CN102776214A - 一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法及应用，编码基因cDNA序列起始密码子位于19bp处，终止密码子位于1888bp处，共编码622个氨基酸。以火鹤成熟植株刚展开幼嫩叶片为外植体，通过启动培养、继代培养、发育培养三个阶段的培养从间接体胚发生途径成功获得再生小植株；外植体诱导愈伤组织周期较短，植株成活率高、繁殖速度快、遗传性稳定、不易发生细胞变异；分离并克隆火鹤SERK基因cDNA全长序列，并从转录水平对不同培养阶段的各个时期SERK基因的表达量进行分析，加深对火鹤体胚发生机制的理解，揭示了调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA及其构建方法，为SERK基因在体细胞胚性转化中的作用提供很高的参考价值。

Description

一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及植物体细胞胚胎发生，尤其是一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法及应用。

背景技术

火鹤(Anthurium andraeanum)又名红掌、安祖花，为天南星科(Araceae)花烛属(Anthurium)植物，原产南美洲热带雨林中。其花型独特，佛焰苞明艳华丽，色彩丰富，花期长，叶形别致，观叶观花俱佳，是现在居室不可多得的装饰珍品，世界花卉贸易中，红掌是仅次于热带兰的第二大热带花卉。我国在20世纪70年代引入栽培，目前已成为市场中名贵的切花品种。

火鹤常用分株繁殖，速度很慢，偶尔也用扦插等方法进行繁殖，但成活率很低，而用播种繁殖必须经过人工授粉才能获得种子，耗费人力，而且种子繁殖有较大变异，所以用常规方法难以扩大生产。目前，花烛组培快繁主要是通过器官发生途径：由不同外植体诱导形成愈伤组织，然后由愈伤组织诱导不定芽再生，进行继代增殖。通过器官发生途径获得再生植株并进行快速繁殖已成为一种较有效的繁殖方式，但仍存在外植体诱导愈伤组织周期较长，、无菌苗长期连续增殖极易发生退化和变异、接种工序中切割材料较耗人工等缺点。而通过体细胞胚胎发生途径再生植株在繁殖率、遗传稳定性等方面均具有许多优势，例如：继代培养中节省了人工切割材料的时间、一次性产生的体胚数量多，繁殖速度明显比器官发生途径快，遗传性稳定、不易发生体细胞变异，还可以用于遗传改良等。

Geie T.在1982年最先报道了通过培养花烛属火鹤的肉穗花序获得胚状体，但胚状体未能发育成苗。1992年Kuehnle A.R.等首次从花烛的叶片诱导出体细胞胚，他们用4种花烛杂交种幼苗的叶片在暗中培养一个月发现有半透明的胚胎发生。1997年Musa等研究发现，花烛属植物火鹤也存在体细胞胚胎发生途径。2002年，MBalachandran等在第26届国际园艺学会会议上报道了花烛品种‘DragonTongue’等不同外植体诱导体细胞胚获得成功，并用于遗传转化研究。2004年Duong Tan Nhut等通过实验获得花烛品种‘Tropical’的体细胞胚，并进行了人工种子萌发条件的研究。2006年Sompong Te-chato等研究了品种、培养基、外植体类型和刻伤对安祖花属植物器官再生和体细胞胚再生的影响。2008年Nydia del Rivero-Bautista等研究了花烛属植物试管苗叶片通过间接途径诱导胚性愈伤、体细胞胚的分化和萌发的最适激素浓度。

国内的研究则是从2006年才开始的，辛伟杰等以花烛盆花品种无菌苗叶片、叶柄、根段为外植体，对花烛体细胞胚胎发生及植株再生进行了研究，建立了花烛体细胞胚胎发生体系，并研究了相关的生理生化特征。2010年，许传营等以花烛品种Amigo为材料，研究了悬浮培养条件下花烛体细胞胚胎发生过程中相关生理生化特征。他还研究了花烛体细胞胚胎发生过程各阶段蛋白质组成变化，发现胚性愈伤组织阶段比体细胞胚胎形成阶段蛋白表达量高且多出3条特异蛋白质谱带。同年，刘雪莲等以火鹤亚利桑娜幼嫩叶片为外植体，筛选出了最优的愈伤诱导培养基和胚状体诱导及成苗培养基。

大量研究表明，体胚中绝大部分基因，如BBM（BABYBOOM）、WUS（WUSChEL）、LEC2（LEAFYCOTYLEDON2）和AGL15（AGAMOUS-Like15)等基因（Schmidt et al.，1997；Thomas，1993）具有提高体胚发生率或维持体胚发生的作用，但它们是在体胚发生后才起作用的，并不是在体细胞从营养生长向胚性生长的转化中起作用，而唯一例外的是SERK基因。

SERK（Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase）基因广泛地存在于单子叶和双子叶植物中，在不同的植物中存在着特定的表达方式。已经报道的除少数SERK基因的表达在体细胞胚内检测不到外，其他已经报导功能的SERK基因一般都参与了体细胞胚的发生，这表明SERK基因的表达与体细胞胚的发生密切相关。另外，有些研究表明SERK基因不仅参与促进体细胞胚的发生，还标志着体细胞从营养生长向胚性生长转变，预示着SERK基因可能会被发展成为体细胞胚发生的标记基因。分离并克隆火鹤体胚SERK基因cDNA全长序列，并从转录水平对不同培养阶段的各个时期SERK基因的表达量进行分析，是阐明SERK基因调控火鹤体细胞胚胎发生机制的重要步骤；缩短外植体诱导愈伤组织周期、减少接种工序中切割材料的人工耗费、高通量快繁火鹤种苗、提供遗传性稳定且不易发生体细胞变异的植株、提供高生活力种苗是繁育火鹤必须要解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种繁殖速度快、遗传稳定的调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA及其构建方法。

为实现上述目的，本发明一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因，该编码基因cDNA序列为:

AGGTGGTGAG GGGAGAAGAT GGCGCCGGCG GCGGCGCCGT GGCTGCTCTG CATGATCGTG    60

CTGCTCCATC CGATCGCGAG GATTCTCGCC AACGTGGAAG GTGATGCTTT GAATAGTCTA    120

AAAACTAATT TACATGATCC TAGTAATGTT CTTCAGAGTT GGGATCCAAC CCTTGTGAAT    180

CCATGCACTT GGTTCCATGT AACGTGCAAC AATGACAATA ATGTTATAAG AGTTGACCTT    240

GGAAATGCAG CATTATCTGG TTCTTTGGTC CCACAGCTTG GTCTGCTCAA AAGTTTGCAA    300

TACCTGGAAC TTTATAGCAA CAATATAAGT GGGGAAATTC CTATTGAACT TGGGAATTTG    360

TCAAGCTTGG TGAGCTTGGA TCTCTATTTG AACAAGTTCA CTGGCCCAAT TCCTGGCACC    420

CTGGAAAAGC TGGCAAAGCT GCGTTTCCTC CGGCTCAACA ACAACAGCTT GTCGGGACCA    480

ATTCCCATGT CTCTAACCAA CATTACTACA CTGCAAGTTC TGGATCTGTC TAACAACGGC    540

TTATCAGGAG TAGTTCCATC AAATGGTTCC TTTTCGCTAT TCACCCCAAT CAGTTTTAGT    600

AACAATCCTT TATTATGTGG CCCGGGTGCA GCCAAGCCTT GTCCTGGATC TCCTCCATTT    660

TCTCCACCAC CACTTGTTCC ACAGGCTACA GTCCCCTCTC CAGGAAGTAG TGCCTCCAGC    720

ACAGGTGCAA TTGCCGGTGG AGTGGCTGCA GGTGCTGCTT TGCTTTTTGC TGCACCTGCA    780

ATCGGGTTTG CATGGTGGCG GCGACGGAAA CCACAAGAAA ATTTCTTTGA TGTACCTGCT    840

GAAGAGGATC CAGAGGTTCA TCTGGGGCAG CTTAAAAGAT TTTCTCTGCG AGAATTACAA    900

GTTGCAACTG ATAGCTTTAG TAATAAAAAC ATCTTGGGAA GAGGTGGATT TGGCAAAGTC    960

TACAAGGGAC GGCTGGCAGA CGGTTCACTT GTGGCAGTAA AGAGGCTAAA GGAAGAGCGC    1020

ACACCTGGTG GAGAGCTCCA GTTTCAGACG GAGGTAGAGA TGATTAGCAT GGCTGTGCAC    1080

CGAAACCTCC TTCGCCTTCG TGGATTTTGC ATGACACCCA CTGAAAGGTT GCTCGTGTAT    1140

CCTTACATGA AAAATGGAAG TGTTGCCTCA CGTTTAAGAG AGCGTTCATC GACAGAGCCA    1200

CCACTTGATT GGTCAACTAG AAAAGGAGTT GCGTTGGGAT CTGCAAGAGG GCTATCTTAC    1260

TTACATGATC ACTGTGACCC AAAGATTATT CACCGTGATG TGAAAGCTGC AAATATATTA    1320

CTGGATGAAG AGTTTGAAGC AGTTGTAGGA GATTTTGGAT TGGCTAAGCT CATGGATTAC    1380

AAAGATACCC ATGTGACGAC TGCTGTCCGT GGCACCATTG GGCATATAGC TCCAGAGTAT    1440

CTTTCCACAG GGAAATCCTC AGAGAAGACA GATGTTTTTG GGTATGGGAT TACACTTCTG    1500

GAGCTCATTA CTGGACAGAG GGCCTTTGAT CTTGCTAGGC TTGCCAACGA TGATGATGTC    1560

ATGTTGCTTG ACTGGGTGAA AGGACTCTTA AAGGAGAAAA AGCTGGACAT GCTGGTAGAT    1620

CCTGATCTAC CAAGCTATTT GGAGGCTGAA GTGGAGCAAC TTATCCGAGT TGCCCTGCTC    1680

TGTACTCAAG GCTCACCAAC GGAACGTCCC AAGATGTCAG AGGTGGTGAG GATGCAGGAA    1740

GGTGACGGCC TCGCAGAGAG ATGGGAAGAA TGGCAGAGGG TTGAAGTTCG ACATGAGGCA    1800

GAGCTTGCAC CACACCGCAA CTCTGAATGG AATATAGAAG ACTCCACGTA CAATCTCCCT    1860

GCAGTCGAAT TATCTGGACC AAGGTGATCT AACCAAAAAT ATCACCTCTG AAGCGTGAAA    1920

GGAAATTGTT TACCCCTCAT TTTTATCCGA ATCGTCGACC TGCAGGCATG CAAGCTGCAC    1980

TGCCGTCGTA CTCA                                                      1994：

其中，起始密码子位于19bp处，终止密码子位于1888bp处，共编码622个氨基酸。

一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法，所述构建方法包括：

a.提取火鹤胚性愈伤组织总RNA；

b.cDNA第一链的合成；

c.火鹤SERK基因保守片段的扩增，引物序列为：

d.cDNA末端扩增法：

（1）SERK基因3'RACE克隆，其中引物序列为：

（2）SERK基因5'RACE克隆，其中引物序列为：

e.SERK基因cDNA全长引物设计，引物序列为：

一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA序列在火鹤快繁中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明以火鹤成熟植株刚展开幼嫩叶片为外植体，通过启动培养、继代培养、发育培养三个阶段的培养从间接体胚发生途径成功获得再生小植株；外植体诱导愈伤组织周期较短，植株成活率高、繁殖速度快、遗传性稳定、不易发生细胞变异；分离并克隆火鹤SERK基因cDNA全长序列，并从转录水平对不同培养阶段的各个时期SERK基因的表达量进行分析，加深对火鹤体胚发生机制的理解，揭示了调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA及其构建方法，为SERK基因在体细胞胚性转化中的作用提供很高的参考价值。

附图说明

图1为火鹤总RNA琼脂糖电泳结果图；

图2为火鹤SERK基因保守区片段扩增产物的电泳图;

图3为火鹤SERK基因3’RACE片段扩增结果图；

图4为火鹤SERK基因5’RACE片段扩增结果图；

图5为火鹤SERK基因cDNA全长片段扩增结果图；

图6为火鹤SERK cDNA全长的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列图；

注：图1中提取的总RNA其中两条亮带分别是28SrRNA、18SrRNA,用此法提取的总RNA无5SrRNA。Marker DL2000，分子大小从上往下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；

图2中M：Marker DL1500，分子大小从上往下分别为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；1为reverse1和forward3组合扩增结果；2为reverse1和forward4扩增条带;

图3中M：Marker DL1500，分子大小从上往下分别为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；

图4中M：Marker DL2000，分子大小从上往下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；

图5中M：Marker DL2000，分子大小从上往下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

研究植物体细胞胚胎发生无论在理论上还是在实践上都具有重要的意义。在理论探索方面，植物体细胞胚胎发生是植物细胞全能性的重要体现，是植物无性繁殖过程中的独特现象，体细胞胚胎发生过程受到基因型、激素、胁迫、光照以及培养基中矿质元素、氮源、碳源等多种因素的影响。但体细胞胚胎发生归根到底是体细胞在各种内外因素的作用下，启动了某些特异基因的表达，从而使体细胞分化和发育受到抑制，并脱分化和再分化转变为胚性细胞。

SERK（Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase）基因广泛地存在于单子叶和双子叶植物中，在不同的植物中存在着特定的表达方式。已经报道的除少数SERK基因的表达在体细胞胚内检测不到外，其他已经报导功能的SERK基因一般都参与了体细胞胚的发生，这表明SERK基因的表达与体细胞胚的发生密切相关。另外，有些研究表明SERK基因不仅参与促进体细胞胚的发生，还标志着体细胞从营养生长向胚性生长转变，预示着SERK基因可能会被发展成为体细胞胚发生的标记基因。

完整的植物总RNA的提取是从RNA途径进行如荧光定量PCR、克隆全长基因、Nothern杂交、mRNA分离等其它分子实验的基础。本发明以在继代培养基上培养20天的胚性愈伤组织为材料，采用改良的CTAB法提取植物总RNA，样品纯度达到要求才进行后续操作。

1火鹤胚性愈伤组织总RNA的提取

完整的植物总RNA的提取是从RNA途径进行如荧光定量PCR、克隆全长基因、Nothern杂交、mRNA分离等其它分子实验的基础。本实验以在继代培养基上培养20天的胚性愈伤组织为材料，采用改良的CTAB法提取植物总RNA。

1.1材料与方法

1.1.1实验材料

以在继代培养基上培养20天的胚性愈伤组织为试验材料。

1.1.2试剂

试剂：CTAB提取缓冲液、DEPC处理水、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、乙醇购自北京诺其亚公司，DNaseI购自大连宝生物有限公司。

TAE电泳缓冲贮存液50×（1L）配制：242g Tris；57.1mL冰乙酸；100mL0.5M EDTA（PH8.0）；

加去离子水定容至1L；用时稀释50倍。

1.5%的琼脂糖凝胶配制：1.5g琼脂糖，100mLTAE（10×）。

1.1.3改良CTAB提取法

准备工作：实验用枪头、2ml离心管、1.5ml离心管、0.2ml PCR管子，高压灭菌两次，用于临时盛放LiCl和镊子均用0.1％DEPC水泡过夜，然后灭菌、80℃烘干。实验用的药匙、研钵和杵在150℃烤4h。

1）取2mL离心管，加CTAB裂解液900μL，β-巯基乙醇30μL，65℃水浴10分钟；

2）称取100mg胚性愈伤组织于液氮中研磨。将预热的CTAB裂解液加入到研钵中裂解，融化后迅速转入2mL离心管，涡旋混匀30s，65℃水浴5分钟；

3）加入1mL氯仿/异戊醇，涡旋混匀，4℃，10000rpm，离心15分钟；；

4）取上清至新的2mL离心管，加入2μL的DNase Ⅰ和5μLBuffer，37℃反应20分钟，4℃，10000rpm，离心15分钟；

5）取上清至新的2mL离心管，加入1mL氯仿/异戊醇，涡旋混匀，4℃，10000rpm，离心15分钟；

6）取上清至1.5mL离心管，加入1/3体积的8mol/L LiCl，4℃沉淀过夜(不超过16h)；

7）4℃，12000rpm离心20分钟，弃上清，加入500μL70%乙醇悬浮沉淀；

8）4℃，12000rpm离心5分钟，加入500μL100%乙醇，弃上清，室温倒置1分钟；

9）加入30μLRNAse-free水溶解RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.1.4RNA质量的检测及浓度测定

取5μL RNA样品与1μL loading buffer混匀，在1.5%琼脂糖凝胶、120V电压下，电泳25分钟，在凝胶成像系统下拍照检测RNA。质量良好的RNA会出现两条清晰的带。如出现拖尾或一条带消失，说明RNA有降解。

1.2结果与分析

完整的、高质量RNA的提取和纯化，是进行RNA方面研究工作的基础，如Nothern杂交、逆转录PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。在整个RNA提取过程中主要问题是防止RNA酶的污染。在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNA酶的污染，从而导致整个实验的失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。为此，必须作到以下几点：一、RNA提取的操作在超净工作台内完成，离心机，移液器，试剂等均应专用；二、操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具。

以火鹤胚性愈伤组织为材料，用改良的CTAB法提取总RNA，图1电泳结果显示为两条清晰的带，其中28S为18S的两倍，可以用于下步实验。

2火鹤SERK基因cDNA全长的获得及序列分析

2.1材料和试剂

2.1.1供试材料

采用改良CTAB法提取的火鹤总RNA。

2.1.2试剂

菌株和载体：感受态菌株购自北京Tiangen公司产品，pMD19-T Vector购自日本Takara公司。

主要仪器设备：

1）PCR仪：Bio-Rad

2）电泳仪、电泳槽：DYY-7C、DYCZ-20C

3）凝胶成像分析系统：Bio-Rad

4）微量移液器：Eppendorf

5）高速冷冻离心机：Eppendorf TLL-C

6）自动蒸汽灭菌锅：TMQ.R/C 3250

7）电热恒温干燥箱：DHG-9140A

8）电热恒温水浴锅：HWSY21-KP4

9）液晶屏恒温摇床：THZ-100

10）超净工作台：YT-CJ-1ND

11）超低温冷冻冰箱：YC-260

12）掌上离心机：LX-200

13）液氮生物容器：YDS-50B-80

试剂：胶回收试剂盒购自Tiangen，Taq greenmix:鼎国昌盛生物公司，反转录试剂盒、3’RACE试剂盒和5’RACE试剂盒购自大连宝生物有限公司（TaKaRa）。

核苷酸引物和序列测序是由上海英骏生物技术有限公司完成。

2.2实验方法

2.2.1cDNA第一链的合成

采用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行第一链cDNA的合成，反应体系为：

1）70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上；

2）离心数秒钟使变性引物聚集于微型管管底部；

反应组分及体系：

3)42℃温育60分钟，70℃温育15分钟后冰上冷却。

2.2.2火鹤SERK基因保守片段的扩增

（1）引物设计

（2）扩增反应体系：

将混合物混匀，短暂离心后，放入已预热的PCR仪中执行以下反应：扩增条件为：

94℃5分钟

72℃延伸10分钟，4℃条件下保存。

注：经过测序比较发现，其中reverse1和forward4组合的扩增结果为后续试验所需要的目的条带（图2中条带2）；reverse1和forward3扩增条带为非目的条带（图2中条带1），扩增结果与后续试验无关。

2.2.3SERK基因3'RACE克隆

2.2.3.1 3′RACE的引物设计

据测序所得的SERK基因保守区序列与其他物种SERK基因序列进行比对，选择与其他物种序列相对特异的区域来设计2条上游引物：

2.2.3.2 3′RACE反转录

反应体系：

反应条件：

42℃，60分钟

70℃，15分钟

2.2.3.3 Outer PCR反应

反应体系：

反应条件：

94℃5分钟

72℃延伸10分钟，4℃条件下保存。

2.2.3.4 Inner PCR反应

反应体系：

反应条件：

94℃5分钟

72℃延伸10分钟，4℃条件下保存。

2.2.4SERK基因5'RACE克隆

2.2.4.1 5'RACE引物设计

据测序所得的SERK基因保守区序列与其他物种SERK基因序列进行比对，选择与其他物种序列相对特异的区域来设计2条下游引物

2.2.4.2去磷酸化处理

使用Alkaline Phosphatase（CIAP）对Total RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。

①按下列组份配制去磷酸反应液。

②50℃反应1h；

③向上述反应液中加入20μL的3M CH₃COONa（pH5.2），130μL的RNaseFree dH₂O后，充分混匀；

④加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀后13，000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的微型管中；

⑤加入200μL的氯仿，充分混匀后13，000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的微型管中；

⑥加入2μL的NA Carrier后均匀混合；

⑦加入200μL的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟；

⑧13，000rpm 4℃离心20分钟，弃上清；

⑨加入500μL的70%冷乙醇（RNase Free dH₂O配制）漂洗，13，000rpm4℃离心5分钟，弃上清后干燥；

⑩加入7μL的RNase Free d H₂O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。

2.2.4.3“去帽子”反应

使用Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团。

①按下列组份配制“去帽子”反应液。

②37℃反应1h。

③此反应液为CIAP/TAP-treated RNA。取5μL用于5′RACE Adaptor连接反应，剩余的5μL保存于-80℃。

2.2.4.4 5′RACE Adaptor的连接

①首先配制下列溶液

65℃保温5分钟后，冰上放置2分钟，然后在溶液Ⅲ加入下列试剂。

②

③16℃反应1h。

④向上述反应液中加入20μL的3M CH₃COONa（pH5.2），140μL的RNaseFree dH₂O后，充分混匀。

⑤加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀后13，000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的微型管中。

⑥加入200μL的氯仿，充分混匀后13，000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的微型管中。

⑦加入2μL的NA Carrier后均匀混合。

⑧加入200μL的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟。

⑨13，000rpm 4℃离心20分钟，弃上清。加入500μL的70%冷乙醇（RNaseFree dH₂O配制）漂洗，13，000rpm 4℃离心5分钟，弃上清后干燥。

⑩加入6μL的RNase Free dH₂O溶解沉淀，得到Ligated RNA。

2.2.4.5反转录反应

反转录反应体系：

反转录反应条件：

30℃10分钟

42℃1小时

70℃15分钟

反应结束后可以进行下一步实验，或将反应液保存于-20℃。

2.2.4.6 Outer PCR反应

Outer PCR反应体系：

PCR反应条件：

94℃5分钟

72℃延伸10分钟，4℃条件下保存。

2.2.4.7 Inner PCR反应

Inner PCR反应液

PCR反应条件：

94℃5分钟

72℃延伸10分钟，4℃条件下保存。

2.2.5 SERK基因cDNA全长克隆

2.2.5.1 SERK基因cDNA全长引物设计

根据所得到的保守序列、3’端序列和5’端序列拼接得到2410个碱基组成SERK基因的cDNA全长序列，在NCBI在线进行ORF查找，找到起始密码子和终止密码子的位置，后分别在起始密码子和终止密码子处设计引物进行全长验证。引物序列如下：

2.2.5.2 反转录反应

反转录反应采用全式金反转录试剂盒反转录（AT301-01）

反应体系：

反应条件：42℃，1小时。

2.2.5.3PCR扩增反应

反应体系：

反应条件：

94℃2分钟

72℃延伸10分钟，4℃条件下保存。

2.2.6切胶回收

（1）柱平衡步骤：向吸附柱CA3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取质量；

（3）向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

（4）将上一部所得溶液加入一个吸附柱CA3中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（5）向吸附柱CA3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，将吸附柱重新放回收集管中；

（6）向吸附柱CA3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；

（7）将吸附柱CA3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，将吸附柱CA3置于室温放置数分钟，彻底的晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

（8）将吸附柱CA3放入一个干净的离心管仲，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟收集DNA溶液。

2.2.7连接转化

(1)在PCR管中配制下列DNA溶液，全量为5μL

(2)加入5μL的Solution I，混匀；

(3)16℃反应30分钟；

(4)全量加入至100μL Top 10感受态细胞中，枪头轻揉搅匀，冰中放置30分钟；

(5)42℃热激60秒后，再在冰中放置2分钟(该过程不要摇动离心管)；

(6)加入890μLLB培养基，37℃震荡培养2小时；

(7)将离心管内容物混匀，吸取200μL已转化的感受态细胞加到含Amp的LB固体培养基上，用涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。

2.2.8菌落PCR

菌落PCR体系：

将白色单菌落用白枪头挑取至上述反应体系中后，在装有2mlLB培养基（含Amp）的离心管中搅动几下，摇匀。菌落PCR反应程序同前，将含有阳性克隆的片段进行测序。

2.2.9序列比对分析

将测序所得保守序列、3’端和5’端序列通过比对分析拼接，并将拼接片段在NCBI中进行BLAST，用DNAMAN（绿色版）进行氨基酸翻译。

2.3结果与分析

2.2.3.1火鹤SERK基因保守区序列的克隆

以反转录合成的cDNA为模板，以简并引物进行PCR扩增，6μL上样量进行琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，将所得条带切胶回收、连接转化、菌落PCR、测序。reverse1和forward4搭配克隆得到约800bp片段，经测序该序列为762bp。在NCBI中BLAST分析发现，该序列与其它多种植物的SERK基因同源性很高。经比较分析将该片段作为3’RACE和5'RACE引物设计的参照序列。

2.3.1火鹤体胚SERK基因的cDNA的3′RACE克隆结果

根据762bp片段设计两条3’RACE特异性引物，用特异性引物与3’RACE试剂盒自带的两条

下游引物进行巢式PCR扩增，得到了1000多bp的条带，与预期片段大小基本相符，如图3所示。

切胶回收纯化该片段，经连接转化、蓝白斑筛选、菌落PCR、琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的片段的菌液送去测序，测序结果为1085bp。NCBI在线BLAST表明，该目的片段序列与其他物种的SERK基因同源性很高，说明得到的片段序列正是SERK基因的3′端序列。

2.3.2火鹤体胚SERK基因的cDNA的5′RACE克隆结果

根据762bp片段设计两条5’RACE特异性引物，用特异性引物与5’RACE试剂盒自带的两条上游引物进行巢式PCR，琼脂糖凝胶电泳可见1000多bp的条带，与预期片段大小基本相符，如图4所示。

切胶回收纯化该片段，经连接转化、蓝白斑筛选、菌落PCR、琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的片段的菌液送去测序，测序得到1098bp的序列。NCBI在线BLAST表明，测序所得片段与其它植物SERK基因同源性相当高，说明此片段是SERK基因的5’端序列。

2.3.3火鹤SERK基因全长扩增

根据拼接所获得SERK基因cDNA全长设计ORF引物进行扩增得到2000bp左右的片段如图5所示，与拼接片段比对发现正是所要克隆的全长片段。

切胶回收纯化该片段，经连接转化、蓝白斑筛选、菌落PCR、琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的片段的菌液送去上海英俊公司进行测序，测序得到包括ORF（1869bp）在内的共1949bp的序列，其中起始密码子位于19bp处，终止密码子位于1888bp处，共编码622个氨基酸，其序列信息如图6所示，红色框分别标出起始密码子和终止密码子。

3.SERK编码基因cDNA的应用

本发明以火鹤成熟植株刚展开幼嫩叶片为外植体，通过启动培养、继代培养、发育培养三个阶段的培养从间接体胚发生途径成功获得再生小植株；并对前两个阶段培养过程中获得的两种愈伤组织进行了细胞学观察，为揭示火鹤体胚发生的途径提供了基础；成功克隆火鹤体胚SERK基因cDNA全长序列，并从转录水平对不同培养阶段的各个时期SERK基因的表达量进行分析，加深对火鹤体细胞胚胎发生机制的理解，为名贵的切花火鹤提供了一种有效的繁殖方式。

除非特殊定义，本发明描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。

除非特殊指明，本发明所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。

Claims (3)

1.一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA，其特征在于，该编码基因cDNA序列为：

AGGTGGTGAG GGGAGAAGAT GGCGCCGGCG GCGGCGCCGT GGCTGCTCTG CATGATCGTG    60

CTGCTCCATC CGATCGCGAG GATTCTCGCC AACGTGGAAG GTGATGCTTT GAATAGTCTA    120

AAAACTAATT TACATGATCC TAGTAATGTT CTTCAGAGTT GGGATCCAAC CCTTGTGAAT    180

CCATGCACTT GGTTCCATGT AACGTGCAAC AATGACAATA ATGTTATAAG AGTTGACCTT    240

GGAAATGCAG CATTATCTGG TTCTTTGGTC CCACAGCTTG GTCTGCTCAA AAGTTTGCAA    300

TACCTGGAAC TTTATAGCAA CAATATAAGT GGGGAAATTC CTATTGAACT TGGGAATTTG    360

TCAAGCTTGG TGAGCTTGGA TCTCTATTTG AACAAGTTCA CTGGCCCAAT TCCTGGCACC    420

CTGGAAAAGC TGGCAAAGCT GCGTTTCCTC CGGCTCAACA ACAACAGCTT GTCGGGACCA    480

ATTCCCATGT CTCTAACCAA CATTACTACA CTGCAAGTTC TGGATCTGTC TAACAACGGC    540

TTATCAGGAG TAGTTCCATC AAATGGTTCC TTTTCGCTAT TCACCCCAAT CAGTTTTAGT    600

AACAATCCTT TATTATGTGG CCCGGGTGCA GCCAAGCCTT GTCCTGGATC TCCTCCATTT    660

TCTCCACCAC CACTTGTTCC ACAGGCTACA GTCCCCTCTC CAGGAAGTAG TGCCTCCAGC    720

ACAGGTGCAA TTGCCGGTGG AGTGGCTGCA GGTGCTGCTT TGCTTTTTGC TGCACCTGCA    780

ATCGGGTTTG CATGGTGGCG GCGACGGAAA CCACAAGAAA ATTTCTTTGA TGTACCTGCT    840

GAAGAGGATC CAGAGGTTCA TCTGGGGCAG CTTAAAAGAT TTTCTCTGCG AGAATTACAA    900

GTTGCAACTG ATAGCTTTAG TAATAAAAAC ATCTTGGGAA GAGGTGGATT TGGCAAAGTC    960

TACAAGGGAC GGCTGGCAGA CGGTTCACTT GTGGCAGTAA AGAGGCTAAA GGAAGAGCGC    1020

ACACCTGGTG GAGAGCTCCA GTTTCAGACG GAGGTAGAGA TGATTAGCAT GGCTGTGCAC    1080

CGAAACCTCC TTCGCCTTCG TGGATTTTGC ATGACACCCA CTGAAAGGTT GCTCGTGTAT    1140

CCTTACATGA AAAATGGAAG TGTTGCCTCA CGTTTAAGAG AGCGTTCATC GACAGAGCCA    1200

CCACTTGATT GGTCAACTAG AAAAGGAGTT GCGTTGGGAT CTGCAAGAGG GCTATCTTAC    1260

TTACATGATC ACTGTGACCC AAAGATTATT CACCGTGATG TGAAAGCTGC AAATATATTA    1320

CTGGATGAAG AGTTTGAAGC AGTTGTAGGA GATTTTGGAT TGGCTAAGCT CATGGATTAC    1380

AAAGATACCC ATGTGACGAC TGCTGTCCGT GGCACCATTG GGCATATAGC TCCAGAGTAT    1440

CTTTCCACAG GGAAATCCTC AGAGAAGACA GATGTTTTTG GGTATGGGAT TACACTTCTG    1500

GAGCTCATTA CTGGACAGAG GGCCTTTGAT CTTGCTAGGC TTGCCAACGA TGATGATGTC    1560

ATGTTGCTTG ACTGGGTGAA AGGACTCTTA AAGGAGAAAA AGCTGGACAT GCTGGTAGAT    1620

CCTGATCTAC CAAGCTATTT GGAGGCTGAA GTGGAGCAAC TTATCCGAGT TGCCCTGCTC    1680

TGTACTCAAG GCTCACCAAC GGAACGTCCC AAGATGTCAG AGGTGGTGAG GATGCAGGAA    1740

GGTGACGGCC TCGCAGAGAG ATGGGAAGAA TGGCAGAGGG TTGAAGTTCG ACATGAGGCA    1800

GAGCTTGCAC CACACCGCAA CTCTGAATGG AATATAGAAG ACTCCACGTA CAATCTCCCT    1860

GCAGTCGAAT TATCTGGACC AAGGTGATCT AACCAAAAAT ATCACCTCTG AAGCGTGAAA    1920

GGAAATTGTT TACCCCTCAT TTTTATCCGA ATCGTCGACC TGCAGGCATG CAAGCTGCAC    1980

TGCCGTCGTA CTCA                                                      1994；

其中，起始密码子位于19bp处，终止密码子位于1888bp处，共编码622个氨基酸。

2.一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

a.提取火鹤胚性愈伤组织总RNA；

b.cDNA第一链的合成；

c.火鹤SERK基因保守片段的扩增，引物序列为：

d.快速cDNA末端扩增法：

(1)SERK基因3′RACE克隆，其中引物序列为：

(2)SERK基因5′RACE克隆，其中引物序列为：

e.SERK基因cDNA全长引物设计，引物序列为：

3.一种如权利要求1所述的调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA在火鹤快繁中的应用。

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