CN109415719A - 用于产生具有基因调节系统的合成染色体的方法及其用途 - Google Patents

用于产生具有基因调节系统的合成染色体的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涵盖允许人们经由合成染色体将在多于一个基因调节组分控制下的多于一个基因递送到受体细胞中并表达的组合物和方法。合成染色体包含多于一个基因控制单元的工程化允许构建复杂的生物回路。

Description

用于产生具有基因调节系统的合成染色体的方法及其用途
相关申请的交叉引用
本国际PCT专利申请要求于2016年4月12日提交的美国临时专利申请第62/321,720号的优先权。
关于政府支持的声明
本发明根据由DARPA授予的合同D15PC00008在美国政府支持下进行。美国政府在本发明中具有一定权利。
发明领域
本发明的领域涵盖允许人们工程化合成染色体以递送在多于一个(multiple)基因调节组分的控制下的多于一个基因的方法。
发明背景
在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文所包含的任何内容不得被解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当的情况下证明根据可应用的法定条文本文引用的文章和方法无法构成现有技术的权利。
已经开发了许多基因调节控制系统，用于植物和动物两者的细胞中基因的控制的表达。这些系统包括四环素控制的转录活化系统(Tet-On/Tet-Off，Clontech,Inc.(PaloAlto,CA)；Bujard和Gossen,PNAS,89(12):5547-5551(1992))、Lac开关诱导型系统(Wyborski等人，Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人，Strategies 5(3):70-72(1992)；美国专利第4,833,080号)、蜕皮素诱导型基因表达系统(No等人，PNAS,93(8):3346-3351(1996))、cumate基因开关系统(Mullick等人，BMC Biotechnology,6:43(2006))、以及他莫昔芬(tamoxifen)诱导型基因表达(Zhang等人，Nucleic AcidsResearch,24:543-548(1996))以及其他。这些控制系统的目标是用于体外和体内实验两者中的蛋白的可调节产生。然而，这些系统的单独应用基本上是“一次性的(one-off)”，即在单个控制系统下的单个基因不允许具有多种逻辑控制机制的复杂生物回路(biologicalcircuit)的构建。
产生全功能哺乳动物合成染色体的能力代表了用于基于细胞的遗传紊乱的校正和生物通路的产生的强大系统。全功能哺乳动物合成染色体提供了超过基于细菌的和基于病毒的递送系统的几个优势，包括增加的有效负载(payload)尺寸、染色体外维持的事实避免了潜在的宿主细胞破坏、引入的基因的转录沉默和可能的免疫学并发症的避免以及哺乳动物合成染色体可以源自合成染色体待被插入到其中的物种并针对该物种进行定制。因为合成染色体可以被工程化为包含多于一个位点特异性的整合位点，并且可以携带大的有效负载，合成染色体提供构建在其上可以装载多于一个基因控制系统的便携式生物回路板的机会。本领域对构建复杂生物表达控制系统的能力的存在需求。本发明提供了解决该需求的方法和组合物。
发明概述
提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势从以下撰写的详述包括附图中阐释的和所附的权利要求中限定的那些方面将是明显的。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于用各自在调节控制系统的控制下的至少两个靶核酸工程化受体细胞的方法，所述方法包括：用合成染色体产生组分转染第一受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；用包含在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的第一递送载体转染第一受体细胞系；激活合成的平台染色体与第一递送载体之间的位点特异性重组，其中在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸被装载到合成的平台染色体上，以产生表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的合成染色体；分离包含表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的合成染色体的第二受体细胞；使第二受体细胞生长；用包含在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的第二递送载体转染第二受体细胞；激活合成的平台染色体与第二递送载体之间的位点特异性重组，其中在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸被装载到合成的平台染色体上，以产生表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸和在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的合成染色体；以及分离包含表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸和在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的合成染色体的第三受体细胞。
在该实施方案的一些方面，所述方法还包括经由第一调节控制系统和第二调节控制系统诱导第一靶核酸和第二靶核酸的转录的步骤。
本发明的又其他实施方案，提供了一种用于用各自在调节控制系统的控制下的至少两个靶核酸工程化受体细胞的方法，所述方法包括：用合成染色体产生组分转染第一受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；用包含在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的第一递送载体转染第一受体细胞系，其中第一靶核酸的基因产物调节第二靶核酸的转录；激活合成的平台染色体与第一递送载体之间的位点特异性重组，其中在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸被装载到合成的平台染色体上，以产生表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的合成染色体；分离包含表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的合成染色体的第二受体细胞；使第二受体细胞生长；用包含在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的第二递送载体转染第二受体细胞，其中第二调节控制系统由第一靶核酸的基因产物调节；激活合成的平台染色体与第二递送载体之间的位点特异性重组，其中在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸被装载到合成的平台染色体上，以产生表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸和在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的合成染色体；分离包含表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸和在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的合成染色体的第三受体细胞；经由第一调节控制系统诱导第一靶核酸的转录以产生第一基因产物；以及经由第一基因产物调节第二靶核酸的转录。
在该实施方案的一些方面，第一靶核酸的基因产物诱导第二靶核酸的转录；并且在一些实施方案中，第一靶核酸的基因产物阻遏第二靶核酸的转录。
本发明的又其他实施方案，提供了一种用于用各自在调节控制系统的控制下的至少三个靶核酸工程化受体细胞的方法，所述方法包括：用合成染色体产生组分转染第一受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；用包含在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的第一递送载体转染第一受体细胞系，其中第一靶核酸的基因产物调节第三靶核酸的转录；激活合成的平台染色体与第一递送载体之间的位点特异性重组，其中在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸被装载到合成的平台染色体上，以产生表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的合成染色体；分离包含表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的合成染色体的第二受体细胞；使第二受体细胞生长；用包含在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的第二递送载体转染第二受体细胞，其中第二靶核酸的基因产物调节第三靶核酸的转录；激活合成的平台染色体与第二递送载体之间的位点特异性重组，其中在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸被装载到合成的平台染色体上，以产生表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸和在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的合成染色体；分离包含表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸和在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的合成染色体的第三受体细胞；使第三受体细胞生长；用包含在第三调节控制系统的控制下的第三靶核酸的第三递送载体转染第三受体细胞，其中第一靶核酸和第二靶核酸的基因产物经由第三调节控制系统调节第三靶核酸的转录；激活合成的平台染色体与第三递送载体之间的位点特异性重组，其中在第三调节控制系统的控制下的第三靶核酸被装载到合成的平台染色体上，以产生表达在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸、在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸和在第三调节控制系统的控制下的第三靶核酸的合成染色体；经由第一调节控制系统和第二调节控制系统诱导第一靶核酸和第二靶核酸的转录以产生第一基因产物和第二基因产物；以及经由第一基因产物和第二基因产物调节第三靶核酸的转录。
在该实施方案的方面中，第一基因产物和第二基因产物两者都是调节第三靶核酸的转录所必需的；以及在其他实施方案中，第一基因产物或第二基因产物调节第三靶核酸的转录。在一些实施方案中，第三靶核酸的调节是诱导第三靶核酸的转录，以及在其他实施方案中，第三靶核酸的调节是阻遏第三靶核酸的转录。
在所有实施方案的某些方面，第一调节控制系统和/或第二调节控制系统可以选自Tet-On、Tet-Off、Lac开关诱导型、蜕皮素诱导型、cumate基因开关或他莫昔芬诱导型系统。
另外，所有实施方案的方面包括分离的细胞，所述分离的细胞包含含有第一靶核酸；第一靶核酸和第二靶核酸；和/或第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸的合成染色体；以及在其上装载了第一靶核酸；第一靶核酸和第二靶核酸；以及第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸的合成染色体。
本发明的这些及其他方面和用途将在详述中描述。
附图简述
图1A是本发明的方法的一个实施方案的简化示意图，其中基因1和基因2处于不同基因调节控制系统的控制下。图1B是本发明的方法的一个实施方案的简化示意图，其中在当诱导物改变时产生的基因产物之间存在切换。
图2是本发明的方法的可选的实施方案的简化示意图，其中基因1处于基因调节控制系统的控制下，并且基因2的表达由基因1的基因产物诱导。
图3是本发明的方法的另一个可选的实施方案的简化示意图，其中基因1处于基因调节控制系统的控制下，并且基因2的表达被基因1的基因产物阻遏。
图4是本发明的方法的又另一个实施方案的简化示意图，其中基因1和基因2处于不同基因调节控制系统的控制下，并且基因3由基因1和基因2的组合的基因产物诱导。
图5是本发明的方法的又另一个实施方案的简化示意图，其中基因1和基因2处于不同基因调节控制系统的控制下，并且基因3由基因1的基因产物或基因2的基因产物诱导。
图6是TET调节物递送载体的简化示意图。
图7是Cumate调节物递送载体的简化示意图。
图8是将scFV多重调节(multiregulable)表达载体装载到合成染色体上的简化示意图。
图9是多重调节scFv表达递送载体的简化示意图。
发明详述
除非另外指示，本文描述的方法可以采用分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和细胞工程化技术的常规技术和描述，这些都在本领域的技术人员的技术内。这样的常规技术包括寡核苷酸合成、寡核苷酸杂交和连接、细胞转化和转导、重组系统的工程化、转基因动物和植物的产生以及人类基因疗法。合适的技术的具体的说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然也可以使用等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以见于标准实验室手册中，诸如Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)(Green等人编著，1999)；Genetic Variation:A Laboratory Manual(Weiner等人编著，2007)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2006)；以及Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2002)(全部来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner等人编著，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编著，Academic Press1995)；Immunology Methods Manual(Lefkovits编著，Academic Press 1997)；GeneTherapy Techniques,Applications and Regulations From Laboratory to Clinic(Meager编著，John Wiley&Sons 1999)；M.Giacca,Gene Therapy(Springer2010)；GeneTherapy Protocols(LeDoux编著，Springer 2008)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths编著；John Wiley&Sons1998)；Mammalian Chromosome Engineering-Methods and Protocols(G.Hadlaczky编著，Humana Press 2011)；Essential Stem Cell Methods,(Lanza和Klimanskaya编著，Academic Press 2011)；Stem Cell Therapies:Opportunities for Ensuring theQuality and Safety of Clinical Offerings:Summary of a Joint Workshop(Board onHealth Sciences Policy,National Academies Press 2014)；Essentials of Stem CellBiology，第三版，(Lanza和Atala编著，Academic Press 2013)；以及Handbook of StemCells,(Atala和Lanza编著，Academic Press 2012)，其全部用于所有目的通过引用以其整体并入本文。在描述本发明的组合物、研究工具和方法之前，应当理解本发明不局限于描述的特定的方法、组合物、目标和用途，因为这些当然可变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。
应当注意，除非上下文另外明确指示，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“组合物”指一种组合物或更多种组合物的混合物，并且提及“测定”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤和方法，等等。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，用于描述和公开在出版物中描述并且可与本文描述的发明关联使用的装置、制剂和方法的目的。
在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每一个居间值以及在该规定的范围中的任何其他规定的值或居间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，受制于规定的范围中的任何特异性排除的限制。在规定的范围包括上限和下限两者的情况下，排除那些包括的限制的仅一个的范围也被包括在本发明内。
在以下的描述中，阐述许多具体细节，以便提供对本发明的更彻底的理解。然而，对于本领域普通技术人员在阅读本说明书后将明显的是，本发明可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下被实践。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。
定义
除非明确规定，本文使用的术语意图具有如由本领域普通技术人员所理解的一般且普通的含义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并不意图改变或以其他方式限制这样的术语的含义，除非特别地指示。
如本文使用的“结合”(例如，提及多肽的核酸结合结构域)指多肽与核酸之间的非共价相互作用。当处于非共价相互作用的状态中时，多肽和核酸被认为是“缔合的”、“相互作用”或“结合”。结合相互作用通常通过小于10-6M至小于10-15M的解离常数(Kd)来表征。“亲和力”指结合强度，增加的结合亲和力与较低的Kd相关。
“结合结构域”意指能够非共价结合另一分子的多肽或蛋白结构域。结合结构域可以结合，例如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。
“着丝粒”为赋予染色体通过细胞分裂分离至子细胞的能力的任何核酸序列。着丝粒可以通过有丝分裂和减数分裂赋予核酸序列(包括包含着丝粒的合成染色体)的稳定分离。着丝粒不必然需要源自与其被引入的细胞相同的物种，但优选地，着丝粒具有在该物种的细胞中促进DNA分离的能力。“双着丝粒(dicentric)”染色体为包含两个着丝粒的染色体。“前双着丝粒染色体(formerly dicentric chromosome)”为当双着丝粒染色体片段化时产生的染色体。“染色体”为在细胞分裂时能够在细胞中复制和分离的核酸分子和缔合的蛋白。通常，染色体包含着丝粒区域、复制起点、端粒区域及着丝粒区域与端粒区域之间的核酸区域。“近端着丝粒染色体(acrocentric chromosome)”指具有不等长度的臂的染色体。
“编码序列”或“编码”肽的序列为当被置于适当的控制序列的控制下时体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界通常由在5’(氨基)端处的起始密码子和在3’(羧基)端处的翻译终止密码子确定。
术语DNA“控制序列”共同地指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、增强子等，它们共同地提供受体细胞中的编码序列的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。
“内源染色体”指在产生或引入合成染色体之前在细胞中发现的染色体。
如本文使用的，“常染色质”指弥散地(diffusely)染色并通常包含基因的染色质，且“异染色质”指保持异常凝聚并被认为是转录不活跃的染色质。高度重复的DNA序列(卫星DNA)通常位于着丝粒周围的异染色质区域。
术语“异源DNA”或“外来(foreign)DNA”(或“异源RNA”或“外来RNA”)可互换使用，并且指不作为它存在于其中的基因组的一部分天然地存在的DNA或RNA，或者在不同于它在自然界中存在的位置的一个位置或更多个位置(a location or locations)和/或以不同于它在自然界中存在的量的量在基因组或细胞中发现的DNA或RNA。异源DNA的实例包括，但不限于，编码感兴趣的一种基因产物或更多种基因产物(a gene product or geneproduct(s))的DNA。异源DNA的其他实例包括，但不限于，编码可跟踪标志物蛋白的DNA以及调节DNA序列。
如本文使用的术语“诱导物”包括直接或间接诱导基因转录的任何生物分子，诸如Tet-On系统中的多西环素、Cumate-Switch系统中的cumate、其他天然分子以及人造的、工程化的分子。
“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以进行它们的通常功能的元件的排布。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响该编码序列的表达。只要控制序列起作用以指导编码序列的表达，控制序列不必与编码序列邻接。因此，例如，居间的非翻译但转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必位于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有导致改变的调节的相互作用。
“启动子”或“启动子序列”为能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、核仁小核RNA(small nuclear of nucleolar RNA)或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调节区域。
受体细胞是用于产生合成染色体、合成的平台染色体或被生物工程化以包含给定的DNA元件的合成的平台染色体的组分所进入的细胞。受体细胞的类型可以包括但不限于：干细胞、间充质干细胞、成体来源的干细胞、T细胞、免疫细胞、诱导多能(pluripotent)干细胞、成纤维细胞、内皮细胞，中胚层、外胚层和内胚层的细胞。还包括肿瘤细胞细胞培养物系、原代细胞和生殖细胞。然后可以将细胞例如培养、准备用于移植、用于产生完整的转基因动物等。
“识别序列”为蛋白、DNA或RNA分子或其组合(诸如，但不限于，限制性内切核酸酶、修饰甲基化酶或重组酶)识别并结合的特定核苷酸序列。例如，Cre重组酶的识别序列为包含位于8个碱基对核心侧翼的两个13个碱基对反向重复序列(作为重组酶结合位点)的34个碱基对序列并被指定为loxP(参见，例如，Sauer,Current Opinion in Biotechnology,5:521-527(1994))。识别序列的其他实例包括，但不限于，由重组酶噬菌体λ整合酶识别的attB和attP、attR和attL等等。指定为attB的重组位点为包含两个9个碱基对核心型Int结合位点和7个碱基对重叠区域的约33个碱基对序列；attP为包含核心型Int结合位点和臂型Int结合位点以及用于辅助蛋白IHF、FIS和Xis的位点的约240个碱基对序列(参见，例如，Landy,Current Opinion in Biotechnology,3:699-7071(1993))。
“重组酶”为催化DNA区段在特定重组位点处交换的酶。整合酶指通常源自病毒或转座子以及可能的古老病毒的重组酶。“重组蛋白”包括使用一个或更多个重组位点参与重组反应的切除蛋白(excisive protein)、整合蛋白、酶、辅因子和相关蛋白(参见，Landy,Current Opinion in Biotechnology,3:699-707(1993))。本文方法中使用的重组蛋白可以经由在适当的载体诸如质粒等上的表达盒递送至细胞。在其他实施方案中，重组蛋白可以以在用于递送期望核酸的同一反应混合物中的蛋白形式递送至细胞。又在其他实施方案中，重组酶也可以在细胞中编码并且使用严格控制的诱导型启动子根据需要进行表达。
“核糖体RNA”(rRNA)为形成核糖体结构的部分并参与蛋白合成的专门RNA。核糖体RNA由基因的转录产生，所述基因在真核细胞中以多于一个拷贝存在。在人类细胞中，约250个拷贝的rRNA基因(即，编码rRNA的基因)/单倍体基因组以簇的形式分散在至少五个不同染色体(染色体13、14、15、21和22)上。在人类细胞中，多于一个拷贝的高度保守的rRNA基因位于串联排列的rDNA单元系列中，所述串联排列的rDNA单元系列通常长度为约40-45kb，并且包含转录区域和称为间隔区(即，基因间的间隔区)DNA的非转录区域，所述间隔区(即，基因间的间隔区)DNA的长度和序列可以变化。
如本文使用的，术语“可选择标志物(selectable marker)”指引入到细胞，特别地在本发明的上下文中，引入到培养物中的细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的可选择标志物为本领域普通技术人员熟知的。在优选的实施方案中，用于在人类合成染色体系统中使用的可选择标志物在人类中应该是非免疫原性的，并且包括，但不限于：人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；荧光MTX底物可用)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；荧光底物可用)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的耐受性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂(alkylator)白消安缀合；CD34+细胞中的化学保护性可选择标志物)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰基乙酰基-L-天冬氨酸(N-phosphonacetyl-L-aspartate；PALA)的耐受性的人类CAD基因；人类多药耐受性1(MDR-1；通过增加的药物耐受性可选择或通过FACS富集的P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；通过Mab-FITC可检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；通过卡莫司汀可选择)；和胞苷脱氨酶(CD；通过Ara-C可选择)。还可以采用药物可选择标志物诸如嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素、G418、四环素。另外，使用FAC分选，如化学发光标志物(例如Halo标签)等可用于阳性选择一样，任何荧光标志物基因可以用于阳性选择。
“位点特异性重组”指在单个核酸分子上的两个特定位点之间或在两个不同分子之间的需要外源蛋白诸如整合酶或重组酶存在而起作用的位点特异性重组。某些位点特异性重组系统可以用于特异性缺失、倒位或插入DNA，其中精确事件由特定位点的取向、特定系统和辅助蛋白或因子的存在控制。另外，DNA区段可以在染色体之间交换，如图4中描述的(染色体臂交换)。
“合成染色体”(也称为“人工染色体”)为具有适应和表达异源基因的能力并且在细胞中与内源染色体一起稳定复制和分离的核酸分子，通常是DNA分子。“哺乳动物合成染色体”指具有活性哺乳动物着丝粒的染色体。“人类合成染色体”指包含在人类细胞中起作用的着丝粒并且优选地在人类细胞中产生的染色体。对于示例性人工染色体，参见，例如，美国专利第8,389,802号；第7,521,240号；第6,025,155号；第6,077,697号；第5,891,691号；第5,869,294号；第5,721,118号；第5,712,134号；第5,695,967号；和第5,288,625号以及公布的国际PCT申请第WO 97/40183号和第WO 98/08964号。
术语“受试者”、“个体”或“患者”可以在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，并且在一些实施方案中指人类。
“载体”为可以附接另一个DNA区段的复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒构建体、粘粒、细菌人工染色体、P-1来源的人工染色体或酵母人工染色体。在一些情况下，载体可以为染色体，诸如在从被工程化为包含重组位点的一个内源染色体臂交换至合成染色体的情况下。载体用于在细胞中转导和表达DNA区段。
本发明
本发明涵盖允许人们由单个合成染色体递送和表达所有来自多于一个基因调节控制系统的多于一个基因的组合物和方法。具有其大携带能力的合成染色体可以携带和表达多于一个基因产物—并且这些多于一个基因产物可以处于不同的调节控制系统的控制下—从而规避了基于病毒和基于质粒的核酸递送的限制。本发明提供了允许在合成的平台染色体上构建复杂的可调节表达系统的方法和组合物，并且适用于合成染色体产生的所有方法，包括“自上而下”方法(“top down”approach)、“自下而上”方法(“bottom up”approach)、天然存在的微型染色体的工程化以及通过特定染色体区段的靶向扩增的诱导的从头染色体产生(所有这些都在下文中更详细地讨论)。
合成的或ACE平台染色体是可以用于多种基于细胞的蛋白产生、基因表达调节或治疗应用的合成染色体。在合成的平台染色体的产生期间，将整合酶介导的异源核酸位点特异性整合所需的独特DNA元件/序列掺入到合成染色体中，这允许工程化合成染色体。由于整合酶靶向序列在合成染色体产生期间被扩增，大量位点特异性重组位点被掺入到合成染色体上，并可用于通过包含多于一个基因调节控制系统的递送载体多重装载合成的平台染色体。
具有多于一个基因调节控制系统的合成的平台染色体的实例是包含Tet-On和Cumate Switch基因调节系统两者的合成的平台染色体。将Tet-On和Cumate Switch调节控制系统由合成的平台染色体工程化并表达，使得在这些调节控制系统的控制下的基因在添加诱导物时由合成的平台染色体表达；多西环素是Tet-On系统的诱导物，并且cumate是cumate Switch系统的诱导物。例如，可以将治疗性蛋白诸如抗体或抗体片段在递送载体上编码，并装载到合成染色体平台上，使得抗体和/或片段处于Tet-On或Cumate-Switch的控制下。当诱导物多西环素和cumate都存在时，所有抗体或抗体片段同时被表达。可选地，Tet-On和Cumate-Switch—以及处于Tet-On或Cumate-Switch系统的控制下的一个或更多个基因—可以独立地被诱导。本发明的该实施方案的示意图示于图1A中。图1A示出了在合成染色体上的两个示例性基因，基因1和基因2的工程化和表达。当基因诱导物1和基因诱导物2都存在时，基因产物1和基因产物2两者都被表达。当仅基因诱导物1存在时，仅基因产物1由合成染色体产生。当仅基因诱导物2存在时，仅基因产物2由合成染色体产生。图1B是简化示意图，其中基因产物的表达在诱导物1存在的情况下进行，并且在诱导物1不存在且诱导物2存在的情况下，仅基因产物2由合成染色体合成。
使用合成染色体用于调节的基因表达的另一个实施方案示于图2中。图2说明了第一表达的基因的基因产物诱导第二基因的表达的情景。图2示出了在合成染色体上的提供信号输出放大的示例性生物回路。当诱导物1不存在时，不存在基因产物1或基因产物2的产生。然而，当诱导物1存在时，基因1被转录，基因产物1被表达，并且基因产物1继而诱导基因2的转录和翻译以及基因产物2的合成。使用该实施方案的一个实例是赋予增加的细胞存活的多重装载的基因的协同表达。在该示例性情景中，多重装载的基因由合成染色体定位并表达，所述合成染色体在响应于肿瘤攻击时赋予增加的细胞存活。肿瘤细胞采用多种方法逃避识别并降低T细胞功能；然而，该攻击可以通过以下来规避：工程化T细胞以由共同的调节控制系统表达抑制细胞周期停滞响应的多重装载因子；例如，表达编码免疫和细胞周期检查点蛋白的抑制剂，诸如抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)和抗CTLA-4(中央T细胞活化和抑制4)的基因。因此，由一种诱导调节控制系统，可以产生多于一种基因产物以增强免疫细胞功能。
与图2中所说明的实施方案相比，来自合成染色体的第二基因的表达可以由在第一调节控制系统的控制下的第一基因产生的第一基因产物的存在而被阻遏。图3示出了生物回路的抑制，其中在不存在诱导物1且存在诱导物2的情况下，基因2被转录并且基因产物2被合成；然而，在诱导物1和诱导物2的存在下，诱导物1阻遏基因2的转录和基因产物2的合成。
在本发明的其他实施方案中，构建了更复杂的“逻辑”回路。例如，可以构建逻辑“和(AND)”开关，使得两个基因的表达和两个基因产物的产生导致第三基因的表达和第三产物的产生。图4图示了该实施方案。图4示出了诱导物1或诱导物2独自存在不足以诱导基因3的转录和基因产物3的合成；然而，诱导物1和诱导物2的组合诱导基因3的转录和基因产物3的合成。
又在另一个实施方案中，构建逻辑“或(OR)”开关，其中诱导物1或诱导物2的存在可以导致基因1或基因2的表达、基因产物1或基因产物2的产生、以及基因3的表达和基因产物3的产生。图5图示了该实施方案。注意，在图1-5中概述的回路和逻辑开关(“和”/“或”)可以与位于细胞内的内源细胞诱导物或另外的外源DNA(例如，除合成染色体之外的载体)上编码的诱导物协同起作用。例如，可以在平台合成染色体上工程化调节控制系统，以响应于从组织环境发出的外源信号，诸如IL-2响应性启动子，该IL-2响应性启动驱动将在肿瘤微环境中表达的因子(例如抗肿瘤因子)的表达。
合成染色体产生
在培养的细胞中产生合成染色体。在一些实施方案中，待被工程化和/或产生合成染色体的细胞可以是天然存在于受试者(人类患者、动物或植物)中的细胞，其中来自合成染色体的基因或调节序列将最终被表达。这样的细胞可以是出于对个体特异性的合成染色体产生的目的而建立的原代培养物细胞系。在其他实施方案中，待被工程化和/或产生合成染色体的细胞来自已建立的细胞系。用于组织培养的多种细胞系为本领域中已知的。细胞系的实例包括但不限于人类细胞系诸如293-T(胚胎肾)、721(黑素瘤)、A2780(卵巢)、A172(成胶质细胞瘤)、A253(癌)、A431(上皮细胞)、A549(癌)、BCP-1(淋巴瘤)、BEAS-2B(肺)、BR293(乳腺)、BxPC3(胰腺癌)、Cal-27(舌)、COR-L23(肺)、COV-434(卵巢)、CML T1(白血病)、DU145(前列腺)、DuCaP(前列腺)、FM3(淋巴结)、H1299(肺)、H69(肺)、HCA2(成纤维细胞)、HEK0293(胚胎肾)、HeLa(子宫颈)、HL-60(原粒细胞)、HMEC(上皮细胞)、HT-29(结肠)、HUVEC(脐静脉上皮细胞)、Jurkat(T细胞白血病)、JY(类淋巴母细胞)、K562(类淋巴母细胞)、KBM-7(类淋巴母细胞)、Ku812(类淋巴母细胞)、KCL22(类淋巴母细胞)、KGI(类淋巴母细胞)、KYO1(类淋巴母细胞)、LNCap(前列腺)、Ma-Mel(黑素瘤)、MCF-7(乳腺)、MDF-10A(乳腺)、MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-435(乳腺)、MG63(骨肉瘤)、MOR/0.2R(肺)、MONO-MAC6(白血细胞)、MRC5(肺)、NCI-H69(肺)、NALM-1(外周血)、NW-145(黑素瘤)、OPCN/OPCT(前列腺)、Peer(白血病)、Raji(B淋巴瘤)、Saos-2(骨肉瘤)、Sf21(卵巢)、Sf9(卵巢)、SiHa(子宫颈癌)、SKBR3(乳腺癌)、SKOV-2(卵巢癌)、T-47D(乳腺)、T84(肺)、U373(成胶质细胞瘤)、U87(成胶质细胞瘤)、U937(淋巴瘤)、VCaP(前列腺)、WM39(皮肤)、WT-49(类淋巴母细胞)、YAR(B细胞)、胚胎细胞系、多能细胞系、成体来源的干细胞、重编程细胞系、任何物种或广泛的胚胎或重编程细胞的通用动物细胞系、患者自体细胞系，并且，在一些优选的实施方案中，利用了HT1080人类细胞系。这些细胞系和其他细胞系从本领域技术人员已知的多种来源可得(参见，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,Va.))。
在一个或更多个调节控制系统的控制下表达多于一个基因的合成染色体的工程化适用于本领域中使用的所有“自上而下”、“自下而上”、微型染色体工程化和诱导的从头染色体产生方法。合成染色体形成的“自下而上”方法依赖于用克隆的α-卫星序列转染允许细胞系后细胞介导的从头染色体形成，所述克隆的α-卫星序列包括典型的宿主细胞适当的着丝粒和可选择标志物基因，具有或不具有端粒和基因组DNA。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Harrington等人，Nat.Genet.,15:345-55(1997)；Ikeno等人，Nat.Biotechnol.,16:431-39(1998)；Masumoto等人，Chromosoma,107:406-16(1998)；Ebersole等人，Hum.Mol.Gene.,9:1623-31(2000)；Henning等人，PNAS USA,96:592-97(1999)；Grimes等人，EMBO Rep.2:910-14(2001)；Mejia等人，Genomics,79:297-304(2002)；以及Grimes等人，Mol.Ther.,5:798-805(2002).)。被克隆到酵母人工染色体、细菌人工染色体或P1来源的人工染色体载体中的合成和天然存在的α-卫星阵列两者在本领域中已用于从头合成的染色体形成。自下而上组装的产物可以是线性的或圆形的，包括具有基于α-卫星DNA的着丝粒的简化和/或多联体化的输入DNA，并且通常尺寸范围在1Mb与10Mb之间。自下而上来源的合成染色体也被工程化以掺入允许将靶DNA序列位点特异性整合到合成染色体上的核酸序列。
产生合成染色体的“自上而下”方法包括顺序轮次的预先存在的染色体臂的随机和/或靶向截断，以产生包括着丝粒、端粒和DNA复制起点的简练(pared down)的合成染色体。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Heller等人，PNAS USA,93:7125-30(1996)；Saffery等人，PNAS USA,98:5705-10(2001)；Choo,Trends Mol.Med.,7:235-37(2001)；Barnett等人，Nuc.Ac.Res.,21:27-36(1993)；Farr等人，PNAS USA,88:7006-10(1991)；以及Katoh等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,321:280-90(2004).)。“自上而下”合成染色体被最佳构建为不含天然存在的表达的基因，并被工程化为包含这样的DNA序列，所述DNA序列允许由例如位点特异性DNA整合酶介导的靶DNA序列位点特异性整合到截短的染色体上。
本领域已知的产生合成染色体的第三种方法为天然存在的微型染色体的工程化。该产生方法通常包括照射诱导的染色体片段化，该染色体包含功能性的，例如人类新着丝粒，其具有着丝粒功能但缺乏α-卫星DNA序列，并被工程化为不含非必需DNA。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Auriche等人，EMBO Rep.2:102-07(2001)；Moralli等人，Cytogenet.Cell Genet.,94:113-20(2001)；以及Carine等人，Somat.Cell Mol.Genet.,15:445-460(1989).)。与产生合成染色体的其他方法一样，工程化微型染色体可以被工程化为包含允许靶DNA序列的位点特异性整合的DNA序列。
用于产生合成染色体的第四种并且优选的方法包括通过特定染色体区段的靶向扩增的诱导的从头染色体产生。该方法包括位于近端着丝粒染色体上的近着丝粒区(pericentromeric)/核糖体DNA区域的大规模扩增。通过对染色体的臂间区域(诸如核糖体RNA)特异性的过量DNA以及允许靶DNA序列的位点特异性整合的DNA序列(诸如attP、attB、attL、attR等)以及任选地整合到染色体的臂间区域的所有的可选择标志物的共转染触发扩增。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Csonka等人，J.Cell Sci 113:3207-16(2002)；Hadlaczky等人，Curr.Opini.Mol.Ther.,3:125-32(2001)；以及Lindenbaum和Perkins等人，Nuc.Ac.Res.,32(21):el72(2004).)。在该过程期间，通过共转染的DNA靶向近端着丝粒染色体的臂间区域诱导大规模染色体DNA扩增、着丝粒序列的复制/激活、以及随后的双着丝粒染色体的裂开和分离，产生“包含多于一个位点特异性整合位点的基于断裂(break-off)”的卫星DNA的合成染色体。
合成的平台染色体技术的一个组成部分是位点特异性重组系统，其允许将选择的调节控制系统和基因“装载”或放置到合成染色体上。在本发明的优选的实施方案中，合成的平台染色体包含多于一个位点特异性重组位点，在所述多于一个位点特异性重组位点的每一个中可以插入一个或几个感兴趣的基因。可以使用任何已知的重组系统，包括使用来自大肠杆菌(E.coli)噬菌体P1的Cre重组酶的Cre/lox重组系统(参见，例如，Sauer,Methods in Enzymology,225:890-900(1993)和美国专利第5,658,772号)；使用来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μ附加体的FLP重组酶的酵母FLP/FRT系统(参见，例如，Cox,PNAS U.S.A.,80:4223(1983)和美国专利第5,744,336号)；解离酶，包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser等人，Mol Gen Genet.,230:170-176(1991)),Cin、Hin、αδ、Tn3；大肠杆菌的Pin重组酶(参见，例如，Enomoto等人，J Bacteriol.,6:663-668(1983))；鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSRl质粒的R/RS系统(参见，例如，Araki等人，J.Mol.Biol.,225:25-37(1992))；来自Kluyveromyces drosophilarium(参见，例如，Chen等人，Nucleic Acids Res.,314:4471-4481(1986))以及克鲁雄酵母菌(Kluyveromyceswaltii)(参见，例如，Chen等人，J.Gen.Microbiol.,138:337-345(1992))的位点特异性重组酶；以及本领域技术人员已知的其他系统；然而，不需要另外因子—或者凭借突变而不需要另外因子操作的重组系统—是优选的。在一个示例性实施方案中，提供了一种用于使用细菌噬菌体λ整合酶的重组酶活性经由序列特异性重组将核酸插入到合成的平台染色体的方法。
λ噬菌体编码的整合酶(命名为“Int”)是整合酶家族的原型成员。经由命名为attB/attP和attL/attR的成对附接位点之间的重组，Int实现噬菌体进入和离开大肠杆菌基因组的整合和切除。每个att位点包含两个反向的9个碱基对核心Int结合位点和7个碱基对重叠区域，这与在野生型att位点中是相同的。像Cre重组酶和Flp-FRT重组酶系统一样，Int在整合重组和切除重组期间执行有序的序列对的链交换。Int、attB和attP或attL和attR的天然靶序列对位于相同或不同的DNA分子上，分别导致分子内或分子间重组。例如，分子内重组分别发生在反向取向的attB与attP之间，或者在attL与attR序列之间，导致居间DNA区段的倒位。尽管野生型Int需要另外的蛋白因子用于整合重组和切除重组以及负超螺旋化用于整合重组，但是突变体Int蛋白在人类细胞中的共转染测定中不需要辅助蛋白来进行分子内整合重组和切除重组(参见Lorbach等人，J Mol.Biol.,25 296:1175-1181(2000))并且对于本发明的方法是优选的。
在生物合成通路中递送多于一个基因的递送载体
待被用于将多于一个调节控制系统和多于一个基因递送或“装载”到合成的平台染色体上的递送载体的选择将取决于多种因素，诸如期望在其中繁殖的细胞的类型。适当的递送载体的选择在本领域技术人员的技术范围内，并且许多载体商购可得。为了制备递送载体，通常通过将基因序列连接到载体中的裂解的限制性酶位点处而将处于一个或更多个调节控制系统的控制下的一个或更多个基因插入到载体中。可选地，可以通过同源重组或位点特异性重组插入所期望的核苷酸序列。通常，通过在所期望的核苷酸序列的侧翼附接与载体同源的区域(例如cre-lox、att位点等)来实现同源重组。包含这样的序列的核酸可以通过例如寡核苷酸的连接，或通过使用包含同源性区域和所期望的核苷酸序列的部分两者的引物的聚合酶链式反应来添加。可以使用的示例性递送载体包括但不限于源自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的那些。例如，可以使用质粒载体诸如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp系列载体。噬菌体载体可以包括λgt10、λgt11、λgtl8-23、λZΑΡ/R和EMBL系列的噬菌体载体。可以利用的粘粒载体包括但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9(charomid 9)系列载体。另外的载体包括基于功能性致育质粒(fertility plasmid)(F-质粒)的细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和P1来源的人工染色体、源自P1噬菌体的DNA的DNA构建体(PACS)。可选地且优选地，重组病毒载体可以被工程化，包括但不限于源自病毒诸如疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒或牛乳头状瘤病毒的那些重组病毒载体。BAC载体由于它们携带大量核酸，即多于一个基因的能力，是对于本发明的优选递送载体。可选地，可以使用多于一个递送载体经由顺序装载将在调节控制系统的控制下的基因装载到合成的平台染色体上；即，可以经由第一递送载体将在第一调节控制系统的控制下的第一基因装载到合成的平台染色体上，可以经由第二递送载体将在第二调节控制系统的控制下的第二基因装载到合成的平台染色体上，如此类推。Perkins和Greene于2016年4月12日提交的USSN62/321,711中描述了在回收单个可选择标志物时顺序装载多于一个递送载体。
可以任选地存在在表达宿主中起作用的可选择标志物，以便于选择包含递送载体的细胞。另外，递送载体可以包括另外的元件；例如，递送载体可以具有一种或两种复制系统；因此允许其在生物体中，例如在用于表达的哺乳动物细胞中和在用于克隆和扩增的原核宿主中被维持。
使用λ整合酶介导的位点特异性重组—或任何其他重组酶介导的位点特异性重组—将在调节控制下的基因从递送载体引入或“装载”到合成的平台染色体上。因为合成的平台染色体包含多于一个位点特异性重组位点，多于一个基因可以被装载到单个合成的平台染色体上。介导位点特异性重组的重组酶可以通过在递送载体上编码重组酶的基因被递送至细胞，或者纯化的或包封的重组酶蛋白可以使用标准技术被递送至受体细胞。多于一个基因的每个都可能处于其自身调节控制系统的控制下；可选地，多于一个基因的表达可以经由基于病毒的或人类内部核糖体进入位点(IRES)元件来协同调节(参见，例如，Jackson等人，Trends Biochem Sci.15:477-83(1990)；以及Oumard等人，Mol.Cell.Biol.20:2755-2759(2000))或2A自裂解肽(参见，Kim等人，PLoS ONE,6(4),el8556.http://doi.org/10.1371/journal.pone.0018556)。另外，使用与在靶基因下游的荧光标志物—例如绿色、红色或蓝色荧光蛋白(GFP、RFP、BFP)—连接的IRES类型元件或2A肽允许鉴定表达整合的靶基因的合成的平台染色体。可选地或者另外，合成染色体上的位点特异性重组事件可以通过设计引物以通过PCR检测整合来快速筛选。
组分递送到合成染色体产生细胞
适用于合成染色体产生的组分和递送载体可以通过本领域已知的任何方法递送至受体细胞。术语转染和转化指外源核酸例如表达载体被宿主细胞接受，无论其事实上是否表达了任何编码序列。许多转染方法为本领域普通技术人员已知的，例如，通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、原生质体转化(包括聚乙二醇(PEG)介导的转化、电穿孔、原生质体融合和微细胞融合)、脂质介导的递送、脂质体、电穿孔、声致穿孔、显微注射，粒子轰击和碳化硅晶须介导的转化及其组合(参见，例如，Paszkowski等人，EMBO J.,3:2717-2722(1984)；Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.,199:169-177(1985)；Reich等人，Biotechnology,4:1001-1004(1986)；Klein等人，Nature,327:70-73(1987)；美国专利第6,143,949号；Paszkowski等人，于Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants中，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes，(Schell和Vasil，编著，AcademicPublishers 1989)；以及Frame等人，Plant J.,6:941-948(1994))；使用磷酸钙的直接摄取(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76:1373-1376(1979))；聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄取；脂质体转染(参见，例如，Strauss,Meth.Mol.Biol.,54:307-327(1996))；微细胞融合(Lambert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:5907-5911(1991)；美国专利第5,396,767号；Sawford等人，Somatic Cell Mol.Genet.,13:279-284(1987)；Dhar等人，Somatic CellMol.Genet.,10:547-559(1984)；以及McNeill-Killary等人，Meth.Enzymol.,254:133-152(1995))；脂质介导的运载体(carrier)系统(参见，例如，Teifel等人，Biotechniques,19:79-80(1995)；Albrecht等人，Ann.Hematol.,72:73-79(1996)；Holmen等人，In Vitro CellDev.Biol.Anim.,31:347-351(1995)；Remy等人，Bioconjug.Chem.,5:647-654(1994)；LeBolch等人，Tetrahedron Lett.,36:6681-6684(1995)；以及Loeffler等人，Meth.Enzymol.,217:599-618(1993))；或其他合适的方法。用于递送合成染色体的方法也被描述于美国申请系列第09/815,979号中。成功转染通常通过检测转染的细胞内异源核酸的存在，诸如例如宿主细胞内异源核酸的任何可视化、可选择标志物的表达或合成的平台染色体或递送载体的运行的任何迹象来确认。可用于实践本发明的递送方法的描述参见美国专利第5,011,776号；美国专利第5,747,308号；美国专利第4,966,843号；美国专利第5,627,059号；美国专利第5,681,713号；Kim和Eberwine，Anal.Bioanal.Chem.397(8):3173-3178(2010)。
可视化、分离以转移至受体免疫细胞
本发明的合成的平台染色体的产生和装载可以通过多种方法来监控。Lindenbaum和Perkins等人,Nucleic Acid Research,32(21):el72(2004)描述了使用现有技术中的技术产生基于哺乳动物卫星DNA的人工染色体表达(ACE)系统。在该现有技术的系统中，使用PCR产生的探针或切口平移的探针进行常规的单色和双色FISH分析和高分辨率FISH。为了检测端粒序列，使有丝分裂涂布物(spreads)与商购获得的肽核酸探针杂交。使用荧光显微术进行显微术。可选地，Perkins和Greene于2016年2月9日提交的PCT/US16/17179，描述了允许人们使用两种标记的标签经由标准化荧光技术实时监测合成染色体形成的组合物和方法：一种标记的标签对于用于产生合成的平台染色体的细胞系内的内源染色体是特异性的，且另一种不同地标记的标签对于待产生的合成染色体上的序列是特异性的。
合成染色体的分离和转移通常包括利用微细胞介导的细胞转移(MMCT)技术或染料依赖性染色体染色及随后的基于流式细胞术的分选。在MMCT技术中，供体细胞被化学诱导使得其染色体多核化，后续被包装到微细胞中，以及最终融合到受体细胞中。合成染色体已经被转移至受体细胞的建立通过药物选择和通过FISH确认的转移的染色体的完整递送来进行。可选地，可以使用基于流式细胞术的转移。对于基于流式细胞术的转移，将有丝分裂停滞的染色体分离并用DNA特异性染料染色，并且基于尺寸和差异染料染色进行流式分选。然后经由标准DNA转染技术将流式分选的染色体递送到受体细胞中，并且完整染色体的递送通过FISH来确定。又在另一个选择中，除了在Perkins和Greene于2016年2月9日提交的PCT/US16/17179中描述的合成染色体产生的可视化和监测之外，合成染色体标签还可以用于经由流式细胞术从合成染色体产生细胞中分离合成染色体，以及监测合成染色体到受体细胞的转移。
实施例
实施例1：基于卫星DNA的人工染色体的从头产生
对于合成染色体的从头产生，将外源DNA序列引入到HT1080合成染色体产生细胞系中，并且在整合到近端着丝粒染色体的臂间异染色质区域后，触发近端着丝粒染色体的短臂(rDNA/着丝粒区域)的大规模扩增。在扩增事件期间，着丝粒被复制，产生具有两个活性着丝粒的双着丝粒染色体。随后的有丝分裂事件导致双着丝粒染色体的裂解和分离，产生尺寸约20-120Mb的断裂物，其主要包含卫星重复序列，所述卫星重复序列具有共扩增的转染的转基因的亚结构域，该亚结构域也可包含扩增的rDNA拷贝。新产生的合成染色体通过经由被工程化到HT1080合成染色体产生细胞系中的内源染色体标签和合成染色体标签观察荧光染色体涂染(或FISH)进行验证。
在转染之前一天，将HT1080合成染色体产生细胞系的细胞以约2.0至8.0×104个贴壁细胞的密度分到24孔组织培养皿中，并将包含外源DNA的载体纯化(例如，使用QiagenEndoFree Plasmid Maxi试剂盒)、线性化，并确定用于转染的载体的浓度。喂养经培养的HT1080细胞3-5小时，然后转染。将225ng pSTV28HurDNA载体和12.5ngp15A7248lacEF1attPPuro载体/24孔半汇合组织培养皿用于使用标准转染试剂(例如，ThermoFisher Lipofectamine LTX、Promega的Viafect或Invitrogen的磷酸钙转染试剂盒)来转染HT1080细胞。pSTV28HurDNA载体包含核糖体DNA序列。p15A7248lacEF1attPPuro载体包含用于位点特异性重组系统的组分、LacO重复序列和氨苄青霉素和嘌呤霉素耐受性基因。将细胞在转染后维持1-3天，在该时间点将它们胰蛋白酶化并重新平铺在10cm培养皿上。在平铺时或在平铺后1-3天，将选择培养基添加至10cm培养皿。选择条件被维持10-21天，每2-3天更换培养基。当集落直径达到2-3mm时挑取抗生素耐受克隆。良好分离的集落是优选的。通过使用克隆柱(cloning cylinder)和胰蛋白酶取出细胞，并转移至24孔板中以用于扩增。
实施例2：产生TET阻遏物和Cumate阻遏物递送载体。
待掺入在合成的平台染色体上的可调节启动子系统的一个实施方案是TET-ON、多西环素诱导型表达系统(Clontech,Inc.)。使用pAPP500载体作为骨架递送载体，以将TET-ON转录调节物插入到合成染色体上。简言之，pEF1alpha-Tet3G转录调节物通过限制性消化(BsrGI和HindlII)分离，然后处理以填充5’末端，并连接到用EcoRY消化的pAPP500中。所得质粒载体(pAPP510；图6：在pApp590中，存在以下元件：SV40\聚A/信号＝SV40聚A；attB、AttL_Zeo＝位点特异性重组位点；人类/EF1α/Pr＝启动子；Tet-On/3G＝转录调节物；f1起点＝复制起点；ZeoR＝博来霉素(zeocin)耐受性)包含在用于靶向到合成的平台染色体上的attB重组位点后面编码的无启动子博来霉素耐受性标志物基因，以及TET-ON转录调节物。
第二可调节基因表达系统(Cumate-ON)将被整合到包含TET-ON的合成的平台染色体上，作为对于产生多于一种可调节的抗癌抗体片段的“原理证明”。将Cumate-ON转录调节物(CymR)克隆到pAPP570中。pAPP570包含在attB重组位点后面编码的无启动子潮霉素耐受性标志物基因。简言之，将包含Cumate-ON转录调节物的pUCMAR1CymR用SaiI消化，然后用Klenow处理以填充5’末端，并连接至已经用HindIII和XhoI消化的并Klenow处理的pAPP570上。所得质粒载体(pAPP590；图7：在pApp590中，存在以下元件：SV40\聚A/信号＝SV40聚A；attB＝位点特异性重组位点；EF1A1序列＝启动子；AmpR、HygR、CymR＝药物耐受性基因；ori＝复制起点；HA标签＝人类流感血凝素表位标签；bGH聚A和3’UTR暂停＝聚A；MAR＝基质附接区域。))包含在用于靶向到合成的平台染色体上的attB重组位点后面编码的无启动子潮霉素耐受性标志物基因，以及Cumate-ON转录调节物。
实施例3：将TET-ON和Cumate-ON转录调节物装载到合成染色体上
使用pAPP510和pAPP590载体作为递送载体，以将TET-ON转录调节物和Cumate-ON转录调节物分别顺序地插入到合成染色体上。在第0天，将包含合成染色体(hSynC)的受体细胞系(例如HT1080)以～4E4个细胞/24孔培养皿的孔接种，使得孔在第1天～70％汇合。将细胞在37℃、5％CO2在适当的培养基(例如，对于HT1080为DMEM+10％FC3)中孵育过夜。在第1天，按照制造商的说明(Fisher Scientific，具有Plus试剂的Lipofectamine LTX)，将递送载体(例如pAPP510)和编码重组蛋白的质粒(例如pCXLamIntR)两者转染到HT1080细胞中。转染以一式两份进行，以便可以进行药物选择和直接细胞分选的比较。将Lipofectamine LTX在Opti-MEM培养基中稀释(Gibco；1.5ul LTX/50ul Opti-MEM用于待转染的24孔培养皿的每个孔)，并且将250ng DNA添加至50ul在Opti-MEM中稀释的LTX中(例如，125ng pAPP510质粒和125ng pCXLamIntR/孔)。将0.25ul PLUS试剂添加至每个～50ulDNA-LTX-Opti_MEM样品中，并且将每个样品在室温孵育5分钟。然后将培养基从第0天铺板的细胞中去除，并且在5分钟孵育期间使用新鲜培养基替换培养基。将DNA-脂质复合物添加至细胞，并且在37℃、5％CO2在适当的培养基中孵育。
在第2-24天，进行药物选择。将来自一式两份24孔的孔的一个孔的细胞胰蛋白酶化并转移至10cm的培养皿中，该培养皿具有包含药物选择(例如，在100ug/ml的博莱霉素)的新鲜培养基。然后将细胞在37℃、5％CO2在适当的培养基中孵育，并且监测集落形成。约每72小时替换一次培养基。当形成明显的集落时(约10天)，将每个集落通过玻璃柱分离、胰蛋白酶化并转移至24孔培养皿的孔中。然后将这些“克隆”在培养物中扩增，直到有足够的细胞可用于将克隆置于冷藏中并分离基因组DNA(约2周；Promega Wizard SV Genomic DNAPurification)，用于PCR分析。
包含感兴趣的基因/DNA元件的递送载体的整合通过使用适当的PCR引物产生跨越合成染色体与递送载体(pAPP510)之间重组位点的独特PCR产物来鉴定。水和宿主基因组DNA(例如HT1080)的阴性对照PCR反应与测试基因组DNA样品一起进行。
在鉴定包含适当地装载到合成染色体上的TET-ON转录调节物的候选克隆后，进行测试以评价TET-ON转录调节物在TRE-紧密启动子(TetP)的控制下控制分泌的萤光素酶的表达的能力。将在不具有多西环素(TET-ON诱导物)的培养基中显示低萤光素酶表达并在多西环素的存在下显示高表达的候选克隆置于长期冷藏中。最佳候选克隆，命名为“A1”，被选择用于递送Cumate-ON转录调节物。当位于合成的平台染色体上时，该系统显示出在TET-ON启动子的调节控制下的瞬时转染的萤光素酶基因报告物的稳健的、多西环素依赖性的诱导。
Cumate-ON转录调节物将被递送至包含TET-ON转录调节物的A1细胞系。在第0天，将包含先前装载有TET-ON转录调节物的合成染色体(hSynC)的受体细胞系(例如HT1080-A1)以～4E4个细胞/24孔培养皿的孔接种，使得孔在第1天～70％汇合。将细胞在37℃、5％CO2在适当的培养基(例如，对于HT1080，DMEM+10％FC3)中孵育过夜。在第1天，按照制造商的说明(Fisher Scientific，具有Plus试剂的Lipofectamine LTX)，将递送载体(例如pAPP590)和编码重组蛋白的质粒(例如pCXLamIntR)两者转染到HT1080-A1细胞系中。转染以一式两份进行，以便可以进行药物选择和直接细胞分选的比较。将Lipofectamine LTX在Opti-MEM培养基中稀释(Gibco；1.5ul LTX/50ul Opti-MEM用于待转染的24孔培养皿的每个孔)，并且将250ng DNA添加至50ul在Opti-MEM中稀释的LTX中(例如，125ng pAPP590质粒和125ng pCXLamIntR/孔)。将0.25ul PLUS试剂添加至每个～50ul DNA-LTX-Opti_MEM样品中，并且将每个样品在室温孵育5分钟。然后将培养基从第0天铺板的细胞中去除，并且在5分钟孵育期间使用新鲜培养基替换培养基。将DNA-脂质复合物添加至细胞，并且在37℃、5％CO2在适当的培养基中孵育。
在第2-24天，进行药物选择。将来自一式两份24孔的孔的一个孔的细胞胰蛋白酶化并转移至10cm的培养皿中，该培养皿具有包含药物选择(例如，在100ug/ml的潮霉素)的新鲜培养基。然后将细胞在37℃、5％CO2在适当的培养基中孵育，并且监测集落形成。约每72小时替换一次培养基。当形成明显的集落时(约10天)，将每个集落通过玻璃柱分离、胰蛋白酶化并转移至24孔培养皿的孔中。然后将这些“克隆”在培养物中扩增，直到有足够的细胞可用于将克隆置于冷藏中并分离基因组DNA(约2周；Promega Wizard SV Genomic DNAPurification)，用于PCR分析。
包含感兴趣的基因/DNA元件的递送载体的整合通过使用适当的PCR引物产生跨越合成染色体与递送载体(pAPP590)之间重组位点的独特PCR产物来鉴定。水和宿主基因组DNA(例如A1)的阴性对照PCR反应与测试基因组DNA样品一起进行。
在鉴定包含适当地装载到合成染色体上的Cumate-ON转录调节物的候选克隆后，进行测试以评价Cumate-ON转录调节物在Cumate响应性启动子(CMV+CuO启动子)的控制下控制分泌的萤光素酶的表达的能力。将在不具有cumate(Cumate-ON诱导物)的培养基中显示低荧萤素酶表达并在cumate的存在下显示高表达的候选克隆置于长期冷藏中。
实施例4：来自两个独立的诱导型启动子系统的多于一个scFv片段的表达
临床经验表明，癌症疗法和传染性疾病的多重靶向方法通常优于单剂治疗。间充质干细胞(MSC)基于它们的可塑性和稳健性，被认为是用于癌症和传染性疾病的治疗的新型治疗方式。因此，生物工程化MSC，或其他另外的干细胞群体，作为针对缺乏有效疗法的癌症和传染性疾病的新型武器，具有优异的效用。此外，经由基于干细胞的疗法递送的治疗性因子的局部递送可以规避与全身递送的特别有毒的剂相关的药理学限制。被工程化为递送多于一个的且可调节的治疗性因子的合成的平台染色体的组合具有作为可以针对靶向不同疾病状态定制的治疗方法的巨大潜力。
单链片段可变(scFv)蛋白是用于靶向递送细胞抑制/细胞毒性生物试剂的有吸引力的治疗剂。scFv是由抗体VH和VL结构域组成的小抗原结合蛋白，其可以精确地靶向和穿透肿瘤床或靶向传染性疾病剂。scFv的小尺寸使它们易于与用于基于免疫毒素的基因疗法的细胞毒性蛋白融合。利用多种选择的肿瘤标志物scFv显示了体外和体内两者的来自合成的平台染色体的多于一种scFv的可调节产生。
表达了靶向Her2(ErbB2；图8中的scFv1)、basigen(图8中的scFv2)、c-kit(图8中的scFv3)和癌胚抗原(CEA；图8中的ScFv4)的四个scFv DNA克隆。所有这四个克隆都从适当的商业供应商(Source Bioscience,Inc.,Addgene)获得。scFv编码DNA区域通过PCR扩增，并且进行每一个区域的N末端与萤光素酶报告物构建体(New England Biolabs,Inc)的融合。将scFv1和scFv2融合至分泌的Gaussia萤光素酶报告物上，并且将scFv3和scFv4融合至分泌的海萤(Cypridina)萤光素酶报告物上。这两种超敏感的分泌的萤光素酶报告物的利用允许以双重测定格式监测表达，因为每种萤光素酶利用一种独特的底物(即，一种萤光素酶的检测可以给定样品中在不具有来自另一种萤光素酶的存在的任何交叉反应性(cross-reactivity)的情况下进行测量)。将scFv1和scFv2克隆并置于TET-ON启动子(图8中的TetP)的控制下。对于多于一个的可调节表达，还利用了Cumate Switch ON系统(系统从System Biosciences Inc.商购可得)。类似于TET-ON系统，Cumate Switch On系统通过Cym阻遏物(cymR；最初源自假单胞菌(Pseudomonas))与CMV5启动子的下游的cumate操纵基因位点的结合起作用以阻断转录。在cumate的存在下，阻遏被解除，允许转录。Cumate SwitchON系统已经在体外应用中广泛使用，并且与TET-ON系统的性能相当。scFv3和scFv4CLuc融合被置于Cumate Switch On启动子的控制下。聚腺苷酸化信号和强转录终止序列被置于所有scFv表达盒的下游。
将scFv表达盒以串联克隆到BAC来源的pAPP递送载体上，其中每个表达盒被基质附接区域分开，以促进最佳表达，并阻断从一个盒至另一个盒的转录读段(图8中的散列框)。将BAC来源的pAPP递送载体改造为包含GFP-(图8中的BSR)融合蛋白盒的上游的attB重组序列。由于在GFP-BSR融合的工程化内含子中细菌E2CK启动子的存在，细菌中的杀稻瘟素耐受性是可选择的。此外，GFP-BSR盒侧翼为lox位点，以允许回收GFP-BSR可选择标志物。该载体，即scFv多重调节的表达BAC，包含所有scFv表达盒，并且尺寸为约21K bp(pBLoVeL-TTS_DualExp_scFv；图9：在BLoVeL-TTS_Dual Exp中，存在以下元件：sopA、sopB和sopC＝质粒分配蛋白(plasmid partitioning protein)；SV40pAn，B-珠蛋白聚An＝聚A；TTS＝转录终止信号；attB＝位点特异性重组位点；lox＝位点特异性重组位点；eGFP＝荧光蛋白；Bsr＝杀稻瘟素耐受性基因；repE＝复制起始位点(replication initiation site)；Ori2＝复制起点；CmR＝氯霉素耐受性基因；聚An＝聚A；Her 2scFv、c-Kit scFv、CEA scFv＝单链片段可变(scFv)蛋白；Tet响应性启动子或CMV+CuO启动子＝诱导型启动子。))。
通过λ整合酶介导的重组将scFv表达BAC工程化到合成的平台染色体上。表达BAC的一个另外特征是相对于attB序列5’放置的强转录终止信号(TTS；图8中的黑色圆圈)的存在。测试TTS的存在，以确定该元件是否阻止通过GFP盒的虚假转录，这导致不在合成的平台染色体上的GFP+细胞的存在。如果TTS的存在阻断了通过GFP基因的虚假转录，则更高百分比的GFP+细胞应该反映表达BAC到合成的平台染色体上的位点特异性重组。如果观察到这一点，则转染后48-72小时，GFP+细胞通过流式细胞术/细胞分选单细胞克隆，规避了在获得合成的平台染色体工程化细胞中对药物选择的需要。这在获得期望的合成的平台染色体克隆中潜在地节省了1-3周的时间，并提高工程化效率。
在克隆扩增后，合成的平台染色体上的表达BAC的放置的确认通过针对attR/attL重组接点的存在的PCR来实现。从先前关于用合成的平台染色体递送载体工程化平台染色体的工作中，已经观察到在克隆被鉴定后，似乎存在放置到合成的平台染色体上的靶向载体的数目的分布。从拷贝数分析来看，在合成的平台染色体上，一些克隆包含单个拷贝的递送载体，一些携带约十个拷贝，并且一些携带超过二十个拷贝的递送载体。qPCR分析用于对于以下合成的平台染色体工程化克隆的拷贝数分析：包含单个拷贝的scFv表达BAC的克隆(添加21Kbp的DNA)、包含约十个拷贝的克隆(添加210Kbp的DNA)、以及包含大于二十个拷贝的scFv表达BAC的克隆(>420Kbp的DNA；分别称为“低”、“中”和“高”)。
实施例5：对于scFv产生的体外测试
将代表性的低、中、高拷贝合成的平台染色体克隆转移到小鼠(Balb/c)D1MSC系中，并且完整的合成染色体工程化平台的递送通过FISH分析来确认。在这一点上，体外测试合成的平台染色体工程化细胞系的选择的scFv的调节产生。分泌的scFv产生水平在以下四种条件下于低、中和高细胞系的每一种进行测试：1)在不具有多西环素、不具有cumate的情况下，2)在具有多西环素、具有cumate的情况下，3)在不具有多西环素、具有cumate的情况下，和4)在具有多西环素、不具有cumate的情况下。根据制造商的说明(New EnglandBiolabs,Inc.)，scFv-GLuc和scFv-CLuc融合两者使用Gaussia和海萤萤光素酶测定系统在样品中测量。将样品在相对于诱导信号(多西环素和/或cumate或仅媒介物)的添加的时间零点测试，且将随后的样品在6小时、12小时、24小时和48小时时间点测定。在48小时时间点，将细胞收获用于RNA分离，并且每个独特表达的scFv的存在或不存在使用对Her2(scFv1)、basigen(scFv2)、c-Kit(scFv3)以及CEA(scFv4)特异的引物通过RT-PCR来确定。
实施例6：scFv产生的体内测试
为了确定体内scFv产生，将包含具有低、中或高拷贝scFv表达盒的合成的平台染色体的1×107个细胞皮下注射到6至8周龄的Balb/c小鼠的胁腹中。类似于体外测试，分泌的scFv产生水平在以下四种条件下对低、中和高细胞系注射的小鼠的每一种进行测试：1)在不具有多西环素、不具有cumate的情况下，2)在具有多西环素、具有cumate的情况下，3)在不具有多西环素、具有cumate的情况下，和4)在具有多西环素、不具有cumate的情况下。总计48只小鼠被用于监测scFv产生(每个测试组4只小鼠×4个测试条件×3个scFv拷贝水平)。在皮下注射细胞后，将小鼠给予诱导物(1mg多西环素和/或150mg cumate，或媒介物对照)i.p.推注(bolus)。在植入后约6小时，利用IVIS(体内成像系统；PerkinElmer,Inc.)对小鼠成像以确定合成的平台染色体工程化的产生萤光酶的D1MSC细胞的存在，并如以上描述测试尾静脉血液抽取样品的萤光素酶活性。在第1天、第3天、第7天、第10天和第14天收集另外的样品并测试。对于每个时间点，在诱导物(或媒介物对照)的i.p.施用当天6小时后采取集血样。
前述仅仅阐释了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计出多种排布形式，尽管本文未明确描述或显示，这些排布形式体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而贡献的概念，并且应被解释为不限于此类具体列举的实例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述预期包括其结构和功能等同物两者。另外，预期这样的等同物既包括当前已知的等同物又包括未来开发的等同物，即开发执行相同的功能而不管结构如何的任何元件。因此，本发明的范围并不意图被限制为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。在以下的权利要求书中，除非使用术语“手段(means)”，否则本文列举的特征或要素都不应该被解释为根据35U.S.C.§112,16的手段加功能的限定。

Claims (28)

1.一种用于用各自在调节控制系统的控制下的至少两个靶核酸工程化受体细胞的方法，所述方法包括：
用合成染色体产生组分转染第一受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；
产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；
用包含在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的第一递送载体转染所述第一受体细胞系；
激活所述合成的平台染色体与所述第一递送载体之间的位点特异性重组，其中在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸被装载到所述合成的平台染色体上，以产生表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸的合成染色体；
分离包含表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸的所述合成染色体的第二受体细胞；
使所述第二受体细胞生长；
用包含在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的第二递送载体转染所述第二受体细胞；
激活所述合成的平台染色体与所述第二递送载体之间的位点特异性重组，其中在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸被装载到所述合成的平台染色体上，以产生表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸和在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸的合成染色体；以及
分离包含表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸和在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸的合成染色体的第三受体细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一调节控制系统和所述第二调节控制系统选自Tet-On、Tet-Off、Lac开关诱导型、蜕皮素诱导型、cumate基因开关或他莫昔芬诱导型系统。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括经由所述第一调节控制系统和所述第二调节控制系统诱导所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的转录的步骤。
4.权利要求1所述的分离的第二受体细胞。
5.权利要求1所述的分离的第三受体细胞。
6.合成染色体，来自权利要求1所述的分离的第二受体细胞。
7.合成染色体，来自权利要求1所述的分离的第三受体细胞。
8.一种用于用各自在调节控制系统的控制下的至少两个靶核酸工程化受体细胞的方法，所述方法包括：
用合成染色体产生组分转染第一受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；
产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；
用包含在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的第一递送载体转染所述第一受体细胞系，其中所述第一靶核酸的基因产物调节第二靶核酸的转录；
激活所述合成的平台染色体与所述第一递送载体之间的位点特异性重组，其中在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸被装载到所述合成的平台染色体上，以产生表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸的合成染色体；
分离包含表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸的所述合成染色体的第二受体细胞；
使所述第二受体细胞生长；
用包含在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的第二递送载体转染所述第二受体细胞；
其中所述第二调节控制系统由所述第一靶核酸的基因产物调节；
激活所述合成的平台染色体与所述第二递送载体之间的位点特异性重组，其中在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸被装载到所述合成的平台染色体上，以产生表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸和在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸的合成染色体；
分离包含表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸和在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸的所述合成染色体的第三受体细胞；
经由所述第一调节控制系统诱导所述第一靶核酸的转录以产生所述第一基因产物；以及
经由所述第一基因产物调节所述第二靶核酸的转录。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一靶核酸的基因产物诱导所述第二靶核酸的转录。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述第一靶核酸的基因产物阻遏所述第二靶核酸的转录。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述第一调节控制系统选自Tet-On、Tet-Off、Lac开关诱导型、蜕皮素诱导型、cumate基因开关或他莫昔芬诱导型系统。
12.权利要求8所述的分离的第二受体细胞。
13.权利要求8所述的分离的第三受体细胞。
14.合成染色体，来自权利要求8所述的分离的第二受体细胞。
15.合成的染色体，来自权利要求8的所分离的第三受体细胞。
16.一种用于用各自在调节控制系统的控制下的至少三个靶核酸工程化受体细胞的方法，所述方法包括：
用合成染色体产生组分转染第一受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；
产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；
用包含在第一调节控制系统的控制下的第一靶核酸的第一递送载体转染所述第一受体细胞系，其中所述第一靶核酸的基因产物调节第三靶核酸的转录；
激活所述合成的平台染色体与所述第一递送载体之间的位点特异性重组，其中在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸被装载到所述合成的平台染色体上，以产生表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸的合成染色体；
分离包含表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸的所述合成染色体的第二受体细胞；
使所述第二受体细胞生长；
用包含在第二调节控制系统的控制下的第二靶核酸的第二递送载体转染所述第二受体细胞，其中所述第二靶核酸的基因产物调节第三靶核酸的转录；
激活所述合成的平台染色体与所述第二递送载体之间的位点特异性重组，其中在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸被装载到所述合成的平台染色体上，以产生表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸和在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸的合成染色体；
分离包含表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸和在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸的所述合成染色体的第三受体细胞；
使所述第三受体细胞生长；
用包含在第三调节控制系统的控制下的第三靶核酸的第三递送载体转染所述第三受体细胞，其中所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的基因产物经由所述第三调节控制系统调节所述第三靶核酸的转录；
激活所述合成的平台染色体与所述第三递送载体之间的位点特异性重组，其中在所述第三调节控制系统的控制下的所述第三靶核酸被装载到所述合成的平台染色体上，以产生表达在所述第一调节控制系统的控制下的所述第一靶核酸、在所述第二调节控制系统的控制下的所述第二靶核酸和在所述第三调节控制系统的控制下的所述第三靶核酸的合成染色体；
经由所述第一调节控制系统和所述第二调节控制系统诱导所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的转录以产生第一基因产物和第二基因产物；以及经由所述第一基因产物和所述第二基因产物调节所述第三靶核酸的转录。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述第一基因产物和所述第二基因产物两者都是调节所述第三靶核酸的转录所必需的。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述第一基因产物或所述第二基因产物调节所述第三靶核酸的转录。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述第三靶核酸的调节是诱导所述第三靶核酸的转录。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述第三靶核酸的调节是阻遏所述第三靶核酸的转录。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述第一调节控制系统和所述第二调节控制系统选自Tet-On、Tet-Off、Lac开关诱导型、蜕皮素诱导型、cumate基因开关或他莫昔芬诱导型系统。
22.权利要求16所述的分离的第二受体细胞。
23.权利要求16所述的分离的第三受体细胞。
24.合成染色体，来自权利要求16的所分离的第二受体细胞。
25.合成染色体，来自权利要求16的所分离的第三受体细胞。
26.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括分离包含合成染色体的第四受体细胞，所述合成染色体包含所述第一靶核酸、所述第二靶核酸和所述第三靶核酸。
27.权利要求24所述的分离的第四受体细胞。
28.合成染色体，来自权利要求16的所分离的第四受体细胞。
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