WO2021185358A1 - 一种提高植物遗传转化和基因编辑效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高植物遗传转化和基因编辑效率的方法。具体而言，该方法通过表达促进植物细胞分裂特别是分生组织细胞分裂的基因，提高植物遗传转化的再生效率和/或提高植物基因编辑的效率。

Description

一种提高植物遗传转化和基因编辑效率的方法 技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种提高植物遗传转化和基因编辑效率的方法。更具体而言，本发明涉及通过表达促进植物细胞分裂特别是分生组织细胞分裂的基因，提高植物遗传转化的再生效率和/或提高植物基因编辑的效率。
发明背景
作物遗传育种经历了人工选择育种、杂交育种、突变育种以及以分子技术为手段的分子标记辅助育种。随着所用品种遗传多样性逐步减少，传统育种瓶颈效应愈来愈为明显：利用常规育种技术已经很难育成突破性新品种，无法满足人类的需求和可持续农业的发张。生命科学的迅速发展使得从生物遗传信息的“读取”阶段进入到后基因组时代，基因组的精准“改写”乃至“全新设计”正逐渐成为现实。这种以设计创造新性状或生命体为目标的生物学技术手段，在疾病治疗、医药、制造、特别是农业等领域显现出巨大的前景。
基因组编辑技术是当前生命科学中出现的革命性技术手段，它可以实现对基因组进行精确、高效和特异的改写，对整个生命科学的研究和探索具有革命性的推动作用。基因编辑是指对目标基因进行删除、替换、插入等操作进而改写遗传信息，以获得新的功能或表型，甚至创造新的物种。开发适合作物高效精准的以基因编辑技术为手段的育种技术，将会打破传统育种的缺陷，实现从基因组精准改造的分子设计育种。对未来农业的发展具有重要的战略性意义。
当前基因编辑技术主要包括ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统由于其高效性和灵活性，是目前最为简单和广泛使用的基因编辑技术体系。CRISPR/Cas系统中，Cas蛋白在人工设计的向导RNA(guide RNA)的导向作用下可以靶向基因组中的任意位置。碱基编辑系统是基于CRISPR系统开发的新型基因编辑技术，分为胞嘧啶碱基编辑系统和腺嘌呤碱基编辑系统，分别将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶与Cas9单链切口酶融合，在向导RNA的靶向作用下，Cas9单链切口酶产生一个单链DNA区域，因此脱氨酶可以高效地分别将靶向位置的单链DNA上的C和A核苷酸脱去氨基，变为U碱基和I碱基，进而在细胞自身修复的过程中被修复为T碱基和G碱基。碱基编辑技术克服了传统的DSB介导的基因编辑的缺陷，可以高效的实现单个碱基的精准替换。CRISPR/Cas系统介导的强大的基因组改造的技术体系，将会为植物的基因组学研究和新型植物分子设计育种提供强大的技术支撑，将加速作物新品种的培育和实现农业的可持续发展。
植物基因编辑的一个关键步骤就是将基因编辑核酸酶蛋白或编码核酸递送到植物 细胞，实现对目的基因的编辑。目前植物基因组编辑的递送技术主要是通过遗传转化和组织培养技术来实现，主要包括农杆菌介导法和基因枪法。过去几年来在植物转化方面取得了的重要进展，但多种农艺学上重要的植物(例如，玉米、大豆、低芥酸菜籽、小麦、籼稻、甘蔗和高粱、以及近交系)的转化依然是困难且耗时的。通常来说，引起培养反应的唯一方法是通过优化培养基组分和/或外植体材料和来源，这导致了一些基因型的成功，但是许多重要的作物植物(包括优良近交系或品种)都未能产生有利的培养反应和再生技术体系。尽管模式基因型的转化可能是有效的，但是将转基因渐渗入生产近交系的过程是费力、昂贵且耗时的。特别是单子叶植物小麦来说，当前基因枪和农杆菌转化方法效率较低而且极大的受制于基因型的限制，需要经过漫长的组织培养过程。目前小麦基因编辑的最大的瓶颈是当前传统小麦转化系统的效率较低，技术难度较大以及容易受到基因型的限制且通量低。
为了更高效的利用基因编辑技术来解析植物基因功能的研究以及进行分子设计育种，建立和挖掘提高植物转化效率和缩短组织培养的时间，对植物基因组编辑编辑的研究具有重要的意义。
发明简述
在一方面，本发明提供一种在植物转化中提高植物细胞再生效率的方法，所述方法包括：
(a)向所述植物细胞导入
i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体；和/或
ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，
(b)从所述植物细胞再生完整植物。
在另一方面，本发明提供一种提高外源感兴趣核酸序列在植物中的转化效率或将外源感兴趣核酸序列转化进植物的方法，所述方法包括：
(a)向所述植物的细胞导入
i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码序列的表达构建体；和/或
ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，
(b)向所述植物细胞导入至少一个包含至少一种外源感兴趣核酸序列的表达构建体；
(c)从所述植物细胞再生完整植物。
在另一方面，本发明提供一种提高植物中基因编辑效率或在植物中进行基因编辑的方法，所述方法包括：
(a)向所述植物的细胞导入
i)包含WUS的编码序列的表达构建体、包含BBM的编码序列的表达构建体和包含SERK的编码序列的表达构建体；和/或
ii)包含GRF的编码序列的表达构建体和包含GIF的编码序列的表达构建体，
(b)向所述植物细胞导入至少一个包含至少一种外源感兴趣序列的表达构建体，其中所述至少一种外源感兴趣序列编码基因编辑系统的组分；或，向所述植物细胞导入基因编辑系统的至少一个组分；
(c)从所述植物细胞再生完整植物。
本发明还提供了一种用于实施本发明的方法的试剂盒，其至少包含i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体；和/或ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体。
本发明还提供了i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体，和/或ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，用于提高植物转化中植物细胞再生效率、提高外源感兴趣核酸序列在植物中的转化效率或提高植物中基因编辑效率的用途。
附图简述
图1.示出用于检测多种DR组合对遗传转化和基因编辑效率影响的表达构建体。
图2.示出用于在小麦中验证GRF4和gif1组合对遗传转化和基因编辑效率影响的表达构建体。
图3.示出用于GRF4和gif1组合优化实验的表达构建体。
图4.示出大豆GRF/gif表达构建体。
图5.GmGRF-GmGIF1复合物对大豆品种Williams 82的再生、转化和基因组编辑的影响。(A)各自包含四个GmGRF-GmGIF1复合体之一的T-DNA区域的示意图。pBSE401是CRISPR/Cas9对照构建体。(B)两个亚基因组中GmFAD2sgRNA靶位点的示意图。(C)农杆菌介导的大豆转化的一般程序。(D)比较四种GmGRF-GmGIF1复合物对Williams 82的再生频率的影响。RF(再生频率)＝具有多芽的外植体数目/植株数×100％。(E)从分别用四种GmGRF-GmGIF1复合物和pBSE401转化的外植体中再生得到的假定的草铵膦抗性长度≥2cm(转化后第50天)伸长芽和长度≥9cm(转化后75天)伸长芽的数目。(F)从分别用四种GmGRF-GmGIF1复合物和pBSE401转化的外植体再生的伸长芽的平均数目。(G)在感染后第50天，用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化并在补充有5.0mg/L草铵膦的培养基中培养的外植体的再生。(H)分别在感染pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401后的第75天，在补充有5.0mg/L草铵膦的培养基中培养具有再生芽的典型外植体。(I) 分别用四种GmGRF-GmGIF1复合物和pBSE401转化的Williams 82的转化效率。(J)分别由四种pGmGRF-GmGIF1构建体和pBSE401处理的CRISPR/Cas9引起的GmFAD2突变频率。(K)分别用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化的成熟的GmFAD2编辑的大豆植物的性能(转化后160天)。所有值和误差线均为三个独立实验平均值±s.e.m.。
图6.GmGRF5-GmGIF1复合物对两个大豆品种中黄13和合丰25的再生、转化和基因组编辑的影响。(A)在转化后第50天用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化的外植体的再生频率。(B，C)分别用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化从中黄13(B)和合丰25(C)的外植体再生得到的转化后第50天假定的草铵膦抗性伸长芽(长度≥2cm)和第75天的伸长芽(长度≥9cm)的数量。(D)分别用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化的合丰25外植体的芽诱导、芽增殖和芽伸长。(E)从分别用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化的中黄13和合丰25的单外植体再生的伸长芽的平均数目。(F)分别用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化的中黄13和合丰25的转化效率。(G)分别用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化的中黄13号和合丰25号的GmFAD2突变率。所有值和误差线均为三个独立实验平均值±s.e.m.。
图7.GmGRF5-GmGIF1复合物对草莓品种Benihoppe的再生、转化和基因组编辑效率的影响。(A)含有GmGRF5-GmGIF1复合物的T-DNA区域的示意图。pHUE411-GFP是CRISPR/Cas9对照构建体。(B)GmGRF5-GmGIF1复合物对草莓再生、转化和基因组编辑效率的影响。在将外植体用pHUE411-GFP-GmGRF5-GmGIF1和pHUE411-GFP转化后的第35天收集数据。RF(再生频率)＝再生芽数/外植体总数×100％。TE(转化效率)＝转基因芽数/外植体总数×100％。MF(变异频率)＝突变体数/外植体总数×100％。(C)在转化后第21天，来自用pHUE411-GFP-GmGRF5-GmGIF1和pHUE411-GFP转化的外植体的GFP阳性愈伤组织。(D)在转化后第35天，分别用pHUE411-GFP-GmGRF5-GmGIF1和pHUE411-GFP转化的外植体的愈伤组织和芽。
图8.TaGRF4-TaGIF1和mTaGRF4-TaGIF1对两种常见小麦品种Kenong 199和Bobwhite的再生和基因组编辑的影响比较。(A)普通小麦GIF1、GRF4和突变GRF4的示意图。虚线表示SNH和QLQ域之间的相互作用。通过在普通小麦TaGRF4的miRNA396目标位点引入五个点突变来创建mTaGRF4。(B)构建体pTaGRF4-TaGIF1、pmTaGRF4-TaGIF1和基本编辑器pUBI-A3A的示意图。pUBI-GFP是对照构建体。(C)通过胞嘧啶碱基编辑器的瞬时表达在普通小麦中进行无转基因基因组编辑的一般程序。(D)比较TaGRF4-TaGIF1和mTaGRF4-TaGIF1对Bobwhite和Kenong199再生频率的影响。RF(再生频率)＝再生芽数/未成熟胚轰击数×100％。(E)比较TaGRF4-TaGIF1和mTaGRF4-TaGIF1对Bobwhite和Kenong199基因组编辑频率的影响。MF(变异频率)＝突变体数/轰击的未成熟胚的数量×100％。(F)用于检测无转基因突变体的引物组，以及对22种代表性TaALS突变体植物(Kenong 199)的测试结果。(G)分别用TaGRF4-TaGIF1，mTaGRF4-TaGIF1和pUBI-GFP(对照构建体)转化的Bobwhite和Kenong199小麦品种的无转基因频率。(H)从瞬时表达mTaGRF4-TaGIF1的Kenong 199个未成熟胚和胞嘧啶碱 基编辑器A3A-PBE再生的不含转基因的突变植物没有表现出异常生长。在(D)、(E)和(G)中，值和误差线为三个独立实验平均值±s.e.m.。
图9.突变的TaGRF4-TaGIF1复合物的瞬时表达对9个优良小麦品种的普通小麦再生和基因组编辑效率的影响。(A)用pmTaGRF4-TaGIF1和pUBI-GFP(对照构建体)转化的9个优良普通小麦品种的再生频率。值和误差线是三个独立实验平均值±s.e.m.。(B)分别用mTaGRF4-TaGIF1和pUBI-GFP(对照构建体)转化的小烟54和中麦175在转化后28天的再生植物。(C)用pmTaGRF4-TaGIF1和pUBI-GFP(对照构建体)转化的9个优良普通小麦品种的突变频率。MF(变异频率)＝突变体总数/轰击的未成熟胚总数×100％。
图10.在15个代表性的用pGmGRF5-GmGIF1转化的Williams 82大豆品系中检测突变和无转基因突变植物。(A)通过PCR-RE测定法鉴定的来自15个代表性大豆品系的GmFAD2基因中的突变。泳道1至15表示使用BstXI从转基因大豆植物中扩增的PCR片段的消化。标记为CK的泳道显示了从野生型对照植物扩增的PCR片段的消化物。(B)在15个代表性gmfad2突变植物中使用两个引物对无转基因突变体进行测试的结果。没有条带的泳道表示无转基因突变体。标记为CK的泳道是从野生植物中扩增的PCR片段。(C)野生型GmFAD2基因和已编辑的gmfad2突变体的Sanger测序。
图11.对大豆(Gmcine max)和草莓(Fvearia vesca)(Fve)的GRF进行了系统发育分析，并设计了可产生草莓FaPL突变基因的sgRNA。(A)Clustal W用于对齐31个GRF，包括9个FveGRF和22个GmGRF。MEGA 7.0用于构建具有1000个引导复制的邻居连接系统树。(B)设计为靶向FaPL基因的sgRNA的示意图。(C)通过Sanger测序在用pHUE411-GFP-GmGRF5-GmGIF1转化的再生草莓系中检测突变。
图12.推断的GRF4和GIF1蛋白的多重序列比对，这在普通小麦和水稻之间最为相似。(A)在氨基酸水平上，普通小麦的GRF4与水稻的GRF4具有62.5％的保守性。(B)在氨基酸水平上，普通小麦的GIF1与大米的GIF1具有86.5％的保守性。使用Geneious Prime比较序列。
图13.普通小麦基因组中TaALS sgRNA靶位点的示意图。碱基编辑系统靶向普通小麦TaALS同源物保守区域内的SgRNA靶位点。sgRNA靶序列中的EcoO109I限制性酶切位点用于突变检测。
具体实施方式
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring  Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子；反之亦然。
“基因组”如本文所用不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。
针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“核酸序列”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“D”表示A、T或G，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、和“蛋白”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核酸序列的表达可指核酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段(包括DNA或RNA片段)、环状质粒、病毒载体。
本发明的“表达构建体”可包含调控序列和与其可操作地连接的感兴趣的核酸序列。调控序列和感兴趣的核酸序列可以是不同来源的，或者是相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于所述细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
将核酸分子(例如表达构建体)“导入”植物细胞是指将该核酸分子呈送给该植物细胞，使得该核酸分子进入植物细胞的内部。
“再生”是指从一个或多个植物细胞(例如，植物原生质体、愈伤组织或外植体)生长完整植物的过程。
二、改进的植物转化
在一方面，本发明提供一种在植物转化中提高植物细胞再生效率的方法，所述方法包括：
(a)向所述植物细胞导入
i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体；和/或
ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，
(b)从所述植物细胞再生完整植物。
在另一方面，本发明提供一种提高外源感兴趣核酸序列在植物中的转化效率或将外源感兴趣核酸序列转化进植物的方法，所述方法包括：
(a)向所述植物的细胞导入
i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码序列的表达构建体；和/或
ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，
(b)向所述植物细胞导入至少一个包含至少一种外源感兴趣核酸序列的表达构建体；
(c)从所述植物细胞再生完整植物。
在该方面的一些实施方案中，所述步骤(a)和步骤(b)同时进行。在该方面的一些实施方案中，先进行步骤(a)，再进行步骤(b)。在该方面的一些实施方案中，先进行步骤(b)， 再进行步骤(a)。在该方面的一些实施方案中，在所述步骤(a)和步骤(b)之后进行步骤(c)。
在另一方面，本发明提供一种提高植物中基因编辑效率或在植物中进行基因编辑的方法，所述方法包括：
(a)向所述植物的细胞导入
i)包含WUS的编码序列的表达构建体、包含BBM的编码序列的表达构建体和包含SERK的编码序列的表达构建体；和/或
ii)包含GRF的编码序列的表达构建体和包含GIF的编码序列的表达构建体，
(b)向所述植物细胞导入至少一个包含至少一种外源感兴趣序列的表达构建体，其中所述至少一种外源感兴趣序列编码基因编辑系统的组分；或，向所述植物细胞导入基因编辑系统的至少一个组分；
(c)从所述植物细胞再生完整植物。
在该方面的一些实施方案中，所述步骤(a)和步骤(b)同时进行。在该方面的一些实施方案中，先进行步骤(a)，再进行步骤(b)。在该方面的一些实施方案中，先进行步骤(b)，再进行步骤(a)。在该方面的一些实施方案中，在所述步骤(a)和步骤(b)之后进行步骤(c)。
本发明还提供了一种用于实施本发明的方法的试剂盒，其至少包含i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体；和/或ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体。
本发明还提供了i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体，和/或ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，用于提高植物转化中植物细胞再生效率、提高外源感兴趣核酸序列在植物中的转化效率或提高植物中基因编辑效率的用途。
WUS(WUSCHEL)、BBM(BABY BOOM)和SERK(Somatic embryogenesis receptor-like kinase)是植物中广泛存在的、保守的发育调控因子(DR)。本发明人令人惊奇地发现，将WUS、BBM和SERK的组合在植物细胞共表达，可以显著提高植物细胞再生成完整植物的效率，也显著提高外源感兴趣核酸序列转化进植物的效率。当外源感兴趣核酸序列编码基因编辑系统时，可以显著提高基因编辑效率。
适用于本发明的WUS、BBM和SERK的实例包括但不限于来自拟南芥、油菜、草莓、马铃薯、水稻、番茄、大豆、玉米或小麦的WUS、BBM和SERK。
在本发明各方面的一些实施方案中，所述WUS是玉米WUS(ZmWUS)，所述BBM是玉米BBM(ZmBBM)，或所述SERK是玉米SERK(ZmSERK)。在一些实施方案中，所述ZmWUS包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ZmBBM包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ZmSERK包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
在本发明各方面的一些实施方案中，所述WUS的编码核酸序列、BBM的编码核酸序列、SERK的编码核酸序列和所述至少一种外源感兴趣核酸序列中的至少两种或至少三种或全部置于同一表达构建体。在一些实施方案中，所述WUS的编码核酸序列、BBM的编码核酸序列、SERK的编码核酸序列和所述至少一种外源感兴趣核酸序列分别置于不同表达构建体。
在本发明各方面的一些实施方案中，所述WUS的编码核酸序列、BBM的编码核酸序列、SERK的编码核酸序列置于同一表达构建体，所述至少一种外源感兴趣核酸序列置于另一表达构建体。
在本发明各方面的一些实施方案中，所述WUS的编码核酸序列、BBM的编码核酸序列、SERK的编码核酸序列和/或所述至少一种外源感兴趣核酸序列与转录调控元件可操作地连接。
通过同一表达构建体表达不同蛋白的方法是本领域已知的。例如，可以在同一表达构建体中将不同的蛋白置于不同的转录调控元件(例如不同启动子)的控制下。或者，可以将不同的蛋白通过自裂解肽(例如2A肽，包括但不限于P2A、E2A、F2A和T2A等)融合，然后置于相同转录调控元件(例如不同启动子)的控制下，使得在翻译时或翻译后通过自裂解肽的自裂解产生分开的不同蛋白。又或者，可以在不同蛋白的编码核酸序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES).
“GRF”(Growth regulating factor)是植物中特有的转录因子，主要调控植物细胞大小、叶绿体增殖、雌蕊发育、渗透胁迫等植物生长发育过程。GRF转录因子在植物中广泛存在，主要包含QLQ和WRC两个保守的结构域。GRF的QLQ结构域可与GIF(GRF-interacting factor)蛋白中的SNH结构域(SYT N-terminal homology domain)发生相互作用，从而行使转录激活功能。WRC结构域包括1个功能性核定位信号和1个DNA结合基序，在DNA结合中起作用。通产而言，QLQ和WRC结构域均位于GRF的N端。然而，某些GRF在C端还存在第二个WRC结构域。
“GIF”(GRF-interacting factor)是可与GRF形成转录共激活因子复合物的蛋白。GIFs与人类转录共激活因子滑膜肉瘤转运蛋白(synovial sarcoma translocation protein，SYT)同源。在拟南芥中，GIF在叶片发育期间的细胞增殖中起作用，并维持分生细胞在花器官发育期间的增殖能力。
本发明人进一步令人惊奇地发现，将GRF和GIF的组合在植物细胞共表达，可以显著提高植物细胞再生成完整植物的效率，也显著提高外源感兴趣核酸序列转化进植物的效率。当外源感兴趣核酸序列编码基因编辑系统时，还可以显著提高基因编辑效率。
适用于本发明的GRF的实例包括但不限于来自拟南芥、油菜、马铃薯、水稻、番茄、大豆、玉米或小麦的GRF。适用于本发明的GIF的实例包括但不限于来自拟南芥、油菜、马铃薯、水稻、番茄、大豆、玉米或小麦的GIF。然而，只要能形成转录共激活因子复合物，本发明中GRF和GIF并不一定具有相同来源。
在本发明的一些实施方案中，所述GRF是小麦GRF。合适的小麦GRF包括但不限 于例如小麦GRF4。在一些实施方案中，所述小麦GRF4包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述GIF是小麦GIF。合适的小麦GIF包括但不限于例如小麦GIF1。在一些实施方案中，所述小麦GIF1包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述GRF是大豆GRF。合适的大豆GRF包括但不限于大豆GRF5、大豆GRF6、大豆GRF11或大豆GRF11。在一些实施方案中，所述大豆GRF5包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述大豆GRF6包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述大豆GRF11包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述大豆GRF18包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述GIF衍生自大豆GIF。合适的大豆GIF包括但不限于例如大豆GIF1。在一些实施方案中，所述大豆GIF1包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列。
植物中许多转录因子包括GRF都受到miRNA的调控。例如，GRF4受到miR396的负调控。本发明令人惊奇地发现，突变GRF中的miRNA结合位点，可以显著改善GRF/GIF组合在提高植物细胞再生和植物遗传转化效率中的作用。
因此，在本发明的一些实施方案中，所述GRF包含突变的miRNA结合位点，从而不受所述miRNA的调控。所述miRNA的实例包括但不限于miR396，取决于具体的GRF。在一些实施方案中，所述包含突变的miRNA结合位点的GRF包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述GRF的编码序列、所述GIF的编码序列和所述至少一种外源感兴趣核酸序列中的至少两种或全部置于同一表达构建体。
在本发明的一些实施方案中，所述GRF的编码序列和GIF的编码序列置于同一表达构建体，而所述至少一种外源感兴趣核酸序列置于另一表达构建体。
在本发明的一些实施方案中，所述GRF的编码序列、所述GIF的编码序列和所述至少一种外源感兴趣核酸序列与转录调控序列可操作地连接。
在本发明的一些实施方案中，所述GRF融合至所述GIF。在一些实施方案中，所述GRF融合至所述GIF的N端。在一些实施方案中，所述GRF通过接头融合至所述GIF。示例性的接头包括AAAA(SEQ ID NO:12)或序列SGGS(SEQ ID NO:13)。优选地，所述接头是AAAA。
在本发明的一些实施方案中，所述“包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体”涵盖包含GRF和GIF的融合蛋白的编码序列的表达构建体。
在本发明的一些实施方案中，所述GRF和GIF的融合蛋白包含SEQ ID NO:17-22中任一所编码的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，所述GRF和GIF的融合蛋白由SEQ ID NO:17-22中任一所编码。在本发明的一些实施方案中，所述GRF和GIF 的融合蛋白包含SEQ ID NO:23-28中任一所编码的氨基酸序列。
所述“至少一种外源感兴趣核酸序列”可以是任何需要转化至植物的核酸序列。例如，所述外源感兴趣核酸序列可以编码对农学、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征、和商业产品而言重要的性状的核酸序列。感兴趣核酸序列还可以包括参与油、淀粉、碳水化合物或营养素代谢的那些核酸序列，以及影响籽粒大小、蔗糖载量等的那些核酸序列。
在本发明的一些优选实施方案中，所述“至少一种外源感兴趣核酸序列”编码基因编辑系统的组分，从而可以对植物进行基因编辑。
“基因编辑”，也称为基因组编辑，其使用序列特异性核酸酶或其衍生物在生物体基因组中进行核苷酸插入、缺失或取代。基因编辑通常通过在基因组中期望的位置导致位点特异性双链断裂(DSB)，然后在修复DSB的过程中引入期望的DNA插入、缺失或取代。然而，基因编辑也可以涵盖不涉及DSB的碱基编辑技术、转录激活或抑制、表观遗传修饰技术，只要其具有序列特异性。
本发明并不特别限制所使用的基因编辑系统。例如，适于本发明使用的基因编辑系统包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶(MGN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统。
“锌指核酸酶”是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备的人工限制性酶。ZFN的单个锌指DNA结合结构域通常含有3-6个单独的锌指重复序列，每个锌指重复序列可以识别例如3bp的独特序列。通过组合不同的锌指重复序列，可以靶向不同的基因组序列。
大范围核酸酶(meganuclease)通常是指能够识别14-40碱基长度的核酸序列的归巢核酸内切酶。长识别序列使得大范围核酸酶具备很强的特异性，从而减少其脱靶效应。
“转录激活因子样效应物核酸酶”是可以经工程化而可以切割特定DNA序列的限制性酶，通常通过将转录激活因子样效应物(TALE)的DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备。TALE经工程化后可以结合几乎任何想要的DNA序列。
“CRISPR系统”通常包含可以形成具有序列特异性的复合物的两种组分：CRISPR核酸酶或其变体，和相应的向导RNA。因此，对于CRISPR系统，本发明所述“至少一种外源感兴趣核酸序列”可以包括CRISPR核酸酶或其变体的编码核酸序列，和/或相应的向导RNA的编码核酸序列。或者，向所述植物细胞导入的基因编辑系统的至少一个组分可以包括CRISPR核酸酶或其变体，和/或相应的向导RNA。
在本发明的一些优选实施方案中，所述基因编辑系统是CRISPR系统。本领域已知大量的不同的CRISPR基因编辑系统，其均可应用于本发明。例如，合适的CRISPR基因编辑系统可见于 http://www.addgene.org/crispr/。CRISPR基因编辑系统涵盖改变基因组序列的系统，也包括用于转录调控但不改变基因组序列的系统。
如本文所用，术语“CRISPR核酸酶”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的 核酸酶。“CRISPR核酸酶变体”包括天然CRISPR核酸酶的修饰形式、人工突变体(包括切口酶突变体)、催化活性片段、或与其他功能蛋白/多肽的融合物等。本领域已知多种CRISPR核酸酶的人工功能性变体，例如高特异性变体或切口酶变体，或其与胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶的融合蛋白等。CRISPR核酸酶或其变体可以通过与相应向导RNA一起相互作用来识别、结合和/或切割靶核酸结构。本领域技术人员知晓如何选择合适的CRISPR核酸酶或其变体以实现本发明的目的。
本发明的CRISPR基因编辑系统使用的CRISPR核酸酶或其变体例如可以选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1(Cas12a)、C2c1、C2c3或C2c2蛋白，或这些核酸酶的功能性变体。
在本发明的一些实施方案中，所述CRISPR核酸酶或其变体包括Cas9核酸酶或其变体。基于Cas9核酸酶或其变体的CRISPR基因编辑系统在本文也称作CRISPR-Cas9基因编辑系统。所述Cas9核酸酶可以是来自不同物种的Cas9核酸酶，例如来自化脓链球菌(S.pyogenes)的spCas9(具有SEQ ID NO:15所示氨基酸序列)。
Cas9核酸酶变体可以包括Cas9切口酶(nCas9)，其中Cas9核酸酶的DNA切割结构域中的两个亚结构域(HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域)之一被失活而形成切口酶。在一些实施方案中，可以利用Cas9切口酶与靶向待编辑序列上下游的两种gRNA组合，实现待编辑序列的缺失，或在供体序列存在下实现待编辑序列的替换。
在本发明的一些实施方案中，所述CRISPR核酸酶或其变体还可以包括Cpf1(Cas12a)核酸酶或其变体例如高特异性变体。所述Cpf1核酸酶可以是来自不同物种的Cpf1核酸酶，例如来自Francisella novicida U112、Acidaminococcus sp.BV3L6和Lachnospiraceae bacterium ND2006的Cpf1核酸酶。基于Cpf1核酸酶或其变体的CRISPR基因编辑系统在本文也称作CRISPR-Cpf1系统。
在本发明的一些实施方案中，所述CRISPR核酸酶变体还可以包括碱基编辑器(base editor)。碱基编辑器通常是包含脱氨酶和缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶变体的融合蛋白。
如本发明所用，“缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶变体”包括但不限于Cas9切口核酸酶(nCas9)、核酸酶死亡的Cas9核酸酶(dCas9)或核酸酶死亡的Cpf1核酸酶(dCpf1)。核酸酶死亡的Cas9核酸酶(dCas9)或核酸酶死亡的Cpf1核酸酶(dCpf1)完全缺失DNA切割活性。本领域已知多种缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶变体。
如本发明所用，“脱氨酶”是指催化脱氨基反应的酶。在本发明一些实施方式中，所述脱氨酶指的是胞嘧啶脱氨酶，其能够接受单链DNA作为底物并能够催化胞苷或脱氧胞苷分别脱氨化为尿嘧啶或脱氧尿嘧啶。在本发明一些实施方式中，所述脱氨酶指的是腺嘌呤脱氨酶，其能够接受单链DNA作为底物并能够催化腺苷或脱氧腺苷(A)形成肌苷(I)。本领域已知多种合适的接受单链DNA作为底物的胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。 合适的胞嘧啶脱氨酶包括但不限于例如APOBEC1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、APOBEC3G、CDA1、人APOBEC3A脱氨酶。在一些优选实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶为人APOBEC3A。合适的腺嘌呤脱氨酶的实例包括但不限于Nicloe M.Gaudelli等人(doi：10.1038/nature24644，2017)所公开的DNA依赖型腺嘌呤脱氨酶。
通过使用缺失DNA切割活性的CRISPR核酸酶变体与脱氨酶融合(形成所谓的“碱基编辑器”)，可以实现靶核苷酸序列中的碱基编辑，例如C至T的转换或A至G的转换。本领域已知多种碱基编辑器，且本领域技术人员知晓如何选择合适的碱基编辑器以实现本发明的目的。基于碱基编辑器的CRISPR基因编辑系统也称作碱基编辑系统。
在本发明一些优选实施方案中，所述CRISPR系统是碱基编辑系统。优选地，所述碱基编辑系统包含具有SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的碱基编辑器。
如本文所用，“向导RNA”和“gRNA”可互换使用，指的是能够与CRISPR核酸酶或其变体形成复合物并由于与靶序列具有一定相同性而能够将所述复合物靶向靶序列的RNA分子。例如，Cas9核酸酶或其变体所采用的gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够相同性以便与该靶序列的互补链杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的引导序列。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。而Cpf1核酸酶或其变体所采用的gRNA通常仅由成熟crRNA分子构成，其也可称为sgRNA。基于所使用的CRISPR核酸酶或其变体和待编辑的靶序列设计合适的gRNA属于本领域技术人员的能力范围内。
在本发明的一些具体实施方式中，所述向导RNA是sgRNA。例如，所述sgRNA包含SEQ ID NO:16所示的支架(scaffold)。
本发明中用于基因编辑的序列特异性核酸酶，例如锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR核酸酶或其变体等，还可以包含亚细胞定位信号(如核定位信号)、肽接头、可检测标签等元件。例如，CRISPR碱基编辑系统中的碱基编辑器通常包含一个或多个核定位信号(NLS)，以促进其进入细胞核，实现对染色体DNA的编辑。
本发明的表达构建体可以通过本领域已知的多种方法之一导入植物细胞，所述方法包括但不限于基因枪法、PEG介导的原生质体转化和土壤农杆菌介导的转化。
在本发明的一些实施方案中，本发明所述植物细胞是适合于通过组织培养而再生成完整植物的细胞。合适的植物细胞的实例包括但不限于原生质体细胞、愈伤组织细胞、未成熟胚细胞、和外植体细胞。
通过培养经转化的原生质体、愈伤组织、未成熟胚或外植体而再生处经转化的完整植物的方法是本领域已知。在所述再生过程中，还可以基于所导入的表达构建体上携带的选择性标志，对转化体进行筛选。在一些实施方案中，所述再生在不存在选择压力下进行。在一些实施方案中，可以用中等严格的筛选条件来筛选转化体。所述中等严格的条件指的是并不完全抑制非转化体的生长的条件。例如，中等严格的筛选条件不抑制转化体生长但部分抑制非转化体的生长。例如，在中等严格的筛选条件下，非转化体可以 生长但是比转化体生长要慢或弱。中等严格的筛选条件是本领域技术人员可以针对具体植物和具体选择性标志确定的。
在本发明的一些实施方案中，本发明的表达构建体瞬时转化至植物细胞。瞬时转化指的是将构建体引入细胞，使其发挥功能但是并不整合至细胞基因组。这对于基因编辑是特别有用的，因为可以产生非转基因的经修饰的植物。本发明的另一个令人惊奇的发现是，即使是瞬时表达WUS、BBM和SERK的组合或GRF和GIF的组合，其也能够促进植物的再生、转化和/或基因编辑效率。
适于用本发明的方法进行转化或基因编辑的植物可以单子叶植物或双子叶植物。例如，所述植物的实例包括但不限于小麦、草莓、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。
本发明的方法特别适合于在之前难转化的植物品种或基因型中进行遗传转化或基因编辑。在一些具体实施方案中，所述植物是小麦，例如所述小麦是济麦20、济麦22、京411、山农20、山农116、小堰54、周麦27、周麦28和中麦175。在一些具体实施方案中，所述植物是大豆，例如所述大豆是Williams 82、中黄13和合丰25。在一些具体实施方案中，所述植物是草莓，例如草莓Benihoppe。
为了在植物中获得有效表达，在本发明的一些实施方式中，所述编码核酸序列或感兴趣核酸序列针对其基因组待进行修饰的植物物种进行密码子优化。
密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year2000.Nucl.Acids Res.，28:292(2000)。
在一方面，本发明提供通过本发明的方法获得的植物及其后代。
实施例
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实施例1、发育调控因子WUS、SERK、LEC1、KN1、BBM对小麦遗传转化和基因编辑效率的提高
近期，利用植物细胞的全能型，通过在体细胞中特定DR(developmental regulators，如WUS、STM、MP、BBM等)组合的异位表达具有诱导分生组织的潜力。将DR和基因编辑系统同时表达，可以很大程度上缩短植物的组织培养的过程而获得基因组编辑的植物个体。此外，有研究表明可以通过表达一些与分生组织细胞分裂有关的基因也可以是实现不经过组织培养的植物基因组编辑。开发新的对植物细胞特别是顶端分生组织细胞具有促进分裂和发育相关的基因，对特别是小麦这样的转化较为困难的植物来说具有重要的意义。
本实施例对可能促进植物细胞分裂和具有促进植物再生的一些候选基因进行筛选，这些候选基因包括WUS、BBM、SERK、KN1和LEC。
1.1.载体构建
选取玉米WUS、SERK、LEC、BBM、KN1进行测试。构建以下植物表达载体：
1.CRISPR/Cas9敲除载体：UBI-Cas9
2.单碱基编辑载体：UBI-A3A
3.sgRNA表达载体：TaU6-sgRNA
4.ZmWUS/BBM组合：nos-ZmWUS-ubi-ZmBBM
5.ZmWUS/BBM/SERK组合：nos-ZmWUS-ubi-ZmBBM-ZmSERK
6.ZmWUS/BBM/LEC1组合：nos-ZmWUS-ubi-ZmBBM-ZmLEC1
7.ZmWUS/KN1/LEC组合：nos-ZmWUS-ubi-ZmKN1-ZmLEC1
上述植物表达载体的结构如图1所示。其中载体4-7也称为促进(booster)载体。
1.2.2.利用基因枪转化小麦未成熟胚并分析转化和编辑效率
UBI-Cas9或UBI-A3A分别与TaU6-sgRNA和四个促进(booster)表达载体组合进行共转化。选取小麦ALS基因为编辑位点。利用已建立的小麦基因枪转化技术进行转化。经过组织培养再生获得植物，通过PCR/RE方法进行突变体的检测。UBI-A3A的结果如下表1所示。
表1.
Figure PCTCN2021081829-appb-000001
以上结果表明：相对于没有booster处理的对照UBI-A3A，nos-ZmWUS-ubi-ZmBBM-ZmSERK对碱基编辑系统UBI-A3A的效率具有显著的提高作用。
实施例2、植物生长控制因子GRF/gif提高小麦遗传转化和基因编辑效率
GRF转录因子是植物中特有的转录因子，主要调控植物细胞大小、参与叶绿体增殖、雌蕊发育、调控渗透胁迫等植物生长发育过程。GRF与GIF可形成转录共激活因子复合物。GIF与人类转录共激活因子滑膜肉瘤转运蛋白(synovial sarcoma translocation protein，SYT)同源。在植物中，GRF4和gif1细胞增殖中起作用，并维持分生细胞在花器官发育期间的增殖能力。本研究选取小麦GRF4和小麦gif进行研究，检测其是否对小麦的遗传转化和基因编辑具有提高作用。
2.1.载体构建
小麦GRF4和gif1用接头AAAA进行融合，用ZmUBI启动子驱动表达。此外，为何减少载体的数目，将GRF4-AAAA-gif1融合蛋白与Cas9或A3A-nCas9构建在同一植物表达载体，并用P2A进行分割表达。所构建的载体结构如图2所示。
2.2.利用基因枪转化小麦未成熟胚并分析转化和编辑效率
利用已建立的小麦基因枪转化技术体系对2.1中构建的促进(booster)载体与TaU6-sgRNA组合进行共转化，UBI-Cas9或UBI-A3A与TaU6-sgRNA组合共转化作为对照。选取小麦ALS基因为编辑位点。经过组织培养再生获得植物，通过PCR/RE方法进行突变体的检测。结果如下表所示。
表2.
Figure PCTCN2021081829-appb-000002
以上结果表明：相对于对照UBI-Cas9和UBI-A3A，加入小麦GRF4/gif1的UBI-GRF4-gif-Cas9和UBI-GRF4-gif1-A3A可以显著增加突变体的数目，提高大约3-12倍。说明植物的生长控制因子可以作为重要的调控蛋白，促进植物遗传转化和提高基因组编辑的效率。
实施例3、优化GRF4/gif1对小麦基因编辑效率的提高
为了更进一步提高对小麦基因组编辑的效率，对GRF4和gif1融合蛋白的接头(linker)进行优化，将linkerA(AAAA)替换为linkerS(SGGS)。此外，miR396/GRF调控模式在植物中的功能十分保守，miR396对GRF4具有下调作用。将GRF4的miR396结合位点进行突变，可以增加GRF4的表达，从而有可能会提高小麦基因组编辑的效率。构建了图3所示的促进(booster)载体。
将所述载体分别与前述实施例所述靶向小麦ALS基因的A3A碱基编辑系统组合通过基因枪进行转化小麦未成熟胚。通过检测获得下表所示结果。
表3.
Figure PCTCN2021081829-appb-000003
从以上结果可以看出，linkerA编辑效率高于LinkerS。最为重要的是GRF4的miR396 的结合位点的突变大幅度的增加小麦的再生效率，同时也大幅度的增加了突变效率。
实施例4、GRF4/gif1提高不同基因型小麦的编辑效率
为了研究GRF4/gif1是否可以提高对其他小麦品种的编辑效率，即打破小麦基因型对遗传转化的限制，选取几个用传统方法效率较低的品种进行测试。结果如下：
表4.
Figure PCTCN2021081829-appb-000004
结果表明，小麦的生长转录因子GFR4/gif1可以显著的实现对多个品种的编辑，打破了基因型的限制。
实施例5、GRF4/gif1对农杆菌介导的小麦转化效率和基因编辑效率的提高
为了进一步研究GRF4/gif1是否可以提高农杆菌介导的小麦转化效率和基因编辑的效率，将GRF4/gif1构建在农杆菌基因编辑载体上，通过农杆菌侵染小麦未成熟胚。其结果如下表所示。
表5.
Figure PCTCN2021081829-appb-000005
可以看到，GRF/gif可以显著提高农杆菌转化介导的编辑效率，使基因编辑的效率从零变为2.3％。
实施例6、GRF/gif对农杆菌介导的大豆再生效率和转化效率的提高
6.1.大豆GRF/gif载体构建
上述实施例的结果表明，植物生长因子GRF/gif组合可以提高单子叶植物小麦的组织培养的再生效率和基因编辑的效率。为研究是否GFR是否可以增加双子叶植物的组培植物再生效率，选取双子叶植物大豆的内源GRF基因进行研究，测试其是否提高大豆的植物再生效率。选取大豆的GFR5、GRF6、GRF11、GRF18为测试对象，并和大豆的gif1进行融合，中间用AAAA接头进行连接。此融合蛋白和Cas9用P2A相隔和连接，用35s启动子驱动表达，sgRNA用U6-26启动子启动，构建于同一载体。所构建的表达载体如图4所示。
6.2.2.大豆GRF/gif提高大豆愈伤组织再生效率
将以上构建的载体通过农杆菌进行转化大豆，其对大豆再生效率的结果如下表所示。
表6.
Figure PCTCN2021081829-appb-000006
RECO:表示大豆侵染后，恢复培养的阶段；SBA：表示大豆进入筛选阶段；EBA：表示大豆进入伸长阶段。ETC：表示大豆伸长培养阶段，不加筛选。
以上结果表明，大豆内源的GFR5结合gif1可以显著提高大豆愈伤再生苗的效率。此外，对再生植物的内源基因的基因编辑效率进行检测，显示其同样可以显著提高基因编辑效率。
实施例7.GmGRF5-GmGIF1促进大豆再生
在大豆基因组中预测的22个GRF基因中，选择了GmGRF5、GmGRF6、GmGRF11和GmGRF18(它们在花和茎顶端分生组织中特异性表达或优先表达(Chen等，2019))，分别与大豆GmGIF1(其在拟南芥和水稻中的同源基因在花中强烈表达并射击顶端分生组织，以控制植物的生长(Kim，2019))融合。每个GmGRF-GmGIF1融合蛋白与CRISPR/Cas9表达盒共表达，产生四个构建体(pGmGRF5-GmGIF1，pGmGRF6-GmGIF1，pGmGRF11-GmGIF1和pGmGRF18-GmGIF1)(图5A)，靶向两个拷贝的大豆脂肪酸去饱和酶2(GmFAD2)基因(图5B)。GmFAD2基因的产物催化油酸向亚油酸的转化并降低大 豆油品质(Haun等人，2014)。评估了GmGRF-GmGIF1复合体对GmFAD2的转化效率和编辑频率。
如图5C所示，通过农杆菌介导的转化将四种pGmGRF-GmGIF1构建体中的每一种转化至大豆栽培种Williams 82，这是大豆最流行的可转化基因型之一(Jia等，2015)。使用含有靶向GmFAD2的CRISPR/Cas9表达盒但不含GmGRF-GmGIF1复合物的构建体pBSE401(Xing等，2014)作为对照(图5A)。引入四个含GmGRF-GmGIF1的构建体后，回收的外植体数量与使用pBSE401获得的外植体数量相似(表7和8)。然而，经过草铵膦选择(5mg/L，该筛选条件是中度严格的，允许转基因的和未转化的外植体伸长)进行两周的芽诱导和两周的芽增殖后，用pGmGRF5-GmGIF1转化的外植体产生了大量芽：每次转化事件中有93.8％的外植体产生了多个芽；相比而言，对照中为58.4％，而在感染了其他GmGRF-GIF1构建体的外植体中具有相似比例(图5D，表7和8)。在草铵膦中等严格选择的伸长培养基上，pGmGRF5-GmGIF1的平均伸长芽(≥2cm)的数量(432.3)相对于对照增加了2.8倍(156.0)，相对于其他构建体增加了2.5倍以上(图5E和图5G，表7和8)。同样，pGmGRF5-GmGIF1的伸长大芽(≥9cm)的平均数量(85.3)比pBSE401(33.7)大2.5倍(图5E和图5H，表7和8)。还发现，用pGmGRF5-GmGIF1转化的外植体与对照(1.1)相比，每个外植体产生的推定草铵膦抗性芽(3.0)明显多(图5F、图5G和图5H，表7和8)。另外，pGmGRF5-GmGIF1从初始转化到第一个伸长的芽达到9cm的时间为58天，而对照为70天(表7和8)。在感染了pBSE401的外植体和其他三种GmGRF-GmGIF1复合体之间，从初始转化到最初的9cm芽之间，芽诱导、芽伸长和时间没有显着差异(表7和8)。总体而言，这些数据表明，GmGRF5-GmGIF1复合物刺激了大豆外植体的再生。
实施例8.GmGRF5-GmGIF1复合物增强大豆的基因组编辑
有效的再生是成功进行植物遗传转化和基因组编辑的前提。与上述再生频率一致，使用pGmGRF5-GmGIF1时外植体的转化效率(TE)为21.8％，明显高于pBSE401的8.5％，而其他复合物的总转化率均不超过10.2％(图5I，表7和8)。使用PCR-RE分析和Sanger测序来检测再生系中GmFAD2的突变。再次，与TE一致，用pGmGRF5-GmGIF1转化的外植体比用pBSE401转化的外植体包含更多的编辑和明显更高的突变频率(MF)(图5J，表7和8)。另外，大量的转化子在FAD2-1A和FAD2-1B中均具有突变，表明这两个基因均被有效地突变(图10，表9)。有趣的是，在用pGmGRF5-GmGIF1转化的94个突变体中，有15个(16.0％)是非转基因的(图10，表7和8)。
为了查看GmGRF-GmGIF1复合物的组成型表达是否引起表型异常，在温室中种植了用pGmGRF5-GmGIF1和pBSE401转化的GmFAD2编辑的Williams 82植物。在整个生长期中，用pGmGRF5-GmGIF1转化的Williams 82植株可育，两组品系之间未观察到形态学差异(图5K)，这表明GmGRF5-GmGIF1极大地刺激了大豆的基因组编辑，而没有产生不良的副作用效果。
实施例9.GmGRF5-GmGIF1复合物可对难转化的大豆品种进行基因组编辑
因为在四个GmGRF-GmGIF1复合物中，pGmGRF5-GmGIF1构建体产生了最高的再生、遗传转化和突变率，所以它被用于提高两个难转化但具有商业意义的大豆品种的转化和基因组编辑效率的尝试：中黄13和合丰25。将GmGRF5-GmGIF1复合物通过农杆菌介导的转化与靶向GmFAD2的CRISPR/Cas9表达盒结合，以pBSE401为对照，转化至中黄13和合丰25。在中黄13中，GmGRF5-GmGIF1显著提高了再生频率(84.0％)，伸长的可能的草铵膦抗性芽(312.6，长度≥2cm)和每个外植体的伸长的可能的草铵膦抗性芽(2.6)及更高的TE(18.2％)和MF(16.0％)，相比而言，pBSE401分别为65.6％，233.0、1.7、5.3％和2.4％(图6A、6B、6E和6G，表7和8)。在合丰25中，约71.1％的用pGmGRF5-GmGIF1转化的外植体产生了至少一个≥2cm的伸长芽，而用pBSE401转化的外植体均未产生芽(图2A、2C-2E，表7和8)。用pGmGRF5-GmGIF1转化的外植体的转化效率为2.5％，五株转基因植物在GmFAD2目标位点具有突变(图6F和6G，表7和4)。还确定了一个无转基因的编辑事件(表7和8)。显然，GmGRF5-GmGIF1复合物极大地刺激了再生，因此可在可少量转化的大豆品种中进行遗传转化和基因组编辑。同样，由于CRISPR DNA的瞬时表达、booster基因的表达刺激了更广泛的细胞增殖，以及选择压力相对较低，GmGRF5-GmGIF1复合物能够产生非转基因的突变体。
实施例10.大豆GmGRF5-GmGIF1复合物促进草莓的再生和基因组编辑
另一双子叶植物草莓(Fragaria ananassa)的再生是基因型依赖性的。最广泛栽培的八倍体草莓品种之一贝尼霍普(Benihoppe)的转化非常困难，并且尚未在该品种中获得基因组编辑事件(Folta和Dhingra，2006)。
使用大豆GmGRF5-GmGIF1复合体检查了Benihoppe的再生和基因组编辑，因为草莓GRF蛋白接近大豆GRF(图11A)。融合蛋白与Cas9在载体pHUE411-GFP-GmGRF5-GmGIF1的单个表达盒中共表达(图7A)。果胶裂解酶基因FaPL导致草莓果实硬度的丧失(Jimenez-Bermudez等，2002)，其被Cas9靶向(图11B)，绿色荧光蛋白(GFP)被用作可视报告基因，允许连续监测转基因事件。对照载体(pHUE411-GFP)包含Cas9，靶向FaPL的sgRNA和GFP基因。总共541和540个草莓叶片外植体分别被含有pHUE411-GFP-GmGRF5-GmGIF1和对照载体的农杆菌感染(图7B)。感染三周后，对在愈伤组织诱导培养基上诱导的叶片外植体的愈伤组织筛选GFP表达。用GmGRF5-GmGIF1转化的外植体中有19.6％(106/541)产生了至少一个GFP阳性愈伤组织，而对照中则为6.5％(35/540)(图7B)。此外，用GmGRF5-GmGIF1转化的叶片外植体倾向于形成多个且具有强GFP荧光的大愈伤组织，而在对照的愈伤组织块上仅观察到一些小的GFP阳性斑点(图7C)。在芽诱导培养基上生长期间，用GmGRF5-GmGIF1转化的外植体上的愈伤组织生长比对照上的更为强劲(图7D)，并且在感染后5周内，受GmGRF5-GmGIF1感染的外植体中有8.1％的前愈伤组织发生了芽萌 发。相比之下，对照仅为3.0％(图7D)。用GmGRF5-GmGIF1转化的外植体的转化效率为0.9％，在0.6％的外植体中检测到FaPL目标位点的突变(图7B，图11C)，而在对照中既未检测到转基因植物，也未检测到突变植物(图7B)。这些数据表明，GmGRF5-GmGIF1复合物可以促进难转化草莓品种的再生、遗传转化和基因组编辑，表明GmGRF5-GmGIF1刺激了其他双子叶植物的遗传转化和基因组编辑。
实施例11.野生型TaGRF4-TaGIF1和突变的TaGRF4-TaGIF1对普通小麦再生和基因组编辑影响的比较
为了扩大GRF-GIF1复合物的应用，研究了它们在单子叶植物普通小麦中的作用，在该小麦中，转化仅限于有限的基因型(He等，2015；Jones等，2005)。系统进化树分析表明，包括GmGRF5在内的大豆GRF家族与水稻单子叶植物GRF家族有着密切的联系(Chen等人，2019)。先前的工作还表明，OsGRF4及其共激活因子OsGIF1的过表达会刺激水稻的细胞增殖和种子大小(Sun等人，2016；Hu等人，2015)。因此，测试了同源物TaGRF4和TaGIF1在普通小麦中的作用(图12)，同时添加了两种修饰。
首先，将TaGRF4与TaGRF1融合形成TaGRF4-TaGIF1复合体，并通过五个点突变(mTaGRF4-TaGIF1)灭活TaGRF4中的miR396目标位点，以增加TaGRF4的转录(图8A和8B)。其次，使用瞬时表达策略(Liang等人，2017；Zhang等人，2016；Zhang等人，2018)避免了整个组织培养过程中的任何选择压力，用于产生T0代无转基因突变体(图8C)。将野生型复合物TaGRF4-TaGIF1和突变体复合物mTaGRF4-TaGIF1以及含有sgRNA的胞嘧啶碱基编辑器pUBI-A3A载体分别转化进可高效转化的普通小麦品种Bobwhite和Kenong 199(图8B和8C)。sgRNA靶向常见的小麦乙酰乳酸合酶基因(TaALS)(图13)，其Pro197处的C-T转换赋予了对烟嘧磺隆的抗性(Zhang等人，2019；Zong等人，2018)。pUBI-A3A和pUBI-GFP的组合用作对照。在非选择性培养基上培养六周后，分析了再生植物的数量和TaALS突变。
结果发现，用TaGRF4-TaGIF1转化的Bobwhite和Kenong 199的未成熟胚(分别为508.0％和654.5％)比对照组(分别为81.0％和136.9％)产生更多的再生植物(图8D，表11)。此外，mTaGRF4-TaGIF1的再生率更高，对Bobwhite和Kenong 199分别为630.1％和1165.4％，比野生型TaGRF4-TaGIF1复合体的再生频率分别高1.2和1.7倍，比对照构建体高7.8和8.5倍(图8D，表11和12)。
还使用PCR-RE分析和Sanger测序检查了TaALS目标位点的基因组编辑。与再生率一致，用TaGRF4-TaGIF1复合物转化的Bobwhite和Kenong 199植物的突变频率(分别为32.7％和103.4％)要高于用对照构建体转化的植物(分别为9.9％和17.7％)(图8E和8D，表11和12)。在由mTaGRF4-TaGIF1复合体产生的植物中，分别在Bobwhite的343个胚中鉴定了216个突变体(63.3％)，在Kenong 199的328个胚中鉴定了577个突变体(176.1％)，比TaGRF4-TaGIF1复合物高1.7-1.9倍，比对照组高6.4-9.9倍(图8E，表11和12)。
由于质粒是使用瞬时表达方法递送的(图8C)，所以TaGRF4-TaGIF1和碱基编辑器DNA构建体似乎尚未整合到突变植物的基因组中的可能性很高。为了测试再生的T0突变体中质粒DNA的存在，使用了总共6个引物对(3个用于pUBI-A3A，三个用于pTaGRF4-TaGIF1或pmTaGRF-TaGIF1)来扩增TaGRF4-TaGIF1和碱基编辑器结构的不同区域，几乎涵盖了整个结构(图8F)。根据PCR分析，用TaGRF4-TaGIF1，mTaGRF4-TaGIF1和对照处理的Bobwhite和Kenong 199突变体的47.1％-55.4％缺少两个载体结构(pUBI-A3A和pTaGRF4-TaGIF1/pmTaGRF4-TaGIF1)(图8G，表11和12)。mTaGRF4-TaGIF1处理组的无转基因突变体总数比对照组高6.0-11.6倍(表11和12)。此外，当在温室中生长来自mTaGRF4-TaGIF1的Kenong 199的无转基因突变体时，发现它们可育，并且在整个发育过程中与WT植物没有明显的表型差异(图8H)。
总之，TaGRF4-TaGIF1复合物提高了普通小麦的再生频率和基因组编辑效率，miR396目标位点的破坏进一步提高了其效率。此外，mTaGRF4-TaGIF1的瞬时表达对表型没有不良影响。
实施例12.突变的TaGRF4-TaGIF1复合物扩展了普通小麦品种的基因组编辑
测试了mTaGRF4-TaGIF1复合物是否提高在中国广泛种植的各种普通小麦品种的再生率和基因组编辑效率。根据图8C中的方法，将含有TaALS sgRNA的pUBI-A3A载体与mTaGRF4-TaGIF1一起递送至9个中国主要普通小麦品种的济麦20、济麦22、京411、山农20、山农116、小烟54、周麦27、周麦28和中麦175的未成熟胚中。pUBI-A3A和pUBI-GFP的组合用作对照。
在非选择性培养基上培养六周后，发现mTaGRF4-TaGIF1刺激了这些普通小麦品种的再生，并且再生频率在9.9％-440.8％之间，显著高于相应的对照(0％-187.3％)(图9A和9B，表13和14)。特别是，mTaGRF4-TaGIF1激发了小燕54、周麦28、济麦20，济麦22和山农20的再生和基因组编辑，这些品种的再生和基因组编辑通常非常困难(图9A和9B，表13)。通过PCR-RE分析和Sanger测序，在这9个用mTaGRF4-TaGIF1转化的普通小麦品种中，检测了TaALS位点的突变，突变频率范围为1.2-8.1％。而对照组突变频率为为0-3.9％，其中五个品种不含突变体(图9C，表14)。此外，在用mTaGRF4-TaGIF1转化的9个品种中，纯合突变频率(HMF)为10.0-55.6％，远高于对照(0-15.4％)(表13和15)。还在用mTaGRF4-TaGIF1复合物转化的9个品种中鉴定到22.2-66.7％的无转基因突变体(表13)。相反，仅在用对照质粒转化的山农116、周麦27号和中麦175号中发现无转基因的突变体(表13)。因此，mTaGRF4-TaGIF1复合物刺激了所有9个普通小麦品种的再生和基因组编辑。
大豆是最重要的食用油和蛋白质来源之一，但尽管有许多可用的遗传转化方法，其转化率仍然很低(Christou，1992；Trick和Finer，1998；Yang等，2016)。因此，迫切需要开发改良的大豆转化系统。植物GRF和GIF基因在包括叶和花器官原基和芽顶端 分生组织在内的分生组织中高度表达(Kim，2019；Omidbakhshfard等，2015；Zhang等，2018)，并有可能被开发为刺激植物再生的促进剂，从而提高遗传转化和基因组编辑率。本发明人在Williams 82中筛选并测试了四种GmGRF-GmGIF1复合物，发现使用GmGRF5-GmGIF1复合物的转化率为21.8％(图5I，表7)，这比传统转化方法获得的转化率要高得多(Finer和McMullen，1991；Hinchee等，1988)。应该注意的是，GmGRF5在GeneBbank(XM_003526701.4)中被称为GmGRF7，因为它与拟南芥AtGRF7最相似。
基因型限制取决于供体基因型对农杆菌感染的易感性和外植体的再生能力(Jia等人，2015)。幸运的是，GmGRF5-GmGIF1复合物提高了中黄13(18.2％)和合丰25(2.5％)的转化效率，中黄13是中国种植最广泛的品种，但很难用当前的方法进行遗传工程改造。这表明GmGRF5-GmGIF1复合物可以克服大豆转化中基因型依赖性的瓶颈。GmGRF5-GmGIF1增强了无转基因FAD2编辑事件的产生，这归因于大量再生芽以及使用适度的严格选择促进了再生芽以及转基因植物的伸长。大豆生长调节因子5(GmGRF5)及其辅因子大豆GIF1复合物在多种双子叶植物中增强再生、转化和基因组编辑的能力进一步证实了GmGRF5-GmGIF1复合物对芽再生的刺激以及由此产生的大豆和草莓的转化和基因组编辑效率的改善。
考虑到它们在所有陆地植物中的分布极为广泛，并在分生组织中优先表达(Kim，2019；Omidbakhshfard等人，2015；Shimano等人，2018)，天然GRF-GIF1复合物可以有效地促进大多数植物的再生。单子叶植物普通小麦的再生仍然是基因型依赖性的(He等，2015；Jones等，2005)，但本发明人证明了小麦mTaGRF4-TaGIF1的瞬时表达显著改善了再生和基因组编辑，并且大大增加了9个中国商业优良品种的无转基因的突变体，其中大多数品种以前从未进行过再生和基因编辑。因此，改良的TaGRF4-TaGIF1复合物(mTaGRF4-TaGIF1)克服了普通小麦再生的基因型限制，并增强了其基因组编辑。
理想的促进剂(booster)不应影响再生植物的形态。在目前的工作中，即使在组成型表达GmGRF5-GmGIF1复合物时，转基因大豆植株也未观察到形态学变化，这可能是由于其表达水平适中，在转录后水平受到调节(Kim和Tsukaya，2015；Liu等，2009；Rodriguez等，2010)。在普通小麦中，发现mTaGRF4-TaGIF1复合物在提高再生能力和基因组编辑频率方面比原始TaGRF4-TaGIF1复合物表现更好。尽管miR396不抑制mTaGRF4-TaGIF1，但瞬时表达系统阻止了该复合物在植物细胞中的长时间存在。这不仅使形态学副作用最小化，而且产生了大量无转基因的突变体。
总之，GmGRF5-GmGIF1复合物增强了双子叶大豆和草莓的再生，因此刺激了遗传转化和基因组编辑。同样，瞬时表达的含有失活的miR396目标位点的改良TaGRF4-TaGIF1复合物可刺激单子叶普通小麦的再生和基因组编辑。此外，GRF-GIF1复合物是不依赖于基因型，因为它们在各种大豆和普通小麦品种中都能很好地发挥作用。鉴于GRF基因家族的成员存在于许多植物物种中，本文所述的GRF-GIF1复合物具有改善多种农作物中基因组编辑效率的巨大前景。
表7.GmGRF-GmGIF1融合对大豆转化和基因组编辑效率的影响。
Figure PCTCN2021081829-appb-000007
RF(regeneration frequency)＝no.of explants with multiple buds/total explant number×100％.Growth rates were measured from the date of the initial transformation to the date when the first elongated shoot reached 9 cm in length.TE(transformation efficiency)＝no.of transgenic plants/total explants×100％.Elongated shoots(≥9cm in length)were collected for transgenic assay only once on day 75 after Agrobacterium-mediated transformation.MF(mutation frequency)＝no.of mutants/total transgenic plants×100％.TFF(transgene-free frequency)＝no.of transgene-free mutants/total mutants×100％.The numbers and means for each treatment were calculated from data collected from three replicates of the experiment.Data are mean±SD(n＝3). a,b,c indicate significant differences compared with the CK group(two-sided Student’s t-test. a indicates P<0.05； b indicates P<0.01； c indicates P<0.001).
表8.GmGRF-GmGIF1融合对大豆转化和基因组编辑效率的影响(Williams 82、合丰25和中黄13，原始数据)。
Figure PCTCN2021081829-appb-000008
RF(regeneration frequency)＝no.of explants with multiple buds/total explant number×100％.Growth rates were measured from the date of the initial transformation to the date when the first elongated shoot reached 9 cm in length.TE(transformation efficiency)＝no.of transgenic plants/total explants×100％.Elongated shoots(≥9cm in length)were collected for transgenic assay only once on day 75 after Agrobacterium-mediated transformation.MF(mutation frequency)＝no.of mutants/total transgenic plants×100％.TFF(transgene-free frequency)＝no.of transgene-free mutants/total mutants×100％.
表9.使用PCR-RE分析对从分别用pGmGRF5-GmGIF1、pGmGRF6-GmGIF1、pGmGRF11-GmGIF1、pGmGRF18-GmGIF1和pBSE401转化的Williams 82外植体再生的突变体进行突变鉴定。
Figure PCTCN2021081829-appb-000009
Figure PCTCN2021081829-appb-000010
Aa/aa and Bb/bb represent heterozygous/homozygous mutations in FAD2-1A and FAD2-1B, respectively.
表10.使用PCR-RE分析对从由pGmGRF5-GmGIF和pBSE401转化的外植体(中黄13和合丰25)再生的突变体进行突变鉴定。
Figure PCTCN2021081829-appb-000011
Aa/aa and Bb/bb represent heterozygous/homozygous mutations in FAD2-1A and FAD2-1B,respectively.
表11.TaGRF4-TaGIF1和mTaGRF4-TaGIF1复合物对普通小麦品种Bobwhite和Kenong 199的再生和基因组编辑效率的影响。
Figure PCTCN2021081829-appb-000012
RF(regeneration frequency)＝no.of regenerated plants/total immature embryos×100％.MF(mutation frequency)＝no.of mutants/total immature embryos×100％.The numbers and means for each treatment were calculated from data collected from three replicates of the experiment.Data are means±s.e.m(n＝3).
表12.TaGRF4-TaGIF1和mTaGRF4-TaGIF1复合物对普通小麦品种Bobwhite和Kenong 199的再生和基因组编辑效率的影响(原始数据)。
Figure PCTCN2021081829-appb-000013
RF(regeneration frequency)＝no.of regenerated plants/total immature embryos×100％.MF(mutation frequency)＝no.of mutants/total immature embryos×100％.
表13.mTaGRF4-TaGIF1对9个优良普通小麦品种再生和基因组编辑效率的影响。
Figure PCTCN2021081829-appb-000014
RF(regeneration frequency)＝no.of regenerated plants/total embryos×100％.MF(mutation frequency)＝no.of mutants/total immature embryos×100％.HMF(homozygous mutant frequency)＝no.of homozygous mutants/total mutants×100％.TFF(transgene-free frequency)＝no.of transgene-free mutants/total mutants×100％.The numbers and means for each treatment were calculated from data collected from three replicates of the experiment.Data are means±s.e.m(n＝3).
表14突变的普通小麦TaGRF4-TaGIF1的表达对9个优良普通小麦品种的再生和基因组编辑效率的影响(原始数据)。
Figure PCTCN2021081829-appb-000015
RF(regeneration frequency)＝no.of regenerated plants/total immature embryos×100％.
表15.从分别用mTaGRF4-TaGIF1和UBI-GFP(CK)处理的9个优良普通小麦品种的未成熟胚中再生出T0 taals突变体的基因型。
Figure PCTCN2021081829-appb-000016
Figure PCTCN2021081829-appb-000017
Figure PCTCN2021081829-appb-000018
Aa/aa, Bb/bb, and Dd/dd represent heterozygous/homozygous mutations in TaALS-1A, TaALS-1B, and TaALS-1D, respectively.
Figure PCTCN2021081829-appb-000019
Figure PCTCN2021081829-appb-000020
Figure PCTCN2021081829-appb-000021
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Figure PCTCN2021081829-appb-000024
Figure PCTCN2021081829-appb-000025
Figure PCTCN2021081829-appb-000026
Figure PCTCN2021081829-appb-000027
Figure PCTCN2021081829-appb-000028

Claims (23)

  1. 一种提高植物细胞再生效率的方法，所述方法包括：
    (a)向所述植物细胞导入
    i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体；和/或
    ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，
    (b)从所述植物细胞再生完整植物。
  2. 一种将至少一种外源感兴趣核酸序列转化进植物中的方法，所述方法包括：
    (a)向所述植物的细胞导入
    i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体；和/或
    ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，
    (b)向所述植物细胞导入至少一个包含至少一种外源感兴趣核酸序列的表达构建体；
    (c)从所述植物细胞再生完整植物。
  3. 一种在植物中进行基因编辑的方法，所述方法包括：
    (a)向所述植物的细胞导入
    i)包含WUS的编码核酸序列的表达构建体、包含BBM的编码核酸序列的表达构建体和包含SERK的编码核酸序列的表达构建体；和/或
    ii)包含GRF的编码核酸序列的表达构建体和包含GIF的编码核酸序列的表达构建体，
    (b)向所述植物细胞导入至少一个包含至少一种外源感兴趣核酸序列的表达构建体，其中所述至少一种外源感兴趣核酸序列编码基因编辑系统的组分；或，向所述植物细胞导入基因编辑系统的至少一个组分；
    (c)从所述植物细胞再生完整植物。
  4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述WUS的编码核酸序列、BBM的编码核酸序列和SERK的编码核酸序列置于同一表达构建体。
  5. 权利要求4的方法，其中所述WUS的编码核酸序列、BBM的编码核酸序列、SERK的编码核酸序列和所述至少一种外源感兴趣核酸序列置于同一表达构建体。
  6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中所述WUS是玉米WUS，所述BBM是玉米BBM，或所述SERK是玉米SERK；例如，所述WUS包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，所述BBM包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或所述SERK包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
  7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述GRF的编码核酸序列和GIF的编码核酸序列置于同一表达构建体。
  8. 权利要求7的方法，其中所述GRF的编码核酸序列、GIF的编码核酸序列和所述至少一种外源感兴趣核酸序列置于同一表达构建体。
  9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述GRF包含突变体miRNA结合位点，从而不受所述miRNA的调控，例如，所述miRNA是miR396。
  10. 权利要求1-9中任一项的方法，其中所述GRF衍生自小麦GRF，例如小麦GRF4。
  11. 权利要求10的方法，其中所述GRF包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
  12. 权利要求1-11中任一项的方法，其中所述GIF衍生自小麦GIF，例如小麦GIF1。
  13. 权利要求12的方法，其中所述小麦GIF1包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。
  14. 权利要求1-9中任一项的方法，其中所述GRF衍生自大豆GRF，例如大豆GRF5、大豆GRF11或大豆GRF11。
  15. 权利要求14的方法，其中所述GRF包含SEQ ID NO:7-10之一的氨基酸序列。
  16. 权利要求1-9和14-15中任一项的方法，其中所述GIF衍生自大豆GIF，例如大豆GIF1。
  17. 权利要求16的方法，其中所述大豆GIF1包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列。
  18. 权利要求1-17中任一项的方法，其中所述GRF通过接头融合至所述GIF，例如，融合至所述GIF的N端，优选地所述接头是SEQ ID NO:12所示的接头。
  19. 权利要求3-18中任一项的方法，其中所述基因编辑系统选自CRISPR系统、TALEN、大范围核酸酶和锌指核酸酶。
  20. 权利要求19的方法，其中所述基因编辑系统是CRISPR系统，例如是碱基编辑系统，优选地包含SEQ ID NO:14所示的碱基编辑器。
  21. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述细胞选自原生质体细胞、愈伤组织细胞、未成熟胚的细胞、和外植体细胞。
  22. 权利要求1-21中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
  23. 权利要求22的方法，其中所述植物选自小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。
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