JP2019513396A - 遺伝子調節システムを有する合成染色体の作成方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の更に他の実施形態は、各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも2つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法を提供し、この方法は、標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップ;複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ;第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸を含む第1の送達ベクターを第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、第1の標的核酸の遺伝子産物が第2の標的核酸の転写を調節するステップ;合成プラットフォーム染色体と第1の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ;第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸を発現する合成染色体を含む第2の受容細胞を単離するステップ;第2の受容細胞を成長させるステップ;第2の調節性制御システムの制御下にある第2の標的核酸を含む第2の送達ベクターを第2の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、第2の調節性制御システムが第1の標的核酸の遺伝子産物によって調節されるステップ;合成プラットフォーム染色体と第2の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第2の調節性制御システムの制御下にある第2の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸と第2の調節性制御システムの制御下にある第2の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ;第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸と第2の調節性制御システムの制御下にある第2の標的核酸とを発現する合成染色体を含む第3の受容細胞を単離するステップ;第1の遺伝子産物が作製されるように第1の調節性制御システムによって第1の標的核酸の転写を誘導するステップ;及び第1の遺伝子産物によって第2の標的核酸の転写を調節するステップを含む。
明示的に定めない限り、本明細書で使用される用語は、当業者が理解するとおりの平易な且つ通常の意味を有することが意図される。以下の定義は読者が本発明を理解する助けとなることを意図するものであり、具体的に指示されない限り、かかる用語の意味を変更したり、又は他の形で限定したりする意図はない。
本明細書で使用されるとき、「ユークロマチン」は、散在性に染色される、典型的には遺伝子を含有するクロマチンを指し、「ヘテロクロマチン」は、通常凝縮したままで、転写的に不活性と考えられるクロマチンを指す。セントロメアを取り囲むヘテロクロマチンの領域には、通常、高度に反復性のDNA配列(サテライトDNA)が位置する。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルスコンストラクト、コスミド、細菌人工染色体、P−1由来人工染色体又は酵母人工染色体など、別のDNAセグメントを付加し得るレプリコンである。一部の例では、ベクターは、組換え部位を含むように操作された1つの内因性染色体から合成染色体に腕を交換する場合のような染色体であってもよい。ベクターは、細胞におけるDNAセグメントの形質導入及び発現に使用される。
本発明は、複数の遺伝子調節性制御システムからの複数の遺伝子の送達及び発現を全て単一の合成染色体から可能にする組成物及び方法を包含する。合成染色体はその大きい運搬能力をもって複数の遺伝子産物−及びこれらの複数の遺伝子産物は異なる調節性制御システムの制御下にあってよい−を運搬して発現させることができ、それによりウイルスベース及びプラスミドベースの核酸送達の限界を回避し得る。本発明は、合成プラットフォーム染色体上への複合的調節可能発現システムの構築を可能にする方法及び組成物を提供するものであり、「トップダウン」手法、「ボトムアップ」手法、天然に存在するミニ染色体の操作、及び特定の染色体セグメントのターゲット増幅による誘導性デノボ染色体生成(これらは全て以下に更に詳細に考察する)を含めたあらゆる合成染色体作製方法に適用可能である。
合成染色体は培養細胞で作成される。一部の実施形態において、操作を受ける、及び/又は合成染色体を産生する細胞は、その合成染色体からの遺伝子又は調節配列が最終的に発現することになる対象(ヒト患者、動物又は植物)に天然に存在する細胞であってもよい。かかる細胞は、個体に特異的な合成染色体作製用に樹立された初代培養細胞株であってもよい。他の実施形態において、操作を受ける、及び/又は合成染色体を産生する細胞は、樹立細胞株からのものである。組織培養用の多種多様な細胞株が当該技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、ヒト細胞株、例えば、293−T(胎児由来腎臓)、721(メラノーマ)、A2780(卵巣)、A172(膠芽腫)、A253(癌腫)、A431(上皮)、A549(癌腫)、BCP−1(リンパ腫)、BEAS−2B(肺)、BR293(乳房)、BxPC3(膵癌)、Cal−27(舌)、COR−L23(肺)、COV−434(卵巣)、CML T1(白血病)、DUI45(前立腺)、DuCaP(前立腺)、FM3(リンパ節)、H1299(肺)、H69(肺)、HCA2(線維芽細胞)、HEK0293(胎児由来腎臓)、HeLa(頸部)、HL−60(骨髄芽球)、HMEC(上皮)、HT−29(結腸)、HUVEC(臍帯静脈上皮)、ジャーカット(T細胞白血病)、JY(リンパ芽球様)、K562(リンパ芽球様)、KBM−7(リンパ芽球様)、Ku812(リンパ芽球様)、KCL22(リンパ芽球様)、KGI(リンパ芽球様)、KYO1(リンパ芽球様)、LNCap(前立腺)、Ma−Mel(メラノーマ)、MCF−7(乳腺)、MDF−10A(乳腺)、MDA−MB−231、−468及び−435(乳房)、MG63(骨肉腫)、MOR/0.2R(肺)、MONO−MAC6(白血球細胞)、MRC5(肺)、NCI−H69(肺)、NALM−1(末梢血)、NW−145(メラノーマ)、OPCN/OPCT(前立腺)、ピア(Peer)(白血病)、ラージ(Raji)(Bリンパ腫)、Saos−2(骨肉腫)、Sf21(卵巣)、Sf9(卵巣)、SiHa(子宮頸癌)、SKBR3(乳癌)、SKOV−2(卵巣癌腫)、T−47D(乳腺)、T84(肺)、U373(膠芽腫)、U87(膠芽腫)、U937(リンパ腫)、VCaP(前立腺)、WM39(皮膚)、WT−49(リンパ芽球様)、YAR(B細胞)、胚細胞株、多能性細胞株、成人由来幹細胞、再プログラム化細胞株、任意の種の汎用動物細胞株又は広義に胎児性の若しくは再プログラム化される細胞、患者自己細胞株が挙げられ、一部の好ましい実施形態では、HT1080ヒト細胞株が利用される。これらの細胞株及び他の細胞株は当業者に公知の種々の供給元から入手可能である(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection:ATCC)(バージニア州マナサス)を参照)。
複数の調節性制御システム及び複数の遺伝子を合成プラットフォーム染色体に送達又は「ロード」するために使用する送達ベクターの選択は、伝播が所望される細胞のタイプなど、種々の要因に依存することになる。適切な送達ベクターの選択は十分に当業者の技能の範囲内にあり、多くのベクターが市販されている。送達ベクターの調製には、1つ以上の調節性制御システムの制御下にある1つ以上の遺伝子が、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位への遺伝子配列のライゲーションを用いてベクターに挿入される。或いは、所望のヌクレオチド配列は相同組換え又は部位特異的組換えによって挿入してもよい。典型的には相同組換えは、相同性領域をベクターに所望のヌクレオチド配列(例えば、cre−lox、att部位等)に隣接して付加することにより達成される。かかる配列を含む核酸は、例えばオリゴヌクレオチドのライゲーションによるか、又は相同性領域及び所望のヌクレオチド配列の一部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって付加することができる。使用し得る例示的送達ベクターとしては、限定はされないが、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNAに由来するものが挙げられる。例えば、pBR322、pUC19/18、pUC118、119などのプラスミドベクター及びM13 mp系ベクターを使用してもよい。バクテリオファージベクターとしては、λgt10、λgt11、λgt18〜23、λZAP/R及びEMBL系バクテリオファージベクターを挙げることができる。利用し得るコスミドベクターとしては、限定はされないが、pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16及びシャロミド9系ベクターが挙げられる。更なるベクターとしては、機能性稔性プラスミド(Fプラスミド)ベースのバクテリア人工染色体(chromsome)(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、及びP1バクテリオファージのDNAに由来するDNAコンストラクトであるP1由来人工染色体(chromsome)(PAC)が挙げられる。或いは、及び好ましくは、限定はされないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来するものを含め、組換えウイルスベクターが操作されてもよい。BACベクターは、大量の核酸、即ち複数の遺伝子を担持する能力があるため本発明に好ましい送達ベクターである。或いは、調節性制御システムの制御下にある遺伝子は、複数の送達ベクターを使用した逐次ローディングによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよい;即ち、第1の調節性制御システムの制御下にある第1の遺伝子が第1の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、第2の調節性制御システムの制御下にある第2の遺伝子が第2の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、以下同様である。2016年4月12日に出願されたパーキンス(Perkins)及びグリーン(Greene)、米国仮特許出願第62/321,711号明細書が、単一の選択可能マーカを再利用しながら複数の送達ベクターを使用して合成プラットフォーム染色体に遺伝子を逐次ロードすることについて記載している。
合成染色体作製に適切な構成要素及び1つ又は複数の送達ベクターは、当該技術分野において公知の任意の方法により受容細胞に送達することができる。用語のトランスフェクション及び形質転換は、任意のコード配列が実際に発現するか否かに関わらず、外因性核酸、例えば発現ベクターが宿主細胞によって取り込まれることを指す。例えば、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)介在性形質転換、プロトプラスト形質転換(ポリエチレングリコール(PEG)介在性形質転換、電気穿孔、プロトプラスト融合、及びマイクロセル融合を含む)、脂質介在性送達、リポソーム、電気穿孔、ソノポレーション、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント及び炭化ケイ素ウイスカ介在性形質転換及びこれらの組み合わせ(例えば、パシュコフスキー(Paszkowski)ら著、エンボ・ジャーナル(EMBO J.)、第3巻、p.2717〜2722、1984年;ポトリクス(Potrykus)ら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Mol.Gen.Genet.)、第199巻、p.169〜177、1985年;ライヒ(Reich)ら著、バイオテクノロジー(Biotechnology)、第4巻、p.1001〜1004、1986年;クライン(Klein)ら著、ネイチャー(Nature)、第327巻、p.70〜73、1987年;米国特許第6,143,949号明細書;パシュコフスキー(Paszkowski)ら著、「植物の細胞培養及び体細胞遺伝学(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)」、第6巻、「植物核遺伝子の分子生物学(Molecular Biology of Plant Nuclear Genes)」、シェル(Schell)及びバシル(Vasil)編、アカデミック・パブリッシャーズ(Academic Publishers)、1989年;及びフレーム(Frame)ら著、プラント・ジャーナル(Plant J.)、第6巻、p.941〜948、1994年を参照);リン酸カルシウムを使用した直接取込み(ウィグラー(Wigler)ら著、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)、第76巻、p.1373〜1376、1979年);ポリエチレングリコール(PEG)介在性DNA取込み;リポフェクション(例えば、シュトラウス(Strauss)著、メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー(Meth.Mol.Biol.)、第54巻、p.307〜327、1996年を参照);マイクロセル融合(ランバート(Lambert)著、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)、第88巻、p.5907〜5911、1991年;米国特許第5,396,767号明細書;ソーフォード(Sawford)ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス(Somatic Cell Mol.Genet.)、第13巻、p.279〜284、1987年;ダール(Dhar)ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス(Somatic Cell Mol.Genet.)、第10巻、p.547〜559、1984年;及びマクニール=キラリー(McNeill−Killary)ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー(Meth.EnzymoL)、第254巻、p.133〜152、1995年);脂質介在性担体システム(例えば、テイフェル(Teifel)ら著、バイオテクニクス(Biotechniques)、第19巻、p.79〜80、1995年;アルブレヒト(Albrecht)ら著、アニュアルズ・オブ・ヘマトロジー(Ann.Hematol.)、第72巻、p.73〜79、1996年;ホルメン(Holmen)ら著、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル(In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.)、第31巻、p.347〜351、1995年;レミー(Remy)ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjug.Chem.)、第5巻、p.647〜654、1994年;ル・ボルシュ(Le Bolch)ら著、テトラヘドロン・レターズ(Tetrahedron Lett.)、第36巻、p.6681〜6684、1995年;及びレフラー(Loeffler)ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー(Meth.EnzymoL)、第217巻、p.599〜618、1993年を参照);又は他の好適な方法による数多くのトランスフェクション方法が当業者に公知である。合成染色体の送達方法はまた、米国特許出願第09/815,979号明細書にも記載されている。トランスフェクションの成功は、概して、トランスフェクト細胞内における異種核酸の存在の検出、例えば、異種核酸の何らかの視覚化、選択可能マーカの発現又は宿主細胞内での合成プラットフォーム染色体又は送達ベクターの作動の何らかの指標などによって認識される。本発明の実施において有用な送達方法の説明については、米国特許第5,011,776号明細書;米国特許第5,747,308号明細書;米国特許第4,966,843号明細書;米国特許第5,627,059号明細書;米国特許第5,681,713号明細書;キム(Kim)及びエーベルワイン(Eberwine)著、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー(Anal.Bioanal.Chem.)、第397巻、第8号、p.3173〜3178、2010年を参照のこと。
本発明の合成プラットフォーム染色体の作製及びローディングは、様々な方法によってモニタすることができる。リンデンバウム(Lindenbaum)及びパーキンス(Perkins)ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acid Research)、第32巻、第21号、p.el72、2004年は、先行技術のテクノロジーを用いた哺乳類サテライトDNAベースの人工染色体発現(ACE)システムの作製について記載している。この先行技術のシステムでは、PCR生成したプローブ又はニック翻訳を受けたプローブを使用して従来の単色及び二色FISH分析並びに高分解能FISHが行われた。テロメア配列の検出のため、有糸分裂スプレッドが、市販品から入手されたペプチド核酸プローブとハイブリダイズされた。蛍光顕微鏡法を用いて顕微鏡法が実施された。或いは、2016年2月9日に出願されたパーキンス(Perkins)及びグリーン(Greene)、PCT/US16/17179号明細書が、2つの標識したタグ:合成プラットフォーム染色体の作製に使用する細胞株内の内因性染色体に特異的な1つの標識タグ、及び作製しようとする合成染色体上の配列に特異的な1つの異なる標識のタグを用いて標準化された蛍光技術による合成染色体形成のリアルタイムモニタリングを可能にする組成物及び方法について記載している。
実施例1:サテライトDNAベースの人工染色体のデノボ作成
合成染色体(chromomsome)のデノボ作製のため、外因性DNA配列をHT1080合成染色体生成細胞株に導入し、それがアクロセントリック染色体のセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域に組み込まれると、アクロセントリック染色体の短腕(rDNA/セントロメア領域)の大規模増幅が惹起された。増幅イベントの間にセントロメアが複製されて2つの活性セントロメアを有する二動原体染色体になった。続く有糸分裂イベントによって二動原体染色体の切断及び分離が起こり、主にサテライト反復配列を含む約20〜120Mbサイズの離脱につながり、そこには増幅されたrDNAコピーも含み得る共増幅されたトランスフェクト導入遺伝子のサブドメインが含まれた。新規に作成された合成染色体は、内因性染色体タグ及びHT1080合成染色体生成細胞株内に操作された合成染色体タグを用いた蛍光染色体ペイント(又はFISH)の観察によってバリデートされる。
合成プラットフォーム染色体に取り込まれる調節可能なプロモータシステムの一実施形態は、TET−ON、ドキシサイクリン誘導性発現システム(クロンテック社(Clontech,Inc.))である。pAPP500ベクターを骨格送達ベクターとして使用してTET−ON転写調節因子を合成染色体に挿入した。端的には、pEF1α−Tet3G転写調節因子を制限消化(BsrGI及びHindIII)によって単離し、次に5’末端を埋め、EcoRVで消化したpAPP500にライゲートした。得られたプラスミドベクター(pAPP510;図6:pApp590には、以下のエレメントが存在する:SV40\ポリA/シグナル=SV40ポリA;attB、AttL_Zeo=部位特異的組換え部位;ヒト/EF1a/Pr=プロモータ;Tet−On/3G=転写調節因子;f1起点=複製起点;ZeoR=ゼオシン耐性)は、合成プラットフォーム染色体へのターゲティング用のattB組換え部位の後ろにコードされたプロモータレスゼオシン耐性マーカ遺伝子、及びTET−ON転写調節因子を含む。
pAPP510及びpAPP590ベクターを送達ベクターとして使用して、それぞれTET−ON転写調節因子及びクマートON転写調節因子を合成染色体に逐次的に挿入する。0日目、合成染色体(hSynC)を含有する受容細胞株(例えば、HT1080)を24ウェルディッシュの1ウェル当たり約4E4細胞で播種し、ウェルが1日目に約70%コンフルエントになる。適切な培地(例えば、HT1080についてDMEM+10%FC3)中において細胞を37℃、5%CO2で一晩インキュベートする。1日目、製造者の指示に従い(フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)、リポフェクタミンLTX(Lipofectamine LTX)、プラス(Plus)試薬含有)、送達ベクター(例えば、pAPP510)及び組換えタンパク質をコードするプラスミド(例えばpCXLamIntR)の両方をHT1080細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションはデュプリケートで実施して、薬物選択の比較及び直接的な細胞ソーティングを行うことができるようにする。リポフェクタミンLTX(Lipofectamine LTX)をオプティメム(Opti−MEM)培地(ギブコ(Gibco);トランスフェクトする24ウェルディッシュの各ウェルにつき1.5μl LTX/50μl オプティメム(Opti−MEM))に希釈し、オプティメム(Opti−MEM)中50μlの希釈LTXに250ng DNA(例えば125ng pAPP510プラスミド及び125ng pCXLamIntR/ウェル)を加える。各約50μl DNA−LTX−オプティメム(Opti_MEM)試料に0.25μlのプラス(PLUS)試薬を加え、各試料を室温で5分間インキュベートする。次に、この5分間のインキュベーション中に、0日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地を使用して培地を交換する。この細胞にDNA−脂質複合体を加えて、適切な培地中、37℃、5%CO2でインキュベートする。
臨床経験が示すところによれば、癌療法及び感染症に対しては、概して単剤治療よりもマルチターゲット手法が優れている。その柔軟性及びロバスト性に基づき、間葉系幹細胞(MSC)は、癌及び感染症の治療の新規治療モダリティに関係があるとされている。従って、バイオエンジニアリングを受けたMSC、又は他の更なる幹細胞集団には、有効な治療法がない癌及び感染症に対する新規対抗手段として特別な有用性がある。更に、幹細胞ベースの療法によって送達される治療的因子の局所送達により、特に毒性薬剤の全身送達に関連する薬理学的制約を回避し得る。複数の調節可能な治療的因子を送達するように操作された合成プラットフォーム染色体の組み合わせは、種々の疾患状態を標的化するように調整し得る治療手法として多大な可能性を有する。
代表的な低、中、及び高コピー合成プラットフォーム染色体クローンをマウス(Balb/c)D1 MSC株にトランスファーし、インタクトな合成染色体操作プラットフォームの送達をFISH分析によって確認する。この時点で、合成プラットフォーム染色体操作細胞株は選択のscFvの調節された産生に関してインビトロで試験する。低、中、及び高の細胞株の各々について、4つの条件下で分泌型scFv産生レベルを試験する:1)ドキシサイクリン無し、クマート無し、2)ドキシサイクリン有り、クマート有り、3)ドキシサイクリン無し、クマート有り、及び4)ドキシサイクリン有り、クマート無し。ガウシア及びウミホタルルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の指示に従い使用して(ニュー・イングランド・バイオラボ社(New England Biolabs,Inc.))、試料中におけるscFv−GLuc及びscFv−CLucの両方の融合物を測定する。試料は、誘導シグナル(ドキシサイクリン及び/又はクマート又は媒体のみ)の添加に関して時間ゼロで試験し、後続の試料は6時間、12時間、24時間、及び48時間の時点でアッセイする。48時間の時点で細胞を回収してRNAを単離し、ユニークに発現した各scFvの存在又は非存在を、Her2(scFv1)、ベイシジン(basigen)(scFv2)、c−kit(scFv3)、及びCEA(scFv4)に特異的なプライマーを使用したRT−PCRによって決定する。
scFv産生をインビボで決定するため、低、中又は高コピーのいずれかのscFv発現カセットを有する合成プラットフォーム染色体を含む1×107細胞を6〜8週齢のBalb/cマウスの側腹部に皮下注射する。インビトロ試験と同様に、低、中、及び高の細胞株を注射したマウスの各々について4つの条件下で分泌型scFv産生レベルを試験する:1)ドキシサイクリン無し、クマート無し、2)ドキシサイクリン有り、クマート有り、3)ドキシサイクリン無し、クマート有り、及び4)ドキシサイクリン有り、クマート無し。合計48匹のマウスを利用してscFv産生をモニタする(各試験群につき4匹のマウス×4つの試験条件×3つのscFvコピーレベル)。細胞の皮下注射後、マウスに誘導因子のi.p.ボーラス(1mgドキシサイクリン及び/又は150mgクマート、又は媒体対照)を投与する。移植の約6時間後、IVIS(インビボイメージングシステム;パーキンエルマー社(PerkinElmer,Inc.))を利用して、ルシフェラーゼを生じる合成プラットフォーム染色体操作D1 MSCの存在に関してマウスをイメージングし、尾静脈採血試料を上記に記載したとおりルシフェラーゼ活性に関して試験する。1、3、7、10及び14日目に更なる試料を採取し、試験する。各時点について、血液試料は当該日の誘導因子(又は媒体対照)i.p.投与6時間後に採取する。
Claims (28)
- 各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも2つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップ;
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ;
第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸を含む第1の送達ベクターを前記第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップ;
前記合成プラットフォーム染色体と前記第1の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ;
前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第2の受容細胞を単離するステップ;
前記第2の受容細胞を成長させるステップ;
第2の調節性制御システムの制御下にある第2の標的核酸を含む第2の送達ベクターを前記第2の受容細胞にトランスフェクトするステップ;
前記合成プラットフォーム染色体と前記第2の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸と前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ;及び
前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸と前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第3の受容細胞を単離するステップ
を含む方法。 - 前記第1及び第2の調節性制御システムが、Tet−On、Tet−Off、Lacスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1及び第2の調節性制御システムによって前記第1及び第2の標的核酸の転写を誘導するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の単離された第2の受容細胞。
- 請求項1に記載の単離された第3の受容細胞。
- 請求項1に記載の単離された第2の受容細胞からの合成染色体。
- 請求項1に記載の単離された第3の受容細胞からの合成染色体。
- 各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも2つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップ;
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ;
第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸を含む第1の送達ベクターを前記第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記第1の標的核酸の遺伝子産物が第2の標的核酸の転写を調節するステップ;
前記合成プラットフォーム染色体と前記第1の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ;
前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第2の受容細胞を単離するステップ;
前記第2の受容細胞を成長させるステップ;
第2の調節性制御システムの制御下にある第2の標的核酸を含む第2の送達ベクターを前記第2の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第2の調節性制御システムが前記第1の標的核酸の前記遺伝子産物によって調節されるステップ;
前記合成プラットフォーム染色体と前記第2の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸と前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ;
前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸と前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第3の受容細胞を単離するステップ;
前記第1の遺伝子産物が作製されるように前記第1の調節性制御システムによって前記第1の標的核酸の転写を誘導するステップ;及び
前記第1の遺伝子産物によって前記第2の標的核酸の転写を調節するステップ
を含む方法。 - 前記第1の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第2の標的核酸の転写を誘導する、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第2の標的核酸の転写を抑制する、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の調節性制御システムが、Tet−On、Tet−Off、Lacスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、請求項8に記載の方法。
- 請求項8に記載の単離された第2の受容細胞。
- 請求項8に記載の単離された第3の受容細胞。
- 請求項8に記載の単離された第2の受容細胞からの合成染色体。
- 請求項8に記載の単離された第3の受容細胞からの合成染色体。
- 各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも3つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップ;
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ;
第1の調節性制御システムの制御下にある第1の標的核酸を含む第1の送達ベクターを前記第1の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記第1の標的核酸の遺伝子産物が第3の標的核酸の転写を調節するステップ;
前記合成プラットフォーム染色体と前記第1の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ;
前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第2の受容細胞を単離するステップ;
前記第2の受容細胞を成長させるステップ;
第2の調節性制御システムの制御下にある第2の標的核酸を含む第2の送達ベクターを前記第2の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第2の標的核酸の遺伝子産物が第3の標的核酸の転写を調節するステップ;
前記合成プラットフォーム染色体と前記第2の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸と前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ;
前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸と前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第3の受容細胞を単離するステップ;
前記第3の受容細胞を成長させるステップ;
第3の調節性制御システムの制御下にある第3の標的核酸を含む第3の送達ベクターを前記第3の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第1及び第2の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第3の調節性制御システムによる前記第3の標的核酸の転写を調節するステップ;
前記合成プラットフォーム染色体と前記第3の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第3の調節性制御システムの制御下にある前記第3の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第1の調節性制御システムの制御下にある前記第1の標的核酸と前記第2の調節性制御システムの制御下にある前記第2の標的核酸と前記第3の調節性制御システムの制御下にある前記第3の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ;
前記第1及び第2の遺伝子産物が作製されるように前記第1及び第2の調節性制御システムによって前記第1及び第2の標的核酸の転写を誘導するステップ;及び
前記第1及び第2の遺伝子産物によって前記第3の標的核酸の転写を調節するステップ
を含む方法。 - 前記第1及び第2の遺伝子産物の両方が前記第3の標的核酸の転写の調節に必要である、請求項16に記載の方法。
- 前記第1又は前記第2の遺伝子産物のいずれかが前記第3の標的核酸の転写を調節する、請求項16に記載の方法。
- 前記第3の標的核酸の調節が前記第3の標的核酸の転写を誘導することである、請求項16に記載の方法。
- 前記第3の標的核酸の調節が前記第3の標的核酸の転写を抑制することである、請求項16に記載の方法。
- 前記第1及び第2の調節性制御システムが、Tet−On、Tet−Off、Lacスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、請求項16に記載の方法。
- 請求項16に記載の単離された第2の受容細胞。
- 請求項16に記載の単離された第3の受容細胞。
- 請求項16に記載の単離された第2の受容細胞からの合成染色体。
- 請求項16に記載の単離された第3の受容細胞からの合成染色体。
- 前記第1、第2及び第3の標的核酸を含む合成染色体を含む第4の受容細胞を単離するステップを更に含む、請求項16に記載の方法。
- 請求項24に記載の単離された第4の受容細胞。
- 請求項16に記載の単離された第4の受容細胞からの合成染色体。
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