JP3151657B2 - 遺伝子導入法 - Google Patents
遺伝子導入法Info
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- JP3151657B2 JP3151657B2 JP09320297A JP9320297A JP3151657B2 JP 3151657 B2 JP3151657 B2 JP 3151657B2 JP 09320297 A JP09320297 A JP 09320297A JP 9320297 A JP9320297 A JP 9320297A JP 3151657 B2 JP3151657 B2 JP 3151657B2
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- plant
- dna
- chain dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子工学の分野、
特に植物細胞への遺伝子の導入法に関する。
特に植物細胞への遺伝子の導入法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞内に外来遺伝子を導入する技術、即
ち、形質転換技術は、導入遺伝子の機能の解析、組み換
えタンパク質の生産、遺伝子治療、有用形質転換植物の
作出などに用いられる遺伝子工学分野における基本的な
技術である。
ち、形質転換技術は、導入遺伝子の機能の解析、組み換
えタンパク質の生産、遺伝子治療、有用形質転換植物の
作出などに用いられる遺伝子工学分野における基本的な
技術である。
【０００３】植物細胞の形質転換技術としてこれまで
に、電気パルスによりDNAを導入する電気的穿孔法, 植
物腫瘍を引き起こす土壌細菌であるアグロバクテリウム
による感染を利用するアグロバクテリウム法、DNAを吸
着させた弾丸を細胞に撃ち込むマイクトプロジェックタ
イルボンバードメント法、融合剤であるポリエチレング
リコールをDNAに結合させエンドサイトーシス様過程
（推定）によりDNAを細胞内に取り込ませるポリエチレ
ングリコール法などが開発されてきた。
に、電気パルスによりDNAを導入する電気的穿孔法, 植
物腫瘍を引き起こす土壌細菌であるアグロバクテリウム
による感染を利用するアグロバクテリウム法、DNAを吸
着させた弾丸を細胞に撃ち込むマイクトプロジェックタ
イルボンバードメント法、融合剤であるポリエチレング
リコールをDNAに結合させエンドサイトーシス様過程
（推定）によりDNAを細胞内に取り込ませるポリエチレ
ングリコール法などが開発されてきた。
【０００４】しかし、上記の方法では25kb以上の巨大DN
Aを細胞内に導入することが不可能であり（CAROL M.et
al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 p9975(1996)）、例え
ば、RFLP(restriction fragment length polymorphis)
マーカー利用により作られた遺伝子地図を用いたマップ
ベースの遺伝子の単離やクローニングなどに上記の形質
転換法を適用することは困難であった。
Aを細胞内に導入することが不可能であり（CAROL M.et
al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 p9975(1996)）、例え
ば、RFLP(restriction fragment length polymorphis)
マーカー利用により作られた遺伝子地図を用いたマップ
ベースの遺伝子の単離やクローニングなどに上記の形質
転換法を適用することは困難であった。
【０００５】このため長鎖DNAを細胞内へ導入するため
に上記の形質転換法の改良などが行われ、近年になりア
グロバクテリウム法およびマイクトプロジェックタイル
法について植物細胞への長鎖DNAの導入について成功例
が報告された（CAROL M.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 93 9975〜9979(1996)、Joyce M.et al.Plant Cell Re
ports.14 299〜304(1995)）。
に上記の形質転換法の改良などが行われ、近年になりア
グロバクテリウム法およびマイクトプロジェックタイル
法について植物細胞への長鎖DNAの導入について成功例
が報告された（CAROL M.et al. Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 93 9975〜9979(1996)、Joyce M.et al.Plant Cell Re
ports.14 299〜304(1995)）。
【０００６】しかしながら、アグロバクテリウム法に
は、導入する外来遺伝子を挿入するベクター系が限定さ
れており、また適用できない植物種があるという問題点
があり、一方、マイクトプロジェックタイル法には装置
が高額でありまた導入効率が低いという問題点があっ
た。
は、導入する外来遺伝子を挿入するベクター系が限定さ
れており、また適用できない植物種があるという問題点
があり、一方、マイクトプロジェックタイル法には装置
が高額でありまた導入効率が低いという問題点があっ
た。
【０００７】なお、純化したDNAさえあれば簡便に行う
ことができ、しかも特に適用可能な植物種に制限のない
という特徴を有し、利用頻度が高いポリエチレングリコ
ール法については長鎖DNAの導入についての報告例は皆
無である。
ことができ、しかも特に適用可能な植物種に制限のない
という特徴を有し、利用頻度が高いポリエチレングリコ
ール法については長鎖DNAの導入についての報告例は皆
無である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、長鎖DNAを
植物細胞内に導入することが可能であり、適用可能な植
物の範囲が広く、かつ簡便な遺伝子導入法を提供するこ
とを課題とする。
植物細胞内に導入することが可能であり、適用可能な植
物の範囲が広く、かつ簡便な遺伝子導入法を提供するこ
とを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ポリエチレングリ
コール法において、ポリエチレングリコールと反応させ
るDNA濃度を高めることにより、長鎖DNAを高効率で植物
細胞内に導入しうることを見出し、本発明を完成するに
至った。
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ポリエチレングリ
コール法において、ポリエチレングリコールと反応させ
るDNA濃度を高めることにより、長鎖DNAを高効率で植物
細胞内に導入しうることを見出し、本発明を完成するに
至った。
【００１０】即ち、本発明は、長鎖DNAを植物細胞内に
導入することが可能なポリエチレングリコール法に関
し、具体的には、（１） 長鎖DNAをプロトプラストに
導入する方法であって、（ａ）プロトプラスト懸濁液、
ポリエチレングリコールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終
濃度が50μg/ml以上になるように混合する工程、（ｂ）
プロトプラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工
程、（ｃ）形質転換細胞を選抜する工程、を含む方法、
（２） 長鎖DNAをプロトプラストに導入する方法であ
って、（ａ）プロトプラスト懸濁液、ポリエチレングリ
コールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終濃度が100μg/ml
以上になるように混合する工程、（ｂ）プロトプラスト
を収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程、（ｃ）形質
転換細胞を選抜する工程、を含む方法、（３） プロト
プラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程にお
けるプロトプラストの洗浄において、静置および／また
は緩やかな撹拌により沈殿したDNAを溶解させプロトプ
ラストを懸濁させることを特徴とする、（１）または
（２）に記載の方法、（４） 長鎖DNAが100kb以上のDN
Aである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５） プロトプラストが単子葉植物由来である、
（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、（６） 単子
葉植物がイネ科植物である、（５）に記載の方法、
（７） イネ科植物がイネである、（６）に記載の方
法、に関する。
導入することが可能なポリエチレングリコール法に関
し、具体的には、（１） 長鎖DNAをプロトプラストに
導入する方法であって、（ａ）プロトプラスト懸濁液、
ポリエチレングリコールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終
濃度が50μg/ml以上になるように混合する工程、（ｂ）
プロトプラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工
程、（ｃ）形質転換細胞を選抜する工程、を含む方法、
（２） 長鎖DNAをプロトプラストに導入する方法であ
って、（ａ）プロトプラスト懸濁液、ポリエチレングリ
コールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終濃度が100μg/ml
以上になるように混合する工程、（ｂ）プロトプラスト
を収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程、（ｃ）形質
転換細胞を選抜する工程、を含む方法、（３） プロト
プラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程にお
けるプロトプラストの洗浄において、静置および／また
は緩やかな撹拌により沈殿したDNAを溶解させプロトプ
ラストを懸濁させることを特徴とする、（１）または
（２）に記載の方法、（４） 長鎖DNAが100kb以上のDN
Aである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５） プロトプラストが単子葉植物由来である、
（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、（６） 単子
葉植物がイネ科植物である、（５）に記載の方法、
（７） イネ科植物がイネである、（６）に記載の方
法、に関する。
【００１１】なお、本発明において「長鎖DNA」とは、3
0kb以上のDNAを指す。また、「洗浄」とは、等張液また
は培地によるプロトプラストの洗浄を指す。さらに「緩
やかな撹拌」とは、プロトプラストが破壊されない程度
の撹拌を指す。
0kb以上のDNAを指す。また、「洗浄」とは、等張液また
は培地によるプロトプラストの洗浄を指す。さらに「緩
やかな撹拌」とは、プロトプラストが破壊されない程度
の撹拌を指す。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、長鎖DNAを植物細胞内
に導入することが可能なポリエチレングリコール法に関
する。
に導入することが可能なポリエチレングリコール法に関
する。
【００１３】本発明の方法においては、まず、プロトプ
ラスト懸濁液、ポリエチレングリコールおよび長鎖DNA
の混合を行う。混合に用いるプロトプラスト懸濁液にお
けるプロトプラスト濃度は、通常、終濃度で106〜2x107
/ml程度である。プロトプラストは、植物細胞から単離
することが可能である。単離法としては、例えば、イネ
科植物であればFujimuraらの方法などが挙げられる（Fu
jimura, T., Sakurai,M., Akagi, H., Negishi, T and
Hirose, A. (1985) Regeneration of rice plants fro
m protoplasts. Plant Tissue Culture Lett. 2 :74〜7
5.,Lorz, H.,Gobel, E., Brown, P. (1988) Advances i
n tissue culture and progress towards genetic tran
sformation of cereals. Plant breeding 100 :1〜2
5）。なお、本発明においては、遺伝子導入が可能な植
物種に特に制限はない。また、混合に用いるポリエチレ
ングリコール濃度は、通常、終濃度で10〜30%程度であ
る。混合に用いる長鎖DNA濃度は、プロトプラストの由
来する植物細胞の種類により変動しうるが、通常、終濃
度で50μg/ml以上であり、好ましくは80μg/ml以上であ
り、さらに好ましくは100μg/ml以上である。一般的な
ポリエチレングリコール法においては、通常、5〜20μg
/mlであるが、本発明の方法では上記のように高濃度のD
NAを混合することを特徴とする。長鎖DNAの形態には特
に制限はなく、直鎖上DNAの他、環状DNAなどを用いるこ
とが可能である。また、DNAの導入にベクターを用いる
場合にも、適用可能なベクターには特に制限はない。
ラスト懸濁液、ポリエチレングリコールおよび長鎖DNA
の混合を行う。混合に用いるプロトプラスト懸濁液にお
けるプロトプラスト濃度は、通常、終濃度で106〜2x107
/ml程度である。プロトプラストは、植物細胞から単離
することが可能である。単離法としては、例えば、イネ
科植物であればFujimuraらの方法などが挙げられる（Fu
jimura, T., Sakurai,M., Akagi, H., Negishi, T and
Hirose, A. (1985) Regeneration of rice plants fro
m protoplasts. Plant Tissue Culture Lett. 2 :74〜7
5.,Lorz, H.,Gobel, E., Brown, P. (1988) Advances i
n tissue culture and progress towards genetic tran
sformation of cereals. Plant breeding 100 :1〜2
5）。なお、本発明においては、遺伝子導入が可能な植
物種に特に制限はない。また、混合に用いるポリエチレ
ングリコール濃度は、通常、終濃度で10〜30%程度であ
る。混合に用いる長鎖DNA濃度は、プロトプラストの由
来する植物細胞の種類により変動しうるが、通常、終濃
度で50μg/ml以上であり、好ましくは80μg/ml以上であ
り、さらに好ましくは100μg/ml以上である。一般的な
ポリエチレングリコール法においては、通常、5〜20μg
/mlであるが、本発明の方法では上記のように高濃度のD
NAを混合することを特徴とする。長鎖DNAの形態には特
に制限はなく、直鎖上DNAの他、環状DNAなどを用いるこ
とが可能である。また、DNAの導入にベクターを用いる
場合にも、適用可能なベクターには特に制限はない。
【００１４】混合後の反応は、通常、20℃程度で、5〜1
5分程度行う。この反応過程において、ポリエチレング
リコールと長鎖DNAとが吸着し、プロトプラストに作用
する。なお、長鎖DNAを用いた場合には、この反応過程
において、ポリエチレングリコールと長鎖DNAとの沈殿
（以下、「ポリエチレングリコール沈殿」と称する）が
生じ、プロトプラストの凝集が起こりうる。特に、100k
bに近い長鎖DNAを用いた場合には、起こりやすい。
5分程度行う。この反応過程において、ポリエチレング
リコールと長鎖DNAとが吸着し、プロトプラストに作用
する。なお、長鎖DNAを用いた場合には、この反応過程
において、ポリエチレングリコールと長鎖DNAとの沈殿
（以下、「ポリエチレングリコール沈殿」と称する）が
生じ、プロトプラストの凝集が起こりうる。特に、100k
bに近い長鎖DNAを用いた場合には、起こりやすい。
【００１５】本発明の方法においては、次いで、プロト
プラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養を行う。プロ
トプラストの収穫は、通常、遠心により行うか、または
静置により沈降したプロトプラストの上清を除去するこ
とにより行う。洗浄は、通常は、マンニトール溶液など
の等張液、次いで培地を用いて行う。洗浄は、必要に応
じて、繰り返し行う。なお、DNAのポリエチレングリコ
ール沈殿が生じプロトプラストが凝集している場合に
は、上記洗浄液に対する速やかな懸濁は困難である。こ
の場合には、プロトプラストの破壊を防止するために、
静置および／または緩やかな撹拌により沈殿したDNAを
溶解させプロトプラストを懸濁させることが好ましい。
洗浄後のプロトプラストの培養は、プロトプラストの由
来となる植物細胞の種類により異なる。例えば、イネで
あれば、N6培地で7〜10日程度培養する（Fujimura, T.,
Sakuraiunc, M., Akagi, H., Negishi, T and Hirose,
A.(1985) Regeneration of rice plants from protop
lasts. Plant Tissue Culture Lett. 2 :74〜75）。
プラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養を行う。プロ
トプラストの収穫は、通常、遠心により行うか、または
静置により沈降したプロトプラストの上清を除去するこ
とにより行う。洗浄は、通常は、マンニトール溶液など
の等張液、次いで培地を用いて行う。洗浄は、必要に応
じて、繰り返し行う。なお、DNAのポリエチレングリコ
ール沈殿が生じプロトプラストが凝集している場合に
は、上記洗浄液に対する速やかな懸濁は困難である。こ
の場合には、プロトプラストの破壊を防止するために、
静置および／または緩やかな撹拌により沈殿したDNAを
溶解させプロトプラストを懸濁させることが好ましい。
洗浄後のプロトプラストの培養は、プロトプラストの由
来となる植物細胞の種類により異なる。例えば、イネで
あれば、N6培地で7〜10日程度培養する（Fujimura, T.,
Sakuraiunc, M., Akagi, H., Negishi, T and Hirose,
A.(1985) Regeneration of rice plants from protop
lasts. Plant Tissue Culture Lett. 2 :74〜75）。
【００１６】本発明の方法においては、次いで、形質転
換細胞の選抜を行う。選抜は、通常、ハイグロマイシン
やビアラホスなどにより行う（Tada, Y., Sakamoto, M.
andFujimura, T. (1990) Efficient gene introductio
ninto rice by electroporation and analysis of tran
sgenic plants: use of electroporation buffer lacki
ng chloride ions. Theor. Appl. Genet. 80 :475〜48
0, Rao, K.V., Rathore, K.,Hodges, T.K. (1995) Phys
ical, chemical and physiological parameters for el
ectroporation-mediated gene delivery into rice pro
toplasts Transgenic Research 4: 361〜368）。
換細胞の選抜を行う。選抜は、通常、ハイグロマイシン
やビアラホスなどにより行う（Tada, Y., Sakamoto, M.
andFujimura, T. (1990) Efficient gene introductio
ninto rice by electroporation and analysis of tran
sgenic plants: use of electroporation buffer lacki
ng chloride ions. Theor. Appl. Genet. 80 :475〜48
0, Rao, K.V., Rathore, K.,Hodges, T.K. (1995) Phys
ical, chemical and physiological parameters for el
ectroporation-mediated gene delivery into rice pro
toplasts Transgenic Research 4: 361〜368）。
【００１７】選抜した形質転換細胞は、必要に応じて再
分化させ、トランスジェニック植物を作製することも可
能である。再分化の方法は、植物細胞の種類により異な
るが、例えば、イネであれば、Tukaharaらの方法により
行うことが可能であり、トウモロコシであればDuncanら
の方法で行うことが可能である（Tsukahara, M. andHir
isawa, T. (1992) Characterization of factors affec
ting plantlet regeneration from rice (Oryza sativ
a L.) callus. Bot. Mag. Tokyo 105:227〜233.,Dunca
n D.R., Williams M.E., Zehr, B.E. Widholm J.M. (19
85) The production of callus capable of plant rege
neration from immatute embryos of numerous Zea may
s genetypes Planta 165: 322〜332）。
分化させ、トランスジェニック植物を作製することも可
能である。再分化の方法は、植物細胞の種類により異な
るが、例えば、イネであれば、Tukaharaらの方法により
行うことが可能であり、トウモロコシであればDuncanら
の方法で行うことが可能である（Tsukahara, M. andHir
isawa, T. (1992) Characterization of factors affec
ting plantlet regeneration from rice (Oryza sativ
a L.) callus. Bot. Mag. Tokyo 105:227〜233.,Dunca
n D.R., Williams M.E., Zehr, B.E. Widholm J.M. (19
85) The production of callus capable of plant rege
neration from immatute embryos of numerous Zea may
s genetypes Planta 165: 322〜332）。
【００１８】以下、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるもの
ではない。
に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるもの
ではない。
【００１９】
[実施例１] 用いた植物とカルスの誘導 日本晴れの完熟種子を滅菌後、N6寒天培地(1mg/lの2,4-
D、10 mMのプロリン、300mg/lのカゼイン加水分解物、3
0g/lの蔗糖、3g/lのゲランガム)に置床した。置床後、3
週間目のカルスを液体のN6培地（1mg/lの2,4-D、10 mM
のプロリン、300mg/lのカゼイン加水分解物、30g/lの蔗
糖)に移植した。1週間の液体培養後、MS培地（1mg/lの
2,4-D、60g/lの蔗糖）に移植した。培養後4日目のカル
スをプロトプラスト単離の材料とした。
D、10 mMのプロリン、300mg/lのカゼイン加水分解物、3
0g/lの蔗糖、3g/lのゲランガム)に置床した。置床後、3
週間目のカルスを液体のN6培地（1mg/lの2,4-D、10 mM
のプロリン、300mg/lのカゼイン加水分解物、30g/lの蔗
糖)に移植した。1週間の液体培養後、MS培地（1mg/lの
2,4-D、60g/lの蔗糖）に移植した。培養後4日目のカル
スをプロトプラスト単離の材料とした。
【００２０】[実施例２] プラスミドの単離 常法（Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E.,
Moore, D. D., Seidman, J. G.,Smith, J. A. and Stru
hl, K. ed. (1994) Current Protocols in Molecular B
iology. Current Protocols : Greene Publishing Asso
ciates and Wiley-Interscience.JA)に従い、バクテリ
アのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を持つ「pucHPT」
（Tada, Y., Sakamoto, M. and Fujimura, T. (1990) E
fficient gene introductioninto rice by electropora
tion and analysis of transgenicplants: use of elec
troporation buffer lacking chloride ions. Theor. A
ppl. Genet. 80 :475〜480）及びヒトの約90kbの遺伝子
を持つ「PAC」（ヒト遺伝子が導入された「PAC」を「PA
C2」と称する。図１(K. Ashworth, M. Alegria-Hartma
n, M. Burgin, L. Devlin, A. V. Carrano & M. A. Bat
zer (1995) Assemblyof high-resolution bacterial ar
tificial chromosome, P1-derived artificial chromos
ome, and cosmid contigs.L.Anal Biochem 224:564〜57
1)）をアルカリSDS法で抽出、超遠心後、形質転換に用
いた。
Moore, D. D., Seidman, J. G.,Smith, J. A. and Stru
hl, K. ed. (1994) Current Protocols in Molecular B
iology. Current Protocols : Greene Publishing Asso
ciates and Wiley-Interscience.JA)に従い、バクテリ
アのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を持つ「pucHPT」
（Tada, Y., Sakamoto, M. and Fujimura, T. (1990) E
fficient gene introductioninto rice by electropora
tion and analysis of transgenicplants: use of elec
troporation buffer lacking chloride ions. Theor. A
ppl. Genet. 80 :475〜480）及びヒトの約90kbの遺伝子
を持つ「PAC」（ヒト遺伝子が導入された「PAC」を「PA
C2」と称する。図１(K. Ashworth, M. Alegria-Hartma
n, M. Burgin, L. Devlin, A. V. Carrano & M. A. Bat
zer (1995) Assemblyof high-resolution bacterial ar
tificial chromosome, P1-derived artificial chromos
ome, and cosmid contigs.L.Anal Biochem 224:564〜57
1)）をアルカリSDS法で抽出、超遠心後、形質転換に用
いた。
【００２１】[実施例３] プロトプラストの単離とポリ
エチレングリコールによる形質転換 Tadaらの方法（Tada, Y., Sakamoto, M. and Fujimura,
T. (1990) Efficientgene introduction into rice by
electroporation and analysis of transgenic plant
s: use of electroporation buffer lacking chloride
ions. Theor. Appl. Genet. 80 :475〜480）を用い、プ
ロトプラストを単離後、プロトプラストを0.5%の塩化カ
ルシウムを含む0.4Mマンニトール液中に細胞密度2x107
で懸濁した。「pucHPT」20μg/ml、「PAC2」100μg/ml
になるようにDNAを加え、細胞密度1x107にし、1mlづつ
遠心管に分注した。Dattaらの報告（Datta, S.K., Pete
rhans, A., Datta, K., Potrykus, I. (1990) Genetica
lly engineered fertile indica-rice recovered from
protoplasts）に従って作成した40%ポリエチレングリコ
ール液（PEG6000）を1ml加え緩やかに混合した。DNAが
ポリエチレングリコール沈殿し、プロトプラストとDNA
凝集が生じた後、10分間静置した。400rpmで3分遠心
後、上澄をすて0.4Mマンニトール溶液を9ml加え1〜2回
混合した。30分の静置後、同じ操作を繰り返した。さら
に30分の静置後、400rpmで遠心し上澄を捨てた後、R2培
地（2mg/lの2,4-D、0.4Mの蔗糖)を9ml加え、緩やかに混
合した後1時間静置した。この操作をもう一度繰り返
し、プロトプラストの凝集がなくなったことを確認後、
藤村らの方法（Fujimura, T., Sakurai, M., Akagi,
H., Negishi, T and Hirose, A. (1985) Regeneration
of rice plants from protoplasts.Plant Tissue Cultu
re Lett. 2 :74〜75）に従いプロトプラストを培養し
た。
エチレングリコールによる形質転換 Tadaらの方法（Tada, Y., Sakamoto, M. and Fujimura,
T. (1990) Efficientgene introduction into rice by
electroporation and analysis of transgenic plant
s: use of electroporation buffer lacking chloride
ions. Theor. Appl. Genet. 80 :475〜480）を用い、プ
ロトプラストを単離後、プロトプラストを0.5%の塩化カ
ルシウムを含む0.4Mマンニトール液中に細胞密度2x107
で懸濁した。「pucHPT」20μg/ml、「PAC2」100μg/ml
になるようにDNAを加え、細胞密度1x107にし、1mlづつ
遠心管に分注した。Dattaらの報告（Datta, S.K., Pete
rhans, A., Datta, K., Potrykus, I. (1990) Genetica
lly engineered fertile indica-rice recovered from
protoplasts）に従って作成した40%ポリエチレングリコ
ール液（PEG6000）を1ml加え緩やかに混合した。DNAが
ポリエチレングリコール沈殿し、プロトプラストとDNA
凝集が生じた後、10分間静置した。400rpmで3分遠心
後、上澄をすて0.4Mマンニトール溶液を9ml加え1〜2回
混合した。30分の静置後、同じ操作を繰り返した。さら
に30分の静置後、400rpmで遠心し上澄を捨てた後、R2培
地（2mg/lの2,4-D、0.4Mの蔗糖)を9ml加え、緩やかに混
合した後1時間静置した。この操作をもう一度繰り返
し、プロトプラストの凝集がなくなったことを確認後、
藤村らの方法（Fujimura, T., Sakurai, M., Akagi,
H., Negishi, T and Hirose, A. (1985) Regeneration
of rice plants from protoplasts.Plant Tissue Cultu
re Lett. 2 :74〜75）に従いプロトプラストを培養し
た。
【００２２】10日目にナース細胞（Ozawa, K., Komamin
e, A. (1996) High-frequency somatic embryogenesis
from small suspension-cultured clusters of cells o
f aninterspecific hybrid of Oryza. Plant Cell,Tiss
ue and Organ Culture 46:157〜159 ）を培地ごと取り
除き、ハイグロマイシンを50mg/lで含むN6培地(1mg/lの
2,4-D、0.2Mの蔗糖)を加え、ハイグロマイシン抵抗性カ
ルスを選抜した。10日後に増殖した細胞塊をN6培地(1mg
/lの2,4-D、10 mMのプロリン、300mg/lのカゼイン加水
分解物、30g/lの蔗糖、3g/lのゲランガム、50mg/lのハ
イグロマイシン)に移した。なお、形質転換実験は3回繰
り返し、通常の形質転換効率でハイグロマシン抵抗性カ
ルスが誘導された。
e, A. (1996) High-frequency somatic embryogenesis
from small suspension-cultured clusters of cells o
f aninterspecific hybrid of Oryza. Plant Cell,Tiss
ue and Organ Culture 46:157〜159 ）を培地ごと取り
除き、ハイグロマイシンを50mg/lで含むN6培地(1mg/lの
2,4-D、0.2Mの蔗糖)を加え、ハイグロマイシン抵抗性カ
ルスを選抜した。10日後に増殖した細胞塊をN6培地(1mg
/lの2,4-D、10 mMのプロリン、300mg/lのカゼイン加水
分解物、30g/lの蔗糖、3g/lのゲランガム、50mg/lのハ
イグロマイシン)に移した。なお、形質転換実験は3回繰
り返し、通常の形質転換効率でハイグロマシン抵抗性カ
ルスが誘導された。
【００２３】10日後、増殖したカルスを塚原らの方法
（Tsukahara, M. and Hirisawa, T. (1992) Characteri
zation of factors affecting plantlet regeneration
from rice (Oryza sativa L.) callus. Bot. Mag. Toky
o 105:227〜233）に従い、再分化培地に地床し、植物体
を再分化させた。
（Tsukahara, M. and Hirisawa, T. (1992) Characteri
zation of factors affecting plantlet regeneration
from rice (Oryza sativa L.) callus. Bot. Mag. Toky
o 105:227〜233）に従い、再分化培地に地床し、植物体
を再分化させた。
【００２４】[実施例４] 導入遺伝子の確認 文献「plant molecular biology manual」に従い、形質
転換植物体のゲノムDNAを抽出し、制限酵素EcoR1で分解
した後、電気泳動を行った。文献「current protocoles
in molecular biology」に従い、導入した「PAC2」を
プローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。
転換植物体のゲノムDNAを抽出し、制限酵素EcoR1で分解
した後、電気泳動を行った。文献「current protocoles
in molecular biology」に従い、導入した「PAC2」を
プローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。
【００２５】なお、3回の実験においてそれぞれ12個体
の再分化植物を選抜し、導入遺伝子の解析を行った。各
実験で得られたハイグロマイシン抵抗性植物12個体中、
それぞれ8個体、7個体、7個体で「PAC2」由来のヒトDNA
のバンドが確認された。図２に8個体が検出された実験
におけるサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
レーン1、2、4、6、7、8、9、12にバンドが確認され
た。図２中の「PAC EcoRI」はEcoRI処理した「PAC2」を
示し、「PAC Not1」はNot1処理した「PAC2」を示し、
「Con」は「pucHPT」のみを導入した形質転換体を示
す。また、レーン1〜12は「pucHPT」および「PAC2」を
導入した形質転換体を示す。
の再分化植物を選抜し、導入遺伝子の解析を行った。各
実験で得られたハイグロマイシン抵抗性植物12個体中、
それぞれ8個体、7個体、7個体で「PAC2」由来のヒトDNA
のバンドが確認された。図２に8個体が検出された実験
におけるサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。
レーン1、2、4、6、7、8、9、12にバンドが確認され
た。図２中の「PAC EcoRI」はEcoRI処理した「PAC2」を
示し、「PAC Not1」はNot1処理した「PAC2」を示し、
「Con」は「pucHPT」のみを導入した形質転換体を示
す。また、レーン1〜12は「pucHPT」および「PAC2」を
導入した形質転換体を示す。
【００２６】また、上記実験において28kbのバンドが検
出された個体につき長鎖DNA断片を検出するためにパル
スフィールド電気泳動を行った。この結果、パルスフィ
ールド電気泳動で60kbの「PAC2」由来のDNAのバンドが
確認できた個体はそれぞれ2個体、3個体、2個体であっ
た。図３に、上記3回のサザンハイブリダイゼーション
実験において28kbのバンドが検出された個体を7個体選
抜してパルスフィールド電気泳動を行った結果を示し
た。図３中の「N」はNot1処理した個体を示し、「No」
は制限酵素処理していない個体を示す。また、「C」は
「pucHPT」のみを導入した形質転換体を示し、「R1」〜
「R7」は「pucHPT」および「PAC2」が導入された形質転
換体を示す。なお、60kbのバンドの確認できた個体の幾
つかでは30kb、18kbのバンドも確認できた。これらの結
果から、「PAC2」の全長が植物体に導入されたことが判
明した。
出された個体につき長鎖DNA断片を検出するためにパル
スフィールド電気泳動を行った。この結果、パルスフィ
ールド電気泳動で60kbの「PAC2」由来のDNAのバンドが
確認できた個体はそれぞれ2個体、3個体、2個体であっ
た。図３に、上記3回のサザンハイブリダイゼーション
実験において28kbのバンドが検出された個体を7個体選
抜してパルスフィールド電気泳動を行った結果を示し
た。図３中の「N」はNot1処理した個体を示し、「No」
は制限酵素処理していない個体を示す。また、「C」は
「pucHPT」のみを導入した形質転換体を示し、「R1」〜
「R7」は「pucHPT」および「PAC2」が導入された形質転
換体を示す。なお、60kbのバンドの確認できた個体の幾
つかでは30kb、18kbのバンドも確認できた。これらの結
果から、「PAC2」の全長が植物体に導入されたことが判
明した。
【００２７】なお、遺伝子導入に用いる「PAC2」の濃度
は、50μg/ml以上であれば形質転換体が得られた。しか
し、50μg/mlより高濃度の「PAC2」（例えば、80μg/m
l、100μg/ml）を用いた場合には、より高い遺伝子導入
効率が得られた。
は、50μg/ml以上であれば形質転換体が得られた。しか
し、50μg/mlより高濃度の「PAC2」（例えば、80μg/m
l、100μg/ml）を用いた場合には、より高い遺伝子導入
効率が得られた。
【００２８】
【発明の効果】本発明により、長鎖DNAを植物細胞内に
導入可能なポリエチレングリコール法が提供された。本
発明のポリエチレングリコール法によれば、純化した長
鎖DNAがあれば用いるプラスミドによる制限もなく、簡
便かつ高効率に植物細胞に長鎖DNAを導入することが可
能である。また、適用可能な植物種に特に制限はなく、
広範囲の植物細胞に長鎖DNAを導入することが可能であ
る。
導入可能なポリエチレングリコール法が提供された。本
発明のポリエチレングリコール法によれば、純化した長
鎖DNAがあれば用いるプラスミドによる制限もなく、簡
便かつ高効率に植物細胞に長鎖DNAを導入することが可
能である。また、適用可能な植物種に特に制限はなく、
広範囲の植物細胞に長鎖DNAを導入することが可能であ
る。
【図１】本発明においてプロトプラストへの導入に用い
た「PAC2」を示す。なお、図中の「N」はNot1部位を示
し、「S」はSal1部位を示す。
た「PAC2」を示す。なお、図中の「N」はNot1部位を示
し、「S」はSal1部位を示す。
【図２】本発明のポリエチレングリコール法により「PA
C2」の導入を行った植物のサザンハイブリダイゼーショ
ンの結果を示す。
C2」の導入を行った植物のサザンハイブリダイゼーショ
ンの結果を示す。
【図３】本発明のポリエチレングリコール法により「PA
C2」が導入された植物のパルスフィールド電気泳動像を
示す。
C2」が導入された植物のパルスフィールド電気泳動像を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．201 （1985）ｐ．513−518 魚住武司他１名著「植物工学」丸善株 式会社、平５−１−31 第109頁 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 長鎖DNAをプロトプラストに導入する方
法であって、（ａ）プロトプラスト懸濁液、ポリエチレ
ングリコールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終濃度が50μ
g/ml以上になるように混合する工程、（ｂ）プロトプラ
ストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程、（ｃ）
形質転換細胞を選抜する工程、を含む方法。 - 【請求項２】 長鎖DNAをプロトプラストに導入する方
法であって、（ａ）プロトプラスト懸濁液、ポリエチレ
ングリコールおよび長鎖DNAを、長鎖DNAの終濃度が100
μg/ml以上になるように混合する工程、（ｂ）プロトプ
ラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程、
（ｃ）形質転換細胞を選抜する工程、を含む方法。 - 【請求項３】 プロトプラストを収穫し、洗浄し、培地
中で培養する工程におけるプロトプラストの洗浄におい
て、静置および／または緩やかな撹拌により沈殿したDN
Aを溶解させプロトプラストを懸濁させることを特徴と
する、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 長鎖DNAが100kb以上のDNAである、請求
項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 プロトプラストが単子葉植物由来であ
る、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 単子葉植物がイネ科植物である、請求項
５に記載の方法。 - 【請求項７】 イネ科植物がイネである、請求項６に記
載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09320297A JP3151657B2 (ja) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | 遺伝子導入法 |
| PCT/JP1997/003445 WO1998042857A1 (fr) | 1997-03-26 | 1997-09-26 | Procede d'introduction genique |
| AU43977/97A AU4397797A (en) | 1997-03-26 | 1997-09-26 | Method of gene introduction |
| US09/194,330 US6143949A (en) | 1997-03-26 | 1997-09-26 | Method for transferring gene |
| CA002256496A CA2256496A1 (en) | 1997-03-26 | 1997-09-26 | Method for transferring gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09320297A JP3151657B2 (ja) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | 遺伝子導入法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10262666A JPH10262666A (ja) | 1998-10-06 |
| JP3151657B2 true JP3151657B2 (ja) | 2001-04-03 |
Family
ID=14075995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09320297A Expired - Lifetime JP3151657B2 (ja) | 1997-03-26 | 1997-03-26 | 遺伝子導入法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3151657B2 (ja) |
| AU (1) | AU4397797A (ja) |
| CA (1) | CA2256496A1 (ja) |
| WO (1) | WO1998042857A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2001020974A1 (en) * | 1999-09-22 | 2001-03-29 | The Penn State Research Foundation | Quantitative transient protein expression in plant tissue culture |
| IL157746A0 (en) * | 2001-05-30 | 2004-03-28 | Chromos Molecular Systems Inc | Chromosome-based platforms |
| JP4771656B2 (ja) | 2001-05-30 | 2011-09-14 | カリックス・バイオ−ベンチャーズ・インコーポレイテッド | 植物人工染色体、その使用及び植物人工染色体の製造方法 |
| US7534934B2 (en) | 2002-02-20 | 2009-05-19 | J.R. Simplot Company | Precise breeding |
| NZ585399A (en) * | 2002-02-20 | 2012-07-27 | Simplot Co J R | Recombinant plant comprising the insertion of a native genetic element without the insertion of border sequences or selectable markers |
| AU2003230693B2 (en) * | 2002-03-20 | 2010-09-30 | J.R. Simplot Company | Refined plant transformation |
| US20050034188A1 (en) * | 2002-03-20 | 2005-02-10 | J. R. Simplot Company | Refined plant transformation |
| NZ554824A (en) | 2004-10-22 | 2010-10-29 | Revivicor Inc | Porcines that lack endogenous antibody chains and express exogenous immunoglobulins |
| EP2348827B1 (en) | 2008-10-27 | 2015-07-01 | Revivicor, Inc. | Immunocompromised ungulates |
| US7868688B2 (en) * | 2008-12-30 | 2011-01-11 | Cosmic Circuits Private Limited | Leakage independent very low bandwith current filter |
| US20190345259A1 (en) | 2016-04-12 | 2019-11-14 | Synploid Biotek, Llc | Methods for creating synthetic chromosomes having gene regulatory systems and uses thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08163936A (ja) * | 1994-12-14 | 1996-06-25 | Japan Turf Glass:Kk | ゾイシア属植物形質転換体及びその作出方法 |
| JPH08187040A (ja) * | 1995-01-11 | 1996-07-23 | Japan Turf Glass:Kk | アグロスティス属植物形質転換体及びその作出方法 |
| JPH09121705A (ja) * | 1995-11-08 | 1997-05-13 | Japan Turf Glass:Kk | 耐病性ゾイシア属植物 |
-
1997
- 1997-03-26 JP JP09320297A patent/JP3151657B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-26 AU AU43977/97A patent/AU4397797A/en not_active Abandoned
- 1997-09-26 US US09/194,330 patent/US6143949A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-26 WO PCT/JP1997/003445 patent/WO1998042857A1/ja active Application Filing
- 1997-09-26 CA CA002256496A patent/CA2256496A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０１（１９８５）ｐ．５１３−５１８ |
| 魚住武司他１名著「植物工学」丸善株式会社、平５−１−３１ 第１０９頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2256496A1 (en) | 1998-10-01 |
| WO1998042857A1 (fr) | 1998-10-01 |
| JPH10262666A (ja) | 1998-10-06 |
| AU4397797A (en) | 1998-10-20 |
| US6143949A (en) | 2000-11-07 |
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