다 교체하였다. 일반적으로, G418 400㎍/mL를 선별을 위해 첨가하고, 일부 실험적 연속물에서 농도를 200㎍/mL로 저하시키거나 500, 600 또는 800㎍/mL로 상승시켰다. 한 발현 벡터는 DHFR을 함유하고 나머지 발현 벡터는 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 선별 마커를 함유하는 공형질감염의 경우에 DHFR-기본 및 NPT-기본 선별시, 세포를 형질감염 2일 후, 하이포크산틴 및 티미딘을 첨가하지 않은 CHO-S-SFMII 배지로 옮기고 또한 G418 (Invitrogen)를 400㎍/mL의 농도로 상기 배지에 첨가하였다.
통합된 이종 유전자의 DHFR-기본 유전자 증폭은 선별제 MTX(Sigma, Deisenhofen, DE)를 5 내지 2000nM의 농도로 HT-비함유 CHO-S-SFMII 배지에 첨가하여 수득할 수 있다.
2. 발현 벡터
발현을 분석하기 위해, pAD-CMV 벡터[참조: Werner et al., 1998]에 기초하고 CMV 인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터(WO 97/15664)를 조합하여 이종 유전자의 항상성 발현을 매개하는 진핵 발현 벡터를 사용하였다. 기본 벡터 pBID는 증폭가능한 선별 마커(cf e.g. EP-0-393-438)로서 작용하는 dhfr-미니유전자를 함유하며, 벡터 pBIN에서 dhfr-미니유전자는 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 내성 유전자로 대체되었다(도 1). 이러한 목적으로, SV40 조기 프로모터 및 TK-폴리아데닐화 시그날을 포함하여 선별가능한 마커 네오마이신-포스포트랜스퍼라제를 시판되는 플라스미드 pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, CA, USA)로부터 1640bp Bsu36I 단편으로서 분리하였다. 클레노우(Klenow)-DNA 폴리머라제를 사용하여 단편의 말단을 충전시키는 반응 후, 단편을 역시 클레노우-DNA-폴리머라제로 처리한 벡터 pBID의 3750bp Bsu36I/StuI 단편과 연결시켰다.
이시스트론성 기본 벡터 pBIDG(도 1)에서, IRES-GFP 유전자 영역은 벡터 pIRES2-EGFP(제조원: Clontech, Palo Alto, CA, USA)로부터 분리하여 벡터 pBID내의 CMV 인핸서/프로모터의 제어하에 놓이도록 하여, 프로모터 영역과 IRES-요소 사이의 다중 클로닝 부위를 유지시켰다. 다음의 과정을 사용하였다. 플라스미드 pIRES2-EGFP가 주형으로서 작용하는 PCR 돌연변이유발에서, IRES 서열내의 HindIII 절단 부위 AAGCTT를 돌연변이유발성 프라이머를 사용하여 서열 ATGCTT로 전환시켜 제거하였다. 다른 한편으로는, IRES 서열의 5' 말단에 대해 상보성을 갖는 프라이머를 사용하여 XbaI 절단부위를 삽입시키거나, GFP 서열의 3' 말단에 대해 상보성을 갖는 프라이머를 사용하여 SpeI 절단 부위를 도입시켰다. 완전한 IRES 및 GFP 서열을 함유한 생성된 PCR 단편을 XbaI 및 SpeI를 사용하여 분해시키고 벡터 pBID의 다중 클로닝 부위의 3' 말단에 있는 단일 XbaI 절단 부위로 클로닝하였다. 동일한 방식으로 벡터 pIRES2-EGFP로부터의 IRES-GFP 유전자 영역을 벡터 pBIN 내의 CMV 인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터의 제어하에 놓이도록 하였다. 이로써 이시스트론성 기본 벡터 pBING가 제조되었다(도 1).
사람 MCP-1 cDNA[참조: Yoshimura et al., 1989]를 0.3kb HindIII/EcoRI 단편으로서 벡터 pBIN의 상응하는 절단 부위로 클로닝하여, 벡터 pBIN-MCP1를 수득하였다(도 2A).
모노클로날 사람화 IgG2 항체를 발현시키기 위해, 중쇄를 1.5kb BamHI/HindIII 단편으로서, BamHI 및 HindIII를 사용하여 분해시킨 벡터 pBID 또는 pBIDG로 클로닝하여 벡터 pBID-HC 또는 pBIDG-HC를 수득하였다(도 2B). 다른 한편으로, 경쇄를 0.7kb BamHI/HindIII 단편으로서 벡터 pBIN 또는 pBING의 상응하는 절단 부위로 클로닝하여 벡터 pBIN-LC 또는 pBING-LC(도 2B)를 수득하였다.
3. FACS
유세포측정 분석 및 분류를 쿨터 에픽스 알트라 장치(Coulter Epics Altra device)를 사용하여 수행하였다. FACS에 여기 파장이 488nm인 헬륨-아르곤 레이저를 장착하였다. 형광 광도는 첨부된 소프트웨어 Coulter Expo32에 의해 형광 단백질 및 과정에 적합한 파장에서 흡수된다. 분류는 일반적으로 8000 내지 10000회 이벤트/초의 비율로 수행한다. 현탁된 세포는 원심분리하고(180xg에서 5분) HBSS 중의 1 내지 1.5 x107/mL의 세포 농도로 조정할 수 있다. 이어서, 세포를 형광 단백질 시그날에 따라서 분류할 수 있다. 세포를 이미 배양 배지를 함유하는 시험관에 용해시킨 다음, 원심분리하고, 분류된 세포의 수에 따라서 적합한 배양 용기로 씨딩하거나 미세역가 플레이트에 직접 침착시켰다.
4. ELISA
안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포의 상청액 중의 MCP-1 역가를 제조업자의 지시(BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, DE)에 따라서 OptEIA Human MCP-1 Set 키트를 사용하여 ELISA로 정량화하였다.
안정하게 형질감염된 CHO-DG44 세포로부터의 상청액 중의 IgG2 mAb를, 한편으로는 염소 항-사람 IgG Fc 단편(Dianova, Hamburg, DE)을, 다른 한편으로는 AP-접합된 염소 항-사람 카파 경쇄 항체(Sigma)를 사용하여 표준 공정[참조; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, updated]에 따라서 ELISA로 정량화하였다. 생산성(pg/세포/일)을 수학식: pg/((Ct-Co)t/ln(Ct-Co))[여기서, Co 및 Ct는 각각 씨딩 및 수거시의 세포 계수이고, t는 배양 시간이다]에 의해 계산하였다.
5. NPT 효소 활성을 측정하기 위한 돗트 검정
문헌[참조: Duch et al., 1990]의 방법에 따라서 세포 추출물을 제조하기 위해, 6x106개 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 추출 완충액(0.135 M Tris-HCl pH 6.8, 20% 글리세롤, 4 mM 디티오트레이톨) 600㎕ 중에 재현탁시켰다. 드라이 아이스조 또는 수조 내에서 4회의 동결 및 해동 사이클 후에, 세포 파편을 원심분리하여 제거하고, 상청액을 후속적 효소 검정을 위해 사용하였다. 세포 추출물 중의 단백질 농도를 BSA를 표준 단백질로 하여[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, 개정판] BIO-RAD 단백질 검정(Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, DE)을 사용하여 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 측정하였다. NPT 효소 활성을 측정하기 위해, 문헌[참조: Platt et al. 1987]의 프로토콜에 기초하여 돗트 검정을 수행하였다. 이를 위해, 단백질 5㎍, 2.5㎍ 및 1.25㎍를 추출 완충액을 사용하여 최종 용적 20㎕으로 조정하고, 비-형질감염된 CHO-DG44 세포로부터의 추출물을 이용하여 전체 단백질 함량이 5㎍이 되도록 하였다. 검정 완충액 200㎕(67mM Tris-HCl pH 7.1, 42mM MgCl2, 400mM NH4Cl) +/- 40㎍/mL G418 및 +/- 5μCi[-33P]-ATP/mL(NEN)을 첨가한 후, 추출물을 27℃에서 135분 동안 항온처리하였다. 이어서, 추출물을 96웰 진공 매니폴드(Schleicher & Schulll, Dassel, DE)에서 Whatman 3MM 종이, P81 포스포셀룰로스 막(Whatman Laboratory Division, Maidstone, Great Britain) 및 니트로셀룰로스 막(Schleicher & Schull)의 한 층의 샌드위치를 통해서 여과하였다. 단백질 키나제에 의해 인산화된 단백질 및 비인산화된 단백질은 니트로셀룰로스에 결합되는 반면, 인산화된 G418은 니트로셀룰로스를 통과하여 포스포셀룰로스에 결합한다. 탈이온화 H2O로 3회 세척한 후, 막을 당해 장치로부터 제거하고 다시 H2O로 세척한 다음, 공기-건조시켰다. 방사성 시그날을 방사형광분석기(Phospho Imager)(Molecular Dynamics, Krefeld, DE)를 사용하여 정량화하였다.
6. 노던 블롯 분석
전체 RNA를 제조업자의 지시(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE)에 따라서 TRIZOL 시약을 사용하여 세포로부터 분리시키고, 글리옥살/DMSO-변성된 RNA에 대한 표준 공정[참조; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, 개정판]에 따라서 겔 전기영동으로 30㎍ RNA를 분리시켜 Hybond N+ 나일론 막(Amersham Biosciences, Freiburg, DE)으로 옮겼다. GeneImages CDP-Star 검출 키트(Amersham Biosciences)와 함께 후속적 비-방사성 하이브리드화를 위해 사용되는 프로브는 GeneImages 무작위적 프라임 표지화 키트(Amersham Biosciences, Freiburg, DE)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라서 FITC-dUTP-표지된 NPT 유전자의 암호화 영역을 포함하는 PCR 산물이었다.
7. 돗트 블롯 분석
게놈 DNA를 제조업자의 지시(DNA Isolation Kit for Cells and Tissue; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE)에 따라서 DNA 분리 키트를 사용하여 세포로부터 분리시켰다. 다양한 양의 DNA(10㎍, 5㎍, 2.5㎍, 1.25㎍, 0.63㎍ 및 0.32㎍)를 96웰 진공 매니폴드(Schleicher & Schull, Dassel, DE)를 사용하여 알칼리성 완충액 중에서 표준 방법[참조: Ausubel et al., 1994]에 의해 Hybond N+ 나일론 막(Amersham Biosciences, Freiburg, DE)으로 여과하였다. 비-형질감염된 CHO-DG44 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 플라스미드 pBIN-LC는 표준(320pg, 160pg, 80pg, 40pg, 20pg, 10pg, 5pg, 2.5pg)으로서 사용하였다. GeneImages CDP-Star 검출 키트(Amersham Biosciences)와 함께 후속적 비-방사성 하이브리드화를 위해 사용되는 프로브는 GeneImages 무작위적 프라임 표지화 키트(Amersham Biosciences, Freiburg, DE)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라서 FITC-dUTP-표지된 NPT 유전자의 암호화 영역을 포함하는 PCR 산물이었다. 화학발광 시그날을 ImageMaster VDS-CL(Amersham Biosciences)를 사용하여 정량화하였다. 이어서, 해당 세포내의 npt 유전자의 카피수를 역가 측정된 플라스미드 DNA의 시그날 강도로부터 수득된 표준 연속물을 사용하여 측정하였다. 플라스미드 분자의 수는 아보가드로 상수를 사용하여 계산하고, CHO 세포의 DNA 함량을 약 5pg이라 고려하였다.
실시예 1: 네오마이신-포스포트랜스퍼라제의 돌연변이유발
NPT 돌연변이체 Glu182Gly(서열 번호 3), Trp91Ala(서열 번호 5), Val198Gly(서열 번호 7), Asp227Ala(서열 번호 9), Asp227Val(서열 번호 11), Asp261Gly(서열 번호 13), Asp261Asn(서열 번호 15) Phe240Ile(서열 번호 17), Glu182Asp(서열 번호 19), Asp227Gly(서열 번호 21), Asp190Gly(서열 번호 23) 및 Asp208Gly(서열 번호 25)를 제조하는데 필요한 야생형 NPT-유전자내의 염기 치환을 돌연변이유발성 프라이머를 사용한 PCR에 의해 수행하였다(도 3). 벡터 pBIN (도 1) 또는 pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, USA)를 PCR 돌연변이유발을 위한 주형으로서 사용하였다. 먼저, 돌연변이체의 5' 또는 3' 절편을 별도의 PCR 작업으로 제조 하였다. 돌연변이체 Glu182Gly, Glu182Asp, Trp91Ala, Asp190Gly, Val198Gly, Asp208Gly 및 Asp227Gly를 제조하기 위해, Neofor5(서열 번호 27) 및 관련 돌연변이유발 역방향(rev) 프라이머 또는 Neorev5(서열 번호 28) 및 관련 돌연변이유발 정방향(for) 프라이머로 이루어진 프라이머 배합물을 증폭을 위해 사용하였다:
- NPT 돌연변이체 Glu182Gly(서열 번호 3)의 경우, Neofor5(서열 번호 27) 와 E182Grev(서열 번호 32) 또는 Neorev5(서열 번호 28)와 E182Gfor(서열 번호 31)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Glu182Asp(서열 번호 19)의 경우, Neofor5(서열 번호 27)와 E182Drev(서열 번호 48) 또는 Neorev5(서열 번호 28)와 E182Dfor(서열 번호 47)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Trp91Ala(서열 번호 5)의 경우, Neofor5(서열 번호 27)와 W91Arev(서열 번호 34) 또는 Neorev5(서열 번호 28)와 W91Afor(서열 번호 33)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Val198Gly(서열 번호 7)의 경우, Neofor5(서열 번호 27)와 V198Grev(서열 번호 36) 또는 Neorev5(서열 번호 28)와 V198Gfor(서열 번호 35)의 배합물
- NPT 돌연변이체 Asp190Gly(서열 번호 23)의 경우, Neofor5(서열 번호 27)와 D190Grev(서열 번호 50) 또는 Neorev5(서열 번호 28)와 D190Gfor(서열 번호 49)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Asp208Gly(서열 번호 25)의 경우, Neofor5(서열 번호 27) 와 D208Grev(서열 번호 52) 또는 Neorev5(서열 번호 28)와 D208Gfor(서열 번호 51)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Asp227Gly(서열 번호 21)의 경우, Neofor5(서열 번호 27) 와 D227Grev(서열 번호 54) 또는 Neorev5(서열 번호 28)와 D227Gfor(서열 번호 52)의 배합물.
돌연변이체 Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn 및 Phe240Ile를 제조하기 위해, Neofor2(서열 번호 29)와 관련 돌연변이유발 역방향(rev) 프라이머 또는 IC49(서열 번호 30)와 돌연변이유발 정방향(for) 프라이머로 이루어진 프라이머 배합물을 증폭을 위해 사용하였다:
- NPT 돌연변이체 Asp227Ala(서열 번호 9)의 경우, Neofor2(서열 번호 29)와 D227Arev(서열 번호 38) 또는 IC49(서열 번호 30)와 D227Afor(서열 번호 37)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Asp227Val(서열 번호 11)의 경우, Neofor2(서열 번호 29)와 D227Vrev(서열 번호 40) 또는 IC49(서열 번호 30)와 D227Vfor(서열 번호 39)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Asp261Gly(서열 번호 13)의 경우, Neofor2(서열 번호 29)와 D261Grev(서열 번호 42) 또는 IC49(서열 번호 30)와 D261Gfor(서열 번호 41)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Asp261Asn(서열 번호 15)의 경우, Neofor2(서열 번호 29)와 D261Nrev(서열 번호 44) 또는 IC49(서열 번호 30)와 D261Nfor(서열 번호 43)의 배합물;
- NPT 돌연변이체 Phe240Ile(서열 번호 17)의 경우, Neofor2(서열 번호 29)와 F240Irev(서열 번호 46) 또는 IC49(서열 번호 30)와 F240Ifor(서열 번호 45)의 배합물.
이어서, 해당 돌연변이체의 5' 절편의 암호화 쇄 및 3' 절편의 상보적 쇄를 돌연변이유발성 프라이머 서열에 의해 형성된 중첩 영역내에서 하이브리드화에 의해 조합하고, 일본쇄 영역을 충전시키고 전체 산물을 프라이머 Neofor5(서열 번호 27)와 Neorev5(서열 번호 28) 또는 Neofor2(서열 번호 29)와 IC49(서열 번호 30)를 사용하여 PCR로 다시 증폭시켰다. 이들 PCR 산물을 StuI/RsrII(돌연변이체 Glu182Gly, Trp91Ala 및 Val198Gly의 Neofor5/Neorev5 PCR-산물), StuI/BstBI (돌연변이체 Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly 및 Asp227Gly의 Neofor5/Neorev5 PCR 산물) 또는 DraIII/RsrII(돌연변이체 Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn 및 Phe240Ile의 Neofor2/IC49 PCR-산물)을 사용하여 분해시켰다. 이어서, 벡터 pBIN-LC(도 2B) 또는 야생형 NPT 서열의 pBK-CMV(Stratagene, La Jolla, USA) 부분을 StuI/RsrII 분해, DraIII/RsrII 분해 또는 StuI/BstBI 분해로 제거하고 PCR 산물의 상응하는 단편으로 대체시켰다. 상보적 쇄 및 암호화쇄 둘다를 서열 분석하여 다양한 돌연변이체내의 목적하는 염기 치환을 확인하여, 잔류하는 DNA 서열이 야생형 NPT 서열에 상응한다는 것을 보장하였다. 이러한 방식으로 발현 벡터 pBIN1-LC, pBIN2-LC, pBIN3-LC, pBIN4-LC, pBIN5-LC, pBIN6-LC, pBIN7-LC 및 pBIN8-LC를 생성시켰고, 이는 NPT 돌연변이체 Glu182Gly, Trp91Ala, Val198Gly, Asp227Ala, Asp227Val, Asp261Gly, Asp261Asn 또는 Phe240Ile를 함유하였다(도 2B).
나머지 NPT 돌연변이체를 1640bp Bsu36I 단편으로서 변형된 pBK-CMV로부터 분리시키고, 단편 말단을 클레노우-DNA 폴리머라제를 이용하여 충전시키고, 역시 클레노우-DNA 폴리머라제로 처리한 벡터 pBID의 3750bp Bsu36I/StuI 단편과 연결시켰다. 이러한 방식으로, 발현 벡터 pKS-N5, pKS-N6, pKS-N7 및 pKS-N8을 생성시켰으며, 이들은 각각 NPT 돌연변이체 Glu182Asp, Asp190Gly, Asp208Gly 및 Asp227Gly를 함유하였다. 이어서, 사람 MCP-1 cDNA를 0.3kb HindIII/EcoRI 단편으로서 이들 발현 벡터내로 클로닝하거나(도 2A), 사람화 IgG2 항체의 경쇄를 0.7 kb HindIII/BamHI 단편으로서 이들 발현 벡터내로 클로닝하였다(도 2B).
한편으로, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 삽입된 돌연변이는 보존된 도메인, 예를 들어, 모티프 1, 2 및 3[참조: Shaw et al., 1993]을 플랭킹하는 보다 보존된(Val198Gly, Phe240Ile) 또는 덜 보존된(Trp91Ala, Glu182Gly, Glu182Asp, Asp227Ala, Asp227Val, Asp227Gly) 아미노산의 치환이다. 다른 한편으로, 돌연변이는 보존된 모티프 1(Asp190Gly), 2(Asp208Gly) 또는 3(Asp261Gly, Asp261Asn)내에 위치하며 보존된 아미노산과 관련된다.
실시예 2: 안정하게 형질감염된 MCP-1 발현 세포의 선별에 대한 NPT 돌연변이의 영향
MCP를 CHO 세포에서 단일쇄 단백질의 발현 예로서 사용되었다. 이를 위해, CHO-DG44를 pKS-N5-MCP1, pKS-N6-MCP1, pKS-N7-MCP1, pKS-N8-MCP1 또는 pBIN-MCP1로 형질감염시켰다(도 2A). 2회의 이중 제조를 수행하였다. 형질감염 2일 후, 세포를 96웰-플레이트(2000개 세포/웰)에 씨딩하고, HT-보충된 CHO-S-SFMII 배지에서 G418 400㎍/mL를 사용하여 선별하였다. pBIN-MCP1로 형질감염된 세포의 경우에, 선별을 G418 800㎍/mL와 병행하여 또한 수행하였다. 수득된 세포 집단을 24웰 플레이트를 통해서 6웨 플레이트로 연속적으로 옮겼다. 선별기 동안에도 다양한 형질감염 혼합물 간에 차이가 검출되었다. 선별이 NPT 야생형 유전자(서열 번호 1)로 수행된 세포 집단과 대조적으로, 돌연변이된 NPT로 형질감염된 세포 집단에서는 보다 소수의 세포가 G418에 의한 초기 선별에서 생존하였다. 따라서, 이러한 세포 집단을 약 4일 후에 24우레 플레이트로 옮길 수 있었다. pKS-N6-MCP1 및 pKS-N7-MCP1로 형질감염된 혼합물에서, 안정하게 형질감염된 어떠한 세포라도 400㎍/mL 농도의 G418에서 선별될 수 없었다. 아마도, 효소 기능이 돌연변이 Asp190Gly 및 Asp208Gly를 갖는 NPT 돌연변이체에서 매우 심하게 손상되어, 안정하게 형질감염된 세포의 성장을 가능하게 하는 정도로 충분한 G418 분자가 불활성화될 수 없기 때문일 것이다. 명백히, G418 농도를 200㎍/mL로 감소시킨 경우, 소수의 세포만이 제1 선별기에서 생존하였지만, 이들 세포는 모두 이의 성장과 생존이 심각하게 손상되었으며, 돌연변이체 Asp208Gly의 경우에서 소수의 예외를 제외하고는 증식은 불가능하였다.
돌연변이체 Glu182Asp 및 Asp227Gly 또는 NPT 야생형로 형질감염된 세포로부터 18개의 풀을 6웰 플레이트에서 4회 계대 배양하고(혼합물 1 및 2 각각의 9개의 풀), 생산된 MCP-1의 농도를 ELISA에 의해 세포 배양 상청액 중에서 측정하였다. NPT 돌연변이체가 선별 마커로서 사용된 세포 풀은 G418 400 또는 심지어 800㎍/mL에서, 선별을 NPT 야생형을 사용하여 수행한 세포 풀에 비해서 평균적으로 50% 내지 57%(Glu182Asp 돌연변이체) 또는 57% 내지 65%(Asp227Gly 돌연변이체) 높은 생산성을 나타냈다(도 5). 따라서, 선별 마커로서 NPT 돌연변이체를 사용하여 형질감염된 세포 집단내의 고 생산자의 비율을 실질적으로 증가시킬 수 있다.
실시예 3: 안정하게 형질감염된 mAb 발현 세포의 선별에 대한 NPT 돌연변이의 영향
공형질감염에서, CHO-DG44 세포를 먼저 플라스미드 조합물 pBIDG-HC/pBIN-LC (NPT 야생형), pBIDG-HC/pKS-N5-LC(Glu182Asp NPT 돌연변이체) 또는 pBIDG-HC/pKS-N8-LC(Asp227Gly NPT 돌연변이체)(도 2B)로 형질감염시켰다. 사용되는 벡터 배위에서, 사람화 IgG2 항체의 두 단백질 쇄는 각각 개별적 전사 단위로서 DHFR 또는 네오마이신 선별 마커를 추가로 암호화하는 자체의 벡터에 의해 발현된다. 유전자 산물의 발현은 CMV-인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 조합물에 의해 매개된다. 그러나, 예를 들어, CMV 인핸서/프로모터, SV40 인핸서/햄스터 유비퀴틴/S27a 프로모터 또는 다른 프로모터 조합물을 사용하여 필적하는 데이타를 수득할 수도 있다.
전체적으로, 4회의 일련의 형질감염을 각 경우에 플라스미드 조합물당 6개의 풀을 사용하여 수행하였다. 선별을 NPT 야생형 유전자를 사용하여 수행한 세포 집단과는 별도로, 돌연변이된 NPT로 형질감염된 세포 집단에서는 보다 소수의 세포만 이 G418에 의한 초기 선별에서 생존하였다. G418 400㎍/mL가 첨가된 HT-비함유 CHO-S-SFMII 배지에서 형질감염된 세포 풀을 2주 내지 3주 동안 선별한 후, 세포 배양 현탁액 중의 항체 역가를 전체 몇회(6 내지 8)에 걸쳐서 ELISA로 측정하였다. 선별 마커로서 NPT 야생형 유전자의 사용과 비교하여, Glu182Asp 돌연변이체를 사용하여 선별한 세포는 평균적으로 각각 86% 및 77%의 생산성 및 역가 증가를 나타냈으며, Asp227Gly 돌연변이체를 사용하여 선별한 세포는 심지어, 각각 126% 및 107%의 생산성 및 역가 증가를 나타냈다. 따라서, 효소 활성이 감소된 NPT 돌연변이체를 사용하여 기본 생산성이 최대 2배 높은 세포를 선택적으로 증대시킬 수 있었다.
다른 일련의 형질감염에서는 선별에 대한 상이한 농도의 G418의 영향을 시험하였다. 400, 500 및 600㎍/mL의 G418을 각 경우에 3개의 풀로 하여 형질감염된 세포 풀의 선별을 위해 사용하였다. 보다 고 농도에서, 현저하게 적은 수의 세포가 세포 집단에서 선별에서 생존하였으며, 선별은 NPT 야생형 유전자를 사용하여 수행하였으며, 이때 그 효과는 Asp227Gly 돌연변이체를 사용한 경우에 가장 컸다. 그러나, 수득된 안정하게 형질감염된 세포는 성장 및 생존에 있어 어떠한 저하도 나타내지 않았다. 그러나, 형질감염을 위해 사용된 플라스미드 조합물에서 달성된 생산성 및 역가 간에 현저한 차이는 수득되지 않았다. 그러나, 여기서도 NPT 돌연변이체를 이용하여 다시 선별한 세포는 평균적으로 생산성이 가장 높았는데, 생산성은 NPT 야생형의 생산성 보다 4배 더 높은 Asp227Gly 돌연변이체의 경우에 가장 높으며, 그 다음으로 생산성이 2.4배 높은 Glu182Asp 돌연변이체가 높다(도 6A).
이어서, 공형질감염에서 CHO-DG44 세포를 플라스미드 조합물 pBIDG-HC/pBIN-LC(NPT 야생형), pBIDG-HC/pBIN1-LC(Glu182Gly NPT 돌연변이체), pBIDG-HC/pBIN2-LC(Trp91Ala NPT 돌연변이체), pBIDG-HC/pBIN3-LC(Val198Gly NPT 돌연변이체), pBIDG-HC/pBIN4-LC(Asp227Ala), pBIDG-HC/pBIN5-LC(Asp227Val NPT 돌연변이체), pBIDG-HC/pBIN6-LC (Asp261Gly NPT 돌연변이체), pBIDG-HC/pBIN7-LC(Asp261Asn NPT 돌연변이체) 또는 pBIDG-HC/pBIN8-LC(Phe240Ile NPT 돌연변이체)(도 2B)로 형질감염시켰다. 사용되는 백터 배위에서는, 다시 모노클로날 사람화 IgG2 항체의 두 단백질 쇄를 각각 개별적 전사 단위로서 DHFR 또는 네오마이신 선별 마커를 추가로 암호화하는 자체의 벡터에 의해 발현시켰다.
각각의 플라스미드 조합물에 있어, 5개의 풀을 형질감염시켰다. 선별을 NPT 야생형 유전자를 사용하여 수행한 세포 집단과는 대조적으로, 돌연변이된 NPT로 형질감염된 세포 집단에서는 보다 소수의 세포만이 G418에 의한 초기 선별에서 생존하였다. G418 400㎍/mL가 첨가된 HT-비함유 CHO-S-SFMII 배지에서 형질감염된 세포 풀을 2주 내지 3주 동안 선별한 후, 세포 배양 현탁액 중의 항체 역가를 6회에 걸쳐서 ELISA로 측정하였다. 도 6B는 시험한 풀로부터 측정된 역가와 생산성의 평균을 나타낸 것이다. 선별 마커로서 NPT 야생형 유전자의 사용과 비교하여, NPT 돌연변이체를 사용하여 선별한 모든 세포 풀은 각각 평균적으로 1.4 내지 14.6 및 1.4 내지 10.8의 인자만큼의 생산성 및 역가 증가를 나타냈다. 따라서, 평균 생산성이 각각 14.6 및 9.3의 인자만큼 증가한 NPT 돌연변이체 Asp227Val 및 Asp261Gly를 사용한 경우에 기본 생산성이 가장 높은 세포의 가장 우수한 선택적 증대가 수 득되었다.
벡터 pBIDG-HC는 또 다른 선별 마커인 GFP를 함유한다. GFP는 IRES 요소를 통해 중쇄에 전사적으로 연결된다. 따라서, 생성된 표적 단백질과 선별가능한 마커 GFP의 발현 간의 상관관계로 인해 형질감염된 세포 집단의 발현 수준의 수준 및 분포를 FACS 분석으로 측정된 GFP 형광에 기초하여 신속하게 평가할 수 있다. G418이 첨가된 HT-비함유 CHO-S-SFMII 배지에서 형질감염된 세포 풀을 2주 내지 3주 동안 선별한 후, GFP 형광을 FACS 분석으로 측정하였다(도 7). GFP 형광 시그날은 사실 모노클로날 IgG2 항체에 대해 수득된 역가 데이타와 상관관계가 있다. NPT 돌연변이체 Asp227Val, Asp261Gly, Asp161Asn 및 Phe240Ile를 사용하여 선별된 풀은 또한 높은 GFP 형광을 갖는 세포의 비율이 보다 높았으며, 그 다음으로 NPT 돌연변이체 Trp91Ala, Asp227Ala, Asp227Gly, Gly182Asp, Glu182Gly 및 Val198Gly를 사용하여 선별된 세포가 높았다.
선별제 메토트렉세이트(MTX)를 배양 배지에 첨가하여, dhfr-매개된 유전자 증폭을 유도함으로써 세포의 생산성을 추가로 증가시킬 수 있었다. 따라서, 예를 들어, 100nM MTX를 이용한 단일 유전자 증폭 단계 후에, 플라스미드 조합물 pBIDG-HC/pBIN5-LC(NPT 돌연변이체 Asp227Val), pBIDG-HC/pBIN6-LC(NPT 돌연변이체 Asp261Gly), pBIDG-HC/pBIN7-LC(NPT 돌연변이체 Asp261Asn) 및 pBIDG-HC/pBIN8-LC (NPT 돌연변이체 Phe240Ile)과의 공형질감염에 의해 수득된 세포 풀에서의 비생산성(specific productivity)은 2 내지 4의 인자만큼 증가할 수 있었으며, 풀에 따라서 4 내지 14pg/세포/일의 생산성이 달성될 수 있었다. 도 8은 예를 통해, pBIDG-HC/pBIN5-LC(NPT 돌연변이체 Asp227Val)의 공형질감염으로 수득된 세포 풀에서 MTX(100nM MTX에 이어서500 nM MTX)를 첨가함으로써 생산성이 27pg/세포/일로 증가되었음을 나타낸다.
실시예 4: NPT 효소 활성의 측정 및 비교
NPT 돌연변이체의 효소 활성과 NPT 야생형의 효소 활성을 비교하기 위해, 돗트 검정을 수행하여 세포 추출물 중의 NPT 활성을 문헌[참조: Platt et al. 1987]의 프로토콜에 기초하여 측정하고, 예로서 NPT 돌연변이체 Glu182Asp 및 Asp227Gly에 대해 도 9A에 제시한다. 세포 추출물은 NPT 야생형 유전자(서열 번호 1) 또는 NPT 돌연변이체 Glu182Gly(서열 번호 3), Glu182Asp(서열 번호 19), Trp91Ala(서열 번호 5), Asp190Gly(서열 번호 23), Val198Gly(서열 번호 7), Asp208Gly(서열 번호 25), Asp227Ala(서열 번호 9), Asp227Val(서열 번호 11), Asp227Gly(서열 번호 21), Asp261Gly(서열 번호 13), Asp261Asn(서열 번호 15) 또는 Phe240Ile(서열 번호 17)로 형질감염시켜 선별한 2개의 상이한 mAb-발현 세포 풀로부터 제조하였다. 비형질감염된 CHO-DG44 세포로부터의 세포 추출물은 음성 대조군으로서 사용하였다.
NPT 돌연변이체의 효소 활성은 NPT 야생형과 비교하여 현저하게 감소되었다. 평균적으로 NPT 돌연변이체는 야생형 효소 활성의 단지 1.5% 내지 62%만을 가진 반면에, 3.1% 및 1.5%를 갖는 NPT 돌연변이체 Asp261Gly 및 Asp261Asn은 가장 낮은 잔류 활성을 가졌으며 61.9% 및 53.2%를 갖는 NPT 돌연변이체 Val198Gly 및 Trp91Ala는 가장 높은 잔류 활성을 가졌다(도 9B). 포스포셀룰로스상에서 수득된 시그날은 NPT 효소 활성에 의해 유발된 G418의 인산화에 대해 특이적이었다. NPT 기질 G418을 검정 완충액에 첨가하지 않은 경우 포스포셀룰로스상에서 활성이 검출될 수 없었다. 세포 추출물내의 단백질 키나제에 의해 인산화된 단백질로부터 초래된, 니트로셀룰로스 막상에서 수득된 시그날은 동량의 적용된 샘플에 대한 내부 대조군으로서 사용하였다.
NPT 야생형과 비교하여 감소된 NPT 돌연변이체의 효소 활성은 감소된 유전자 발현 때문이라고 할 수 없었다. 대조적으로, 전체 RNA에 대한 대한 노던 블롯 분석은 NPT 야생형으로 형질감염되고 높은 NPT 효소 활성을 나타낸 세포 풀이 NPT 돌연변이체로 형질감염된 세포 풀에 비해서 RNA를 덜 발현했음을 보여주었다(도 10). 오직 예외는 NPT 돌연변이체 Glu 182Gly로 형질감염되었고 유사한 양의 NPT-mRNA를 발현한 세포였다. 이들 형질감염된 세포 집단 유래의 게놈 DNA에 대해 수행한 돗트 블롯 분석에서, NPT 돌연변이체의 보다 고 발현은 유전자 용량 효과 및/또는 보다 전사-활성인 게놈 영역내로의 외인성 DNA의 통합에 의해 수득되었음이 나타났다(도 10). 예를 들어, NPT 돌연변이체 Trp91Ala를 사용하여 선별한 세포에서, 유전자 용량 효과는 풀 1에서 우세한 반면에, 풀 2에서는 통합 효과가 우세하다. 이와 같이, 감소된 효소 활성을 갖는 마커를 선별을 위해 사용한 형질전환된 세포는 동일한 선별 압력하에 선별제에 대한 감소된 내성을 보상하기에 충분한 마커 단백질을 합성할 수 있다.
실시예 5: GFP-기본 FACS 분류에 의한 mAb의 발현율이 높은 세포의 분리
공형질감염에서, CHO-DG44 세포를 모노클로날 사람화 IgG2 항체를 암호화하는 플라스미드 조합물 pBID-HC 및 pBING-LC로 형질감염시켰다(도 2B). 사용된 벡터 배위에서, 사람화 IgG2 항체의 두 단백질 쇄는 각각 개별적 전사 단위로서 DHFR 또는 네오마이신 선별 마커(Asp227Gly 돌연변이체; 서열 번호 21)를 추가로 암호화하는 자체의 벡터에 의해 발현된다. 또한, 벡터 pBING-LC는 또 다른 선별 마커인 GFP를 함유한다. IRES 요소에 의한 GFP 및 경쇄의 발현의 전사적 연결의 결과로서, 벡터 pBID-HC/pBING-L로 CHO-DG44를 공형질감염시, 순차적 FACS 분류에 의해 높은 GFP 함량을 갖는 세포를 순수히 선별함으로써 모노클로날 항체의 발현율이 높은 세포를 단시간내에 분리할 수 있었다. 전체적으로, 8개의 개별적 세포 풀을 형질감염시키고, 이로부터 처음 2주 내지 3주 후에 G418 400㎍/mL을 첨가한 HT-비함유 CHO-S-SFMII 배지에서 선별하여 안정하게 형질감염된 세포 집단을 수득하였다. 모든 8개 풀의 역가 및 생산성을 전체 수회(7 내지 8)에 걸쳐서 ELISA로 측정하였다. 평균적으로 역가는 약 1.4mg/L이었으며, 생산성은 1일당 약 1.3pg/세포였다. 후속적인 순차적 FACS-기본 분류를 위해, 가장 높은 생산성을 갖는 풀 5 및 모든 풀들의 평균에 상응하는 생산성을 갖는 풀 8을 선별하였다. 각각의 단계에서, 가장 높은 GFP 형광을 갖는 5%의 세포를 FACS로 분류하고 당해 풀에서 추가로 배양하였다. 이러한 분류는 전부 6회 이하로 수행하였으며, 세포 배양 기간은 각 분류마다 약 2주로 하였다. 놀랍게도, mAb 생산성과 GFP 형광 간에 상당한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌으며(도 13), 두 단백질 쇄가 이들의 자체 백터에 의해 GFP-기본 FACS 분류 동안 각각 발현되었으나, GFP에의 전사적 커플링의 결과로서 경쇄의 발현에 대한 선별만이 가능하였다. 생산성은 FACS-기본 분류만에 의해 9.5pg/세포/일로 증가될 수 있었다(도 11). 햄스터 프로모터를 CMV-인핸서 대신에 SV40-인핸서에 기능적으로 연결시킨 경우에 유사한 데이타가 또한 수득되었다. 1회의 후속적 MTX 증폭 단계에 의해 제1 분류 단계의 풀 5 및 8로부터 출발하여 100nM 메토트렉세이트를 선별 배지에 첨가함으로써 당해 풀들의 생산성을 20pg/세포/일을 초과하는 평균으로 증가시킬 수 있었다(도 12). 형광 단백질의 고 발현 수준은 세포 성장 및 생존성 어떠한 것에도 음성적 효과를 갖지 않았다. 유전자 증폭 동안, 특히 MTX를 보다 고 농도로 첨가하는 경우에 세포의 성장 특성도 MTX의 첨가에 의해 심각하게 부정적으로 영향을 받는다. 그러나, 예비 분류된 세포 풀은 100nM MTX의 매우 높은 초기 용량에 반응하여 상당히 보다 강한 특징들을 보여주었다. 이들 세포 풀은 선별기를 보다 잘 견디어 냈으며, 즉 단지 2주 후에 생존성이 높고 성장율이 우수한 세포 집단이 수득되었다.
또한, 고 생산성 세포를 선별하기 위한 개발 시간은 증가되는 MTX의 첨가량과 함께 일반적으로 4회의 증폭 단계를 포함하는 통상의 단계적 유전자 증폭 전략에 비해서 약 6주로 감소되었다. 이는 감소된 효소 활성을 갖는 변형된 NPT-선별 마커를 사용한 다음, GFP-기본 FACS 분류에 의해 달성된 관심대상의 유전자의 발현이 증가된 형질전환된 세포의 증대와 후속적 유전자 증폭 단계의 병용에 의해 달성되었다.
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ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 2 <211> 264 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val 1 5 10 15 Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser 20 25 30 Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe 35 40 45 Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala 50 55 60 Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val 65 70 75 80 Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu 85 90 95 Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys 100 105 110 Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro 115 120 125 Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu 145 150 155 160 Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala 165 170 175 Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys 180 185 190 Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp 195 200 205 Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala 210 215 220 Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe 225 230 235 240 Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe 245 250 255 Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 <210> 3 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: Neomycin mutant E182G <400> 3 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540 ggcggggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 4 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: Neomycin mutant E182G <400> 4 Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val 1 5 10 15 Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser 20 25 30 Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe 35 40 45 Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala 50 55 60 Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val 65 70 75 80 Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu 85 90 95 Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys 100 105 110 Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro 115 120 125 Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu 145 150 155 160 Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala 165 170 175 Ser Met Pro Asp Gly Gly Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys 180 185 190 Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp 195 200 205 Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala 210 215 220 Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe 225 230 235 240 Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe 245 250 255 Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 <210> 5 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atcaggcttg gcagaaagtg cattagctca cggagcctta tcattggcga aagctctctc 240 aagtagaaaa tcaatgtgtt tgctcatagt gcaatcatta tgtttcgaga ggggaagggt 300 acaatcgttg gggcatgtgt ggtcacatct gaatagcagt agctccctag gagaattcca 360 agttctttgg tggtgtatca atgcccttaa aggggtcaac aacttttttt ccctctgaca 420 aaactatctt cttatgtcct tgtccctcat atttgaagta ttttattctt tgcagtgttg 480 aatatcaatt ctagcacctc agacatgtta ggtaagtacc ctacaactca ggttaactaa 540 tttaatttaa ctaatttaac cccaacactt tttctttgtt tatccacatt tgtggagtgt 600 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc 660 gcgcgcgcgc gcgctcggat cattctacct tttgtttaaa aaatgttagt ccaggggtgg 720 ggtgcactgt gaaagtctga gggtaacttg ctggggtcag ttctttccac tataggacag 780 aactccaggt gtcaactctt tactgacaga accatccaaa tagccctatc taattttagt 840 tttttattta tttatttttt gtttttcgag acagggtttc tctgtggctt tggaggctgt 900 cctggaacta gctcttgtag accaggctgg tctcgaactc agagatccac ctgcctctgc 960 ctcctgagtg ctgggattaa aggcatgcgc caccaacgct tggctctacc taattttaaa 1020 agagattgtg tgtcacaagg gtgtcatgtc gccctgcaac cacccccccc ccaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa acttcactga agctgaagca cgatgatttg gttactctgg ctggccaatg 1140 agctctaggg agtctcctgt caaacagaat ctcaacaggc gcagcagtct tttttaaagt 1200 ggggttacaa cacaggtttt tgcatatcag gcattttatc taagctattt cccagccaaa 1260 aatgtgtatt ttggaggcag cagagctaat agattaaaat gagggaagag cccacacagg 1320 ttattaggaa gataagcatc ttctttatat aaaacaaaac caaaccaaac tggaggaggt 1380 ctacctttag ggatggaaga aaagacattt agagggtgca atagaaaggg cactgagttt 1440 gtgaggtgga ggactgggag agggcgcaac cgctttaact gtcctgtttt gcctattttt 1500 tggggacagc acatgttcct atttttccca ggatgggcaa tctccacgtc caaacttgcg 1560 gtcgaggact acagtcattt tgcaggtttc cttactgtat ggcttttaaa acgtgcaaag 1620 gtgaccatta accgtttcac gctgggaggg cacgtgcggc tcagatgctt cctctgactg 1680 agggccagga gggggctaca cggaagaggc cacacccgca cttgggaaga ctcgatttgg 1740 gcttcagctg gctgagacgc cccagcaggc tcctcggcta caccttcagc cccgaatgcc 1800 ttccggccca taacccttcc cttctaggca tttccggcga ggacccaccc tcgcgccaaa 1860 cattcggccc catcccccgg tcctcacctg aatctctaac tctgactcca gagtttagag 1920 actataacca gatagcccgg atgtgtggaa ctgcatcttg ggacgagtag ttttagcaaa 1980 aagaaagcga cgaaaaacta caattcccag acagacttgt gttacctctc ttctcatgct 2040 aaacaagccc cctttaaagg aaagcccctc ttagtcgcat cgactgtgta agaaaggcgt 2100 ttgaaacatt ttaatgttgg gcacaccgtt tcgaggaccg aaatgagaaa gagcataggg 2160 aaacggagcg cccgagctag tctggcactg cgttagacag ccgcggtcgt tgcagcgggc 2220 aggcacttgc gtggacgcct aaggggcggg tctttcggcc gggaagcccc gttggtccgc 2280 gcggctcttc ctttccgatc cgccatccgt ggtgagtgtg tgctgcgggc tgccgctccg 2340 gcttggggct tcccgcgtcg ctctcaccct ggtcggcggc tctaatccgt ctcttttcga 2400 atgtag 2406

Claims (47)

  1. 야생형 유전자를 기준으로 아미노산 91번, 198번 및 240번 위치 중의 1개의 위치, 2개의 위치 또는 3개의 위치에서 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자와 상이한 아미노산을 암호화함을 특징으로 하는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 의해 암호화되는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 비해 낮은 효소 활성을 가짐을 특징으로 하는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 야생형 유전자를 기준으로 아미노산 91번 위치의 알라닌, 아미노산 198번 위치의 글리신 및 아미노산 240번 위치의 이소류신 중에서 1개의 위치, 2개의 위치 또는 3개의 위치에서 해당 아미노산을 암호화함을 특징으로 하는, 야생형 유전자와 비교하여 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 18에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화함을 특징으로 하는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 5, 서열 번호 7 또는 서열 번호 17에 따른 서열을 함유하거나 이러한 서열로 이루어진 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  6. 야생형 유전자를 기준으로 아미노산 182번 위치에서 글리신, 아미노산 227번 위치에서 알라닌 또는 발린, 또는 아미노산 261번 위치에서 글리신, 또는 이들의 조합을 암호화함을 특징으로 하는, 야생형 유전자와 비교하여 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 4, 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화함을 특징으로 하는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 서열 번호 3, 서열 번호 9, 서열 번호 11 또는 서열 번호 13에 따른 서열을 함유하거나 이러한 서열로 이루어진 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자.
  9. 제1항에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 의해 암호화되는 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제.
  10. 제1항에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 진핵 발현 벡터.
  11. 이종 프로모터에 기능적으로 연결된 관심대상의 이종 유전자 및 야생형 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 비교하여 보다 낮은 효소 활성을 갖는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 암호화하는 제1항에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 진핵 발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14 또는 서열 번호 18에 따른 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 프로모터 또는 프로모터들에 기능적으로 연결된 하나 이상의 인핸서(enhancer)를 함유함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 인핸서가 사이토메갈로바이러스 (CMV) 또는 시미안 바이러스 40 (SV40) 인핸서임을 특징으로 하는 발현 벡터.
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 햄스터로부터 유래된 유비퀴틴과 S27a의 융합유전자의 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 관심대상의 이종 유전자가 유비퀴틴과 S27a의 융합유전자의 프로모터의 제어하에 있음을 특징으로 하는 발현 벡터.
  17. 제11항 또는 제12항에 있어서, 임의로 관심대상의 유전자 및 이종 프로모터에 기능적으로 연결되거나 연결될 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 추가로 함유함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 이종 프로모터의 제어하에, 형광 단백질을 암호화하는 유전자와 관심대상의 단백질을 암호화하는 유전자의 이시스트론(bicistronic) 발현을 가능하게 하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 함유함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 하나 또는 2개의 개별적 전사 단위내에 위치함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  20. 제1항, 제2항, 제6항 또는 제7항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 함유하는 포유동물 세포.
  21. 제11항 또는 제12항에 따른 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포.
  22. 제17항에 따른 발현 벡터로 형질감염된 포유동물 세포.
  23. 제20항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커 유전자로 추가로 형질감염되었음을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  24. 제23항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커 유전자가 디하이드로폴레이트-리덕타제(DHFR)임을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  25. 제20항에 있어서, 설치류 세포임을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  26. 제25항에 있어서, 설치류 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포임을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  27. (i) 포유동물 세포의 풀(pool)을, 제1항, 제2항, 제6항 또는 제7항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 유전자로 형질감염시키고;
    (ii) (i)의 포유동물 세포를, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있는 조건하에 배양하고;
    (iii) (ii)의 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양함을 특징으로 하여, 포유동물 세포를 증대시키는 방법.
  28. (i) 포유동물 세포의 풀을, 하나 이상의 관심대상의 유전자 및 제1항, 제2항, 제6항 또는 제7항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 네오마이신-포스포트랜스퍼라제 유전자로 형질감염시키고;
    (ii) (i)의 포유동물 세포를, 관심대상의 유전자 또는 유전자들 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있는 조건하에 배양하고;
    (iii) (ii)의 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양함을 특징으로 하여, 하나 이상의 관심대상의 이종 유전자를 발현하는 포유동물 세포를 수득 및 선별하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단계 (i)에서 형질감염된 포유동물 세포를 증폭가능한 선별 마커 유전자로 추가로 형질감염시키고, 선별된 포유동물 세포를 1회 이상의 유전자 증폭 단계에 적용시킴을 특징으로 하는 방법.
  30. (i) 재조합 포유동물 세포를, 제17항에 따른 발현 벡터로 형질전환시키고;
    (ii) (i)의 포유동물 세포를 관심대상의 하나 이상의 유전자, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있는 조건하에 배양하고;
    (iii) (ii)의 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고;
    (iv) (iii)의 포유동물 세포를 유세포 측정 분석법으로 분류함을 특징으로 하여, 하나 이상의 관심대상의 이종 유전자를 발현하는 포유동물 세포를 수득 및 선별하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 단계 (i)에서 형질전환된 포유동물 세포를 증폭가능한 선별 마커 유전자로 추가로 형질감염시키고, 유세포 측정 분석법으로 분류된 세포를 1회 이상의 유전자 증폭 단계에 적용시킴을 특징으로 하는 방법.
  32. (i) 포유동물 세포의 풀을, 하나 이상의 관심대상의 유전자 및 제1항, 제2항, 제6항 또는 제7항 중의 어느 한 항에 따른 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자로 형질감염시키고;
    (ii) (i)의 세포를 관심대상의 하나 이상의 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있는 조건하에 배양하고;
    (iii) (ii)의 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고;
    (iv) 관심대상의 하나 이상의 단백질을 포유동물 세포 또는 배양 상청액으로부터 수득함을 특징으로 하여, 재조합 포유동물 세포에서 하나 이상의 관심대상의 단백질을 생산하는 방법.
  33. (i) 재조합 포유동물 세포를 제17항에 따른 발현 벡터로 형질전환시키고;
    (ii) (i)의 포유동물 세포를 관심대상의 하나 이상의 유전자, 형광 단백질을 암호화하는 유전자 및 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 발현될 수 있는 조건하에 배양하고;
    (iii) (ii)의 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양하고;
    (iv) (iii)의 포유동물 세포를 유세포 측정 분석법으로 분류하고;
    (v) 관심대상의 하나 이상의 단백질을 포유동물 세포 또는 배양 상청액으로부터 수득함을 특징으로 하여, 재조합 포유동물 세포에서 하나 이상의 관심대상의 단백질을 생산하는 방법.
  34. (i) 제23항에 따른 포유동물 세포를 관심대상의 유전자, 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 증폭가능한 선별 마커 유전자가 발현될 수 있는 조건하에 배양하고;
    (ii) (i)의 포유동물 세포를, 포유동물 세포의 성장에 선택적으로 작용하고 상기 변형된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 당해 포유동물 세포의 성장에 유리하게 작용하는 하나 이상의 선별제의 존재하에 배양 및 선별하고;
    (iii) 선별된 포유동물 세포를 1회 이상의 유전자 증폭 단계에 적용시키고;
    (iv) 관심대상의 하나 이상의 단백질을 포유동물 세포 또는 배양 상청액으로부터 연속적으로 수득함을 특징으로 하여, 하나 이상의 관심대상의 단백질을 생산하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 단계 (i)의 포유동물 세포를 이형(heteromeric) 단백질을 암호화하는 2개 이상의 관심대상의 유전자로 형질감염시키고, ① 이형 단백질의 서브유닛이 발현될 수 있는 조건하에 배양하고; ② 이형 단백질을 배양물 또는 배양 배지로부터 분리함을 특징으로 하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 단계 (iii)에서 배양된 포유동물 세포가 나타내는 목적하는 하나 이상의 유전자 산물의 1일당 및 세포당 평균 비생산성(specific productivity)이 5pg를 초과함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 단계 (iii)에서 증폭된 포유동물 세포가 나타내는 목적하는 하나 이상의 유전자 산물의 1일당 및 세포당 평균 비생산성(specific productivity)이 20pg를 초과함을 특징으로 하는 방법.
  38. 제32항에 있어서, 단계 (i)의 포유동물 세포가 설치류 세포임을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 설치류 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포임을 특징으로 하는 방법.
  40. 제32항에 있어서, 단계 (ii)에서 배양된 포유동물 세포를 현탁액 배양물 중에서 배양함을 특징으로 하는 방법.
  41. 제32항에 있어서, 단계 (ii)에서 배양된 포유동물 세포를 무혈청 조건하에 배양함을 특징으로 하는 방법.
  42. 제21항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커 유전자로 추가로 형질감염되었음을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  43. 제21항에 있어서, 설치류 세포임을 특징으로 하는 포유동물 세포.
  44. 제33항에 있어서, 단계 (i)의 포유동물 세포를 이형 단백질을 암호화하는 2개 이상의 관심대상의 유전자로 형질감염시키고, ① 이형 단백질의 서브유닛이 발현될 수 있는 조건하에 배양하고; ② 이형 단백질을 배양물 또는 배양 배지로부터 분리함을 특징으로 하는 방법.
  45. 제34항에 있어서, 단계 (i)의 포유동물 세포를 이형 단백질을 암호화하는 2개 이상의 관심대상의 유전자로 형질감염시키고, ① 이형 단백질의 서브유닛이 발현될 수 있는 조건하에 배양하고; ② 이형 단백질을 배양물 또는 배양 배지로부터 분리함을 특징으로 하는 방법.
  46. 제29항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커 유전자가 디하이드로폴레이트-리덕타제(DHFR)이고, 유전자 증폭이 메토트렉세이트의 첨가에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  47. 제31항에 있어서, 증폭가능한 선별 마커 유전자가 디하이드로폴레이트-리덕타제(DHFR)이고, 유전자 증폭이 메토트렉세이트의 첨가에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
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