CN107406843A - 用于实时监测哺乳动物合成染色体的构建和生物工程化的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括允许人们经由标准化荧光技术实时监测合成染色体的形成的组合物和方法，消除了对繁杂、昂贵和可能的诱变分析的需要。

Description

用于实时监测哺乳动物合成染色体的构建和生物工程化的组 合物和方法

相关申请的交叉引用

本国际PCT专利申请要求于2016年2月9日提交的美国优先权专利申请第62/113,707号的权益。

关于政府支持的声明

本发明根据由DARPA授予的合同D15PC00008在政府支持下进行。政府在本发明中具有一定权利。

发明领域

本发明的领域包括允许人们经由标准化显微术实时监测合成染色体的产生的组合物和方法。

发明背景

在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文包含的任何内容不得被解释为对现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当的情况下证明，根据可适用的法定条文本文引用的文章和方法不构成现有技术的权利。

生成全功能哺乳动物合成染色体的能力代表了用于以下的强大系统：基于细胞的遗传紊乱矫正、转基因动物中重组蛋白的产生、多种细胞类型以及人类疾病的动物模型中大的人类基因的调控和表达分析、减数分裂和染色体结构的研究、指导细胞分化和去分化、诱导的多能干细胞的形成、创建新型自分泌和旁分泌细胞通信网络、创建能够进行多个编码的因子的化学计量的产生的多表达系统、生物电路的产生、能够探测核结构的DNA元件的插入和下游用于使用核结构中发现的相互作用调控基因组表达的用途，以及大的DNA元件的操作，诸如但不限于染色体臂交换到合成染色体上或将多个大的DNA元件掺入到合成染色体上。

全功能哺乳动物合成染色体提供了超过基于病毒的递送系统的几个优势，包括增加的有效负载(payload)尺寸、染色体外维持的事实避免了潜在的宿主细胞破坏、引入的基因的转录沉默和可能的免疫学并发症的避免以及哺乳动物合成染色体可以源自合成染色体待被插入到其中的物种并针对该物种进行定制。然而，虽然已经证明了哺乳动物合成染色体的成功产生，但成功的染色体产生的证实需要大量的筛选时间和努力来鉴定和表征感兴趣的合成染色体。合成染色体产生过程事实上是无从知晓的。因此，在本领域中对允许人们在新的合成染色体正在生成时实时跟踪该新的合成染色体的产生的组合物和方法存在需求。本发明提供了解决该需求的方法和组合物。

发明概述

提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势从以下撰写的详述包括附图中阐明的和所附的权利要求中限定的那些方面将是明显的。

在一些实施方案中，本发明提供了一种用于筛选合成染色体的产生的方法，所述方法包括：构建包含内源染色体标签和合成染色体标签的合成染色体产生报告物细胞系(asynthetic chromosome production reporter cell line)，其中内源染色体标签和合成染色体标签变为稳定地整合到合成染色体产生报告物细胞系基因组中；用合成染色体产生组分转染合成染色体产生报告物细胞系；以及监测合成染色体产生报告物细胞系中合成染色体的产生。

在又其他实施方案中，本发明提供了一种用于筛选合成染色体的产生的方法，所述方法包括：提供合成染色体产生报告物细胞系；用合成染色体产生组分和内源染色体标签和合成染色体标签转染合成染色体产生报告物细胞系，其中内源染色体标签和合成染色体标签变为稳定地整合到合成染色体中；以及监测合成染色体产生报告物细胞系中合成染色体的产生。

在仍然其他实施方案中，本发明提供了一种用于筛选合成染色体的产生的方法，所述方法包括：构建包含内源染色体标签的合成染色体产生报告物细胞系，其中内源染色体标签变为稳定地整合到合成染色体产生报告物细胞系基因组中；用合成染色体产生组分和合成染色体标签转染合成染色体产生报告物细胞系，其中合成染色体标签变为稳定地整合到合成染色体中；以及监测合成染色体产生报告物细胞系中合成染色体的产生。

在又其他实施方案中，本发明提供了一种用于筛选合成染色体的产生的方法，所述方法包括：构建包含合成染色体标签的合成染色体产生报告物细胞系，其中合成染色体标签变为稳定地整合到合成染色体产生报告物细胞系基因组中；用合成染色体产生组分和内源染色体标签转染合成染色体产生报告物细胞系，其中内源染色体标签变为稳定地整合到合成染色体中；以及监测合成染色体产生报告物细胞系中合成染色体的产生。

在以上提及的实施方案的一些方面，存在于报告物细胞系中的内源染色体的臂包含和与合成染色体中的重组位点相互作用兼容的重组位点。

同样在以上提及的实施方案的一些方面，内源染色体标签和合成染色体标签的标签为荧光标签，并且监测步骤通过荧光显微术进行。在该方面的一些配置中，荧光标签选自TagBFP、TagCFP、TagGFP2、TagYFP、TagRFP、FusionRed、mKate2、TurboGFP、TurboYFP、TurboRFP、TurboFP602、TurboFP635、TurboFP650、AmCyanl、AcvGFPl、ZsGreenl、ZsYellowl、mBanana、mOrange、mOrange2、DsRed-Express2、EsRed-Express、tdTomato、DsRed-Monomer、DsRed2、AsRed2、mStrawberry、mCherry、HcRedl、mRaspberry、E2-Crimson、mPlum、Dendra2、Timer和PAmCherry、HALO-标签或红外位移的荧光蛋白(infrared-shifted fluorescentproteins)。

在以上提及的实施方案的其他方面，内源染色体标签和合成染色体标签的标签为化学发光标签并且监测步骤通过化学发光显微术进行，或为磷光标签并且监测步骤通过磷光显微术进行。

在以上提及的实施方案的一些方面，内源染色体标签包含对组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4或H5特异性的标志物，并且合成染色体标签包含已经针对已知序列的数据库进行筛选的4ⁿ个核苷酸。

在以上提及的实施方案的一些方面，合成染色体产生报告物细胞系选自哺乳动物细胞系、胚胎细胞系、多能细胞系、成体来源的干细胞、重编程细胞系或人类细胞系，并且在优选的方面，合成染色体产生报告物细胞系为人类细胞系HT1080。

在本发明的实施方案的一些方面，将合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由自上而下方法(a top down approach)产生合成染色体；在其他方面，将合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由自下而上方法(abottom up approach)产生合成染色体；在又其他方面，将合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由天然存在的微型染色体的工程化产生合成染色体；并且在优选的方面，将合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由通过染色体区段的靶向扩增的从头染色体生成(de novo chromosome generation)来产生合成染色体，并且在该方面的一个优选的方法中，染色体区段为染色体的臂间区域。

在以上提及的实施方案的一些方面，内源染色体标签包括多个内源染色体标签。

在以上提及的实施方案的一些方面，内源染色体标签为融合蛋白、核酸/蛋白嵌合体、核酸/蛋白复合物(诸如RNA/CRISPR-CAS9)或包含对内源染色体特异性的TALEN蛋白和荧光或磷光标记物的部分，且合成染色体标签为核酸/蛋白嵌合体。

本发明还提供了一种合成染色体产生报告物细胞系，所述合成染色体产生报告物细胞系包含内源染色体标签和合成染色体标签，其中所述内源染色体标签和合成染色体标签被稳定地掺入到合成染色体产生报告物细胞系的基因组中。

另外，本发明还提供了一种由合成染色体产生细胞系产生的合成染色体，以及一种通过本发明的方法实时监测其产生的合成染色体。

本发明的这些及其他方面和用途将在详述中描述。

附图简述

图1为用于创建用于实时跟踪新的合成染色体的产生的系统的方法步骤的简化流程图。在该实施方案中，跟踪系统的组分被整合到产生细胞系的内源基因组中。

图2为用于创建用于实时跟踪新的合成染色体的产生的可选系统的方法步骤的简化流程图。在该实施方案中，跟踪系统的组分被整合到合成染色体中，并且因此与合成染色体共转入(co-ported)到产生细胞系中。

图3为用于创建用于实时跟踪新的合成染色体的产生的又另一个可选系统的方法步骤的简化流程图。在该实施方案中，跟踪系统的一个组分被整合到合成染色体中，且跟踪系统的一个组分被整合到产生细胞系的内源基因组中。

图4为用于监测“染色体臂”从内源基因组交换至合成染色体的方法步骤的简化流程图。

图5示出了在合成染色体产生细胞系中创建合成染色体的一个示例性过程(在这种情况下，经由通过特定染色体区段的靶向扩增的诱导的从头染色体生成)的细节，该过程通过本发明的方法监测。

图6示出了内源染色体特异性标签载体、合成染色体特异性标签载体和组合的内源和合成染色体特异性载体的简化构建体。

图7示出了使用本发明的方法的实时合成染色体产生的时间线。

图8为使用CRISPR/Cas荧光可视化系统用于监测、分离和/或纯化合成染色体的图形表示。

图9为使用两种不同的CRISPR/Cas荧光可视化系统用于监测、分离和/或纯化合成染色体的图形表示。

图10为使用两种不同的CRISPR/Cas荧光可视化系统用于监测内源染色体与合成染色体之间的染色体臂交换的图形表示。

发明详述

除非另有指示，本文描述的方法可以采用分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和细胞工程化技术的常规技术和描述，其全部都在本领域技术人员的技术内。此类常规技术包括寡核苷酸合成、寡核苷酸的杂交和连接、细胞的转化和转导、重组系统的工程化、转基因动物和植物的创建以及人类基因疗法。合适的技术的具体的说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然也可使用等效的常规程序。此类常规技术和描述可以见于诸如以下的标准实验室手册中：Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)(Green,等，编著，1999)；Genetic Variation:A Laboratory Manual(Weiner，等，编著，2007)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2006)；以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2002)(所有都来自冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress))；Protein Methods(Bollag等，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors forGene Therapy(Wagner等编著，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy，编著，Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(Lefkovits编著，AcademicPress 1997)；Gene Therapy Techniques,Applications and Regulations FromLaboratory to Clinic(Meager，编著，John Wiley&Sons1999)；M.Giacca,Gene Therapy(Springer 2010)；Gene Therapy Protocols(LeDoux，编著，Springer 2008)；Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths，编著，John Wiley&Sons1998)；Mammalian Chromosome Engineering-Methods and Protocols(G.Hadlaczky，编著，Humana Press 2011)；Essential Stem Cell Methods,(Lanza和Klimanskaya，编著，Academic Press 2011)；Stem Cell Therapies:Opportunities forEnsuring the Quality and Safety of Clinical Offerings:Summary of a JointWorkshop(Board on Health Sciences Policy,National Academies Press 2014)；Essentials of Stem Cell Biology，第3版(Lanza和Atala，编著，Academic Press 2013)；以及Handbook of Stem Cells,(Atala和Lanza，编著，Academic Press 2012)，其全部都出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在描述本发明的组合物、研究工具和方法之前，应当理解本发明不局限于描述的特定的方法、组合物、目标和用途，因为这些当然可变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。

应当注意，除非上下文另有明确指示，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“组合物”指一种组合物或更多种组合物的混合物，并且提及“测定”包括提及本领域技术人员已知的等效步骤和方法，等等。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，用于描述和公开在出版物中描述并且可与本文描述的发明关联使用的装置、制剂和方法的目的。

在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每一个居间值以及在该规定的范围中的任何其他规定的值或居间值被包括在本发明内。服从于规定的范围中的任何特定排除的限值，这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内。在规定的范围包括上限和下限两者的情况下，排除那些包括的限值的仅一个的范围也被包括在本发明内。

在以下的描述中，阐述许多具体细节，以便提供对本发明的更彻底的理解。然而，对于本领域普通技术人员在阅读本说明书后将明显的是，本发明可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下被实践。在其他情况下，为了避免使本发明晦涩，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。

定义

除非明确规定，本文使用的术语意图具有如由本领域普通技术人员所理解的一般且普通的含义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并不意图改变或以其他方式限制此类术语的含义，除非特别地指示。

如本文使用的“结合”(例如，提及多肽的核酸结合结构域)指多肽与核酸之间的非共价相互作用。当处于非共价相互作用的状态中时，多肽和核酸被认为是“缔合的”、“相互作用”或“结合”。结合相互作用通常通过小于10^-6M至小于10^-15M的解离常数(Kd)来表征。“亲和力”指结合强度，增加的结合亲和力与较低的Kd相关。

“结合结构域”意指能够非共价结合另一分子的多肽或蛋白结构域。结合结构域可以结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。

“着丝粒”为赋予染色体通过细胞分裂分离至子细胞的能力的任何核酸序列。着丝粒可以通过有丝分裂和减数分裂赋予核酸序列(包括包含着丝粒的合成染色体)的稳定分离。着丝粒不必然需要源自与其被引入的细胞相同的物种，但优选地，着丝粒具有在该物种的细胞中促进DNA分离的能力。“双着丝粒(dicentric)”染色体为包含两个着丝粒的染色体。“前双着丝粒染色体(formerly dicentric chromosome)”为当双着丝粒染色体片段化时产生的染色体。“染色体”为在细胞分裂时能够在细胞中复制和分离的核酸分子和缔合的蛋白。通常，染色体包含着丝粒区域、复制起点、端粒区域及着丝粒区域与端粒区域之间的核酸区域。“近端着丝粒染色体(acrocentric chromosome)”指具有不等长度的臂的染色体。

“编码序列”或“编码”肽的序列为当被置于适当的控制序列的控制下时体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界通常由在5’(氨基)端处的起始密码子和在3’(羧基)端处的翻译终止密码子确定。

术语DNA“控制序列”共同地指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、增强子等，它们共同地提供受体细胞(recipient cell)中的编码序列的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。

“内源染色体”指在产生或引入合成染色体之前在细胞中发现的染色体。

如本文使用的，“常染色质”指弥散地(diffusely)染色并通常包含基因的染色质，且“异染色质”指保持异常凝聚并被认为是转录不活跃的染色质。高度重复的DNA序列(卫星DNA)通常位于着丝粒周围的异染色质区域。

术语“异源DNA”或“外来(foreign)DNA”(或“异源RNA”或“外来RNA”)可互换使用，并且指不是天然地作为它存在于其中的基因组的一部分存在的DNA或RNA，或者在不同于它在自然界中存在的位置的一个位置或更多个位置和/或以不同于它在自然界中存在的量的量在基因组或细胞中发现的DNA或RNA。异源DNA的实例包括，但不限于，编码感兴趣的一种基因产物或更多种基因产物的DNA。异源DNA的其他实例包括，但不限于，编码可跟踪标志物蛋白的DNA以及调控DNA序列。

“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以执行它们的通常功能的元件的布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响该编码序列的表达。只要控制序列起作用以指导编码序列的表达，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，居间的非翻译但转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，此类序列不必位于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有导致改变的调控的相互作用。

“启动子”或“启动子序列”为能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、核仁核小RNA(small nuclear of nucleolar RNA)或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区域。

“识别序列”为蛋白、DNA或RNA分子或其组合(诸如，但不限于，限制性内切核酸酶、修饰甲基化酶或重组酶)识别并结合的特定核苷酸序列。例如，Cre重组酶的识别序列为包含位于8个碱基对核心侧翼的两个13个碱基对反向重复序列(作为重组酶结合位点)的34个碱基对序列并被指定为loxP(参见，例如，Sauer,Current Opinion in Biotechnology,5:521-527(1994))。识别序列的其他实例包括，但不限于，由重组酶噬菌体λ整合酶识别的attB和attP、attR和attL等等。指定为attB的重组位点为包含两个9个碱基对核心型Int结合位点和7个碱基对重叠区域的约33个碱基对序列；attP为包含核心型Int结合位点和臂型Int结合位点以及用于辅助蛋白IHF、FIS和Xis的位点的约240个碱基对序列(参见，例如，Landy,Current Opinion in Biotechnology,3:699-7071(1993))。

“重组酶”为催化DNA区段在特定重组位点处交换的酶。整合酶指通常源自病毒或转座子以及可能的古老病毒的重组酶。“重组蛋白”包括使用一个或更多个重组位点参与重组反应的切除蛋白(excisive protein)、整合蛋白、酶、辅因子和相关蛋白(参见，Landy,Current Opinion in Biotechnology,3:699-707(1993))。本文方法中使用的重组蛋白可以经由在适当的载体诸如质粒等上的表达盒递送至细胞。在其他实施方案中，重组蛋白可以以在用于递送期望核酸的同一反应混合物中的蛋白形式递送至细胞。在又其他实施方案中，重组酶也可以在细胞中编码并且使用严格控制的诱导型启动子根据需要进行表达。

“核糖体RNA”(rRNA)为形成核糖体结构的部分并参与蛋白合成的专门RNA。核糖体RNA由基因的转录产生，所述基因在真核细胞中以多个拷贝存在。在人类细胞中，每单倍体基因组约250个拷贝的rRNA基因(即，编码rRNA的基因)以簇的形式分散在至少五个不同染色体(染色体13、14、15、21和22)上。在人类细胞中，多个拷贝的高度保守的rRNA基因位于串联排列的rDNA单元系列中，所述串联排列的rDNA单元系列通常长度为约40-45kb，并且包含转录区域和称为间隔区(即，基因间的间隔区)DNA的非转录区域，所述间隔区(即，基因间的间隔区)DNA的长度和序列可以变化。

如本文使用的，术语“可选择标志物(selectable marker)”指引入到细胞，特别地在本发明的上下文中，引入到培养物中的细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的可选择标志物为本领域普通技术人员熟知的。在优选的实施方案中，用于在人类合成染色体系统中使用的可选择标志物在人类中应该是非免疫原性的，并且包括，但不限于：人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；荧光MTX底物可用)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；荧光底物可用)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的耐受性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂(alkylator)白消安缀合；CD34⁺细胞中的化学保护性可选择标志物)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰基乙酰基-L-天冬氨酸(N-phosphonacetyl-L-aspartate；PALA)的耐受性的人类CAD基因；人类多药耐受性-1(MDR-1；通过增加的药物耐受性可选择或通过FACS富集的P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；通过Mab-FITC可检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；通过卡莫司汀可选择)；和胞苷脱氨酶(CD；通过Ara-C可选择)。还可以采用药物可选择标志物诸如嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素、G418、四环素。另外，使用FAC分选，如化学发光标志物(例如Halo标签)等可用于阳性选择一样，任何荧光标志物基因可以用于阳性选择。连接至可以结合磁珠或表面以分离或富集感兴趣的细胞的部分的细胞表面蛋白为另外的选择标志物机制。

“位点特异性重组”指在单个核酸分子上的两个特定位点之间或在两个不同分子之间的需要外源蛋白诸如整合酶或重组酶存在而起作用的位点特异性重组。某些位点特异性重组系统可以用于特异性缺失、倒位或插入DNA，其中精确事件由特定位点的取向、特定系统和辅助蛋白或因子的存在控制。另外，DNA区段可以在染色体之间交换，如图4中描述的(染色体臂交换)。

“合成染色体”(也称为“人工染色体”)为可以在具有适应和表达异源基因的能力的细胞中与内源染色体一起稳定复制和分离的核酸分子，通常为DNA。“哺乳动物合成染色体”指具有活性哺乳动物着丝粒的染色体。“人类合成染色体”指包含在人类细胞中起作用的着丝粒并且优选地在人类细胞中产生的染色体。对于示例性人工染色体，参见，例如，美国专利第8,389,802号；第7,521,240号；第6,025,155号；第6,077,697号；第5,891,691号；第5,869,294号；第5,721,118号；第5,712,134号；第5,695,967号；和第5,288,625号以及公布的国际PCT申请第WO 97/40183号和第WO 98/08964号。

术语“受试对象”、“个体”或“患者”可以在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，并且在一些实施方案中指人类。

“载体”为可以附接另一个DNA区段的复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒构建体、粘粒、细菌人工染色体、P-1来源的人工染色体或酵母人工染色体。在一些情况下，载体可以为染色体，诸如在从被工程化为包含重组位点的一个内源染色体臂交换至合成染色体的情况下。载体用于在细胞中转导和表达DNA区段。

本发明

本发明包括允许人们经由标准化显微术诸如荧光显微术或通过其他视觉方法实时监测合成染色体的形成的组合物和方法，消除了对繁杂、昂贵和可能的诱变分析的需要。在本发明之前，合成染色体的产生事实上是无从知晓的，其中新的合成染色体的产生不能够被实时跟踪，并且成功仅在药物耐受性细胞集落被克隆、扩繁并经由低通量方法诸如荧光原位杂交(FISH)筛选大量克隆被测定之后才可被衡量。

本发明的组合物和方法的优点包括1)合成染色体产生可以经由标准化荧光显微术(或其他视觉手段)被实时监测，允许快速消除无效克隆(abortive clone)(即，不产生合成染色体的药物耐受性集落)；2)减少或消除了对测试染色体形成的定期FISH分析的需要；3)系统可以被用于测试用于合成染色体生成的组分，并且测试组分的化学计量可以被评价，导致合成染色体产生的优化；4)该系统提供可测定的格式，允许筛选控制或增强合成染色体产生的潜在小分子化合物；5)减少或消除对在基于流式细胞术的分选、分离和转移期间用于鉴定合成染色体的潜在诱变染料的需要；以及6)筛选步骤的减少或消除降低了所需试剂的成本以及表征合成染色体所花费的时间。例如，Lindenbaum和Perkins等，NucleicAcid Research,32(21):el72(2004)描述了基于哺乳动物卫星DNA的人工染色体表达(ACE)系统的产生。在该系统中，新的合成染色体不能够被实时跟踪，且成功仅在药物耐受性细胞集落被克隆、扩繁并经由荧光原位杂交(FISH)筛选大量克隆被测定之后才可被衡量，其花费约3个月。本发明允许人们减少或完全消除重复的FISH分析，其花费至少四天来进行。

用于实时监测合成染色体产生的本发明的组合物和方法适用于合成染色体产生的所有方法，包括“自上而下”方法、“自下而上”方法、天然存在的微型染色体的工程化以及通过特定染色体区段的靶向扩增的诱导的从头染色体生成(所有这些都在下文中更详细地讨论)。

图1为用于创建用于实时跟踪新的合成染色体的产生的系统的一个实施方案的方法步骤的简化流程图。在方法100中的第一步101为构建其中产生合成染色体的合成染色体产生报告物细胞系。合成染色体产生报告物细胞系的构建基本上需要稳定地转化细胞系以表达至少两个定义的标签：对染色体工程化报告物细胞系中的内源染色体特异性的一个标记的标签，以及对在待产生的合成染色体上的序列特异性的一个不同地标记的标签(即，“顺式内源染色体(cis endogenous chromosome)”系统，其中标签由报告物细胞系中的内源染色体编码)。用于构建合成染色体产生报告物细胞系的方法和标签将取决于细胞源自其的物种和待产生的合成染色体上的标签互补物而不同。

第二步103为用适于合成染色体产生的组分转染或转化在步骤101中构建的合成染色体产生报告物细胞系。适当的组分将取决于所采用的染色体产生的方法(即，方法是否为“自上而下”、“自下而上”、微型染色体的工程化或从头染色体生成)以及选择的用于将遗传有效负载工程化到合成染色体中的系统而变化。

最后，第三步105为经由例如荧光显微术或其他视觉手段分析和跟踪内源染色体特异性标签和合成染色体特异性标签来实时监测合成染色体的产生。内源染色体特异性标签允许人们评价内源染色体群体以确保合成染色体产生报告物细胞系的“健康”，并且合成染色体特异性标签允许人们评价合成染色体的形成和持续存在。另外，如果合成染色体特异性标签对合成染色体上的位点特异性整合序列(接纳位点(acceptor site))是特异性的，则来自标记的标签的信号间接地为接纳位点的数目的度量。

图2阐明了本发明的组合物和方法的可选实施方案。如同图1，图2为用于创建用于实时跟踪新的合成染色体的产生的系统的一个实施方案的方法步骤的简化流程图。在方法200中的第一步201为选择其中产生合成染色体的合成染色体产生细胞系。应当注意，在先前的实施方案中的情况下，报告物细胞系被构建为表达两个定义的报告物标签(“顺式内源染色体”)，在该可选实施方案中，合成染色体产生细胞系不表达报告物标签；而是，合成染色体被工程化为表达报告物标签(即，“顺式合成染色体(cis synthetic chromosome)”，其中标签由合成染色体编码)。

第二步203为用适于合成染色体产生的组分转染在步骤201中构建的合成染色体产生细胞系。如关于第一个实施方案所讨论的，适当的组分将取决于所采用的染色体产生的方法(即，方法是否为“自上而下”、“自下而上”、微型染色体的工程化或从头染色体生成)以及选择的用于将遗传有效负载工程化到合成染色体中的系统而变化。然而，与第一个实施方案相对，在该可选实施方案中，合成染色体被工程化为表达两个报告物标签：对合成染色体产生细胞系中的内源染色体特异性的一个标记的标签，以及对在待产生的合成染色体上的序列特异性的一个不同地标记的标签。

最后，方法200的第三步205与方法100的第三步105相同：经由荧光显微术或其他视觉手段通过跟踪内源染色体特异性标签和合成染色体特异性标签来实时监测合成染色体的产生。内源染色体特异性标签允许人们评价内源染色体群体以确保合成染色体产生细胞系的“健康”，并且合成染色体特异性标签允许人们评价合成染色体的形成和持续存在。

该可选方法的不同之处在于，图1中阐明的方法需要构建合成染色体产生报告物细胞系，而图2中的方法仅需要选择用于合成染色体产生的细胞系，而无需将该报告特征工程化到细胞系中。在任一种方法中，待被工程化为报告和产生合成染色体(图1的方法)的细胞或仅用于产生合成染色体的细胞(图2的方法)的选择至少部分地取决于正在产生合成染色体的物种以及其中合成染色体最终将被递送的细胞的类型。例如，为了产生待在人类中使用的合成染色体，期望选择人类细胞系用于合成染色体产生，因为完全人源化的合成染色体可能避免了当被递送到人类患者中时除了人类以外的哺乳动物细胞中产生的合成染色体可能存在的问题，诸如潜在的免疫应答和遗传稳定性问题。

图3阐明了本发明的组合物和方法的又另一个可选实施方案。如同图1和图2，图3为用于创建用于实时跟踪新的合成染色体的产生的系统的一个实施方案的方法步骤的简化流程图。在方法300中的第一步301为构建其中产生合成染色体的合成染色体产生报告物细胞系。合成染色体产生报告物细胞系的构建基本上需要稳定地转化细胞系以表达两个标签之一：对内源染色体特异性的标记的标签。在步骤303中，将合成染色体报告物细胞系用合成染色体产生组分和合成染色体标签转染，所述合成染色体标签被掺入到合成染色体中。在该实施方案中，报告物细胞系被工程化为表达对内源染色体特异性的标记的标签，并且合成染色体被工程化为表达对合成染色体特异性的不同地标记的标签(即，“反式染色体(trans chromosome)”系统，其中标签由不同的染色体表达：内源染色体和合成染色体)。应当注意，在先前的实施方案中，报告物细胞系被构建为表达两个定义的报告物标签(“顺式内源染色体”系统)，或者合成染色体被工程化为表达两个定义的报告物标签(“顺式合成染色体”系统)。

最后，方法300的第三步305与方法100的第三步105以及方法200的205相同：经由荧光显微术或其他视觉手段通过跟踪内源染色体特异性标签和合成染色体特异性标签来实时监测合成染色体的产生。内源染色体特异性标签允许人们评价内源染色体群体以确保合成染色体产生细胞系的“健康”，并且合成染色体特异性标签允许人们评价合成染色体的形成和持续存在。

应当注意，人们可以构建另一个可选系统-“相对的反式染色体(opposite transchromosome)”系统，其中合成染色体产生报告物细胞系被稳定地转化为表达对合成染色体特异性的不同地标记的标签，并且合成染色体被工程化为表达对内源染色体特异性的标记的标签。本质上，人们是否选择图1的系统(“顺式内源染色体”系统)、图2的系统(“顺式合成染色体系统”)、图3的系统(“反式染色体”系统)或“相对的反式染色体系统”仅仅为基于载体的设计、用于创建合成染色体的方法、待被工程化的细胞系等的一种设计选择。

在合成染色体产生后，它可以被用于以下的许多方面：药理学、治疗和生物学应用，例如，转基因动物中重组蛋白的产生、多种细胞类型或动物模型中大的人类基因的调控和表达分析和用于离体(ex vivo)基因疗法的基于染色体的基因递送载体、指导细胞分化和去分化、诱导的多能干细胞的形成、创建新型自分泌和旁分泌细胞通信网络、创建能够进行多个编码的因子的化学计量的产生的多表达系统、生物电路的产生、能够探测核结构的DNA元件的插入和下游用于使用核结构中发现的相互作用调控基因组表达的用途，以及大的DNA元件(>50Kb、>100Kb、>200Kb或更大)的操作，诸如但不限于染色体臂交换到合成染色体上或将多个大的DNA元件掺入到合成染色体上。

图4为显示本发明的方法如何可以被用于监测“染色体臂”从内源基因组交换至合成染色体的方法步骤的简化流程图。在步骤401中，构建包含内源染色体标签和合成染色体标签的合成染色体产生报告物细胞系。在步骤403中，合成染色体产生报告物细胞系中的内源染色体的臂被选择以被工程化为具有重组位点。在步骤405中，用合成染色体产生组分转染合成染色体产生报告物细胞系，并且在步骤407中，通过确定涂染内源染色体的标记物是否被检测到作为与合成染色体相关联来监测内源染色体的臂与合成染色体的一部分的交换。

合成染色体产生细胞

在一些实施方案中，待被工程化和/或产生合成染色体的细胞可以是天然存在于受试对象(人类患者、动物或植物)中的细胞，其中来自合成染色体的基因或调控序列将最终被表达。此类细胞可以是出于对个体特异性的合成染色体产生的目的而建立的原代培养物细胞系。在其他实施方案中，待被工程化和/或产生合成染色体的细胞来自已建立的细胞系。用于组织培养的多种细胞系为本领域中已知的。细胞系的实例包括但不限于人类细胞系诸如293-T(胚胎肾)、721(黑素瘤)、A2780(卵巢)、A172(成胶质细胞瘤)、A253(癌)、A431(上皮细胞)、A549(癌)、BCP-1(淋巴瘤)、BEAS-2B(肺)、BR293(乳腺)、BxPC3(胰腺癌)、Cal-27(舌)、COR-L23(肺)、COV-434(卵巢)、CML Tl(白血病)、DUI45(前列腺)、DuCaP(前列腺)、FM3(淋巴结)、H1299(肺)、H69(肺)、HCA2(成纤维细胞)、HEK0293(胚胎肾)、HeLa(子宫颈)、HL-60(原粒细胞)、HMEC(上皮细胞)、HT-29(结肠)、HUVEC(脐静脉上皮细胞)、Jurkat(T细胞白血病)、JY(类淋巴母细胞)、K562(类淋巴母细胞)、KBM-7(类淋巴母细胞)、Ku812(类淋巴母细胞)、KCL22(类淋巴母细胞)、KGI(类淋巴母细胞)、KYOl(类淋巴母细胞)、LNCap(前列腺)、Ma-Mel(黑素瘤)、MCF-7(乳腺)、MDF-10A(乳腺)、MDA-MB-231、-468和-435(乳腺)、MG63(骨肉瘤)、MOR/0.2R(肺)、MONO-MAC6(白血细胞)、MRC5(肺)、MSU1.1(成纤维细胞)、NCI-H69(肺)、NALM-1(外周血)、NW-145(黑素瘤)、OPCN/OPCT(前列腺)、Peer(白血病)、Raji(B淋巴瘤)、Saos-2(骨肉瘤)、Sf21(卵巢)、Sf9(卵巢)、SiHa(子宫颈癌)、SKBR3(乳腺癌)、SKOV-2(卵巢癌)、T-47D(乳腺)、T84(肺)、U373(成胶质细胞瘤)、U87(成胶质细胞瘤)、U937(淋巴瘤)、VCaP(前列腺)、WM39(皮肤)、WT-49(类淋巴母细胞)和YAR(B细胞)。感兴趣的啮齿动物细胞系包括但不限于3T3(小鼠成纤维细胞)、4T1(小鼠乳腺)、9L(大鼠成胶质细胞瘤)、A20(小鼠淋巴瘤)、ALC(小鼠骨髓)、B16(小鼠黑素瘤)、B35(大鼠成神经细胞瘤)、bEnd.3(小鼠脑)、C2C12(小鼠成肌细胞)、C6(大鼠神经胶质瘤)、CGR8(小鼠胚胎)、CT26(小鼠癌)、E14Tg2a(小鼠胚胎)、EL4(小鼠白血病)、EMT6/AR1(小鼠乳腺)、Hepalclc7(小鼠肝癌)、J558L(小鼠骨髓瘤)、MC-38(小鼠腺癌)、MTD-1A(小鼠上皮细胞)、RBL(大鼠白血病)、RenCa(小鼠癌)、X63(小鼠淋巴瘤)、YAC-1(小鼠Be细胞)、BHK-1(仓鼠肾)和CHO(仓鼠卵巢)。使用的植物细胞系包括但不限于BY-2、Xan-1、GV7、GF11、GT16、TBY-AtRER1B、3n-3和G89(烟草)；VR、VW和YU-1(葡萄)；PAR、PAP和PAW(美洲商陆(pokeweed))；Spi-WT、Spi-1-1和Spil2F(菠菜(spinach))；PSB、PSW和PSG(芝麻(sesame))；A.per、A.pas、A.plo(芦笋(asparagus))；Pn和Pb(竹(bamboo))；和DG330(大豆(soybean))；胚胎细胞系；多能细胞系；成体来源的干细胞；重编程细胞系；任何物种或广泛的胚胎或重编程细胞的通用动物细胞系；斑马鱼细胞系；原代犬细胞；原代马细胞；鸡DT40细胞；犬细胞系；猫细胞系；患者细胞系；并且在一些优选的实施方案中，利用HT1080人类细胞系。使用的潜在的细胞包括任何活细胞，但特别预期来自真核生物的那些细胞。这些细胞系和其他细胞系可从本领域技术人员已知的多种来源可得(参见，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,Va.))。将用本文描述的一种或更多种载体转染的细胞用于建立包含一种或更多种载体来源的序列的新细胞系。

递送标记的标签的载体

待被用于递送对内源染色体特异性的标记的标签和对合成染色体特异性的标记的标签的载体的选择将取决于多种因素，诸如期望在其中繁殖的细胞的类型。某些载体可用于扩增和制备大量所期望的DNA序列，而其他载体适于在培养的细胞中表达。其他载体还适于在整个动物的细胞中转移和表达。适当载体的选择在本领域技术人员的技术范围内，并且许多载体商购可得。为了制备构建体，通常通过将序列连接到载体中的裂解的限制性酶位点处而将多核苷酸插入到载体中。可选地，可以通过同源重组或位点特异性重组插入所期望的核苷酸序列。通常，通过在所期望的核苷酸序列的侧翼附接与载体同源的区域(例如cre-lox、att位点等)来实现同源重组。包含此类序列的核酸可以通过例如寡核苷酸的连接，或通过使用包含同源性区域和所期望的核苷酸序列的部分两者的引物的聚合酶链式反应来添加。可以使用的示例性载体包括但不限于源自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的那些。例如，可以使用质粒载体诸如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp系列载体。噬菌体载体可以包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZΑΡ/R和EMBL系列的噬菌体载体。可以使用的粘粒载体包括但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9(charomid9)系列载体。另外的载体包括基于功能性致育质粒(fertility plasmid)(F-质粒)的细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和P1来源的人工染色体、源自P1噬菌体的DNA的DNA构建体(PACS)。可选地且优选地，重组病毒载体可以被工程化，包括但不限于源自病毒诸如疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒或牛乳头状瘤病毒的那些重组病毒载体。

在优选的实施方案中，本发明中利用的与用于标记出或“涂染”内源染色体和合成染色体的标签相关的标记物为表达的荧光蛋白；因此，可以采用表达盒。表达载体提供转录和翻译调控序列，并且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区域被可操作地连接，处于转录起始区域以及转录和翻译终止区域的转录控制下。这些控制区域可以是编码多肽的基因天然的，或者可以源自外源来源，包括物种特异性的内源启动子。通常，转录和翻译调控序列可以包括，但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。除了组成型和诱导型启动子以外，强启动子(例如，T7、CMV等)可用于本文描述的构建体，特别地在体内(in vivo)(基于细胞)或体外(invitro)表达系统中期望高表达水平的情况下。其他示例性启动子包括小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)启动子、腺病毒启动子、来自人类CMV的立即早期基因的启动子和来自RSV长末端重复(LTR)的启动子。可选地，启动子也可以由例如逆转录病毒的5'UTR提供。

表达载体通常具有位于启动子序列附近的便利的限制性位点，以提供编码感兴趣的蛋白的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中起作用的可选择标志物，以便于选择包含载体的细胞。另外，表达构建体可以包括另外的元件。例如，表达载体可以具有一种或两种复制系统；因此允许其在生物体中，例如在用于表达的哺乳动物细胞中和在用于克隆和扩增的原核宿主中被维持。另外，表达构建体可以包含可选择标志物基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因为本领域熟知的，并且将随所使用的宿主细胞而变化。

合成染色体产生

本发明的合成染色体产生方法的实时监测适用于所有当前采用的合成染色体产生的方法。如以上简要讨论的，本发明的实时监测方法适用于本领域中使用的所有“自上向下”、“自下而上”、微型染色体的工程化、以及诱导的从头染色体生成的方法。合成染色体形成的“自下而上”方法依赖于在用克隆的α-卫星序列转染允许细胞系之后细胞介导的从头染色体形成，所述克隆的α-卫星序列包括典型的宿主细胞适合的着丝粒和可选择标志物基因，具有或不具有端粒和基因组DNA。(这些方法的方案和详细描述参见，例如，Harrington，等，Nat.Genet.,15:345-55(1997)；Ikeno，等，Nat.Biotechnol.,16:431-39(1998)；Masumoto，等，Chromosoma,107:406-16(1998),Ebersole，等，Hum.Mol.Gene.,9:1623-31(2000)；Henning，等，PNAS USA,96:592-97(1999)；Grimes，等，EMBO Rep.2:910-14(2001)；Mejia等，Genomics,79:297-304(2002)；以及Grimes，等，Mol.Ther.,5:798-805(2002).)。被克隆到酵母人工染色体、细菌人工染色体或P1来源的人工染色体载体中的合成和天然存在的α-卫星阵列二者在本领域中已用于从头合成染色体形成。自下而上组装的产物可以是线性的或圆形的，包括具有基于α-卫星DNA的着丝粒的简化和/或多联体化的输入DNA，并且通常尺寸范围在1Mb与10Mb之间。自下而上来源的合成染色体也被工程化为掺入核酸序列，所述核酸序列允许将靶DNA序列位点特异性整合到合成染色体上。

产生合成染色体的“自上而下”方法牵涉顺序轮的预先存在的染色体臂的随机和/或靶向截短，以产生包含着丝粒、端粒和DNA复制起点的简练(pared down)的合成染色体。(这些方法的方案和详细描述参见，例如，Heller，等，PNAS USA,93:7125-30(1996)；Saffery，等，PNAS USA,98:5705-10(2001)；Choo,Trends Mol.Med.,7:235-37(2001)；Barnett，等，Nuc.Ac.Res.,21:27-36(1993)；Farr，等，PNAS USA,88:7006-10(1991)；以及Katoh，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,321:280-90(2004).)。“自上而下”合成染色体被最佳构建为不含天然存在的表达的基因，并被工程化为包含DNA序列，所述DNA序列允许例如由位点特异性DNA整合酶介导的靶DNA序列位点特异性整合到截短的染色体上。

本领域已知的产生合成染色体的第三种方法为天然存在的微型染色体的工程化。该产生方法通常牵涉照射诱导的染色体片段化，所述染色体包含功能性的例如人类新着丝粒，其具有着丝粒功能但缺乏α-卫星DNA序列并被工程化为不含非必需DNA。(这些方法的方案和详细描述参见，例如，Auriche，等，EMBO Rep.2:102-07(2001)；Moralli，等，Cytogenet.Cell Genet.,94:113-20(2001)；以及Carine，等，Somat.Cell Mol.Genet.,15:445-460(1989).)。与生成合成染色体的其他方法一样，工程化的微型染色体可以被工程化为包含允许靶DNA序列的位点特异性整合的DNA序列。

用于产生合成染色体的第四种方法牵涉通过特定染色体区段的靶向扩增的诱导的从头染色体生成。该方法牵涉位于近端着丝粒染色体上的近着丝粒区(pericentromeric)/核糖体DNA区域的大规模扩增。通过对染色体的臂间区域(诸如核糖体RNA)特异性的过量DNA以及允许靶DNA序列的位点特异性整合的DNA序列以及还有整合到染色体的臂间区域的药物可选择标志物的共转染触发扩增。(这些方法的方案和详细描述参见，例如，Csonka，等，J.Cell Sci 113:3207-16(2002)；Hadlaczky，等，Curr.Opini.Mol.Ther.,3:125-32(2001)；以及Lindenbaum和Perkins，等，Nuc.Ac.Res.,32(21):el72(2004).)。在该过程中，通过共转染的DNA靶向近端着丝粒染色体的臂间区域诱导大规模染色体DNA扩增、着丝粒序列的复制/活化、以及随后的双着丝粒染色体的裂开和分离，产生“基于断裂(break-off)的卫星DNA的包含多个位点特异性整合位点的合成染色体。该过程的一个示例性实施方案示于图5中。

图5为用于实时监测染色体产生的方法的一个实施方案的图形表示。将示例性组分列出并指示如下：对在人类工程化细胞系中的内源染色体特异性的组蛋白H2B红色荧光蛋白标签；对合成染色体特异性的LacI绿色荧光蛋白标签；递送组分以创建合成染色体的pHurDNA载体和pHUPattPPurolacO载体；结合合成染色体上的lacO序列的LacI绿色荧光蛋白；以及结合染色体的组蛋白H2B红色荧光蛋白。在该过程中，将人类工程化细胞系用递送组分的两种载体转染以创建合成染色体，并将这些载体整合到人类工程化细胞系中的内源染色体中。诱导lacO阵列的大规模扩增，并且由内源染色体和合成染色体的组分形成双着丝粒染色体。另外，LacI绿色荧光蛋白标签定位于合成染色体上的lacO阵列。在双着丝粒染色体经有丝分裂裂开之后，新形成的合成染色体被维持在人类工程化细胞系中。组蛋白红色荧光蛋白标签和LacI绿色荧光标签的共定位允许合成染色体通过双色流式细胞术纯化。

图6示出了内源染色体特异性标签载体、合成染色体特异性标签载体和组合的内源和合成染色体特异性载体的简化构建体。将示例性组分列出并指示如下：内源染色体特异性标签；内源染色体结合部分(例如，组蛋白结合部分)；第一报告物部分(例如，第一荧光蛋白)；合成染色体特异性标签；合成染色体结合部分(例如，lac阻遏物)；第二报告物部分(例如，第二荧光蛋白)；和可选择标志物(例如，药物耐受性基因，例如用于潮霉素耐受性的药物耐受性基因)。

组分递送到合成染色体产生细胞

携带本发明的报告物标签的载体和/或适于合成染色体产生的组分可以通过本领域已知的任何方法递送至待被工程化和/或产生合成染色体的细胞。术语转染和转化指外源核酸例如表达载体被宿主细胞吸收，无论其事实上是否表达了任何编码序列。许多转染方法为本领域普通技术人员已知的，例如，通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、原生质体转化(包括聚乙二醇(PEG)介导的转化、电穿孔、原生质体融合和微细胞融合))、脂质介导的递送、脂质体、电穿孔、声致穿孔、显微注射，粒子轰击和碳化硅晶须介导的转化及其组合(参见，例如，Paszkowski，等，EMBO J.,3:2717-2722(1984)；Potrykus,Gen.Genet.,199:169-177(1985)；Reich，等，Biotechnology,4:1001-1004(1986)；Klein，等，Nature,327:70-73(1987)；美国专利第6,143,949号；Paszkowski，等，于Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants中，第6卷，Molecular Biology of Plant NuclearGenes,(Schell和Vasil，编著，Academic Publishers 1989)；以及Frame，等，Plant J.,6:941-948(1994))；使用磷酸钙的直接摄取(Wigler，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76:1373-1376(1979))；聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄取；脂质体转染(lipofection)(参见，例如，Strauss,Meth.Mol.Biol.,54:307-327(1996))；微细胞融合(Lambert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:5907-5911(1991)；美国专利第5,396,767号；Sawford，等，Somatic Cell Mol.Genet.,13:279-284(1987)；Dhar，等，Somatic Cell Mol.Genet.,10:547-559(1984)；以及McNeill-Killary，等，Meth.Enzymol.,254:133-152(1995))；脂质介导的运载体(carrier)系统(参见，例如，Teifel，等，Biotechniques,19:79-80(1995)；Albrecht，等，Ann.Hematol.,72:73-79(1996)；Holmen，等，In Vitro CellDev.Biol.Anim.,31:347-351(1995)；Remy，等，Bioconjug.Chem.,5:647-654(1994)；LeBolch，等，Tetrahedron Lett.,36:6681-6684(1995)；以及Loeffler，等，Meth.Enzymol.,217:599-618(1993))；或其他合适的方法。用于递送合成染色体的方法也被描述于美国申请系列第09/815,979号中。成功转染通常通过检测转染的细胞内异源核酸的存在，诸如例如宿主细胞内异源核酸的任何可视化、可选择标志物的表达或载体的操作的任何迹象来确认。可用于实践本发明的递送方法的描述参见美国专利第5,011,776号；美国专利第5,747,308号；美国专利第4,966,843号；美国专利第5,627,059号；美国专利第5,681,713号；Kim和Eberwine,Anal.Bioanal.Chem.397(8):3173-3178(2010)。

标记的标签

如以上讨论的，在图1-4的讨论中，本发明涉及两个标签：对在合成染色体产生细胞系中的内源染色体特异性的一个标记的标签，以及对在待产生的合成染色体上的序列特异性的一个不同地标记的标签。然而，在又其他实施方案中，可以实施另外的标签以区分合成染色体的多个区域。对在合成染色体产生报告物细胞系中的内源染色体特异性的标记的标签优选地为对细胞系中的所有内源染色体特异性的标签，诸如例如组蛋白特异性标志物，诸如对组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4和H5特异性的标志物。可选地，还预期了可以使用对不同染色体特异性的标签的集合，所有标签被连接至单个标记物(例如，荧光蛋白)。在优选的实施方案中，对内源染色体特异性的标记的标签为融合肽；然而，对内源染色体特异性的标记的标签也可以是核酸/蛋白嵌合体，其中标签部分为对内源染色体特异性的核酸序列，且标记物部分为蛋白，诸如荧光或磷光蛋白，或者标签部分可以是对内源染色体特异性的TALEN蛋白，且标记物部分为蛋白，诸如荧光、磷光或发光蛋白。另外，标签部分也可以是与荧光蛋白融合的经修饰的CRISPR部分(核酸酶缺陷型)，并且共表达RNA部分，导致合成染色体的特异性结合和可视化(参见，例如，Chen等，Cell,155:1479-1491(2013)；以及Chen和Huang,Methods in Enzymololgy,546:337-354(2014))。图8-10为使用CRISPR/Cas荧光可视化系统用于监测、分离和/或纯化合成染色体的图形表示。在图8中，使用单个报告物系统，其中CRISPR部分与荧光蛋白融合，并且共表达的RNA部分导致合成染色体的特异性结合和可视化。图9示出了两种不同的细胞系。一种细胞系包含与合成染色体结合的一种CRISPR/Cas/荧光部分，且另一种细胞系显示与两条合成染色体结合的两种CRISPR/Cas/荧光部分——一种具有荧光蛋白1，另一种具有荧光蛋白2。图10示出了使用两种不同的CRISPR/Cas/荧光部分检测合成染色体产生细胞内源或天然的染色体与合成染色体之间的位点特异性臂交换。两种不同的CRISPR/Cas/荧光部分也允许分离合成染色体。

此外，在优选的实施方案中，选择对所有内源染色体特异性的并将标记出所有内源染色体的标记的标签；然而，如以上提及的，本领域普通技术人员应该清楚，可以采用多于一种标记的标签，诸如对单个或少数染色体特异性的多个标记的标签或各自对单个染色体特异性的多个标签。

在优选的实施方案中，对合成染色体特异性的标签包含与合成染色体上独特的核酸序列互补的核酸序列(诸如任何4ⁿ个核苷酸的列表——其具有为独特的高可能性并且可以针对已知序列的数据库进行筛选)和荧光蛋白作为核酸/蛋白嵌合体。在优选的实施方案中，合成染色体特异性标签对合成染色体上的位点特异性整合序列(接纳位点)是特异性的；因此，来自标记的标签的信号间接用作接纳位点的数目的度量，并且所产生的合成染色体可以通过它们的接纳位点的数目进行分选。

预期用于在本发明中使用的标记物包括任何可视标记物，其可以与对合成染色体产生细胞系中的内源染色体特异性的标签以及对合成染色体上的序列特异性的标签结合利用。在优选的实施方案中，标记物为荧光标记物，其被合成染色体产生细胞转录并翻译为融合蛋白或掺入标签的核酸/蛋白嵌合体。在本发明中特别有用的荧光蛋白包括但不限于，TagBFP、TagCFP、TagGFP2、TagYFP、TagRFP、FusionRed、mKate2、TurboGFP、TurboYFP、TurboRFP、TurboFP602、TurboFP635或TurboFP650(所有都从Evrogen,Moscow可得)；AmCyanl、AcvGFPl、ZsGreenl、ZsYellowl、mBanana、mOrange、mOrange2、DsRed-Express2、EsRed-Express、tdTomato、DsRed-Monomer、DsRed2、AsRed2、mStrawberry、mCherry、HcRedl、mRaspberry、E2-Crimson、mPlum、Dendra 2、Timer和PAmCherry(所有都从Clontech,Palo Alto,CA可得)；HALO-标签；红外(远红移)标签(所有都从Promega,Madison,WI可得)；和本领域已知的其他荧光标签，以及随后发现的荧光标签。

可视化和监测

如果本发明的报告物标签用荧光标记物进行标记，则标记物在合成染色体产生细胞中的定位可以通过荧光显微术来完成。通常，细胞在所使用的特定荧光标记物的激发波长处被光源激发，并且发射波长处的所得荧光被检测。在优选的实施方案中，激发光源为适于激发荧光标记物的激光。用于检测标记物的共焦显微镜可以用计算机控制级自动化以自动地扫描整个细胞培养皿。类似地，显微镜可以配备有附接至自动化数据采集系统的光电转换器(phototransducer)(例如，光电倍增管、固态阵列、CCD照相机等)，以自动地记录由培养物中的每一个细胞或细胞集落产生的荧光信号。可选地，人们还可以采用成像流式细胞仪(诸如Flowsight(Amnis,Seattle,WA))，其捕获激光激发之后的流动流中每一个“细胞”的图像；因此使用于产生合成染色体的每一个细胞集落的评价自动化。

Lindenbaum和Perkins等,Nucleic Acid Research,32(21):el72(2004)描述了使用现有技术中的技术产生基于哺乳动物卫星DNA的人工染色体表达(ACE)系统。在该现有技术的系统中，使用PCR产生的探针或使用切口平移的探针进行常规的单色和双色FISH分析和高分辨率FISH。为了检测端粒序列，使有丝分裂涂布物(spreads)与商购获得的肽核酸探针杂交。使用荧光显微术进行显微术。该过程花费约三个月。本发明则允许人们减少或完全消除重复的FISH分析，消除对将用于对通过本申请中的新方法获得的染色体进行分选的潜在诱变染料的需要，并且允许人们实时观察合成染色体的发展。另外，本发明的方法允许合成染色体的更容易的下游工程化，其中感兴趣的DNA元件被插入到合成染色体中。图7示出了产生如本文描述的合成染色体的方法的时间线。

实施例

提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整的公开内容和描述，且以下实施例并不意图限制发明人认为是他们的发明的范围，它们也不意图代表或暗示下文的实验是进行的所有实验或仅有实验。本领域技术人员将理解，可以对如具体实施方案中示出的发明作出许多变化和/或改变而不脱离如所广泛描述的本发明的精神或范围。因此，所列出的实施方案在所有方面被认为是说明性的而非限制性的。

作出了努力以确保关于使用的数字(例如，量、温度，等)的准确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另有指示，份数为重量份数，分子量为加权平均分子量，温度以摄氏度计，且压力处于大气压下或临近大气压。

实施例1：递送标签的载体的构建

为了实时监测合成平台的染色体，细胞系HT1080被工程化为携带内源染色体特异性标签载体——一种识别所有天然的、内源染色体的标签，以及合成染色体特异性标签载体——一种识别除了内源染色体以外的合成染色体的标签(参见图6，并参见，例如，Robinett，等，J Cell Biol.,135(6Pt 2):1685-700(1996))。内源染色体特异性标签包含染色体特异性结合部分，例如，DNA结合蛋白诸如组蛋白(参见，例如，Kimura，等，J CellBiol.,153(7):1341-53(2000))、牵涉染色质结构的蛋白或基因组编辑蛋白诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(参见，例如，Thanisch，等，Nucleic AcidsRes.,42(6):e38(2014)；以及Miyanari，等，Nat Struct Mol Biol.,20(11):1321-24(2013))、CRISPER/Cas系统蛋白(参见，例如，Anton，等，Nucleus,5(2):163-72(2014))、或工程化的兆核酸酶。对于内源染色体特异性标签，染色体特异性结合部分与报告物部分融合并表达，所述报告物部分通过标准显微方法或流式细胞术方法检测。在优选的实施方案中，报告物部分包括分子诸如荧光分子(例如，绿色荧光蛋白)或结合化学配体的蛋白融合标签(例如，Halo标签)。

合成染色体特异性标签载体包含DNA序列特异性结合部分，诸如，例如结合工程化在合成染色体上的Lac操纵子序列的细菌Lac阻遏蛋白或工程化为结合对合成染色体特异性的DNA序列的基因组编辑蛋白(例如TALENS、RNA/CRISPR-CAS)。合成染色体特异性标签与报告物部分一起融合并表达，所述报告物部分可以通过标准显微方法或流式细胞术方法检测。在优选的实施方案中，与合成染色体特异性标签融合的报告物部分包括分子诸如荧光分子(例如，红色荧光蛋白)或结合化学配体的蛋白融合标签(例如，Halo标签)。

内源染色体特异性标签和合成染色体特异性标签由启动子(例如，人类葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子)表达，并且由两种独特的载体表达，尽管内源染色体特异性标签和合成染色体特异性标签可以被组合到具有适应药物选择(例如，赋予潮霉素耐受性的表达的基因)的单一载体(再次参见图5)。可选地，可以由诱导型启动子(例如，四环素可调控型启动子)表达内源染色体特异性标签和合成染色体特异性标签。为了随后从工程化的细胞系中去除标签和/或标签载体序列，将位点特异性重组序列(例如，loxP序列)置于内源染色体特异性标签载体和合成染色体特异性标签载体上并位于其侧翼，并且通过引入适当的位点特异性重组酶(例如，Cre蛋白)并通过标准显微方法或流式细胞术方法鉴定所得重组体将这些序列选择性地消除。

实施例2：将标签载体递送到宿主细胞系基因组中

为了将标签载体转染到宿主细胞系基因组中，使用标准哺乳动物细胞转染试剂(包括但不限于lipofectamine LTX(ThermoFisher)或Viafect(Promega))将线性化的标签载体DNA引入到HT1080宿主细胞基因组中并允许在培养物中生长约2-5天。在整合到宿主细胞基因组中之后，由整合的内源染色体特异性标签和合成染色体特异性标签的表达允许FAC选择产生两种标签的宿主细胞。

在转染之前一天，将HT1080宿主细胞系细胞以约2-8×10⁴个贴壁细胞的密度划分到24孔组织培养皿的每一个孔中，并将标签元件载体诸如pMCl纯化(例如，使用QiagenEndoFree Plasmid Maxi试剂盒，Qiagen,Valencia,CA)、线性化，并确定用于转染的载体的浓度。喂养经培养的HT1080细胞3-5小时，然后转染。pMCl载体包含EF1/HTLV启动子、绿色荧光蛋白标志物序列、lac IF；SV40聚A、IFN-β支架/基质附着区域、R6K复制起点、β珠蛋白基质附着区域、组蛋白H2B序列、mCherry选择标志物、IRES序列、潮霉素耐受性基因、bGH聚A和3’UTR序列。将250-500ng载体DNA/24孔半汇合的组织培养皿的孔用于使用例如Lipofectamine-LTX介导的转染(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)转染HT1080细胞。将细胞在转染后维持1-5天，在该时间点将它们胰蛋白酶化并转移至10cm培养皿中。在平铺至10cm培养皿时或在平铺之后1-3天，将潮霉素选择培养基添加至10cm培养皿。将潮霉素耐受性克隆进行环克隆并在24孔培养皿中扩繁。将表达两种标签元件的克隆单细胞分选到96孔组织培养皿中。将单细胞克隆在培养物中扩繁，并且随着它们在培养物中生长而使用荧光显微镜来监测，以鉴定具有最佳性能的整合的标签元件的克隆。将最佳候选者在培养物中扩繁，并通过标准方法置于冷藏状态用于将来使用。

实施例3：基于卫星DNA的人工染色体的从头生成

对于合成染色体的从头生成，将外源DNA序列引入到HT1080合成染色体产生细胞系中，并且在整合到近端着丝粒染色体的臂间异染色质区域后，触发近端着丝粒染色体的短臂(rDNA/着丝粒区域)的大规模扩增。在扩增事件期间，着丝粒被复制，产生具有两个活性着丝粒的双着丝粒染色体。随后的有丝分裂事件导致双着丝粒染色体的裂解和分离，产生尺寸约20-120Mb的断裂物，其主要包含卫星重复序列，所述卫星重复序列具有共扩增的转染的转基因的亚结构域，其也可包含扩增的rDNA拷贝。新生成的合成染色体通过经由被工程化到HT1080合成染色体产生细胞系中的内源染色体标签和合成染色体标签观察荧光染色体涂染进行验证。

在转染之前一天，将HT1080合成染色体产生细胞系的细胞以约2.0至8.0×10⁴个贴壁细胞的密度划分到24孔组织培养皿中，并将包含外源DNA的载体纯化(例如，使用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi试剂盒)、线性化，并确定用于转染的载体的浓度。喂养经培养的HT1080细胞3-5小时，然后转染。将每24孔半汇合组织培养皿225ngpSPOP481acHurDNA载体和12.5ng EFlalphaattPPuro载体用于使用标准转染试剂(例如，ThermoFisher Lipofectamine LTX、Promega的Viafect或Invitrogen的磷酸钙转染试剂盒)来转染HT1080细胞。pSPOP481acHurDNA载体包含LacI重复序列和核糖体DNA序列。EFlalphaattPPuro载体包含用于位点特异性重组系统的组分和氨苄青霉素和嘌呤霉素耐受性基因。将细胞在转染后维持1-3天，在该时间点将它们胰蛋白酶化并重新平铺在10cm培养皿上。在平铺时或在平铺后1-3天，将选择培养基添加至10cm培养皿。选择条件被维持10-21天，每2-3天更换培养基。当集落直径达到2-3mm时挑取抗生素耐受克隆。良好分离的集落是优选的。通过使用克隆柱(cloning cylinder)和胰蛋白酶取出细胞，并转移至24孔板中以用于扩繁。

实施例4：实时监测合成染色体平台

对于合成染色体平台的创建，将表达内源染色体特异性标签(例如，人类H2B-RFP融合蛋白)和合成染色体特异性标签(例如，与GFP融合的Lac阻遏物，LacI-GFP)的HT1080合成染色体产生报告物细胞以约2.0至8×10⁴个贴壁细胞接种到24孔组织培养皿中。染色体特异性标签蛋白为组成型表达。在接种之后一天，使用标准转染方法诸如Invitrogen的磷酸钙转染试剂盒、Lipofectamine-LTX介导的转染(Life Technologies,Inc.,GrandIsland,NY)或Viafect(Promega)进行转染。对于转染到HT1080工程化细胞系中，将线性化的载体(pSPOP481acHurDNA)与携带插入在人类启动子与药物可选择标志物(例如，嘌呤霉素耐受性)之间的位点特异性重组位点(例如，attP)的线性化的质粒(pEFlalphaattPPuro)共转染。另外，pSPOP481acHurDNA包含约48个拷贝的合成染色体特异性标签识别序列(例如，48个拷贝的lac操纵子序列，lacO)；即被合成染色体特异性标签LacI-GFP识别和结合的序列。对于共转染，将过量的pSPOP481acHurDNA与pEFlalphaattPPuro质粒一起递送(>3:1摩尔过量的pSPOP481acHurDNA比pEFlalphaattPPuro)。在转染后24小时，将来自24孔培养皿的每一个孔的HT1080细胞胰蛋白酶化，并平铺至10cm细胞培养皿(将24孔培养皿的一个孔平铺到一个10cm培养皿中)并孵育。在转染后1至4天，将培养基替换为由包含0.5微克/ml嘌呤霉素的完全培养基组成的筛选培养基。选择培养基每周更换3次，持续2-3周，直至药物耐受性克隆的出现为肉眼可视。应当注意，如果在24孔培养皿中对候选者进行初始荧光显微检查时，观察到具有成熟合成染色体断裂产物的克隆，那么通过荧光显微术检查细胞可以较早地转向10cm组织培养皿中的观察，然后进行环克隆。由于生成合成染色体的过程在过去一直是无从知晓的，因此初始合成染色体形成的时间尚未完全确定。

当克隆可视时，将96个克隆通过环克隆分离，并将每一个克隆转移到24孔组织培养皿的一个孔中并在具有药物选择的情况下进行培养。此时，使用胰蛋白酶处理收获24孔培养皿中几乎汇合(2-10天)的细胞，并且将每一个克隆细胞的悬浮液分配至两个单独的24孔板上的等同孔。一个培养皿用于实时监测合成染色体产生，而另一个等同培养皿用于常规维持和生长。在监测合成染色体产生的24孔培养皿中的生长期间，将细胞利用标准荧光显微术每48小时进行分析，并检查表现出红色标记的内源染色体(结合内源染色体的H2B-RFP的存在)和共定位的点状染色的合成染色体标签(即，新合成的平台染色体或“香肠状(sausage)”染色体(合成的平台染色体的前体)上LacI-GFP标签的存在)的有丝分裂细胞的出现。pSPOP481acHurDNA和pEFlalphaattPPuro载体靶向到天然近端着丝粒染色体的着丝粒/rDNA区域中诱导了整合的质粒的内在的大规模扩增，包括lacO重复阵列的扩繁以及双着丝粒染色体(其随后断裂)的形成和合成染色体的产生。如果需要，可以添加细胞周期停滞剂诸如秋水仙胺(KaryoMax秋水仙胺溶液，Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)以增加处于G2/M期的细胞群体，以促进凝聚染色体的实时可视检查。利用内源染色体标签和合成染色体标签对合成染色体产生的实时监测减轻了对使用静态方法诸如荧光原位杂交(FISH)监测产生的需要。当来自用于常规维持和生长的24孔培养皿的细胞达到几乎汇合时，将这些细胞持续地传代到两个单独的24孔培养皿中，其中一个培养皿用于进一步的生长和维持，且另一个用于实时监测，直至包含新产生的、有丝分裂稳定的合成染色体的克隆被鉴定出——约2-4周。在整个过程中拍摄培养物的显微照片和/或电影来记录合成染色体形成(即外源DNA元件的整合)的进展；具有掺入的外源DNA的染色体区域的扩增；双着丝粒染色体的形成；以及双着丝粒染色体的有丝分裂裂开。

包含新的合成染色体的分离的克隆可以进一步扩繁到三个15cm培养皿中。一个培养皿专用于长期低温储存。使用秋水仙胺使剩余的两个培养皿停滞在中期，并且将合成染色体如先前描述的进行收获和纯化(参见，例如，Vanderbyl等，Cytometry,44(2):100-05(2001)；以及Lindenbaum和Perkins，等，Nucleic Acid Res.,32(21):el72(2004))。与先前描述的利用潜在诱变剂(例如，Hoechst和色霉素A3)对染色体进行复染的方法相对，合成平台染色体上的H2B-RFP和LacI-GFP的结合和存在允许合成染色体的双色、荧光激活分选和分离以用于随后递送到治疗感兴趣的细胞中。此外，用H2B-RFP和LacI-GFP包被的分离的合成染色体随后可以用于评价和优化合成染色体到感兴趣的细胞类型中的递送，即通过荧光监测具有递送的合成染色体的转染的细胞的百分比。图7中示出了该过程的概述。

前述仅仅阐明了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计出多种排布形式，尽管本文未明确描述或显示，这些排布形式体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而贡献的概念，并且被解释为不限于此类具体列举的实例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述预期包括其结构和功能等同物两者。另外，预期此类等同物既包括当前已知的等同物又包括未来开发的等同物，即开发执行相同的功能而不管结构如何的任何元件。因此，本发明的范围并不意图被限制为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则本文列举的特征或要素都不应该被解释为根据35U.S.C.§112,6的手段加功能的限定。

Claims (23)

1.一种用于筛选合成染色体的产生的方法，所述方法包括：

提供合成染色体产生报告物细胞系；

用内源染色体标签和合成染色体标签转染所述合成染色体产生报告物细胞系；

用合成染色体产生组分转染所述合成染色体产生报告物细胞系；以及

通过使用所述内源染色体标签和所述合成染色体标签监测所述合成染色体产生报告物细胞系中合成染色体的产生。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述内源染色体标签和合成染色体标签被稳定地整合到所述合成染色体产生报告物细胞系的基因组中。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述内源染色体标签变为稳定地整合到所述合成染色体产生报告物细胞系的基因组中，并且所述合成染色体标签变为稳定地整合到所述合成染色体中。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述内源染色体标签和所述合成染色体标签被稳定地整合到所述合成染色体中。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述内源染色体标签变为稳定地整合到所述合成染色体中，并且所述合成染色体标签变为稳定地整合到合成染色体产生报告物细胞系的基因组中。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中存在于所述合成染色体产生报告物细胞系中的内源染色体的臂包含和与所述合成染色体中的重组位点相互作用兼容的重组位点。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述内源染色体标签和所述合成染色体标签包含荧光标签，并且监测步骤通过荧光显微术进行。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述荧光标签选自TagBFP、TagCFP、TagGFP2、TagYFP、TagRFP、FusionRed、mKate2、TurboGFP、TurboYFP、TurboRFP、TurboFP602、TurboFP635、TurboFP650、AmCyanl、AcvGFPl、ZsGreenl、ZsYellowl、mBanana、mOrange、mOrange2、DsRed-Express2、EsRed-Express、tdTomato、DsRed-Monomer、DsRed2、AsRed2、mStrawberry、mCherry、HcRedl、mRaspberry、E2-Crimson、mPlum、Dendra 2、Timer和PAmCherry、HALO-标签或红外位移的荧光蛋白。

9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述内源染色体标签和所述合成染色体标签的标签包括化学发光标签并且监测步骤通过化学发光显微术进行，或包括磷光标签并且监测步骤通过磷光显微术进行。

10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述内源染色体标签包含对组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4或H5特异性的标志物。

11.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述合成染色体标签包含已经针对已知序列的数据库进行筛选的4ⁿ个核苷酸。

12.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述合成染色体产生报告物细胞系选自哺乳动物细胞系、胚胎细胞系、多能细胞系、成体来源的干细胞、重编程细胞系或人类细胞系。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述合成染色体产生报告物细胞系为人类细胞系HT1080。

14.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由自上而下方法产生合成染色体。

15.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由自下而上方法产生合成染色体。

16.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由天然存在的微型染色体的工程化产生合成染色体。

17.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中将所述合成染色体产生报告物细胞系用合成染色体产生组分转染，以经由通过染色体区段的靶向扩增的从头染色体生成来产生合成染色体。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述染色体区段为染色体的臂间区域。

19.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述内源染色体标签包括多个内源染色体标签。

20.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述内源染色体标签为融合蛋白、核酸/蛋白嵌合体、核酸/蛋白复合物(诸如RNA/CRISPR-CAS9复合物)或包含对所述内源染色体特异性的TALEN蛋白和荧光或磷光标记物的部分。

21.一种合成染色体产生报告物细胞系，所述合成染色体产生报告物细胞系包含内源染色体标签和合成染色体标签，其中所述内源染色体标签和合成染色体标签被稳定地掺入到所述合成染色体产生报告物细胞系的基因组中。

22.一种通过如权利要求1-20所述的方法产生的合成染色体。

23.一种通过如权利要求1-20所述的方法产生的合成染色体并且所述合成染色体的尺寸为20-120Mbp。