JP4491808B1 - 高発現細胞の効率的な選別に有用な薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット - Google Patents
高発現細胞の効率的な選別に有用な薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】 プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、mRNA不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルを有する薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット。かかるカセットを使用した、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群の選別方法。
【選択図】 図5
Description
(1)プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、mRNA不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルを有することを特徴とする薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット。
(2)薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする(1)に記載の発現カセット。
(3)薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする(2)に記載の発現カセット。
(4)mRNA不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の3’非翻訳領域に存在するATリッチ配列に由来することを特徴とする(1)〜(3)のいずれか一項に記載の発現カセット。
(5)mRNA不安定化配列が、TTATTTA(A/T)(A/T)のモチーフ配列を有することを特徴とする(1)〜(3)のいずれか一項に記載の発現カセット。
(6)モチーフ配列が、2回以上繰り返されていることを特徴とする(5)に記載の発現カセット。
(7)モチーフ配列の繰り返し間に1塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする(6)に記載の発現カセット。
(8)mRNA不安定化配列中に1ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする(4)〜(7)のいずれか一項に記載の発現カセット。
(9)(1)〜(8)のいずれか一項に記載の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
(10)目的タンパク質遺伝子発現カセットをさらに有することを特徴とする(9)に記載の発現ベクター。
(11)目的タンパク質遺伝子発現カセット中の目的タンパク質遺伝子が、抗体の重鎖又は/及び軽鎖遺伝子のコード配列であることを特徴とする(10)に記載の発現ベクター。
(12)マルチクローニングサイトを備えた発現カセットをさらに有することを特徴とする(9)に記載の発現ベクター。
(13)マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されていることを特徴とする(12)に記載の発現ベクター。
(14)(9)に記載の発現ベクターと、目的タンパク質遺伝子発現カセット又はマルチクローニングサイトを備えた発現カセットを有する発現ベクターとからなる一対の発現ベクター。
(15)マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されている(14)に記載の一対の発現ベクター。
(16)(9)〜(15)のいずれか一項に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
(17)宿主細胞が動物細胞であることを特徴とする(16)に記載の形質転換細胞。
(18)動物細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする(17)に記載の形質転換細胞。
(19)哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であることを特徴とする(18)に記載の形質転換細胞。
(20)(16)〜(19)のいずれか一項に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
(21)(16)〜(19)のいずれか一項に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
(22)(16)〜(19)のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法。
(23)タンパク質が、抗体であることを特徴とする(22)に記載の方法。
(24)タンパク質が、ワクチンであることを特徴とする(22)に記載の方法。
(25)(16)〜(19)のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、アミノ酸を生産する方法。
(26)(16)〜(19)のいずれかに記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、ヌクレオチドを生産する方法。
本発明は、mRNA不安定化配列が極めて効果的に薬剤耐性遺伝子の発現を減弱化することができることを見出したことに基づくものである。本発明のmRNA不安定化配列を含む薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを搭載した発現ベクターを宿主細胞へ遺伝子導入した場合、mRNA不安定化配列を含まない場合と比較して、薬剤選択後の生存細胞数、あるいはそのコロニーは1/10〜1/100に減少する。これはmRNA不安定配列の存在により薬剤選択マーカーのmRNAが不安定化し、薬剤選択マーカーの発現量が下がるため、宿主細胞のゲノム中で転写活性の高い高発現領域に当該発現カセットが組み込まれた細胞でなければ薬剤選択下での生存が困難になるためと考えられる。
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるmRNA不安定化配列の効果
(1)プラスミドベクターpBS−CMV−SNAPm−Pur(比較例)及びpBS−CMV−SNAPm−Pur・N4(実施例)の構築
図1に示すスキームに従って、プラスミドベクターpBS−CMV−SNAPm2を構築した。即ち、まずEmerald Lucベクター(pELuc−test)(東洋紡績社製)の制限酵素ClaI、EcoRIサイトにCMVプロモーター(配列番号1)が導入されたpELuc−CMVプラスミドから制限酵素EcoRI、NotIでEmerald Luc(ELuc)遺伝子を切出した。一方、SNAPm発現プラスミドpSNAPm(Covalys社製)からSNAP26m遺伝子を配列番号2,3のプライマーを用いてPCRで増幅し、pELuc−CMVプラスミドの制限酵素EcoRI、NotIサイトに導入してpSNAP26m−CMVを構築した。続いて、pSNAP26m−CMVより、CMVプロモーター/SNAP26m/SV40 polyAを配列番号4,5のプライマーを用いてPCRで増幅し、部分消化によって、プラスミドpBluescript II KS(−)(ストラタジーン社製)の制限酵素ClaI、BamHIサイトへ導入し、プラスミドpBS−CMV−SNAPm2を構築した。
CHO−K1細胞(理研バイオリソースセンター、No.RCB0285)を1×105cells/mlに調整し、12ウェルプレートに2mlずつ前日に播種し、一晩培養して、トランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。この際、培地として10%牛胎児血清を添加したHam’s F12培地(日水製薬社製)を使用した。
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるmRNA不安定化配列の効果
実施例1(1)で構築した二種類のプラスミドベクターを使用して実施例1(2)と同様に遺伝子導入を行った。次に、ピューロマイシンの濃度を9μg/mlに変更し、選択培養の期間を2週間に変更した以外は、実施例1(2)と同様にして選択培養を行った。選択培養終了後、形成されたコロニーを顕微鏡下でピペットの先でpBS−CMV−SNAPm−Purについては48クローン、pBS−CMV−SNAPm−Pur・N4については20クローンをかきとり、12ウェルプレートに播種した。増殖が認められた、それぞれ36クローン、10クローンについて、実施例1(2)と同様にSNAP−Cell−505で標識処理をし、FACS解析を実施した。
EF1αプロモーター使用下での薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるmRNA不安定化配列の効果
(1)プラスミドベクターpEF1α−SNAP26m−Pur・N4(実施例)及びpEF1α−SNAP26m−Pur−RE2(比較例)の構築
次に、目的タンパク質遺伝子発現カセットのプロモーターをCMVプロモーターからEF1αプロモーターに置換した場合も、実施例1,2と同様の効果が認められるかどうかを検討するため、プラスミドベクターを構築した。本実験では、図9に示すスキームに従って構築されたプラスミドpEF1α−KOD3G8HC−RE2を利用した。即ち、まず、CMVプロモーターをEF−1αプロモーターに置換したpCI−neoプラスミド(プロメガ社製)の制限酵素XbaI−NotIサイトに抗KOD抗体の重鎖を挿入したプラスミドのpEF1α−KOD3G8HCを鋳型に、KOD−Plus−Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号10、11のプライマーを用いて発現カセットの上流に制限酵素SalIおよびNheIサイトを付加したpEF1α−KOD3G8HC−REを構築した。更にこのプラスミドを鋳型に、KOD−Plus−Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号12、13のプライマーを用いて発現カセットの下流に制限酵素BsiWIおよびXhoIサイトを付加して、プラスミドpEF1α−KOD3G8HC−RE2を構築した。
実施例1(2)に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例3(1)で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdI(New England Biolabs社製)でリニアライズ(直鎖状化)した。トランスフェクションは、3μl GeneJuice Transfection Reagentを100μl Opti−MEM I Reduced−Serum Mediumで希釈した後、前記のリニアライズしたプラスミド1μgを加え、10分間放置した後、この混合液を前記CHO−K1細胞に加え、24時間インキュベートすることにより行った。翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、5、7.5、あるいは10μg/mlピューロマイシンをそれぞれ含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例1(2)に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
薬剤選択マーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるmRNA不安定化配列の効果
(1)プラスミドベクターpEF1α−SNAP26m−Hyg‐RE2(比較例)及びpEF1α−SNAP26m−Hyg・N4(実施例)の構築
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにハイグロマイシン耐性遺伝子を用いた場合もmRNA不安定化配列の効果が認められるかどうかを検討するため、プラスミドを構築した。本実験では、図13に示すスキームに従って構築されたプラスミドpEF1α−KOD3G8LC−Hyg−RE2を利用した。即ち、まず、CMVプロモーターをEF−1αプロモーターに変更したpCI−neoプラスミドの制限酵素XbaI−NotIサイトに抗KOD抗体の軽鎖を挿入したプラスミドのpEF1α−KOD3G8LCを鋳型に、KOD−Plus−Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号10、11のプライマーを使って発現カセットの上流に制限酵素SalIおよびNheIサイトを付加したpEF1α−KOD3G8LC−REを構築した。更にこのプラスミドを鋳型に、KOD−Plus−Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号12、13のプライマーを用いて発現カセットの下流に制限酵素BsiWIおよびXhoIサイトを付加して、プラスミドpEF1α−KOD3G8LC−RE2を構築した。
実施例1(2)に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、実施例4(1)で構築したSNAP26m発現コンストラクトを制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例3(2)に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、800μg/mlハイグロマイシン HygroGold(InvivoGen社製)を含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例1(2)に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
薬剤選択マーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子を使用した薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットにおけるmRNA不安定化配列の効果
(1)プラスミドベクターpEF1α−SNAP26m−Neo−RE2(比較例)及びpEF1α−SNAP26m−Neo・N4(実施例)の構築
薬剤選択マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合もmRNA不安定化配列の効果が認められるかどうかを検討するため、図17に示すスキームに従って、プラスミドpEF1α−SNAP26m−Neo・N4(実施例)を構築した。即ち、実施例4と同様にしてpEF1α−SNAP26m−Neo−RE2(比較例)構築した。次に、このプラスミドを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号21、23のプライマーを用いてネオマイシン耐性遺伝子の下流にN4配列を付加したpEF1α−SNAP26m−Neo・N4(実施例)を構築した。
実施例1(2)に記載の方法でトランスフェクション用のCHO−K1細胞を準備した。一方、pEF1α−SNAP26m−Neo−RE2及びpEF1α−SNAP26m−Neo・N4を制限酵素AhdIでリニアライズした。トランスフェクションは、実施例3(2)に記載の方法で行い、トランスフェクションの翌日、培地を除去し、2.5g/l−Trypsin・1mmol/l−EDTA Solutionで処理して細胞を分散させ、90mmペトリディッシュに移し、1mg/mlジェネティシン G418(ナカライテスク社製)を含むHam’s F12+10%FBS培地中で1週間選択培養を行った。選択培養中、3〜4日ごとに培地を交換した。選択培養終了後、実施例1(2)に記載の方法で、細胞集団のSNAP26mの発現強度を解析した。
mRNA不安定化配列のモチーフ配列の繰り返し回数の検討
mRNA不安定化配列のモチーフ配列の繰り返し回数が高発現細胞の選択効率に与える影響を検討するため、実施例3のプラスミドにおいて繰り返し回数を4回から2回、6回、又は8回に変更したものを図20に示すスキームに従って構築した。即ち、実施例3(1)に記載のpEF1α−SNAP26m−Pur・N4を鋳型に、KOD−Plus−Mutagenesis Kitを用いたInverse PCR法によって、配列番号16、24のプライマーを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の下流にN2配列(AREモチーフ配列TTATTTATTの2回の繰り返し)を付加したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N2を構築した。また、同様の方法で、配列番号7、24のプライマーを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の下流にN6配列(AREモチーフ配列TTATTTATTの6回の繰り返し)を付加したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N6を構築し、配列番号7、25のプライマーを用いてピューロマイシン耐性遺伝子の下流にN8配列(AREモチーフ配列TTATTTATTの8回の繰り返し)を付加したプラスミドpEF1α−SNAP26m−Pur・N8を構築した。
配列番号10〜17は、実施例4に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号18〜22は、実施例6に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号23は、実施例8に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
配列番号24及び25は、実施例10に記載された設計されたポリヌクレオチドの配列である。
Claims (26)
- プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、mRNA不安定化配列、及びポリアデニレーションシグナルを有することを特徴とする薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット。
- 薬剤選択マーカー遺伝子が、タンパク質合成阻害系抗生物質耐性遺伝子であることを特徴とする請求項1に記載の発現カセット。
- 薬剤選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン−N−アセチルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項2に記載の発現カセット。
- mRNA不安定化配列が、サイトカイン、インターロイキン、又は癌原遺伝子の3’非翻訳領域に存在するATリッチ配列に由来することを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の発現カセット。
- mRNA不安定化配列が、TTATTTA(A/T)(A/T)のモチーフ配列を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の発現カセット。
- モチーフ配列が、2回以上繰り返されていることを特徴とする請求項5に記載の発現カセット。
- モチーフ配列の繰り返し間に1塩基以上のスペーサー配列を含むことを特徴とする請求項6に記載の発現カセット。
- mRNA不安定化配列中に1ないし数塩基の置換、挿入または欠失を含むことを特徴とする請求項4〜7のいずれか一項に記載の発現カセット。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の薬剤選択マーカー遺伝子発現カセットを有することを特徴とする発現ベクター。
- 目的タンパク質遺伝子発現カセットをさらに有することを特徴とする請求項9に記載の発現ベクター。
- 目的タンパク質遺伝子発現カセット中の目的タンパク質遺伝子が、抗体の重鎖又は/及び軽鎖遺伝子のコード配列であることを特徴とする請求項10に記載の発現ベクター。
- マルチクローニングサイトを備えた発現カセットをさらに有することを特徴とする請求項9に記載の発現ベクター。
- マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項12に記載の発現ベクター。
- 請求項9に記載の発現ベクターと、目的タンパク質遺伝子発現カセット又はマルチクローニングサイトを備えた発現カセットを有する発現ベクターとからなる一対の発現ベクター。
- マルチクローニングサイトに目的タンパク質遺伝子が導入されている請求項14に記載の一対の発現ベクター。
- 請求項9〜15のいずれか一項に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られることを特徴とする形質転換細胞。
- 宿主細胞が動物細胞であることを特徴とする請求項16に記載の形質転換細胞。
- 動物細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項17に記載の形質転換細胞。
- 哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であることを特徴とする請求項18に記載の形質転換細胞。
- 請求項16〜19のいずれか一項に記載の形質転換細胞を薬剤選択する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現する細胞群を選別する方法。
- 請求項16〜19のいずれか一項に記載の形質転換細胞からなる細胞群であって、目的タンパク質遺伝子を高レベルで発現することを特徴とする細胞群。
- 請求項16〜19のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、タンパク質を生産する方法。
- タンパク質が、抗体であることを特徴とする請求項22に記載の方法。
- タンパク質が、ワクチンであることを特徴とする請求項22に記載の方法。
- 請求項16〜19のいずれか一項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、アミノ酸を生産する方法。
- 請求項16〜19のいずれかに記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、ヌクレオチドを生産する方法。
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