JP4999293B2 - 人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法 - Google Patents

人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法 Download PDF

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Description

関連出願
米国の国内段階に関して本出願は、発明の名称「ARTIFICIAL CHROMOSOMES，USES THEREOF AND METHODS FOR PREPARING ARTIFICAL CHROMOSOMES」で１９９６年８月７日に出願された同時係属中の米国特許出願０８／６９５１９１号（GYULAHADLACZKYおよびALADAR SZALAY）の一部継続出願である。本出願はさらに、発明の名称「ARTIFICIAL CHROMOSOMES，USES THEREOF AND METHODS FOR PREPARING ARTIFICAL CHROMOSOMES」で１９９６年７月１５日に出願された同時係属中の米国特許出願０８／６８２０８０号（GYULA HADLACZKYおよびALADAR SZALAY）の一部継続出願でもあり、発明の名称「ARTIFICIAL CHROMOSOMES，USES THEREOF AND METHODS FOR PREPARING ARTIFICAL CHROMOSOMES」で１９９６年４月１０日に出願された同時係属中の米国特許出願０８／６２９８２２号（GYULA HADLACZKYおよびALADAR SZALAY）の一部継続出願でもある。
国際段階に関しては、これら各出願に対する優先権の恩恵が請求されており、その出願の主題はその全体が、本明細書に組み込まれるものとする。
米国特許出願０８／６９５１９１号は、米国特許出願０８／６８２０８０号の一部継続出願であり、米国特許出願０８／６２９８２２号の一部継続出願でもある、米国特許出願０８／６８２０８０号は、米国特許出願０８／６２９８２２号の一部継続出願である。
本出願は、現在米国特許５２８８６２５号である米国特許出願０７／７５９５５８号に関係し、１９９６年１０月２１日出願の米国特許出願０８／７３４３４４号に関係し、１９９５年１月１９日出願の認可された米国特許出願０８／３７５２７１号に関係するものであり、該米国特許出願０８／３７５２７１号は１９９３年６月２３日出願の米国特許出願０８／０８００９７号の継続出願であり、該出願は１９９２年６月３日出願の米国特許出願０７／８９２４８７号の継続出願であり、該出願は１９９０年５月９日出願の米国特許出願０７／５２１０７３号の継続出願である。
許容される範囲まで、米国特許出願０８／７３４３４４号、０８／６９５１９１号、０８／６８２０８０号、０８／６２９８２２号、０８／３７５２７１号、０８／０８００９７号、０７／８９２４８７号および０７／５２１０７３号ならびに米国特許５２８８６２５号のそれぞれの主題は、それに対する引用によって、全体が本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は、人工染色体を含む細胞系の製造方法、人工染色体の単離方法、異種ＤＮＡの該染色体への標的挿入、特定の細胞および組織への該染色体の導入、ならびに該染色体の単離および大量生産方法に関するものである。さらには、上記方法で使用される細胞系、該方法によって製造される細胞系および染色体も提供される。さらには、人工染色体を使用した、異種蛋白の細胞に基づく製造方法、遺伝子治療および遺伝子導入動物、特には人間以外の遺伝子導入動物の形成方法も提供される。
遺伝子治療および異種核酸の組換え体発現のためのいくつかのウィルスベクター、非ウイルス性導入系および物理的導入系が開発されている（例えば、Mitani et al.(1993)Trends Biotech.11:162-166参照）。しかしながら現在使用できる系には、特に持続的、安定または制御された遺伝子発現が必要な場合に多くの制限がある。その制限には、（１）ウィルスベクターが許容できるＤＮＡ挿入物［遺伝子］の大きさに、多くて約１０キロ塩基［ｋＢ］程度の制限があるための大きさ上の制限（それに対して、治療上重要と考えられる多くの哺乳動物遺伝子は、特に全ての制御要素が含まれる場合、その限界よりかなり高い）、（２）組み込みの標的を特異的に定めることができないため、ランダムな組み込みが起こって、重要な遺伝子または癌抑制遺伝子を破壊する危険性があること、（３）ランダムに組み込まれた治療遺伝子の発現が、核における機能的区画化によって影響を受けると考えられ、しかも染色質に基づく位置効果によって影響を受けること、（４）コピー数と従ってゲノムに組み込まれる所定の遺伝子の発現を制御できないことなどがある。従って、遺伝子導入における改善と安定な発現系が望まれている（例えば、Mulligan (1993) Science 260:926-932参照）。
さらに、安全かつ有効なベクターおよび遺伝子治療には、現在使用可能な系では保証されない多くの特徴がなければならない。例えば、安全なベクターは、宿主の遺伝物質において組換えもしくは突然変異によって望ましくない変化を促進し得るＤＮＡ要素を含んでいてはならず；ベクターを有する細胞、組織もしくは生物において有害効果を起こす可能性のあるものであってはならず；しかもゲノムの機能を妨害するものであってはならない。さらに、ベクターが非組み込み型であるか、あるいは部位特異的組み込み用であることが有利であると考えられる。さらに、ベクターが有する治療遺伝子のコピー数を制御して安定なものとする必要があり；ベクターは導入される遺伝子の独立かつ制御された機能を確保すべきであり；ベクターは大きい（Ｍｂまで）挿入物を受け入れ、その挿入物の機能的安定性を確保するものでなければならない。
しかしながら、既存の遺伝子導入技術の限界があるために、大きい（Ｍｂ以上の大きさ）遺伝子および遺伝子複合体を、治療遺伝物質の安全で、制御された、持続的な発現を提供する調節要素とともに転移させるのに好適な別のベクター系の開発が望まれる。
現在、利用可能なベクターでこれらの要件を全て満たすものはない。しかしながら、これらの特徴のほとんどを染色体が有している。そこで人工染色体は、遺伝子治療だけでなく、多くの遺伝子発現の調整を必要とするかまたは大きい遺伝子によってコードされる遺伝子産生物の安定で高レベルな制御された生産および他の用途に理想的なベクターであると考えられる。酵母での異種遺伝子の発現のための人工染色体が利用可能であるが、所定の哺乳動物の人工染色体の構築は達成されていない。単離された機能的哺乳動物動原体がなく、それの産生および安定複製のための必須条件の解明が不十分であることが、そのような構築の障害となっている。酵母の場合とは異なり、哺乳動物の動原体に非常に近い選択可能な遺伝子はなく、非常に反復性の高い挟動原体異質染色質ＤＮＡが長く続くことで、染色体歩行などの現在利用できる方法を用いた哺乳動物動原体の単離が実質的に不可能となる。哺乳動物の人工染色体生産には他の戦略が必要であり、いくつか開発されている。例えば、米国特許５２８８６２５号には、人工染色体、すなわち約２０〜３０メガ塩基であるミニ染色体を含む細胞系が提供されている。しかしながら、その染色体の単離に用いられている方法では、わずか約１０〜２０％の純度のものしか得られない。そこで、別の人工染色体の開発および単離・精製方法の完成、ならびにより多用途な染色体の開発およびミニ染色体のさらなる特性決定が、この技術の可能性を実現する上で必要である。
米国特許５２８８６２５号 Mitani et al.(1993)Trends Biotech.11:162-166 Mulligan (1993) Science 260:926-932
従って本発明の目的は、哺乳動物の人工染色体ならびに外来ＤＮＡをそのような染色体に導入する方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、当該染色体の単離・精製方法を提供することにある。本発明の目的はさらに、特定の細胞に哺乳動物の人工染色体を導入する方法を提供すること、ならびにそうして得られる細胞と、人工染色体を含む遺伝子導入の人間以外の動物、鳥、魚および植物を提供することにある。本発明の目的はさらに、人工染色体を用いる遺伝子療法および遺伝子産物の発現方法を提供することにある。本発明の目的はさらに、生物特異的な人工染色体を新規に（デノボ）構築する方法を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、デノボ哺乳動物人工染色体を形成する方法を提供することにある。
本発明は以下の特徴を有する。
１．選択可能マーカーを含む１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを細胞に導入する段階と、
前記１つまたは複数のＤＮＡフラグメントをゲノムＤＮＡに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
サテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階と
を含んで成る、ここでサテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものである、人工染色体の製造方法。
２．１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを細胞の染色体の増幅可能領域の内部またはその近傍に導入することを特徴とする上記１に記載の方法。
３．増幅可能領域がｒＤＮＡからなることを特徴とする上記２に記載の方法。
４．増幅可能領域が異質染色質からなることを特徴とする上記２に記載の方法。
５．細胞の染色体の挟動原体異質染色質にＤＮＡを導入することを特徴とする上記１または２に記載の方法。
６．細胞が哺乳動物の細胞であることを特徴とする上記１に記載の方法。
７．更に、サテライト人工染色体を単離する段階を含むことを特徴とする上記１または２に記載の方法。
８．１つまたは複数のＤＮＡフラグメントが、当該フラグメントを染色体の異質染色質領域にターゲットするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする上記１から７のいずれかに記載の方法。
９．ターゲッティングヌクレオチド配列がサテライトＤＮＡからなることを特徴とする上記８に記載の方法。
１０．細胞がヒトの細胞であることを特徴とする上記１から９のいずれかに記載の方法。
１１．細胞が、魚類、昆虫類、爬虫類、両棲類、蜘蛛類または齧歯類の細胞であることを特徴とする上記１から５及び７から９のいずれかに記載の方法。
１２．１つまたは複数のＤＮＡフラグメントが導入される細胞がＥＣ３／７細胞であることを特徴とする上記１に記載の方法。
１３．１つまたは複数のＤＮＡフラグメントが導入される細胞がマウス染色体またはヒト染色体を含むことを特徴とする上記１に記載の方法。
１４．更に、遺伝子産物をコードするＤＮＡを導入する段階を含んでおり、この遺伝子産物をコードするＤＮＡは選択可能マーカーを含むフラグメントに存在するかまたは第二のＤＮＡフラグメントに存在し、得られるサテライト人工染色体が遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含むことを特徴とする上記１に記載の方法。
１５．サテライト人工染色体がメガ染色体であり、ここでメガ染色体が、２個の反転メガレプリコンを有するアンプリコンを含む、約５０Ｍｂ〜約４００Ｍｂからなるサテライト人工染色体であり、メガレプリコンが反復異質染色質ＤＮＡ単位を含むものであり、方法が更に、
断片化用ベクターを導入し、これによって細胞内のメガ染色体のサイズを小さくする段階と、
１５〜６０Ｍｂのサイズのサテライト人工染色体を含む細胞を同定する段階と
を含むことを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
１６．サテライト人工染色体がメガ染色体であり、ここでメガ染色体が、２個の反転メガレプリコンを有するアンプリコンを含む、約５０Ｍｂ〜約４００Ｍｂからなるサテライト人工染色体であり、メガレプリコンが反復異質染色質ＤＮＡ単位を含むものであり、方法が、末端切断されたメガ染色体を含む細胞が産生される条件を細胞に作用させる段階を更に含むことを特徴とする上記１から１１のいずれかに記載の方法。
１７．前記条件が、Ｘ線照射と、染色体内部の塩基対合を不安定化する物質の存在下の増殖とから選択されることを特徴とする上記１６に記載の方法。
１８．前記物質がブロモデオキシウリジンであることを特徴とする上記１７に記載の方法。
１９．更に、１５〜６０Ｍｂからなるサテライト人工染色体を含んでいる細胞を選択する段階を含むことを特徴とする上記１から１８のいずれかに記載の方法。
２０．細胞からサテライト人工染色体を単離する段階を更に含むことを特徴とする上記１から１９のいずれかに記載の方法。
２１．単離が、
中期染色体を単離し、
内因性染色体からサテライト人工染色体を識別し、
内因性染色体からサテライト人工染色体を分離することによって行われることを特徴とする上記２０に記載の方法。
２２．ＤＮＡ配列特異的染料で染色体を染色することによってサテライト人工染色体を内因性染色体から識別し、フローセルソーターによって分離することを特徴とする上記２１に記載の方法。
２３．上記１３に記載の方法によって得られ、マウス動原体またはヒト動原体を含むサテライト人工染色体。
２４．上記１から２２のいずれか一項に記載の方法によって製造されるサテライト人工染色体。
２５．実質的に純粋な単離された、１５Ｍｂまたはそれより大きいサテライト人工染色体。
２６．植物染色体または動物染色体であることを特徴とする上記２５に記載のサテライト人工染色体。
２７．マウスまたはヒトのサテライト人工染色体であることを特徴とする上記２５に記載のサテライト人工染色体。
２８．５００Ｍｂ〜１０００Ｍｂからなることを特徴とする上記２４または２５に記載のサテライト人工染色体。
２９．アンチセンスＲＮＡをコードする核酸であることを特徴とする上記２４または２５に記載のサテライト人工染色体。
３０．５０〜４５０Ｍｂからなるメガ染色体であることを特徴とする上記２５に記載のサテライト人工染色体。
３１．２５０〜４００Ｍｂからなることを特徴とする上記２５に記載のサテライト人工染色体。
３２．１５０〜２００Ｍｂからなることを特徴とする上記２５に記載のサテライト人工染色体。
３３．１５〜６０Ｍｂからなることを特徴とする上記２５に記載のサテライト人工染色体。
３４．１５〜６０Ｍｂからなることを特徴とする上記２５に記載の実質的に純粋な単離されたサテライト人工染色体。
３５．配列番号１８から２４のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする上記２４または２５に記載のサテライト人工染色体。
３６．Ｇ３Ｄ５細胞系またはＨ１Ｄ３細胞系の細胞から単離されたものであることを特徴とする、上記２５に記載のサテライト人工染色体。
３７．上記１から２２のいずれかに記載の方法によって製造されるサテライト人工染色体を含む細胞。
３８．上記２４から３６のいずれかに記載のサテライト人工染色体を含む細胞。
３９．哺乳動物の細胞であることを特徴とする上記３７または３８に記載の細胞。
４０．人工染色体が１０〜６０Ｍｂからなるサテライト人工染色体であることを特徴とする上記３７から３９のいずれか一項に記載の細胞。
４１．染色体を不安定化する物質の存在下でＴＦ１００４Ｇ１９Ｃ５または１９Ｃ５ｘＨａ４細胞系（それぞれ、受託番号９６０４０９２６または９６０４０９２７でＥＣＡＣＣに寄託されている）の細胞を増殖させる段階と、
サテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階と
を含んで成るサテライト人工染色体の製造方法。
４２．選択可能マーカーを含む１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを細胞に導入する段階と、
前記１つまたは複数のＤＮＡフラグメントをそのゲノムＤＮＡに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
増殖した細胞から新規な動原体を含む二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
サテライト人工染色体が産生される条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成る人工染色体の製造方法。
４３．選択可能マーカーを含む１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを細胞に導入する段階と、
前記１つまたは複数のＤＮＡフラグメントをそのゲノムＤＮＡに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
増殖した細胞から新規な動原体を含む二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
二動原体型染色体が分裂して元二動原体型染色体を産生する細胞を産生するために細胞を増殖させる段階と、
元二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
ソーセージ型染色体が産生される条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成る、ここでソーセージ型染色体が増幅された異質染色質および真正染色質腕を含む、人工染色体の製造方法。
４４．１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを細胞内の染色体の増殖可能領域の内部またはその近傍に導入することを特徴とする上記４２または４３に記載の方法。
４５．増幅可能領域がｒＤＮＡからなることを特徴とする上記４４に記載の方法。
４６．増幅可能領域が異質染色質からなることを特徴とする上記４４に記載の方法。
４７．ＤＮＡを細胞の染色体の挟動原体異質染色質に導入することを特徴とする上記４２または４３に記載の方法。
４８．更に、
サテライト人工染色体にターゲットされる断片化用ベタターを導入する段階と、細胞を増殖させる段階と、断片化用ベクターが導入された細胞のサテライト人工染色体よりも小さいサテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階とを含むことを特徴とする上記４２に記載の方法。
４９．選択可能マーカーを含むＤＮＡフラグメントを細胞に導入する段階と、
前記ＤＮＡフラグメントをそのゲノムＤＮＡに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
増殖した細胞から二動原体型染色体を産生した細胞を選択する段階と、
異質染色質アームをもつ染色体を含んでいる細胞が産生されるような、選択可能マーカーを使用する選択条件下で細胞を増殖させる段階と
を含んで成る人工染色体の製造方法。
５０．更に、異質染色質アームをもつ染色体を含んでいる細胞を選択する段階と、染色体を不安定化する物質の存在下で前記細胞を増殖させる段階とを含むことを特徴とする上記４９に記載の方法。
５１．更に、５０〜４００Ｍｂの異質染色質染色体を有している細胞を同定する段階を含むことを特徴とする上記５０に記載の方法。
５２．細胞内の染色体の増幅可能領域の内部またはその近傍にＤＮＡフラグメントを導入することを特徴とする上記４９から５１のいずれかに記載の方法。
５３．増幅可能領域がｒＤＮＡからなることを特徴とする上記５２に記載の方法。
５４．増幅可能領域が異質染色質からなることを特徴とする上記５２に記載の方法。
５５．ＤＮＡを細胞の染色体の挟動原体異質染色質に導入することを特徴とする上記５２に記載の方法。
５６．サテライト人工染色体をヒト以外の動物細胞に導入する段階を含んで成るトランスジェニック非ヒト動物の産生方法。
５７．更に、得られた動物細胞を代理母となる雌動物に導入して発育させ、トランスジェニック動物を得る段階を含むことを特徴とする上記５６に記載の方法。
５８．動物細胞が胚細胞であることを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
５９．胚細胞が幹細胞であることを特徴とする上記５８に記載の方法。
６０．胚細胞が胚に存在するものであることを特徴とする上記５８に記載の方法。
６１．動物細胞が受精卵であることを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
６２．幹細胞がマウス幹細胞であることを特徴とする上記５９に記載の方法。
６３．動物細胞が卵母細胞、接合体または生殖系列細胞であることを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
６４．サテライト人工染色体が、高次の複製単位の２つの反転反復を含む反復ＤＮＡ増幅単位の配列を含むメガ染色体であり、受託番号９６０４０９２８及び９６０４０９２９でＥＣＡＣＣに寄託されている細胞系の同定特性の全部を有する細胞系に由来することを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
６５．細胞が前核にサテライト人工染色体を含むことを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
６６．サテライト人工染色体が上記１に記載の方法によって得られることを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
６７．サテライト人工染色体が遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含むことを特徴とする上記５６から６６のいずれかに記載の方法。
６８．サテライト人工染色体が治療用物質をコードする異種ＤＮＡを含むことを特徴とする上記５６から６６のいずれかに記載の方法。
６９．遺伝子産物が嚢胞性繊維症膜貫通調節蛋白質、抗ＨＩＶリボザイムまたは腫瘍抑制遺伝子であることを特徴とする上記６７に記載の方法。
７０．抗ＨＩＶリボザイムが抗ｇａｇリボザイムであり、腫瘍抑制遺伝子がｐ５３であることを特徴とする上記６９に記載の方法。
７１．遺伝子産物が、発現によってトランスジェニック非ヒト動物中の病原体に対する免疫防御応答を誘発する抗原を含むことを特徴とする上記６７に記載の方法。
７２．遺伝子産物が、発現によって複数の病原体に対する免疫防御応答を誘発する複数の抗原を含むことを特徴とする上記６７に記載の方法。
７３．トランスジェニック非ヒト動物が魚類、昆虫類、爬虫類、両棲類、蜘蛛類または哺乳動物であることを特徴とする上記５６から７２のいずれかに記載の方法。
７４．サテライト人工染色体が、細胞融合、キャリア系による脂質仲介転移、微量注入、ミクロセル（微小核体）融合、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイル、核転移、衝撃または直接ＤＮＡ転移によって導入されることを特徴とする上記５６から７３のいずれかに記載の方法。
７５．動物が哺乳動物または卵生動物であり、サテライト人工染色体が蛋白質と、動物の母乳または動物の卵の内部で遺伝子を発現させる調節要素とを含むことを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
７６．動物が、雌ウシ、ヤギ、雄ウシ、ブタ及びヒツジから選択されることを特徴とする上記７５に記載の方法。
７７．動物が家禽から選択されることを特徴とする上記７５に記載の方法。
７８．サテライト人工染色体がヒト細胞表面蛋白質発現用遺伝子をコードするＤＮＡを含み、それにより動物の器官がヒト蛋白質を発現し、ヒトに移植されたときに拒絶が生じないことを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
７９．動物が卵生であることを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
８０．動物が鶏であることを特徴とする上記７９に記載の方法。
８１．動物が昆虫であることを特徴とする上記５６または５７に記載の方法。
８２．遺伝子産物がホルモン、抗体、サイトカイン、成長因子、調節蛋白質、分泌蛋白質であることを特徴とする上記６７に記載の方法。
８３．上記５６から７２のいずれかに記載の方法によって産生されるトランスジェニック非ヒト動物。
８４．魚類、昆虫類、爬虫類、両棲類、蜘蛛類または哺乳動物であることを特徴とする上記８３に記載のトランスジェニック動物。
８５．それぞれ受託番号９６０４０９２６、９６０４０９２７、９６０４０９２９及び９６０４０９２８でＥＣＡＣＣに寄託されているＴＦ１００４Ｇ１９Ｃ５、１９Ｃ５ｘＨａ４、Ｈ１Ｄ３及びＧ３Ｄ５のいずれかの同定特性を有する細胞系。
８６．５０〜４００Ｍｂからなるメガ染色体を含む細胞系であって、メガ染色体が、２個の反転メガレプリコンを有するアンプリコンを含む、約５０Ｍｂ〜約４００Ｍｂからなるサテライト人工染色体であり、メガレプリコンが反復異質染色質ＤＮＡ単位を含むものであることを特徴とする細胞系。
８７．メガ染色体が２５０〜４００Ｍｂからなることを特徴とする上記８６に記載の細胞系。
８８．メガ染色体が１５０〜２００Ｍｂからなることを特徴とする上記８６に記載の細胞系。
８９．メガ染色体が９０〜１２０Ｍｂからなることを特徴とする上記８６に記載の細胞系。
９０．メガ染色体が６０〜１００Ｍｂからなることを特徴とする上記８６に記載の細胞系。
９１．治療用物質のＤＮＡを含むサテライト人工染色体をターゲット細胞に導入する段階と、
得られたターゲット細胞をヒト以外の宿主動物に導入する段階と
を含んで成る遺伝子治療方法。
９２．ターゲット細胞が、リンパ球、幹細胞、神経細胞、昆虫細胞、鶏細胞または筋肉細胞であることを特徴とする上記９１に記載の方法。
９３．異種遺伝子の多数コピーまたは複数の異種遺伝子を含むサテライト人工染色体を有する細胞を含んで成る細胞性産生系。
９４．異種遺伝子が代謝経路を構成する蛋白質をコードすることを特徴とする上記９３に記載の系。
９５．代謝経路の発現によって産生される物質の発現方法であって、代謝経路を構成する蛋白質が発現されて前記物質を産生する条件下で上記９４に記載の系を培養する段階を含んで成る方法。
９６．物質がビタミン、ホルモン、ヌクレオチド、アミノ酸、蛋白質またはペプチドであることを特徴とする上記９５に記載の方法。
９７．物質が成長因子、抗体、転写因子、腫瘍抑制蛋白質、酵素、熱ショック蛋白質、受容体、サイトカイン、プロテアーゼ及びホルモンから成る群より選択されることを特徴とする上記９５に記載の方法。
９８．異種遺伝子が選択的条件なしに細胞で発現されることを特徴とする上記９３に記載の系。
９９．上記２４から２６または２８から３６のいずれかに記載のサテライト人工染色体を植物細胞に導入する段階と、植物が産生される条件下で細胞を培養する段階とを含んで成るトランスジェニック植物の産生方法。
１００．プロトプラスト融合、微量注入、ミクロセル（微小核体）融合、脂質仲介遺伝子移入、エレクトロポレーション、微粒子衝撃、または、直接ＤＮＡ移入によってサテライト人工染色体を導入することを特徴とする上記９９に記載の方法。
１０１．上記２４から３６のいずれかに記載のサテライト人工染色体を細胞に導入する段階と、１つまたは複数の遺伝子産物が発現される条件下で細胞を培養する段階とを含んで成る、１つまたは複数の遺伝子産物の産生方法。
１０２．代謝経路を構成する蛋白質をコードする一連の遺伝子の発現によって遺伝子産物が産生されること、及び、サテライト人工染色体がこれらの遺伝子の各々を含むことを特徴とする上記１０１に記載の方法。
１０３．選択可能マーカーを含む１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを細胞の染色体の増幅可能領域の内部または近傍に導入する段階と、
前記１つまたは複数のＤＮＡフラグメントをそのゲノムＤＮＡに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
真性染色質よりも異質染色質を多く含む人工染色体を有している細胞を選択する段階と
を含んで成る人工染色体の製造方法。
１０４．増幅可能領域がｒＤＮＡであることを特徴とする上記１０３に記載の方法。
１０５．更に、人工染色体を単離する段階を含むことを特徴とする上記１０３または１０４に記載の方法。
１０６．上記１０３から１０５のいずれかに記載の方法によって産生される人工染色体。
１０７．サテライト人工染色体を細胞に導入する段階を含むことを特徴とする異種核酸を含む細胞を産生する方法。
１０８．細胞が動物細胞または植物細胞であることを特徴とする上記１０７に記載の方法。
１０９．サテライト人工染色体が哺乳動物のサテライト人工染色体または植物のサテライト人工染色体であることを特徴とする上記１０７に記載の方法。
１１０．サテライト人工染色体が、直接ＤＮＡ移入または取り込み、エレクトロポレーション、リポフェクション、核微量注入、リポソーム仲介転移、微粒子衝撃、多価カチオン介在転移、ポリエチレングリコール転移及びミクロセル（微小核体）融合から選択される方法により導入されることを特徴とする上記１０９に記載の方法。
１１１．細胞が胚細胞であることを特徴とする上記１０７に記載の方法。
１１２．植物細胞がタバコ、米、トウモロコシ、ライ麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモ、トマトまたはシロイヌナズナの細胞であることを特徴とする上記１０８に記載の方法。
１１３．動物細胞が哺乳動物、鳥、鶏、魚、無脊椎動物、脊椎動物、は虫類または昆虫であることを特徴とする上記１０８に記載の方法。
１１４．サテライト人工染色体をヒト以外の核ドナー細胞に導入する段階と、
核ドナー細胞の核をヒト以外の除核受容体細胞に転移する段階と
を含んで成る方法。
１１５．更に、受容体細胞を母系宿主動物に転移することを含むことを特徴とする上記１１４に記載の方法。
１１６．更に、転移した細胞を宿主中で動物へ発育させる段階を含むことを特徴とする上記１１５に記載の方法。
１１７．除核受容体細胞が卵母細胞であることを特徴とする上記１１４から１１６のいずれかに記載の方法。
１１８．除核受容体細胞が胚幹細胞であることを特徴とする上記１１４から１１６のいずれかに記載の方法。
１１９．胚幹細胞がマウス胚幹細胞であることを特徴とする上記１１８に記載の方法。
１２０．サテライト人工染色体をドナー細胞の前核に導入することを特徴とする上記１１４に記載の方法。
１２１．サテライト人工染色体が上記１に記載の方法によって得られることを特徴とする上記１１４に記載の方法。
１２２．人工染色体が遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含むことを特徴とする上記１１４から１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．人工染色体が遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含んでおり、発育した動物がその動物の母乳中に遺伝子産物を発現することを特徴とする上記１１６に記載の方法。
１２４．異種ＤＮＡが動物内でアンチセンスＲＮＡをコードすることを特徴とする上記１２２に記載の方法。
１２５．宿主が雌牛、ヤギ、マウス、雄牛、ラタダ、ブタ及びヒツジから成る群より選択されることを特徴とする上記１１４から１２２のいずれかに記載の方法。
１２６．得られる動物がマウスであることを特徴とする上記１１６に記載の方法。
１２７．人工染色体が直接取り込み、微量注入、細胞融合、ミクロセル（微小核体）融合、エレクトロポレーション、電気融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール転移及び脂質介在転移から成る群より選択される方法により核ドナー細胞に導入されることを特徴とする上記１１４から１２２のいずれかに記載の方法。
１２８．ドナー細胞と受容体細胞とを融合することにより核ドナー細胞の核が受容体細胞に転移することを特徴とする上記１１４に記載の方法。
１２９．微量注入により核ドナー細胞の核が受容体細胞に転移することを特徴とする上記１１４に記載の方法。
１３０．遺伝子産物が嚢胞性繊維症膜貫通調節蛋白質、抗ＨＩＶリボザイムまたは腫瘍抑制遺伝子であることを特徴とする上記１２２に記載の方法。
１３１．抗ＨＩＶリボザイムが抗ｇａｇリボザイムであり、腫瘍抑制遺伝子がｐ５３であることを特徴とする上記１３０に記載の方法。
１３２．遺伝子産物が、発現によって（ヒト以外の）トランスジェニック動物中で病原体に対する免疫防御応答を誘発する抗原を含むことを特徴とする上記１２２に記載の方法。
１３３．遺伝子産物が、発現によって複数の病原体に対する免疫防御応答を誘発する複数の抗原を含むことを特徴とする上記１２２に記載の方法。
１３４．遺伝子産物がホルモン、抗体、サイトカイン、成長因子、調節蛋白質、または分泌蛋白質であることを特徴とする上記１２２に記載の方法。
１３５．動物が卵生であることを特徴とする上記１１６に記載の方法。
１３６．動物が鶏または昆虫であることを特徴とする上記１１６に記載の方法。
１３７．サテライト人工染色体がヒト細胞表面蛋白質発現用遺伝子をコードするＤＮＡを含み、それにより動物の器官がヒト蛋白質を発現し、ヒトに移植されたときに拒絶が生じないことを特徴とする上記１１４から１２２のいずれかに記載の方法。
１３８．サテライト人工染色体を植物細胞に導入する段階と、サテライト人工染色体を含む植物が発生する条件下で細胞を培養する段階とを含んで成るトランスジェニック植物の産生方法。
１３９．サテライト人工染色体が植物人工染色体であることを特徴とする１３８に記載の方法。
１４０．サテライト人工染色体が動物人工染色体であることを特徴とする１３８に記載の方法。
１４１．サテライト人工染色体が哺乳動物人工染色体であることを特徴とする１３８に記載の方法。
１４２．細胞がプロトプラストであることを特徴とする１３８から１４１のいずれかに記載の方法。
１４３．細胞がタバコ、米、トウモロコシ、ライ麦、小麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモ、トマトまたはシロイヌナズナの細胞であることを特徴とする１３８から１４１のいずれかに記載の方法。
１４４．人工染色体が脂質介在転移、細胞融合、微量注入、ミクロセル（微小核体）融合、エレクトロポレーション、微粒子衝撃、ポリエチレングリコール転移、核転移または直接ＤＮＡ転移により導入されることを特徴とする上記１３８から１４３のいずれかに記載の方法。
１４５．サテライト人工染色体が上記１に記載の方法によって得られることを特徴とする上記１３８に記載の方法。
１４６．人工染色体が遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含むことを特徴とする上記１３８から１４５のいずれかに記載の方法。
１４７．植物細胞が単子葉植物または双子葉植物の細胞であることを特徴とする上記１３８に記載の方法。
１４８．上記１３８から１４７のいずれかに記載の方法によって得られるトランスジェニック植物。
１４９．サテライト人工染色体を含むトランスジェニック植物。
１５０．サテライト人工染色体が植物のサテライト人工染色体または哺乳動物のサテライト人工染色体であることを特徴とする１４９に記載のトランスジェニック植物。
１５１．タバコ、米、トウモロコシ、ライ麦、小麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモ、トマトまたはシロイヌナズナであることを特徴とする１４８から１５０のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
１５２．遺伝子治療に有用な組成物の製造のためのサテライト人工染色体の使用。
１５３．サテライト人工染色体が上記１に記載の方法によって得られたものであることを特徴とする上記１５２に記載の使用。
１５４．人工染色体が治療用物質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする上記１５２に記載の使用。
１５５．治療用物質をコードするＤＮＡが、リンパ球、幹細胞、神経細胞及び筋肉細胞から成る群より選択されるターゲット細胞に導入されることを特徴とする上記１５４に記載の使用。
１５６．遺伝子治療に使用するためのサテライト人工染色体を含む組成物。
本発明により、哺乳動物人工染色体［ＭＡＣ］が提供される。ＭＡＣおよび本発明の方法を用いて製造される昆虫、鳥、ニワトリおよび魚などの他の高等真核生物についての人工染色体も提供される。そのような染色体の形成方法および単離方法も提供される。昆虫、鳥、ニワトリおよび魚類などの他の動物から、ＭＡＣを用いて人工染色体を構築する方法も提供される。人工染色体は、十分機能的に安定な染色体である。２種類の人工染色体が提供される。１種類は、本明細書においてＳＡＴＡＣと称するもので（付随人工染色体または付随ＤＮＡに基づく人工染色体（これら用語は本明細書では互換的に使用する））、安定な異質染色質染色体であり、他方の種類は真正染色質の増幅に基づくミニ染色体である。
人工染色体は、１個のプロモーターに機能的に連結された１個の遺伝子の複数コピーあるいは各個別のプロモーターに連結された各コピーまたはいくつかのコピーなどの１個もしくは複数の遺伝子を含むメガ塩基［Ｍｂ］対の大きさのＤＮＡ断片の標的組み込みのためのゲノム外座を提供するものである。そこで、ＭＡＣを用いて、細胞、組織および動物ならびに鳥、ニワトリ、魚および植物などの生物に遺伝子を導入する方法も提供される。組み込み異種ＤＮＡを有する人工染色体は、遺伝子治療；遺伝子産生物、特には複遺伝子性生合成経路の発現を必要とし、遺伝子導入（人間以外の）動物、鳥、鶏および魚を生産するための、胚幹細胞［ＥＳ細胞］などの生殖細胞系細胞の核への導入のための産生物の製造方法で使用することができる。単子葉植物および双子葉植物などの遺伝子導入植物も、本発明では想到される。
哺乳動物人工染色体は、対象とする蛋白をコードする遺伝子の導入のためのゲノム外特異的組み込み部位を提供し、メガ塩基の大きさのＤＮＡ組み込みが可能であることから、例えば、代謝経路全体をコードする遺伝子あるいは嚢胞性繊維症［ＣＦ；約２５０ｋｂ］ゲノムＤＮＡ遺伝子、多価ワクチン製造のための一連の抗原をコードする多重遺伝子などのいくつかの遺伝子などの非常に大きい遺伝子を安定に細胞に導入することができる。ｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子、嚢胞性繊維症膜貫通調節蛋白質［ＣＦＴＲ］のｃＤＮＡ、および抗ＨＩＶｇａｇリボザイム（ribozyme）遺伝子などの抗ＨＩＶリボザイムの遺伝子等のそのような遺伝子を人工染色体に標的導入するためのベクターも提供される。
本発明で提供される染色体は、細胞、好ましくは安定な細胞系に、１個または複数の選択可能なマーカーをコードするＤＮＡを含む異種ＤＮＡを導入し；細胞を選択条件で成長させ；得られたクローンの中から、１以上の動原体および／またはそれの断片を有する染色体を含むクローンを確認することで形成される。追加の動原体を製造する増幅が、染色体の挟動原体領域の動原体付近で異種ＤＮＡが組み込まれた染色体を含む細胞で起こる。次に、特定のクローン細胞を用いて、人工染色体を形成する。
ＤＮＡの非標的導入によって適切な座への組み込みをいくらかの頻度で生じるが、標的導入が好ましい。そこで好ましい実施態様では、細胞に導入されて人工染色体の形成を行う選択可能マーカーを有するＤＮＡが、挟動原体領域、異質染色質および特には染色体のｒＤＮＡなどの増幅可能領域を標的としてそれを導入する配列を有する。例えば、それぞれマウス付随ＤＮＡおよびヒト付随ＤＮＡに特異的なそのようなＤＮＡを含むｐＴＥＭＰＵＤおよぴｐＨＡＳＰＵＤ（本発明で提供）のようなベクターが提供される。プラスミドｐＨＡＳＰＵＤは、ヒト染色体を特異的に標的とするヒト付随ＤＮＡ配列を含むｐＴＥＭＰＵＤの誘導体である。好ましい標的配列には、異種ＤＮＡを標的として、ｒＤＮＡを含む染色体のｒＤＮＡ領域に組み込む哺乳動物リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列（本明細書においてはｒＤＮＡと称する）などがある。例えば、マウスｒＤＮＡを含むｐＴＥＲＰＵＤなどのベクターが提供される。細胞に存在する染色体に組み込む際、これらのベクターは増幅を誘発することができ、それによって追加の動原体が形成される。
人工染色体は、細胞を多動原体染色体、代表的には二動原体染色体とともに、染色体が切断されてミニ染色体と元二動原体（formerly dicentric）染色体とを形成する条件下に培養することで形成される。本発明で提供されるＭＡＣの中には、主として短い付随ＤＮＡの反復単位からなり、ほぼ完全に異質染色性であることから、異種もしくは異質のＤＮＡの挿入がなければ、染色体が好ましくは遺伝情報を持たないか、あるいはｒＤＮＡ配列などの非蛋白コード遺伝子配列のみを有するＳＡＴＡＣがある。そこで、それは有害である可能性のある遺伝子を持たないことから、哺乳動物宿主へのＤＮＡ組み込みのための「安全な」ベクターとして使用することができる。ＳＡＴＡＣは、例えば米国特許５２８８６２５号におけるようなミニ染色体断片からではなく、元二動原体染色体の断片から形成される。
さらに、真正染色質ミニ染色体の形成方法およびそれの使用方法も本発明で提供される。ある種のＭＡＣ、すなわち米国特許５２８８６２５号にすでに記載されているミニ染色体の形成方法ならびに異種ＤＮＡの発現のためのそれの使用方法が提供される。ミニ染色体などのＭＡＣを形成するための本発明で提供される特定の方法では、哺乳動物ｒＤＮＡを含む異種ＤＮＡおよび１以上の選択可能マーカー遺伝子を細胞に導入し、それを次に、選択条件下に成長させる。複数の動原体を有する染色体を含む得られた細胞を選別し、染色体が分裂しでミニ染色体およびミニ染色体が放出される元多動原体（代表的には二動原体）染色体を形成する条件下で培養する。
ミニ染色体を含む細胞系およびそれの細胞融合への使用も提供される。１実施態様において、哺乳動物ミニ染色体を含む細胞系を、特定の遺伝子または複数遺伝子をコードするドナーＤＮＡに対する受容細胞として使用する。ドナーＤＮＡのミニ染色体への組み込みを容易にするため、受容細胞系には好ましくはミニ染色体を含ませるが、やはり元二動原体染色体は含ませない。これは、細胞融合ならびにミニ染色体を含むが元二動原体染色体を含まない細胞の選別などの本明細書に開示の方法によって行うことができる。ドナーＤＮＡを、第２の選択可能マーカーに連結し、ミニ染色体を標的とし、それに組み込む。得られた染色体を、細胞融合によって、チャイニーズ・ハムスター細胞系［ＣＨＯ］などの適切な受容細胞系に転移させる。遺伝子操作染色体を有する細胞の大量生産後、その染色体を単離する。詳細には、コルヒチン添加などによって中期染色体を得て、それを細胞溶解物から精製する。その染色体を、異種ＤＮＡのクローニング、配列決定および細胞への組み込みに使用する。
選択条件下での反復培養ならびに元二動原体染色体から生産される染色体を含む細胞のサブクローニングによって形成される各種大きさのＳＡＴＡＣも提供される。ＳＡＴＡＣの例としては、約１５Ｍｂ［２個の約７．５Ｍｂブロック］である反復ＤＮＡ単位に基づいたものである。他の生物および他の染色体から形成されるＳＡＴＡＣの反復ＤＮＡ単位は変動し得るが、代表的には、約７〜約２０Ｍｂ程度であると考えられる。反復ＤＮＡ単位は本明細書ではメガレプリコンと称するが、それは例示のＳＡＴＡＣでは、異種ＤＮＡおよび非付随ＤＮＡなどの非ＤＮＡが隣接する付随ＤＮＡの縦列ブロックを含む。増幅によって、異種［「外来」］ＤＮＡと接する２個の反転メガレプリコンを含む１列の染色体部分（それぞれアンプリコンと称される）が生産される。細胞融合、選択培地での成長および／またはＢｒｄＵ［５−ブロモデオキシウリジン］処理または他のゲノム不安定化試薬または不安定化剤による他の処理（Ｘ線などによるイオン化放射線照射等）ならびにサブクローニングを繰り返すことで、１５０〜２００Ｍｂの「ソーセージ」染色体、５００〜１０００Ｍｂのギガ染色体、安定な２５０〜４００Ｍｂのメガ染色体ならびにそれらから誘導される各種の相対的に小さい安定な染色体などの安定な異質染色性または部分的に異質染色性の染色体を有する細胞系が得られる。これらの染色体は、これらの反復単位に基づいたものであり、発現される異種ＤＮＡを含み得るものである。
そこで、両方の種類のＭＡＣ（すなわち、ＳＡＴＡＣＳおよびミニ染色体）の製造方法が提供される。その方法は、哺乳動物、鳥、鶏、魚、昆虫および植物などの高等真核生物細胞由来の動原体を有する人工染色体の製造に利用される。
得られる染色体を本発明で提供される方法によって精製して、異種ＤＮＡを特定細胞に導入して異種ＤＮＡによってコードされた遺伝子産生物の生産、遺伝子導入（人間以外）の動物、鳥、鶏、魚および植物の生産あるいは遺伝子治療を行うためのベクターを提供することができる。
さらに、ミニ染色体およびＳＡＴＡＣの断片化のための方法およびベクターが提供される。そのような方法およびベクターは、比較的小さく安定な人工染色体のin vivoでの形成に使用することができる。染色体断片化のためのベクターを用いて、メガレプリコン、動原体および２個の末端小粒を有し、約７．５Ｍｂ〜約６０Ｍｂ、好ましくは約１０Ｍｂ〜１５Ｍｂおよび３０〜５０Ｍｂのものである人工染色体を製造する。例を挙げると、好ましい範囲は約７．５Ｍｂ〜５０Ｍｂである。そのような人工染色体は、他の方法によって製造することもできる。
１５Ｍｂ（または２個の反転繰り返し単位を有する３０Ｍｂアンプリコン）または３０Ｍｂ以上のそれのマルティマー（例：６０Ｍｂ）の単離は、in vitroで操作できる安定な染色体ベクターを提供するものでなければならない。ＭＡＣを小さくしてより安定な自己再生人工染色体を形成する方法も提供される。
さらに本発明では、本明細書で提供のもののような哺乳動物人工染色体をin vitroで製造する方法ならびに得られる染色体も提供される。その方法では、構造要素および機能要素をin vitroで組み立てて、安定な人工染色体を提供する。そのような要素には、動原体、２個の末端小粒、１個以上の複製源ならびに付随ＤＮＡなどの充填物異質染色質などがある。その後の選択のための選択可能マーカーなどもあり得る。これらの特異的ＤＮＡ要素は、異種ＤＮＡの細胞への導入ならびに人工染色体、特にはＳＡＴＡＣを生じるその後の増幅によって形成されたものなどの本発明で提供される人工染色体から得ることができる。人工染色体のin vitroでの構築に使用する動原体配列も、本発明で提供される動原体クローニング法を用いることで得ることができる。好ましい実施態様においては、複製源、特にはメガレプリケータを提供する配列はｒＤＮＡ由来のものである。これらの配列には好ましくは、ｒＤＮＡ複製源および増幅促進配列などがある。
異種ＤＮＡを人工染色体に狙って組み込む方法およびベクターも、相対的に小さいが安定で自己再生性の人工染色体を製造するための染色体の断片化方法およびそのためのベクターと同様に提供される。
前記染色体を細胞に導入して、細胞源に応じて、安定な形質転換細胞系または細胞を得る。導入は、エレクトロポレーション；リン酸カルシウム沈殿などによる直接取り込み；リポフェクション（lipofection）、微小核体融合、脂質介在キャリア系その他の好適な方法による単離染色体の取り込みなど（ただし、これらの方法に限定されるものではない）の好適な方法によって行われる。得られる細胞は、細胞中での蛋白生産に使用することができる。その染色体は単離して、遺伝子取り込みに使用することができる。基準染色体と比較してＭＡＣにおいて異なる染色体のＤＮＡ含有量に基づく染色体の単離方法が提供される。さらに、ＭＡＣの含有量、特に密度および大きさによって決まる方法も提供される。
これらの人工染色体は、遺伝子治療；遺伝子産生物生産系；人化した遺伝子形質転換動物臓器の生産；遺伝子導入した植物および哺乳動物、鳥、鶏、魚、無脊椎動物、脊椎動物、は虫類および昆虫なとの動物（人間以外）、臓器または情報保存媒体として染色体要素を使用すると考えられる機器の生産；ならびに、動原体機能の分析および研究；in vitroで構築できる人工染色体ベクターの生産；および生物特異的人工染色体の製造で使用することができる。人工染色体は、微量注入法、細胞融合、微小核体融合、エレクトロポレーション、核転移、電気融合、粒子衝撃法（projectile bombardment）、核転移、リン酸カルシウム沈殿、脂質介在転移系および他のそのような方法を用いて、細胞に導入することができる。人工染色体とともに使用するのに特に好適な細胞には、特にトマト、シロイヌナズナ（arabidopsis）およびその他のような植物細胞；カイコ細胞などの昆虫細胞；昆虫の幼虫；魚；は虫類；両生類；蜘蛛；哺乳動物細胞；鳥の細胞；胚幹細胞；造血幹細胞；胚ならびに養子免疫療法で使用されるリンパ球および神経もしくは神経細胞などの遺伝子療法で使用される細胞などがあるが、これらに限定されるものではない。そこで、遺伝子産生物および遺伝子導入（人間以外）動物および植物を生産する方法も提供される。得られる遺伝子導入動物・植物も提供される。
これらの染色体を含む細胞系の例も提供される。
特定生物についての人工染色体を製造する方法および動原体のクローニング方法も提供される。例えば、異なる生物で使用される人工染色体を形成するために提供される２つの方法の例を以下に示す。第１に、本発明の方法を異なる生物に適用することができる。第２に、生物特異的人工染色体の形成手段および動原体をクローニングする手段が提供される。詳細には、動物または植物からの動原体をクローニングする方法は、その植物もしくは動物のゲノムを含むＤＮＡ断片のライブラリを得て、各断片を、選択した植物もしくは動物（通常は非哺乳動物）と異なる生物（通常は哺乳動物）からの動原体および選択可能なマーカーを含む哺乳動物付随人工染色体［ＳＡＴＡＣ］に導入することで得られる。選択される植物または動物は、哺乳動物動原体が機能しないものである。各ＳＡＴＡＣを、選択条件下で成長する細胞に導入し、それを選択条件下に成長させ、ＳＡＴＡＣを有する細胞を確認する。そのようなＳＡＴＡＣはライブラリからのＤＮＡによってコードされた動原体を有するはずであるか、あるいは選択された生物における安定な複製に必要な要素を有するはずである。
比較的大きいＤＮＡ断片が人工染色体に含まれているライブラリも提供される。
遺伝子導入（人間以外）動物、無脊椎動物および脊椎動物、植物および昆虫、魚、は虫類、両生類、蜘蛛、烏、鶏および哺乳動物も提供される。特に興味深いものは、耐性を与えるか疾患に対する感受性を低下させる遺伝子を発現する遺伝子導入（人間以外）動物および植物である。例えば転移遺伝子（transgene）は、ウイルス、細菌または害虫などの病原体に対して毒性があるが、遺伝子導入宿主には毒性を持たない蛋白をコードすることができる。さらに、複数の遺伝子をＭＡＣに導入できることから、抗原をコードする一連の遺伝子を導入し、それが発現時に、抗原への曝露によって免疫または何らかの保護を与える疾患に対して宿主動物を免疫感作する［多価ワクチンと同様にして］上で役立つ。
さらには、疾患の研究ならびにそれの治療および治癒法を開発する上で使用されるある種の疾患および障害のモデルとして役立つ遺伝子導入（人間以外）動物も興味深い。そのような疾患の動物モデルは、ＭＡＣで動物に導入され、その動物において疾患もしくは障害を誘発する遺伝子［代表的には、疾患関連の突然変異を有する遺伝子］を発現する。同様に、アンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子を有するＭＡＣを動物細胞に導入して、条件的「ノックアウト」遺伝子導入（人間以外）動物を得ることができる。そのような動物では、アンチセンスＲＮＡの発現によって、アンチセンスＲＮＡに相当する遺伝子の産生物が減少するか完全になくなる。さらに興味深いものとしては、動物の母乳で発現される治療蛋白をコードする含ＭＡＣ遺伝子を有している遺伝子導入哺乳動物がある。動物の臓器を人化するのに役立つ含ＭＡＣ遺伝子を発現する、異物移植術用の遺伝子導入（人間以外）動物も興味深い。動物臓器の人化で使用可能と考えられる遺伝子には、ヒト表面抗原をコードするものなどがある。
哺乳動物動原体などの動原体のクローニング方法も提供される。詳細には、１実施態様において、ＳＡＴＡＣの断片から構成されるライブラリを、チロシナーゼをコードするＤＮＡなどの検出可能なマーカーを有するＹＡＣ［酵母人工染色体］にクローニングし、次にアルビノマウス胎仔などの哺乳動物細胞に導入する。哺乳動物で機能する動原体を含むようなＹＡＣを有する胎仔から得られるマウスは、前記の検出可能マーカーを発現する。そこで、機能性の哺乳動物動原体が導入されたアルビノマウス胎仔からマウスを得た場合、そのマウスは有色であるか、または有色領域を有する。
ＤＮＡの反復縦列配置を製造する方法も提供される。本明細書ではテロメアＤＮＡを用いた例を示しているこの方法は、いかなる反復配列にも適用可能であり、特に複雑さの小さい反復に適用可能である。縦列ＤＮＡの配置の合成のために本発明で提供される方法は、一連の延長段階に基づくものであり、その延長段階では、反復配列を連続的に倍化することで、縦列反復の配置が級数的に延長する。縦列反復を有するＤＮＡ断片を合成する方法の１実施態様について、以下に説明する。出発原料としては、２個のオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチド１は、長さｋの反復配列（その横は無関係である）のものであり、反復配列の比較的短い長さのもの（６０〜９０ヌクレオチド）を有し、それに隣接して適切に選択された制限部位がある。
５'-S1＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞S2 -３'
ここでＳ１はＥ１によって開裂する制限部位１であり、Ｓ２はＥ２によって開裂する第２の制限部位であり、＞は簡単な反復単位を表し、「 」は下記のオリゴヌクレオチド２と相補的な配列が隣にある短い（８〜１０）ヌクレオチドを示す。
３'- S3-５'
ここで、Ｓ３は酵素Ｅ３についての第３の制限部位であり、構築の際に使用されるベクターに存在する。その方法では次の段階を行う。（１）オリゴヌクレオチド１および２をアニーリングする；（２）アニーリングされたオリゴヌクレオチドを埋めて、二本鎖（ｄｓ）配列を得る；（３）二本鎖ＤＮＡを制限酵素Ｅ１およびＥ３で開裂させ、次に、同じ酵素Ｅ１およびＥ３で開裂させてあったベクター（例：ｐＵＣ１９または酵母ベクター）に連結する；（４）制限酵素Ｅ１およびＥ３で消化させることで、プラスミドの第１の部分から挿入物を単離し、プラスミドの第２の部分を酵素Ｅ２（３’の突出を除くための処理）およびＥ３で切断し、大きい断片（プラスミドＤＮＡと挿入物）を単離する；（５）２個のＤＮＡ断片（Ｓ１〜Ｓ３挿入物断片とベクター＋挿入物）を連結する；（６）段階４および５を必要な回数繰り返して、所望の反復配列の大きさとする。各延長サイクルで、反復配列の大きさは倍化する。すなわち、ｍを延長サイクルの回数とすると、反復配列の大きさはｋ×２ｍヌクレオチドとなる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用の全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有するものとする。本明細書で引用の全ての特許および刊行物は引用によって本明細書に含まれるものとする。
本明細書で使用する場合、哺乳動物人工染色体［ＭＡＣ］とは、内因性染色体とともに、安定に複製および分離できるＤＮＡ片である。それは、染色体に挿入された異種遺伝子を収容および発現できるものである。それは活性な哺乳動物動原体を有することから、哺乳動物人工動原体と称する。植物人工染色体、昆虫人工染色体および鳥人工染色体は、それぞれ植物および昆虫の動原体を含む染色体と称する。ヒト人工染色体［ＨＡＣ］とは、ヒト動原体を含む染色体を指し、ＢＵＧＡＣとは昆虫人工染色体を指し、ＡＶＡＣとはトリ人工染色体を指す。本発明で提供されるＭＡＣ中、ＳＡＴＡＣ、ミニ染色体およびin vitro合成人工染色体がある。各種類の構築方法が本発明で提供される。
本明細書で使用する場合、in vitro合成人工染色体とは、必須構成要素（少なくとも動原体、複製源）をin vitroで結合することで得られる人工染色体である。
本明細書で使用する場合、内因性染色体とは、ＭＡＣの形成または導入以前に細胞で認められるゲノム染色体を指す。
本明細書で使用する場合、安定な染色体維持とは、約８５％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の細胞が染色体を保持する場合のものである。安定性は、選択剤の存在下に測定する。好ましくは、それらの染色体は、選択剤不在下でも維持される。安定な染色体はさらに、細胞培養時にそれの構造を保持し、染色体内や染色体間の再配列を起こすことがない。
本明細書で使用する場合、選択条件下での成長とは、生残についての選択可能マーカーの発現を必要とする条件下での細胞の成長を意味する。
本明細書で使用する場合、染色体を不安定化させる薬剤は、増幅事象、突然変異を促進することが、当業者には公知のいずれかの薬剤である。ＢｒｄＵを含むそのような薬剤は、当業者には公知である。
本明細書で使用する場合、動原体に関して「デノボ（新規の）」という用語は、本発明の方法を用いて異種ＤＮＡ断片を組み込んだことで生じる過剰の動原体形成を指す。
本明細書で使用する場合、真正染色質および異質染色質は、それらの一般に認められた意味を有する。すなわち真正染色質は、広範に染色し、代表的には遺伝子を含む染色質を指し、異質染色質とは、異常に凝縮したままで、転写的には不活性であると考えられている染色質を指す。少なくとも哺乳動物細胞に関して、非常に反復性の高いＤＮＡ配列［付随ＤＮＡ］は通常、動原体周囲の異質染色質［挾動原体異質染色質］の領域にある。構成異質染色質とは、構成上凝縮しており、遺伝的に不活性である非常に反復性の高いＤＮＡを含む異質染色質を指す。
本明細書で使用する場合、ＢｒｄＵとは、複製時にチミジンに代わって挿入される５−ブロモデオキシウリジンを指す。ＢｒｄＵは、突然変異原として使用される。それはさらに、細胞分裂時の中期染色体の凝縮を阻害する。
本明細書で使用する場合、二動原体染色体とは、２個の動原体を有する染色体である。多動原体染色体は、２個より多い動原体を有する。
本明細書で使用する場合、元二動原体染色体とは、二動原体染色体が断片化し、新たな末端小粒を獲得することで、それぞれが一方の動原体を有する２個の染色体を生成する時に生成する染色体である。各断片は複製可能な染色体である。
染色体の一方について真正染色質ＤＮＡの増幅を行って、新たに導入された異質ＤＮＡおよび主として［少なくとも５０％超］真正染色質を含む完全に機能性の染色体が得られる場合、それはミニ染色体である。残りの染色体は、元二動原体染色体である。一方の染色体について増幅を行うことで、異質染色質［付随ＤＮＡ］が増幅され、真正染色質部分［または腕］が残っている場合、それはソーセージ染色体と称される。異種ＤＮＡの部分を除く実質的に全ての異質染色質である染色体はＳＡＴＡＣと称される。そのような染色体［ＳＡＴＡＣ］は、ＢｒｄＵ処理および／または選択条件下での増殖のように、染色体を不安定化させることで、付随人工染色体［ＳＡＴＡＣ］を生成する条件下でソーセージ染色体を含む細胞を培養することで、ソーセージ染色体から生成することができる。本明細書に関しては、ＳＡＴＡＣは必ずしも複数段階で生成するとは限らないが、最初に異種ＤＮＡを導人し、選択条件下に成長させた後に生じるか、あるいは選択条件下でのいくつかの成長サイクルおよびＢｒｄＵ処理後に生じ得るものであることは明らかである。
本明細書で使用する場合、ＳＡＴＡＣとは異種ＤＮＡの部分を除く実質的に全て異質染色質である染色体を指す。代表的には、ＳＡＴＡＣは不随ＤＮＡに基づく人工染色体であるが、その用語は、真正染色質より異質染色質を多く含む本発明の方法によって得られる染色体を含むものである。
本明細書で使用する場合、染色体に関して使用する際、特には本発明によって提供されるＳＡＴＡＣ形成方法について使用する際の「増幅可能」という用語は、増幅を起こしやすい染色体領域を指す。増幅は代表的には、複製および他の組換えが関与する細胞事象の際に生じる。そのような領域は代表的には、付随ＤＮＡ、ｒＤＮＡおよび他のそのような配列などの縦列反復を含む染色体領域である。
本明細書で使用する場合、ＤＮＡに関しての「増幅」とは、ＤＮＡの部分を複製して、実質的に縦列もしくは連続反復単位または反転反復単位としてつながっているのが普通の同一もしくはほぼ同一のＤＮＡ部分の２個以上のコピーを生じるプロセスである。
本明細書で使用する場合アンプリコンとは、メガレプリコンの１組の反転反復単位を有する反復ＤＮＡ増幅単位である。メガレプリコンは、比較的高次の複製単位を代表するものである。例えば、ＳＡＴＡＣに関して、メガレプリコンは、それぞれが非付随ＤＮＡの隣接する付随ＤＮＡを有する１組の縦列ＤＮＡブロックを有する。挟動原体異質染色質および恐らくは動原体の複製の調整および促進に関与すると考えられるメガレプリケータと称される一次複製部位が、メガレプリコン内にある。メガレプリコン内には、相対的に小さい［例：一部の哺乳動物細胞で５０〜３００ｋｂ］二次レプリコンがある場合がある。例示のＳＡＴＡＣでは、メガレプリコンは、２個の約７．５Ｍｂの縦列ＤＮＡブロックによって決定されている［例えば図３参照］。各人工染色体［ＡＣ］内で、あるいはそれの群において、各アンプリコンはほぼ同じ構造を有するが、配列が異なっている場合がある。そのような配列の差異は、特に培養時に生じる移動性遺伝要素の運動、欠失もしくは挿入または突然変異の結果生じるものである。そのような差異は、本明細書に記載のＡＣの使用やその全体的構造に影響を与えるものではない。
本明細書で使用する場合、リボソームＲＮＡ［ｒＲＮＡ］とは、リボソーム構造の一部を形成し、蛋白合成に関与する特殊化したＲＮＡである。リボソームＲＮＡは、真核生物細胞において複数コピーに存在する遺伝子の転写によって産生される。ヒト細胞においては、一倍体ゲノム当たり約２５０コピーのｒＲＮＡ遺伝子が、５以上の異なる染色体（１３、１４、１５、２１および２２番染色体）上のクラスターで広がっている。マウス細胞では、リボソームＤＮＡ［ｒＤＮＡ］の存在は、２０個のマウス染色体中の１１以上の対［５、６、９、１１、１２、１５、１６、１７、１８、１９番染色体およびＸ染色体］で確認されている（Rowe et al（1996）Mamm.Genome 7:886-889およびJohnson et al（1993）Mamm.Genome 4:49-52参照）。真核生物細胞では、高度に保存されたｒＲＮＡの複数コピーが、縦列に配置された一連のｒＤＮＡ単位にあり、該ｒＤＮＡ単位は長さが約４０〜４５ｋｂであり、転写領域ならびに長さおよび配列において多様であり得るスペーサ（すなわち、遺伝子間スペーサ）ＤＮＡとして知られる非転写領域を有する。ヒトおよびマウスにおいて、これらの縦列配置のｒＤＮＡ単位は、挟動原体付随ＤＮＡ配列（異質染色質）に隣接している。ｒＤＮＡかあるこれら染色体領域は、核小体形成部位（ＮＯＲ）と称され、細胞核中のリボソーム産生部位である核仁に輪状に存在する。
本明細書で使用する場合、ミニ染色体とは、異質染色質ＤＮＡより多くの真正染色質ＤＮＡを含む多動原体染色体、代表的には二動原体染色体（例えば図１参照）由来の染色体を指す。
本明細書で使用する場合、メガ染色体とは、導入された異種ＤＮＡを除き、実質的に異種染色質から構成される染色体を指す。メガ染色体は、導入された異種ＤＮＡに隣接する２個の反転メガレプリコンを有する反復アンプリコン配置からなる（例えば、メガ染色体の模式図については図３参照）。本発明に関しては、メガ染色体は、約５０〜４００Ｍｂ、一般には約２５０〜４００Ｍｂである。相対的に短いものは切断メガ染色体［約９０〜１２０もしくは１５０Ｍｂ］、矮小メガ染色体［約１５０〜２００Ｍｂ］および細胞系、ならびにミクロメガ染色体［約５０〜９０Ｍｂ、代表的には５０〜６０Ｍｂ］とも称される。本発明に関しては、メガ染色体という用語は、いずれかの挿入異種ＤＮＡに隣接する２個の反転メガレプリコンを有する反復染色体部分［アンプリコン］の配に基づいた全体的に反復性の構造を指す。その大きさを指定する。
本明細書で使用する場合、遺伝子治療には、ある種の細胞すなわち標的細胞への異種ＤＮＡの転移もしくは挿入による、疾患の改善もしくは調節に関与する具体的な遺伝子産生物の取得が関与する。異種ＤＮＡが発現され、それによってコードされた産生物を産生するような形で、特定の標的細胞に、そのＤＮＡを導入する。別法として、異種ＤＮＡは何らかの形で、治療性生成物をコードするＤＮＡの発現に介在する。それは、何らかの形で、直接もしくは間接に治療性生成物の発現に介在する、ペプチドもしくはＲＮＡなどの生成物をコードすることができる。さらに、遺伝子治療を用いて、宿主では通常は産生されないか、あるいは治療上有効な量または治療上有用な時期に産生されないＴＮＦなどの治療性化合物を導入することも可能である。標的細胞によって疾患を患っている生体内でのその標的細胞による異種ＤＮＡの発現によって疾患の調節を行うことができる。治療性生成物をコードする異種ＤＮＡに修飾を行ってから、疾患を患っている宿主の細胞に導入して、それの産生物もしくは発現を促進その他の形で変えることができる。
本明細書で使用する場合、異種または外来のＤＮＡおよびＲＮＡは互換的に使用され、天然に生じるものとは異なるゲノムの位置に存在もしくは認められるゲノムの一部として天然には生じないＤＮＡまたはＲＮＡを指す。それは、細胞に対しては内因性ではなく、細胞に外部から導入されたＤＮＡもしくはＲＮＡである。異種ＤＮＡの例としては、遺伝子治療またはコードされた蛋白の産生を目的として導入された、対象とする遺伝子産物または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡなどがあるが、それに限定されるものではない。異種ＤＮＡの他の例としては、薬剤耐性を与える蛋白などの追跡可能なマーカー蛋白をコードするＤＮＡ、抗癌剤、酵素およびホルモンなどの治療上有効な物質をコードするＤＮＡ、抗体などの他の種類の蛋白をコードするＤＮＡなどがあるが、それらに限定されるものではない。異種ＤＮＡによってコードされる抗体は、その異種ＤＮＡを導入した細胞の表面で分泌または発現され得る。
本明細書で使用する場合、治療上有効な生成物とは、ＤＮＡを宿主に導入した際に、先天性疾患もしくは後天性疾患の症状、発現を効果的に緩和もしくは解消する生成物またはその疾患を治癒させる生成物が発現される異種ＤＮＡによってコードされた生成物である。
本明細書で使用する場合、遺伝子導入植物とは、異種もしくは外来ＤＮＡが発現される植物、あるいは植物に天然に存在する遺伝子の発現に変化が生じた植物を指す。
本明細書で使用する場合、プロモーター、エンハンサー、転写・翻訳終止部位、他の信号配列などのヌクレオチドの調節配列およびエフェクタ配列に対する異種ＤＮＡの機能的（operative）連結とは、そのようなＤＮＡとそのようなヌタレオチド配列との間の関係を指す。例えば、プロモーターに対する異種ＤＮＡの機能性連結とは、そのようなＤＮＡの転写が、読み取り枠でそのＤＮＡの認識、結合および転写を行うＲＮＡポリメラーゼによって、プロモーターから開始するような、異種ＤＮＡとプロモーターの間の物理的関係を指す。好ましいプロモーターには、哺乳動物腺特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーター；ＴＫ、ＣＭＷ、アデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーター；ならびに当業者に公知の他のプロモーターなどがある。
本明細書で使用する場合、単離された実質的に純粋なＤＮＡとは、当業者が用いる標準的方法に従って精製されるＤＮＡ断片を指す（例えば、Maniatis et al.（1982）Molecular Cloning:A Laborator Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NYにあるもの）。
本明細書で使用する場合、発現とは、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に翻訳されるプロセスを指す。核酸がゲノムＤＮＡ由来のものである場合、適切な真核生物宿主細胞または生体を選択すると、発現にはｍＲＮＡのスプライシングか含まれる場合がある。
本明細書で使用する場合、ベクターもしくはプラスミドは、異種ＤＮＡの発現またはクローニングされた異種ＤＮＡの複製のいずれかを目的として細胞中に異種ＤＮＡを導入するのに使用される別個の要素を指す。そのようなベクターおよびプラスミドの選択および使用は、当業界の技術レベルの範囲内である。
本明細書で使用する場合、形質転換／トランスフェクションとは、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。トランスフェクションとは、実際にいずれのコード配列が発現されるかとは無関係に、宿主細胞による発現ベクターなどの外来核酸の取り込みを指す。多くのトランスフェクション法が当業者には知られており、例えば、リン酸カルシウムを用いた直接取り込み［ＣａＰＯ4；例えば、Wigler et al．（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76:1373-1376］、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］介在ＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、リボフェクション［例えば、Strauss（1996）Meth.Mol.Biol.54:307-327］、微小核体融合［実施例参照、さらにはLambert（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．88:5907-5911;米国特許５３９６７６７号；Sawford et al．（1987）Somatic Cell Mol.Genet．13:279-284；Dhar et al．（1984）Somatic Cell Mol.Genet．10:547-559;およびMcNeill-Killary et al．（1995）Meth.Enzymol．254:133-152参照］、脂質介在キャリア系［例えば、Teifel et al．（1995）Biotechniques 19:79-80;Albrecht et al．（1996）Ann.Hematol．72:73-79;Holmen et al．（1995）In Vitro Cell Dev.Biol.Anim．31: 347-351；Remy et al．（1994）Bioconjug.Chem. 5:647-654;Le Bolch et al．（1995）Tetrahedron Lett.36:6681-6684;Loeffler et al．（1993）Meth.Enzymol.217:599-618参照］その他の好適な方法によって行うことができる。トランスフェクションが奏功したか否かは、宿主細胞内でのベクターの機能指示などの、トランスフェクションした細胞内での異種核酸の存在検出によって確認されるのが普通である。形質転換とは、ＤＮＡを生体に導入して、そのＤＮＡを、染色体外要素としてあるいは染色体組み込みによって複製可能とすることを意味する。
本明細書で使用する場合、「注入（された）」とは、細胞へのＤＮＡの微量注入［小型注射器を使用］を指す。
本明細書で使用する場合、実質的に均一なＤＮＡとは、別のそのような配列と十分類似していて、特定条件下に安定なハイブリッドを形成するヌクレオチド配列を含むＤＮＡを指す。
同じ条件下に、異なる配列を有する核酸断片が検出可能な形で同一の「標的」核酸にハイブリダイゼーションし得ることは当業者には公知である。１個の断片が、他の核酸断片における１以上の部分の配列に対して相補的（またはほぼ相補的）である配列に少なくとも約１４のヌクレオチドを有する部分を持つことから、十分長いハイブリダイゼーション期間にわたって緊縮条件下では、２個の核酸断片は検出可能な形でハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションが起こり得る時間が、所定の緊縮条件下に、正確に相補的な塩基対合部分を有する２個の核酸断片が検出可能な形で互いに対してハイブリダイゼーションするだけの時間で一定に保たれた場合、正確な相補性からの逸脱が塩基対合部分にあっても良く、そのような場合であっても、塩基対合はハイブリダイゼーションを検出可能とするのに十分な程度に起こる。２個の核酸の塩基対合部分間の相補性からの逸脱が大きくなり、ハイブリダイゼーション条件がさらに厳しくなるに連れて、２個の部分が検出可能な形で互いに対してハイブリダイゼーションする確率が低下する。
２個の一本鎖核酸部分は、（ａ）その両方が同一部分と塩基対合二体鎖を形成し、（ｂ）前記２つの二体鎖の０．５×ＳＳＰＥ溶液での融点差が１０℃未満である場合、それらの部分は本明細書の意味の範囲内で、「実質的に同一の配列」を有する。比較する部分が同数の塩基を有していて、「実質的に同じ配列」を有するという場合、それは代表的には１０個中１個未満の配列が異なるというものである。核酸二体鎖の融点測定方法は公知である［例えば、Meinkoth and Wahl（1984）Anal.Biochem．138:267-284およびその文献中で引用の参考文献を参照）。
本明細書で使用する場合、核酸プローブとは、同一もしくは非常に関係の深いヌクレオチド配列を有するＤＮＡもしくはＲＮＡに対して特異的にハイブリダイゼーションするだけの数のヌクレオチドを有するＤＮＡ断片もしくはＲＮＡ断片である。プローブは、約１０という少数から数十万という多数のヌクレオチドまで、いかなる数のヌクレオチドを有していても良い。そのようなハイブリダイゼーション反応の条件およびプロトコールは、プローブの大きさ、温度、不適正対合の程度、塩濃度およびハイブリダイゼーション反応についての他のパラメータの効果のように、当業者には公知である。例えば、ハイブリダイゼーションを行う場合の温度が低く、塩濃度が高いほど、ハイブリッド分子中に存在する不適合対合の程度は大きくなる。
ハイブリダイゼーションプローブとして使用するには、核酸を例えば32Ｐ、3Ｈおよび14Ｃなどの検出可能な部分もしくは標識で標識することで、またはウラシル部分の５’位でビオチン化されたデオキシウリジレートの存在下でのニック翻訳などの化学的標識のような他の手段によって検出できるようにするのが普通である。得られたプローブには、チミジレート残基に代わってビオチン化ウリジレートがあり、ストレプトアビジンのビオチンへの結合に基づく多くの市販検出システムのいずれかによって検出することができる（ビオチン部分を介して）。そのような市販の検出システムは、エンゾ・バイオケミカルズから入手可能である（Enzo Biochemicals，Inc.，New York，NY）。非放射能標識などの当業者に公知の他の標識は、それがプローブを十分検出可能とする限りにおいて使用可能であり、それはアッセイの感度、使える時間［細胞培養、ＤＮＡ抽出およびハイブリダイゼーションアッセイに対して］、プローブ源として利用可能なＤＮＡもしくはＲＮＡの量、特定の標識およびその標識を検出するのに使用される手段によって決まる。
プローブに対して十分高い程度で相同性を有する配列が確認されたら、それは標準法（例えばManiatis et al．（1982）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NYに記載のもの）によって容易に単離することができる。
本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子が安定なハイブリッドを形成し、実質的に相同性であると考えられる条件とは、少なくとも約６０％の相補性を有するＤＮＡ分子が安定なハイブリッドを形成するような条件を言う。そのようなＤＮＡ断片はこの場合、「実質的に相同」であると考えられる。例えば、特定の蛋白をコードするＤＮＡは、そのＤＮＡが安定なハイブリッドを形成して、断片の配列が少なくとも約６０％相補的である場合、ならびにＤＮＡによってコードされる蛋白がその活性を保持する場合に、別のＤＮＡ断片に対して実質的に相同である。
本明細書に関して、緊縮条件は以下のように規定される。
１）高緊縮性：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２）中緊縮性：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３）低素縮性：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
あるいは、塩および温度ならびに他の試薬の組み合わせによって、同程度の不適合または適合を選択することができる。
本明細書で使用する場合、「免疫保護（性）」とは、ワクチンまたは抗原もしくは免疫誘発剤への曝露が、ワクチンもしくは抗原を投与もしくは導入した宿主に対して、疾患の原因となる病原体による感染に抵抗する能力または症状を軽減させる能力を与えることができる能力を指す。選択される抗原は、病原体によって提供される抗原であるのが普通である。
本明細書で使用する場合、ハイブリダイゼーション反応および抗体−抗原反応などの全てのアッセイおよび手順は、別段の断りがない限り、当業者が標準的条件と考える条件下に実施する。
Ａ．ＭＡＣを含む細胞系の製造
１．メガレプリコン
本発明で提供される方法、細胞およびＭＡＣは、動原体領域に比較的高次の複製単位［メガレプリコン］が存在することを発見したことによって得られたものである。このメガレプリコンは、一次複製開始部位［メガレプリケータ］を境界とし、動原体異質染色質および最も可能性の高いものとして動原体の複製を促進するように思われる。異種ＤＮＡのメガレプリケータ領域またはそのごく近くへの組み込みによって、メガ塩基サイズの染色体部分の大量増幅が開始し、それによって生存細胞においてデノボ染色体形成が起こるようになる。
好ましいメガレプリケータを提供するＤＮＡ配列は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を生じるｒＤＮＡ単位である。哺乳動物、特にマウスおよびヒトでは、そのｒＤＮＡ単位には、複製源（またはマウスにおける二方向複製源、すなわちＯＢＲ）ならひに増幅促進配列（ＡＰＳ）および増幅制御要素（ＡＣＥ）などの特殊化要素がある（例えば、Gogel et al．（1996）Chromosoma 104:511-518;Coffman et al．（1993）Exp.Cell.Res．209:123-132;Little et al．（1993）Mol.Cell.Biol．13:6600-6613;Yoon et al．（1995）Mol.Cell.Biol．15:2482-2489;Gonzalez and Sylvester （1995） Genomics 27: 320-328;Miesfeld and Arnheim（1982）Nuc.Acids Res．10:3933-3949;Maden et al．（1987）Biochem.J．246:519-527参照）。
上記のように、理論は別として、これらの特殊化要素は、細胞における本明細書に記載のような染色体のデノボ形成で、メガ塩基の大きさの染色体部分の複製および／または増幅を促進することができる。これらの特殊化要素は代表的には、ｒＤＮＡの転写領域の上流にある非転写遺伝子間スペーサ領域にある。遺伝子間スペーサ領域はそれ自体、縦列に反復したブロックおよび非縦列ブロックとして分類することができる反復配列を内部に有し得るものである（Gonzalez and Sylvester（1995）Genomics 27:320-328参照）。マウスｒＤＮＡでは、二方向複製源は、転写開始部位の約１．６ｋｂ上流を中心とする３ｋｂの開始ゾーン内に認めることができる（例えば、Gogel et al．（1996）Chromosoma 104:511-518参照）。これらの特殊化要素の配列は、例えばヌクレアーゼ過敏または曲がったＤＮＡ構造を生じ得るＡＴ豊富領域の存在によって検出可能な、変化した染色質構造を有する傾向がある。複製源を含む配列の例が、ほぼ位置２４３０〜５４３５で配列番号１６およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ８２５６４に示してある。増幅促進配列を含む配列の例としては、配列番号１６のヌクレオチド６９０〜１０６０および１１０５〜１５３０などがある。
ヒトｒＤＮＡでは、一次複製開始部位は、転写領域上流の数キロ塩基対に認められ、二次開始部位は、非転写遺伝子間スペーサ領域全体に認められる（例えば、Yoon et al．（1995）Mol.Cell.Biol．15:2482-2489参照）。完全なヒトｒＤＮＡ反復単位は、ＧＥＮＢＡＮＫに受託番号Ｕ１３３６９で示されており、本明細書では配列番号１７に示してある。複製開始部位を含む別の配列例は、配列番号１７のヌクレオチド３５３５５〜４２４８６の配列内、特にはヌクレオチド３７９１２〜４２４８６の配列内、さらに詳細には配列番号１７のヌクレオチド３７９１２〜３９２８８の配列内にある（Coffman et al．（1993）Exp.Cell.Res．209:123-132参照）。
ＭＡＣを含む細胞系は、細胞、好ましくは安定な細胞系を、選択可能なマーカーをコードする異種ＤＮＡ断片で形質転換し；選択条件下に培養し；多動原体染色体、好ましくは二動原体染色体を有する細胞を確認することで得ることができる。その細胞を次に、本明細書に記載の方法に従って操作して、本明細書に記載のようなミニ染色体および他のＭＡＣ、特には異質染色質ＳＡＴＡＣを生成することができる。
多動原体染色体、特には二動原体染色体の形成は、挟動原体異質染色質、好ましくはｒＤＮＡ配列を有する染色体の動原体領域における異種ＤＮＡの組み込みによって行われるのが普通である。そこで、取り込みの頻度は、選択可能なマーカーをコードする異種断片におけるｒＤＮＡまたは付随ＤＮＡなどの（これらに限定されるものではないが）ＤＮＡ等によって、それらの領域を標的とすることで上昇させることかできる。異種ＤＮＡを挟動原体異質染色質に向かわせるための好ましい標的配列には、ｒＲＮＡ遺伝子を有する染色体の動原体領域を標的とするｒＤＮＡ配列がある。そのような配列には、配列番号１６およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ８２５６４のＤＮＡおよびそれの一部、配列番号１７およびＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｕ１３３６９のＤＮＡおよびそれの部分、配列番号１８〜２４のＤＮＡなどがあるが、これらに限定されるものではない。異種ＤＮＡを染色体ｒＤＮＡに組み込む上で使用される配列番号１６内からのＤＮＡを組み込む特定ベクターは、ｐＴＥＲＰＵＤである（実施例１２参照）。付随ＤＮＡ配列を用いて、異種ＤＮＡを挟動原体異質染色質に組み込むこともできる。例えば、マウスおよびヒトの付随ＤＮＡをそれぞれ有するベクターｐＴＥＭＰＵＤおよびｐＨＡＳＰＵＤが、デノボ人工染色体形成のために異種ＤＮＡを細胞に導入するためのベクター例として本明細書にある（実施例１２参照）。
次に、得られた細胞系を本発明で例示の細胞同様に処理して、二動原体染色体が断片化した細胞を得ることができる。次に、その細胞を用いて、別の選択的マーカーを断片化二動原体染色体（すなわち、元二動原体染色体）に導入して、挟動原体異質染色質を増幅して、異質染色質染色体を得ることができる。
以下の考察では、ＥＣ３／７細胞系と得られる細胞を参照して、このプロセスについて説明する。他の細胞、特に細胞系に対して同じ手順を適用して、ＳＡＴＡＣおよび真正動原体ミニ染色体を得ることができる。
２．デノボ染色体の形成
ヒトおよび細菌のＤＮＡを有するλ構築物［λＣＭ８およびλｇｔＷＥＳｎｅｏ］の同時組み込み後の形質転換マウスＬＭＴＫ-線維芽細胞系［ＥＣ３／７］でのデノボ動原体形成［Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8106-8110および米国特許出願０８／３７５２７１号参照）が報告されている。「異種」操作ヒト、細菌およびファージＤＮＡの組み込みと、その後のマウスおよび異種ＤＮＡの増幅による二動原体染色体形成が、マウス染色体の短腕の動原体領域で起こった。Ｇ分染によって、この染色体はマウス７番染色体であることが確認された。同じ染色体上に２個の機能的に活性な動原体が存在することから、動原体間では一定の切断が起こる。そのような特異的染色体切断によって、ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片が認められるようになった（細胞の約１０％で）。ＥＣ３／７細胞系［受託番号９００５１００１でEuropean Collection of Animal Cell Culture（以下ＥＣＡＣＣと称する）に寄託された米国特許５２８８６２５号参照;Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8106-8110および米国特許出願０８／３７５２７１号ならびに相当する公開欧州出願ＥＰ０４７３２５３号も参照］から、２つの亜細胞系［ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６］を反復単一細胞クローニングによって選別した。これらの細胞系では、ｎｅｏ−動原体は専らミニ染色体［ｎｅｏ−ミニ染色体］で認められたが、元二動原体染色体には「異種」ＤＮＡの痕跡を有していた。
現在、動原体の異質染色質領域への選択可能マーカーをコードするＤＮＡの組み込みによって二動原体染色体が形成されたことがわかっている。
３．ｎｅｏ−ミニ染色体
ｎｅｏ−動原体をマウス染色体から分離するＥＣ３／７細胞での染色体切断がＧバンド陽性「異種」ＤＮＡ領域で起こった。これは、元二動原体染色体の切断末端にλおよびヒトＤＮＡ配列の痕跡が認められたことで裏付けられる。ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片のＧバンドパターンを安定なｎｅｏ−ミニ染色体のものと比較することで、ｎｅｏ−ミニ染色体が、ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片の反転複製物であることが明らかである。これは、ｎｅｏ−ミニ染色体が機能性動原体１個のみを有するが、ミニ染色体のいずれの末端も異質染色性であり、in situハイブリダイセーションによって、これらの異質染色性領域においてマウス付随ＤＮＡ配列が認められたことで裏付けられる。
例示の実施例ではλＤＮＡおよびネオマイシン耐性遺伝子である異種ＤＮＡの複数反復単位を有するミニ染色体を含むマウス細胞を、細胞形質転換における受容細胞として用いることができる。ハイグロマイシン（hygromycin）耐性を与えるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ［ｈｙｇ］をコードする遺伝子などの第２の選択可能マーカーに連結されたλＤＮＡを有する特定の異種ＤＮＡなどのドナーＤＮＡをマウス細胞に導入し、ドナーＤＮＡ中のλＤＮＡをミニ染色体におけるものと相同的に組み換えることで、ミニ染色体に組み込むことができる。組み込みは、in situハイブリダイゼーションおよびサザンブロッティング分析によって確認される。異種ＤＮＡの転写および翻訳は、プライマー延長および免疫ブロッティング分析によって確認される。
例えば、やはりハイグロマイシン耐性をコードするＤＮＡおよびサイトメガロウイルス［ＣＭＶ］初期プロモーターなどのプロモーターに連結したRenillaルシフェラーゼ遺伝子ならびに細菌性ネオマイシン耐性コードＤＮＡを含有するλＤＮＡ構築物［ｐＮｅｍ１ｒｕｃ］を用いて、ＥＣ３／７Ｃ５細胞で、ＤＮＡがｎｅｏ−ミニ染色体に導入されている。特定の細胞［ＰＨＮ４と称される］における染色体へのドナーＤＮＡの組み込みか、核酸増幅［ＰＣＲ］およびin situハイブリダイゼーションによって確認されている。ｎｅｏ−ミニ染色体を生じると考えられる事象を図１に描いてある。
異種ＤＮＡを含む得られた遺伝子操作ミニ染色体は次に、チャイニーズハムスター卵巣細胞［ＣＨＯ］などの受容細胞系への細胞融合によって転移させることができ、異種ＤＮＡの正しい発現を確認することができる。細胞生産に続いて、例えばコルヒチンを加えることで中期染色体を得て、二重レーザー光に基づくセルソーターでＡＴ特異染料およびＧＣ特異染料を加えることで染色体を精製する（人工染色体の単離方法の説明については、実施例１０Ｂ参照）。純度９５％以上の分取量の染色体［染色体５×１０4〜５×１０7個／ｍＬ］が得られる。得られた染色体を用いて、微量注入およびリボソーム介在転移などの方法によって、細胞に導入する。
そうして、ｎｅｏ−ミニ染色体は細胞中で安定に維持され、自己複製し、非選択的培養条件下でｎｅｏ遺伝子の持続的な長期発現を可能とする。それはさらに、対象ＤＮＡの相同的組み換えおよび組み込みのための標的部位として役立つメガ塩基の公知の異種ＤＮＡ［例示の実施態様におけるλＤＮＡ］も有する。そこでｎｅｏ−ミニ染色体は、細胞の遺伝子操作のためのベクターとなる。それをＳＣＩＤマウスに導入したところ、内因性染色体と同様に複製することが明らかになっている。
本発明の方法は、選択的マーカー［好ましくは、優性の選択可能マーカー］を有する異種ＤＮＡを細胞に導入し、選択条件下にその細胞を培養することで、ｎｅｏ−ミニ染色体を形成する事象を誘発する手段を提供するものである。結果的に、増幅によって生じる多動原体染色体（例えば二動原体染色体）およびそれの断片を有する細胞が得られる。次に、二動原体染色体を有する細胞を、ＢｒｄＵなどの薬剤で処理するおよび／あるいは選択条件下で培養することで染色体を不安定化させて、二動原体染色体が２個の染色体を生成する細胞を得ることができる。その２個の染色体は、いわゆるミニ染色体と元二動原体染色体であり、後者は通常、異種ＤＮＡが組み込まれた異質染色質中で増幅されて、ＳＡＴＡＣまたはソーセージ染色体を与える［これについては後述する］。その細胞を他の細胞と融合させて、ミニ染色体を元二動原体染色体から分離して別の細胞に導入して、各種類のＭＡＣを別個に操作することができる。
４．ＳＡＴＡＣの製造
ＳＡＴＡＣ製造のためのプロトコール例を図２［特にＤ、ＥおよびＦ］および図３［実施例、特に実施例４〜７も参照］に図示してある。
ＳＡＴＡＣを得るには、出発原料は細胞、好ましくは線維芽細胞系などの安定な細胞系および選択的マーカーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片である。リン酸カルシウムを用いる直接取り込み、エレクトロポレーションおよび脂質介在転移などの（これらに限定されるものではないが）ＤＮＡ転移方法によって、ＤＮＡ断片を細胞に導入する。異質染色質におけるＤＮＡ断片の組み込みを確実に行うには、λＣＭ８ならびに付随ＤＮＡを含むｐＴＥＭＰＵＤ［図５］およびｐＨＡＳＰＵＤ［実施例１２参照］のような本発明で提供されるベクターなどの染色体の挟動原体異質染色質領域に、あるいは具体的にはｒＤＮＡ配列を有する染色体の動原体領域におけるｒＤＮＡに導入されるＤＮＡを原料とするのが好ましい。ＤＮＡを導入した後、細胞を選択条件下で成長させる。得られた細胞について調べて、多動原体染色体、特には二動原体染色体［または異質染色質染色体またはソーセージ染色体その他のそのような構造;図２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ参照］を選別する。
詳細には、二動原体染色体を有する細胞を選別した場合、それを選択条件下で成長させることができるか、あるいは好ましくは、第２の選択可能マーカーをコードする別のＤＮＡを導入し、その第２のマーカーに対して選択的な条件下に細胞を成長させる。得られた細胞には、図２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆに図示したものと同様の構造を有する染色体が含まれているはずである。図２Ｄのソーセージ染色体のような構造を有する細胞を選別し、第２の細胞系と融合させて、対象外の他の染色体を除去することができる。所望に応じて、他の染色体を有する細胞を選別し、本明細書に記載の方法に従って処理することができる。ソーセージ染色体を有する細胞を選別した場合、それをＢｒｄＵなどの薬剤で処理して、染色体を不安定化させて、異質染色質腕が実質的に異質染色性である染色体［すなわち、メガ染色体。図２Ｆ参照］を形成するようにすることができる。異質染色質腕を増幅したがｎｅｏ−染色質腕から切り離していないギガ染色体などの構造も認められる。メガ染色体は安定な染色体である。融合および選択条件での増殖および／またはＢｒｄＵ処理その他のそのような処理等のさらなる操作を行って、メガ染色体の断片化を行って、基本的反復単位としてアンプリコンを有する相対的に小さい染色体を形成することができる。
ｐＴＥＭＰＵＤ［図５および実施例１２参照］、ｐＨＡＳＰＵＤまたはｐＴＥＲＰＵＤ（実施例１２参照）などの染色体断片化ベクターを用いてメガ染色体をin vivoでさらに断片化して、最終的に、１〜４個のメガレプリコンを含む約１５Ｍｂ〜６０Ｍｂの相対的に小さい安定な複製可能単位を有する染色体を得ることができる。
そうして、マウス７番染色体の短腕由来のデノボ生成した安定な染色体を分析した。この染色体領域は、大きい染色体部分の増幅能力を示し、デノボ染色体生成を促進する。同じ染色体領域での大量増幅によって、二動原体および多動原体染色体、ミニ染色体、１５０〜２００Ｍｂの大きさのλｎｅｏ−染色体、「ソーセージ」染色体、５００〜１０００Ｍｂギガ染色体および安定な２５０〜４００Ｍｂメガ染色体が生成する。
メガ染色体の腕に沿って明らかな分断が認められ、分析によって、この染色体の構成単位は、両末端に組み込まれた「外来」ＤＮＡ配列を有するマウスの主要付随ＤＮＡから構成される約３０Ｍｂのアンプリコンであることが明らかになっている。その約３０Ｍｂアンプリコンは、約７．５Ｍｂのマウス主要付随ＤＮＡブロックからなる２個の約１５Ｍｂの反転二重線からなり、それらは非付随配列の狭い帯によって互いに分離されている［例えば図３参照］。アンプリコンの境界にある比較的広い非付随領域には組み込まれた外来［異質］ＤＮＡがあるが、アンプリコン内の非付随ＤＮＡ配列の狭い帯は、マウス染色体の挟動原体異質染色質の重要な部分である。これらの結果は、非付随ＤＮＡに隣接する約７．５Ｍｂのブロックがマウス染色体の挟動原体異質染色質の構成単位であり、マウス染色体の約１５Ｍｂの大きさの挟動原体領域には２個の約７．５Ｍｂ単位があることを示している。
真正染色質末端部分は別として、メガ染色体全体は異質染色性であり、構造的に均一である。従って、この大きい染色体は、増幅プロセスについてのデータを得る上で、さらには異種ＤＮＡにおけるベクターとしておよびさらなる断片化における標的として挟動原体構成異質染色質のいくつかの基本的特徴を分析する上で、ユニークな可能性を提供するものである。
本明細書に示すように、この現象は普遍的に起こるもので、他の染色体でも認めることができる。さらに、これらのデノボ生成染色体部分および染色体は外観は異なっているが、同様の増幅機序がその生成においてある役割を果たしている。すなわち、（ｉ）各場合において、増幅はマウス染色体の動原体領域で開始し、大きい（Ｍｂの大きさ）アンプリコンが生成する。（ｉｉ）マウスの主要付随ＤＮＡ配列は、異質染色質アンプリコンの大部分を提供するか［Ｈ型増幅］、あるいは真正染色質アンプリコンに境界を設ける［Ｅ型増幅］ことで、アンプリコンの一定の構成要素となる。（ｉｉｉ）反転部分の生成を、λｎｅｏ−染色体およびメガ染色体で示すことができる。（ｉｖ）増幅によって形成される染色体腕および染色体は、安定かつ機能性である。
反転染色体断片が存在することは、マウス７番染色体の動原体領域でデノボで形成される染色体において一般に見られると考えられる。ｎｅｏ−ミニ染色体生成の際、ｎｅｏ−動原体を有するマウス７番染色体の遠位部分の安定化を生じる事象が、その反転複製物の形成であった。メガ染色体のアンプリコンは、約７．５Ｍｂのマウス主要付随ＤＮＡブロックの反転二本線である。
５．細胞系
ミニ染色体、λｎｅｏ−染色体およびＳＡＴＡＣなどのＭＡＣを有する細胞系が本発明で提供されるか、あるいはそれを本発明の方法によって得ることができる。そのような細胞系は、これら染色体の簡便な入手源を提供するものであり、細胞融合または特定細胞系との融合における微小核体の生産などによって操作して、対象とする染色体をハイブリッド細胞系に導入することができる。本明細書では細胞系の例を記載しており、一部はＥＣＡＣＣに寄託されている。
ａ．ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６
細胞系ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６を、ＥＣ３／７の単一細胞クローニングによって得た。例を挙げるとＥＣ３／７Ｃ５はＥＣＡＣＣに寄託されている。これらの細胞系には、ＥＣ３／７からのミニ染色体および元二動原体染色体が含まれている。細胞系ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６における安定なミニ染色体は同一であるように思われ、それらは二動原体染色体の約１０〜１５Ｍｂの「分裂」断片の複製誘導体であるように思われる。これらの独立に得られた細胞系でそれらの大きさが同様であることは、約２０〜３０Ｍｂが、安定なミニ染色体の最小または最小に近い物理的大きさであることを示していると考えられる。
ｂ．ＴＦ１００４Ｇ１９
第２の選択可能マーカー、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（すなわち、ハイグロマイシン耐性遺伝子）および検出可能なマーカーβ−ガラクトシダーゼ（すなわち、ｌａｃＺ遺伝子）をコードするＤＮＡなどの別の異種ＤＮＡをＥＣ３／７Ｃ５細胞系に導入し、選択条件下に増殖させて、ＴＦ１００４Ｇ１９と称する細胞を得た。詳細にはこの細胞系は、抗ＨＩＶリボザイム（ribozyme）およびハイグロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＨ１３２、ｐＣＨ１１０［β−ガラクトシダーゼをコード］およびλファージ［λｃ１８７５Ｓａｍ７］ＤＮＡとの共トランスフェクションおよびハイグロマイシンＢによる選別によって、ＥＣ３／７Ｃ５細胞系から得られた。
λファージおよびプラスミドＤＮＡ配列を用いたin situハイブリダイゼーションによるＴＦ１００４Ｇ１９細胞系の詳細な分析により、ソーセージ染色体の形成が明らかになった。ＥＣ３／７Ｃ５細胞系の元二動原体染色体を別の末端動原体染色体の末端に転座させた。異種ＤＮＡを元二動原体染色体の狭異質染色質に組み込み、メガ塩基のマウス挟動原体異質染色質付随ＤＮＡ配列［図２Ｄ］を用いて数回増幅して、「ソーセージ」染色体を得る。その後、末端動原体マウス染色体を真正染色質末端小粒によって置換した。
ハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のビオチン標識した小断片を用いたin situハイブリダイゼーションによって、ソーセージ染色体の異質染色質腕のみにハイブリッド信号が生じ、ＴＦ１００４Ｇ１９形質転換細胞では、これらの遺伝子が挟動原体異質染色質に局在していることが示された。
しかしながら、高レベルの遺伝子発現が検出された。異質染色質はショウジョウバエ、酵母で、さらにはマウス動原体で付随ＤＮＡに導入されたＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に対して沈黙効果を有する。そこで、ＴＦ１００４Ｇ１９形質転換細胞系を調べて、異質染色質に局在する遺伝子が一般に認められている定説とは対照的に実際に発現したことが確認されたことは興味深いものであった。
それに関して、異なるソーセージ染色体［図２Ｄ参照］を有するＴＦ１００４Ｇ１９のサブクローンを単一細胞クローニングによって得た。ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の小断片を有するサブクローンから単離されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションから、ハイブリダイゼーションの強さとソーセージ染色体の長さとの間に密接な相関関係があることが明らかになった。この所見は、これらの遺伝子がソーセージ染色体の異質染色質腕に局在するという結論を裏付けるものである。
（１）ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５
ＴＦ１００４Ｆ−１９Ｃ５は、ｎｅｏ−ミニ染色体および安定な「ソーセージ」染色体を含むマウスＬＭＴＫ-線維芽細胞系である。それは、ＴＦ１００４Ｇ１９のサブクローンであり、ＴＦ１００４Ｇ１９細胞系の単一細胞クローニングによって形成されたものである。それは、細胞系の例およびソーセージ染色体源の例としてＥＣＡＣＣに寄託してある。その後、この細胞系とＣＨＯ Ｋ２０細胞との融合を行い、ハイグロマイシンおよびＧ４１８およびＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリア（aminopteria）およびチミジン培地；Szybalski et al.（1962）Proc.Natl.Acad.Sci．48:2026参照）による選別を行って、ソーセージ染色体とｎｅｏ−ミニ染色体を有するハイブリッド細胞（１９Ｃ５×Ｈａ４と称する）を得た。ハイブリッド細胞のＢｒｄＵ処理とそれに続く単一細胞クローニングおよびＧ４１８および／またはハイグロマイシンによる選別によって、ＧＢ４３およびＧ３Ｄ５などの対象とする染色体を有する各種細胞を得た。
（２）他のサブクローン
１９Ｃ５×Ｈａ４細胞をＢｒｄＵ処理し、次にＧ４１８を含有する選択培地で成長させ、ＢｒｄＵで再度処理することで、細胞系ＧＢ４３およびＧ３Ｄ５を得た。その２つの細胞系を、所定細胞の単一細胞クローニングによって単離した。ＧＢ４３細胞にはｎｅｏ−ミニ染色体のみが含まれている。ＥＣＡＣＣに寄託したＧ３Ｄ５には、ｎｅｏ−ミニ染色体およびメガ染色体がある。この細胞系を単一細胞クローニングし、次にサブクローンをＧ４１８およびハイグロマイシンを含む培地で成長させて、ｎｅｏ−ミニ染色体およびメガ染色体を有するＧＨＢ４２細胞系などのサブクローンを得た。Ｈ１Ｄ３は、メガ染色体を有するが、ｎｅｏ−ミニ染色体を持たないマウス−ハムスターハイブリッド細胞系であり、１９Ｃ５×Ｈａ４細胞をＢｒｄＵで処理し、次にハイグロマイシンを含む選択培地で増殖させ、特定細胞の単一細胞サブクローニングを行って得た。この細胞系を、やはり別の選択（selection）遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡを有するＣＤ４+ＨｅＬａ細胞系と融合させて、メガ染色体とＣＤ４ｎｅｏを有するヒト染色体を持った細胞［Ｈ１×ＨＥ４１細胞］を生成した。さらにＢｒｄＵ処理を行い、単一細胞クローニングを行うことで、切断メガ染色体を有する細胞を含む１Ｂ３などの細胞系を得た。
５．細胞の転換に使用するＤＮＡ構築物
染色体製造時のいずれかの段階で、トランスフェクションその他の適切な方法によって、異種ＤＮＡを細胞に導入することができる［例えば図４参照］。一般に、そのようなＤＮＡのＭＡＣへの導入は、異種ＤＮＡでのλ−ＤＮＡの封入（例示の染色体について）、および別の選択的マーカー遺伝子によって行うことができるように、部位指向性組み込みによって確保される。例えば、ミニ染色体またはＳＡＴＡＣなどのＭＡＣを含む細胞は、ＨＩＶリボザイムをコードするＤＮＡ、嚢胞性繊維症遺伝子およびハイグロマイシン耐性などの第２の選択可能マーカーをコードするＤＮＡ等の所望の異種ＤＮＡを有するプラスミドと共トランスフェクションすることができる。次に、新たな選択可能マーカーを発現しない細胞には有害である薬剤に細胞を曝露することで、細胞に選択圧をかける。そのようにして、異種ＤＮＡをＭＡＣに封入した細胞が確認される。第２の細胞系との融合によって、一つの特定の種類の染色体構造またはＭＡＣを有する細胞系を形成する手段を提供することができる。
本発明ではそのための各種ベクターが提供され［実施例参照］、他のものは容易に構築することができる。そのベクターは好ましくは、ＭＡＣ内に含まれるＤＮＡに対して相同性のＤＮＡを有することで、ＤＮＡをＭＡＣに向かわせて、そこに組み込むようにする。そのベクターにはさらに、選択可能マーカー遺伝子および対象となる特定の異種遺伝子もある。本明細書の開示および当業者の知識に基づいて、当業者はそのようなベクターを構築することができる。
ＤＮＡを特定染色体の異質染色質領域に組み込むことができるベクターｐＴＥＭＰＵＤとそれの誘導体が、ここでは特に興味深い。これらのベクターはまた、断片化ベクターとしても役立ち得る［例えば、実施例１２参照］。
対象とする異種遺伝子には、治療効果のある物質をコードする遺伝子ならびに対象とする遺伝子生成物をコードするＤＮＡなどがある。これらの遺伝子およびＤＮＡには、嚢胞性繊維症遺伝子［ＣＦ］、嚢胞性繊維症膜貫通調節蛋白質（ＣＦＴＲ）遺伝子などがあるが、これらに限定されるものではない（米国特許５２４０８４６号；Rosenfeld et al．（1992）Cell 68:143-155；Hyde et al．（1993）Nature 362:250-255；Kerem etal．（1989）Science 245:1073-1080；Riordan et al．（1988）Science 245:1066-1072；Rommens et al．（1989）Science 245:1059-1065；Osborne et al．（1991）Am.J.Hum.Genetics 48:6989-6122；White et al．（1990）Nature 344:665-667；Dean et al．（1990）Cell 61:863-870；Erlich et al．（1991）Science252:1643；ならびに米国特許５４５３３５７号、５４４９６０４号、５４３４０８６号および５２４０８４６号（正常なＣＦＴＲ遺伝子をコードするレトロウィルスベクターを提供）など参照）。
Ｂ．人工染色体の単離
本発明で提供されるＭＡＣは、当業者に公知の好適な方法によって単離することができる。さらに、本発明では、特にＳＡＴＡＣのかなりの精製を行う方法が提供される。ＳＡＴＡＣは、蛍光活性化細胞選択［ＦＡＣＳ］によって単離されている。この方法は、高い異質染色質ＤＮＡ含量により、細胞中の他の染色体とは異なるＳＡＴＡＣのヌクレオチド塩基含有量を利用するものである。特定の実施態様では、中期染色体を単離し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８およびクロモマイシンＡ３などの塩基特異的染料で染色する。蛍光活性化細胞選択は、ＳＡＴＡＣを内因性染色体と分けるものである。２つのレーザが染料を別個に励起するよう設定されている二重レーザ細胞選択機［FACS Vantage Becton Dickinson Immunocytometry Systems］によって、塩基対の組成および大きさごとに染色体の二変量分析を行うことができた。そのようなＳＡＴＡＣを含む細胞を同様に選別することができる。
内因性染色体から人工染色体を単離する本発明で提供される別の方法には、ＳＡＴＡＣなどの人工染色体の大量単離に特に好適な方法などがある。その方法では、ＳＡＴＡＣと内因性染色体との間の大きさおよび密度の差を利用して、それらの２種類の染色体を分離する。そのような方法には、スウィングバケット（swinging bucket）遠心、ゾーン遠心および速度沈降などの方法が関与する。内因性染色体から人工染色体を分離するための親和性、特に免疫親和性に基づく方法も、本発明で提供される。例えば、主として異質染色質であるＳＡＴＡＣは、ハムスター細胞におけるように、内因性染色体が比較的少ない異質染色質を含む場合に、特異的に異質染色質および／またはそれに関連する蛋白を認識する抗体が関与する免疫親和性法によって、内因性染色体から分離することができる。
Ｃ．人工染色体のin vitro構築
人工染色体は、細胞における安定な複製および分離を内因性染色体とともに行うことができる完全染色体に寄与する構造的および機能的要素を組み立てることで、in vitroで構築することができる。共同で機能性染色体を生じる別個の要素を確認することで、人工染色体のin vitro形成が可能となった。厳重に制御可能な人工染色体のin vitro構築のプロセスは、例えば大量に必要な染色体または遺伝子導入動物系での特定用途に向けた染色体の形成において望まれる利点を提供するものである。
例えば、in vitro構築は、時間および規模の効率が人工染色体製造において重要な考慮事項である場合に有利であると考えられる。in vitro構築法には広範囲の細胞培養法が関与しないことから、in vitroの細胞に基づく生産系で使用される細胞を形質転換、供給、培養および回収するのに必要な時間および労力が使えない場合に、それらを利用することができる。
in vitro構築は、所望の人工染色体のいくつかの要素を組み合わせる正確な方法、ならびにそれらを組み立てて正確な規格の染色体を生成するのにどの配列および割合とするかに関して、厳しく制御することができる。これらの側面は、特定量の非常に純粋かつ特異的なＤＮＡ配列のみが宿主動物に導入されるようにすることが望ましい生存動物で使用される人工染色体の製造において重要であると考えられる。
以下に、出発原料の例としてメガ染色体を利用して、in vitroで人工染色体の構築に関与する方法について説明する。
１．人工染色体の成分の確認および単離
本発明で提供されるＭＡＣ、特にＳＡＴＡＣは、人工染色体のin vitro構築で使用される成分の確認および単離で使用するのに好都合な簡単な染色体である。本明細書に記載のように、非常に高レベルの純度までＭＡＣを精製する能力により、これらの用途での使用が促進される。例えば、メガ染色体、特にはそれの切断型［すなわち、Ｈ１Ｄ３（受託番号９６０４０９２９下にEuropean Collection of Animal Cell Culture(ECACC)に寄託したもの；以下の実施例参照）由来の１Ｂ３およびｍＭ２Ｃ１等の細胞系］は原料として役立つ。
例えば、ｍＭ２Ｃ１細胞系には、有利には１個のみの動原体、隣接するｒＤＮＡ配列を有する組み込み異種ＤＮＡの２つの領域があり、染色体ＤＮＡの残りはマウスの主要付随ＤＮＡであるミクロメガ染色体（約５０〜６０ｋＢ）を有する。他の切断メガ染色体は、末端小粒源として役立ち得るか、あるいは末端小粒が提供できる（縦列の反復末端小粒配列を有するプラスミドの構築に関しては、下記の実施例参照）。ｍＭ２Ｃ１細胞系の動原体は、マウスの少量付随ＤＮＡを含み、それが動原体ＤＮＡの単離において有用な標識を提供する。
ｍＭ２Ｃ１細胞系のミクロメガ染色体などの本発明で提供される特定ＳＡＴＡＣの別の特徴で、それらＳＡＴＡＣを染色体成分の単離および確認における出発原料として役立つよう特に適合させるものとしては、単一の特異的細胞系内の各メガ染色体の動原体が同一であるという事実である。均一な動原体源を用いて開始できることで（異なる動原体配列を有する異なった染色体の混合物とは対照的に）、動原体ＤＮＡのクローニングは非常に促進される。適切な制限エンドヌクレアーゼを用いての精製メガ染色体、特にミクロメガ染色体などの切断メガ染色体を消化し、市販で公知のＹＡＣベクター（例えば、Burke et al．（1987）Science 236:806-812参照）、ＢＡＣベクター（例えば、Shizuya et al．（1992）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A. 89:8794-8797（０．９〜１ＭｂのＤＮＡを組み込む能力を有する細菌人工染色体）参照）またはＰＡＣベクター（３００ｋｂのＤＮＡを組み込む能力を有し、バクテリオファージパッケージング（packaging）ではなくエレクトロポレーションによって大腸菌宿主細胞に導入されるＰ１人工染色体ベクター；例えば、Ioannou et al．（1994）Nature Genetics 6:84-89;Pierce et al．（1992）Meth.Enzymol．216:549-574;Pierce et al．（1992）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．89:2056-2060;米国特許５３００４３１号および国際ＰＣＴ出願ＷＯ９２／１４８１９号参照）に断片をクローニングすることで、わずか５０個のクローンがミクロメガ染色体全体を代表することができる。
ａ．動原体
哺乳動物人工染色体の構築に使用される動原体の例には、例えばＨ１Ｄ３などの本発明で提供される含メガ染色体細胞系およびｍＭ２１Ｃ１細胞などのそれの誘導体のメガ染色体内に含まれるものがある。メガ染色体は、例えば本明細書に記載の手順を利用してそのような細胞系から単離され、動原体配列はその単離メガ染色体から抽出される。例えばメガ染色体は、例えば主として複製部位および／または異種ＤＮＡ組み込み部位および／または付随ＤＮＡにある部位で認識および切断する特定の制限エンドヌクレアーゼを利用して、断片に分離することができる。得られた断片の大きさに基づいて、含動原体配列から、ある種の望ましくない要素を分離することができる。含動原体ＤＮＡは、１Ｍｂ程度の大きさであると考えられる。
マウスの少量付随ＤＮＡに基づくプローブ［例えば、Wong et al．（1988）Nucl.Acids Res．16:11645-11661参照］などの動原体配列を特異的に認識するプローブを用いて、メガ染色体由来の含動原体ＹＡＣ、ＢＡＣまたはＰＡＣクローンを単離することができる。別法にて、あるいは含動原体メガ染色体ＤＮＡの直接確認を併用して、マウスの主要付随ＤＮＡ、異種ＤＮＡおよび／またはｒＤＮＡに特異的なプローブなどの非動原体要素を特異的に認識するプローブを用いて、含非動原体ＤＮＡクローンを確認・除去することができる。
さらに、本明細書に記載の動原体クローニング法を利用して、メガ染色体の含動原体配列を単離することができる。例えば実施例１２には、動原体配列の確認のために、マウスチロシナーゼ遺伝子およびＮＭＲＩ／Ｈａｎマウスとの併用でＹＡＣベクターを使用することが記載されている。
動原体断片を単離したら、それの配列決定を行い、次にその配列データを、メガ染色体その他の動原体源からの動原体配列のＰＣＲ増幅に使用することができる。単離された動原体について、ＤＮＡを宿主哺乳動物細胞に転移させることで、in vivoでの機能を調べることもできる。機能分析には例えば、動原体配列が動原体結合蛋白に結合する能力の検査などがあり得る。クローニングされた動原体は、選択可能マーカー遺伝子を有する哺乳動物細胞に転移され、抗動原体抗体などの動原体特異蛋白（例えばＬＵ８５１；Hadlaczky et al．（1986）Exp.Cell Res．167:1-15参照）の結合を用いて、動原体の機能を評価することができる。
ｂ．末端小粒
好ましい末端小粒は、本発明で提供される１ｋＢ合成末端小粒である（実施例参照）。変わりなく反転配向のままである優性な選択可能マーカー遺伝子に連結した１ｋＢ合成末端小粒を含む二重合成末端小粒構成物を用いて、操作しやすくすることができる。そのような二重構成物には、マーカー遺伝子の一連のTTAGGG反復３’と反転配列の一連の反復、すなわちGGGATTであるマーカー遺伝子の５’を、(GGGATTT)n---優性マーカー遺伝子---(TTAGGG)nのように有する。適切に配向した断片のみを選択することから、反転マーカーの使用により、例えば平滑末端連結による等の簡単な挿人方法が提供される。
ｃ．メガレプリケータ
本発明で提供されるｒＤＮＡなどのメガレプリケータ配列は、in vitro構築物での使用で好ましい。ｒＤＮＡは複製源を提供し、in vitroでの人工染色体の増幅を促進して染色体を大きくし、例えば、対象とする異種遺伝子のコピーを多く有し、その異種遺伝子を連続的に高レベルで発現する配列も提供する。
ｄ．充填異質染色質
充填異質染色質、特には付随ＤＮＡを含有させて、人工染色体の構造的完全性および安定性を維持し、染色体内に遺伝子を有するための構造的基礎を提供する。付随ＤＮＡは、マウス主要付随ＤＮＡなどのＡ／Ｔ豊富ＤＮＡ配列またはハムスター天然付随ＤＮＡなどのＧ／Ｃ豊富ＤＮＡ配列であるのが普通である。そのようなＤＮＡ源には、十分なＡ／ＴもしくはＧ／Ｃ組成を有する非コード付随ＤＮＡを有して、ＦＡＣＳまたは密度勾配などによって、配列ごとの容易な分離を促進する真核生物などがある。付随ＤＮＡはさらに、非常にＡ／ＴもしくはＧ／Ｃ豊冨なＤＮＡ単位の単調な縦列反復を含む配列を形成することで合成することもできる。
人工染色体の構築に使用される充填異質染色質の最も好適な量は、例えば大きさを増しながら構築プロセスに各種長さの部分を含めることで、経験的に求めることができる。小さすぎて使用には適さない断片は、細胞に基づく発現試験で評価できる機能性染色体を提供しないか、あるいは機能の寿命または有糸分裂および構造の安定性が限られた染色体を生じる。
ｅ．選択可能マーカー
簡便な選択可能マーカーを、ＭＡＣの簡便な座で用いることができる。
２．単離染色体要素の組み合わせ
単離要素を得たら、それらを組み合わせて、完全で機能的な人工染色体を形成する。この組立は、例えば溶液、ＬＭＰアガロースまたはマイクロビーズでin vitro連結を行うことができる。連結を行って、動原体の一端が末端小粒に直接結合するようにする。遺伝子保有染色体腕として機能する動原体の他端は、付随ＤＮＡとｒＤＮＡ配列の組み合わせから形成され、やはり選択可能マーカー遺伝子を有することができる。別の末端小粒は、遺伝子保有染色体腕の末端に結合させる。遺伝子保有腕とは、例えばそれによってコードされた所望の蛋白の発現で、対象の異種遺伝子が染色体のin vitro構築時またはその後のいずれかの時点で組み込まれる部位である。
３．人工染色体の分析および試験
in vitroで構築された人工染色体は、ＳＡＴＡＣ、ミニ染色体について本明細書に記載の方法、または当業者に公知の方法のいずれかを用いて、in vivoの哺乳動物細胞系で機能性を調べることができる。
４．in vitro合成染色体への所望の異種ＤＮＡの導人
異種ＤＮＡは、分子生物学の常法を用いてin vitro合成染色体に導入することができ、ＳＡＴＡＣについて本明細書に記載の方法を用いて導入することができ、あるいは異質染色質などの合成要素の一つの一部として、in vitro合成染色体に組み込むことができる。異種ＤＮＡは、特定の反復断片に連結することができ、次に得られた構築物は、本発明で提供されるようなin vitro増幅法を用いてin vitroで増幅することができる（実施例参照）。
Ｄ．細胞、組織、動物および植物への人工染色体の導入
本発明で提供されるＭＡＣの導入に好適な宿主には、動物もしくは植物、それらの細胞もしくは組織などがあるが、これらに限定されるものではなく、例としては、哺乳動物、鳥、は虫類、両生類、昆虫、魚、蜘蛛、タバコ、トマト、小麦、植物およびソウ類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞に含まれる場合、ＭＡＣは細胞融合もしくは微小核体融合によって導入することができる。あるいはＭＡＣが細胞から単離されている場合、直接ＤＮＡ転移、エレクトロポレーション、脂質介在転移（例：リポフェクションおよびリポソーム）、微小粒子衝撃法（microprojectile bombardment）、細胞および胚での微量注入、原形質体の植物への再生および他の好適な方法など（これらに限定されるものではない）を含む当業者には公知の方法によって、これらは宿主細胞に導入することができる［例えば、Weissbach et al．（1988）Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，N.Y.，Section VIII，pp.421-463;Grierson et al．（1988）Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch．7-9参照；さらに、米国特許５４９１０７５号、５４８２９２８号および５４２４４０９号も参照；哺乳動物の分離細胞の粒子介在形質転換について記載した米国特許５４７０７０８号も参照］。
細胞にＤＮＡを導入する他の方法には、核微量注入および無傷の細胞との細菌原形質体融合などがある。ポリブレンおよびポリオルニチンなどの多価カチオンも用いることができる。哺乳動物細胞の形質転換のための各種技術については、例えばケオウンらの報告（Keown et al.Methods in Enzymology（1990）Vol.185,pp.527-537）およびマンソールらの報告（Mansour et al．（1988）Nature 336:348-352）を参照する。
例えば、単離・精製された人工染色体を、ヒト腎臓初期胚細胞系［ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３］または胚幹細胞［例えば、Hogan et al．（1994）Manipulating the Mouse Embryo,A:Labotatory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Press Harbor，NY参照、特には255-264ページおよび添付資料３を参照］などの胎仔細胞系に注入することができる。
好ましくは、エッペンドルフ（Eppendorf）自動微量注入システムなどのシステムを用いる微量注入によって染色体を導入し、ハイグロマイシンＢまたはネオマイシンの存在下等の選択条件下に成長させる。
１．宿主への染色体の導入方法
使用する宿主細胞に応じて、そのような細胞に適した標準的方法を用いて形質転換を行う。その方法には、当業者には公知である以下に記載のものなどがある。
ａ．ＤＮＡ取り込み
細胞壁を持たない哺乳動物細胞の場合、異種ＤＮＡ導入のためのリン酸カルシウム沈殿法が好ましい場合が多い［例えば、Graham et al．（1978）Virology 52:456-457;Wigler et al．（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．76 1373-1376;およびCurrent Protocols in Molecular Biology Vol.1，Wiley Inter-Science,Supplement 14,Unit 9.1.1-9.1.9(1990)参照）。ＤＮＡ取り込みは、ＤＮＡ単独でまたは融合剤であるポリエチレングリコール存在下に［ＰＥＧ介在遺伝子転移］、あるいは当業者に公知のそのような方法の変法［例えば、米国特許４６８４６１１号参照］によって行うことができる。
細胞へのＤＮＡ導入の好ましい方法には脂質介在キャリア系もある［例えば、Teifel et al．（1995）Biotechniques 19:79-80;Albrecht et al．（1996）Ann.Hematol.72:73-79;Holmen et al．（1995）In Vitro Cell Dev.Biol.Anim．31:347-351；Remy et al．（1994）Bioconjug.Chem. 5:647-654;Le Bolc'h et al．（1995）Tetrahedron Lett．36:6681-6684；Loeffler et al．（1993）Meth.Enzymol．217:599-618参照］。リポフェクション［例えば、Strauss（1996）Meth.Mol.Biol．54: 307-327参照］を用いて、ＤＮＡを細胞に導入することもできる。この方法は特に、ニワトリ細胞への外来ＤＮＡの転移に好適である（例えば、ニワトリ胚葉細胞および主要なニワトリ線維芽細胞；Brazolot et al．（1991）Mol.Repro.Dev．30:304-312参照）。詳細には、対象とするＤＮＡを、リソチームおよび卵白アルブミンなどの遺伝子からのプロモータと機能的連結でニワトリに導入し、それを卵で発現させることによって、卵で異種ＤＮＡを発現させることができる。
細胞へのＤＮＡの直接転移に有用な別の方法には、粒子銃電気融合［例えば、米国特許４９５５３７８号、４９２３８１４号、４４７６００４号、４９０６５７６号および４４４１９７２号参照］およびビリオン介在遺伝子転移などがある。
陸上植物における遺伝子転移に対して一般に用いられるアプローチには、精製ＤＮＡの原形質体への直接導入が関与する。植物細胞への直接遺伝子転移の３つの基本的方法には、１）ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］介在ＤＮＡ取り込み、２）エレクトロポレーション介在ＤＮＡ取り込みおよび３）微量注入などがある。さらに、超音波処理を行って、植物を形質転換させることができる［例えば、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／００３５８号参照］。
ｂ．エレクトロポレーション
エレクトロポレーションでは、原形質体と外来ＤＮＡとの混合物を含む溶液に高電圧の電気パルスを印加して、植物原形質体および他の細胞の膜に可逆的な穴を設ける段階が関与する。エレクトロポレーションは、強固な細胞壁障壁を有する植物などの原核生物その他の細胞に用いられる［例えば、米国特許４７８４７３７号、５５０１９６７号、５５０１６６２号、５０１９０３４号、５５０３９９９号参照；さらには、Fromm et al．（1985）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．82:5824-5828も参照］。
例えば、エレクトロポレーションは多くの場合、植物の形質転換に使用される［例えば、Ag Biotechnology News 7:3および17（１９９０年９月／１０月）参照］。この方法では、植物原形質体に対して、やはり表現型マーカーを含む対象ＤＮＡの存在下にエレクトロポレーションを行う。高電界強度の電気衝撃波が生体膜を可逆的に浸透性とすることで、プラスミドの導入を行うことができるようになる。エレクトロポレーションされた植物原形質体は細胞壁を修復し、分裂し、植物カルスを形成する。形質転換植物細胞は、発現される表現型マーカーによって確認される。外来ＤＮＡは、例えば露出した直線、環状もしくは超らせんＤＮＡ、リポソームに包み込まれたＤＮＡ、スフェロプラスト中のＤＮＡ、他の植物原形質体中のＤＮＡ、塩と複合体形成したＤＮＡおよび他の方法などのいずれかの形で、原形質体に加えることができる。
ｃ．微小核体
人工染色体を含む微小核体を製造し、次に特定の標的細胞と融合させることで、染色体を転移させることができる。そのような微小核体の製造および融合の方法は公知である［実施例参照。さらには、米国特許５２４０８４０号、４８０６４７６号、５２９８４２９号、５３９６７６７号、Fournier（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:6349-6353;およびLambert et al（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A. 88:5907-59参照］。人工染色体を含む微小核体を用いた微小核体融合は、ＤＴ４０ニワトリＢ前駆細胞などのトリ細胞へのＭＡＣ導入の特に有用な方法である［例えば、Dieken et al．（1996）Nature Genet. 12:174-182参照］。
２．宿主
好適な宿主には、異種ＤＮＡの導入および発現に有用であることが知られている宿主などがある。ここで特に興味深いものとしては、動物および植物の細胞および組織があり、それには昆虫の細胞および幼虫、植物および動物などがあり（これらに限定されるものではない）、特には遺伝子導入（人間以外）動物ならびに動物細胞がある。他の宿主には、哺乳動物、鳥（特にはニワトリなどの家禽）、は虫類、両生類、昆虫、魚、蜘蛛、タバコ、トマト、小麦、単子葉植物、双子葉植物および藻類、ならびに異種ＤＮＡの導入が望ましいあらゆる宿主などがあるが、これらに限定されるものではない。そのような導入は、本発明で提供されるＭＡＣを用いて行うことができるか、あるいは必要に応じて、本発明で提供されるＭＡＣを用いて、生物固有の動原体および／または機能性染色体単位を確認し、次に得られた動原体もしくは染色体単位を人工染色体として用いるか、あるいは別法として、ＭＡＣの製造に関して本明細書に例示の方法を行って生物固有の人工染色体を製造することで行うことができる。
ａ．遺伝子導入（人間以外）動物生産のための胚へのＤＮＡの導入および動物細胞へのＤＮＡの導入
遺伝子導入（人間以外）動物は、微量注入によって、哺乳動物接合体の卵核に外来遺伝子材料を導入することで得ることができる［例えば、米国特許４８７３１９１号および５３５４６７４号参照；さらに、米国特許出願０８／１５９０８４号に基づく国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／１４７６９も参照］。接合体は、哺乳動物へ発達することができる。胚または接合体を宿主の雌子宮中に移植し、発達させる。詳細なプロトコールおよび例を以下に説明する。
核転移［Wilmut et al．（1997）Nature 385:810-813、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９７／０７６６９およびＷＯ９７／０７６６８参照］。すなわちこの方法では、対象の遺伝子を含むＳＡＴＡＣを、好適な方法によって、哺乳動物腺細胞のように、分化全能核を有する適切なドナー細胞に導入することができる。次に、細胞融合または微量注入などによって、第２減数分裂の中期で停止している不活性な卵母細胞、好ましくは、除核細胞に、Ｇ０期またはＧ１期である細胞の二倍体核を導入する。実際の除去などの好適な方法によるか、あるいは機能的に核を除去する紫外線などの手段による処理を行うことによって、除核を行うことができる。
次に、正しい倍数性を維持しながら、好ましくは新たな核と細胞質とのある一定の接触期間後に（畜牛の場合、約６〜２０時間）、卵母細胞を活性化し、胚を再構築し、宿主に導入する。例えば、ノコダゾール、コルヒチン、コセミド（cocemid）およびタキソールなどの微小管阻害剤の存在下に、再生細胞をインキュベーションすることで、倍数性を維持し、それによってＤＮＡを１回複製する。
遺伝子導入ニワトリは、発達段階Ｘの受容胚に同様の段階のニワトリ肝からの分散胚葉細胞を注射することで得ることができる［例えば、Etches et al．（1993）Poultry Sci.72:882-889;Petitte et al．（1990）Development 108:185-189参照］。最初に、例えばリポフェクション［例えば、Brazolot et al．（1991）Mol.Repro.Dev.30:304-312参照］または微小核体融合［例えば、Dieken et al．（1996）Nature Genet．12:174-182参照］などの方法を用いて、ドナー胚葉細胞に、異種ＤＮＡを導入する。次に、トランスフェクションしたドナー細胞を、受容体であるニワトリ胚に注入する［例えば、Carsience et al．（1993）Development 117:669-675参照］。殻体内の受容体ニワトリ胚を明かりに透かして観察し、孵化して、生殖細胞キメラニワトリを得るようにする。
直接取り込み、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］とのインキュベーション、微量注入、エレクトロポレーション、リポフェクション、細胞融合、微小核体融合、微小粒子衝撃法などの粒子衝撃法［例えば、粒子衝撃を介して、分離した哺乳動物細胞の形質転換を行う方法を提供する米国特許５４７０７０８号参照］、他のそのような方法などの（これらに限定されないが）公知の方法を用いて、ＤＮＡを動物細胞に導入することができる。例えば、リポソーム中のプラスミドＤＮＡのin situでのヒト細胞への直接転移が、ヒトでの使用についてＦＤＡによって承認されている［例えば、Nabel et al．（1990）Science 249:1285-1288および米国特許５４６１０３２号参照］。
ｂ．異種ＤＮＡの植物への導入
遺伝子導入植物の製造または開発については、多くの方法が当業者には利用可能である。使用される方法は主として、植物の種類によって決まる。これらの方法には、ＰＥＧ誘発ＤＮＡ取り込み、原形質体融合、微量注入、エレクトロポレーションおよび微小粒子衝撃法などのＤＮＡの直接転移などがあるが、これらに限定されるものではない［例えば、そのような方法についての総説に関してはUchimiya et al．（1989）J.of.Biotech.12:1-20参照；さらに、米国特許５４３６３９２号および５４８９５２０号ならびに多くの他の特許も参照］。この場合、ＭＡＣの導入に際しては、微量注入、原形質体融合および粒子銃衝撃が好ましい。
タバコ、米、トウモロコシ、ライ麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモおよびトマトなどの植物を用いて、遺伝子導入植物が得られている。タバコおよびツクバネアサガオなどの他の植物は、それらの方法を開発し、遺伝子を最初に導入および発現させる実験モデルとして役立つことが多かった。
ＤＮＡ取り込みは、植物原形質体を用いて、ＤＮＡ単独または融合剤であるＰＥＧの存在下に行うことができるか、あるいは当業者に公知のそのような方法の変法によって行うことができる［例えば、Schilperootらに対する米国特許４６８４６１１号参照］。原形質体と外来ＤＮＡの混合物を含む溶液に対する高電圧電気衝撃波印加を行って、可逆的穴を形成するエレクトロポレーションを用いて、例えば外来遺伝子を米およびBrassica napusに導入して奏功している。培養細胞および無傷の植物器官の細胞ならびに組織培養および微小粒子衝撃法［粒子銃装置を用いて、ＤＮＡを含む高密度微小粒子を高速まで加速して、その粒子を植物の細胞壁および細胞膜を貫通させる］における胚葉体などの植物細胞へのＤＮＡの微量注入も用いられている。ＤＮＡを導入することができ、形質転換細胞から再形成することができる全ての植物細胞を用いて、転移人工染色体を有する形質転換した植物全体を作ることができる。植物宿主にＤＮＡを導入する特定のプロトコールおよび手段を、特定の植物または栽培品種に適合するよう適応または改善する必要がある場合がある。
ｃ．昆虫細胞
（ａ）有用な蛋白をコードする遺伝子の増幅を人工染色体で行って、昆虫細胞での蛋白収量を高めることができる；（ｂ）蛋白の生理的機能に必要である可能性のある糖付加およびリン酸化などの必要な翻訳後修飾を、昆虫細胞が支持し；（ｃ）昆虫細胞が、哺乳動物ウィルスを支持せず、従ってそのような感染源による生成物の交差汚染の問題がなくなり；（ｄ）その方法は、昆虫細胞系における栄養蛋白、工業用蛋白または医療用蛋白の製造のための従来の組換えバキュロウィルス系より優れており；（ｅ）昆虫細胞の成長に最適な温度が低いことから（２８℃）、生産のエネルギーコストが低く；（ｆ）昆虫細胞に対する血清を含まない成長培地によって生産コストが低くなり；（ｇ）人工染色体を含む細胞は、低温でいくらでも保存でき、（ｈ）昆虫の幼虫は、受精昆虫卵の微量注入により栄養蛋白、医療用蛋白または工業用蛋白の生物工場となる等（これらに限定されるものではないが）の多くの理由により、昆虫は人工染色体の導入に有用な宿主である［Bombyx morjの卵に異種ＤＮＡを微量注入する方法を提供するJoy et al．（1991）Current Science 66:145-150参照］。
ＭＡＣまたは昆虫固有の人工染色体［ＢＵＧＡＣ］を用いて、遺伝子を昆虫に導入する。実施例に記載したように、ＭＡＣは昆虫において機能して、それに含まれる異種ＤＮＡを発現させるように思われる。例えば、実施例に記載のように、ｌａｃＺ遺伝子に融合したB.moriアクチン遺伝子プロモータを有するＭＡＣが、融合遺伝子を含むプラスミドによるＥＣ３／７Ｃ５細胞のトランスフェクションによって得られている。その後、選別を生き残ったトランスフェクションＥＣ３／７Ｃ５細胞とB.mori細胞を融合させることで、β−ガラクトシダーゼ発現が検出される含ＭＡＣ昆虫−マウスハイブリッド細胞系を得ている。
昆虫宿主細胞には、Spodoptera frugiperda［青虫］、Aedesasegypti［蚊］、Aedes albopictus［蚊］、Drosphila melanogaster［ミバエ］、Bombyx morj［蚕］、Manduca sexta［スズメガ幼虫］およびTrichoplusia ni［イラクサキンウワバ］などの宿主があるが、これらに限定されるものではない。培養での昆虫細胞の繁殖に向けた努力が行われている。そのような努力は行列毛虫ヨトウガSpodoptera frugiperdaに集中している。イラクサキンウワバTrichoplusia niおよび蚕Bombyx moriなどの他の昆虫からも細胞系が開発されている。スズメガ幼虫Manduca sextaを用いて、類似の細胞系を得ることができることも提案されている。昆虫にＤＮＡを導入するには、それを幼虫に導入し、増殖させ、次に血リンパ液を幼虫から回収して、それから蛋白を単離できるようにする。
昆虫細胞への人工染色体導入のための本発明における好ましい方法は微量注入である［例えば、Tamura et al．（1991）Bio Ind.8:26-31;Nikolaev et al．（1989）Mol.Biol．（Moscow）23:1177-87;および本明細書で例示・考察してある方法参照］。
Ｅ．人工染色体の応用および使用
人工染色体は簡便かつ有用なベクターを提供し、場合によっては（例えば、非常に大きい異種遺伝子の場合）、宿主への異種遺伝子の導入のための唯一のベクターである。実質的にあらゆる対象遺伝子が、人工染色体を介しての宿主への導入を行いやすい。そのような遺伝子には、受容体、サイトカイン、酵素、プロテアーゼ、ホルモン、成長因子、抗体、腫瘍抑制遺伝子、治療物質および多重遺伝子経路をコードする遺伝子などがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明で提供される人工遺伝子は、蛋白および遺伝子産生物の生産方法で、特にそのような産生物の生成における宿主細胞として昆虫を用いて、さらには人工染色体（特にはＭＡＣ）が医療用および工業用の重要な化合物の生物製造を至適化するための高信頼性で安定な有効な手段を提供する細胞（例えば、哺乳動物細胞）生産系で用いられる。それらはさらに、遺伝子治療での使用、ならびに遺伝子導入植物および動物の生産を目的としたものでもある［上記、以下および実施例で述べてある］。
１．遺伝子治療
治療遺伝子産生物または多重遺伝子経路の産生物をコードする核酸は、治療を目的として、ヒトなどの宿主動物に、あるいは動物への導入のために標的細胞系に導入することができる。そのような治療目的には、治癒することまたは欠如もしくは欠陥のある遺伝子産生物を提供して抗腫瘍剤などの薬剤を標的細胞もしくは動物に提供すること、ならびに病原体に対する抵抗性を提供するかもしくは感受性を低下させるか、または疾患もしくは障害の症状を緩和する遺伝子産生物を提供することなどがある。以下に、遺伝子および遺伝子産生物の例をいくつか示す。そのような例示は本発明を限定するものではない。
ａ．抗ＨＩＶリボザイム
以下に例示のように、抗ＨＩＶリボザイムをコードするＤＮＡを、真正染色質に基づくミニ染色体およびＳＡＴＡＣなどのＭＡＣを用いて、細胞に導入し、そこで発現させることができる。これらのＭＡＣを用いて、リボザイムを発現する遺伝子導入マウスを作ることができる。従ってそれらＭＡＣは、そのようなリボザイムの活性を調べるためのモデルとして、あるいはリボザイム産生細胞系を作ることができるモデルとして役立つ。さらに、抗ＨＩＶリボザイムをヒト細胞中にコードするＭＡＣの導入は、ＨＩＶ感染の治療として役立つ。そのような系はさらに、疾患特異的リボザイムの使用が特定の疾患を治療もしくは緩和する上で有効であることを示すものである。
ｂ．腫瘍抑制遺伝子
腫瘍抑制遺伝子は、それの野生型対立遺伝子において、異常な細胞増殖を抑制する蛋白を発現する遺伝子である。腫瘍抑制蛋白をコードする遺伝子に突然変異もしくは欠失が生じると、生じた突然変異蛋白または腫瘍抑制蛋白発現の完全な喪失のために、細胞増殖が正しく調節されなくなる場合がある。その結果、特に細胞調節機序に対してすでに損傷がある場合には、異常な細胞増殖が起こる場合がある。多くのかなり研究されているヒト腫瘍および腫瘍細胞系が、腫瘍抑制細胞の欠如または機能喪失を有することが明らかになっている。
腫瘍抑制遺伝子の例としては、網膜芽細胞腫遺伝子すなわちＲＢ遺伝子、ｐ５３遺伝子、結腸癌において欠失している遺伝子［すなわち、ＤＣＣ遺伝子］および神経線維腫症１型［ＮＦ−１］腫瘍抑制遺伝子などがあるが、これらに限定されるものではない［例えば、米国特許５４９６７３１号、Weinberg et al．（1991）254:1138-1146参照］。腫瘍抑制遺伝子の機能喪失または失活は、かなりの数のヒト癌の発生および／または進行において中心的な役割を果たすと考えられる。
ｐ５３遺伝子
５３遺伝子の体細胞突然変異は、ヒト癌に関連する遺伝子突然変異で最も高頻度のものであると言われている［例えば、Weinberg et al．（1991）Science 254:1138-1146参照］。正常もしくは野生型ｐ５３遺伝子は、損傷を受けた場合に細胞形質転換を指向する細胞増殖の陰性調節因子である。ｐ５３発現産生物は核で認められ、そこでは他の遺伝子産生物と同時にあるいは共動的に作用し得る。ｐ５３が欠失した腫瘍細胞系を野生型ｐ５３ベクターで治療することで、腫瘍形成性を低下させることに成功している［Baker et al．（1990）Science 249:912-915参照］。
ｐ５３遺伝子をコードするＤＮＡおよびそのＤＮＡを含むプラスミドは公知である［例えば、米国特許５２６０１９１号参照；さらに、Chen et al．（1990）Science 250:1576;Farrel et al．（1991）EMBO J．10:2879-2887も参照；その遺伝子を有するプラスミドはＡＴＣＣから入手可能であり、その配列はGenBank Databaseにあり、受託番号Ｘ５４１５６、Ｘ６００２０、Ｍ１４６９５、Ｍ１６４９４、Ｋ０３１９９である］。
ｃ．ＣＦＴＲ遺伝子
嚢胞性繊維症［ＣＦ］は、気道、汗腺、膵臓その他の臓器の上皮組織に発症する常染色体劣性疾患である。それは、塩素イオン輸送における欠陥と関連する致死性遺伝病であり、各種真核細胞における塩素伝導性の発現と関連していた１４８０アミノ酸の蛋白である嚢胞性繊維症膜貫通伝導性調節蛋白質［ＣＦＴＲ］をコードする遺伝子における突然変異が原因で生じる。ＣＦＴＲにおける欠陥によって、気道、汗腺、膵臓その他の組織における上皮細胞が、ｃＡＭＰ介在作働薬に反応して塩素イオンを輸送する能力を破壊もしくは低下させ、ｃＡＭＰ依存性蛋白キナーゼＡ［ＰＫＡ］による頂端膜チャンネルの活性化を障害する。この疾患の発生率が高いことおよび破壊的性質を考慮すると、有効なＣＦ治療の開発が急務である。
ＣＦＴＲ遺伝子［約２５０ｋｂ］をＭＡＣ中にトランスフェクションし、それを例えば以下のように遺伝子治療に用いることができる。ＣＦ−ＹＡＣ［Green et al．Science 250:94-98参照］を変性させて、プロマイシンもしくはハイグロマイシンに対する耐性を提供する蛋白をコードする遺伝子などの選択可能マーカー、およびｎｅｏ−ミニ染色体もしくはＳＡＴＡＣへの部位特異的組み込みで使用されるλ−ＤＮＡを持たせるようにすることができる。そのような変性ＣＦ−ＹＡＣは、変性ＣＦ−ＹＡＣを有する酵母原形質体との融合あるいは変性ＣＦ−ＹＡＣを有する酵母核の細胞への微量注入によって、ＥＣ３／７Ｃ５細胞もしくは１９Ｃ５×Ｈａ４細胞などの含ＭＡＣ細胞に導入することができる。次に、抗生物質耐性に基づいて、安定な形質転換体を選択する。その形質転換体は、細胞に含まれるＭＡＣ中に変性ＣＦ−ＹＡＣを有する。
２．遺伝子的に変化を受けて、疾患に対する抵抗性などの望ましい形質を有する動物、鳥、魚および植物
人工染色体は、例えば、疾患抵抗性、苛酷な環境条件に対する抵抗性、異なった成長パターンおよび物理的特徴向上などのある種の所望の形質を有する鳥および魚ならびに哺乳動物のような脊椎動物および無脊椎動物を含む動物を得るのに、理想的に適している。
疾患抵抗性生物を得る上での人工染色体のある使用例には、多価ワクチンの製造が関与する。そのようなワクチンには、ＭＡＣもしくは生物固有の人工染色体に含ませ、宿主に組み込んで免疫性を誘発するか、あるいは胚に組み込んで、ある種の疾患に対して免疫性であるかもしくは感受性が低い遺伝子導入（人間以外）動物および植物を形成することができる複数抗原をコードする遺伝子などがある。
病原体を破壊もしくは弱毒化するあるいは病原体が宿主に接触するのを抑制する遺伝子産物（ある種の病原体に対して有毒であるリボザイムおよび蛋白など）をコードするＤＮＡを有する人工染色体の宿主生物または胚に導入することで、疾患に対する抵抗性を与え、またはそれに対する感受性が低下した疾患抵抗性の動物および植物も得ることができる。
例えば、農業用および装飾用植物の産業などの分野における生物の有用性、加工可能性および商業的価値を高めると考えられる所望の形質を有する動物および植物も、疾患抵抗性の動物および植物の生産について上記と同様の方法で人工染色体を用いて得ることができる。そのような場合、生物または胚に導入される人工染色体は、生物において所望の形質を与える上で役立つ遺伝子産生物をコードするＤＮＡを有する。
特にニワトリなどの家禽のような鳥、魚および甲殻類は、人工染色体を用いた遺伝的に変化させた生物の製造用のモデル宿主として役立つ。
３．ライブラリーの取得およびスクリーニングへのＭＡＣおよび他の人工染色体の使用
大きいＤＮＡ断片を各人工染色体に組み込むことができることから、その染色体は、ゲノムＤＮＡライブラリの取得において全ゲノムを有することができるクローニング媒体として用いるのに適しており、スクリーニングを容易に行うことができる。例えはＭＡＣを用いて、各種生物から機能性動原体ＤＮＡを確認および単離するのに有用なゲノムＤＮＡライブラリを得ることができる。そのような利用分野では、特定生物からゲノムＤＮＡライブラリを得るのに使用されるＭＡＣは、その生物の細胞中では機能性ではないものである。すなわちそのＭＡＣは、その生物の細胞におけるＭＡＣ内にある遺伝子を安定に複製せす、分離せず、その発現を行わない。好ましくはＭＡＣには、生物の細胞中の指標遺伝子の転写を促進することができるプロモーターに連結した指標遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子またはネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える産生物をコードする遺伝子など）を持たせる。生物からのゲノムＤＮＡの断片をＭＡＣに組み込み、ＭＡＣを生物からの細胞に転移させる。ゲノムＤＮＡ断片内に含まれる機能性動原体を組み込んだＭＡＣを有する細胞は、マーカー遺伝子発現を検出することで確認される。
４．安定で高レベルの蛋白産生のためのＭＡＣおよび他の人工染色体の使用
本発明で提供されるＭＡＣおよび／または他の人工染色体は、蛋白の製造、特には生化学的経路もしくは多価ワクチンに関与する複数蛋白などの１つの細胞系からのいくつかの蛋白の製造に使用され、有効である。蛋白をコードする遺伝子を人工染色体に導入し、次にそれを細胞に導入する。別法として、対象の異種遺伝子を、その遺伝子が人工染色体に向かうような形で、すでに人工染色体を有する生産細胞系に転移させる。異種蛋白が発現される条件下で細胞を培養する。蛋白は安定で永久的なゲノム外染色体系において高レベルで発現されることから、選択的条件は必要ない。
細胞培養系での連続増殖に適応できる組換え宿主として役立ち得るトランスフェクション可能な細胞［例えば、McLean（1993）Trends In Biotech．11:232-238］は、人工染色体に基づく蛋白生産系での使用に好適である。宿主細胞系の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞［例えば、Zang et al．（1995）Biotechnolgy 13:389-392参照］、ＨＥＫ２９３、Ｌｔｋ-、ＣＯＳ−７、ＤＧ４４およびＢＨＫ細胞などがあるが、これらに限定されるものではない。ＣＨＯ細胞は特に好ましい宿主細胞である。人工染色体に基づく蛋白生産系で使用する宿主細胞系の選択は当業界の技術範囲に含まれるものであるが、多くの場合、生産される異種蛋白の性質、宿主細胞における蛋白の毒性の可能性、蛋白の翻訳後修飾（例えば、糖化、アミノ化、リン酸化）の必要条件、細胞で利用できる転写因子、異種遺伝子の発現を推進するのに使用されるプロモーター要素の種類、産生が完全に細胞内であるかまたは異種蛋白が好ましくは細胞から分泌されるか、ならびに細胞における酵素処理の種類などの各種因子によって決まる。
異種蛋白生産のための人工染色体に基づく系は多くの有利な特徴を有する。例えば上述のように、異種ＤＮＡは独立のゲノム外人工染色体（宿主細胞ゲノムの未知領域にランダムに挿入されたものや、一時的発現のみを与える染色体外要素として局在するものとは異なって）に局在することから、それは活性転写単位で安定に維持され、細胞分裂時の組み換えや脱離を介して放出されることはない。
従って、宿主細胞に選択遺伝子を含める必要はなく、従って選択条件下での増殖も必要ない。さらに、人工染色体はＤＮＡの大きい部分を組み込むことができることから、染色体に複数の異種遺伝子および連結プロモータ要素のコピーを保持することができ、それによって外来蛋白を高レベルで発現させることができる。別法として、遺伝子の複数のコピーを１個のプロモータ要素に連結することができ、いくつかの異なる遺伝子を融合した多遺伝子複合体で単一のプロモータに連結して、例えば完全な代謝経路を構成する全ての重要な蛋白を発現させることができる［例えば、Beck von Bodman et al．（1995）Biotechnology 13:587-591参照］。別法として、単一遺伝子の複数のコピーを単一のプロモーターに機能的に連結させることができるか、あるいは個々のまたは１個もしくは数個のコピーを異なるプロモータまたは同じプロモータの複数のコピーに連結させることができる。さらに、人工染色体は外来遺伝子の組み込みおよび発現に関してほとんど無限の能力を有することから、対象とする最終生成物をコードする遺伝子の発現だけでなく、宿主細胞の最適な維持および代謝管理に関連する遺伝子（例：成長因子をコードする遺伝子）ならびに所望の異種蛋白生成物の本来の構造における迅速な合成を容易にすることができる遺伝子（例：プロセシング酵素および転写因子をコードする遺伝子）の発現にも使用可能である。ＭＡＣＳは、生理活性にin vivoでの翻訳後修飾を必要とする蛋白およびペプチドなどのあらゆる蛋白もしくはペプチドの発現に好適である。そのような蛋白には、抗体断片、全長抗体および多重結合抗体、腫瘍抑制蛋白、天然もしくは人工の抗体および酵素、熱ショック蛋白その他などがあるが、これらに限定されるものではない。
そこで、そのような細胞に基づくＭＡＣを用いる「蛋白工場」を、適切なプロモーターを有する蛋白コード遺伝子、あるいは単一のプロモータによって作用する複数の遺伝子、すなわち融合遺伝子複合体［植物発現系における完全代謝経路など；Beckvon Bodman（1995）Biotechnology 13:587-591参照］の複数コピー［理論的には、無限数または得られるＭＡＣが、ほぼゲノム染色体（すなわち内因性）の大きさ以下である数字以上］で構成されるＭＡＣを用いて形成することができる。そのようなＭＡＣが構築されると、蛋白を含まない培地［例えば、（1995）Biotechnology 13:389-39参照］でのＣＨＯ細胞系、または連続生産を確定することができる他の不死化細胞系［例えば、（1993）TIBTECH 11:232-238参照］などの好適な細胞培養系に転移させることができる。
ＭＡＣが宿主細胞において高レベルの異種蛋白発現を行う能力は、例えば、本明細書に記載されＥＣＡＣＣに寄託されたＨ１Ｄ３およびＧ３Ｄ５細胞系の分析によって示される。これらの細胞から得られるｍＲＮＡのノーザンブロッティング分析によって、細胞におけるハイグロマイシン抵抗性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が、それに含まれるメガ染色体のアンプリコン数と相関していることが明らかである。
Ｆ．反復ＤＮＡ単位を含むＤＮＡ配列の合成方法
一般に、縦列反復ＤＮＡの組立により、相補的オリゴの明瞭なアニーリングなどの問題が生じる。例えば、別個にアニーリングされた生成物を、逆の配向で連結することができる。さらに、縦列もしくは反転した反復単位は、その配列を乱し得る組み換えおよび欠失事象を特に受けやすい。縦列反復ＤＮＡ単位の配列合成のクローニング段階で使用する適切な宿主生物（例：ｒｅｃ株）の選択は、そのような事象の減少および排除に役立ち得るものである。
本発明においては、反復ＤＮＡ単位を有する延長ＤＮＡ配列の合成方法が提供される。その方法は特に、縦列に反復したＤＮＡ単位の配置の合成に適用できるが、通常そのような配列は、他の公知の遺伝子組立戦略を用いて構築することは困難であるか、不可能である。これらの方法の具体的な用途は、単純な（例えば、２〜６個のヌクレオチド）縦列反復（臨床的意義を持つ可能性のある末端小粒および付随ＤＮＡ反復単位およびトリヌクレオチド反復単位など）ならびに複雑な反復ＤＮＡ配列の合成におけるものである。これらの方法を用いた１５０を超える連続反復ヘキサマーを有する末端小粒配列の合成の特定の例を、本明細書に示してある。
縦列ＤＮＡ反復配置の合成について本発明で提供される方法は、反復の配列を連続的に倍化することで、縦列反復の配置を級数的に延長する一連の延長段階に基づくものである。これらの方法は、遺伝子組立の既知の方法より勝る利点をいくつか提供するものである。例えば、原料のオリゴヌクレオチドは１回だけ使用する。本明細書に記載のＤＮＡ配置の最終生成物とともに、それの構築における中間体は、微生物（例：大腸菌および酵母）におけるクローニング型で得ることができる。これらの方法に関して、特に重要な点としては、この方法ではわずか２つのオリゴヌクレオチドを必要とするだけであるにもかかわらず、この手順の各延長段階で、配列の長さは直線的にではなく級数的に増加するという点である。制限部位は組立手順中にごく一時的に使用されることから、その構築プロセスは、制限酵素認識配列および反復ＤＮＡの配列の適合性の影響を受けない。アダプターは必要ない。ただし、同様の機能を有する領域が、このプロセスで使用される２つの制限部位間にある。制限部位使用に関係する唯一の制限は、この方法で使用される２個の部位がいずれのクローニング段階でも使用されるベクターの他の筒所にあってはならないという点である。その方法を利用して、ヒトアポリポ蛋白Ｂ１００遺伝子（３０ｂｐの反復単位、１００％ＡＴ）またはアルホイド付随ＤＮＡの各種数の縦列反復（ＶＮＴＲ）３’などの完全に同一の反復単位を有する複雑な反復を構築することができる。
縦列反復を有するＤＮＡ配列の合成方法について、以下に説明する。
１．原料
原料として２個のオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチド１は、長さｋの反復配列のものであり（隣接部分とは無関係）、適切に選択された制限部位に隣接している比較的短い長さ（６０〜９０ヌクレオチド）の反復単位を有する。
５'-S1＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞S2 -３'
ここで、Ｓ１はＥ１［好ましくは３’−突出（例：PacI，PstI，SphI，NsiIなど）または平滑末端を形成する酵素］によって開裂する制限部位１であり；Ｓ２はＥ２（好ましくは、３’−突出を形成する酵素またはＴｓｐＲＩなどの認識部位外で開裂するもの］によって開裂する第２の制限部位であり；＞は簡単な反復単位を表し、「 」は下記のオリゴヌクレオチド２に相補的な配列に隣接する短い（８〜１０）ヌクレオチドを示す。
３'- S3-５'
ここで、Ｓ３は酵素Ｅ３についての第３の制限部位であり、構築時に使用されるベクターに存在する部位である。
多くの異なるＤＮＡ配列を開裂部位として認識する非常に多様な制限酵素があることから、いずれかの特定の反復配置の合成に関連して、これらの方法に好適な部位および酵素（好ましくは３’−突出末端を形成するもの）を常に選択できなければならない。ほとんどの場合、反復配列には、制限部位の１個のみの（または恐らくは２個の）ヌクレオチドが存在することが必要であり、制限部位の残りのヌクレオチドは、以下の例のように除去することができる。
PacI:TTAAT/TAA--（クレノウ／dNTP）TAA--
PstI:CTGCA/G--（クレノウ／dNTP）G--
NsiI: ATGCA/T--（クレノウ／dNTP）T--
KpnI: GGTAC/C--（クレノウ／dNTP）C--
１個のＡを残す公知の制限酵素はないが、この問題は、以下のように全く残さない酵素によって解決できる。
TaiI: ACGT/（クレノウ／dNTP）--
NlaIII: CATG/（クレノウ／dNTP）--
さらに、クレノウに代えてヤエナリヌタレアーゼを用いた場合、次のようになる。
Xbal: T/CTAGAヤエナリヌクレアーゼ A--
さらに、認識配列外で切断する多くの制限酵素があり、その場合には全く制限はない。
TspRI NNCAGTGNN/--（クレノウ／dNTP）--
BsmI GAATG CN/--（クレノウ／dNTP）--
CTTAC/GN--（クレノウ／dNTP）--
２．段階１−アニーリング
オリゴヌクレオチド１および２を、重複の長さに応じて選択した温度でアニーリングする（代表的には、３０〜６５℃の範囲）。
３．段階２−二本鎖分子の形成
アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、ｄＮＴＰの存在下にクレノウポリメラーゼで充填して、二本鎖（ｄｓ）配列を得る。
５'-S1＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞＞S2 -S3-３'
３'-S1＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜＜S2 - S3-５'
４．段階３−二本鎖ＤＮＡのベクターへの組み込み
二本鎖ＤＮＡを、制限酵素Ｅ１およびＥ３で開裂し、次に同じ酵素Ｅ１およびＥ３で開裂させてあったベクター（例ｐＵＣ１９または酵母ベクター）に連結させた。連結生成物を用いて、使用するベクターに適合する適正な宿主細胞を形質転換し（例：ｐＵＣ１９を用いる場合、大腸菌ＤＨ５αなどの細菌細胞が好適な宿主である）、次にそれを選択平板で平板培養する。組換え体は、色（例えば、β−ガラクトシダーゼ発現の場合はＸｇａ１染色によって）または32Ｐ標識オリゴヌクレオチド２を用いるコロニーハイブリダイゼーション（オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによる検出が好ましい。その理由としては、それの配列はその後の各延長段階で除去され、反復配列の延長が奏功したＤＮＡを含む組み換え体のみに存在するからである）によって確認することができる。
５．段階４−プラスミドからの挿入物の単離
ｋ個のヌクレオチドの反復配列を有する組換えプラスミドの少量サンプルを、制限酵素Ｅ１およびＥ３で消化させ、挿入物をゲルで単離する（挿入物が短い時はポリアクリルアミドであるが、その後の段階での比較的長い挿入物の単離ではアガロースを用いることができる）。組換えプラスミドの第２の少量サンプルを酵素Ｅ２（クレノウおよびｄＮＴＰで処理して、３’−突出を除去）およびＥ３で切断し、大きい断片（プラスミドＤＮＡと挿入物）を単離する。
６．段階５−ｋ個反復のＤＮＡ配列の延長
２個のＤＮＡ（Ｓ１〜Ｓ３挿入物断片とベクター＋挿入物）を連結し、選択的平板で平板培養し、段階３のように延長組み換え体についてスクリーニングを行う。ここで、制限部位間の反復配列の長さは、前の段階における反復配列の２倍、すなわち２×ｋである。
７．段階６−２×ｋ個反復のＤＮＡ配列の延長
段階４および段階５を必要な回数繰り返して、所望の反復配列サイズを得る。
各延長サイクルにおいて、反復配列の大きさは倍化する。すなわち、ｍを延長サイクル数とすると、反復配列の大きさはｋ×２ｍヌクレオチドとなる。
以下に実施例を示すが、これらは例示のみを目的としたものであり、本発明を限定するものではない。
全般的な材料および方法
以下の材料および方法は、下記の実施例で使用され、人工染色体を含む細胞系を得るのに使用することができる方法の例である。当業者に公知である他の好適な材料および方法を使用することも可能である。当業者に公知のこれら材料および方法に対する変更も行うことができる。
Ａ．細胞系の培養、細胞融合および細胞のトランスフェクション
１．チャイニーズハムスターＫ−２０細胞およびマウスＡ９線維芽細胞をＦ−１２培地で培養した。ＥＣ３／７［米国特許５２８８６２５号参照、受託番号９００５１００１下にEuropean Collection of Animal Cell Culture（ECACC）に寄託；さらに、Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A.88:8106-8110および米国特許出願０８／３７５２７１号も参照］およびＥＣ３／７Ｃ５［米国特許５２８８６２５号およびPraznovszky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．88:11042-11046参照］マウス細胞系ならびにＫＥ１−２／４ハイブリッド細胞系を、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＦ−１２培地［SIGMA，St.Louis，MO］で維持した。
２．以下に記載のＴＦ１００４Ｇ１９およびＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５マウス細胞と以下に記載の１９Ｃ５×Ｈａ４ハイブリッドおよびそれの亜細胞系を、４００μｇ／ｍＬ以下のハイグロマイシンＢ［Calbiochem］を含むＦ−１２培地で培養した。ＬＰ１１細胞を、３〜１５μｇ／ｍＬのプロマイシン［SIGHA,St.Louis，MO］を含むＦ−１２培地で維持した。
３．ＥＣ３／７Ｃ５細胞とプラスミド［ファルマシアから入手のｐＨ１３２、ｐＣＨ１１０；Hall et al．（1983）J.Mol.Appl.Gen．2:101-109も参照］とλＤＮＡとの共トランスフェクションを、受容体細胞５×１０6個当たりプラスミドＤＮＡ２〜５μｇおよびλファージＤＮＡ２０μｇを用いて、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法［例えば、Chen et al．（1987）Mol.Cell.Biol．7:2745-2752参照］によって行った。
４．細胞融合
マウスおよびハムスターの細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合した［Davidson et al．（1976）Som.Cell.Genet．2:165-176］。４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含むＨＡＴ培地中で、ハイブリッド細胞を選別した。
約２×１０7個の受容体細胞および２×１０6個のドナー細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合した［Davidson et al．（1976）Som.Cell.Genet．2:165-176参照］。ハイブリッドを選別し、１０％ＦＣＳおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含むＦ−１２／ＨＡＴ培地で維持した［Szybalsky et al．（1962）Natl.Cancer Inst.Monogr．7: 75-89］。ハイブリッド細胞系における「親」染色体の存在が、ビオチン標識したヒトおよびハムスターのゲノムＤＮＡならびにマウスの長い分散反復ＤＮＡ［ｐＭＣＰＥ１．５１］を用いた、生物特異的プローブによるin situハイブリダイゼーションによって確認された。
５．微小核体融合
ＥＣ３／７Ｃ５細胞から受容体細胞への人工染色体の微小核体介在転移を、グッドフェローら［Goodfellow et al．（1989）Techniques for mammalian genome transfer，Genome Analysis a Practical Approach，K.E.Davies，ed.，IRL Press，Oxford，Washington DC．pp．1-17］およびヤマダら［Yamada et al．（1990）Oncogene 5:1141-1147］の変法を用い、サキソンらの方法に従って［Saxon et al．（1985）Mol.Cell.Biol．1:140-146］行った。すなわち、Ｔ２５フラスコ中の５×１０6個のＥＣ３／７Ｃ５細胞を、最初に０．０５μｇ／ｍＬのコルセミドで４８時間、次に１０μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢで３０分間処理した。Ｔ２５フラスコを端で遠心し、ペレット化した微小核体を血清を含まないＤＭＥ培地中に懸濁させた。最初に５ミクロン、次に３ミクロンのポリカーボネートフィルターによって微小核体を篩い、５０μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニンで処理し、受容体細胞とのポリエチレングリコール介在融合に用いた。ＭＭＣｎｅｏを含む細胞の選別を、４００〜８００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含む培地中で、融合から４８時間後に開始した。
微小核体を、以下のようにして１Ｂ３およびＧＨＢ４２ドナー細胞からも得て、Ｅ２Ｄ６Ｋ細胞と融合させた［プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＣＨＯ Ｋ−２０細胞系、すなわち、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でのプロマイシン耐性遺伝子］。ドナー細胞を接種して、２４〜３６時間以内に６０〜７５％の集密度を得た。その後、１２時間もしくは２４時間にわたってコルヒチン（１０μｇ／ｍＬ）に曝露することで、細胞を有糸分裂で停止させ、微小核化を誘発した。ＧＨＢ４２細胞の小核化を促進するため、細胞を低張処理した（３７℃で１０分間）。コルヒチン処理後、またはコルヒチンと低張処理後に、細胞をコルヒチンを含まない培地で成長させた。
ドナー細胞をトリプシン処理および速心し、ペレットを１：１パーコール培地に懸濁させ、３７℃で３０〜４０分間インキュベーションした。インキュベーション後、１〜３×１０7個の細胞（６０〜７０％微小核化指数）を各パーコール勾配に負荷した（各融合を１〜２勾配に分配した）。これらの勾配をＳｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４ローター中３４〜３７℃で８０分間１９０００ｒｐｍにて遠心した。遠心後、２つの細胞可視帯域を除去し、４℃で１０分間２０００ｒｐｍにて遠心し、再懸濁させ、８μｍ孔径ヌクレオポアフィルターで濾過した。
１Ｂ３およびＧＨＢ４２細胞から得た微小核体を、Ｅ２Ｄ６Ｋと融合させた。Ｅ２Ｄ６Ｋ細胞は、ｐＣＨＴＶ２によるＣＨＯ Ｋ−２０細胞のＣａｐｏ4トランスフェクションによって得られた。プラスミドｐＣＨＴＶ２は、ＳＶ４０プロモータおよびポリアデニル化信号、Saccharomyces cerevisiaeＵＲＡ３遺伝子、チャイニーズハムスター２番染色体特異的付随ＤＮＡの２．４および３．２ｋｂ断片（ＨＣ−２付随体；Fatyol et al．（1994）Nuc.Acids Res．22:3728-3736参照）、ジフテリア毒Ａ鎖遺伝子の２個のコピー（１個は単純庖疹ウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子プロモータおよびＳＶ４０ポリアデニル化信号に連結したものであり、他方はポリアデニル化信号を持たずにＨＳＶ−ＴＫプロモータに連結したものである）、アンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製開始点を有する。トランスフェクション後、プロマイシン耐性コロニーを単離した。Ｅ２Ｄ６Ｋ細胞系におけるｐＣＨＴＶ２プラスミドの存在が、細胞から単離されたＤＮＡの核酸増幅によって確認された。
精製微小核体を前述と同様にして遠心し、フィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ、１００μｇ／ｍＬ）２ｍＬに再懸濁した。次にその微小核体懸濁液をＥ２Ｄ６Ｋ細胞の６０〜７０％集密度受容体培養物に加えた。それを室温で３０〜４０分間インキュベーションして、微小核体を凝集させた。ＰＨＡ−Ｐを除去した後、細胞を５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１ｍＬとともに１分間インキュベーションした。ＰＥＧを除去し、培養物を血清を含まないＦ−１２培地で３回洗浄した。細胞を非選択的培地中で４８〜６０時間インキュベーションした。その後、細胞培養物をトリプシン処理し、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢおよび１０ｇ／ｍＬのプロマイシンを含むＦ−１２培地で平板培養して、親細胞系に対して選別を行った。
ハイブリッド細胞を、選択培地で培養しておいた細胞から単離した。これらのクローンを次に、Ｘ−ｇａｌ染色法によってβ−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ＧＨＢ４２微小核体とＥ２Ｄ６Ｋ細胞との融合によって得られていた５つのハイブリッドクローン中の４個が、染色結果が陽性で、ＧＨＢ４２細胞が与えたメガ染色体に含まれるｌａｃＺ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼを発現していることを示している。同様に、１Ｂ３微小核体とＥ２Ｄ６Ｋ細胞との融合によって形成していたハイブリッドクローンからは陽性の染色結果が得られ、１Ｂ３細胞が与えたメガ染色体に含まれるｌａｃＺ遺伝子がβ−ガラクトシダーゼを発現していることを示唆していた。ハイブリッドクローンのin situハイブリダイゼーションも行って、マウス−ハムスターハイブリッド細胞のマウス染色体含有量も分析した。
Ｂ．染色体分染
染色体のトリプシンＧ分染を、ワンらの方法(Wang & Fedoroff（1972）Nature 235:52-54］を用いて行い、ＢＳＧによる構成異質染色質の検出を行った。Ｃ分染法をサムナーの方法（Sumner（1972）Exp.Cell Res.75:304-306）に従って実施した。ブロモデオキシウリジン［ＢｒｄＵ］組み込みによる染色体複製の検出には、ペリーらの（Perry & Wolff（1974）Nature 251:156-158）フルオレセイン−ギムザ［ＦＰＧ］染色法を用いた。
Ｃ．染色体の免疫標識およびin situハイブリダイゼーション
ヒト抗動原体血清ＬＵ８５１［Hadlaczky et al．（1986）Exp.Cell.Res．167:1-15］による間接免疫蛍光標識および同じ試料に対する間接免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーションを、既報の方法に従って行った［Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8106-8110参照；さらに、米国特許出願０８／３７５２７１号も参照］。マウスＡ９染色体の処理に関して２Ｍ塩酸を３７℃で２５分間行い、ハイブリッド細胞の染色体に関して、１Ｍ塩酸を３７℃で３０分間用いた以外は、メーカー推奨の手順に従って、フルオレセイン標識抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体［Boehringer］による免疫標識を行った。
Ｄ．走査型電子顕微鏡検査
オスミウム含浸を用いた走査型電子顕微鏡検査のための有糸分裂染色体製造を、既報の方法に従って行った［Sumner（1991）Chromosoma 100:410-418］。その染色体を、加速電圧２５ｋＶで動作する日立Ｓ−８００電界放出走査型電子顕微鏡で観察した。
Ｅ．ＤＮＡ操作、プラスミドおよびプローブ
１．一般的方法
ＤＮＡ操作はいずれも、標準的方法によって行った［例えば、Sambrook et al．（1989）Molecular cloning:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY参照］。マウスの主要付随体プローブを、ラトナー博士の方法によって得た［Dr.J.B.Rattner，University of Calgary，Alberta，Canada］。カルガリー大学のラトナー博士から、マウスの主要付随体プローブなどのクローニングしたマウス付随ＤＮＡプローブ［Wong et al．（1988）Nucl.Acids Res． 16:11645-11661参照］の提供を受けた。完全ハムスターゲノムＤＮＡを用いてハムスター染色体の着色を行い、２番染色体の動原体領域に固有のクローニング反復配列[Fatyol et al.]（1994）Nucl.Acids Res．22:3728-3736］も用いた。マウス染色体の着色を、マウス真正染色質に固有のクローニングした長い分散反復配列［ｐＭＣＰ１．５１］を用いて行った。
共トランスフェクションおよびin situハイブリダイゼーションには、ｐＣＨ１１０β−ガラクトシダーゼ構築物［PharmaciaまたはInvitrogen］およびλｃ１８７５Ｓａｍ７ファージＤＮＡ［New England Biolabs］を用いた。
２．プラスミドｐＰｕｒｏＴｅｌの構築
プロマイシン耐性遺伝子およびクローン化２．５ｋｂヒト末端小粒配列［配列番号３］を、ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏレトロウイルスベクターから構築した［Morgenstern et al．（1990） Nucl. Acids Res. 18: 3587-3596: Dr. L. Szekely (Microbiology and Tumorbiology Center，Karolinska Institutet，Stockholm）によって提供；さらに、Tonghua et al．（1995）Chin.Med.J．（Beijing，Engl.Ed.）108:653-659;Couto et al．（1994）Infect.Immun．62:2375-2378;Dunckley et al．（1992）FEBS Lett．296:128-34;French et al．（1995）Anal.Biochem．228:354-355;Liu et al．（1995）Blood 85:1095-1103;国際ＰＣＴ出願ＷＯ９５２００４４号、ＷＯ９５００１７８号およびＷＯ９４１９４５６号も参照］。
Ｆ．寄託細胞系
細胞系ＫＥ１−２／４、ＥＣ３／７Ｃ５、ＴＦ１００４Ｇ１９Ｃ５、１９Ｃ５×Ｈａ４、Ｇ３Ｄ５およびＨ１Ｄ３を、ブダペスト条約に従って、ＥＣＡＣＣ（European Collection of Animal Cell Culture）に、それぞれ受託番号９６０４９２４、９６０４９２５、９６０４９２６、９６０４９２７、９６０４９２８および９６０４９２９下に寄託した。これらの細胞系の寄託は１９９６年４月９日に行った（European Collection of Animal Cell Culture(ECACC)Vaccine Research and Production Laboratory，Public Health Laboratory Service，Centre for ApplicedMicrobiology and Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，United Kingdom）。寄託は、本願において寄託細胞系に対する正式の証明書を有し、欧州特許協定の規則２８（１）（ｄ）に従って、寄託細胞系を一般に利用可能とすることに対して無条件かつ最終的同意を与えたハドラツキー（Gyula Hadlaczky，H.6723，SZEGED，SMAMOS U.1.A．IX.36．HUNGARY）の名前で行った。
ＥＣ３／７、ＥＣ３／７Ｃ５および関連細胞系の取得
ＥＣ３／７細胞系は、ｎｅｏ−動原体を有するＬＭＴＫ-マウス細胞系である。ＥＣ３／７Ｃ５細胞系は、ｎｅｏ−ミニ染色体を有するＥＣ３／７の単一細胞サブクローンである。
Ａ．ＥＣ３／７細胞系
米国特許５２８８６２５号［さらに、Praznovszky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．88: 11042-11046およびHadlaczky et al．（199１）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A. 88:8106-8110も参照］に記載の方法に従って、ヒトおよび細菌のＤＮＡを有するλ構築物［λＣＭ８およびλｇｔＷＥＳｎｅｏ］の共組み込み後に、デノボ動原体形成を、形質転換マウスＬＭＴＫ-線維芽細胞系［ＥＣ３／７］で行う。
λ中でクローニングした１４ｋｂのヒトＤＮＡ断片［λＣＭ８］および優性マーカー遺伝子［λｇｔＷＥＳｎｅｏ］の共トランスフェクションにより、優性マーカー遺伝子［ｎｅｏ−動原体］に連結した選択可能動原体を、マウスＬＭＴＫ-細胞系ＥＣ３／７で形成した［Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88:8106-8110；図１参照］。異種ＤＮＡ［λＤＮＡおよびマーカー遺伝子をコードするＤＮＡ］の組み込みを、末端動原体染色体［７番染色体（図１Ｂ参照）］の短腕に行い、そこで増幅プロセスを行うことで、新たな動原体が形成された［ｎｅｏ−動原体（図１Ｃ参照）］。二動原体染色体（図１Ｃ）については、新たに形成された動原体領域に、細胞および活性動原体に導入される全ての異種ＤＮＡ［ヒト、λおよび細菌］か含まれる。
同じ染色体に２つの機能的に活性な動原体があることで、動原体間で規則的切断が生じる［図１Ｅ参照］。二動原体染色体上の２個の動原体間の距離は約１０〜１５Ｍｂと推定され、ミニ染色体を分離する切断が２つの動原体間で起こった。そのような固有染色体切断により、ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片が生じる（細胞の約１０％で）（図１Ｆ）。この染色体断片は主として、ヒト、λ、プラスミドおよびネオマイシン耐性遺伝子ＤＮＡから構成されるが、若干のマウス染色体ＤＮＡも有する。細胞学的証拠から、ＭＭＣｎｅｏの安定化時にｎｅｏ−動原体を有する染色体断片の反転複製があったことが示唆される。ＭＭＣｎｅｏを含む細胞系におけるミニ染色体の大きさは約２０〜３０Ｍｂである。この所見は、大きさが倍化したことを示している。
二動原体染色体［図１Ｅ］を有するＥＣ３／７細胞系から、反復単−細胞クローニングによって、２個の亜細胞系［ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６］を選別した。これらの細胞系では、ｎｅｏ−動原体は専ら小さい染色体［ｎｅｏ−ミニ染色体］上に認められたが、元二動原体染色体は、検出可能な量の外来ＤＮＡ配列を有しており、活性なｎｅｏ−動原体は持たなかった［図１Ｆおよび１Ｇ］。
細胞系ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６のミニ染色体は類似している。細胞レベルおよび分子レベルのいずれにおいても、それらの構成に相違は認められない。これらのミニ染色体は、従来の制限エンドヌクレアーゼマッピングやパルスフィールド電気泳動およびサザンハイブリダイゼーションを用いる広範囲マッピングによっては区別できなかった。ＥＣ３／７Ｃ６系の細胞の細胞骨格はコルヒチンに対する感受性が高いことを示していたことから、ＥＣ３／７Ｃ５系を用いてさらに詳細な分析を行った。
Ｂ．ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６細胞系の取得
ｎｅｏ−ミニ染色体を有するＥＣ３／７Ｃ５細胞を、高濃度のＧ４１８［致死用量の４０倍］でのＥＣ３／７細胞系の３５０世代にわたるサブクローニングによって得た。２つの単一細胞由来の安定な細胞系［ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６］を得た。これらの細胞系は、ミニ染色体上にｎｅｏ−動原体を有し、二動原体染色体の残りの断片も有する。抗動原体抗体による間接免疫蛍光およびその後のin situハイブリダイゼーション実験から、ミニ染色体が二動原体染色体由来であることが示された。ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６細胞系（それぞれ、１４０個および１２８個の中期）において、無傷の二動原体染色体は認められず、それぞれ細胞の９７．２％および９８．１％でミニ染色体が検出された。これらのミニ染色体は、１５０細胞世代にわたって維持したものである。これらは、元二動原体染色体の残りの部分を有する。
末端小粒ＤＮＡ配列の複数コピーを、in situハイブリダイゼーションによって、元二動原体染色体の残りの部分のマーカー動原体領域で検出した。これは、マウス末端小粒配列が外来ＤＮＡ配列によって共増幅されたことを示している。
これらの安定なミニ染色体を有する細胞系は、別の動原体が機能して、ミニ染色体を維持することができることを示す直接の証拠を提供するものである［米国特許５２８８６２５号］。
ｎｅｏ−動原体をマウス染色体から分離するＥＣ３／７細胞での染色体切断が、Ｇバンド陽性「外来」ＤＮＡ領域で起こった。これは、元二動原体染色体の切断末端でλおよびヒトＤＮＡ配列の痕跡が認められたことで裏付けられる。ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片のＧバンドパターンを安定なｎｅｏ−ミニ染色体のものと比較することで、ｎｅｏ−ミニ染色体が、ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片の反転複製であることが明らかになっている。それはさらに、ｎｅｏ−ミニ染色体が１個の機能性動原体のみを有するが、ミニ染色体のいずれの末端も異質染色性であり、マウス付随ＤＮＡ配列が、in situハイブリダイゼーションによってこれらの異質染色質領域で認められた。
そこで、これらの２つの細胞系ＥＣ３／７Ｃ５およびＥＣ３／７Ｃ６は、優性マーカー遺伝子に連結した動原体を有する選択可能な哺乳動物ミニ染色体［ＭＭＣｎｅｏ］を有する［Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．88:8106-8110］。ＭＭＣｎｅｏは、ミニ染色体介在遺伝子転移のベクターとして使用するためのものであり、ミニ染色体に基づくベクター系のモデルとして使用されてきた。
ＭＭＣｎｅｏの広範囲マッピング研究から、ヒトＤＮＡおよびネオマイシン耐性遺伝子構築物が、マウス染色体に別個に組込まれ、次に外来ＤＮＡを含む染色体領域が増幅されることが明らかになっている。ＭＭＣｎｅｏは、約１６０ｋｂの反復ブロックの形でλＣＭ８およびλｇｔＷＥＳｎｅｏＤＮＡの約３０〜５０個のコピーを有し、それらが一緒になって、３．５Ｍｂ以上の領域を網羅している。これに加えて、マウス末端小粒配列［Praznovszky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．88:11042-11046］ならびに染色分体の正確で高次の構造構成に必要なマウス由来ＤＮＡがある。
専ら真正染色質マウスＤＮＡを認識する染色体着色プローブｍＣＰＥ１．５１［マウスの長い分散反復ＤＮＡ］を用いたら、検出可能な量の分散反復配列が、in situハイブリダイゼーションによってＭＭＣｎｅｏで認められた。ｎｅｏ−動原体は、少量であるが検出可能な量の付随ＤＮＡと関連している。ｎｅｏ−動原体をマウス染色体と分ける染色体切断が、「外来」ＤＮＡ領域で起こる。これは、元二動原体染色体の切断末端にλおよびヒトＤＮＡが存在することで明らかである。しかしながら、ＭＭＣｎｅｏの両末端には、in situハイブリダイゼーションによって明らかなマウスの主要付随ＤＮＡの痕跡がある。この所見は、ＭＭＣｎｅｏの安定化の際にｎｅｏ−動原体を有する染色体断片の大きさが倍化するのは、反転複製の結果であることを示唆するものである。ｎｅｏ−動原体形成時に外来ＤＮＡ配列で共増幅したマウス末端小粒配列は十分なＭＭＣｎｅｏ用末端小粒を提供できるが、複製によって、ミニ染色体用の機能性末端小粒が得られたものと考えられる。
ｎｅｏ−ミニ染色体の部分のヌクレオチド配列を次のようにして決定した。標準的方法に従って、ＥＣ３／７Ｃ５細胞から全長ＤＮＡを単離した。ＤＮＡについて、メーカーの手順に従って、ＰＣＲシステム(Expand Long Template PCR)［Boehringer Mannheim］を用いて核酸増幅を行った。その増幅方法では、ｎｅｏ−ミニ染色体に含まれるファージλ右腕の領域にある配列に相当する単一の３３量体オリゴヌクレオチドプライマーのみが必要であった。このオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１３の最初の３３個のヌクレオチドとして示してある。ｎｅｏ−ミニ染色体には、この配列の一連の反転反復があることから、その単一のオリゴヌクレオチドを正および逆のプライマーとして用いて、ファージλＤＮＡの反転反復集合間にあるＤＮＡが増幅された。一つの増幅反応から３つの生成物が得られ、反転反復の異なる群の間にあるＤＮＡの配列が異なっている可能性のあることが示唆された。人工染色体中の反復核酸単位において、わずかな相違がある可能性があり、人工染色体を有する細胞の培養時にそれが起こるものと考えられる。例えば、移動性遺伝要素の組み込みと反復配列の欠失とともに、塩基対変化が起こる可能性がある。
これら３つの生成物のそれぞれについて、ＤＮＡ配列分析を行った。３つの生成物の配列はそれぞれ、配列番号１３、１４および１５に示してある。配列決定した生成物がｎｅｏ−ミニ染色体から増幅されたことを確認するため、ミニ染色体および元二動原体染色体を持たない陰性対照細胞系（マウスＬｔｋ-細胞）ならびにｎｅｏ−ミニ染色体のみを有する陽性対照細胞系［１９Ｃ５×Ｈａ４細胞（図４参照）をＢｒｄＵで処理し、次にＧ４１８を含む選択培地で成長させ、ＢｒｄＵで再処理する事で得られたマウス−ハムスターハイブリッド細胞系ＧＢ４３］から単離したＤＮＡについて、同じプライマーを用いて対照増幅を行った。陽性対照細胞系のみが３つの増幅生成物を与え、陰性対照反応では、増幅生成物は検出されなかった。陽性対照増幅で得られた結果も、ｎｅｏ−ミニ染色体ＤＮＡが増幅され、元二動原体マウス染色体の断片は増幅されなかったことを示している。
３つの増幅生成物の配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースにある配列と比較した。配列番号１３および１４は、マウスからの槽内Ａ粒子からのＤＮＡの部分に対して高い（約９６％）相同性を示していた。配列番号１５は、データベースに入手できる配列とほとんど相同性を示さなかった。これら３つの配列を全て用いて、ｎｅｏ−ミニ染色体に対する相同性ＤＮＡとして遺伝子標的ベクターを得ることができる。
Ｃ．ミニ染色体の単離および部分精製
ＥＣ３／７Ｃ５細胞の有糸分裂染色体を、グリシンーヘキシレングリコール緩衝液系［Hadlaczky et al.，(1982)Chromosoma 86: 643-659］を用いて、ハドラツキーら（Hadlaczky et al.，(1981)Chromosoma 81:537-555］記載の方法に従って単離した。染色体懸濁液を１２００×ｇで３０分間遠心した。ミニ染色体を含む上清を５０００×ｇで３０分間遠心し、ペレットを適切な緩衝液に再懸濁させた。部分的に精製したミニ染色体を−２０℃で５０％グリセリン中にて保存した。
Ｄ．ＭＭＣｎｅｏ維持およびｎｅｏ発現の安定性
２８４日にわたって非選択培地中で成長させ、次に４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含む選択培地に転移させたＥＣ３／７Ｃ５細胞は、Ｇ４１８の存在下に永久的に培養された対照細胞と比較して、９６％平板培養効率［コロニー形成］を示した。細胞形成分析では、選択および非選択培養条件下では、ＭＭＣｎｅｏが細胞当たり１個のコピーで安定に維持されることが示された。分析した２２７０個の分裂中期で、２個のＭＭＣｎｅｏを有する分裂中期は２個のみ認められた。
サザンハイブリダイゼーション分析では、ＤＮＡ制限パターンに検出可能な変化は示されず、選択または非選択培養条件下で成長させた細胞からのＤＮＡを比較した場合、同様のハイブリダイゼーション強度がｎｅｏプローブで認められた。
選択および非選択条件下に成長させた細胞から単離したｎｅｏ遺伝子からのＲＮＡ転写物のノーザン分析では、ごくわずかで重要性の低い相違のみが示された。ｎｅｏ遺伝子の発現は、非選択培養条件下で２９０日間Ｇ４１８を含まないＦ−１２培地で維持されたＥＣ３／７Ｃ５細胞で持続した。ミニ染色体からのｎｅｏ遺伝子の長期発現は、ＭＭＣｎｅｏの核位置によって影響を受ける可能性がある。in situハイブリダイゼーション実験では、中間期核において、ＭＭＣｎｅｏの周辺位置が優先することが明らかになった。２５００の核分析中６０％を超えるもので、核外膜付近の核の周囲で、ミニ染色体が認められた。
ミニ染色体転移とλｎｅｏ染色体の製造
Ａ．ミニ染色体転移
ｎｅｏ−ミニ染色体［ＭＭＣｎｅｏと称する、図２Ｃ］は、ハムスターおよびヒトなどの異なる哺乳動物細胞とミニ染色体を有する細胞［ＥＣ３／７Ｃ５またはＥＣ３／７Ｃ６］との融合による遺伝子転移に使用されている。３７個の安定なハイブリッド細胞系が得られている。得られたハイブリッド細胞系はいずれも、「染色体着色」用のビオチン化ヒトおよびハムスターのゲノムまたはｐＭＣＰＥ１．５１マウス長分散反復ＤＮＡプローブを用いるin situハイブリダイゼーションによって明らかなように、真正のハイブリッドであることがわかっている。ＭＭＣｎｅｏはさらに、ＥＣ３／７Ｃ５細胞由来の微小核体の融合によってマウスＡ９、Ｌ９２９および多分化能Ｆ９テラトカルシノーマに転移させて奏功している。転移は、ＰＣＲ、サザンブロッティングおよびミニ染色体特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーションによって確認した。細胞形成分析から、微小核体融合について予想されるように、わずかな細胞［１〜５％］がＭＭＣｎｅｏを受けた（または保持した）ことが確認された。
これらの結果は、ＭＭＣｎｅｏが広範囲の細胞によって耐容されることを示している。原核生物遺伝子およびミニ染色体上にあるヒトおよびλの配列についての過量投与は、組織培養細胞には不利ではないと考えられる。
ＭＭＣｎｅｏは、ＥＣ３／７Ｃ５ゲノムの最も小さい染色体であり、約２０〜３０Ｍｂと推定され、それは大半の宿主細胞（マウス）染色体よりかなり小さい。大きさが小さくなることで、簡単な分別遠心によって、単離染色体の懸濁液からミニ染色体を部分的に精製することができる。このようにして、純度１５〜２０％のミニ染色体懸濁液が得られている。これらのミニ染色体豊富物を用いて、微量注入もしくはリポフェクションなどによって、ミニ染色体を特定の標的細胞に導入することができる。標的細胞には、遺伝子療法で使用できる治療細胞、さらには遺伝子導入（人間以外）動物を得るための胚細胞などがある。
ＭＭＣｎｅｏは、自己複製することができ、細胞中で安定に維持され、非選択条件下に長期培養した後であっても、ｎｅｏ遺伝子の持続的発現を可能とするものである。核外膜付近の領域を占有しているように思われるのは非組み込みベクターである。核においてそれが周辺部に局在していることは、ＭＭＣｎｅｏの機能的完全性および安定性を維持する上で重要な役割を有する。宿主核の機能的区画化は、外来配列の機能に効果を有すると考えられる。さらに、ＭＭＣｎｅｏはメガ塩基のλＤＮＡ配列を有し、それは相同的組換えと従って所望の遺伝子のＭＭＣｎｅｏへの組み込みのための標的部位として役立つはずである。それは、細胞および微小核体の融合、微量注入、エレクトロポレーション、脂質介在キャリア系または染色体取り込みによって転移させることができる。ＭＭＣｎｅｏのｎｅｏ−動原体は、比較的大きい１５０〜２００Ｍｂのλｎｅｏ染色体の正常な分離を維持および支持することができる。この結果は、ＭＭＣｎｅｏ染色体が異種ＤＮＡの大きい断片を持つのに有用であるに違いないことを示している。
Ｂ．λｎｅｏ染色体の製造
ＥＣ３／７およびチャイニーズハムスター卵巣細胞［図２］によって得られたハイブリッド細胞系ＫＥ１−２／４では、二動原体染色体からのｎｅｏ−動原体の分離は、さらなる増幅プロセスと関連していた。この増幅によって、平均的な大きさの安定な染色体が形成された［すなわち、λｎｅｏ染色体；Praznovszky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．88:11042-11046参照］。λｎｅｏ染色体は、末端に位置する機能性動原体を有し、λ、ヒト、細菌およびマウスのＤＮＡ配列の複数コピーを有する７個の大きいアンプリコンから構成されている［図２参照］。これらのアンプリコンは、アンプリコン間の構成異質染色質の狭いバンドを形成するマウスの主要な付随ＤＮＡ［Praznovszky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．88:11042-11046］によって分離される。
「ソーセージ染色体」（ＳＣ）の形成
上記の実施例に記載の所見は、マウス７番染色体の動原体領域が大量増幅能力を有することを示している［他の結果は、この能力が７番染色体に固有のものではないことを示している］。この結論は、元二動原体７番染色体とｎｅｏ−ミニ染色体を有するＥＣ３／７Ｃ５に第２の優性選択可能マーカー遺伝子および非選択マーカー遺伝子を導入した共トランスフェクション実験からの結果によってさらに裏付けられる。ＥＣ３／７Ｃ５細胞系を、λファージＤＮＡ、ハイグロマイシン耐性遺伝子構築物［ｐＨ１３２］およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子構築物［ｐＣＨ１１０］で形質転換した。安定な形質転換体を、高濃度［４００μｇ／ｍＬ］ハイグロマイシンＢの存在下に選別し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。取り込まれた外来ＤＮＡの複数コピーを示す得られた形質転換細胞系について、in situハイブリダイゼーションによって調べて、取り込み部位の位置を決定し、ＬａｃＺ染色によってβ−ガラクトシダーゼ発現を検出した。
Ａ．材料および方法
１．ｐＨ１３２の構築
ｐＨ１３２プラスミドは、β−アクチンプロモーターの制御下に、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子および抗ＨＩＶ−１ｇａｇリボザイム［リボザイムの配列に相当するＤＮＡ配列については配列番号６参照］を有する。このプラスミドは、ｐＨｙｇプラスミド［Sugden et al．（1985）Mol.Cell.Biol．5:410-413；リッグ博士（Dr.A.D.Riggs，Beckman Research Institute，Duarte）から提供；例えば米国特許４９９７７６４号参照］およびｐＰＣ−ＲＡＧ１２プラスミド［Chang et al．（1990）Clin Biotech 2:23-31;ロッシ博士（Dr.J.J.Rossi,Beckman Research Institute,Duarte）から提供；抗ＨＩＶｇａｇリボザイムならびにβ−アクチンプロモーターとＳＶ４０後期遺伝子転写終止およびポリＡの信号に連結したリボザイム挿入物を有する哺乳動物発現ベクターの構築について記載している米国特許５２７２２６２号、５１４９７９６号および５１４４０１９号も参照］から構築した。ＢａｍＨＩリンカーが隣接しているリボザイム挿入物の挿入が関与するｐＰＣ−ＲＡＧ１２の構築を、ＢａｍＨＩ消化ｐＨβ−Ａｐｒ−１ｇｐｔに行った［Gunning et al．（1987）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．84:4831-4835参照、米国特許５１４４０１９号も参照］。
プラスミドｐＨ１３２を以下のようにして構築した。最初に、ｐＰＣ−ＲＡＧ１２［Chang et al．（1990）Clin.Biotech．2:23-31に記載］をＢａｍＨＩで消化させて、遺伝子の５’末端にヒトβ−アクチンプロモーターが隣接し、遺伝子の３’末端にＳＶ４０後期転写終止信号およびポリアデニル化信号が隣接している抗ＨＩＶリボザイム遺伝子［リボザイムＤと称する（Chang et al．（1990）Clin.Biotech．2:23-31による）；ロッシ（Rossi）らに対する米国特許５１４４０１９号、特にその特許の図４も参照］を有する断片を切り取った。チャンら（Chang et al．（1990）Clin.Biotech．2:23-31）の報告に記載のように、リボザイムＤを標的として、ＨＩＶｇａｇ遺伝子の翻訳開始領域の開裂を行う。このｐＰＣ−ＲＡＧ１２の断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（＋）［Stratagene，La Jolla，CA］にサブクローニングして、プラスミド１３２を得た。次に、プラスミド１３２をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化させて、遺伝子の５’末端にβ−アクチンプロモーターが隣接し、遺伝子の３’末端にＳＶ４０終止信号およびポリアデニル化信号が隣接しているリボザイムＤ遺伝子を有する断片を得た。この断片を、ｐＨｙｇ［Sugden et al．（1985）Mol.Cell.Biol．5:410-413]のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによる消化によって得られた最大断片に連結して、ｐＨ１３２を得た。そこで、ｐＨ１３２は、抗ＨＩＶリボザイム遺伝子と次にＳＶ４０終止信号およびポリアデニル化信号に連結したβ−アクチンプロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子と次にチミジンキナーゼ遺伝子ポリアデニル化信号に連結したチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、ならびに大腸菌ＣｏｌＥ１複製開始点およびアンピリシン耐性遺伝子という要素を有する約９．３ｋｂのプラスミドである。
ＨＳＶ−１ｔｋ遺伝子からの転写対照を用いてハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるプラスミドｐＨｙｇ［例えば、米国特許４９９７７６４号、４６８６１８６号および５１６２２１５号参照］は最初は、ｐＫａｎ２［Yates et al．（1984）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．81:3806-3810］およびｐＬＧ８９［Gritz et al．（1983）Gene 24:179-188参照］から構築されたものである。すなわち、ｐＫａｎ２をＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩで消化させて、トランスポゾンＴｎ５由来の配列を取り出した。ＳｎａＩ部位での平滑末端連結およびＢｇｌＩＩ部位での「突出末端」連結［容量２０ｍＬ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）１ワイス単位を使用］を用いて、ハイグロマイシン耐性ｈｐｈ遺伝子を消化したｐＫａｎ２に挿入した。ｐＫａｎ２のＳｍａｌ部位およびＢｇｌＩＩ部位は連結時に失われた。
ｐＨｙｇへのプロモーターおよびポリＡ部位を有する抗ＨＩＶリボザイム構築物の導入から得られるプラスミドｐＨ１３２には、β−アクチンプロモーターの制御下での抗ＨＩＶリボザイムならびにＴＫプロモーターの制御下でのハイグロマイシン耐性遺伝子がある。
２．染色体分染法
染色体のトリプシンＧ分染を、実施例１に記載の方法に従って実施した。
３．細胞培養
以下に記載のＴＦ１００４Ｇ１９およびＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５マウス細胞と１９Ｃ５×Ｈａ４ハイブリッドならびにそれの亜細胞系を、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ［Calbiochem］を含むＦ−１２培地で培養した。
Ｂ．ＥＣ３／７Ｃ５の共トランスフェクションによるＴＦ１００４Ｇ１９の生成
プラスミド［ファルマシアから入手可能なｐＨ１３２、ｐＣＨ１１０；Hall et al．（1983）J.Mol.Appl.Gen．2:101-109も参照］およびλＤＮＡ［λｃｌ８７５Ｓａｍ７（New England Biolabs）とＥＣ３／７Ｃ５との共トランスフェクションを、５×１０6個の受容体細胞当たりプラスミドＤＮＡ２〜５μｇおよびλファージＤＮＡ２０μｇを用いて、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法［例えば、Chen et al．（1987）Mol.Cell.Biol．7:2745-2752参照］によって行った。
Ｃ．ソーセージ染色体を有する細胞系
ＴＦ１００４Ｇ１９と称される形質転換体の一つの分析から、それがかなりのコピー数の組み込みｐＨ１３２配列およびｐＣＨ１１０配列を有し、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現を有していることが明らかになった。Ｇ分染およびヒトプローブ［ＣＭ８；例えば、米国特許出願０８／３７５２７１号参照］を用いたin situハイブリダイゼーションによって予想外に、ＥＣ３／７Ｃ５細胞系の元二動原体７番染色体で組み込みが起こったことが明らかになった。さらにこの染色体は、新たに形成された異質染色質染色体腕を有していた。この異質染色質腕の大きさは、個々の分裂中期で約１５０〜約８００Ｍｂの範囲であった。
ＴＦ１００４Ｇ１９細胞系からの単一細胞クローニングによって、約１００〜１５０Ｍｂの異質染色質腕を有する安定な７番染色体［ソーセージ染色体］を持つサブクローンＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５［図２Ｄ］を得た。この細胞系は、受託番号９６０４０９２６下にＥＣＡＣＣに寄託してある。この染色体腕は、付随ＤＮＡ豊富な４〜５個の付随部分と、等間隔に組み込まれた異種「外来」ＤＮＡ配列から構成されている。ソーセージ染色体のコンパタトな異質染色質腕の末端には、凝縮度の比較的小さい真核末端部分が規則的に認められる。このサブクローンを用いて、さらに分析を行った。
Ｄ．ソーセージ染色体が元二動原体染色体由来であることの明示
ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５細胞系におけるλファージおよびｐＨ１３２ＤＮＡによるin situハイブリダイゼーションにより、ミニ染色体上ならびに「ソーセージ」染色体の異質染色質腕上のみでの陽性のハイブリダイゼーションが明らかになった［図２Ｄ］。「ソーセージ」染色体［以下、ＳＣとも称する］がＥＣ３／７Ｃ５細胞系の元二動原体染色体（ＦＤ）から形成されたように思われる。
これを確認するため、ｐＣＨ１１０およびｐＨ１３２プラスミドの組み込み部位を決定した。これは、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のビオチン標識小断片によるこれら細胞でのin situハイブリダイゼーションによって行った。両方の実験により、ソーセージ染色体の異質染色質腕での狭いハイブリダイゼーションバンドが生じた。同じハイブリダイゼーションパターンが、ビオチン標識λプローブおよびｐＨ１３２プラスミドの混合物を用いて、ソーセージ染色体で検出されて、λファージ、ｐＨ１３２プラスミドおよびｐＣＨ１１０プラスミドの共組み込みか明らかになった。
これをさらに調べるため、ＤＮＡ結合染料ヘキスト３３２５８の存在下に細胞を培養した。この染料存在下でのマウス細胞の培養により、中期染色体の挟動原体異質染色質の低凝縮が生じ、ハイブリダイゼーションパターンを比較的良好に観察することができる。この方法を用いると、ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５細胞のソーセージ染色体の異質染色質腕は規則的な低凝縮を示し、in situでのハイブリダイゼーションによる「ソーセージ」染色体の構造が詳細にわかる。ハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のビオチン標識小断片を有するヘキスト処理ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５細胞でのin situでのハイブリダイゼーションの結果は、これらの遺伝子がソーセージ染色体の異質染色質腕のみに局在することを示している。さらに、等しい分染ハイブリダイゼーションパターンが認められた。この反復単位［アンプリコン］パターンは明瞭に、増幅プロセスによってソーセージ染色体が形成されたこと、ならびにλファージ、ｐＨ１３２およびｐＣＨ１１０プラスミドＤＮＡ配列がアンプリコンに隣接していることを示している。
マウス挟動原体異質染色質の主要構成分であるマウスの主要付随ＤＮＡを用いて実施された蛍光in situハイブリダイセーション［ＦＩＳＨ］を用いた別の系統の実験では、結果から、ソーセージ染色体のアンプリコンが主として付随ＤＮＡから構成されることが確認された。
Ｅ．ソーセージ染色体の１個の動原体
マウス動原体配列が「ソーセージ」染色体を形成する増幅プロセスに関与していたか否かならびにアンプリコンが不活性動原体を有するか否かを決定するため、マウスの少量付随ＤＮＡを用いてin situハイブリダイゼーションを行った。マウスの少量付随ＤＮＡは特に、全てのマウス染色体の動原体付近に局在している。ソーセージ染色体を含む全ての動原体で陽性のハイブリダイゼーションが検出されたが、それは異質染色質腕の開始時に陽性の信号を示すのみであった。
機能性動原体［例えば、Hadlaczky et al．（1989）Chromosoma 97:282-288参照］のみを認識するヒト抗動原体抗体［ＬＵ８５１］を用いた間接免疫蛍光では、ソーセージ染色体が活性動原体を１個のみ有することが明らかになった。動原体は、染色体の元二動原体部分から来るもので、マウスの少量ＤＮＡプローブのin situハイブリダイゼーション信号とともに局在している。
Ｆ．ソーセージ染色体の異質染色質における選択および非選択異種ＤＮＡの発現
１．高レベル異種遺伝子の発現
そうしてＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５細胞系は、ソーセージ染色体の異質染色質腕にのみ局在するハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の複数コピーを有する。ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５細胞は、２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢの存在下で、あるいは４００μｇ／ｍＬの場合でさえ、非常に良好に成長することができる［発現レベルは、ハイグロマイシン耐性遺伝子および単一コピー遺伝子の小断片によるノーザンハイブリダイゼーションによって求めた。］。
ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５形質転換体における非選択β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を、細胞のＬａｃＺ染色によって検出した。この方法により、１００％の細胞が暗青色に染色され、全てのＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５細胞において高レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現があることを示している。
２．発現される異種遺伝子のソーセージ染色体の異質染色質での存在
ソーセージ染色体の構成異質染色質に局在する遺伝子が、ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５形質転換体［すなわち、β−ｇａｌ発現］のハイグロマイシン耐性およびＬａｃＺ染色能力を提供することを示すため、ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５マウス細胞とチャイニーズハムスター卵巣細胞との間のＰＥＧ誘発細胞融合を行った。ハイブリッドを選別し、Ｇ４１８［４００μｇ／ｍＬ］およびハイグロマイシン［２００μｇ／ｍＬ］を含むＨＡＴ培地で維持した。１９Ｃ５×Ｈａ３および１９Ｃ５×Ｈａ４と称される２個のハイブリッドクローン（これらは受託番号９６０４０９２７下にＥＣＡＣＣに寄託してある）を選別した。そのいずれも、ソーセージ染色体とミニ染色体を有している。
１９Ｃ５×Ｈａ４ハイブリッドの単一細胞由来コロニー２７個を維持し、個々のサブクローンについて分析した。ハムスターおよびマウスの染色体着色プローブおよびハムスター２番染色体特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーションにより、１９Ｃ５×Ｈａ４クローンが完全チャイニーズハムスターゲノムおよび部分的マウスゲノムを有することが確認された。１９Ｃ５×Ｈａ４サブクローンはいずれも、ハムスターゲノムを保持したが、異なるサブクローンは、異なる数のマウス染色体を示し、マウス染色体の優先的脱離を示している。
マウス染色体のさらなる脱離を促進するため、ハイブリッド細胞をＢｒｄＵで繰り返し処理した。ゲノムを不安定化させるＢｒｄＵ処理によって、マウス染色体が大幅に失われる。ＢｒｄＵ処理１９Ｃ５×Ｈａ４ハイブリッド細胞を３つの群に分けた。一つのハイブリッド細胞群（ＧＨ）を、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）およびＧ４１８（４００μｇ／ｍＬ）の存在下に維持し、他の２つの細胞群は、Ｇ４１８（Ｇ）もしくはハイグロマイシン（Ｈ）選択条件下で培養して、ソーセージ染色体もしくはミニ染色体の脱離を促進させた。
１ケ月後、単一細胞由来サブクローンを、１９Ｃ５×Ｈａ４ハイブリッド系のこれら３個の継代培養物から得た。ビオチン標識λファージおよびハムスター染色体着色プローブによるin situハイブリダイゼーションによってサブクローンをモニタリングした。ソーセージ染色体を失っていたかミニ染色体を保持したＧ４１８の存在下に選別された４つの個々のクローン［Ｇ２Ｂ５、Ｇ３Ｃ５、Ｇ４Ｄ６、Ｇ２Ｂ４］が認められた。ハイグロマイシン選別下では、１個のサブクローン［Ｈ１Ｄ３］のみがミニ染色体を失った。このクローンには、メガ染色体［実施例５参照］が存在していた。
ハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はソーセージ染色体から発現されると考えられたことから、これら遺伝子の発現を、ソーセージ染色体を失っている４つのサブクローンで分析した。２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンの存在下に、４つの個々のサブクローンの細胞の１００％が死んだ。
β−ガラクトシダーゼ発現ハイブリッドを検出するため、ＬａｃＺ染色によってサブクローンを分析した。ソーセージ染色体を失った４つのサブクローンの細胞の１００％が、ＬａｃＺ染色能力も失った。非選択培養条件下でソーセージ染色体を失わなかった他のいずれのハイブリッドサブクローンも、ＬａｃＺ染色は陽性であった。
これらの所見は、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現がソーセージ染色体の存在に関連していることを示すものである。in situハイブリダイゼーションの結果は、異種ＤＮＡがソーセージ染色体の構成異質染色質から発現されることを示している。
他の３つのハイブリッドサブクローン［Ｇ２Ｃ６、Ｇ２Ｄ１およびＧ４Ｄ５］のin situハイブリダイゼーション研究では、ソーセージ染色体の存在は検出されなかった。ＬａｃＺ染色法によって、これらハイブリッド系で染色した細胞が一部検出され、これらのサブクローンについてハイグロマイシン選別を行ったところ、一部のクローンが生残した。これらハイグロマイシン耐性コロニーの細胞学的分析およびin situハイブリダイゼーションからソーセージ染色体の存在が明らかになり、ソーセージ染色体を失っていないＧ２Ｃ６、Ｇ２Ｄ１およびＧ４Ｄ５ハイブリッドの細胞のみがハイグロマイシン耐性およびβ−ガラクトシダーゼ発現を保持できたことが示唆された。この結果は、これら遺伝子がソーセージ染色体の存在に関連していることを確認するものであった。β−ガラクトシダーゼ発現のレベルを、モノクローナル抗体を用いる免疫ブロッティング法によって測定した。
ソーセージ染色体を有する細胞のハイグロマイシン耐性およびβ−ガラクトシダーゼが、マウス挟動原体異質染色質に局在する遺伝子によって発現された。これは、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅小断片をプローブとして用いて、ソーセージ染色体を持たないハイブリッド細胞でサザンＤＮＡハイブリダイゼーションを行うことで示された。いずれのサブクローンも、これらプローブとのハイブリダイゼーションを示さなかった。しかしながら、分析したクローンのいずれにもミニ染色体があった。ソーセージ染色体を有する他のハイブリッドクローンは、これらＤＮＡプローブとの強力なハイブリダイゼーションを示した。これらの結果から、ソーセージ染色体を有する細胞のハイグロマイシン耐性およびβ−ガラクトシダーゼ発現がマウス挟動原体異質染色質に局在する遺伝子によって行われたと言うことができる。
ギガ染色体
実施例４で説明した通りに、ソーセージ染色体を細胞融合によってチャイニーズハムスター細胞に転移させた。ハイグロマイシンＢ／ＨＡＴおよびＧ４１８選別を用いて、ソーセージ染色体を有する２つのハイブリッドクローン１９Ｃ５×Ｈａ３および１９Ｃ５×Ｈａ４を得た。ハムスターおよびマウス染色体着色プローブおよびハムスター２番染色体特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーションにより、１９Ｃ５×Ｈａ４が完全なチャイニーズハムスターゲノムと一部のマウスゲノムを有することが確認された。２７個の１９Ｃ５×Ｈａ４コロニーを維持し、個々のサブクローンとして分析した。２７個のサブクローン中２６個が形態的に未変化のソーセージ染色体を有していた。
１９Ｃ５×Ｈａ３細胞系の１個のサブクローン、１９Ｃ５×Ｈａ４７［図２Ｅ参照］では、ソーセージ染色体の異質染色質腕が不安定となり、継続的な染色体内成長を示した。極端な場合、増幅染色体腕の大きさは１０００Ｍｂを超えていた（ギガ染色体）。
安定なメガ染色体
Ａ．メガ染色体を有する細胞系の形成
すべての１９Ｃ５×Ｈａ４サブクローンは完全なハムスターゲノムを保持したが、異なるサブクローンは異なった数のマウス染色体を示したことから、マウス染色体の優先的脱離が示された。実施例４に記載のように、マウス染色体のさらなる脱離を促進するためには、ハイブリッド細胞をＢｒｄＵで処理し、Ｇ４１８（Ｇ）もしくはハイグロマイシン（Ｈ）選択条件下に培養し、次に１０-4ＭのＢｒｄＵで１６時間の再処理を行い、単一細胞サブクローンを得た。ＢｒｄＵ処理がゲノムを不安定化させて、同様にソーセージ染色体における変化を引き起こしたように思われた。さらに増幅を行った細胞群で、徐々に増加するのが認められた。ソーセージ染色体の約１５０〜２５０Ｍｂ異質染色質染色体腕が形成され、それはマウス７番染色体のものとは異なっていた。別の真正染色質終端部分を獲得することで、新たな次中部動原体染色体（メガ染色体）が形成された。７９個の個々のサブクローンを、単一細胞クローニングによって、これらのＢｒｄＵ処理培地から得た。４２個のサブクローンが無傷のメガ染色体を有し、５個のサブクローンがソーセージ染色体を有し、３２個のサブクローンで、メガ染色体の断片もしくは転位部分が認められた。メガ染色体を有する２６個のサブクローンを、２ケ月間にわたって、非選択条件下で培養した。２６個のサブクローン中１９個で、メガ染色体が保持された。メガ染色体を失ったサブクローンはいずれも、ハイグロマイシンＢに感受性となり、β−ガラクトシダーゼ発現がなく、両方のマーカーがメガ染色体に連結していることを示していた。
さらなる実験用に選択した２つの亜細胞系（Ｇ３Ｄ５およびＨ１Ｄ３）は、選択条件下で１００を超える世代でメガ染色体の形態に変化はなかった。Ｇ３Ｄ５細胞は、Ｇ４１８含有培地での１９Ｃ５×Ｈａ４細胞の成長と、それに続く再度のＢｒｄＵ処理によって得られたものであったが、Ｈ１Ｄ３細胞は、ハイグロマイシン含有培地での１９Ｃ５×Ｈａ４細胞の培養とそれに続く再度のＢｒｄＵ処理によって得られたものであった。
Ｂ．メガ染色体の構造
以下の結果は、真正染色質終端部分、組み込み外来ＤＮＡ（および例示の実施態様の場合にはｒＤＮＡ配列）は別として、メガ染色体全体が構成異質染色質であり、４０ブロック［約７．５Ｍｂ］以上のマウス主要付随ＤＮＡ［図２および３参照］の縦列配置を有する。４つの付随ＤＮＡブロックは、各末端に組み込み外来ＤＮＡ配列を有する巨大な回文構造［アンプリコン］に構成されている。次中部動原体染色メガ染色体の長腕および短腕はそれぞれ、６個のアンプリコンおよび４個のアンプリコンを有する。当然のことながら、各成分の固有の構成および大きさは生物および増幅事象が開始する染色体によって異なり得るものである。
１．主として異質染色質で構成されたメガ染色体
終端領域および組み込み外来ＤＮＡを除き、メガ染色体は主として、異質染色質から構成される。これはメガ染色体のＣ分染法によって明らかになっており、構成異質染色質の染色特性が陽性となっている。終端領域および組み込み外来ＤＮＡは別として、メガ染色体全体は異質染色性であるように思われる。マウス主要付随ＤＮＡはマウス染色体の挟動原体構成異質染色質の主要成分であり、総ＤＮＡの約１０％である［Waring et al．（1966）Science 154:791-794］。in situハイブリタイゼーションにマウス主要付随ＤＮＡプローブを用いると、終端領域を除いて、メガ染色体全体に強力なハイブリダイゼーションが認められた。そのハイブリダイゼーションは、分割パターンを示した。４つの大きいブロックが短腕に現れ、通常は４〜７ブロックが長腕に認められた。これらの部分を、約１５Ｍｂの主要付随ＤＮＡを有する正常マウス染色体の挟動原体領域と比較することで、メガ染色体上の主要付随ＤＮＡのブロックの大きさが、約３０Ｍｂであると推定された。
真正染色質に特異的なマウスプローブ［ｐＭＣＰＥ１.５１；マウス長分散反復ＤＮＡプローブ］を用いたら、Ｈ１Ｄ３ハイブリッド亜細胞系のメガ染色体の終端部分のみで、ハイブリダイゼーション陽性が検出された。Ｇ３Ｄ５ハイブリッドでは、ハムスター特異的プローブによるハイブリダイゼーションによって、いくつかのメガ染色体が長腕にハムスター起源の終端部分を有することが明らかになった。この所見は、これら染色体での終端部分の獲得がハイブリッド細胞で起こっていること、ならびにメガ染色体の長腕が形成されて間もない腕であることを示していた。マウス染色体の動原体に特異的なマウスの少量付随プローブを用いると［Wong et al．（1988）Nucl.Acids Res．16:11645-11661］、強力なハイブリダイゼーション信号がメガ染色体の一次くびれのみで検出され、それはヒト抗動原体血清［ＬＵ８５１］によって生じる陽性の免疫蛍光信号と同じ位置であった。
ｐＨ１３２、ｐＣＨ１１０およびλＤＮＡプローブを用いたin situハイブリダイゼーション実験からは、全ての異種ＤＮＡがマウス主要付随ＤＮＡ部分間のギャップにあることが明らかになった。マウス主要付随ＤＮＡの各部分の境界には、二重バンドの異種ＤＮＡが存在する長腕の第２の部分を除き、狭バンドの組み込み異種ＤＮＡがあり、そこには主要付随ＤＮＡ部分がないか、あるいはかなり少ないことを示していた。この染色体領域は、メガ染色体の長腕を確認する上での有用な細胞学的マーカーとして役立った。１個の染色分体で部分全体の形成が起こった場合は、これら欠落付随ＤＮＡブロックの「復旧」が１０-4の頻度で認められた。
ヘキスト３３２５８処理（５０μｇ／ｍＬで１６時間）後、メガ染色体は、終端部分を除き、それの全長にわたって低凝縮を示した。これによって、比較的高い分解能で、メガ染色体の構造を調べることが可能となった。低凝縮メガ染色体でのマウス主要付随プローブによるin situハイブリダイゼーションでは、約３０Ｍｂの主要付随部分が、狭バンドの非ハイブリダイゼーション配列によって互いに分離された約７．５Ｍｂの４個のブロックから構成されていることが示された［図３］。ＬＭＴＫ-細胞系およびＡ９細胞系からの中部動原体マウス染色体における挟動原体異質染色質の大きいブロックで、同様の分割化を認めることができる。
２．２個の縦列約７．５Ｍｂブロックとそれに続く反転ブロックを有する部分から構成されたメガ染色体
マウス細胞を単一Ｓ期の間、ＢｒｄＵの存在下に成長させた場合、マウス主要付随体のＤＮＡの２個の鎖の間でチミジン含有量に非対称性があることから、構成異質染色質はＦＰＧ染色後に側面非対称を示す。さらに、１９Ｃ５×Ｈａ４ハイブリッドでは、マウス線維芽細胞のチミジン−キナーゼ［Ｔｋ］欠乏が、ハムスターＴｋ遺伝子によって補完されて、ＢｒｄＵ組み込み実験が可能であった。
メガ染色体の驚くべき構造上の規則性が、ＦＰＧ法を用いて検出された。いずれの染色分体においても、メガ染色体の外観を格子模様とする暗および明の交互の染色が認められた。同様の見かけが、フルオレセイン接合抗ＢｒｄＵ抗体による標識によって得られた。これらの外観をメガ染色体の分割された外観と比較することで、１個の暗および１個の明ＦＰＧバンドが、約３０Ｍｂのメガ染色体部分１個に相当することが明らかになった。これらの結果は、約３０Ｍｂ部分の両半分が反転した配向を有することを示唆している。これは、in situでのハイブリダイゼーションと同じ染色体でのフルオレセイン接合抗ＢｒｄＵ抗体による取り込みＢｒｄＵの免疫標識とを併用することで確認された。このメガ染色体の約３０Ｍｂの部分［またはアンプリコン］はマウス主要付随ＤＮＡの４個のブロックから構成されていることから、一つの部分内に、縦列の約７．５Ｍｂブロック２個に続いて、２個の反転ブロックがあると言うことができる。
パルスフィールド電気泳動および「外来」ＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションによるメガ染色体ＤＮＡの大量マッピングにより、簡単なパターンの制限断片が明らかになった。組み込み外来ＤＮＡ配列において開裂部位がないか一つだけであるエンドヌクレアーゼを用い、次にｈｙｇプローブによるハイブリダイゼーションを行ったところ、１〜４個の主要断片が検出された。メガ染色体には１０〜１２個のアンプリコンがあり、そのアンプリコン当たり推定で３〜８個のｈｙｇ配列のコピーがあることから（メガ染色体当たり３０〜９０個のコピー）、ハイブリダイゼーション断片数が小さいということは、増幅部分においてＤＮＡが均一であることを示している。
３．メガ染色体の走査型電子顕微鏡測定による上記所見の確認
メガ染色体の異質染色質腕の均一な構成が、高分解能走査型電子顕微鏡観察によって確認された。ヘキスト３３２５８で処理したメガ染色体の延長腕およびマウス染色体の挟動原体異質染色質領域は同様の構造を示した。構成異質染色質領域は、真正染色質部分よりコンパクトであるように見えた。終端領域は別として、メガ染色体の両方の腕は完全に延長され、かすかな窪みを示しており、それは非増幅染色体とメガ染色体における付随ＤＮＡブロックの境界に相当するはずである。ヘキスト処理を行わない場合、その溝はメガ染色体腕におけるアンプリコン境界に相当するように思われた。さらに動原体は、周囲の異質染色質よりコンパクトで細かい繊維状外観を示していた。
４．ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する１Ｂ３細胞のメガ染色体
異種ＤＮＡの組み込み部位の領域におけるメガ染色体の配列を、クローニング法を用いたその領域の単離および得られたクローンの配列分析によって調べた。
この分析の結果は、異種ＤＮＡが、メガ染色体に含まれるマウスリボソームＲＮＡ遺伝子（すなわち、ｒＤＮＡ）付近に異種ＤＮＡが局在することを示していた。
ａ．異種ＤＮＡを組み込んだメガ染色体の領域のクローニング
本明細書に記載の方法（実施例１０参照）に従った蛍光活性化細胞選別法を用いて、メガ染色体を１Ｂ３細胞（反復ＢｒｄＵ処理とＨ１×ＨＥ４１細胞（図４参照）の単一細胞クローニングによって得られ、切断メガ染色体を有するもの）から単離した。内因性染色体からのＳＡＴＡＣ（メガ染色体）の分離後、単離したメガ染色体をＧＨ緩衝液（１００ｍＭグリシン、１％へキシレングリコール、飽和水酸化カルシウム溶液でｐＨ８．４〜８．６に調節したもの；実施例１０参照）に保存し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ中のアガロース床に遠心して入れた。
異種ＤＮＡの組み込み部位の領域周囲のメガ染色体の大量マッピングから、それがＮｏｔＩ用の認識部位のようなレアカッティング（rare-cutting）酵素部位を有する配列で豊富であることが明らかになった。さらに、マウス主要付随ＤＮＡ（メガ染色体の大部分を構成する）は、ＮｏｔＩ認識部位を持たない。従って、異種ＤＮＡ組み込み部位と関連するメガ染色体領域の単離を容易にするため、単離したメガ染色体を８ｂｐのＧＣ認識部位を有するレアカッティング制限エンドヌクレアーゼであるＮｏｔＩで開裂させた。メガ染色体の断片を次のように、プラスミドｐＷＥ１５（Stratagene，La Jolla，California）に挿入した。単離ＳＡＴＡＣを有する１００μＬの低融点アガロースブロック（メガプラグ）の半量を、ＮｏｔＩで３７℃にて終夜消化させた。次に、メガプラグを溶融させ、消化プラスミド、連結緩衝液およびＴ４リガーゼと混合した。連結は１６℃で終夜実施した。細菌ＤＨ５α細胞を連結生成物によって形質転換させ、形質転換した細胞をＬＢ／Ａｍｐ平板で平板培養した。１５〜２０個のコロニーを各平板で増殖させて、計１８９個のコロニーを得た。プラスミドＤＮＡを、ＬＢ／Ａｍｐ培地での増殖を生き残ったコロニーから単離し、サザンブロッティングハイブリダイゼーションにより、ｐＵＣ１９プローブに対してハイブリダイゼーションしたＤＮＡの存在について分析した。このスクリーニング方法によって、全てのクローン、挿入物を持たないがｐＷＥ１５プラスミドを有するクローンさえも検出されるようになった。挿入ＤＮＡを有するクローンは、異種ＤＮＡの組み込み部位にある非付随ＧＣ豊富メガ染色体ＤＮＡ配列を有すると予想されよう。いずれのコロニーも、ハイブリダイゼーションＤＮＡについては陽性であった。
１８９の全ての形質転換体の液体培養物を用いてコスミドの微小サンプルを得て、挿入ＤＮＡ内の制限部位分析に供した。最初の１８９のコスミドコロニー中６コロニーが挿入物を有していた。これらのクローンは２８（約９ｋｂの挿入物）、３０（約９ｋｂの挿入物）、６０（約４ｋｂの挿入物）、１１３（約９ｋｂの挿入物）、１５７（約９ｋｂの挿入物）および１６１（約９ｋｂの挿入物）と称した。制限酵素分析から、これらクローン中で３個（１１３、１５７および１６１）が同じ挿入物を有していることがわかった。
ｂ．プローブとしてメガ染色体の単離部分を用いるin situハイブリダイゼーション実験
クローン３０、１１３、１５７および１６１からの挿入ＤＮＡを精製し、標識し、いくつかの細胞系のin situハイブリダイゼーション試験におけるプローブとして使用した。ヨウ化プロピジウムを用いた細胞の対比染色によって、ハイブリダイゼーションの細胞部位を確認しやすくした。細胞中で検出された信号の位置を、以下の表にまとめてある。
Figure 0004999293
ｃ．プローブとしてメガ染色体の単離部分を用いるサザンブロッティングハイブリダイゼーション
マウス脾臓組織、マウスＬＭＴＫ-細胞、Ｋ２０チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＥＪ３０ヒト線維芽細胞およびＨ１Ｄ３細胞からＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡとラムダファージＤＮＡについて、メガ染色体クローンＮｏ．３０、１１３、１５７および１６１から単離した挿入物をプローブとして用いるサザンブロッティングハイブリダイゼーションを行った。プラスミドｐＷＥ１５を陰性対照プローブとして用いた。４つのメガ染色体クローン挿入物のそれぞれを、ラムダファージＤＮＡを除くＤＮＡサンプル全てに、多コピー法でハイブリダイゼーションした（ハイブリダイゼーションの強度およびハイブリダイゼーションバンド数によって示される）。プラスミドｐＷＥ１５はラムダＤＮＡのみにハイブリダイゼーションした。
ｄ．メガ染色体クローンＮｏ．１６１の配列分析
メガ染色体クローンＮｏ．１６１は、in situ実験およびサザンハイブリダイゼーション実験で最強のハイブリダイゼーションを示すように思われ、挿入配列の分析に選択した。配列分析は、最初にコスミドクローンＮｏ．１６１のサブクローニングを行って、次のような５個のサブクローンを得ることで行った。
クローンＮｏ．１６１の挿入物の末端断片を得るため、タローンをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化させ、ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（Stratagene,La Jolla,California）と連結させた。クローンＮｏ．１６１の挿入物の２個の断片、０．２ｋｂおよび０．７ｋｂ挿入物断片を得た。クローンＮｏ．１６１の挿入物の内部断片のサブクローニングを行うため、同じ消化物をＢａｍＨＩ消化ｐＵＣ１９と連結させた。クローンＮｏ．１６１の挿入物の３個の断片、０．６ｋｂ、１．８ｋｂおよび４．８ｋｂ挿入物断片を得た。
サブクローニングした挿入物断片全ての末端について、最初に手技にて配列決定した。しかしながら、極めて高いＧＣ含有量のため、オートラジオグラフは解釈が困難で、ＡＢＩシーケンサおよび染料終止暗号サイクルプロトコールを用いて配列決定を繰り返した。その配列データとＧＥＮＢＡＮＫデータベースにある配列とを比較したところ、クローンＮｏ．１６１の挿入物がＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ８２５６４（本明細書では配列番号１６として示してある）で示された位置７５５１〜１５６７０の間のマウスリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）反復単位の内部部分に相当することがわかった。クローンＮｏ．１６１の挿入物について得られた配列データを配列番号１８〜２４に示してある。具体的には、個々のサブクローンが、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ８２５６４（すなわち、配列番号１６）および配列番号１８〜２４における以下の位置に相当していた。
Figure 0004999293
配列番号１８〜２４に示した配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ８２５６４の位置７５５１〜１５６７０で示された配列とは一部の位置が異なっている。そのような相違は、ｒＤＮＡの反復単位間のランダム突然変異が原因であると考えられる。クローン１６１の配列分析の結果はそれがｒＤＮＡに相当することを示したか、それはそのクローンがヒトリンパ球およびマウス脾臓細胞で形成したin situハイブリダイゼーション信号の外観と相関性がある。ハイブリダイゼーション信号は、これら細胞における末端動原体染色体で明瞭に認められ、そのような種類の染色体は、その染色体の短腕にある挾動原体付随ＤＮＡに隣接するｒＤＮＡを含むことが知られている。さらに、ｒＲＮＡ遺伝子は哺乳動物において非常に保存度が高く、それはヒト染色体ＤＮＡに対するクローンＮｏ．１６１の生物間交差ハイブリダイゼーションによって裏付けられる。
ｒＤＮＡで認められるもののような増幅−複製制御領域を単離するため、Ｈ１Ｄ３細胞などのメガ染色体を有する細胞から単離したＤＮＡに対して、例えば以下のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、核酸増幅を行うことが可能である。
増幅制御要素順プライマー（１〜３０）
増幅制御要素逆プライマー（２１４２〜２１１１）
複製領域順プライマーの起源（２１１６〜２１４１）
複製領域逆プライマーの起源（５５４６〜５５２１）
Ｃ．メガ染色体形成の概要
図２に、マウスＬＭＴＫ-細胞系における二動原体染色体の形成から始まる安定なメガ染色体の形成に至る事象を示してある。（Ａ）λＣＭ８およびλｇｔＷＥＳｎｅｏによるＬＭＴＫ-細胞のトランスフェクション後のマウス７番染色体の動原体領域での１回のＥ型増幅により組み込み外来ＤＮＡに連結したｎｅｏ−動原体を得て、二動原体染色体を形成する。複数回のＥ型増幅によってλｎｅｏ染色体を形成する。それは７番染色体由来のものであり、マウスーハムスターハイブリッド細胞系で安定化したものである。（Ｂ）二動原体７番染色体の動原体間の特異的切断により、ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片と、末端に外来ＤＮＡの痕跡を有する７番染色体とを形成する。（Ｃ）ｎｅｏ−動原体を有する断片の反転複製により、安定なｎｅｏ−ミニ染色体を形成する。（Ｄ）元二動原体７番染色体の外来ＤＮＡ領域への外因性ＤＮＡの組み込みによってＨ型増幅を行い、異質染色質腕を形成する。真正染色質終端部分を捕捉することで、この新たな染色体腕を「ソーセージ」染色体の形で安定化させる。（Ｅ）ＢｒｄＵ処理および／または薬剤選別によってさらにＨ型増幅が誘発され、それによって不安定なギガ染色体が形成されるように見える。（Ｆ）繰り返しＢｒｄＵ処理および／または薬剤選別により、動原体複製を含むさらなるＨ型増幅を誘発し、それによって別の異質染色質染色体腕を形成する。染色体切断によって、それを７番染色体から切り離し、終端部分を獲得させて、安定なメガ染色体を形成する。
Ｄ．メガ染色体またはそれの誘導体を有する細胞系でのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子およびハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子の発現
メガ染色体またはそれの誘導体を有する細胞系での異種遺伝子（すなわち、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子）発現のレベルを量的に測定した。異種遺伝子のコピー数間の関係およびそれから発現される蛋白のレベルも測定した。
１．材料および方法
ａ．細胞系
上記のような２５０〜４００Ｍｂのメガ染色体を有するＨ１Ｄ３細胞と５０〜６０Ｍｂのミクロメガ染色体を有するｍＭ２Ｃ１細胞の異種遺伝子発現レベルを量的に評価した。Ｈ１×Ｈｅ４１細胞系（メガ染色体ならびにＣＤ４およびｎｅｏ遺伝子を有する単一のヒト染色体を有するマウス−ハムスター−ヒトハイブリッド細胞系；図４参照）の再度のＢｒｄＵ処理および単一細胞クローニングによって、ｍＭ２Ｃ１細胞を形成した。Ｆ１２培地中で、選択条件（１２０μｇ／ｍＬハイグロマイシン）もしくは非選択条件下に、その細胞系を成長させた。
ｂ．β−ガラクトシダーゼアッセイのための細胞抽出物の取得
ｍＭ２Ｃ１もしくはＨ１Ｄ３細胞培養物の単層を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞をゴム製ポリスマンで掻き取り、懸濁させて、再度ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞を０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に再憑濁させ、液体窒素中での冷凍および３７℃での解凍を３サイクル行って破壊した。抽出液を４℃にて１２０００ｒｐｍで５分間遠心することで透明とした。
ｃ．β−ガラクトシダーゼアッセイ
β−ガラクトシダーゼアッセイ混合物は、１ｍＭのＭｇＣｌ2、４５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．８ｍｇ／ｍＬのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび６６ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含んでいた。反応混合物を細胞抽出物とともに時間を長＜して３７℃でインキュベーションした後、３倍容量の１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3を加えることで反応を停止し、４２０ｎｍで光学密度を測定した。細胞抽出物を加えずにインキュベーションしたアッセイ混合物を対照として用いた。反応の直線範囲を測定したところ、０．１〜０．８０Ｄ420であった。β−ガラクトシダーゼ活性１単位を、３７℃で１分間に３ｎｍｏｌのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加水分解する酵素量と定義する。
ｄ．ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼアッセイのための細胞抽出物の取得
細胞を上記のように洗浄し、２０ｍＭのヘペス（Hepes）緩衝液（ｐＨ７．３）、１００ｍＭの酢酸カリウム、５ｍＭの酢酸マグネシウムおよび２ｍＭのジチオトレイトールに再懸濁させた。微小先端プローブを用い、ＭＳＥ超音波破砕機中０℃で１０秒間印加を６回行うことで、細胞を破壊した。各超音波印加後１分間、細胞を放冷した。抽出物を微量遠心管中、２０００ｒｐｍで１分間遠心することで透明とした。
ｅ．ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼアッセイ
ホスホセルロース紙結合アッセイ（Haas and Dowding（1975），Meth.Enzmol．43:611-628に記載のもの）によって、酵素活性を測定した。細胞抽出物に、０．１Ｍの塩化アンモニウムおよび１ｍＭのアデノシン−γ−32Ｐ−トリホスフェート（比放射能：３００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を補給した。０．１ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンを加えて反応開始し、長い時間にわたって３７℃でインキュベーションした。水浴で７５℃にて５分間サンプルを加熱することで反応停止し、沈殿した蛋白を微量遠心管中で５分間遠心することで除去した後、上清の少量サンプルをワットマン（Whatman）Ｐ−８１ホスホセルロース紙（２ｃｍ2）にスポットとしてしみ込ませた。室温で３０秒後、紙を高温（７５℃）蒸留水５００ｍＬに３分間入れた。この条件下で放射性ＡＴＰが溶液中に残っている間、ハイグロマイシンホスフェートはホスホセルロースに強力かつ定量的に結合している。紙を蒸留水５００ｍＬ中で３回すすぎ、ベックマン（Beckman）液体シンチレーションカウンタで、トルエンシンチレーションカクテル中にて、結合している放射能を測定した。ハイグロマイシンを加えずにインキュベーションした反応混合物を対照とした。
ｆ．異種遺伝子のコピー数の測定
細胞のＳＤＳ溶解とそれに続くプロテイナーゼＫ処理およびフェノール／クロロホルム抽出が関与する標準的な精製プロトコールを用いて、ＤＮＡをＨ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞から得た。単離ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化させ、アガロースゲルで分別し、ナイロンフィルターに吸い取らせ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子もしくはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子由来の放射性プローブとハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションのレベルを定量した（Molecular Dynamics Phosphorlmage Analyzerにて）。異なった細胞系から負荷したＤＮＡの総量を補正するため、フィルターを単一コピー遺伝子で再プロービングし、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を単一コピー遺伝子ハイブリダイゼーションに対して正規化した。
ｇ．蛋白濃度の測定
細胞抽出物の総蛋白量を、標準としてウシ血清アルブミンを用いるブラッドフォード比色分析によって測定した。
２．Ｈ１Ｄ３細胞およびｍＭ２Ｃ１細胞で発現されるβ−ガラクトシダーゼおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性の特性決定
量的条件を確立するため、β−ガラクトシダーゼおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性の最も重要な動力学的パラメータについて調べた。この比色分析で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性は、ｎＭ２Ｃ１およびＨ１Ｄ３細胞系の両方について、０．１〜０．８ＯＤ420の範囲で線形であった。β−ガラクトシダーゼ活性は、いずれの細胞系においても、総蛋白濃度範囲５〜１００μｇ以内で反応混合物に加えた蛋白量にも比例していた。ｎＭ２Ｃ１およびＨ１Ｄ３細胞系のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性は、β−ガラクトシダーゼについて記載の条件下での反応時間または加えた細胞抽出物の総量にも比例していた。
ａ．ｍＭ２Ｃ１およびＨ１Ｄ３細胞系のβ−ガラクトシダーゼ活性の比較
対数増殖期ｍＭ２Ｃ１およびＨ１Ｄ３細胞系から得られた細胞抽出物についてβ−ガラクトシダーゼ活性を調べ、１０回の独立の実験で比活性を比較した。Ｈ１Ｄ３細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性は、４４０±２５Ｕ／ｍｇ総蛋白であった。同じ条件下で、ｍＭ２Ｃ１細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ活性は１／４．８であり、９２±１３Ｕ／ｍｇ総蛋白であった。
Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞系の高分散、分散およびほぼ集密の培養液のβ−ガラクトシダーゼ活性も比較した。これらの実験では、対数的に細胞数が異なったＨ１Ｄ３細胞およびｍＭ２Ｃ１細胞を、一定容量の培地に接種し、標準的条件下に３日間成長させた。異なる細胞密度で成長させた細胞培養物のβ−ガラクトシダーゼ比活性に有意差は認められず、Ｈ１Ｄ３／ｍＭ２Ｃ１β−ガラクトシダーゼ比活性も、３つの細胞密度のいずれにおいても同様であった。しかしながら、Ｈ１Ｄ３もしくはｍＭ２Ｃ１細胞の集密で静止した細胞培養物では、恐らくは接触阻害の結果としての細胞分裂停止のためにβ−ガラクトシダーゼの発現は有意に低かった。
ｂ．Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞系のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性の比較
細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは、Ｈ１Ｄ３またはｍＭ２Ｃ１細胞系に膜結合型で存在する。これは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性を、これら細胞抽出物の高速遠心によって完全に取り除くことができ、その酵素活性は高速ペレットを再懸濁することで回復できるという所見によるものである。
Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞系における酵素の比活性の比は、β−ガラクトシダーゼ活性と同様であった。すなわち、Ｈ１Ｄ３細胞は、ｍＭ２Ｃ１細胞と比較して４．１倍の比活性を有している。
ｃ．非選択条件下で成長させたＨ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞におけるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ活性
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現レベルを、３０世代にわたって非選択条件下で成長させたＨ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞系における比酵素活性定量に基づいて測定した。培地にハイグロマイシンがないことは、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現に影響しなかった。
３．Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞系におけるβ−ガラクトシダーゼおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子コピー数の定量
前述のように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、メガ染色体、すなわちＨ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞におけるミクロメガ染色体内のみにある。Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞系から単離したＤＮＡのゲノムサザンブロットの定量分析（PhosphorlmageAnalyzerによる）から、メガ染色体に組込んだβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のコピー数は、ｍＭ２Ｃ１細胞の場合と比較してＨ１Ｄ３細胞での方が約１０倍であることがわかった。ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数は、ｍＭ２Ｃ１細胞の場合と比較してＨ１Ｄ３細胞での方が約７倍である。
４．メガ染色体またはそれの誘導体を有する細胞での異種遺伝子発現の定量結果の概要と結論
異質染色質メガ染色体における細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有する高等真核生物（例：Ｈ１Ｄ３細胞）のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量測定により、細胞染色法によって検出される組込み細菌遺伝子が高レベルで発現するのが認められることが確認された。遺伝子導入動物における外来遺伝子の発現についての研究の報告では、導入遺伝子発現は正確な組織および発達の特異性を示すが、発現レベルは低いのが普通であり、広範囲の位置依存性の変動性を示す（すなわち、導入遺伝子発現のレベルは、染色体組込みの部位によって決まる）ことが明らかになっている。導入遺伝子の発現が低レベルであるのは、導入遺伝子を周囲の染色質の阻害効果から絶縁し、有効な遺伝子発現に必要な活性染色質構造の形成を促進する特殊なＤＮＡ配列がないためであると仮定されている。この位置依存的変動性を無効にし得て、高等真核生物における導入遺伝子座作用性領域（ＬＡＲ）配列および下等真核生物における固有の染色質構造（ｓｃｓ）要素の高レベル発現を保証できるいくつかのシス作用性ＤＮＡ配列要素が確認されている（例えば、Eissenbergand Elgin（1991）Trends in Genet．7:335-340参照）。これらのシス作用性ＤＮＡ配列がない場合、導入遺伝子発現のレベルは低く、コピー数依存性である。
Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞の異質染色質メガ染色体に含まれる細菌β−ガラクトシダーゼ受容体遺伝子は強力な真核生物プロモーターエンハンサー要素によって作用するが、特異的シス作用性ＤＮＡ配列要素を設計したり、それを境界要素として機能すると考えられる細菌ＤＮＡ構築物に組み込んではいない。そこで、特にメガ染色体におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が、遺伝子発現を遮断できることが知られている長くコンパクトな異質染色質環境にあることから、これらの細胞で測定される高レベルβ−ガラクトシダーゼ発現は重要である。メガ染色体は、遺伝子発現に対する異質染色質の阻害効果を克服するよう機能する細菌ＤＮＡ配列に関連して、ＤＮＡ配列要素を有するように思われる。
メガ染色体における異種遺伝子発現の特異性は、β−ガラクトシダーゼ発現レベルがコピー数依存性であるという所見によっても裏付けられる。全長メガ染色体を有するＨ１Ｄ３細胞系では、β−ガラクトシダーゼの比活性は、比較的小さく切断された形のメガ染色体のみを有するｍＭ２Ｃ１細胞の約５倍である。定量的ハイブリダイゼーション法によるＨ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞系におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子コピーの数の比較から、β−ガラクトシダーゼの発現がコピー数依存性であることが確認された。組込みβ−ガラクトシダーゼ遺伝子コピー数は、Ｈ１Ｄ３細胞の方がｍＭ２Ｃ１細胞の約１０倍である。そこで、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のコピー数を多く有する細胞系では、β−ガラクトシダーゼ活性レベルは高くなり、それは発現のコピー数依存性を裏付けるものである。メガ染色体の異なる誘導体を有する細胞系におけるβ−ガラクトシダーゼレベルおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ酵素レベルのコピー数依存性は、細菌遺伝子の組込み部位を囲む染色質配置およびメガ染色体の異質染色質環境のいずれも遺伝子発現を抑制しないことを示している。
Ｈ１Ｄ３細胞で発現されるβ−ガラクトシダーゼ蛋白の相対量を、この酵素のＶmax［均一な結晶化細菌β−ガラクトシダーゼ（Naider et al．（1972）Biochemistr 11: 3202-3210）の場合５００］およびＨ１Ｄ３細胞蛋白の比活性に基づいて推定することができる。５００というＶmaxは、均一なβ−ガラクトシダーゼ蛋白が３７℃で酵素蛋白１ｍｇ当たり１分間に基質５００μｍｏｌを加水分解することを意味している。総Ｈ１Ｄ３細胞蛋白抽出物１ｍｇが、３７℃で毎分１．４μｍｏｌの基質を加水分解することができる。すなわちＨ１Ｄ３細胞抽出物中に存在する蛋白の０．２８％がβ−ガラクトシダーゼである。
ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは、Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞中に膜結合した形で存在する。その酵素が高等真核生物細胞で膜中に組込まれる傾向は、それが原核生物細胞において細胞周辺に局在することと関係があると考えられる。細菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼは、均一になるまで精製されたことはない。従って、それのＶmaxは測定されていない。従って、その細胞系で発現されるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ蛋白の総量について推定を行うことはできない。しかしながら、ｍＭ２Ｃ１細胞と比較してＨ１Ｄ３細胞におけるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの比活性が４倍であることは、それの発現もコピー数依存性であることを示している。
特にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現に対する選択圧がない場合におけるＨ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞でのその遺伝子の発現が一定で高レベルであることは、異質染色質メガ染色体で生じる遺伝子発現が安定であることを明瞭に示している。この結論はさらに、Ｈ１Ｄ３およびｍＭ２Ｃ１細胞を非選択条件下に増殖させた場合、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ発現レベルが変化しなかったという所見によっても裏付けられる。細菌マーカー遺伝子の常に高レベルな、安定した、コピー数依存的発現は、メガ染色体が外来遺伝子の発現に対する理想的ベクター系であることを明瞭に示している。
構築されたＳＡＴＡＣおよびミニ染色体を有する細胞系の一部についての概要
１．ＥＣ３／７由来細胞系
マウス線維芽細胞系であるＬＭＴＫ-由来細胞系を、λＣＭ８およびλｇｔＷＥＳｎｅｏＤＮＡでトランスフェクションして［実施例２参照］、形質転換細胞系を得た。これらの細胞系には、受託番号９００５１００１下にＥＣＡＣＣ（European Collection of Animal Cell Culture）に寄託されたＥＣ３／７があった［米国特許５２８８６２５号参照；Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．88:8106-8110および米国特許出願０８／３７５２７１号も参照］。
この細胞系は、ｎｅｏ−動原体を有する二動原体染色体を有する。再クローニングおよび選別によって、安定なｎｅｏ−ミニ染色体および元二動原体染色体を有する細胞系であるＥＣ３／７Ｃ５などの細胞系を得た［図２Ｃ参照］。
２．ＫＥ１−２／４細胞
ＥＣ３／７のＣＨＯ−Ｋ２０細胞との融合およびＧ４１８／ＨＡＴによる選別によってハイブリッド細胞系が得られ、その中にＫＥ１−２／４があって、それは受託番号９６０４０９２４下にＥＣＡＣＣに寄託してある。ＫＥ１−２／４は、λｎｅｏ染色体を有する安定な細胞系であり［図２Ｄ参照；米国特許５２８８６２５号も参照］、Ｅ型増幅によって得られたものである。ＫＥ１−２／４は、λＤＮＡ、プロマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカー、ｐ５３および抗ＨＩＶリボザイム遺伝子などの対象遺伝子を有するベクターでトランスフェクションされている。これらのベクターは、染色体中の異種ＤＮＡによる相同組換えによってλｎｅｏ染色体中に対象遺伝子を導入する。
３．Ｃ５ｐＭＣＴ５３細胞
ＥＣ３／７Ｃ５細胞系をｐＨ１３２、ｐＨ１１０およびλＤＮＡならびに他の構築物と共トランスフェクションしている（実施例２参照）。各種クローンおよびサブクローンが選別されている。例えば、ｐ５３をコードするＤＮＡを有する構築物による形質転換によって、Ｃ５ｐＭＣＴ５３と称される細胞を得た。
４．ＴＦ１００４Ｇ２４細胞
前述のように、プラスミド［ファルマシアから入手のｐＨ１３２、ｐＣＨ１１０；Hall et al.（1983）J.Mol.Appl.Gen．2:101-109も参照］およびλＤＮＡ［λｃ１８７５Ｓａｍ７（New England Biolabs）］とのＥＣ３／７Ｃ５細胞の共トランスフェクションによって、形質転換細胞を得た。これらの中には、ｎｅｏ−ミニ染色体中で抗ＨＩＶリボザイムをコードするＤＮＡを有するＴＦ１００４Ｇ２４がある。ＴＦ１００４Ｇ２４の再クローニングによって、多くの細胞系が得られた。その中にはＮＨＨＬ２４細胞系がある。この細胞系も、ｎｅｏ−ミニ染色体に抗ＨＩＶリボザイムを有し、高レベルのβ−ｇａｌを発現する。それをＣＨＯ−Ｋ２０細胞と融合させて、各種ハイブリッドを得た。
５．ＴＦ１００４Ｇ１９由来細胞
ＴＦ１００４Ｇ形質転換体の再クローニングおよび選別によって、不安定なソーセージ染色体およびｎｅｏ−ミニ染色体を有する、実施例４で前述した細胞系ＴＦ１００４Ｇ１９を得た。単一細胞クローニングによって、安定なソーセージ染色体およびｎｅｏ−ミニ染色体を有するＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５［図４参照］細胞系を得た。ＴＦ１００４Ｇ−１９Ｃ５をＣＨＯ細胞と融合させて、ハイブリッドを選択条件下に成長させて、１９Ｃ５×Ｈａ４および１９Ｃ５×Ｈａ３細胞系［実施例４参照］およびその他の細胞系を得た。１９Ｃ５×Ｈａ３細胞系の再クローニングによって、ギガ染色体を有する細胞系、すなわち細胞系１９Ｃ５×Ｈａ４７（図２Ｅ参照）を得た。１９Ｃ５×Ｈａ４細胞のＢｒｄＵ処理および選択条件下［ネオマイシン（Ｇ）および／またはハイグロマイシン（Ｈ）］での成長によって、Ｇ３Ｄ５およびＧ４Ｄ６細胞系ならびに他の細胞系などのハイブリッド細胞系が得られている。Ｇ３Ｄ５はｎｅｏ−ミニ染色体およびメガ染色体を有している。Ｇ４Ｄ６は、ｎｅｏ−ミニ染色体のみを有する。
Ｈ培地での１９Ｃ５×Ｈａ４細胞の再クローニングによって多くのクローンが得られた。その中には、安定なメガ染色体を有するＨ１Ｄ３［図４参照］がある。再度のＢｒｄＵ処理およびＨ１Ｄ３細胞の再クローニングによってＨＢ３１細胞系が得られており、それをｐＴＥＭＰＵＤ、ｐＴＥＭＰＵ、ｐＴＥＭＰＵ３およびｐＣＥＰＵＲ−１３２ベクターによる形質転換に用いた［以下の実施例１２および１４参照］。
Ｈ１Ｄ３を、プラスミドにＣＤ４およびネオマイシン耐性をコードするＤＮＡを有するＣＤ４+Ｈｅｌａ細胞系と融合させている［例えば、そのＨｅｌａ細胞について記載している米国特許５４１３９１４号、５４０９８１０号、５２６６６００号、５２２３２６３号、５２１５９１４号、５１４４０１９号参照］。ＧＨによる選別によって、メガ染色体とＣＤ４ｎｅｏ構築物を含む単一のヒト染色体を有するＨ１×ＨＥ４１［図４参照］などのハイブリッドを得ている。再度のＢｒｄＵ処理および単一細胞クローニングによって、メガ染色体を有する細胞系を得ている［細胞系１Ｂ３；図４参照］。１Ｂ３細胞の約２５％が切断メガ染色体［約９０〜１２０Ｍｂ］を有する。これらサブクローンの別のものである２Ｃ５と称されるものを、含ハイグロマイシン培地で培養し、メガ染色体を含まない細胞系を得て、Ｇ４１８を含む培地で成長させた。これら細胞の再クローニングによって、矮小メガ染色体［約１５０〜２００Ｍｂ］を有するＩＢ４その他の細胞系、ならびにミクロメガ染色体［約５０〜９０Ｍｂ］を有するＩ１Ｃ３およびｍＭ２Ｃ１などの細胞系を得た。細胞系ｍＭ２Ｃ１のミクロメガ染色体は末端小粒を持たない。しかしながら、所望に応じて、本明細書で記載および生成したものなどの合成末端小粒をｍＭ２Ｃ１細胞ミクロメガ染色体に付加することができる。ミクロメガ染色体を有するｍＭ２Ｃ１細胞系などの比較的小さい切断メガ染色体を有する細胞系を用いて、さらに小さいメガ染色体（例えば、大きさが約１０〜３０Ｍｂ）を形成することができる。これは例えば、これら細胞をＸ線照射、ＢｒｄＵもしくは末端小粒指向in vivo染色体断片化に曝露することで、その細胞におけるミクロメガ染色体を切断および断片化することで行うことができる。
メガ染色体の複製
メガ染色体の均一構造により、構成異質染色質の複製についての詳細な分析を行う特有の機会が得られる。
Ａ．材料および方法
１．細胞系の培養
メガ染色体を有するＨ１Ｄ３マウス−ハムスターハイブリッド細胞［実施例４参照］を、１０％ウシ胎仔血清［ＦＣＳ］および４００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ［Calbiochem］を含むＦ−１２培地で培養した。Ｇ３Ｄ５ハイブリッド細胞［実施例４参照］を、１０％のＦＣＳ、４００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Calbiochem）および４００μｇ／ｍＬのＧ４１８［SIGMA］を含むＦ−１２培地で維持した。マウスＡ９線維芽細胞を、１０％ＦＣＳを補給したＦ−１２培地で培養した。
２．ＢｒｄＵ標識
代表的な実験では、並行して２０〜２４個の半集密細胞培養物を１０ｃｍシャーレに準備した。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Fluka）を、ＮａＯＨ１滴でアルカリ性とした蒸留水に溶かして、１０-2Ｍ原液を得た。このＢｒｄＵ原液１０〜５０μＬずつを各１０ｍＬ培地に加えて、ＢｒｄＵの最終濃度を１０〜５０μＭとした。細胞をＢｒｄＵ存在下に３０分間培養し、温完全培地で洗浄し、用時までＢｒｄＵ不在下にインキュベーションした。この時点で、５μｇ／ｍＬのコルヒチンをサンプル培養物に１時間ごとまたは２時間ごとに加えた。１〜２時間のコルヒチン処理後、有糸分裂細胞を「振り落とし（shake-off）」によって回収し、通常の染色体調製物を得て、免疫標識に供した。
３．染色体の免疫標識およびin situハイブリダイゼーション
マウスＡ９染色体の場合には２Ｍ塩酸を３７℃で２５分間使用し、ハイブリッド細胞の染色体については１Ｍ塩酸を３７℃で３０分間使用した以外は、メーカーの説明に従って、フルオレセイン接合抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体（Boehringer）による免疫標識を行った。ビオチン標識プローブによるin situハイブリダイゼーション、ならびに同一調製物についての間接免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーションを、既報の方法に従って行った［Hadlaczky et al.（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．88:8106-8110；米国特許５２８８６２５号も参照］。
４．顕微鏡検査
観察および顕微鏡写真撮影はいずれも、顕微鏡（Vanox AHBS;Olympus）を用いて行った。写真には、フジカラー４００ＳｕｐｅｒＧまたはフジカラー１６００ＳｕｐｅｒＨＧ高速カラーネガを用いた。
Ｂ．結果
ＢｒｄＵパルス標識とそれに続く免疫標識によって、メガ染色体の複製を分析した。最初にin vivoでのＤＮＡ標識についての基本的パラメータを決定した。
並行培地で５０μＭＢｒｄＵの３０分間パルスを用いて、パルス開始から５分間隔で、さらにはＢｒｄＵ除去から１５分〜１時間ごとにサンプリングおよび固定を行った。組み込まれたＢｒｄＵを、フルオレセイン接合抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体を用いる免疫標識によって検出した。最初の時点で（５分間）、３８％の核が標識され、ＢｒｄＵ存在下でのインキュベーション中は標識核の数が徐々に増加するのが認められ、ＢｒｄＵ除去の時点で３０分サンプルにおいて４６％という最高値を得た。それ以上の時点（６０分、７５分および９０分）において、変化はほとんど認められず、標識核の割合は一定のままであった［４４．５〜４６％］。
この結果は、（ｉ）ＢｒｄＵの取り込みが急速なプロセスであること、（ｉｉ）３０分間のパルス時間がＳ期核の高信頼性標識には十分であること、（ｉｉｉ）ＢｒｄＵは洗浄によって、培地から効果的に除去できることを示している。
最終複製染色体部分での最も早いＢｒｄＵ信号の出現と１回の完了した細胞周期後に染色体の染色分体の一つのみでの同一パターンの出現との間の時間を測定することで、Ｈ１Ｄ３およびＧ３Ｄ５細胞の細胞周期の長さを推定した。前期染色体での最初の検出可能ＢｒｄＵ信号の時間と標識有糸分裂法によって、Ｇ２期の長さを求めた［Qastler et al.（1959）Exp.Cell Res.17:420-438］。（ｉ）細胞周期長さと３０〜１２０分間のパルス中に標識された核の割合に基づき、（ｉｉ）最終複製染色体の複製の丁度終了した時点とＳ期開始時の染色体での最初の信号検出との間の時間を測定することで、（ｉｉｉ）標識有糸分裂法によってという３つの方法で、Ｓ期の長さを求めた。実験を繰り返して、細胞周期の期間が２２〜２６時間であり、Ｓ期か１０〜１４時間であり、Ｇ２期が３．５〜４．５時間であることが認められた。
メガ染色体の複製分析を、コルヒチン処理の２時間後に２時間間隔で有糸分裂細胞を回収することで、並行培養にて行った。再実験で、１時間のサンプリング間隔と１時間のコルヒチン処理を行って同じ分析を行った。それら２回の方法とも同等の結果を与えたが、約３０％の細胞が平均よりかなり短いかもしくは長い細胞周期を有することが認められたことから、２時間サンプリング間隔の方が適切であるように見えた。個々の染色体、特に後期複製ハムスター染色体の一部の特徴的な複製パターンが、Ｓ期の異なる段階についての有用な内部マーカーとして役立った。異なった実験で細胞周期の長さが異なることで生じるエラーを低減するため、第２のＳ期開始時に１個の染色分体に最初の信号が認められるまで、全細胞周期にわたってサンプリングおよび分析を行った。
メガ染色体の複製順序は次の通りである。Ｓ期の最も初期では、メガ染色体の複製が染色体末端で開始する。中間位置での最初の複製開始は通常、動原体領域で検出することができる。間もなく、なおもＳ期の最初の１／４期において、短腕の終端領域がほとんどそれの複製を完了した時に、染色体腕に沿って明瞭な開始信号が現れる。Ｓ期の第２の１／４期では、複製が進行するに連れて、ＢｒｄＵ標識領域が徐々に広がり、メガ染色体の格子パターンが明瞭になる［例えば、図２Ｆ参照］。同時に、マウス染色体の挟動原体領域もＢｒｄＵの強力な取り込みを示す。メガ染色体の複製はＳ期の第２の１／４期と第３の１／４期で最高となる。Ｓ期の第３の１／４期終了後および最終１／４期の丁度開始時に、メガ染色体およびマウス染色体の狭動原体異質染色質が複製を完了する。Ｓ期終了までに、マウスおよびハムスターの最後の複製部分のみがなお、ＢｒｄＵ取り込みを行っている。
ゲノム全体の複製は、明瞭な段階で起こる。Ｓ期の前半終了まで取り込みＢｒｄＵの信号が連続的に増加したが、Ｓ期の第３の１／４期が開始すると、異質染色質領域以外の染色体部分はほとんどＢｒｄＵを取り込まなかった。Ｓ期の最終１／４期では、ＢｒｄＵ信号が再度増加し、その際に最終複製部分が非常に強い取り込みを示した。
対照として、マウスＡ９細胞における複製について同様の分析を行った。免疫標識パターンの分解能を上げるため、ヘキスト３３２５８処理によってＡ９染色体の挟動原体領域を分散させた。周囲の真正染色質配列の強力な複製があるために、低凝集のマウス染色体であっても、異質染色質における最初のＢｒｄＵ信号の正確な位置決定は通常は困難であった。最初の信号の位置が明瞭に決定された染色体では、Ａ９染色体の挟動原体異質染色質の複製は、メガ染色体の場合と同様であった。Ａ９細胞の染色体も、ハイブリッド細胞におけるマウス染色体の物と同様の複製パターンおよび配列を示した。これらの結果は、メガ染色体およびマウス染色体が、ハイブリッド細胞においてその元のタイミングと特異性を保持していたことを示している。
ＢｒｄＵ取り込み後に得られた聞始部位のパターンと、Ｓ期の第１の１／４期の詳細な分析における「外来」ＤＮＡの組込み部位の位置とを比較することで、メガ染色体のアンプリコン構造に関係する複製起源（開始部位）の確認を試みた。メガ染色体の長腕での組込みＤＮＡの二重バンドが細胞マーカーとして役立った。得られた結果は、細胞レベルで認められたＢｒｄＵとin situハイブリダイゼーション信号とが同じ位置にあることを示しており、「外来」ＤＮＡ配列が複製起源のごく近傍にあって、レプリケータと付随配列との間の非付随配列に組込まれていると推定されることを示していた［図３参照］。実施例６．Ｂ．４に記載のように、メガ染色体で検出されるｒＤＮＡ配列も、「外来」ＤＮＡ配列の組込み部位のアンプリコン境界に位置し、メガ染色体の複製開始を起こす複製起源にｒＤＮＡ配列が関与していることが示唆される。いくつかの他の染色体の挟動原体領域では、メガ染色体における開始信号と同様の点のようなＢｒｄＵ信号を認めることができる。その信号は、通常の染色体の異質染色質領域における同様の開始部位を表している可能性がある。
頻度１０-4で、組込みＤＮＡ配列の「未制御」増幅が、メガ染色体で認められた。「外来」配列がレプリケータに近接しているという仮定（上述）と一致して、この空間的に制限された増幅は、複製起源の未制御の反復点火（firing）の結果として部分全体の複製が完了しないためであると考えられる。
Ｃ．考察
染色体の挾動原体領域の構成異質染色質は後期複製性であると考えられている［例えば、Miller（1976）Chromosoma 55:165-170参照］。それとは対照的に、それらの実験から、異質染色質ブロックの複製がＳ期の前半で明瞭な開始部位にて開始し、Ｓ期のほぼ３／４期にわたって続くことが明らかになっている。この差は、次のようにして説明することができる。（ｉ）通常の染色体では、付随ＤＮＡ周囲にある活発に複製する真正染色質配列によって開始信号が不明瞭となることから、開始部位の正確な位置がわかりにくい。（ｉｉ）異質染色質の複製は、異質染色質複製物の大部分と他のほとんどの染色体領域がすでにその複製を完了しているかまたはそれをまだ開始していないＳ期の後半期にのみ明瞭に検出することができる。そこで、オートラジオグラフィーによる放射能標識前駆体の取り込みの分析などの低分解能の細胞学的方法では、隣接する真正染色質部分がもはや複製を行っていないＳ期の後半で、異質染色質における顕著な複製信号を検出するのみである。
メガ染色体では、複製の最初の開始部位は、「外来」ＤＮＡ配列およびｒＤＮＡ配列がアンプリコン境界で組み込まれる部位で同じ位置を占めている。同様の開始信号が、「外来」ＤＮＡを持たないマウス染色体の一部の挟動原体異質染色質において、同時に認められ、アンプリコンの境界での複製開始部位が付随ＤＮＡブロックの非付随隣接配列にある可能性のあることを示している。各付随ＤＮＡ二本鎖に第１の開始部位が存在することは、この大きい染色体部分が、第１の開始部位とその単位の各末端における終止点によって区切られた単一の巨大な複製単位［メガサイクロン］であることを示唆している。いくつかの系統の証拠から、この高次複製単位内で、「二次」起源およびレプリコンがメガレプリコンの完全な複製に寄与することが示されている。
１．メガ染色体の異質染色質領域の総複製時間は約９〜１１時間であった。真核生物染色体では代表的である複製フォークの運動速度毎分０.５〜５ｋｂでは［Kornberg et al.（1992）DNA Replication．２nd．Ed.，New York:W.H.Freeman and Co.，p.474］、約１５Ｍｂのレプリコンの複製には５０〜５００時間を要すると考えられる。別法として、１個のみの複製開始点を使用した場合、平均複製速度は毎分２５ｋｂとなって、１０時間以内に複製が完了するはずであると考えられる。真正染色質および異質染色質の染色体部分におけるＢｒｄＵ信号の強度を比較することで、それらの複製速度が５〜５０倍異なることを示す証拠は認められなかった。
２．短いＢｒｄＵパルス標識を用いると、単一の複製開始点によって、複製フォークの動きを反映して、レプリコンに沿って移動する複製バンドが生じる。それとは対照的に、最終的にメガ染色体の格子パターンを生じた複製ゾーンの拡大が認められ、複製期間中では、ほとんどの強力なＢｒｄＵ取り込みがＳ期の後半で起こった。これは、メガレプリケータが活性化されたら、それによって「二次」開始点の活性化および点火ができ、付随ＤＮＡの大部分の複製が、Ｓ期の後半でそれらの「二次」開始点から起こることを示唆するものである。これは、メガ染色体の複製のある種の段階で、アンプリコン全体が短いＢｒｄＵパルスによって見かけ上標識され得るという所見によって裏付けられる。
メガレプリケータおよび二次複製開始点は、厳格な時間的および空間的制御下にあると思われる。メガ染色体内での最初の開始は動原体で起こるのが普通であり、その後間もなくして、メガレプリケータ全てが活性となる。複製を完了するメガ染色体の最後の部分は、長腕の第２の部分であるのが普通であった。マウスＡ９染色体を用いた対照実験の結果からは、マウス染色体の異質染色質の複製が、メガ染色体アンプリコンの複製に相当することが示される。従って、異質染色質ブロックにすでに存在する複製の時間的制御が、メガ染色体で保存されている。転写活動と複製開始との間の正の相関［Hassan et al．（1994）J.Cell.Sci．107:425-434］および負の相関［Haase et al．（1994）Mol.Cell.Biol．14:2516-2524］が提案されている。メガ染色体では、組込み遺伝子の転写は、複製開始点の元のタイミングに対して影響しないと思われる。異なるアンプリコンでのメガレプリケータ開始の統一的で正確なタイミングは、特異的でシス作用性の配列、複製起源の存在を示唆するものである。
マウス染色体の挟動原体異質染色質が、７〜１５Ｍｂの範囲の数千の短く簡単な反復単位を有し、動原体自体も数百のキロ塩基を有し得ることを考慮すると、高次の複製単位が存在する可能性が高いと思われる。メガ染色体の複製開始領域に制限された未制御染色体内複製が認められたことは、ローリングサークル型増幅を強く示唆するものであり、この領域における複製開始点の存在に対する証拠を追加するものである。
特異的複製開始部位がアンプリコンの境界で生じるという所見は、複製が増幅プロセスで何らかの役割を果たす可能性のあることを示唆するものである。その結果は、メガ染色体の各アンプリコンを、複製の「二次」開始点を有する一次開始部位［メガレプリケータ］によって規定される巨大なメガレプリコンと見なすことができることを示唆するものである。メガレプリコン内における二方向性複製の異なる起源からの複製バブル（bubble）の融合［DePamphilis（1993）Ann.Rev.Biochem.62:29-63］によって、メガレプリコン全体に相当する巨大な複製バブルが形成されると考えられる。これを考慮すると、複製指向的な増幅機序によって、メガベースの大きさのアンプリコンを形成することができる。Ｈ型およびＥ型増幅では、アンプリコンの染色体内増加が認められ［上記の実施例参照］、それは不均一姉妹染色分体交換モデルと一致する。構成異質染色質におけるメガレプリコンの誘発もしくは自然の不定期複製によっても新たなアンプリコンが形成されて、それが増幅の拡大または「正常」染色体の異質染色質多形を生じる可能性がある。メガ染色体の長腕の失われた部分の「復旧」は、１本鎖に限定された１個のアンプリコンの再複製の結果であると考えられる。
これらを併せて考えると、理論は別として、複製指向機序によって、マウス染色体の動原体領域における大量複製開始とデノボ染色体形成に対して妥当な説明が得られる。特異的［増幅配列、すなわち増幅を制御する配列］配列が増幅プロセスを促進する上で何らかの役割を果たす場合、メガレプリコンの一次複製開始部位［メカレプリケータ］での配列が候補として考えられる。
メガ染色体における外来ＤＮＡ付近のアンプリコン境界におけるｒＲＮＡ遺伝子配列の存在は、この配列が一次複製開始部位に寄与し、ＳＡＴＡＣのデノボ形成における挟動原体異質染色質の大量増幅に関与することを示唆するものである。リボソームＲＮＡ遺伝子は、縦列遺伝子の複数コピーを提供する固有の増幅機序を有する。そこで、本発明に関しては、細胞でのＳＡＴＡＣの構築で、ｒＤＮＡは標的組込みのための領域として、さらにはin vitroで構築されるＳＡＴＡＣの成分として役立つ。
マウス１番染色体由来の増幅領域を有する染色体の形成
実施例２〜７に記載の事象がマウス７番染色体に固有のものではないこと、ならびに人工染色体形成にＥＣ７／３細胞系が必要条件というわけではないことを示すため、異なる初期細胞系およびＤＮＡ断片を用いて実験を繰り返した。いかなる細胞または細胞系も使用が可能であるか、あるいは使用できないことを容易に決定することができる。
Ａ．材料
５×１０6個の受容体細胞についてプラスミドＤＮＡ２５μｇを用いて、「掻き取り負荷」トランスフェクション法［Fechheimer et al．（1987）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A.84:8463-8467］によって、ＬＰ１１細胞系を得た。ＬＰ１１細胞を、３〜１５μｇ／ｍＬのプロマイシン［SIGMA］を含むＦ−１２培地で維持した。
Ｂ．ＬＰ１１細胞での増幅
上記の実施例に記載の大量増幅は、形質転換ＥＣ３／７細胞系やマウスの７番染色体に限定されるものではない。独立の形質転換実験で、選択可能なプロマイシン耐性遺伝子を含む構築物でｐＰｕｒｏＴｅｌと称されるもの［このプラスミドの記載については、実施例１．Ｅ．２参照］を用いたリン酸カルシウム沈殿法によって、ＬＭＴＫ-細胞をトランスフェクションして、細胞系ＬＰ１１を得た。細胞系ＬＰ１１は、異なった長さ［約１５０〜６００Ｍｂ］の増幅染色体部分のある染色体を有する。ＬＰ１１細胞の細胞学的分析から、増幅は、ロバートソン（Robertsonian）転座によって生成する次中部動原体染色体の長腕の挟動原体領域で起こることが示された。この染色体腕は、Ｇ分染によって１番染色体であると確認された。Ｃ分染およびマウス主要付随ＤＮＡプローブとのin situハイブリダイゼーションは、Ｅ型増幅が起こっていることを示しており、新たに形成された領域は、異なる量の異質染色質を含む真正染色質染色体部分の配置から構成されていた。増幅部分の大きさおよびＣバンドパターンは不均一であった。いくつかの細胞で、これら増幅単位の数は５０を超えていた。しかしながら、ＬＰ１１細胞系の単一細胞サブクローンは、１０〜１５個の部分と一定のＣバンドパターンを有する安定なマーカー染色体を有する。
ＬＰ１１細胞の単一細胞クローニングによって得られたチミジンキナーゼ欠乏ＬＰ１１細胞の亜細胞系（例：ＬＰ１１−１５Ｐ １Ｃ５／７細胞系）を、チミジンキナーゼ遺伝子構築物でトランスフェクションした。安定なＴＫ+トランスフェクション体を得た。
異型塩基含有量および／または大きさによるＳＡＴＡＣおよび他の染色体の単離
１．内因性染色体からの人工染色体の単離
ＳＡＴＡＣなどの人工染色体は、好適な方法を用いて内因性染色体から分けることができ、代表的には中期染色体の単離、人工染色体と内因性染色体との識別および人工染色体と内因性染色体との分離が関与する。そのような方法には通常、（１）好ましくは１×１０6個程度で人工染色体を得ることができるだけの数の細胞（代表的には、約２×１０7個の有糸分裂細胞）を培養する段階、（２）コルヒチンなどの有糸分裂停止剤を用いて、有糸分裂の段階、好ましくは中期で、細胞の細胞周期を停止する段階、（３）特には、細胞を低張緩衝液中で膨張させることで処理して、破壊に対する細胞の感受性を高める段階、（４）放出された染色体を安定化させるための単離緩衝液の存在下に、物理的力を加えて細胞を破壊する段階、（５）遊離染色体を安定化させるための単離緩衝液の存在下で染色体を分散させる段階、（６）人工染色体と内因性染色体とを分離する段階、（７）単離した染色体を適切な緩衝液中で保存する段階（および所望に応じて輸送する段階）という基本的段階がある。例えば、成長の特性および要件が異なる各種細胞型を扱い、停止剤による有糸分裂遮断の期間を至適化して染色体収量と残屑レベルの望ましい均衡を得るための人工染色体の一般的単離方法の改良法および変法を経験的に決定することができる。
段階１〜５は、中期染色体の単離に関係するものである。人工染色体と内因性染色体との分離（段階６）は、各種方法で行うことができる。例えば、染色体は、ヘキスト３３２５８およひタロモマイシンＡ3などのＤＮＡ特異的染料で染色し、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を行うことで、染料含有量に基づいて人工染色体と内因性染色体に選別した。人工染色体の大量単離を容易にするため、スイングバケット遠心（染色体の大きさおよび密度に基づいた分離を行うため）[Mendelsohn et al．（1968）J.Mol.Biol.32:101-108参照］、ゾーナルローター遠心（染色体の大きさおよび密度に基づいた分離を行うため）[例えば、Burki et al.（1973）Prep.Biochem.3:157-182;Stubblefield et al.（1978）Biochem.Biophys.Res.Commun.83:1404-1414参照］、速度沈降（染色体の大きさおよび形状に基づいた分離を行うため）［例えば、Collard et al.（1984）Cytometry 5:9-19参照］などの各種分離方法を用いることができる。免疫親和性精製法も、大量人工染色体単離法で用いることができる。その方法では、人工染色体を含む細胞（非同期または有系分裂豊富）の大きい群をまとめて回収し、固体状態基体（例：カラム樹脂または磁気ビーズなど）に結合した抗体に結合させることで、有糸分裂染色体（低張緩衝液中での細胞のインキュベーションおよび／または処理した細胞の物理的破壊と併用した細胞の洗剤処理などの標準的方法を用いて、細胞から放出させることができる）が豊富となる。この方法での使用に好適な抗体を、凝集動原体蛋白または凝集およびＤＮＡ結合ヒストン蛋白に結合させる。例えば、哺乳動物動原体を認識する自己抗体ＬＵ８５１（Hadlaczky et al．（1989）Chromosoma 97:282-288参照）を用いて染色体の大量単離を行ってから、ＦＡＣＳなどの方法を用いて内因性染色体から人工染色体を分離することができる。
結合した染色体を洗浄し、最終的に溶離して選別することになろう。免疫親和性精製法を用いて、人工染色体を内因性染色体と直接分離することもできる。例えば、ハムスター細胞（例：Ｖ７９細胞もしくはＣＨＯ−Ｋ１細胞）などの比較的少量の異質染色質を含む染色体を有する細胞系でＳＡＴＡＣを形成することができるか、あるいはその細胞系にＳＡＴＡＣをトランスフェクションすることができる（例：本明細書に記載のような微量注入または微小核体融合によって）。次に、固体基体に接合した抗異質染色質結合蛋白（ショウジョウバエＨＰ−１）抗体を利用することで、主として異質染色質であるＳＡＴＡＣを内因性染色体から分離する。そのような基体は、ハムスター染色体と比較してＳＡＴＡＣと優先的に結合する。末結合のハムスター染色体を基体から洗い出し、ＳＡＴＡＣを標準法によって溶離する。
Ａ．細胞系および細胞培養手順
ある単離方法では、メガ染色体または切断メガ染色体を有する１Ｂ３マウス−ハムスター−ヒトハイブリッド細胞［図４参照］を、１０％ウシ胎仔血清、１５０μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補給したＦ−１２培地で増殖させた。メガ染色体およびミニ染色体を有するＧＨＢ４２［Ｇ３Ｄ５細胞から再クローニングした細胞系］マウス−ハムスターハイブリッド細胞も、１０％ウシ胎仔血清、１５０μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢおよび４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含むＦ−１２培地で培養した。両方の細胞系の倍化時間は約２４〜４０時間、代表的には約３２時間であった。
代表的には、細胞単層が約６０〜８０％の集密度に達した時に継代培養し、４８〜７２時間ごとに分けた。８０％を超える集密度に達した細胞は培養で老化しており、染色体回収には好ましくない。細胞を、約５０〜７０％集密度で１２〜３０時間にわたって１００〜２００個の１００ｍＬシャーレ中で平板培養してから、有糸分裂停止を行うことができる（下記参照）。
人工染色体のための宿主として使用することができ、人工染色体を単離することができる他の細胞系には、ＰｔＫ１（ＮＢＬ−３）有袋動物腎臓細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ３５）、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、Ｖ７９−４チャイニーズハムスター肺細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ９３）、インドムンチャク（Indianmuntjac）皮膚細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１５７）、ＬＭＴＫ(-)チミジンキナーゼ欠乏マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１．３）、Ｓｆ９行列毛虫ヨトウガ（fall armyworm）（Spodoptera frugiperda）卵巣細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１７１１）ならびにＭＡＣ、特にＳＡＴＡＣを構築するのに使用することができる、例えば本明細書に記載のハムスター−マウスハイブリッド細胞などの形成ヘテロカリオン（ハイブリッド）細胞系などがあるが、これらに限定されるものではない。
細胞系を選択して、例えば大量生産プロセスで望まれるような人工染色体の生産および単離の効率を高めることができる。例えば、宿主細胞選択における考慮事項の一つとしては、細胞の人工染色体／総染色体比があり得る。人工染色体と内因性染色体との分離を容易にするため、人工染色体／総染色体比は高い方が望ましいと考えられる。例えばＨ１Ｄ３細胞（マウス／ハムスターヘテロカリオン；図４参照）の場合、この比は１：５０、すなわち総染色体５０個に対して人工染色体（メガ染色体）１個である。それとは対照的に、インドムンチャク皮膚細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１５７）は、染色体総数（７本の染色体の二倍数）が相対的に少なく、同様にカンガルーネズミ細胞（１２本の染色体の二倍数）でも、細胞での人工染色体の導入または形成時における人工染色体／総染色体比が相対的に高いと考えられる。
人工染色体の生産および単離について宿主細胞を選択する上での別の考慮事項としては、人工染色体の大きさと比較した内因性染色体の大きさがあると考えられる。染色体の大きさの差を利用して、人工染色体と内因性染色体との分離を容易にすることができる。例えば、インドムンチャク皮膚細胞染色体は、ミニ染色体や切断メガ染色体よりかなり大きいことから、人工染色体とムンチャク染色体との分離は、一変量（１個の染料、ヘキスト３３２５８またはクロモマイシンＡ３）ＦＡＣＳ分離法を用いて行うことができると考えられる。
人工染色体の生産および単離のための宿主細胞を選択する上での別の考慮事項としては、細胞の倍化時間があり得る。例えば、人工染色体を単離する手順で使用するのに十分な数の人工染色体含有細胞を形成するのに必要な時間は、大量生産にとっては重要であると考えられる。そこで、倍化時間が相対的に短い宿主細胞が望ましいと考えられる。例えば、Ｖ７９ハムスター肺細胞の倍化時間は約９〜１０時間であるのに対してＨ１Ｄ３細胞の倍化時間は約３２時間である。
従って、いくつかの点について考慮して、人工染色体の生産および単離のための宿主細胞選択を行うことができる。人工染色体のデノボ形成に最も望ましいとして選択される宿主細胞は、細胞系で形成される人工染色体の大量生産向けに至適化されていない場合がある。そのような場合、最初の宿主細胞系で人工染色体を形成したら、人工染色体の有効で高レベルな生産および単離に比較的好適な産生細胞系にそれを転移させることが可能であると考えられる。そのような転移は、例えば本明細書に記載のような微小核体融合または本明細書に記載のような手順を用いる形成細胞系から精製した人工染色体の生産細胞系への微量注入などのいくつかの方法によって行うことができる。生産細胞系は好ましくは、細胞当たり２個以上の人工染色体コピーを有するものとする。
Ｂ．染色体単離
一般に、細胞は級数的成長で２世代にわたって培養してから、有糸分裂停止を行うのが普通である。ある特定の単離法で有糸分裂１Ｂ３およびＧＨＢ４２細胞を蓄積するため、５μｇ／ｍＬコルヒチンを培地に１２時間加えた。得られた有糸分裂指数は６０〜８０％であった。有糸分裂細胞を、単層細胞での培地の慎重なピペット採取による選択的分離によって回収した。集めた（有糸分裂）細胞を平板から放出させる手段として、機械的振り落としを利用することも可能である。２００×ｇで１０分間の遠心によって、細胞を沈降させた。
細胞（プラスチック上または懸濁液で成長）は、ヒドロキシ尿素、ビンブラスチン、コルセミドまたはアフィジコリンなどのコルヒチン以外の化学薬剤によって、細胞周期の各種段階で停止させることができる。ヒドロキシ尿素およびアフィジコリンなどの有糸分裂以外の段階に細胞を停止させる化学薬剤を用いて、その群における全ての細胞の周期を同期させてから、細胞培地から取り出して、細胞をほぼ同時に有糸分裂まで進めて、その時点で細胞を回収して、染色体を分散させることができる。有糸分裂細胞を豊富として、機械的振り落とし（付着細胞）に供することができると考えられる。ＭＡＣ含有細胞の群内での細胞の細胞周期を、養分、成長因子またはホルモン遮断によって同期させて、Ｇ1またはＧ0段階の細胞を蓄積することもできる。次に、養分または成長因子を再度加えることで、静止細胞を約１世代において同期された細胞周期に再度入らせることができる。このようにしてホルモン遮断に対して反応することが知られていて、人工染色体のための宿主として好適である細胞系には、増殖刺激をプロラクチンに全面的に依存しているＮｂ２ラットリンパ腫細胞系などがある（Gout et al.（1980）Cancer Res.40:2433-2436参照）。細胞をプロラクチン欠乏培地で１８〜２４時間培養することで増殖を停止し、細胞を細胞周期のＧ1期初期で蓄積する。プロラクチンを加えると、９０％を超える細胞が有糸分裂状態にあると考えられるＭ期まで、全ての細胞がその細胞周期を進む（コルヒチンを加えることで、有糸分裂細胞の量を９５％超とすることができると考えられる）。プロラクチン添加による増殖の再開と染色体分離のための有糸分裂細胞回収の間の時間は経験的に決定することができる。
別法として、Ｖ７９細胞などの付着細胞を、ローラーボトルで増殖させ、ローラーボトルを２００ｒｐｍ超で回転させることで、有糸分裂細胞をプラスチック表面から放出させる（Shwarchuk et al．（1993）Int.J.Radiat.Biol．64: 601-612）。ある所定の時点で、級数的に成長する同期群中の細胞の約１％がＭ期となる。コルヒチンを加えない場合であっても、２００ｒｐｍでの５分間の遠心によって、４個の１７５０ｃｍ2ローラーボトルから２×１０7個の有糸分裂細胞が回収されている。コルヒチンを２時間加えることで、収量を６×１０8個の細胞まで上昇させることができる。
いくつかの方法を用いて、これらの細胞から中期染色体を単離することができ、その方法には、ポリアミン緩衝液系に基づくもの［Cram et al．（1990）Methods in Cell Biology 33:377-382］、修正ヘキシレングリコール緩衝液系に基づくもの［Hadlaczky et al．（1982）Chromosoma 86:643-65］、硫酸マグネシウム緩衝液系に基づくもの［Van den Engh et al．（1988）Cytometry 9:266-270およびVan den Engh et al．（1984）Cytometry 5:108］、酢酸固定緩衝液系に基づくもの［Stoehr et al．（1982）Histochemistry 74:57-61］ならびに低張ＫＣｌおよびヨウ化プロピジウムを利用する方法に基づくもの［Cram et al．（1994）XVII meeting of the International Society forAnalytical Cytology，October 16-21，Tutorial IV Chromosome Analysis and Sorting with Commercial Flow Cytometers;Cram et al．（1990）Methods in Cell Biology 33: 376］などがあるが、これらに限定されるものではない。
１．ポリアミン法
１Ｂ３またはＧＨＢ４２細胞から人工染色体を単離するのに使用したポリアミン法では、約１０7個の有糸分裂細胞を低張緩衝液（７５ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペルミジン）１０ｍＬ中で室温にて１０分間インキュベーションすることで、細胞を膨張させた。細胞は低張緩衝液中で膨張して、中期染色体を放出するが、細胞溶解には至らない。次に細胞を、代表的には室温で、１００×ｇで８分間遠心した。細胞ペレットを注意深く取り出し、約１０7個の細胞をポリアミン緩衝液［１５ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１４ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１％ジギトニン、０．２ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペルミジン］１ｍＬに再懸濁させて、中期染色体を物理的に分散させた。次に、細胞懸濁液を慎重に抜き取り、それを３ｍＬプラスチック注射器に取り付けた２２Ｇ針から排出することで、染色体を放出させた。染色体濃度は、染色体約１〜３×１０8個／ｍＬであった。
ポリアミン緩衝液単離プロトコールは、高分子量染色体ＤＮＡを得るのに好適である［Sillar and Young（1981）J.Histochem.Ctochem.29:74-78;VanDilla et al．（1986）Biotechnology 4:537-552;Bartholdi et al．（1988）In”Molecular Genetics of Mammalian Cells”(M.Goettsman,ed.)，Methods in Enzymology 151:252-267．Academic Press，Orlando］。染色体安定化緩衝液は、ポリアミンであるスペルミンおよびスペルミジンを用いて、染色体構造を安定化させ［Blumenthal et al.（1979）J.Cell Biol.81:255-259;Lalande et al．（1985）Cancer Genet Cytogenet．23:151-157］、重金属キレート化剤を用いてヌクレアーゼ活性を低下させるものである。
しかしながらポリアミン緩衝液プロトコールは、他のプロトコールの場合同様に広い適用範囲を持ち、遮断時間、細胞濃度、低張膨張緩衝液の種類、膨張時間、低張緩衝液の容量、および渦攪拌時間という変量を各細胞種について至適化しなければならない。このプロトコールを用いて製造される染色体は非常に凝縮しているのが普通である。
細胞を膨張させるのに使用できるいくつかの低張緩衝液があり、その例としては、７５ｍＭ ＫＣｌ；７５ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペルミジン；１６．２ｍＭ亜硝酸ナトリウム、６．５ｍＭ酢酸ナトリウム、３２．４ｍＭ ＫＣｌのオーヌキ（Ohnuki）の緩衝液［Ohnuki（1965）Nature 208:916-917およびOhnuki（1968）Chromosoma 25:402-428］ならびにさらに０．２ｍＭスペルミンおよび０．５ｍＭスペルミジンを含むオーヌキの緩衝液の変種などがある。加える緩衝液の量および低張性は、細胞の種類および細胞濃度によって変動する。量は細胞１０7個当たり２．５〜５．５ｍＬの範囲またはそれ以上とすることができる。膨張時間は１０〜９０分で変動させることができ、細胞の種類およびどの膨張緩衝液を使用するかで決まる。
ポリアミン単離緩衝液の組成も変動し得る。例えば、ある修正緩衝液では、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、７０ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１４ｍＭβ−メルカプトエタノール、０.２５％トリトン−Ｘ、０．２ｍＭスペルミンおよび０．５ｍＭスペルミジンを含む。
染色体分散は、各種物理的手段によって行うこともできる。例えば、細胞懸濁液を慎重に抜き取り、２２ゲージ針を取り付けた３ｍＬ注射器に排出することができ［Cram et al．（1990）Methods in Cell Biology 33:377-382］；細胞懸濁液は卓上渦攪拌機で攪拌することができ［Cram et al．（1990）Methods in Cell Biology 33:377-382］；細胞懸濁液は、ホモジナイザーによって破壊することができ［Sillar and Young（1981）J.Histochem.Cytochem．29:74-78;Carrano et al．（1979）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．76:1382-1384］；細胞懸濁液は卓上超音波浴で破壊することができる［Stoehr et al．（1982）Histochemistry 74:57-61］。
２．ヘキシレングリコール緩衝液系
１Ｂ３またＧＨＢ４２細胞から人工染色体を単離するのに用いたヘキシレングリコール緩衝液法では、約８×１０6個の有糸分裂細胞を、グリシン−ヘキシレングリコール緩衝液［１００ｍＭグリシン、１％ヘキシレングリコール、飽和水酸化カリウム溶液でｐＨ８．４〜８．６に調節］１０ｍＬに再懸濁させ、３７℃で１０分間インキュベーションし、次に１０分間遠心することで、核をペレット化した。上清を再度、２００×ｇで２０分間遠心して、染色体をペレットとした。染色体を単離緩衝液中に再懸濁させた（染色体１〜３×１０8個／ｍＬ）。
ヘキシレングリコール緩衝液組成も変更可能である。例えば、ある修正緩衝液では、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、７５０ｍＭヘキシレングリコール、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有させる［Carrano et al．（1979）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A. 76:1382-1384］。
３．硫酸マグネシウム緩衝液系
この緩衝液系は、ポリアミンおよびヘキシレングリコール緩衝液系との関連で上述したような細胞膨張法および染色体分散法のいずれにおいても使用することができる。この方法では、有糸分裂細胞を、４．８ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、９．８ｍＭ ＭｇＳＯ4、４８ｍＭ ＫＣｌ、２．９ｍＭジチオトレイトールからなる緩衝液に再懸濁させる［Van den Engh et al．（1985）Cytometry 6:92およびVan den Engh et al．（1984）Cytometry 5: 108］。
４．酢酸固定緩衝液系
この緩衝液系は、ポリアミンおよびヘキシレングリコール緩衝液系との関連で上述したような細胞膨張法および染色体分散法のいずれにおいても使用することができる。この方法では、有糸分裂細胞を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）、７５０ｍＭ（１，６）−ヘキサンジオール、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2、１．０％酢酸からなる緩衝液に再懸濁させる［Stoehr et al．（1982）Histochemistr 74:57-61］。
５．ＫＣｌ−ヨウ化プロピジウム緩衝液系
この緩衝液系は、ポリアミンおよびヘキシレングリコール緩衝液系との関連で上述したような細胞膨張法および染色体分散法のいずれにおいても使用することができる。この方法では、有糸分裂細胞を、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム、０.３３％トリトンＸ−１００、３３３μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅからなる緩衝液に再懸濁させる［Cram et al．（1990）Methods in Cell Biology 33:376］。
蛍光染料ヨウ化プロピジウムを用いるが、これは染色体安定化剤としても役立つ。顕微鏡のスライドグラス上に懸濁液の小滴を乗せ、位相差顕微鏡／蛍光顕微鏡によって細胞を観察することで、低張媒体（これもヨウ化プロピジウムを含むことができる）中での細胞の膨張をモニタリングすることができる。細胞は膨張しながらヨウ化プロピジウムを排除するはずであるが、一部は早期に溶解して、染色体蛍光を示す。細胞を遠心し、ＫＣｌ−ヨウ化プロピジウム緩衝液系に再懸濁させた後、その細胞は、緩衝液中に洗剤が存在するために溶解する。次に、染色体を分散させてから、３７℃にて３０分以下でインキュベーションして、ＲＮａｓｅを活性化させることができる。次に、染色体取得物をフローサイトメーターによって分析する。ヨウ化プロピジウムの蛍光を、アルゴンレーザの４８８ｎｍ波長で励起させ、１個の光電子増倍管によってＯＧ５７０光ファイバーを介して検出することができる。一変量ヒストグラムで、単一パルスを、統合・獲得することができる。小さい（直径１．５μｍ）ミクロスフェアを用いて、流動細胞計測法を２％以下のＣＶに配置することができる。染色体取得物を６０μｍナイロンメッシュで濾過して、分析に供する。
Ｃ．ＤＮＡ特異的染料による染色体の染色
単離後、染色体取得物を６μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８および２００μｇ／ｍＫＬのクロモマイシンＡ３で染色した。分析の１５分前に、２５ｍＭの亜硫酸ナトリウムおよび１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを染色体懸濁液に加えた。
Ｄ．染色体の流動選別
１Ｂ３およびＧＨＢ４２細胞から得られ維持された染色体を、ポリアミンに基づくシース（sheath）緩衝液（０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、２．０ｍＭ ＥＤＴＡ、８０ｍＭ ＫＣ、７０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７． ２）、０．２ｍＭスペルミンおよび０．５ｍＭスペルミジン）に懸濁させた［Sillar and Young（1981）J.Histochem.Cytochem．29:74-78］。次に染色体を、２個のレーザが染色体を別個に励起して、大きさと塩基対組成によって染色体の二変量解析ができるようになっている二重レーザセルソーター［FACStar PlusまたはFAXStar Vantage Becton Dickinson Immunocytometry System;Coulter Electronics製造のもの（Elite ESP）およびCytomation製造のもの（MoFlo）などの他の二重レーザ選別機も使用可能である］に通した。ＳＡＴＡＣと他の染色体の塩基組成の差と結果的に生じる染料との相互作用における差、ならびに大きさの差があることから、ＳＡＴＡＣは他の染色体と分離された。
Ｅ．選別した人工染色体の保存
選別した染色体を遠心によってペレットとし、各種緩衝液中に懸濁させ、４℃で保存した。例えば、単離した人工染色体をＧＨ緩衝液（１００ｍＭグリシン、１％ヘキシレングリコール（飽和水酸化カルシウム溶液でｐＨ８．４〜８．６に調節したもの）[例えば、Hadlaczky et al.（1982）Chromosoma 86:643-659参照］中で１日間保存して、遠心によってアガロースに包埋することができる。選別された染色体を遠心してアガロース床に入れ、固形物を５００ｍＭ ＥＤＴＡ中４℃で保存する。別の保存緩衝液には、ＣＭＢ−Ｉ／ポリアミン緩衝液（１７．５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５ｍＭベンズアミドＨＣｌ、０．４０ｍＭスペルミン、１．０ｍＭスペルミジン、０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ、４０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ ＮａＣｌ）ならびにＣＭＢ−ＩＩ／ポリアミン緩衝液（１００ｍＭグリシン（ｐＨ７．５）、７８ｍＭヘキシレングリコール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５ｍＭベンズアミド−ＨＣｌ、０．４０ｍＭスペルミン、１．０ｍＭスペルミジン、０．２５ｍＭ ＥＧＴＡ、４０ｍＭ ＫＣｌ、３５ｍＭ ＮａＣｌ）などがある。
微量注入が所期の用途である場合、選別した染色体を３０％グリセリンで−２０℃にて保存する。選別した染色体は、短い期間であれば（３〜６日間）、グリセリンを用いずに保存緩衝液中４℃で保存することもできる。微量注入用の緩衝液の例としては、ＣＢＭ−Ｉ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５ｍＭベンズアミドＨＣｌ、０．３０ｍＭスペルミン、０．７５ｍＭスペルミジン）、ＣＢＭ−ＩＩ（１００ｍＭグリシン（ｐＨ７．５）、７８ｍＭヘキシレングリコール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５ｍＭベンズアミド−ＨＣｌ、０．３０ｍＭスペルミン、０．７５ｍＭスペルミジン）などがある。
分離染色体の長期保存には、上記の緩衝液に５０％グリセロールを加え、−２０℃で保存するのが好ましい。
Ｆ．品質管理
１．純度分析
選別された染色体の純度を、ビオチン標識マウス付随ＤＮＡプローブによる蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって調べた［Hadlaczky et al．（1991）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A. 88:8106-8110参照］。単離染色体の純度は約９７〜９９％であった。
２．選別染色体の特性
パルスフィールドゲル電気泳動およびサザンハイブリダイゼーションを行って、選別された人工染色体のＤＮＡ含有量の大きさ分布を求めた。
Ｇ．純粋人工染色体の機能性
これら染色体の活性が保存されているか否かを調べるため、純粋な人工染色体を、初代培養細胞、体細胞および幹細胞に微量注入し（実施例１３に記載のような方法によって）、次にそれについて、選択培地での増殖に関する分析およびβ−ガラクトシダーゼ活性のアッセイなどの人工染色体が有する異種遺伝子の発現を分析する。
ＩＩ．哺乳動物人工染色体を含む微小核体の分離
Ａ．小核化
細胞を、４Ｔ１５０フラスコ中で、８０〜９０％集密度となるまで増殖させた。コルセミドを、最終濃度０．０６μｇ／ｍＬとなるまで加え、次に３７℃で細胞と２４時間インキュベーションした。
Ｂ．核摘出
１０μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢを加え、得られた微小核体を２８〜３３℃で１５０００ｒｐｍにて７０分間遠心した。
Ｃ．濾過による微小核体の精製
スイネックス（Swinnex）フィルターユニットおよびヌクレオポア（Nucleopore）フィルター［５μｍおよび３μｍ］を用いて、微小核体を精製した。
Ｄ．微小核体の染色および選別
上述のように、細胞をヘキストおよびクロモマイシンＡ３染料を用いて染色した。微小核体は、セルソーターによって選別し、哺乳動物人工染色体を含む微小核体を単離した。
Ｅ．融合
人工染色体を含む微小核体を、例えば実施例１．Ａ．５に記載の方法に従って、所定の初代培養細胞、体細胞、胚幹細胞に融合させて、遺伝子導入（人間以外）動物を形成して遺伝子療法に用いたり、他の細胞に融合させてその染色体を細胞に導入する。
哺乳動物人工染色体の昆虫細胞への導入
昆虫細胞は、ＭＡＣ用、特に遺伝子産生物の生産で使用するのに有用な宿主であるが、それには以下のような多くの理由がある。
１．哺乳動物人工染色体は、対象の蛋白をコードする遺伝子導入のためのゲノム外特異的組み込み部位を提供する［生産系での突然変異の確率低下］。
２．人工染色体が大きいと、メガ塩基の大きさのＤＮＡ組み込みが可能となり、蛋白またはアルカロイド［ジギタリス、モルヒネ、タキソール］などの治療的価値のある非蛋白を生じる経路全体をコードする遺伝子を人工染色体に持たせることができる。
３．有用な蛋白をコードする遺伝子の増幅を、人工哺乳動物染色体で行って、昆虫細胞での蛋白収量を上昇させることができる。
４．昆虫細胞は、蛋白の生理機能に必須の必要な翻訳後修飾（糖付加、リン酸化）を支持する。
５．昆虫細胞は、哺乳動物ウィルスを支持せず、ヒト感染因子による生成物の交差汚染が起こらない。
６．染色体を導入する能力は、昆虫細胞系における栄養用、工業用または医療用蛋白の生産に向けた従来の組換えバキュロウィルス系より優れている。
７．昆虫細胞成長に最適な低い温度（２８℃）により、生産のエネルギーコストを下げることができる。
８．昆虫細胞用の血清を含まない成長培地により、生産コストが低くなる。 ９．人工染色体を含む細胞は、低温で無期限に保存することができる。
１０．昆虫の幼虫は、受精昆虫卵の微量注入によって、栄養用蛋白、医療用蛋白または工業用蛋白の生産のための生物工場として役立つ。
Ａ．昆虫細胞による哺乳動物プロモーターの認識
検出可能なマーカー遺伝子［Renillaルシフェラーゼ遺伝子（RenillaルシフェラーゼをコードするＤＮＡならびにそのようなベクターの構築のための原料を提供し得るプラスミドｐＴＺｒＬｕｃ−１の説明については、例えば米国特許５２９２６５８号参照。さらに、配列番号１０も参照）］に連結されたＣＭＶプロモーターや、さらにはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に機能的に連結されたサルウィルス４０（ＳＶ４０）プロモーターなどの哺乳動物プロモータを有する遺伝子構築物を、２種類の動物Trichoplusia ni［イラクサキンウワバ］およびBombyx mori［カイコ］の細胞に導入した。
エレクトロボレーションまたは微量注入によって昆虫細胞を構築物に転移させた後、２４時間のインキュベーション後に、マーカー遺伝子の発現をルシフェラーゼアッセイ（例えば、実施例１２．Ｃ．３）およびβ−ガラクトシダーゼアッセイ（ｌａｃＺ染色アッセイなど）によって検出した。これら遺伝子を含まないサンプルに対し、遺伝子を有するサンプルでのみ、陽性の結果が得られた。さらに、B.moriβ−アクチンプロモータ−Renillaルシフェラーゼ遺伝子融合体を、T.niおよびB.mori細胞に導入したところ、トランスフェクション後にこれらは発光した。すなわち、ある種の哺乳動物プロモーターは、昆虫細胞でのこれらマーカー遺伝子を直接発現させるように機能する。従って、ＭＡＣは昆虫細胞における異種遺伝子の発現の候補である。
Ｂ．昆虫細胞で使用するためのベクターの構築および哺乳動物細胞との融合
１．発現ベクターを有するＬＭＴＫ-細胞を下記のもので形質転換する。
ａ．B.moriβ−アクチンプロモーター昆虫細胞におけるＨｙｇr選択可能マーカー遺伝子
ｂ．哺乳動物細胞におけるプロマイシンr選択可能マーカー遺伝子を制御するＳＶ４０またはＣＭＶプロモーター。
２．ＬＭＴＫ細胞（プロマイシン rＬＭＴＫ細胞）で哺乳動物プロモータの発現を検出する。
３．Bombyx細胞およびTrichoplusia細胞との融合実験でプロマイシンr細胞を用い、Ｈｙｇr細胞を選別する。
Ｃ．昆虫細胞へのＭＡＣの挿入
これらの実験は、昆虫細胞に導入されたＭＡＣにある検出可能マーカー遺伝子［ｐＳＶ４０などの哺乳動物プロモータの制御下に発現されるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子など］を検出するためのものである。データは、β−ｇａｌが発現されたことを示している。
例えばミニ染色体［ＥＣ３／７Ｃ５］もしくはミニおよびメガ染色体［Ｇ３Ｄ５から再クローニングされる細胞系であるＧＨＢ４２など］の哺乳動物人工染色体を有する哺乳動物細胞あるいはメガ染色体［Ｈ１Ｄ３またはそれの再クローニング体など］のみを有する細胞系と、昆虫細胞を融合させる。融合は次のように行う。
１．対数増殖期にある哺乳動物と昆虫細胞を混合する（５０％／５０％）、
２．カルシウム／ＰＥＧ細胞融合：（１０分間〜０．５時間）、
３．ヘテロカリオン（＋７２時間）を選別する。
ＭＡＣを含む昆虫細胞について選別を行う以下の選別条件を用いることができる［＋＝陽性選別」、−＝陰性選別］。
１．２８℃での成長（＋昆虫細胞、−哺乳動物細胞）；
２．グレーシズ（Graces）昆虫細胞培地［SIGMA］（−哺乳動物細胞］
３．外因性ＣＯ2がないこと（−哺乳動物細胞）および／または
４．抗生物質選択（ＨｙｇまたはＧ４１８）（＋形質転換昆虫細胞）
融合プロトコールの直後に、哺乳動物と各昆虫細胞の間に多くのヘテロカリオン［融合事象］が認められる［９０％以下のヘテロカリオン］。形質転換哺乳動物細胞の選別に使用される選別レベルでＧ４１８および／またはハイグロマイシンを含む昆虫培地での増殖［２週間以上］後、個々のコロニーについて、融合平板での増殖を検出する。ＭＡＣによって与えられる抗生物質耐性の選択および昆虫細胞の選択によって、これらのコロニーはＭＡＣを有するはずである。
B.moriβ−アクチン遺伝子プロモータは、B.mori細胞および哺乳動物細胞（例：ＥＣ３／７Ｃ５細胞）中でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を指向することが明らかになっている。そこで、プロモータに連結されたマーカー遺伝子の存在を哺乳動物細胞系および得られる昆虫細胞系で測定できることから、B.moriβ−アクチン遺伝子プロモータは、後に昆虫細胞に転移される哺乳動物細胞で形成されるＭＡＣに入れるのに特に有用である。
染色体断片化用ベクター及びＭＡＣにＤＮＡをターゲット化組込みするために用いられるその他のベクターの調製
メガ染色体の断片化によって最終的には、ベクターとして使用するために操作し易いサイズである約１５Ｍｂ〜５０Ｍｂに短縮された安定な染色体が得られる。このような断片化用ベクターはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生される人工染色体の調製に必要な要素を容易に決定及び同定するために使用できる。
異なる多くの方法によってメガ染色体のサイズを短縮し得る。このような短縮方法としては例えば、貧栄養化または低温処理もしくは熱処理などのストレス処理、ＢｒｄＵ、クマリン、ＥＭＳなどのゲノムを不安定化するもしくはＤＮＡに切れ目を入れる物質による処理、イオン化放射線による処理（例えば、Ｂｒｏｗｎ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：４７９−４８６参照〕、テロメア特異的ｉｎ ｖｉｖｏ染色体断片化〔例えば、Ｆａｒｒら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ． １４：５４４４−５４５４参照〕などがある。
Ａ．人工染色体断片化のため及び選択された遺伝子産物のターゲット化組込みのために用いるベクターの調製
１．ｐＴＥＭＰＵＤの構築
プラスミドｐＴＥＭＰＵＤ（図５参照）は、ｉｎ ｖｉｖｏ染色体断片化を行うため及び部位特異的組込みによって大規模増幅を誘発するために用いられるマウス相同組換え“キラー”ベクターである。図５を参照すると、〜３，６２５ｂｐのＳａ１１−ＰｓｔＩフラグメントはｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏレトロウィルスベクターから得られた（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５８７−３５９６参照）。このフラグメントは、アンピシリン耐性をコードするＤＮＡと、ｐＵＣ複製起点と、ＳＶ４０初期プロモーターのコントロール下のピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とを含む。ＵＲＡ３遺伝子部分はｐＹＡＣ５クローニングベクター（ＳＩＧＭＡ）に由来する。ＵＲＡ３をＳａｌＩ−ＸｈｏＩ消化によってｐＹＡＣ５から切出し、ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローニングし、次いでＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩで切断し、ｐＢａｂｅｐｕｒｏのＳａｌＩ部位に結合させてｐＰＵを作製した。
マウスの主要サテライトをコードする１２９３ｂｐのフラグメント（配列１参照）を、マウスＬＭＴＫ−線維芽細胞から調製したＤＮＡライブラリーからＥｃｏＲＩフラグメントとして単離し、ｐＰＵのＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＭＰＵを作製した。
ＴＫプロモーターに駆動されるジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ−Ａ）を、ｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（Ｍａｘｗｅｌｌら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：４６６０−４６６６参照）のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消化によって誘導し、ネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列を置換することによってｐＭＣ１ｎｅｏポリＡ発現ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にクローニングした。ＴＫプロモーター、ＤＴ−Ａ遺伝子及びポリＡ配列をこのベクターから除去し、付着末端をクレノウで埋め戻し、得られたフラグメントの平滑末端を結合させ、ｐＭＰＵのＳｎａＢＩ（ＴＡＣＧＴＡ）に結合させてｐＭＰＵＤを作製した。
Ｈｕｔｅ１の２．５ｋｂのフラグメント（配列３参照）をｐＭＰＵＤのＰＳｔ１部位に挿入し（ｐＴＥＭＰＵＤの６１００Ｐｓｔ１−３６２５ｐｓｔＩフラグメント参照）、ｐＴＥＭＰＵＤを作製した。このフラグメントは、ヒトのテロメアを含んでいる。このフラグメントは、非反復ＢｇｌＩＩ部位（配列３のヌクレオチド１０４２−１０４７参照）を含み、ＢａｍＨＩオーバーハングはＢｇｌＩＩ部位と適合性なので、この非反復ＢｇｌＩＩ部位は合成テロメアの導入部位として使用される。合成テロメアは、非反復に維持されているＢｇｌＩＩ部位に挿入するためのＢａｍＨＩ末端及びＢｇｌＩＩ末端を備えた配列ＴＴＡＧＧＧの多数（８０）の反復を含む。ＢａｍＨＩフラグメントがＢｇｌＩＩ結合すると、ＢｇｌＩＩ部位が破壊され、単一のＢｇｌＩＩ部位が残存する。非反復ＢｇｌＩＩ部位を選択することによって合成テロメアの正しい方向の挿入が確保される。非反復ＢｇｌＩＩ部位でベクターは直鎖化されている。
配列ＴＴＡＧＧＧの多数の反復から成る合成テロメアを作製するために、この配列の反復を含む３０量体のオリゴヌクレオチドの結合産物のクローニングまたは増幅を試みた。一方が配列ＴＴＡＧＧＧの４つの反復と反復全鎖の各末端の１／２の配列とを含み、他方が相補配列ＡＡＴＣＣＣの５つの反復を含む２つの３０量体オリゴヌクレオチドをアニーリングした。得られた二重鎖分子は１／２の配列を各々が表す３ｂｐの突出末端を有しており、それ自体で結合してｎ×３０ｂｐのコンカテマーを生じると予測された。しかしながら恐らくは、Ｇに富む鎖から４本鎖ＤＮＡが形成されるという理由で、この方法は成功しなかった。５量体の形態のヒトサテライトＩＩ及びＩＩＩのユニットの長い反復配列を作製する試みでも同様の困難に直面した。従って一般的に、定期的な間隔で出現する一連のグアニンヌクレオチドを含むオリゴマー配列は、この配列を含む長い二重鎖ＤＮＡの構築を妨害するような望ましくない４本鎖を形成し易いと考えられる。
従って、ｐＴＥＭＰＵＤのＢｇｌＩＩ部位に挿入すべき合成テロメアを構築するための別の試みでは、４本鎖構造の形成に感受性でない相補的Ｃに富む反復配列（即ちＡＡＴＣＣＣ）に基づく出発材料を使用した。ｐＴＥＬ２８０１１０及びｐＴｅ１２８０１１１と命名した２つのプラスミドを以下の手順で構築し、出発材料として使用した。
最初に、逆方向配列ＡＡＴＣＣＣ（即ち、テロメア配列ＴＴＡＧＧＧの相補配列）の９個の反復を含み反復全鎖の各末端に１／２配列が結合されており（従って、実質的に１０個の反復を含む）かつ制限酵素ｐｓｔＩ及びＰａｃＩの認識部位を含む長いオリゴヌクレオチドを標準方法によって合成した。オリゴヌクレオチドは、配列：５’−ＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴ−３’（配列２９）を有している。
また、配列：３’−ＴＴＧＧＧＣＣＣＴＡＧＧＣＴＴＡＡＧＧ−５’（配列３０）の部分的に相補的な短いオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドをゲル精製し、アニーリングし、クレノウポリメラーゼで修復し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化した。得られたＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＵＣ１９に結合させた。得られたプラスミドを使用して大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換させ、ＬＢ／アンピシリン選択に生き残った形質転換体の１つに由来のプラスミドＤＮＡ（ｐＴｅ１１０２）をＰａｃＩで消化し、クレノウ及びｄＮＴＰで平滑末端を形成し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた２．７ｋｂのフラグメントをゲル精製した。
同時に、伸長したより遠位の２６量体のＭ１３配列決定プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって同じプラスミドを増幅させた。増幅産物をＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、６０ｂｐのテロメア反復配列（と２４ｂｐのリンカー配列と）を含む８４ｂｐの二重鎖フラグメントを６％の生ポリアタリルアミドゲルで単離し、二重消化したｐＴｅｌ１０２に結合させて１２０ｂｐのテロメア配列を作製した。このプラスミドを用いてＤＨ５α細胞を形質転換させた。得られた組換え体のうち、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）選択に生き残った２つの組換え体に由来のプラスミドＤＮＡをＡＢＩ ＤＮＡシークエンサーで色素ターミネーション法によって配列決定した。ｐＴｅｌ２９と命名された一方のプラスミドは、配列ＴＴＡＧＧＧの２０個の反復を含む（即ち、配列ＴＴＡＧＧＧの連続する１９個の反復と反復全鎖の各末端に結合した１／２配列とから成る）。ｐＴｅｌ２８と命名された他方のプラスミドは、本質的には配列ＴＴＡＧＧＧの１０個の反復を各々が含む２つの配列が結合し、この結合部で２ｂｐ（ＴＡ）が欠失したプラスミドである。この結果として、ｐＴｅｌ２８は接合部にモチーフＧＧＧＴＧＧＧを有している。この突然変異はテロメア特異的染色体断片化の実験のタグとして役立つ。従って、普通よりも幾分長くポリリンカーから遠い配列、例えば配列：５’−ＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列３１）の使用、または、いくつかの実験では、
ｍ１３順方向プライマーとして配列：
５’−ＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣ−３’（配列３２）、逆方向プライマーとして配列：
５’−ＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ−３’（配列３３）の使用に基づくｐＵＣ／Ｍ１３配列決定プライマーを用いたＰＣＲによってｐＴｅｌ２９インサートを増幅させた。
増幅産物をＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた１４４ｂｐのフラグメントを６％の生ポリアクリルアミドゲルでゲル精製し、ＰａｃＩで消化し、クレノウ及びｄＮＴＰで平滑末端を形成し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によってリンカーを除去しておいたｐＴｅｌ２８に結合させた。この結合によって得られたプラスミドをｐＴｅｌ２８０１と命名した。プラスミドｐＴｅｌ２８０１は、配列ＴＴＡＧＧＧの４０個の反復から成り、１つの配列（即ち３０番目の配列）の２個のヌクレオチド（ＴＡ）が欠失して配列ＴＧＧＧとなっているテロメア配列を含む。
次の伸長段階では、ｐＴｅｌ２８０１をＳｍａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２６４ｂｐのインサートフラグメントをゲル精製し、Ｐａｃ１で消化し、平滑末端を形成し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたｐＴｅｌ２８０１に結合させた。得られたプラスミドでＤＨ５α細胞を形質転換させ、得られた形質転換体のうちアンピシリン選択に生き残った１２の形質転換体に由来のプラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって試験して、０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ｐｓｔＩインサートフラグメントの有無を判定した。１１個の組換え体が、予想された０．５ｋｂのインサートを含んでいた。２つの組換え体のインサートを配列決定すると予想通りであることが判明した。これらのプラスミドをｐＴｅｌ２８０１１０及びｐＴｅｌ２８０１１１と命名した。これらのプラスミドは同一であり、双方ともが配列ＴＴＡＧＧＧの８０個の反復を含み、ｐＴｅｌ２８で生じていた欠失を原因として２つの配列（即ち、３０番及び７０番目の配列）の２個のヌクレオチド（ＴＡ）が欠失して配列ＴＧＧＧが生じていた。従って、（最初の段階を除く）各クローニング段階で合成テロメアの長さは倍加した。即ち、テロメアのサイズは指数関数的に増大した。テロメアは６０×２nｂｐの長さを有しており、ｎは実施した伸長クローニング段階の数を表す。従って、原則的には(大腸菌、または、例えば酵母のような任意の他の微生物宿主が長いタンデム型反復ＤＮＡを許容すると想定すると)、所望の任意のサイズの安全なテロメアを形成するために配列を反復させることが可能である。
更に別の伸長段階では、ｐＴｅｌ２８０１１０をＰａｃＩで消化し、ｄＮＴＰの存在下のクレノウポリメラーゼで平滑末端を形成し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた０．５ｋｂのフラグメントをゲル精製した。プラスミドｐＴｅｌ２８０１１１をＳｍａイ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、３．２ｋｂのフラグメントをゲル精製し、ｐＴｅｌ２８０１１０に由来の０．５ｋｂのフラグメントに結合させた。得られたプラスミドを用いてＤＨ５α細胞を形質転換させた。アンピシリン選択に生き残った形質転換体からプラスミドＤＮＡを精製した。選択した組換え体の９個を制限酵素分析によって試験して、１．０ｋｂのＥｃＯＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントの有無を判定した。この結果、４つの組換え体（ｐＴｌｋ２、ｐＴｌｋ６、ｐＴｌｋ７及びｐＴｌｋ８と命名）が配列ＴＴＡＧＧＧの１６０個の反復を含む所望の９６０ｂｐのテロメアＤＮＡインサート配列を含み、ｐＴｅｌ２８で生じた欠失を原因として２つのヌタレオチド（ＴＡ）が欠失した配列ＴＧＧＧを有している４つの反復が存在することが判明した。フラグメントの両端から約３００ｂｐが解明されたこれらのプラスミドのうちの２つのプラスミド（即ちｐＴｌｋ２及びｐＴｌｋ６）のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントの部分的ＤＮＡ配列解析によって、この配列が配列ＴＴＡＧＧＧの連続反復から構成されていることを確認した。
合成テロメア配列にＰｍｅＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位を付加するために、ｐＴｌｋ２をＰａｃＩ及びＰｓｔＩによって消化し、３．７ｋｂのフラグメント（即ち２．７ｋｂのｐＵＣ１９と１．０ｋｂの反復配列）をゲル精製し、配列：５’−ＧＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡ−３’（配列３４）のオリゴヌクレオチドによってＰｓｔＩ付着末端に結合させた。次いで、結合産物をクレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰによって修復し、それ自体で結合させ、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換させた。アンピシリン選択に生き残った合計１４個の組換え体が得られた。各組換え体に由来のプラスミドＤＮＡはＢｇｌＩＩで開裂可能であり、これは、この付加された非反復制限部位が各組換え体によって保存されていたことを示す。１４個の組換え体のうちの４個の組換え体が１ｋｂの完全合成テロメアインサートを含んでいたが、残りの１０個の組換え体は種々の長さの欠失を有していた。１ｋｂの合成テロメア配列が完全に(ｉｎｔａｃｔ)保存されていた４個のプラスミドをｐＴｌｋＶ２、ｐＴｌｋＶ５、ｐＴｌｋＶ８及びｐＴｌｋＶ１２と命名した。これらのプラスミドの各々はまたＰｍｅＩで消化することが可能であった。更に、ＢｇｌＩＩ部位とＰｍｅＩ部位との双方が存在することが配列解析によって確認された。これらの４個のプラスミドはいずれもＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩによって消化されて、１ｋｂの合成テロメア配列を含むフラグメントを遊離でき、このテロメア配列を次にＢｇｌＩＩ消化したｐＴＥＭＰＵＤに結合し得る。
２．in vivo染色体断片化のためのｐＴＥＭＰＵＤの使用
ＢｇｌＩＩによってｐＴＥＭＰＵＤを直鎖化すると、一端にヒトテロメアをもつ直鎖状分子が得られる。この直鎖状フラグメントを染色体、例えばハイブリッド細胞のメガ染色体またはマウス主要サテライト配列の反復を含む任意のマウス染色体に組込むと、選択可能マーカーであるピューロマイシン耐性遺伝子が組込まれ、テロメア末端によってプラスミドが開裂される。ＤＴ遺伝子は組込み及び発現のときに毒性であるため、完全直鎖状フラグメントがランダムイベントによって組込まれることを阻止する。従ってランダム組込みは毒性であり、このため、ターケットされたＤＮＡに対する部位特異的組込みが選択されるであろう。このような組込みが、断片化された染色体を産生させる。
新規なテロメアをもつ断片化された欠失染色体は生き残り、動原体をもたない他のフラグメントは消滅するであろう。ｉｎ ｖｉｖｏ断片化を繰返すことによって最終的には、可能な最小の機能性人工染色体が選択される。従ってこのベクターは、マウス染色体からミニクロモソームを作製するため、または、メガ染色体を断片化するために使用できる。原則として、このベクターは、断片化を行うために任意の染色体中の選択された任意のＤＮＡ配列をターゲットするために使用できる。
３．ｐＴＥＲＰＵＤの構築
染色体をｉｎ ｖｉｖｏ断片化するため、及び、部位特異的組込みによる大規模増幅を誘発するために好適であるがマウス主要サテライトＤＮＡでなくマウスｒＤＮＡ配列に基づく、ｐＴＥＭＰＵＤに類似の断片化／ターゲッティングベクターはｐＴＥＲＰＵＤと命名されている。このベクターにおいては、ｐＴＥＭＰＵＤのマウス主要サテライトＤＮＡ配列が、配列１６のヌクレオチド１０，２３２−１５，０００に対応する配列を含むメガ染色体クローン１６１の４７７０ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントによって置換されている。
４．ｐＨＡＳＰＵＤ及びｐＴＥＭＰｈｕ３
ヒト染色体を特異的にターゲットするベタターをｐＴＥＭＰＵＤから構築できる。これらのベクターは、選択されたサテライト配列に従って特異的ヒト染色体を断片化し、ヒトミニクロモソームを作製し、またヒト動原体を単離するために使用できる。
ａ．ｐＨＡＳＰＵＤ
ｐＴＥＭＰＵＤがヒト染色体の断片化に好適なプラスミドとなるように、マウス主要サテライト配列をヒトサテライト配列によって置換する。マウス染色体と違って、ヒト染色体の各々は、非反復サテライト配列を有している。例えば、マウス主要サテライトをヒト６量体αサテライト（またはアルホイド（ａｌｐｈｏｉｄ）サテライト）ＤＮＡ配列によって置換した。この配列はヒト結腸癌細胞系Ｃｏｌｏ３２０（受託番号ＡＴＣＣＣＣＬ ２２０．１で寄託）から単離されＥＭＢＬデータベースに受託番号Ｘ６０７１６で寄託されたタローンｐＳ１２に由来の８１３ｂｐのフラグメント（配列２のヌクレオチド２３２−１０４４）である。８１３ｂｐのアルホイドフラグメントは、各々がＥｃｏＲＩ部位を含む合成プライマーを用いた核酸増幅によってｐＳ１２クローンから得られる。合成プライマーは、配列：ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴ ＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴ ＣＡＧＴＴＧＡ（配列４）の順方向プライマーと、配列：ＣＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣ ＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴ ＣＴＴＡＡＧＧＡ（配列５）の逆方向プライマーとから成る。
増幅産物のＥｃｏＲＩ消化によってヒトαサテライト配列を含むＥｃｏＲＩ末端をもつフラグメントが得られる。この配列をマウス主要サテライトを含むＥｃｏＲＩフラグメントに置換してｐＴＥＭＰＵＤに挿入しｐＨＡＳＰＵＤを作製する。
ベクターｐＨＡＳＰＵＤをＢｇｌＩＩによって直鎖化し、画線添加（ｓｃｒａｐｅ Ｉｏａｄｉｎｇ）によってＥＪ３０（ヒト線維芽）細胞の形質転換に使用する。２７個のピューロマイシン耐性形質転換株が得られた。
ｂ．ｐＴＥＭＰｈｕ３
ｐＴＥＭＰｈｕ３中では、マウス主要サテライト配列がＤ３Ｚ１（ＡＴＣＣ受託番号８５４３４で寄託；Ｙｒｏｋｏｖ（１９８９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．５１：１１１４も参照）に由来の３ｋｂのヒト染色体３特異的αサテライトによって置換されている。
５．ヒト３番染色体における増幅を誘発するためのｐＴＥＭＰＨＵ３の使用
ヒト染色体の各々は非反復染色体特異的アルホイド配列を含む。従って、３番染色体特異的αサテライトにターゲットされたｐＴＥＭＨＵ３は、３番染色体の動原体領域の大規模増幅と新規な染色体の産生とが確保される選択条件下でヒト細胞に導入できる。このような誘発された大規模増幅は、新規な（ｄｅｎｏｖｏ）染色体形成を誘発する手段を提供し、また、規定されたヒト染色体フラグメントをメガ塩基のサイズまでｉｎ ｖｉｖｏクローニングする手段を提供する。
例えば、３番ヒト染色体の破断点は動原体の近傍の短いアーム上に存在する。
この領域は腎細胞癌の形成に関与する。ｐＴＥＭＰｈｕ３をこの領域にターゲッティングすることによってこの領域に大規模増幅が誘発され、ｐＴＥＭＰｈｕ３ベクター中の細菌マーカー及び酵母マーカーを用いてこの領域をクローニングできる。
ｐＴＥＭＰｈｕ３クローニングベクターは、相同組換え体の選択を可能にするだけでなく、ＹＡＣ中で取込み部位の直接クローニングを可能にする。このベクターはまた、マウス−ヒトモノ染色体マイタロセルハイブリッド系中で、好ましくは欠失した短いアームをもつヒト３番染色体をターゲットするために使用できる。相同組換え体を核酸増幅（ＰＣＲ）によってスクリーニングし、増幅をＤＮＡハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってスクリーニングし得る。増幅領域をＹＡＣにクローニングできる。このベクター及びこれらの方法はまた、クローニングされた染色体領域の機能性分析を行うために、クローニングされた増幅領域を哺乳類細胞に再導入することによって使用できる。
Ｂ．動原体のクローニング及び機能性染色体ユニットの同定に使用できるＹＡＣベクター中のライブラリーの調製
縮小されたサイズの機能性哺乳類人工染色体ユニットを作製し、このユニットを動原体ＤＮＡのクローニングに使用する別の方法では、ＹＡＣベクターに基づく哺乳類ＤＮＡのライブラリーをスクリーニングし、トランスジェニックマウスモデル系で潜在的陽性クローンの機能性を分析する。マウスのチロシナーゼ遺伝子を含む哺乳類ＤＮＡライブラリーを、ＹＲＴ２（Ｓｃｈｅｄｌら（１９９３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４７８３−４７８７参照）のようなＹＡＣベクター中で調製する。哺乳類のテロメア及び動原体の配列プローブに対するハイブリダイゼーションによってライブラリーをスクリーニングする。標準方法に従って陽性クローンを単離し、ＮＭＲＩ／Ｈａｎマウスの受精卵母細胞の前核に微量注入する。次に、胚をＮＭＲＩ／Ｈａｎの養母に移入する。トランスジェニック子孫中でのチロシナーゼ遺伝子の発現は同定可能な表現型（色素沈着）を与える。従って、チロシナーゼを発現するトランスジェニックマウスを生じるクローンは機能性哺乳類人工染色体ユニットを含むことが確認される。
あるいは、上記の標準方法に従って、ＳＡＴＡＣのフラグメントをＹＡＣベクターに導入し、次いでＮＭＲＩ／Ｈａｎマウスの受精卵母細胞の前核に導入してもよい。これによって、チロシナーゼを発現するトランスジェニックマウスを生じるクローンは、機能性哺乳類人工染色体ユニット、特に動原体を含むことが確認される。
Ｃ．相同ターゲッティングベクターを用いた哺乳類人工染色体によるヘテロロガス遺伝子の取込み
上述のように、ヘテロロガス遺伝子を発現させるために哺乳類人工染色体を使用すると、レシピエント細胞ゲノム内へのヘテロロガスプラスミドＤＮＡのランダム組込みに起因するいくつかの不利な効果が回避される。ランダム組込みに伴う不利な効果を回避するための有効なツールとなり得る哺乳類人工染色体の本質的な特徴は、この染色体がレシピエント細胞中にゲノム外遺伝子ソースとして存在することにある。従って、哺乳類人工染色体からヘテロロガス遺伝子を発現させるためには、レシピエント細胞ゲノム内への不要なランダム組込みを生じることなく、哺乳類人工染色体に限定されたヘテロロガス遺伝子の特異的なターゲット化取込みが望ましい。
ヘテロロガス遺伝子を人工染色体に部位特異的に組込む１つの手段では、相同ターゲッティングベクターを使用する。人工染色体に存在するヌタレオチドに相同な核酸配列を含むターゲッティングベクターに、有益なヘテロロガス遺伝子をサブクローニグする。次に、ベタターと染色体との相同部位の組換えイベントによって人工染色体で部位特異的組込みが生じるような方法でベクターを人工染色体含有細胞に導入する。相同ターゲッティングベクターはまた、人工染色体にベクターを取込んだ細胞を容易に同定するための選択可能マーカーと、レシピエント細胞ゲノム内への不要なベクター組込みが生じたときにのみ発現される致死選択遺伝子とを含み得る。代表的な２つの相同ターゲッティングベクター、λＣＦ−７及びｐλＣＦ−７−ＤＴＡを以下に記載する。
１．ベクターλＣＦ−７の構築
ベクターλＣＦ−７は、遺伝子治療に使用される哺乳類人工染色体に取込まれ得る治療用分子をコードする代表的な核酸として嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子を含む。選択可能マーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を含み、またパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｕｒａ３遺伝子（オロチジン−５−ホスフェートデカルボキシラーゼ）を更に含むこのベクターを以下の一連段階で構築した。
ａ．ｐＵＲＡの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｕｒａ３遺伝子を含む酵母人工染色体ベクターｐＹＡＣ５（Ｓｉｇｍａ；ＹＡＣベタターの記述に関してはＢｕｒｋｅら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８０６−８１２参照；ｐＹＡＣ５の完全配列に関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１０８６参照）に由来の２．６ｋｂのＳａｌＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＨｙｇの３．３ｋｂのＳａｌＩ／ＳｍａＩフラグメント（例えば、米国特許第４，９９７，７６４号、第４，６８６，１８６号及び第５，１６２，２１５号、並びに前記参照）に結合させることによってプラスミドｐＵＲＡを調製した。結合に先立って、ｐＨｙｇの３．３ｋｂフラグメントのＳｍａＩ末端に平滑末端結合できるようにＸｈｏＩ末端をクレノウポリメラーゼによって処理した。従って、ｐＵＲＡはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｕｒａ３遺伝子と大腸菌ＣｏｌＥ１の複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含む。組込まれた構築物をＹＡＣクローンとして哺乳類細胞から回収する手段を提供するためにｕｒａＥ遺伝子が含まれている。
ｂ．ｐＵＰ２の構築
プラスミドｐＵＲＡをＳａｌＩで消化し、ｐＣＥＰＵＲの１．５ｋｂのＳａｌＩフラグメントに結合させた。プラスミドｐＣＥＰＵＲは、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｈｅＩ−ＮｒｕＩフラグメントに、ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏの１．１ｋｂのＳｎａＢＩ−ＮｈａＩフラグメントを結合させることによって調製した（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５８７−３５９６；Ｄｒ．Ｌ．Ｓｚｅｋｅｌｙ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）によって提供された；また、Ｔｏｎｇｈｕａら（１９９５）Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｅｎｇｌ．Ｅｄ．）１０８：６５３−６５９；Ｃｏｕｔｏら（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２３７５−２３７８；Ｄｕｎｃｋｌｅｙら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２９６：１２８−３４；Ｆｒｅｎｃｈら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８：３５４−３５５；Ｌｉｕら（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８５：１０９５−１１０３；国際ＰＣＴ出願ＷＯ９５２００４４；ＷＯ９５００１７８及びＷＯ９４１９４５６参照）。
得られたプラスミドｐＵＰ２は、ｐＵＲＡの全部の要素に加えて、ｐＣＥＰＵＲに由来のＳＶ４０プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子を含む。
ｃ．ｐＵＰ−ＣＦＴＲの構築
１つのプラスミド中でｐＵＰ２の要素をＣＦＴＲ遺伝子と組合わせるために中間プラスミドｐＵＰ−ＣＦＴＲを作製した。先ず、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）に基づくベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｙａｔｅｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２−８１５参照；また、米国特許第５，４６８，６１５号参照）の多数クローニング部位のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとの間にＣＦＴＲ遺伝子を挿入するために、ＣＦＴＲをコードするＤＮＡ（Ｒｉｏｒｄａｎら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１０６６−１０７３参照；ＣＦＴＲ遺伝子の配列に関しては米国特許第５，２４０，８４６号及びＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２８６６８参照）を含むｐＣＭＶ−ＣＦＴＲのＣＦＴＲ遺伝子だけを含んでいる４．５ｋｂのＳａｌＩフラグメントを、ＸｈｏＩ消化したｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及び本文中にも記載）に結合させた。得られたプラスミドをｐＣＥＰ−ＣＦＴＲと命名した。プラスミドｐＣＥＰ−ＣＦＴＲを次にＳａｌＩで消化し、ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとが隣接したＣＦＴＲ遺伝子を含む５．８ｋｂのフラグメントを、ＳａｌＩ消化したｐＵＰ２に結合させてｐＵＰ−ＣＦＴＲを作製した。従って、ｐＵＰ−ＣＦＴＲは、ｐＵＰ２の全部の要素に加えて、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに連結されたＣＦＴＲ遺伝子を含む。
ｄ．λＣＦ−７の構築
次に、プラスミドｐＵＰ−ＣＦＴＲをＥｃｏＲＩで部分消化することによって直鎖化し、ＣＦＴＲ遺伝子を含む１３ｋｂのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ消化したＣｈａｒｏｎ ４Ａλに結合させた（Ｃｈａｒｏｎ ４Ａλの記述に関しては、Ｂｌａｔｔｎｅｒら（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１６１；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ（１９７９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５５５；及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｓｅｃｉｏｎ ２．１８参照）。得られたベクターλＣＦ８は、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａλバクテリオフアージの左アームと、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに連結されたＣＦＴＲ遺伝子と、ｕｒａ３遺伝子と、ＳＶ４０プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子と、チミジンキナーゼプロモーター（ＴＫ）と、ＣｏｌＥ１複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子と、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａλバクテリオファージの右アームとを含む。λＣＦ８構築物を次にＸｈｏＩで消化し、得られた２７．１ｋｂを、ＳＶ４０ポリＡシグナルとＥｃｏＲＩ消化したＣｈａｒｏｎ ４Ａλの右アームとを含むｐＪＢＰ８６（後述）の０．４ｋｂのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントに結合させた。得られたベクターλＣＦ−７は、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａλの左アームと、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリＡシグナルに連結されたＣＦＴＲのコーディングＤＮＡと、ｕｒａ３遺伝子と、ＳＶ４０プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子と、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａλの右アームとを含む。λＤＮＡフラグメントは、代表的な人工染色体に存在するヌクレオチドに相同なコード配列を提供する。
次に、本文中に例示した人工染色体を含む細胞にベタターを導入する。例えば、本文中に記載のようなメガ染色体を担持する融合細胞系に直鎖状λＣＦ−７ベクターを導入するとき、このベクターは、ベクターと人工染色体との相同バタテリオファージλ配列間の組換えによってメガ染色体に特異的に組込まれるであろう。
２．ベクターλＣＦ−７−ＤＴＡの構築
ベクターλＣＦ−７−ＤＴＡもまた、λＣＦ−７に含まれている全部の要素を含み、加えて、致死選択マーカーとジフテリア毒素Ａ（ＤＴ−Ａ）遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子と複製起点とを含む。このベクターを以下の一連段階で構築した。
ａ．ｐＪＢＰ８６の構築
上記λＣＦ−７の構築にプラスミドｐＪＢＰ８６を使用した。ＳＶ４０プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＥＰＵＲの１．５ｋｂのＳａｌＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＪＢ８に結合させた（例えばＩｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｔｚら（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：２９８９−２９９８参照；ＡＴＣＣ受託番号３７０７４から入手可能；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬの市販製品）。結合に先立って、ｐＣＥＰＵＲの１．５ｋｂフラグメントのＳａｌＩ末端とＨｉｎｄＩＩＩ直鎖化したｐＪＢ８末端とをクレノウポリメラーゼによって処理した。得られたベクターｐＪＢＰ８６は、ＳＶ４０プロモーター及びポリＡシグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子と、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａλの１．８ｋｂのＣＯＳ領域と、ＣｏｌＥ１複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子とを含む。
ｂ．ｐＭＥＰ−ＤＴＡの構築
ジフテリア毒素−Ａ遺伝子を含むｐＭＣ１−ＤＴ−Ａ（例えばＭａｘｗｅｌｌら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：４６６０−４６６６参照）の１．１ｋｂのＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ＸｈｏＩ消化したｐＭＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に結合させてｐＭＥＰ−ＤＴＡを作製した。ｐＭＣ１−ＤＴ−Ａを作製するためには、ＤＴＡ遺伝子のコーディング領域をｐ２２４９−１から８００ｂｐのＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離し、ｐＭＣ１ｎｅｏｐｏｌｙＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＭＣ１）のｎｅｏ遺伝子に置換してＴＫプロモーターのコントロール下に導入した。得られた構築物ｐＭＣ１ＤＴ−ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウで末端を埋め戻し、ＳａＩＩリンカーを結合させて、ＸｈｏＩ末端（５’）と、２７０ｂｐのＴＫプロモーターと、〜７９０ｂｐのＤＴ−Ａフラグメントとを含むＳａｌＩ末端とをもつ１０６１ｂｐのＴＫ−ＤＴＡ遺伝子カセットを作製した。このフラグメントをＸｈｏＩ消化したｐＭＥＰ４に結合させた。
従って、プラスミドｐＭＥＰ−ＤＴＡは、ＴＫプロモーター及びＳＶ４０に連結されたＤＴ−Ａ遺伝子と、ＣｏｌＥ１複製起点とアンピシリン耐性遺伝子とを含む。
ｃ．ｐＪＢ８３−ＤＴＡ９の構築
プラスミドｐＪＢ８をＨｉｎｄＩＩＩ及びＣｌａＩで消化し、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドのセンス鎖としては配列７参照、アンチセンス鎖としては配列８参照）に結合させてｐＪＢ８３を作製した。ＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＪＢ８に結合したオリゴヌタレオチドは、制限エンドヌタレアーゼＳｗａＩ、ＰａｃＩ及びＳｒｆＩの認識部位を含んでいた。これらの部位はｐλＣＦ−７−ＤＴＡ構築物の直鎖化を容易にする。
次に、ＤＴ−Ａ遺伝子を含むｐＭＥＰ−ＤＴＡの１．４ｋｂのＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ＳａｌＩ消化したｐＪＢ８３に結合させてｐＪＢ８３−ＤＴＡ９を作製した。
ｄ．λＣＦ−７−ＤＴＡの構築
λＣＦ−７の１２ｂｐのオーバーハングを、Ｍｕｎｇ ｂｅａｎヌタレアーゼ及びＴ４ポリメラーゼを順次用いた処理によって除去した。得られた４１．１ｋｂの直鎖状λＣＦ−７ベクターを、ＣｌａＩで消化しＴ４ポリメラーゼで処理しておいたｐＦＢ８３−ＤＴＡ９に結合させた。得られたベクターλＣＦ−７−ＤＴＡは、λＣＦ−７の全部の要素と、ＴＫプロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに連結されたＤＴ−Ａ遺伝子と、１．８ｋｂのＣｈａｒｏｎ ４Ａλ ＣＯＳ領域と、アンピシリン耐性遺伝子（ｐＪＢ８３−ＤＴＡ９に由来）と、ＣｏｌＥ１複製起点（ｐＪＢ８３−ＤＴ９Ａに由来）とを含む。
Ｄ．ルシフェラーゼマーカーを用いるターゲッティングベクター：プラスミドｐＭＣＴ−ＲＵＣ
哺乳類人工染色体にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を部位特異的にターゲットするプラスミドｐＭＣＴ−ＲＵＣ（１４ｋｂｐ）を構築した（ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡ及びこのようなベクターを構築するための出発物質を提供し得るプラスミドｐＴＺｒＬｕｃ−１の記述に関しては米国特許第５，２９２，６５８号及び第５，４１８，１５５号参照）。このプラスミドの有利な特徴は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーセ遺伝子がヒトサイトメガロウイルスの前初期遺伝子エンハンサー／プロモーターの転写調節下に維持されていること、及び、正の選択可能マーカーであるヒグロマイシン耐性遺伝子がチミジンキナーゼプロモーターの転写調節下に維持されていることである。特にこのプラスミドは、ミニクロモソームに相同のＤＮＡ（即ちネオマイシン耐性遺伝子）を含むプラスミドｐＡＧ６０（米国特許第５，１１８，６２０号、第５，０２１，３４４号、第５，０６３，１６２号及び第４，９４６，９５２号参照；また、Ｃｏｌｂｅｒｔ−Ｇａｐａｐｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４参照）と、Ｒｅｎｉｌｌａ遺伝子及びヒグロマイシン耐性遺伝子と、相同組換えの負の選択可能マーカーであるｔｋプロモーターのコントロール下のＨＳＧ−ｔｋ遺伝子と、プラスミドを直鎖化するための非反復ＨｐａＩ部位とを含む。
この構築物を、リン酸カルシウムトランスフェクションによってＥＣ３／７Ｃ５細胞に導入した（Ｌｏｒｅｎｚら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．１１：３１−３７参照）。ＥＣ３／７Ｃ５細胞を単層として維持した（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３；１７５−１８３参照）。プレートあたり１０μｇの直鎖化したｐＭＣＴ−ＲＵＣを用いるリン酸カルシウムトランスフェクション(Ｈａｒｐｅｒら(１９８１)Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ８３：４３１−４３９参照)を行うために、１００ｍｍのシャーレ中で５０％集密度の細胞を使用した。単一のトランスフェクト細胞に由来するコロニーを単離し、ヒグロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）と１０％ウシ胎仔血清とを含むＦ−１２培地に維持した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーセアッセイに先立って細胞を１００ｍｍのシャーレで増殖させた。
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイを実施した(例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：８５−９１参照)。ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの発光を測定するために、直鎖化したプラスミドｐＭＣＴ−ＲＵＣをＥＣ３／７Ｃ５細胞（“Ｂ”細胞系）にトランスフェクトした後に得られたヒグロマイシン耐性細胞系を、１００％集密度まで増殖させた。
約３０世代後のｉｎ ｖｉｖｏの発光を以下の手順で測定した。増殖培地を除去し、コエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）（最終濃度１ミリモル／リットル）を含む１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０で置換した。次に、シャーレを弱光の映像解析装置（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ａｒｇｕｓ−１００）に配置することによって細胞から放出された発光を可視化した。１００％感度の光子計数管を用いて５分間の光子蓄積後に画像を形成した。ｉｎ ｖｉｔｒｏの発光を測定するために、細胞をトリプシン処理し、１つのシャーレから採取し、ペレット化し、１ｍｌのアッセイバッファ（０．５モル／リットルのＮａＣｌ、１ミリモル／リットルのＥＤＴＡ、０．１モル／リットルのリン酸カルシウム，ｐＨ７．４）に再懸濁させ、氷上で１０秒間音波処理した。次に、１ミリモル／リットルの濃度のコエレンテラジン０．５ｍｌを速やかに注入後、溶解液をＴｕｒｎｅｒ ＴＤ−２０ｅルミノメーターで１０秒間検定し、発光の平均値をＬＵとして記録した（この器具で１ＬＵ＝１．６×１０６ｈｕ／秒）。
直鎖化したプラスミドｐＭＣＴ−ＲＵＣによってトランスフェクトされたＥＣ３／７Ｃ５細胞の独立細胞系は異なるレベルのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を示した。同じ細胞系の溶解液を用いて測定試験を行ったときにも発光は同様の違いを示した。発光のこの違いは、マウスゲノム内へのプラスミドｐＭＣＴ−ＲＵＣのランダム組込みによって生じた位置効果に起因すると考えられる。何故なら、この実験ではルシフェラーゼ遺伝子の部位ターゲッティングを目的とした濃縮を行わなかったからである。
ミニクロモソームに組込まれたルシフェラーゼ遺伝子を含む細胞が濃縮されたトランスフェクタント集団を得るために、トランスフェクト細胞をガンシクロビルの存在下で増殖させた。この負の選択培地は、添加されたｐＭＣＴ−ＲＵＣプラスミドがゲノムに組込まれた宿主細胞ＥＣ３／７Ｃ５の増殖を抑制する。従ってこの選択に生き残ったトランスフェクト集団中では、ｐＭＣＴ−ＲＵＣが組込まれたミニクロモソームを含む細胞が濃縮されている。この選択に生き残った細胞をルシフェラーゼアッセイによって試験すると、より均一なレベルのルシフェラーゼ発現を示した。更に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの結果は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子がこれらの細胞のミニクロモソームに含まれていることを示し、これは更に、ミニタロモソームに対するｐＭＣＴ−ＲＵＣのターケッティングが成功したことを示す。
また、ミニクロモソームに相同な伸長領域を与えるために更にλ ＤＮＡを含むｐＭＣＴ−ＲＵＣの変種（後述の“他のターゲッティングベクター”の項参照）をＥＣ３／７Ｃ５細胞にトランスフェクトした。レシピエントＥＣ３／７Ｃ５細胞中のミニクロモソームに対してｐＮＥＭ−１中のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子及びヒグロマイシン耐性遺伝子の部位特異的ターゲッティングを行った。これを、ＤＮＡ増幅分析及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって確認した。更に、トランスフェクタントのルシフェラーゼアッセイによってルシフェラーゼ遺伝子発現を確認した。
Ｅ．タンパク質分泌用ターゲッティングベクター
哺乳類細胞発現系において細胞内産生されたヘテロロガスタンパク質を単離するためには、苛酷にもなり得る条件下で細胞破壊を行うこと、及び、細胞夾雑物から組換えタンパク質を精製することが必要である。組換え産生されたタンパク質を、精製による除去を要する夾雑物の少ない細胞外媒質に分泌させることによって、タンパク質単離のプロセスを簡単にすることができる。従って、哺乳類の人工染色体系と共に使用するための分泌用ターゲッティングベタターを構築した。
哺乳類細胞中のヘテロロガスタンパク質の産生及び分泌を示す有用なモデルベクターは、タンパク質を細胞膜に輸送すること及び細胞からタンパク質を分泌することを指令する有効な分泌シグナルに融合した検出容易なリポータータンパタ質をコードするＤＮＡを含む。後述するベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣ及びｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣλはこのようなベクターの例である。これらのベクターは、インターロイキン−２（ＩＬ２）のシグナルペプチドとＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。ＩＬ−２のシグナルペプチド（配列９に示す配列によってコードされている）は、該ペプチドに連結されたルシフェラーゼタンパク質を哺乳類細胞から分泌するように指令する。宿主哺乳類細胞から分泌されると、ＩＬ−２のシグナルペプチドが融合タンパク質から切断され、活性ルシフェラーゼタンパク質が細胞外媒質に放出される。このヘテロロガスタンパク質の産生及び分泌の成否は、媒質にルシフェラーゼ酵素の生物発光ルシフェリン基質を接触させたときに生じる発光を測定するルシフェラーゼアッセイによって容易に検出できる。この特徴は、人工染色体を遺伝子治療に使用するときに有用であろう。治療用遺伝子に融合したＩＬ−ＲＵＣを担持する機能性人工染色体の存在を容易にモニターできる。体液または体組織のサンプルを採取し、ルシフェリンと適正な補因子とを添加し、生物発光を観察することによってルシフェラーゼ発現を試験し得る。
１．タンパク質分泌用ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣの構築
ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣは、哺乳類細胞中で遺伝子を構成的に発現させるためにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーターに連結されたヒトＩＬ−２シグナルペプチド−Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ融合遺伝子を含む。構築物を以下の手順で調製した。
ａ．ＴＬ−２シグナル配列をコードするＤＮＡの調製
適当なＩＬ−２プライマーを用いたＨＥＫ ２９３細胞系の核酸増幅によって、ヒトＩＬ−２シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む６９ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られた（例えば、ＩＬ−２をコードするＤＮＡに関しては米国特許第４，５１８，５８４号及び配列９参照；ＩＬ−２遺伝子及び対応するアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅで受託番号Ｋ０２０５６及びＪ００２６４として提供される）。シグナルペプチドは、双方のＧｅｎｂａｎｋに収録された翻訳産物及び配列９の最初の２０個のアミノ酸を含む。
最初の２０個のアミノ酸をコードする対応するヌクレオチド配列は、上記の収録された翻訳産物の配列（例えば、受託番号Ｋ０２０５６のヌタレオチド２９３−５２及び受託番号Ｊ００２６４のヌクレオチド４７８−５３７）中に示されており、また、配列９に示されている。増幅プライマーは、ｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に結合後のＤＮＡフラグメントをサブクローニングするためのＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を含んでいた。順方向プライマーを配列１１に示し、逆方向プライマーを配列１２に示す。
ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧ（順方向、配列１１）
ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣ（逆方向、配列１２）
ｂ．Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼをコードするＤＮＡの調製
Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ遺伝子の出発ソースはプラスミドｐＬＸＳＮ−ＲＵＣであった。ベタターｐＬＸＳＮ（例えば、米国特許第５，３２４，６５５号、第５，４７０，７３０号、第５，４６８，６３４号及び第５，３５８，８６６号並びにＭｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０参照）は、ヘテロロガスＤＮＡをレトロウイルスＬＴＲの転写調節下に発現させ得るレトロウイルスベクターである。このベクターは更に、ＳＶ４０初期領域プロモーターに発現動作可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含む。Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ遺伝子をプラスミドｐＴＺｒＬｕｃ−１（例えば、米国特許第５，２９２，６５８号参照；また、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ受託番号Ｍ６３５０１参照；また、Ｌｏｒｅｎｚら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：４４３８−４４４２参照）から入手し、配列１０に示す。ｐＴＺｒＬｕｃ−１の０．９７ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメントは、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡのコーディング領域を含む。ベクターｐＬＸＳＮを消化し、ｐＬＸＳＮ−ＲＵＣに含まれたルシフェラーゼ遺伝子に結合させた。ｐＬＸＳＮ−ＲＵＣは、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を指令するＳＶ４０プロモーターの上流でウイルスＬＴＲに作動可能に連結されたルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた。
ｃ．ｐＬＸＳＮ−ＩＬＲＵＣを作製するためのＩＬ−２シグナルペプチドをコードするＤＮＡとＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ遺伝子との融合
項１．ａで前述したＩＬ−２シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターｐＧＥＭＴをＥｃｏＲＩで消化し、得られたシグナルペプチドをコードするフラグメントを、ＥｃｏＲＩ消化したｐＬＸＳＮ−ＲＵＣに結合させた。得られたプラスミドをｐＬＸＳＮ−ＩＬＲＵＣと命名したが、このプラスミドは、ｐＬＸＳＮ−ＲＵＣ中のＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ遺伝子の直ぐ上流にＩＬ−２シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む。次に、融合遺伝子の３’端にＳｍａＩ部位を付加するために融合遺伝子の核酸増幅鋳型としてプラスミドｐＬＸＳＮ−ＩＬＲＵＣを使用した。直鎖化した（ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ消化した）ｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に増幅産物をサブクローニングしてＩＬＲＵＣ−ｐＧＥＭＴを作製した。
ｄ．哺乳類細胞中で発現させる調節要素を含むベクターへの融合遺伝子の導入
プラスミドＩＬＲＵＣ−ｐＧＥＭＴをＫｓｐＩ及びＳｍａＩで消化し、ＩＬ−２シグナルペプチド−ルシフェラーゼ融合遺伝子を含むフラグメントを遊離させ、これをＨｐａＩ消化したｐＬＮＣＸに結合させた。ベクターｐＬＮＣＸ（例えば、米国特許第５，３２４，６５５号及び第５，４５７，１８２号参照；また、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０参照）は、ヘテロロガスＤＮＡをＣＭＶプロモーターのコントロール下に発現させるレトロウイルスベクターである。このベクターはまた、ウイルスプロモーターの転写調節下のネオマイシン耐性遺伝子を含む。結合反応によって得られたベクターをｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣと命名した。ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣは、ｐＬＮＣＸ中のＣＭＶプロモーターの直ぐ下流でウイルス３’ＬＴＲ及びポリアデニル化シグナルの上流にＩＬ−２シグナルペプチド−ルシフェラーゼ融合遺伝子を含む。この配置によって融合遺伝子がＣＭＶプロモーターのコントロール下で発現し得る。ヘテロロガスタンパク質をコードするＤＮＡ（即ち、ルシフェラーゼ遺伝子）がＩＬ−２シグナルペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された配置によって、ベクターがトランスフェクトされた哺乳類細胞中で融合タンパク質が発現され、ヘテロロガスタンパク質が宿主細胞から細胞外媒質に分泌される。
２．タンパク質分泌用ターゲッティングベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣλの構築
ＩＬ−２シグナルペプチド−ルシフェラーゼ融合遺伝子を宿主細胞の哺乳類人工染色体に導入するために、ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣを修飾して使用するとよい。ｐＬＮＸＣ−ＩＬＲＵＣ発現ベクターによる哺乳類人工染色体の特異的取込みを促進するために、人工染色体に存在するヌクレオチドに相同な核酸配列を部位特異的組換え可能な状態でベクターに付加する。
本文中に記載の代表的人工染色体はλファージＤＮＡを含む。従って、分泌ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣを作製するために、λファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ ４Ａアームに由来）を添加することによってタンパク質分泌用ターゲッティングベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣを調製した。
３．哺乳類細胞からのＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの発現及び分泌ａ．ｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣを用いるＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの発現
エレクトロポレーション（ＢＩＯＲＡＤ、製造業者の指示通りに実施）によって、哺乳類細胞（ＬＭＴＫ−、ＡＣＴＴから入手）にベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣ（〜１０μｇ）を一過性にトランスフェクトした。また、ｎｅｏ選択用Ｇ４１８中の増殖によって産生された安定なトランスフェクタントも調製した。
トランスフェクタントを増殖させ、次いでルシフェラーゼの発現を分析した。
トランスフェクト細胞から活性ルシフェラーゼが分泌されたか否かを判定するために、コエレントラジンの添加によって培養培地のルシフェラーゼを検定した（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：８５−９１参照）。
これらのアッセイの結果は、ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣが哺乳類宿主細胞中でヘテロロガスＤＮＡを構成的に発現し得ることを確認する。これらの結果は更に、ヒトＩＬ−２シグナルペプチドはペプチドのＣ末端に融合したタンパク質の分泌を指令し得ることを証明する。加えて、これらのデータは、Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼタンパク質か極めて有効なリポーター分子であり、哺乳類細胞環境で安定であり、高感度の容易な遺伝子発現アッセイの基礎となることを示す。
ｂ．ＬＭＴＫ−細胞から分泌されると考えられるＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ
（ｉ）細胞ペレットのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ
以下の細胞を試験した：
ベクター非含有細胞：陰性対照としてベクター非含有のＬＭＴＫ−細胞；
ｐＬＮＣＸ単独をトランスフェクトした細胞：
ＲＵＣ−ｐＬＮＣＸ（ｐＬＮＣＸベクター中にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むベクター）をトランスフェクトした細胞；
ｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣ（ｐＬＮＣＸベクター中にＩＬ−２リーダー配列＋Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ融合遺伝子を含むベタター）をトランスフェクトした細胞。
エレクトロポレーションの４８時間後、細胞及び培養培地を収集した。４つのプレートの細胞から得られた細胞ペレットを１ｍｌのアッセイバッファに再懸濁させ、音波処理によって溶解した。２００μｌの再懸濁細胞ペレットを各ルシフェラーゼ活性アッセイに使用した（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：８５−９１参照）。アッセイを３回繰返し、生物発光の平均測定値を算出した。
結果は、ｐＬＮＣＸをトランスフェクトした細胞または陰性対照細胞中に比較的低いバックグラウンド生物発光が存在することを示した。ＩＬ−２リーダー配列−ルシフェラーゼ遺伝子融合ベクターを含む細胞に由来の細胞ペレット中では低レベルが観察され、ＲＵＣ−ｐＬＮＣＸを含む細胞サンプル中では５，０００ＲＬＵを上回る値が観察された。
（ｉｉ）細胞培地のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ
４つの細胞プレートに由来の４０ミリリットルの培地を採取して遠心沈殿させた。各ルシフェラーゼ活性アッセイに２００マイクロリットルの培地を使用した。アッセイを数回繰返し、生物発光の平均測定値を算出した。これらの結果は、ｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣで形質転換させた細胞の細胞培地中で比較的高いレベルの生物発光が検出されることを示した。ＲＵＣ−ｐＬＮＣＸをトランスフェクトした細胞中の検出レベルは約１／１０という低い値（ベクター非含有またはｐＬＮＣＸ単独をトランスフェクトした細胞の培地中のバックグラウンドレベルをやや上回る値）であった。
（ｉｉｉ）結論
これらの実験の結果は、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼがＩＬ−２シグナルペプチドの指令下でＬＭＴＫ−細胞から分泌されると考えられることを示した。ＩＬ−２分泌シグナルをコードするＤＮＡに連結されたＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡをトランスフェクトした細胞の培地は、対照またはルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含むがシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含まない細胞よりも実質的に高いレベルのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を有していた。また、対照とルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含む細胞との差は、ルシフェラーゼ活性がルシフェラーゼ特異的であり、非特異的反応に由来しないことを示す。更に、ＲＵＣ−ｐＬＮＣＸをトランスフェクトした細胞の培地から得られた結果がバックグラウンドと同様であることは、培地中のルシフェラーゼ活性が細胞溶解に由来するのでなく分泌ルシフェラーゼに由来することを示す。
ｃ．ｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣλを用いたＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの発現
哺乳類人工染色体からＩＬ−２シグナルペプチド−Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ融合遺伝子を発現させるために、ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣλは、哺乳類人工染色体に含まれているλＤＮＡ配列との相同組換えによって哺乳類人工染色体に部位特異的に組込まれるようにターゲットされる。これは、哺乳類人工染色体を担持している融合細胞系または哺乳類人工染色体を含む哺乳類宿主細胞にｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣλを導入することによって行われる。例えばベクターのマイクロインジェクションまたはベクターによる融合細胞系のトランスフェクションを介して人工染色体を担持している融合細胞系にベクターが導入される場合、細胞を選択的条件下で増殖させる。ベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣλを取込んだ人工染色体を、前述のような精製手順を用いて生存細胞から単離し、次いで哺乳類宿主細胞に注入する。
あるいは、融合細胞系から単離しておいた哺乳類人工染色体を最初に哺乳類宿主細胞に注入してもよい。次に、宿主細胞にベクターｐＬＮＣＸ−ＩＬＲＵＣλをトランスフェクトして増殖させる。
次に、組換え宿主細胞のルシフェラーゼ発現を上述の手順で検定する。
Ｆ．他のターゲッティングベクター
ベクターｐＭＣＴ−ＲＵＣに基づくこれらのベクターは二重組換え体の挿入及び選択を確保するために正の選択及び負の選択に依存する。１回の交差によって細胞を殺傷するＤＴ−Ａが取込まれ、２回の交差組換えによってＤＴ−１遺伝子が欠失する。
１．プラスミドｐＮＥＭ１は以下の要素を含む。
ＤＴ−Ａ：ジフテリア毒素遺伝子（負の選択可能マーカー）と、Ｈｙｇ：ヒグロマイシン遺伝子（正の選択可能マーカー）と、ｒｕｃ：Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子（非選択可能マーカー）と、１：ＬＴＲ−ＭＭＴＶプロモーターと、
２：ＴＫプロモーターと、
３：ＣＭＶプロモーターと、
ＭＭＲ：相同領域（プラスミドｐＡＧ６０）。
２．プラスミドｐＮＥＭ−２及び−３は異なる負の選択可能マーカーを有する以外はｐＮＥＭ１に等しい。
ｐＮＥＭ−１：“−”選択可能マーカーとしてジフテリア毒素遺伝子、
ｐＮＥＭ−２：“−”選択可能マーカーとしてヒグロマイシンアンチセンス遺伝子、
ｐＮＥＭ−３：“−”選択可能マーカーとしてチミジンキナーゼＨＳＶ−１遺伝子。
３．プラスミドλＤＮＡに基づく相同
ｐＮＥＭλ−１：ベースベクター、
ｐＮＥＭλ−２：ｐ５＝遺伝子を含むベースベクター、
１：ＬＴＲ ＭＭＴＶプロモーター、
２：ＳＶ４０プロモーター、
３：ＣＭＶプロモーター、
４：μＴＩＩＡプロモーター（メタロチオネイン遺伝子プロモーター）。
−相同領域（プラスミドｐＡＧ６０）
λの左右のアームのλＬ．Ａ．及びλＲ．Ａ．相同領域（λｇｔ−ＷＥＳ）。
哺乳類細胞に対するプラスミドＤＮＡのマイクロインジェクション
これらの手順は、哺乳類細胞、昆虫類細胞などの真核細胞にＭＡＣを微量注入するために使用される。
マイクロインジェクション技術は、細胞内デリバリーシステムとして小さいガラス毛細管を使用する技術であり、ＤＮＡフラグメントを核に導入するために使用されている（例えば、Ｃｈａｌｆｉｅら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２−８０４参照）。この技術によって、ホルモン、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡなどのほぼすべての種類の分子をレシピエント細胞の細胞質または核に導入することが可能である。この技術では、扱う細胞の種類の制限もなく、Ｃａ2＋仲介型遺伝子導入及びリポソーム仲介型遺伝子導入のような他の方法よりも効率が高い。注入された細胞の約２０〜３０％が形質転換に成功する。
マイクロインジェクションは位相差顕微鏡の観察下で行う。マイクロマニピュレータを用い、予めＤＮＡサンプルを充填したガラス微量毛細管を注入対象細胞に向ける。毛細管に接続されたトランスジェクターから適度な空気圧を作用させることによって適量のサンプル（１〜１０μｌ）を細胞に移入する。注入された細胞の位置を特定し易いように、番号を付けた方眼をプリントしたガラススライド上でレシピエント細胞を増殖させる。
ａ．材料及び装置
３５×１０ｍｍのＮｕｎｃｌｏｎ組織培養皿、マウス細胞系ＥＣ３／７Ｃ５プラスミドＤＮＡ ｐＣＨ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、精製した緑色蛍光タンパク質（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）（Ａｅｑｕｏｒｅａ及びＲｅｎｉｌｌａに由来のＧＦＰは精製されており、ＧＦＰをコードするＤＮＡもクローニングされている。例えば、Ｐｒａｓｈｅｒら（１９９２）Ｇｅｎｅ １１１：２２９−２３３；米国特許出願０８／１１９，６７８及び０８／１９２，２６４に基づく国際ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０７４６３参照）、ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００顕微鏡、エッペンドルフトランスジェクター５２４６、エッペンドルフマイタロマニピュレータ５１７１、エッペンドルフのセロケート・カバースライド、エッペンドルフ微量充填器、エッペンドルフのフェムトチップス及びその他の標準装置。
ｂ．注入プロトコル
（１）３５ｍｍの組織培養皿（３７℃、５％ＣＯ2）で細胞密度が８０％集密度に達するまで線維芽細胞を増殖させる。インキュベータから皿を取出し、培地を深さ約５ｍｍまで加える。
（２）皿ホルダーに皿を載せ、倍率１０×の対物レンズで細胞を観察する。細胞表面上方に焦点を合わせるのが望ましい。
（３）微粒状落屑を完全に除去するために十分な遠心力でＤＮＡサンプルを遠心（典型的には微量遠心管で約１０，０００ｒｐｍで１０分間）することによって、プラスミドまたは染色体ＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μｌ）及びＧＦＰタンパク質溶液を更に精製する。
（４）２つの２μｌのＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μｌ）をエッペンドルフ微量充填器で微量毛細管に充填する。充填中、微量毛細管の先端に充填器を挿入する。ＧＦＰ（１ｍｇ／ｍｌ）を同じ手順で充填する。
（５）微量毛細管から保護シースを外し、微量毛細管をマイクロマニピュレータに接続した毛細管ホルダーに固定する。
（６）毛細管の先端を培地の表面まで下降させ、徐々に細胞に焦点を合わせていきながら毛細管の先端を細胞の表面に到達させる。更に下降させて毛細管を細胞に挿入する。毛細管のレベル、時間及び圧力のような種々のパラメーターは特定装置毎に決定される。例えば、線維芽細胞系Ｃ５と上記装置とを使用したときの最良条件は、注入時間０．４秒、圧力８０ｐｓｉである。ＤＮＡは次に細胞の核に自動的に注入される。
（７）注入後、細胞をインキュベータに戻し、約１８〜２４時間インキュベートする。
（８）インキュベーション後、選択マーカーに依存する適当な方法で形質転換体の数を測定し得る。例えば、緑色蛍光タンパク質を使用する場合、ＵＶ光源及び注入後０〜２４時間に設定した蛍光フィルターを使用してアッセイを実施し得る。ｐＨＣ１１０に由来のＤＮＡのようなβ−ｇａｌ含有ＤＮＡを注入した場合、形質転換体のβ−ｇａｌを検定し得る。
（ｃ）プラスミドＤＮＡが注入された細胞中のβ−ガラクトシターゼの検出
培養プレートから培地を除去し、５ｍｌの定着溶液（１％のグルタルアルデヒド；０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファ溶液；１ｍＭのＭｇＣｌ2）を加えて細胞を定着させ、３７℃で１５分間インキュベートする。定着溶液１を、５ｍｌのＸ−ｇａｌ溶液ＩＩ（０．２％のＸ−ｇａｌ；１０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．０）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；３．３ｍＭのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６Ｈ２０；３．３ｍＭのＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6）で置換し、プレートを３７℃で３０〜６０分間インキュベートする。Ｘ−ｇａｌ溶液を除去し、２ｍｌの７０％グリセロールを各プレートに添加する。青色に染色された細胞を光学顕微鏡で確認する。
この方法は、ＭＡＣ、特に抗ＨＩＶメガ染色体をもつＭＡＣを導入して、抗ＨＩＶ活性マウスモデルを作製するために使用されるであろう。
（ヒト以外の）トランスジェニック動物
動物体に所望の形質、例えば疾病耐性を与えるヘテロロガス遺伝子を発現する（ヒト以外の）トランスジェニック動物を作製し得る。疾病耐性動物のモデルとして役立つトランスジェニックマウスを作製する。ワクチンをコードしているかまたは治療用分子をコードしている遺伝子を胚または胚幹細胞（ＥＳ細胞）に導入して遺伝子産物を発現させ、特定の疾病に耐性または低感受性の動物を作製し得る。
哺乳類の人工メガ染色体及びその他の人工染色体、特にＳＡＴＡＣを使用して、病原性ウイルス耐性のような所望の形質を与える遺伝子を安定に発現させる哺乳類及び鳥類のような（ヒト以外の）トランスジェニック動物を作製し得る。人工染色体はまた、免疫的にヒト化された異種移植用器官を作製するために、ブタのような（ヒト以外の）トランスジェニック動物を作製するために使用され得る。
例えば、抗ＨＩＶリボザイムをコードするトランスジーンを含むトランスジェニックマウスは、これらの方法を用いて作製された安定な（ヒト以外の）トランスジェニック動物の有用な発育モデルである。（ヒト以外の）トランスジェニック動物、特に、乳汁中に有益なタンパタ質を産生する雌牛、ヤギ、マウス、雄牛、ラタダ、ブタ及びヒツジ、卵中に治療用タンパク質または他の有益なタンパク質を産生するトランスジェニックニワトリ及び他の産卵性家禽、などが人工染色体を用いて作製され得る。例えば、乳汁中にヘテロロガスＤＮＡを発現させるために乳腺特異的プロモーターを使用することが公知である（例えば、米国特許第４，８７３，３１６号参照）。特に、乳汁特異的プロモーター、または好ましくは乳房組織中で特異的に活性化される乳汁特異的シグナルペプチドに連結されたプロモーターは有益なＤＮＡに作動可能に連結され、これによって乳汁中でこのＤＮＡ配列を発現させる。
１．抗ＨＩＶリボザイムを発現する対照トランスジェニックマウスの発育
ベクターに担持されたトランスジーンＤＮＡを用いて発育させたマウス（対照マウス）中のトランスジーン発現と、人工メガ染色体に担持されたトランスジーンを用いて発育させたマウス中の発現との安定性及び量を比較するために対照トランスジェニックマウスを作製する。
ａ．β−ガラクトシダーゼを発現する対照トランスジェニックマウスの発育
β−ガラタトシダーゼ遺伝子を単独でマウス胚にマイタロインジェクションすることによって１組の対照トランスジェニックマウスを作製した。プラスミドＤＮＡをマウス胚に導入するために使用したマイクロインジェクション手順は実施例１３に記載の手順を胚を使用するように修正したものである(例えば、Ｈｏｇａｎら（１９９４）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，特にｐｐ２５５−２６４及び付録３参照)。受胎マウス肝（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃｏ．から得られたＣＢ６株）に、ＢａｍＨＩ消化によって直鎖化しておいた１ｎｇのプラスミドｐＣＨ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を注入した。このプラスミドは、ＳＶ４０後期プロモーターに連結されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子産物は、トランスジーン発現の成否を知るための検出容易なマーカーを提供する。更に、これらの対照マウスは、プラスミドを胚に導入するために使用したマイクロインジェタション手順を追認する。更に、モデル系（下記参照）のマウス胚に導入されるメガ染色体がβ−ガラタトシダーゼ遺伝子も含むので、ｐＣＨ１１０の胚注入によって作製された対照トランスジェニックマウスは、プラスミドに由来のヘテロロガス遺伝子の発現と人工染色体に担持された遺伝子に由来のヘテロロガス遺伝子の発現とを比較するための相似的な系として役立つ。
注入後、胚が分裂して２細胞を形成するまで胚を改質ＨＴＦ培地中で、５％ＣＯ2下、３７℃で１日間培養する。２細胞の胚を代理母となる雌マウスに移植する（手順に関しては、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９４）Ｈｏｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．１２７以降参照）。
ｂ．抗ＨＩＶリボザイムを発現する対照トランスジェニックマウスの発育
異なる３つの遺伝子、即ち、（１）抗ＨＩＶリボザイムをコードするＤＮＡと、(２)ピューロマイシン耐性遺伝子と、(３)ヒグロマイシン耐性遺伝子とを含むプラスミドｐＣＥＰＵＲ−１３２をマイクロインジェクションによってマウス胚に導入し１組の抗ＨＩＶリボザイム遺伝子含有対照トランスジェニックマウスを作製した。プラスミドｐＣＥＰＵＲ−１３２は、抗ＨＩＶリボザイム遺伝子（以後、Ｃｈａｎｇら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：２３−３１に準じてリボザイムＤと呼ぶ；他の参考文献としてはＲｏｓｓｉらの米国特許第５，１４４，０１９号、特に図４）とヒグロマイシン耐性遺伝子とを含むプラスミドｐＣＥＰ−１３２の部分をピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＣＥＰＵＲの部分に結合させることによって構築された。
プラスミドｐＣＥＰ−１３２を以下の手順で構築した。ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；また、Ｙａｔｅｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２−８１５参照）を、ベクターの多数クローニング部位領域を開裂するＸｈｏＩで消化した。この〜１０．４ｋｂのベクターは、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたヒグロマイシン耐性遺伝子を含み、更にアンピシリン耐性遺伝子とＣｏｌＥ１複製起点とＥＢＮＡ−１（エプスタイン・バールウイルス核抗原）遺伝子とＯｒｉＰとを含む。サイトメガロウイルスプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとが多数クローニング部位に隣接している。
ＸｈｏＩ消化したｐＣＥＰ４を、プラスミド１３２（このプラスミドの記述に関しては実施例４参照）のＸｈｏＩ及びＳａｌＩによる消化によって得られたフラグメントに結合させた。このＸｈｏＩ／ＳａｌＩフラグメントは、３’端にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが連結された抗ＨＩＶリボザイム遺伝子を含んでいる。この結合によって得られたプラスミドをｐＣＥＰ−１３２と命名した。従って詳細にはｐＣＥＰ−１３２は、抗ＨＩＶリボザイム遺伝子のＣＭＶプロモーター駆動発現のために多数タローニング部位に挿入された抗ＨＩＶリボザイム遺伝子とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとを含むｐＣＥＰ４から成る。
ｐＣＥＰＵＲ−１３２を作製するために、ｐＣＥＰ−１３２をｐＣＥＰＵＲのフラグメントに結合させた。ｐＣＥＰＵＲは、ｐＣＥＰ４のＮｈｅＩ／ＮｒｕＩ消化によって生じた７．７ｋｂのフラグメントを、５’端にＳＶ４０プロモーターが連結されたピューロマイシン耐性遺伝子を含むｐＢａｂｅの１．１ｋｂのＮｈｅＩ／ＳｎａＢＩフラグメントに結合させることによって調製した（ｐＢａｂｅの記述に関しては、Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ ａｎｄ Ｌａｎｄ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３５８７〜３５９６参照）。従って、ｐＣＥＰＵＲは、ｐＣＥＰ４に由来のアンピシリン耐性遺伝子及びＥＢＮＡ１遺伝子と、ＣｏｌＥ１及びＯｒｉＰ要素と、ｐＢａｂｅに由来のピューロマイシン耐性遺伝子とから構成されている。ｐＣＥＰＵＲ中のピューロマイシン遺伝子の５’端にＳＶ４０プロモーター（ｐＢａｂｅに由来）が隣接し、３’端にＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ｐＣＥＰ４に由来）が隣接している。
プラスミドｐＣＥＰＵＲをＸｈｏＩ及びＳａｌＩで消化し、５’端にＳＶ４０プロモーターが連結されたピューロマイシン耐性遺伝子を、ＸｈｏＩ消化したｐＣＥＰ−１３２に結合させて、〜１２．１ｋｂのプラスミドを作製し、ｐＣＥＰＵＲ−１３２と命名した。従って詳細にはｐＣＥＰＵＲ−１３２は、ＸｈｏＩ部位に挿入されたピューロマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０プロモーターとを含むｐＣＥＰ−１３２から成る。ｐＣＥＰＵＲ−１３２の主要要素は、チミジンキナーゼプロモーター及ひポリアデニル化シグナルに連結されたヒグロマイシン耐性遺伝子と、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに連結された抗ＨＩＶリボザイム遺伝子と、ＳＶ４０プロモーター及びポリアデニル化シグナルに連結されたピューロマイシン耐性遺伝子とから成る。プラスミドはまた、アンピシリン耐性遺伝子及びＥＢＮＡ１遺伝子とＣｏｌＥ１複製起点及びＯｒｉＰとを含む。
（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＣＢＡ／Ｊ）Ｆ１雄マウスと予め交配した（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＣＢＡ／Ｊ）Ｆ１雌マウス（例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９４）Ｈｏｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４２９参照）から受精卵を調製した。これらのＦ２受精卵の雄性前核に、ＮｒｕＩ消化によって直鎖化しておいたｐＣＥＰＵＲ−１３２（〜３μｇ／ｍｌ）を注入した（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９４）Ｈｏｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。注入を受けた卵を代理母となる雌マウスに移植し、トランスジェニック子孫を発育させた。
これらの一次キャリアの子孫の尾細胞から単離したＤＮＡ中のトランスジーンの存在を分析した（後述の手順）。尾細胞中にトランスジーンを含んでいた（しかし全身の細胞にトランスジーンを含まなくてもよい、即ちキメラでもよい）７体のキャリアマウスを交配して非キメラまたは生殖系のヘテロ接合体を産生させ得る。ヘテロ接合体を更に交配してホモ接合体であるトランスジェニック子孫を産生させ得る。
２．哺乳類人工染色体を用いるモデルトランスジェニックマウスの発育
受精マウス胚に、融合細胞系Ｇ３Ｄ５またはＨ１Ｄ３（前出）から単離したメガ染色体（１ｐｌあたり０−１個の染色体を含む１−１０ｐｌの材料）を前述の手順で微量注入する。メガ染色体は本文中に記載の手順で単離する。どちらの細胞系から単離したメガ染色体も、抗ＨＩＶリボザイム（リボザイムＤ）遺伝子とヒグロマイシン耐性遺伝子及びβ−ガラタトシダーゼ遺伝子とを含む。注人を受けた胚を発育させ、前述のようなトランスジェニックマウスを得る。
あるいは、メガ染色体含有細胞系Ｇ３Ｄ５*またはＨ１Ｄ３*を、マウス胚幹細胞（例えば、米国特許第５，４５３，３５７号参照、市販物質；他の参考文献としてＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９４）Ｈｏｇａｎら，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２５３−２８９ページ）に、標準手順（例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２５，Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ｄｅ Ｐａｍｐｈｉｌｉｓ，ｅｄｓ．（１９９３），８０３−９３２ページ参照）で融合させる。（また、（前出のような）マイクロセル手順を用いて単離メガ染色体を胚幹細胞に導入することも可能である）。幹細胞を線維芽細胞（例えば、ヒグロマイシン及びピューロマイシンに耐性のＳＴＯ線維芽細胞）の存在下で培養する。得られた融合細胞系の細胞はトランスジーン（即ち、抗ＨＴＶリボザイム遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を担持するメガ染色体を含む。この細胞を次にマウス線維芽細胞に移植し、次いで代理母となる雌マウスに移植して発育させ、トランスジェニックマウスを得る。
この方法によって作製されたマウスはキメラである。トランスジーンの発現はマウスのいくつかの領域、例えば、頭部に限定され、従って全部の細胞で発現されることはない。
３．トランスジーン発現用トランスジェニックマウスの分析
上述のように作製したトランスジェニックマウスが３〜４週齢に成長したときに、発育場所である胚（または受精卵）に導入されたトランスジーンの安定な発現を分析する。以下のような複数の方法でトランスジェニックマウスを分析し得る。
ａ．トランスジェニックマウスから得られた細胞の分析
トランスジェニックマウスから細胞サンプル（例えば、脾臓、肝臓及び腎臓の細胞、リンパ球、尾細胞）を採取する。どの細胞を用いてトランスジーン発現を試験してもよい。しかしながら、メガ染色体含有細胞を受精卵にマイクロインジェクションするかまたは胚幹細胞と融合させることによって作製したキメラマウスの場合、トランスジーンを担持する領域のマウス細胞だけがトランスジーンを発現すると予想される。細胞がヒグロマイシン（細胞が２つの抗生物質耐性遺伝子の導入によって作製されたマウスに由来する場合にはヒグロマイシンとピューロマイシンまたはネオマイシン）上で増殖を維持する場合、この増殖維持は、これらの細胞がトランスジーンを安定に発現しているという指標となる。標準方法に従って細胞から単離したＲＮＡをノーザンブロット手順によって分析し、細胞が、抗生物質耐性遺伝子に基づく核酸プローブにハイブリダイズする転写物を発現するか否かを判断し得る。更に、トランスジェニックマウスから得られた細胞によるβ−ガラクトシダーゼ発現の分析は、このマーカー酵素用の標準アッセイ（例えば、β−ガラクトシダーゼ及びＸ−ｇａｌ基質が関与する反応の産物の直接染色、例えば、Ｊｏｎｅｓ（１９８６）ＥＭＢＯ ５：３１３３−３１４２、またはβ−ガラクトシダーゼ活性の測定、例えばＭｉｌｌｅｒ（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐｐ．３５２−３５５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ参照）を用いて行うとよい。特に、胚に導入されたトランスジーンがβ−ガラタトシダーセ遺伝子だけであるような対照トランスジェニックマウスから得られた細胞中のトランスジーン発現を評価するときは、β−ガラクトシダーゼ発現の分析を使用する。
トランスジェニックマウスから得られた細胞中の抗ＨＩＶリボザイム遺伝子の安定な発現は複数の方法で評価できる。第一の方法では、標準手順に従って細胞から単離したＤＮＡを、リボザイム遺伝子配列に対応するプライマーを用いて核酸増幅する。遺伝子が細胞に含まれているとき、反応混合物とリボザイム遺伝子配列に基づく核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって所定のサイズの増幅産物が検出される。更に、このような核酸プローブに対するハイブリダイゼーションについて、細胞から単離したＤＮＡをサザンブロット法を用いて分析してもよい。第二の方法では、細胞がリボザイム遺伝子に基づく核酸プローブにハイブリダイズするＲＮＡを発現するか否かを判断するために、細胞から単離したＲＮＡをノーザンブロットハイブリダイゼーションで処理し得る。第三の方法では、例えば、Ｃｈａｎｇら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：２３−３１に記載されているように、細胞中の抗ＨＩＶリボザイム活性の存在を分析し得る。この分析では、細胞から単離したＲＮＡを、放射性標識したＨＩＶ ｇａｇターゲットＲＮＡと混合する。このターゲットＲＮＡは、Ｃｈａｎｇら（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：２３−３１に記載のようなｇａｇターゲットのｉｎ ｖｉｔｒｏ開裂に有利な反応条件下でｇａｇ遺伝子鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られる。反応の停止後、完全鋳型よりもサイズの小さい開裂産物が検出されるか否かを判断するために混合物をゲル電気泳動によって分析する。このような開裂フラグメントの存在は安定に発現されたリボザイムの存在の指標となる。
ｂ．完全トランスジェニックマウスの分析
抗ＨＩＶリボザイム遺伝子（並びに選択及びマーカー遺伝子）を胚または受精卵に導入することによって作製した完全トランスジェニッタマウスにおけるトランスジーンの発現は、マウスをＨＩＶ感染で攻撃することによってを分析し得る。高生産性ＨＩＶ感染Ｕ９３７細胞（例えば、Ｌｏｃａｒｄｉら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６４９−１６５４参照）の腹膜組織内注入によってマウスをＨＩＶ感染させることが可能である。感染の成否は、ＨＴＶ感染ヒト細胞を注入したトランスジェニッタマウスから得られた末梢血単核細胞のような細胞から単離したＤＮＡの分析によって確認し得る。例えば、ＨＩＶ特異的プライマーを用いる核酸増幅によって証明されるように、感染トランスジェニックマウス細胞のＤＮＡはＨＩＶ特異的ｇａｇ及びｅｎｖ配列を含むであろう。細胞が抗ＨＩＶリボザイムも安定に発現させているならば、細胞のＲＮＡ抽出物を分析したときに、リボザイムによるｇａｇ転写物の開裂によって生じた短縮ｇａｇフラグメントが検出されるであろう。
更に、抗ＨＩＶリボザイム遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを、ヒトＣＤ４（即ち、ＨＩＶの細胞性レセプター）（ヒトＣＤ４を発現するトランスジェニックマウスの記述に関してはＧｉｌｌｅｓｐｉｅら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２９５２−２９５８；Ｈａｎｎａら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１０８４−１０９４；及びＹｅｕｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１９１１−１９２０参照）を発現するトランスジェニックマウスと交配し得る。ＣＤ４及び抗ＨＩＶリボザイムの双方のトランスジーンを発現するこれらの交配トランスジェニックマウスの子孫は、（抗ＨＩＶリボザイムを発現することなく）ＣＤ４を単独に発現するマウスよりも（細胞中の活性ＨＩＶレベルが低下した結果）感染に対して耐性であるに違いない。
４．人工染色体を用いるトランスジェニックニワトリの発育
トランスジェニックニワトリの発育は、商業的に重要な農畜産品種である家禽を病気耐性遺伝子及び治療用タンパタ質をコードする遺伝子によって改良するなどの多くの用途を有している。この分野では、トランスジェニックニワトリの作製を目指す研究が、ランダム導入によってレシピエント細胞に遺伝子を導入する従来の方法でニワトリ細胞にトランスジーンを安定に発現させることが難しいという問題に直面していた。人工染色体は、宿主細胞中でトランスジーンを安定に維持させるので、トランスジェニックニワトリの発育に特に有用である。
ａ．レシピエントニワトリ細胞にトランスジーンを導入するための人工染色体の調製
（ｉ）哺乳類人工染色体
本文中に記載のＳＡＴＡＣ及びミニクロモソームのような哺乳類人工染色体は、検出可能なリポーター遺伝子及び／またはトランスジェニックニワトリの発育に使用される有益なトランスジーンを取込むように修飾され得る。あるいは、本文中に記載の方法を使用してニワトリ特異的人工染色体を構築し得る。より特定的には、本文中に記載のＭＡＣの作製方法を用いてニワトリ人工染色体（ＣＡＣ）を調製し得る。また、上述のように、本発明によって提供されるＭＡＣにニワトリライブラリーを導入し、得られたＭＡＣをニワトリ細胞に導入し、ニワトリ細胞中で機能性のＭＡＣを選択し得る。
実施例４及び７並びに本文の他の筒所で記載したように、人工染色体を含むマウスＬＭＴＫ−由来の細胞系またはミニクロモソームを含む細胞系とそのハイブリッドに、選択されたＤＮＡをトランスフェタトし、ＤＮＡ内部に含まれているヘテロロガス遺伝子を機能的に発現させる外来ＤＮＡを組込んだＭＡＣ（またはＣＡＣ）を作製し得る。
ニワトリ細胞中で発現させるべきトランスジーンを含むＭＡＣまたはＣＡＣを作製するために、ＭＡＣ含有細胞系に、λＤＮＡとニワトリ細胞中の遺伝子発現を駆動し得るプロモーターに作動可能に連結された有益なトランスジーンとを含むＤＮＡをトランスフェクトし得る。あるいは、上述のように作製したミニクロモソームまたはＭＡＣ（またはＣＡＣ）を単離し、細胞に導入し、次いで選択されたＤＮＡのターゲット化組込みを行うとよい。ターゲット化組込み用のベタターは本発明によって提供されるかまたは本文中に記載の手順で構築され得る。
有益なプロモーターは、ニワトリ細胞中の遺伝子発現を促進するために当業界で公知の構成性、誘発性の組織（または細胞）特異的プロモーターである。例えば、ニワトリ胞胚葉性細胞及び初代ニワトリ線維芽細胞中のｌａｃＺ遺伝子の発現が、マウス熱ショックタンパク質６８（ｈｓｐ６８）プロモーター（ｐｈｓｐＰＴｌａｃＺｐＡ；Ｂｒａｚｏｌｏｔら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．３０：３０４−３１２参照）、Ｚｎ２＋誘発性ニワトリメタロチオネイン（ｃＭｔ）プロモーター（ｐＣＢｃＭｔｌａｃｚ；Ｂｒａｚｏｌｏｔら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．３０：３０４−３１２参照）、タンデム配置のラウス肉腫ウイルス及びニワトリβ−アクチンプロモーター（ｐｍｉｗＺ；Ｂｒａｚｏｌｏｔら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．３０：３０４−３１２参照）、構成性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを用いて証明された。本発明に特に有益なプロモーターは、卵白アルブミン及びリゾチームのような卵中で発現される遺伝子に由来の卵特異的プロモーターである。
プロモーターの選択は、種々の要因、例えば、トランスジーン産物をトランスジェニックニワトリの全身で発現させるべきかまたは卵のような特定場所に限定するべきかなどの要因に左右される。ニワトリ体内で機能性の細胞特異的プロモーターとしては、卵白アルブミンタンパク質をコードする遺伝子のステロイド応答性プロモーター（Ｇａｕｂら（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：２３１３−２３２０；Ｔｏｒａら（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：３７７１−３７７８；Ｐａｒｋら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）３６：８１１−８１６）がある。
（ｉｉ）ニワトリ人工染色体
更に、ニワトリ人工染色体を本文中に記載の方法を用いて作製し得る。例えば、初代ニワトリ線維芽細胞（例えば、Ｂｒａｚｏｌｏｔら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．３０：３０４−３１２）のようなニワトリ細胞に、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性を与えるタンパク質）をコードし且つ導入ＤＮＡを内在性ニワトリ染色体の動原体周囲領域にターゲットするＤＮＡ（例えばニワトリサテライトＤＮＡ）を含むＤＮＡをトランスフェクトするとよい。次に、選択培地で増殖を維持するトランスフェクタントを本文中に記載の方法を用いて分析し、ミニクロモソーム及び特にＳＡＴＡＣのような人工染色体の有無を判定する。次に、人工染色体含有トランスフェクタント細胞に、有益なトランスジーン（適当なプロモーターに融合）をコードするＤＮＡを、外来ＤＮＡをニワトリ人工染色体にターゲットするＤＮＡと共にトランスフェクトする。
ｂ．有益なトランスジーンを担持する人工染色体のレシピエントニワトリ細胞内導入
染色体をレシピエント細胞に導入するために、有益な（１つまたは複数の）トランスジーンを担持している人工染色体を含む細胞系（即ち、ドナー細胞）をレシピエントニワトリ細胞に融合し得る。あるいは、例えば本文中に記載の方法（例えば実施例１０参照）を用いて人工染色体をドナー細胞から単離し、レシピエント細胞に直接導入してもよい。
代表的なニワトリレシピエント細胞系の非限定例は、Ｘ期胞胚葉細胞（例えば、Ｂｒａｚｏｌｏｔら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３０：３０４−３１２；Ｅｔｃｈｅｓら（１９９３）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．７２：８８２−８８９：Ｐｅｔｉｔｔｅら（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０８：１８５−１８９参照）及びニワトリ受精卵（例えば、Ｌｏｖｅら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：６０−６３参照）である。
例えば、マイクロセル融合は、人工染色体を烏類細胞に導入するための１つの方法である（マイクロセルをＤＴ４０ニワトリプレＢ細胞と融合させる方法に関しては例えば、Ｄｉｅｋｅｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１２：１７４−１８２参照）。この方法では、人工染色体含有細胞系からマイタロセルを調製し（例えば、実施例１．Ａ．５に記載の手順を用いる）、ニワトリレシピエント細胞に融合させる。
単離した人工染色体を、リポフェクション手順（例えば、Ｂｒａｚｏｌｏｔら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３０：３０４−３１２参照）のような脂質仲介キャリア系を介してニワトリレシピエント細胞系に直接導入してもよく、または直接マイクロインジェクションを使用してもよい。人工染色体をニワトリ受精卵に導入する場合には概してマイクロインジェクションが好ましい（例えば、Ｌｏｖｅら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：６０−６３参照）。
ｃ．トランスジェニックニワトリの発育
レシピエント細胞として（人工染色体を受容した）Ｘ期胞胚葉細胞を同じ発生期の胚に注入することによってトランスジェニックニワトリを発育させ得る（例えば、Ｅｔｃｈｅｓら（１９９３）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．７２：８８２−８８９；Ｐｅｔｉｔｔｅら（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０８：１８５−１８９；Ｃａｒｓｉｅｎｃｅら（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１７：６６９−６７５参照）。卵殻内のレシピエントニワトリ胚を明りに透かして良否を判定して孵化させ、いずれかの細胞が（１つまたは複数の）トランスジーンを発現している生殖系キメラニワトリを産生させる。
あるいは、例えば直接マイクロインジェクションによって（例えば、Ｌｏｖｅら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：６０−６３参照）、人工染色体をニワトリ受精卵に直接導入してもよい。この場合、人工染色体はニワトリの細胞の少なくとも一部分に取込まれる。卵特異的プロモーターのような組織特異的プロモーターを組込むことによって、作動可能に連結されたヘテロロガスＤＮＡの適正な発現が確保される。
また、本発明で提供される方法によって有益なＤＮＡをミニクロモソームに導入してもよい。ミニタロモソームは本発明によって提供されるものでもよく、または本文中に記載の方法を用いてニワトリ細胞中で作製したものでもよい。ヘテロロガスＤＮＡは、本発明で提供されるかまたは本発明の方法によって構築されたターゲッティングベクターを用いて導入される。
いくつかの変形は当業者に自明であると考えられるので、本発明の範囲は請求の範囲の記載のみに限定されることを理解されたい。
図１は、ＭＭＣｎｅｏ［ミニ染色体］染色体の生成を描いた模式図である。Ａ〜Ｇは、当該ミニ染色体の形成および安定化に至ると考えられる観察データと一致する連続事象を表す。 図２には、認められた新たな染色体の生成形態の模式的概要と、異なるデノボ生成染色体間の関係を示してある。詳細にはこの図は、マウス７番染色体の動原体領域で開始するデノボ染色体形成の模式図を示している。（Ａ）７番染色体の動原体領域における１回のＥ型増幅によって、組み込まれた「外来」ＤＮＡに連結したｎｅｏ−動原体が形成され、二動原体染色体が形成される。複数回のＥ型増幅によって、λｎｅｏ−染色体が形成され、それは二動原体染色体の動原体間の特異的切断によって、マウス７番染色体の残りの部分から分離され、マウス−ハムスター雑種細胞系で安定化した。（Ｂ）二動原体７番染色体の動原体間の特異的切断によって、ｎｅｏ−動原体を有する染色体断片と、末端に異種ＤＮＡの痕跡を有する７番染色体が生成する。（Ｃ）ｎｅｏ−動原体を有する断片の反転複製によって、安定なｎｅｏ−ミニ染色体が生成する。（Ｄ）元二動原体７番染色体の異種ＤＮＡ領域への外来ＤＮＡの組み込みによってＨ型増幅が開始し、異質染色質腕が生成する。真正染色質末端部分を捕捉することで、その新たな染色体腕が「ソーセージ」染色体の形で安定化する。（Ｅ）ＢｒｄＵ［５−ブロモデオキシウリジン］処理および／または薬剤選別によって、さらにＨ型増幅が誘発され、それによって不安定なギガ染色体が生成する。（Ｆ）ＢｒｄＵ処理および／または薬剤選別を繰り返すことで、動原体複製を含むさらなるＨ型増幅が誘発され、それによってさらに別の染色体腕が生成する。それは染色体切断によって７番染色体から切り離され、末端部分を獲得することで、安定なメガ染色体が生成する。 図３は、レプリコン構造の模式図であって、メガ染色体が生成すると考えられる図式である。 図４は、本明細書に記載の細胞系例の一部のものの間の関係を説明する図である。 図５は、プラスミドｐＴＥＭＰＵＤの図である。

Claims (23)

  1. 選択可能マーカーおよびＤＮＡフラグメントが植物細胞染色体の狭動原体領域を標的として導入されるようにする標的化配列を含む１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを植物細胞に導入し、植物細胞の染色体の挟動原体異質染色質に前記ＤＮＡフラグメントを導入する段階と、
    前記１つまたは複数のＤＮＡフラグメントをゲノムＤＮＡに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
    サテライト人工染色体を含む細胞を選択する段階と
    を含んで成る、ここでサテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものである、植物サテライト人工染色体の製造方法。
  2. 更に、遺伝子産物をコードするＤＮＡを導入する段階を含んでおり、この遺伝子産物をコードするＤＮＡは選択可能マーカーを含むフラグメントに存在し、得られるサテライト人工染色体が遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. サテライト人工染色体がメガ染色体であり、ここでメガ染色体が、２個の反転メガレプリコンを有するアンプリコンを含む、５０Ｍｂ〜４００Ｍｂからなるサテライト人工染色体であり、メガレプリコンが反復異質染色質ＤＮＡ単位を含むものであり、方法が、 末端切断されたメガ染色体を含む細胞が産生される条件を細胞に作用させる段階を更に含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記条件が、Ｘ線照射と、染色体内部の塩基対合を不安定化する物質の存在下の増殖とから選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 前記物質がブロモデオキシウリジンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 更に、１５〜６０Ｍｂからなるサテライト人工染色体を含んでいる細胞を選択する段階を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 細胞からサテライト人工染色体を単離する段階を更に含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 単離が、
    中期染色体を単離し、
    内因性染色体からサテライト人工染色体を識別し、
    内因性染色体からサテライト人工染色体を分離することによって行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. ＤＮＡ配列特異的染料で染色体を染色することによってサテライト人工染色体を内因性染色体から識別することを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって製造されるサテライト人工染色体。
  11. 請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって製造されるサテライト人工染色体を含む細胞。
  12. 選択可能マーカーおよびＤＮＡフラグメントが植物細胞染色体の狭動原体領域を標的として導入されるようにする標的化配列を含む１つまたは複数のＤＮＡフラグメントを植物細胞に導入し、植物細胞の染色体の挟動原体異質染色質に前記ＤＮＡフラグメントを導入する段階と、
    前記１つまたは複数のＤＮＡフラグメントをそのゲノムＤＮＡに取込んだ細胞が産生されるような選択条件下で細胞を増殖させる段階と、
    増殖した細胞から新規な動原体を含む二動原体型染色体を有する細胞を選択する段階と、
    サテライト人工染色体が産生される条件下で細胞を増殖させる段階と
    を含んで成る植物サテライト人工染色体の製造方法、ここで植物サテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものである。
  13. 請求項１０に記載のサテライト人工染色体を細胞に導入する段階と、１つまたは複数の遺伝子産物が発現される条件下で細胞を培養する段階とを含んで成る、１つまたは複数の遺伝子産物の産生方法。
  14. 植物サテライト人工染色体を細胞に導入する段階を含むことを特徴とする異種核酸を含む細胞を産生する方法、ここで、サテライト人工染色体は請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により製造されるものであり、真正染色質よりも異質染色質を多く含むものである。
  15. サテライト人工染色体を植物細胞に導入する段階、ここでサテライト人工染色体は請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により製造されるものである、および、
    サテライト人工染色体を含む植物が産生される条件下で細胞を培養する段階、ここでサテライト人工染色体は真正染色質よりも異質染色質を多く含むものである、
    を含んで成る、トランスジェニック植物の産生方法。
  16. サテライト人工染色体が、５００〜１０００Ｍｂ、５０〜４５０Ｍｂ、２５０〜４００Ｍｂ、１５０〜２００Ｍｂ、１５〜２００Ｍｂ、１５〜６０Ｍｂ、または１０〜６０Ｍｂからなることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. サテライト人工染色体が、直接ＤＮＡ移入または取り込み、エレクトロポレーション、リポフェクション、核微量注入、リポソーム仲介転移、微粒子衝撃、多価カチオン介在転移、ポリエチレングリコール転移及びミクロセル（微小核体）融合から選択される方法により導入されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  18. 細胞がタバコ、イネ、トウモロコシ、ライ麦、小麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモ、トマトまたはシロイヌナズナの細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  19. 人工染色体が遺伝子産物をコードする異種ＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 植物細胞が単子葉植物または双子葉植物の細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  21. 植物細胞がプロトプラストであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  22. 請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法によって得られるトランスジェニック植物。
  23. タバコ、イネ、トウモロコシ、ライ麦、小麦、大豆、Brassica napus、綿、レタス、ジャガイモ、トマトまたはシロイヌナズナであることを特徴とする請求項２２に記載のトランスジェニック植物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077697A (en) 1996-04-10 2000-06-20 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US20020160970A1 (en) * 1996-04-10 2002-10-31 Gyula Hadlaczky Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US20030033617A1 (en) * 1996-04-10 2003-02-13 Gyula Hadlaczky Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
WO1998008964A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Tsuneko Okazaki Mammalian artificial chromosomes
US6900012B1 (en) 1997-06-03 2005-05-31 The University Of Chicago Plant artificial chromosome compositions and methods
US7193128B2 (en) * 1997-06-03 2007-03-20 Chromatin, Inc. Methods for generating or increasing revenues from crops
US7119250B2 (en) 1997-06-03 2006-10-10 The University Of Chicago Plant centromere compositions
US7227057B2 (en) * 1997-06-03 2007-06-05 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US6972197B1 (en) 1999-03-18 2005-12-06 The University Of Chicago Plant chromosome compositions and methods
US7235716B2 (en) * 1997-06-03 2007-06-26 Chromatin, Inc. Plant centromere compositions
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US6979728B2 (en) * 1998-05-04 2005-12-27 Baylor College Of Medicine Articles of manufacture and methods for array based analysis of biological molecules
TWI255853B (en) * 1998-08-21 2006-06-01 Kirin Brewery Method for modifying chromosomes
WO2000034436A2 (en) * 1998-12-04 2000-06-15 Genetronics, Inc. Facs assisted methods for introducing individual chromosomes into cells
AU3764900A (en) * 1999-03-18 2000-10-04 University Of Chicago, The Plant chromosome compositions and methods
CA2904855A1 (en) * 1999-03-18 2000-09-21 The University Of Chicago Plant centromeres
US7989202B1 (en) * 1999-03-18 2011-08-02 The University Of Chicago Plant centromere compositions
DE19942149A1 (de) * 1999-09-03 2001-03-15 Daniele Zink Verfahren zur Expression von exogenen Sequenzen in Säugerzellen
KR100863823B1 (ko) * 1999-12-22 2008-10-15 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 코스미드 ｄｎａ 작제물 및 이를 제조하고 이용하는 방법
AU2000258017A1 (en) * 2000-07-17 2002-02-13 Jiahui Xia Human source gene leading sequence, gene vector and gene expression strategy
EP1911837B1 (en) * 2000-09-28 2011-05-25 Bioriginal Food & Science Corp. FAD5-2 fatty acid desaturase family member and uses thereof
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
US8008459B2 (en) * 2001-01-25 2011-08-30 Evolva Sa Concatemers of differentially expressed multiple genes
DE60239386D1 (de) * 2001-01-25 2011-04-21 Evolva Ltd Zellbibliothek
AU2002226307A1 (en) * 2001-01-25 2002-08-06 Evolva Biotech A/S Artificial chromosomes comprising concatemers of expressible nucleotide sequences
AU2002252076C1 (en) * 2001-02-23 2008-05-01 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Cloning of transgenic animals comprising artificial chromosomes
US6936469B2 (en) 2001-03-22 2005-08-30 Chromos Molecular Systems Inc. Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof
US20030186390A1 (en) * 2001-03-22 2003-10-02 De Jong Gary Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof
US7294511B2 (en) 2001-03-22 2007-11-13 Chromos Molecular Systems, Inc. Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof
WO2002081710A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Artificial chromosomes that can shuttle between bacteria, yeast, and mammalian cells
CA2508763C (en) 2001-05-11 2012-01-24 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Human antibody producing mouse and method for producing human antibody using the same
EP1401849A4 (en) * 2001-05-30 2005-05-18 Chromos Molecular Systems Inc ARTIFICIAL PLANT CHROMOSOMES, THEIR USE AND METHOD FOR THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL PLANT CHROMOSOMES
CA2441937A1 (en) * 2001-05-30 2002-12-05 Chromos Molecular Systems, Inc. Chromosome-based platforms
AU2011202647B2 (en) * 2001-05-30 2012-09-27 Agrisoma, Inc. Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
EP1281767A3 (en) 2001-07-31 2003-05-28 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of tumors
CA2459269A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-13 Thomas E. Wagner Stable episomal vectors
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
AU2002332027A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-14 The Government Of The United States Of America, As Tandem repeat markers
CA2463725A1 (en) 2001-10-12 2003-11-06 Spectral Genomics, Inc. Compilations of nucleic acids and arrays and methods of using them
US7439346B2 (en) * 2001-10-12 2008-10-21 Perkinelmer Las Inc. Nucleic acids arrays and methods of use therefor
US20040210955A1 (en) * 2001-10-26 2004-10-21 Hidenori Akutsu Preparation of spermatozoa for ICSI-mediated transgenesis and methods of using the same
DE60324385D1 (de) * 2002-01-25 2008-12-11 Evolva Ag Screeningmethoden nach mehreren parametern und entwicklung von zellen, um kleine moleküle mit mehreren funktionalitäten zu produzieren
AU2003220119A1 (en) 2002-03-07 2003-09-22 University Of Delaware Methods, compositions, and kits for enhancing oligonucleotide-mediated nucleic acid sequence alteration using compositions comprising a histone deacetylase inhibitor, lambda phage beta protein, or hydroxyurea
US6916621B2 (en) * 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
US7226771B2 (en) 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP1497418B1 (en) 2002-04-19 2012-10-17 Verenium Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20030228261A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-11 Aladar Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
EP1369491A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-10 Aladar A. Szalay Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue
US20060252156A1 (en) * 2002-08-01 2006-11-09 Evolva Ltd. C/O Dr. Iur. Martin Eisenring Methods of mixing large numbers of heterologous genes
US20040142864A1 (en) * 2002-09-16 2004-07-22 Plexxikon, Inc. Crystal structure of PIM-1 kinase
US20050048573A1 (en) * 2003-02-03 2005-03-03 Plexxikon, Inc. PDE5A crystal structure and uses
US20050170431A1 (en) * 2003-02-28 2005-08-04 Plexxikon, Inc. PYK2 crystal structure and uses
EP3023498B1 (en) 2003-03-06 2018-11-28 BASF Enzymes LLC Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20050198700A1 (en) * 2003-03-07 2005-09-08 Avigenics, Inc. Genomic modification
MX295545B (es) 2003-03-07 2012-02-03 Diversa Corp Hidrolasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos para hacerlas y usarlas.
US20050273873A1 (en) * 2003-03-07 2005-12-08 Avigenics, Inc. Genomic modification
US20050034186A1 (en) * 2003-03-07 2005-02-10 Harvey Alex J. Site specific nucleic acid integration
US20040255345A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-16 Rapp Jeffrey C. Production of transgenic avians
US7592434B2 (en) 2003-04-04 2009-09-22 Verenium Corporation Pectate lyases, nucleic encoding them and methods for making and using them
EP1644492B1 (en) 2003-06-18 2009-01-07 Genelux Corporation Modified recombinant vaccinia viruses, uses thereof
EP2404931A1 (en) 2003-07-02 2012-01-11 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20050079548A1 (en) * 2003-07-07 2005-04-14 Plexxikon, Inc. Ligand development using PDE4B crystal structures
CA2535526C (en) 2003-08-11 2015-09-29 Diversa Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7330851B2 (en) * 2003-08-18 2008-02-12 Eaglehawk, Limited Data security through dissembly of data elements or connections between elements
WO2005028624A2 (en) * 2003-09-15 2005-03-31 Plexxikon, Inc. Molecular scaffolds for kinase ligand development
AU2004286845A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-19 Tufts-New England Medical Center Prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA in amniotic fluid
US20070066641A1 (en) * 2003-12-19 2007-03-22 Prabha Ibrahim Compounds and methods for development of RET modulators
EP1696920B8 (en) * 2003-12-19 2015-05-06 Plexxikon Inc. Compounds and methods for development of ret modulators
US7517970B2 (en) 2003-12-19 2009-04-14 Plexxikon, Inc. Nucleic acids encoding kinase and phosphatase enzymes, expression vectors and cells containing same
EP1708564A4 (en) * 2004-01-15 2007-03-07 Avigenics Inc PRODUCTION OF A TRANSGENIC AVIAN ANIMAL BY CYTOPLASMIC INJECTION
WO2005083096A1 (en) * 2004-02-23 2005-09-09 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
US20060123504A1 (en) * 2004-12-07 2006-06-08 Avigenics, Inc. Methods of producing polyclonal antibodies
US20060174364A1 (en) * 2004-03-01 2006-08-03 Avigenics, Inc. Artificial chromosomes and transchromosomic avians
US7585859B2 (en) * 2004-05-06 2009-09-08 Plexxikon, Inc. PDE4B inhibitors and uses therefor
AU2005264938B2 (en) 2004-06-16 2011-11-24 Verenium Corporation Compositions and methods for enzymatic decolorization of chlorophyll
US7498342B2 (en) * 2004-06-17 2009-03-03 Plexxikon, Inc. Compounds modulating c-kit activity
EP1967529A1 (en) 2004-07-20 2008-09-10 Symphogen A/S Anti-rhesus D recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
WO2006025995A2 (en) * 2004-07-27 2006-03-09 The Regents Of The University Of California Compositions and methods using md-2 mutants and chimeric proteins
EP1786813A2 (en) * 2004-09-03 2007-05-23 Plexxikon, Inc. Bicyclic heteroaryl pde4b inhibitors
CA3079874C (en) 2004-10-22 2023-01-03 Revivicor, Inc. Ungulates with genetically modified immune systems
WO2006099207A2 (en) 2005-03-10 2006-09-21 Diversa Corporation Lyase enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
NZ594810A (en) 2005-03-15 2012-12-21 Verenium Corp Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US9139849B2 (en) 2005-04-08 2015-09-22 The United States of America as Represented by the Government of the Department of Health and Human Services Rapid generation of long synthetic centromeric tandem repeats for mammalian artificial chromosome formation
KR20080027775A (ko) * 2005-05-17 2008-03-28 플렉시콘, 인코퍼레이티드 피롤(２,３-ｂ)피리딘 유도체 단백질 키나제 억제제
CN102603581B (zh) * 2005-06-22 2015-06-24 普莱希科公司 作为蛋白质激酶抑制剂的吡咯并[2,3-b]吡啶衍生物
US8222028B2 (en) * 2005-09-08 2012-07-17 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
CN101360826B (zh) 2005-11-18 2014-04-30 格兰马克药品股份有限公司 抗α2整联蛋白抗体及它们的用途
WO2007084767A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 University Of South Florida Methods for profiling transcriptosomes
WO2007092314A2 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Verenium Corporation Esterases and related nucleic acids and methods
DK2450439T3 (da) 2006-02-10 2014-02-10 Verenium Corp Cellulosenedbrydende enzymer, nucleinsyrer, der koder for dem, og fremgangsmåder til at fremstille og benytte dem
EP2548955A1 (en) 2006-02-14 2013-01-23 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
KR101588539B1 (ko) 2006-03-07 2016-01-25 바스프 엔자임스 엘엘씨 알돌라제, 이것을 코딩하는 핵산과 그 제조 방법 및 사용 방법
EP2112227B1 (en) 2006-03-07 2013-05-15 Cargill, Incorporated Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2652247C (en) 2006-05-08 2015-11-17 Adaerata, Limited Partnership Chimeric pcsk9 proteins, cells comprising same, and assays using same
US20090165176A1 (en) * 2006-05-17 2009-06-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Artificial Plant Minichromosomes
CA2652598A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Artificial plant minichromosomes
US20090100550A1 (en) * 2006-05-17 2009-04-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Artificial Plant Minichromosomes
TW200819540A (en) 2006-07-11 2008-05-01 Genelux Corp Methods and compositions for detection of microorganisms and cells and treatment of diseases and disorders
BRPI0714876B1 (pt) 2006-08-04 2022-04-19 Verenium Corporation Ácido nucleico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula bacteriana, fúngica ou de levedura transformada, polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante, composição, bem como métodos de produção e de usos dos mesmos
WO2008036863A2 (en) 2006-09-21 2008-03-27 Verenium Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN113789316A (zh) 2006-09-21 2021-12-14 巴斯夫酶有限责任公司 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
WO2008063888A2 (en) 2006-11-22 2008-05-29 Plexxikon, Inc. Compounds modulating c-fms and/or c-kit activity and uses therefor
WO2008079909A1 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Plexxikon, Inc. Pyrrolo [2,3-b] pyridines as kinase modulators
PE20081581A1 (es) * 2006-12-21 2008-11-12 Plexxikon Inc COMPUESTOS PIRROLO[2,3-b]PIRIDINAS COMO MODULADORES DE QUINASA
WO2008080001A2 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Plexxikon, Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
CA2673525C (en) 2006-12-21 2017-12-05 Verenium Corporation Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2674721C (en) 2007-01-30 2018-04-03 Verenium Corporation Enzymes for the treatment of lignocellulosics, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8614089B2 (en) * 2007-03-15 2013-12-24 Chromatin, Inc. Centromere sequences and minichromosomes
EP2129799B1 (en) * 2007-03-19 2012-06-20 Chu Sainte-justine Methods of stratifying adolescent idiopathic scoliosis, isolated nucleic acid molecules for use in same
CN101680887B (zh) 2007-03-30 2014-06-25 褚圣-贾斯汀公司 测定脊柱侧凸风险的方法
EP3196310B1 (en) 2007-04-27 2020-07-08 The Regents of The University of California Plant co2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
US20100190777A1 (en) 2007-07-17 2010-07-29 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
CA2603615A1 (en) * 2007-09-21 2009-03-21 Patrick Labonte Methods of reducing viral infection and kits therefore
WO2009045627A2 (en) 2007-10-03 2009-04-09 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US9273310B2 (en) 2007-10-08 2016-03-01 Synthetic Genomics, Inc. Methods for cloning and manipulating genomes
WO2009052454A2 (en) 2007-10-19 2009-04-23 University Of California Compositions and methods for ameliorating cns inflammation, psychosis, delirium, ptsd or ptss
US20090111184A1 (en) * 2007-10-24 2009-04-30 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Chromosome selection
US20090111764A1 (en) * 2007-10-25 2009-04-30 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Mitochondrial selection
US20090111185A1 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Female genome selection
CA2739011A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 The Regents Of The University Of California Osteoarthritis gene therapy
US8541220B2 (en) 2008-01-03 2013-09-24 Verenium Corporation Isomerases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
JP5563990B2 (ja) 2008-01-03 2014-07-30 ヴェレニウム コーポレイション トランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼ、それらをコードする核酸並びにそれらを製造および使用する方法
WO2009143633A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Institut De Recherches Cliniques De Montreal Pcsk9 inhibitors and methods of use thereof
US8198062B2 (en) 2008-08-29 2012-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8241846B1 (en) 2008-09-08 2012-08-14 Institut De Recherches Cliniques De Montreal Hedgehog pathway modulation and uses thereof for treating, preventing and/or diagnosing cancer
EP2326720B1 (en) 2008-09-15 2018-03-21 F. Hoffmann-La Roche AG Compositions and methods for regulating cell osmolarity
EP2348827B1 (en) 2008-10-27 2015-07-01 Revivicor, Inc. Immunocompromised ungulates
JP5775458B2 (ja) * 2008-11-06 2015-09-09 グレンマーク ファーマシューティカルズ， エセ．アー． 抗α２インテグリン抗体を使用する処置
PT2387627E (pt) 2009-01-15 2016-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp Determinação do perfil de imunidade adaptativa e métodos de geração de anticorpos monoclonais
CR20170089A (es) * 2009-04-03 2017-07-17 Plexxikon Inc Composiciones del acido propano-1--sulfonico {3-[5-(4-cloro-fenil)-1h-pirrolo [2,3-b] piridina-3-carbonil] -2,4-difluoro-fenil}-amida y el uso de las mismas
CN102459303B (zh) 2009-05-21 2016-06-29 巴斯夫酶有限责任公司 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
US8703711B2 (en) * 2009-06-09 2014-04-22 Val-Chum, Limited Partnership Ninjurin-1 modulation and uses thereof
US8293468B2 (en) * 2009-06-10 2012-10-23 Centre Hospitalier De L'université De Montréal MCAM modulation and uses thereof
US9050276B2 (en) 2009-06-16 2015-06-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Autism-associated biomarkers and uses thereof
CA2767724A1 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Chromatin, Inc. Sorghum centromere sequences and minichromosomes
US8329724B2 (en) 2009-08-03 2012-12-11 Hoffmann-La Roche Inc. Process for the manufacture of pharmaceutically active compounds
UA111708C2 (uk) 2009-10-16 2016-06-10 Бандж Ойлз, Інк. Спосіб рафінування олії
UA109884C2 (uk) 2009-10-16 2015-10-26 Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування
NZ599866A (en) 2009-11-06 2014-09-26 Plexxikon Inc Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
JP5972176B2 (ja) 2010-02-23 2016-08-17 サノフイ 抗アルファ２インテグリン抗体及びそれらの使用
JP2013520989A (ja) 2010-03-05 2013-06-10 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド ゲノムのクローニングおよび操作のための方法
WO2012045176A1 (en) 2010-10-04 2012-04-12 Chu Sainte-Justine Biomechanical-based methods of diagnosing scoliosis
BR112013008347A2 (pt) 2010-10-06 2016-06-14 Bp Corp North America Inc polipeptídeos de variantes cbh i
MA34948B1 (fr) 2011-02-07 2014-03-01 Plexxikon Inc Composes et procedes de modulation de kinase, et leurs indications
TWI558702B (zh) 2011-02-21 2016-11-21 普雷辛肯公司 醫藥活性物質的固態形式
US9289513B2 (en) 2011-03-23 2016-03-22 Option Pharmaceuticals, Llc Targeted cytokine for treatment of musculoskeletal diseases
RU2631487C2 (ru) 2011-05-17 2017-09-22 Плексксикон Инк. Модуляция киназ и показания к её применению
WO2013070807A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 The Regents Of The University Of Califonia Niche targeting of quiescent cancer stem cells
BR112014020127A2 (pt) 2012-02-14 2020-06-30 The Regents Of The University Of Calefornia métodos para tratamento, melhoramento ou proteção (prevenção) de um indivíduo ou um paciente, e de uma disfunção, uma doença, uma infecção ou uma condição, e, método para suprimir o ganho de peso, ou suprimir o apepite, ou estimular ou iniciar a perda de peso
US10039777B2 (en) 2012-03-20 2018-08-07 Neuro-Lm Sas Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders
US9150570B2 (en) 2012-05-31 2015-10-06 Plexxikon Inc. Synthesis of heterocyclic compounds
HU230368B1 (hu) 2012-11-16 2016-03-29 Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Kutatóközpont Új módszer az emlős mesterséges kromoszóma több génnel való feltöltésére
CA2910553A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Universite De Montreal Novel biomarkers for acute myeloid leukemia
CA2914209A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Alain Moreau New markers for severe progression of idiopathic scoliosis and uses thereof to stratify scoliotic patients and predict the risk of developing scoliosis
CA2914213A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Alain Moreau A method of increasing gipcr signalization in the cells of a scoliotic subject
US20160139146A1 (en) 2013-06-17 2016-05-19 Chu Sainte-Justine Gi protein phosphorylation as marker for scoliosis and scoliosis progression, methods of increasing gipcr signaling in scoliotic subjects
EP3044321B1 (en) 2013-09-09 2019-07-31 Chu Sainte-Justine New marker for the classification, diagnosis and treatment of scoliosis
JP2015119643A (ja) * 2013-12-20 2015-07-02 国立研究開発法人産業技術総合研究所 人工染色体ベクター及び形質転換哺乳類細胞
US20170182129A1 (en) 2014-04-03 2017-06-29 The Regents Of The University Of California Systemic delivery of virus vectors encoding urocortin-2 and related genes to treat diabetes-related cardiac dysfunctions and congestive heart failure
CN107406843A (zh) * 2015-02-09 2017-11-28 爱德华·珀金斯 用于实时监测哺乳动物合成染色体的构建和生物工程化的组合物和方法
WO2016164641A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
GB2538321A (en) * 2015-05-15 2016-11-16 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Artificial chromosome for retroviral production
GB2538324A (en) * 2015-05-15 2016-11-16 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Packaging cell line for retroviral production
US10519239B2 (en) 2015-05-28 2019-12-31 Institut National De La Recherche Scientifique Inhibitors of prototypic galectin dimerization and uses thereof
US10829484B2 (en) 2015-07-28 2020-11-10 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
SG11201804711RA (en) 2015-12-07 2018-07-30 Plexxikon Inc Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
US20190345259A1 (en) 2016-04-12 2019-11-14 Synploid Biotek, Llc Methods for creating synthetic chromosomes having gene regulatory systems and uses thereof
CN117568371A (zh) 2016-04-12 2024-02-20 辛普洛德生物技术有限责任公司 使用单个可选择标志物顺序装载多于一个递送载体
AU2017249321A1 (en) 2016-04-12 2018-11-22 CarryGenes Bioengineering Methods for creating synthetic chromosomes expressing biosynthetic pathways and uses thereof
CN106148520A (zh) * 2016-07-06 2016-11-23 西北工业大学 Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用
TW201815766A (zh) 2016-09-22 2018-05-01 美商普雷辛肯公司 用於ｉｄｏ及ｔｄｏ調節之化合物及方法以及其適應症
CA3046509A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Synploid Biotek, Llc Methods of cell renewal
AU2017395023B2 (en) 2016-12-23 2022-04-07 Plexxikon Inc. Compounds and methods for CDK8 modulation and indications therefor
WO2018226846A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation
WO2019046446A2 (en) 2017-08-29 2019-03-07 San Diego State University (SDSU) Foundation, dba San Diego State University Research Foundation COMPOSITIONS AND METHODS USING METHANOTROPHE LAYER PROTEINS FOR THE EXPRESSION OF HETEROLOGOUS PROTEINS
CA3073321A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Synploid Biotek, Llc Lineage reporter synthetic chromosomes and methods of use
WO2024064338A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Agilent Technologies, Inc. Anti-human icos antibodies for use in immunohistochemistry (ihc) protocols and for diagnosing cancer

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873191A (en) * 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
NL8200523A (nl) * 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US4476004A (en) * 1983-04-08 1984-10-09 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4441972A (en) * 1983-04-08 1984-04-10 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4806476A (en) * 1983-09-08 1989-02-21 Lovelace Medical Foundation Efficient cell fusion process
US4608339A (en) * 1983-10-25 1986-08-26 Yoakum George H Protoplast fusion method for high-frequency DNA transfection in human cells
FR2569723B1 (fr) * 1984-08-31 1986-09-19 Centre Nat Rech Scient Application des antibiotiques de la famille des phleomycines a titre d'agent de selection dans le domaine du genie genetique
US4686186A (en) * 1984-09-26 1987-08-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant vector and eukaryotic host transformed thereby
US5223263A (en) * 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
US4970162A (en) * 1985-11-13 1990-11-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human-mouse hybrid cell line expressing monocyte-macrophage properties
US4935350A (en) * 1985-11-18 1990-06-19 Amgen Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability
FR2593827B1 (fr) * 1986-01-31 1989-12-22 Inst Nat Sante Rech Med Fragments d'adn utilisables dans des vecteurs pour le maintien hereditaire de genes etrangers a l'etat autonome dans des animaux transgeniques, procede pour leur obtention et applications biologiques
US4784737A (en) * 1986-04-18 1988-11-15 The United States Department Of Energy Electromicroinjection of particles into living cells
US4906576A (en) * 1986-05-09 1990-03-06 Electropore, Inc. High speed, high power apparatus for vesicle prealignment, poration, loading and fusion in uniform electric fields and method therefor
US4923814A (en) * 1986-05-09 1990-05-08 Electropore, Inc. High speed, high power apparatus for vesicle prealignment, poration, loading and fusion in uniform electric fields and method therefor
US5215914A (en) * 1986-06-18 1993-06-01 American Registry Of Pathology Adherent and invasive mycoplasma
US5364761A (en) * 1986-07-24 1994-11-15 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Method for isolating a DNA encoding an autonomously replicating sequence
EP0254315B1 (en) * 1986-07-24 1996-03-27 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Mammalian cell derived autonomously replicating sequence DNA fragments having affinity to DNA binding proteins
US5071773A (en) * 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US4997764A (en) * 1987-04-23 1991-03-05 New York University Transformation of human B-lympocytes with Epstein Barr virus and c-myc containing vectors
US5063162A (en) * 1987-04-24 1991-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Process for isolating nucleic acids utilizing protease digestion
CA1297431C (en) * 1987-04-24 1992-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the isolation of nucleic acids
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
DE68925030T2 (de) * 1988-01-21 1996-07-25 Massachusetts Inst Technology Molekültransport durch gewebe mit der verwendung von elektroporation.
US4955378A (en) * 1988-05-02 1990-09-11 University Of South Florida Apparatus and methods for performing electrofusion at specific anatomical sites
EP0350052A3 (en) * 1988-07-06 1991-04-03 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Transgenic animals transformed with autonomously replicating sequence-containing plasmid
US5162215A (en) * 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
GB8823068D0 (en) * 1988-09-30 1988-11-09 Ici Plc Recombinant dna
CA2006011A1 (en) * 1988-12-21 1990-06-21 Cecilia Lo Transgenic organisms and cells and methods of producing transgenic organisms and cells
US5144019A (en) * 1989-06-21 1992-09-01 City Of Hope Ribozyme cleavage of HIV-I RNA
US5272262A (en) * 1989-06-21 1993-12-21 City Of Hope Method for the production of catalytic RNA in bacteria
DK168302B1 (da) * 1989-06-29 1994-03-07 Danisco Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller
US5501967A (en) * 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
GB8918226D0 (en) * 1989-08-09 1989-09-20 Wellcome Found Dna assays
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
US5434086A (en) * 1989-08-22 1995-07-18 The Regents Of The University Of Michigan Method of testing potential cystic fibrosis treating compounds using cells in culture
US5149796A (en) * 1989-08-31 1992-09-22 City Of Hope Chimeric DNA-RNA catalytic sequences
DE69033911D1 (de) * 1989-10-24 2002-03-14 Chiron Corp System zur freisetzung von infektiösen proteinen
US5292658A (en) * 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
US5436392A (en) * 1990-01-12 1995-07-25 Arizona Technology Development Corporation Transgenic plants expressing M. sexta protease inhibitor
CA2042093C (en) * 1990-05-09 2002-12-24 Gyula Hadlaczky Cell line carrying an excess of mammalian centromeres
US5269590A (en) * 1990-05-21 1993-12-14 Carilli Brian D Multi-layer high impact seating
US5470730A (en) * 1990-09-28 1995-11-28 Immunex Method for producing TH -independent cytotoxic T lymphocytes
US5382524A (en) * 1990-10-24 1995-01-17 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-n-acetylgalactosaminidase
DE69129897T2 (de) * 1990-10-25 1998-12-17 Clague Pitman Hodgson Methode des gentransfers mittels retrotransposons
US5461032A (en) * 1991-03-01 1995-10-24 Fmc Corporation Insecticidally effective peptides
ES2162796T3 (es) * 1991-03-11 2002-01-16 Syngenta Ltd Proteinas biocidas.
US5240840A (en) * 1991-04-05 1993-08-31 Regents Of The University Of Michigan Dna superfragment cloning
US5468634A (en) * 1991-06-24 1995-11-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Axl oncogene
US5358866A (en) * 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5288625A (en) * 1991-09-13 1994-02-22 Biologic Research Center Of The Hungarian Academy Of Sciences Mammalian artificial chromosomes
WO1993008270A1 (en) * 1991-10-15 1993-04-29 Agracetus, Inc. Particle-mediated transformation of mammalian unattached cells
US5260191A (en) * 1992-01-30 1993-11-09 Agracetus, Inc. Method for diagnosing tumors
US5266600A (en) * 1992-02-28 1993-11-30 Bristol-Myers Squibb Company BU-4641V, an antibacterial, antiviral and antitumor antibiotic
JP3314241B2 (ja) * 1992-04-06 2002-08-12 ヤマハ発動機株式会社 自動二輪車用エンジンの排気浄化装置
US5501662A (en) * 1992-05-22 1996-03-26 Genetronics, Inc. Implantable electroporation method and apparatus for drug and gene delivery
EP0578627A1 (en) * 1992-07-09 1994-01-12 Monsanto Company Virus resistant plants
US5453357A (en) * 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5449604A (en) * 1992-10-21 1995-09-12 University Of Washington Chromosome 14 and familial Alzheimers disease genetic markers and assays
IL108707A (en) * 1993-02-19 1999-06-20 Weiner David B Pharmaceutical compositions and diagnostic kits containing RPH protein or RPV-binding proteins
US5496731A (en) * 1993-03-25 1996-03-05 Xu; Hong-Ji Broad-spectrum tumor suppressor genes, gene products and methods for tumor suppressor gene therapy
WO1994023049A2 (en) * 1993-04-02 1994-10-13 The Johns Hopkins University The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals
FR2703996B1 (fr) * 1993-04-16 1995-07-21 Transgene Sa Ensemble de transposition destine au transfert d'un gene d'interet dans le genome d'une cellule eucaryote.
AU7177494A (en) * 1993-06-25 1995-01-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Pore-forming and superantigen encoding toxin cassettes for gene therapy
US5468615A (en) * 1993-07-01 1995-11-21 The Upjohn Company Binding assay employing a synthetic gene for D4 dopamine receptors
US5413914A (en) * 1993-07-07 1995-05-09 The Regents Of The University Of Colorado Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases
JPH09509046A (ja) * 1993-11-29 1997-09-16 ユニヴァーシティ オブ サウス フロリダ トランスジェニックマウス
JPH09508267A (ja) * 1994-01-19 1997-08-26 ザ ウェルカム トラスト リミテッド アズ トラスティー トゥー ザ ウェルカム トラスト 自然抵抗性結合マクロファージタンパク質およびその使用法
US5457182A (en) * 1994-02-15 1995-10-10 Merck & Co., Inc. FK-506 cytosolic binding protein, FKBP12.6
US5635376A (en) * 1994-04-29 1997-06-03 The Regents Of The University Of Michigan Method for purifying chromosomes and hybrid muntjac cell lines containing foreign chromosomes
GB9410446D0 (en) * 1994-05-25 1994-07-13 Cancer Res Campaign Tech Novel chromosome fragment
US6348353B1 (en) * 1995-06-07 2002-02-19 Case Western Reserve University Artificial mammalian chromosome
GB9517779D0 (en) * 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517780D0 (en) * 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
WO1997016533A1 (en) * 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
WO1998008964A1 (en) * 1996-08-26 1998-03-05 Tsuneko Okazaki Mammalian artificial chromosomes
CN1113099C (zh) * 1996-10-26 2003-07-02 湖南医科大学 用于基因治疗的新的载体

Also Published As

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