KR101206928B1

KR101206928B1 - 배추속 식물의 자가불화합성 인자에 대한 ｒｎａ 간섭 카세트, 그를 포함하는 벡터 및 상기 ｒｎａ 간섭 카세트가 도입된 형질전환 배추속 식물

Info

Publication number: KR101206928B1
Application number: KR1020100062262A
Authority: KR
Inventors: 신동영; 노일섭; 박종인; 이인호
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2012-11-30
Also published as: KR20120001465A

Abstract

본 발명은 배추속 (Brassica genus) 식물의 자가불화합성 인자에 대한 RNA 간섭 (RNA interference 또는 RNAi) 카세트 및 그의 이용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 배추 (Brassica rapa. ssp.) 및 소송채 (Brassica rapa)를 비롯한 배추속 식물의 자가불화합성 (self-incompatibility, SI)을 타파하여 자가화합성 (self-compatibility, SC)으로 전환시키기 위한 RNAi 카세트, 상기 RNAi 카세트를 포함하는 벡터 (RNAi 벡터), 상기 벡터에 의해 형질전환된 배추속 식물, 및 상기 RNAi 카세트를 이용하여 자가불화합성 인자를 넉아웃 시키는 방법 및 자가화합성 배추속 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 RNAi를 이용하는 경우 자가화합성을 갖는 식물체를 생산할 수 있어 경제적으로 유용한 자가결실성 우량 호모계통의 육성이 가능하다.

Description

배추속 식물의 자가불화합성 인자에 대한 ＲＮＡ 간섭 카세트, 그를 포함하는 벡터 및 상기 ＲＮＡ 간섭 카세트가 도입된 형질전환 배추속 식물 {RNA interference cassette against a self-incompatibility factor of Brassica genus, vector comprising the same and transgenic Brassica plant comprising the same}

본 발명은 배추속 (Brassica genus) 식물의 자가불화합성 인자에 대한 RNA 간섭 (RNA interference 또는 RNAi) 카세트 및 그의 이용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 소송채 (Brassica rapa)를 비롯한 배추속 식물의 자가불화합성 (self-incompatibility, SI)을 타파하여 자가화합성 (self-compatibility, SC)으로 전환시키기 위한 RNAi 카세트, 상기 RNAi 카세트를 포함하는 벡터 (RNAi 벡터), 상기 벡터에 의해 형질전환된 배추속 식물, 및 상기 RNAi 카세트를 이용하여 자가불화합성 인자를 넉아웃 시키는 방법 및 자가화합성 배추속 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

유전자 발현제어 기술로는 목적 유전자의 돌연변이주 단리, 트랜스포존 (transposon) 혹은 T-DNA 삽입에 의한 파괴주 이용 및 안티센스(antisense) RNA 혹은 공동발현(Cosuppression) 등이 알려져 있다. 최근 RNA 간섭 (RNA interference 혹은 RNAi)법에 의한 유전자 사일런싱 (gene silencing)을 유도할 수 있는 방법이 개발되어 dsRNA 발현벡터의 구축, RNAi와 표적의 배열, RNAi의 효율 및 RNAi의 검출 등에 관한 연구가 왕성히 이루어지고 있다.

RNAi는 생물체나 세포 내에 이중사슬 RNA(dsRNA)가 도입되어 상동성 있는 mRNA를 분해하는 현상이다. 이와 관련하여, 선충에서 번역되지 않는 저분자의 RNA(non coding RNA)가 발육단계에 있어서 유전자의 발현을 제어하는 것이 알려진 이후 선충 게놈에 많은 저분자 RNA가 존재하는 것이 발견되었다 (Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in C. elegans. Nature. 391: 806-811). 이러한 저분자 RNA의 크기는 25nt 이하 정도로, 이를 miRNA (micro RNA)라고 하며, 선충에서는 200종류 이상 존재한다. 식물에 있어서도 miRNA가 발견되었으며, 이러한 저분자 RNA(21 내지 25nt)중 목적 유전자의 배열과 완전히 일치하는 것을 소간섭 RNA (small interfering RNA 혹은 siRNA), 불완전한 일치를 나타내는 것을 마이크로 (micro RNA 혹은 miRNA)라고 부른다. 이러한 저분자 RNA는 비번역 (non coding) RNA로부터 RNA 프로세싱 효소인 다이서 (DICER)에 의한 절단에 의해 생긴다. 절단 전의 RNA는 두 가닥 RNA (stem loop RNA)를 형성하고 있다. 그 후 목적 유전자 영역에 결합하여 RNA 유도된 사일런싱 복합체 (RNA induced silencing complex 혹은 RISC) 등에 의해 발현제어가 일어난다. 식물에 있어서도 DICER 유사 단백질 (Carpel factory / Suspensor / Short integument)이 존재하며, 애기장대 (Arabidopsis)의 변이체(sus, caf 변이체)에 있어서는 형태이상이 나타난 결과로부터 miRNA에 의한 내재성 RNA 사일런싱에 의해 발현제어가 행하여지고 있는 것이 시사되고 있다. 그래서 최근에는 다양한 생물체에서 특정유전자의 발현을 넉-아웃하는 도구로서 RNAi 방법을 많이 이용하고 있다.

자식(selfing)을 방어하기 위하여 동종의 화분으로부터 자기 개체 유래의 화분을 식별하여 수정시키지 않도록 하는 유전적 형질 중 가장 고도의 기구가 자가불화합성 (Self-incompatibility, SI)이다. 자가불화합성 현상에는 우열관계가 분명한 복대립인자가 관여하는 것으로 알려져 있으며, 불화합인자를 S로 나타낸다(예, S¹, S², S³ 내지 Sⁿ).

배추 (Brassica)속 작물의 자가불화합성은 단일 SI 유전자 좌(S-locus)에 의해 조절되는 S 복대립 유전자(S-allele)에 의해 설명되고 SI 유전자 좌에는 자성측 SI 유전자 SLG (S-linked glycoprotein) 및 SRK (S-receptor kinase)와 웅성측 SI 유전자 SP11 (S-locus protein 11)/SCR (S-locus cysteine rich protein) 유전자가 연쇄되어 있다. 분자수준에서의 연구는 1980년대부터 미국 코넬대의 Nasrallah 그룹과 일본 동북대학의 Hinata그룹 (Watanabe, Isogai, Nishio, Takasaki 등)에 의해 경쟁적으로 시작되었으며, 그 후 배추속 작물이 매우 경제적 가치가 크기 때문에 영국(Dikinson 등), 프랑스(Dumas 등), 캐나다(Goring 등)의 많은 육종학 및 생물공학자들이 분자적 연구에 가담하였다. 최근에는, Takasaki 등(Takasaki, T., Hatakeyama, K., Suzuki, G., Watanabe, M., Isogai, A. and Hinata, K. (2000) The S receptor kinase determines self-imcompatibility in Brassica stigma. Nature 403: 913-916.)에 의하여 자가불화합성 유전자인 SRK가 주두 (stigma) 측의 자가불화합성 결정인자라는 것이 보고되었고, 배추속 식물에서 처음으로 동정된 SP11/SCR이 자가불화합성 유전자(Schopfer et al . 1999; Suzuki et al . 1999; 및 Takayama et al . 2000b) 중 화분 측의 자가불화합성 결정인자라는 것이 보고되었다(Takayama et al . 2000b; 및 Shiba et al . 2001). SRK 유전자는 막통과(transmembrane) 관통형이며, 세포 외 S-도메인과 세포 내 카이네이즈 도메인으로 구성되어 있다. 화분에서 SP11/SCR의 산물은 화분의 표면에 존재하고 있다. 그리하여 SP11/SCR(이하, SP11로 표기함) 유전자 산물이 주두 측의 자가불화합성 유전자인 SRK의 산물과 유두세포상 (포자체형) 혹은 화주 내 (배우체형)에서 인식반응을 일으킨다.

배추속에 속하는 소송채 (Brassica rapa)는 초자는 입성이고 잎은 진한 녹색으로 장원형인 배추속의 식물로서, 해독효과가 있고 신경을 안정시키는 작용을 가지며, 잎 및 새싹 채소로 이용되고 있다. 같은 속에 속하는 양배추류(Brassica oleracea)에서 밝혀진 것처럼 소송채 역시 여러 S 복대립유전자(S-multiallele)로 구성이 되어있고 대립유전자간의 자가불화합성 활력 차이 또한 다르다. 따라서 대립유전자간의 활력의 차이를 구명하고 자가불화합성을 이용한 잡종 종자의 효율적인 채종을 가능케 하고자 하는 연구가 일부 진행되어왔다. 특히 모본 유지를 위한 채종에는 자가불화합성의 경우 뇌수분이나 개화기의 CO₂처리를 통하여 자가불화합성을 일시적으로 타파해야 하고, 웅성불임성을 이용하는 경우에는 계통유지를 위해 유지친 (maintainer)을 자가수분시켜야 하므로 여기에는 막대한 노력, 시설 및 경비가 소요된다. 특히 우수품종 육종을 위한 세포질 웅성 불임성 (cytoplasmic male sterility, CMS) 채종에 자가화합성이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 자가화합성을 갖는 소송채를 비롯한 배추속 식물을 제조하기 위하여 연구를 계속한 결과, RNA 간섭 기법을 이용하여 배추를 자가불화합성에서 자가화합성으로 바꿀 수 있는 화분측 자가불화합성 유전자인 SP11의 고효율적 유전자 사일런싱을 위한 RNAi 벡터를 구축하고, 이를 이용하여 자가화합성 배추를 작제한 후 자가결실성 우량 호모계통을 육성하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 배추속 식물의 자가불화합성을 타파하기 위한 RNAi 카세트, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 배추속 식물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 RNAi 카세트를 이용하여 배추속 식물의 자가불화합성 유전자를 넉아웃시키는 방법 및 자가화합성 식물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 RNAi 카세트와 같은 외래 유전자를 배추속 식물에 도입시켜 형질전환하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 배추속 식물의 자가불화합성 인자에 대한 RNA 간섭 (RNAi) 카세트에 관한 것이다.

용어 "RNA 간섭 (RNA interference, RNAi)"는 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA (double-strand RNA)를 세포 등에 도입하여 선택적으로 표적유전자의 mRNA의 분해를 유도하고 표적유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상을 말한다.

또한, 용어 "자가불화합성 (self-incomparibility)"는 한 개의 꽃, 같은 그루 또는 같은 계통(系統)의 꽃 사이에서는 종자(種子)가 생기지 않는 성질을 말하고, "자가불화합성 인자"는 동종의 화분으로부터 자기 개체 유래의 화분을 식별하여 수정시키지 않음으로 자가불화합성을 갖게 하는 유전적 인자를 의미한다. 바람직하게는, 상기 자가불화합성 인자는 자성측 자가불화합성 유전자인 SLG 및 SRK, 및 웅성측 자가불화합성 유전자인 SP11/SCR일 수 있고, 더욱 바람직하게는 SP11/SCR이다.

본 발명의 RNAi 카세트는 이와 같은 배추속 식물의 자가불화합성 인자에 대해 선택적인 RNA 간섭을 일으키는 것으로서, 자가불화합성 인자에 대한 안티센스 RNA 및 센스 RNA를 포함한다. 바람직하게는, 서열번호 38 및 39의 SP11에 대한 안티센스 RNA, 및 서열번호 41 및 42의 SP11의 센스 RNA를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 안티센스 및 센스 RNA는 SP11-52 (GeneBank Acc.No.: BAA92247) 및 SP11-S60 (GeneBank Acc. No.: BAB86353)를 사용하여 제조될 수 있다.

바람직한 일 양태로서, 본 발명의 RNAi 카세트는 상기 안티센스 및 센스 RNA의 사이에 GUS (beta-glucuronidase) 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 RNAi 카세트는 708 내지 1809bp의 GUS 영역을 포함할 수 있다. 상기 GUS 영역은 pBI101 이원체 벡터를 템플릿으로 이용하여 PCR로 증폭시켜 얻을 수도 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 RNAi 카세트는 서열번호 43 및 44의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 RNAi 카세트를 구축하기 위하여, 공지된 다양한 유전자 재조합 기술을 사용할 수 있다. 구체적인 일 양태로서, 본 발명자는 도 1에 도시된 바와 같은 안티센스 SP11::GUS(708-1809)::센스 SP11를 RNAi 카세트로서 설계하였고, 각각의 영역을 PCR로 증폭한 후 이들을 템플릿으로 이용하여 PCR 증폭으로 서로 연결하여 상기 RNAi 카세트를 구축하였다.

한편, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 RNAi 카세트를 포함하는 RNAi 벡터에 관한 것이다.

용어 "벡터"란 적당한 숙주세포로 외래 유전자를 도입하여 그것이 발현될 수 있게 하는 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 현재 식물세포를 형질전환시키기 위하여 개발된 벡터 중에서 가장 많이 쓰이는 벡터는 이원체 벡터(binary vector)다. 이원체 벡터는 2개의 플라스미드로 구성되어 있는데, 하나는 아그로박테리움 감염에 필요한 유전자와 T-DNA를 전달하는데 필요한 유전자가 들어 있고, 다른 하나에는 목적 유전자가 삽입될 수 있는 T-DNA가 들어 있다. 후자는 대장균과 아그로박테리움에서 염색체와 독립적으로 복제될 수 있을 뿐 아니라, 항생체 저항성 유전자를 갖고 있으며, 식물세포로의 유전자 전이에 필수적인 T-DNA의 양끝 말단 부위 (left boarder (LB) 및 right boarder (RB))를 지니고 있도록 제조되었다. 당업계에는 다양한 이원체 벡터가 공지되어 있으며, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 pBI101 이원체 벡터를 사용하였다.

본 발명에 따른 RNAi 벡터는 배추속 식물의 자가불화합성 인자에 대한 상기 RNAi 카세트를 포함한다. 한편, 숙주세포인 배추속 식물에서 상기 RNAi 카세트의 발현은, 프로모터, 폴리아데닐화 서열, 조직-특이성 조절 요소 및 인핸서와 같은 특정 조절 요소들 (regulatory elements)의 제어하에 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RNAi 벡터는 상기 RNAi 카세트 외에도 상기 조절요소를 포함할 수 있는데, 바람직하게, 본 발명의 RNAi 벡터는 RNAi 카세트에 대한 프로모터를 포함할 수 있으며, 이러한 프로모터로는 구성성 프로모터 (constitutive promorer), 유도성 프로모터 (inducible 프로모터) 및 조직-특이성 프로모터 (tissue-specific 프로모터)가 있다. 구체적인 일 실시예에서, RNAi 벡터의 제조를 위해 pCR2.1 벡터에서 클로닝된 서열번호 45의 SP11S⁹ 및 서열번호 46의 SP11S⁶⁰ 프로모터를 사용하였다.

이러한 본 발명의 RNAi 벡터는 포함되는 각 요소가 작동가능하게 연결되도록 작제된다. "작동가능하게 연결된 (operably linked)"이라는 것은 일반적 기능을 수행하도록 상기 핵산 발현조절 서열과 외래 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다. 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 pBI101 이원체 벡터를 SalI와 SacI로 소화시켜 GUS 영역을 제거한 후 회수하고, RNAi 카세트를 포함한 pCR2.1 벡터를 소화시켜 회수하였고, 이 회수된 RNAi 카세트 산물을 GUS 영역이 제거된 이원체 벡터에 연결하였다. 이후, 상기 이원체 벡터를 KpnI 및 SalI로 소화하여 SSH 영역을 제거한 후 pCR2.1 벡터에 클로닝된 SP11S⁹ 및 SP11S⁶⁰ 프로모터를 KpnI 및 SalI로 소화시킨 후 회수된 산물을 상기 이원체 벡터에 삽입하여 도 4에 도시된 RNAi 벡터를 작제하였다.

또 다른 일 양태에서, 본 발명은 상기 RNAi 벡터의 도입에 의하여 형질전환된 식물체에 관한 것이다. 상기 "식물체"란 식물 기관, 식물 조직, 식물 세포, 종자 및 캘러스를 포함한다. 바람직하게는 상기 식물체는 배추속 식물체, 더욱 바람직하게는 배추 (Brassica rapa. ssp.) 또는 소송채 (Brassica rapa. cv. Osome)이다.

본 발명에 따른 RNAi 벡터를 도입하여 상기 식물체를 형질전환시키는 방법으로서, 공지된 다양한 방법, 즉, 아그로박테리아-매개된 형질전환, 입자 총 충격 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커 (silicon cargide whiskers), 초음파 처리 (sonication) 및 전기천공법 (electroporation) 등이 알려져 있다. 이러한 방법들 중 가장 널리 사용되는 것은 아그로박테리움의 자연적인 형질전환 시스템을 이용하는 방법과 아그로박테리움의 자연적인 형질전환 시스템(natural transformation system)을 이용하는 방법과 유전자 총을 이용하여 직접 DNA를 쏘아넣는 방법이다. 아그로박테리움는 Ti 또는 Ri 플라스미드를 갖고 있는데, 상기 플라스미드는 식물체에 외래 유전자로 형질전환시킬 수 있는 유전자들을 갖고 있다. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움을 통한 유전자 전이방법은 Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238(1989) 등과 같은 다수의 문헌에 기재되어 있다. 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 RNAi 벡터를 사용하여 소송채를 형질전환시키고자, 아그로박테리움 및 소송채의 배축을 이용한 배축법을 사용하여 형질전환된 배추를 생산하였다.

이러한 다양한 방법에 의해 RNAi 벡터가 도입되어 형질전환된 식물체는 상기 벡터 내의 RNAi 카세트에 의해 자가불화합성 인자가 넉아웃되어 자가화합성을 갖게 된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 RNAi 카세트를 이용하여 식물체의 자가 불화합성 인자를 넉아웃 시키는 방법 또한 제공한다.

한편, 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 RNAi 카세트를 이용하여 자가화합성 식물체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

(i) 제1항의 RNAi 카세트를 구축하는 단계;

(ⅱ) 상기 RNAi 카세트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

(ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 제조된 벡터를 배추속 식물에 형질전환시키는 단계; 및

(ⅳ) 단계 (ⅲ)에서 형질전환된 배추속 식물을 배양하는 단계를 포함하는 방법.

상기 각 단계의 구체적인 수행방법은 앞서 설명된 바와 같다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 RNAi 카세트와 같은 외래 유전자를 배추속 식물에 도입시켜 형질전환시키는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 형질전환 방법에서는 유전자 도입 효율을 높이기 위하여, 아그로박테리움을 이용하여 배추속 식물의 배축을 형질전환시키고, 상기 배축은 담배 세포현탁배양액을 사용하여 배양 및 형질전환시키는 것을 특징으로 한다. 더욱 상세하게는, 본 발명에 따른 형질전환 방법은 (i) 아그로박테리움을 배양하는 단계; (ⅱ) 배추속 식물의 배축을 담배 현탁 배양액을 이용하여 배양하는 단계; (ⅲ) 단계 (i)의 아그로박테리움을 단계 (ⅱ)의 배축에 감염시켜 형질전환시키는 단계; (ⅳ) 단계 (ⅲ)에서 형질전환된 배축을 캘러스 유도 배지에 배양하는 단계; (ⅴ) 단계 (ⅳ)의 캘러스를 재분화 및 성숙시켜 신초를 생산하는 단계; 및 (ⅵ) 단계 (ⅴ)의 신초를 발근 및 순화시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 형질전환 방법에서는 담배 현탁 배양액을 사용하여 배추속 식물체 내로의 RNAi와 같은 외래 유전자의 도입 효율을 향상시켰으며, 본 발명에 따른 형질전환방법을 "배축법"이라 명명하였다.

다른 한편, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 담배 세포 현탁 배양액을 이용하는 배추속 식물의 형질전환 방법에 관한 것이다.

상기 담배 세포 현탁 배양액은 바람직하게 배추속 식물의 배축을 배양하기 위하여 사용하는 것이며, 상기 배축은 아그로박테리움 등으로 감염시켜 형질전환하기 위한 것이다.

상기 담배 세포 현탁 배양액의 농도는 배축이 성장하기에 적합한 양, 바람직하게 샤레당 10 내지 30ml, 보다 바람직하게 10 내지 20ml를 사용한다. 또한, 배양하는 배축의 크기는 5 내지 7mm가 바람직하다.

본 발명자에 의하여 상기 배양액의 농도 및 배축의 크기를 가지면서 배양하였을 때 배축의 성장이 가장 우수한 것임을 확인하였다.

본 발명에 따른 RNAi 카세트를 도입시켜 제조된 형질전환 식물체는 자가불화합성 인자가 넉아웃되어 자가화합성으로 전환되어 자가결실이 될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RNAi를 이용하는 경우 자가화합성을 갖는 식물체를 생산할 수 있어 경제적으로 유용한 자가결실성 우량 호모계통의 육성이 가능하다. 이러한 자가결실성 우량 호모계통의 육성은 1)동일 SI간의 F₁ 하이브리드 생산, 2) CMS F₁채종의 화분친으로 활용, 3) CMS 모본과 화분친이 동일한 SI간의 활용, 4) 막대한 시설비가 소요되는 CO₂ 시설 없이 원종 증식 및 5) 3원 교배의 B 및 C 친으로 활용 가능하여 산업적 효과가 매우 클 것으로 기대된다. 또한 CMS 유지친의 원종 증식도 가능할 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 구축된 SP11 RNAi 카세트, 그의 프라이머 및 어댑터에 관한 모식도이다.
도 2는 pBI101 벡터의 구축을 나타내는 모식도이다.
도 3은 pBI101 벡터 내로 SP11 RNAi 카세트를 삽입하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 4는 pBI101 벡터 내로 SP11 프로모터를 삽입하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 5는 SP11S⁹ 및 SP11S⁶⁰ 프로모터 부위로부터 증폭된 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 SP11S⁹ 및 SP11S⁶⁰ 유전자의 서열을 나타낸 도면이다. 상기 도 6의 서열 중에서 밑줄 친 부분은 SP11S⁹ 및 SP11S⁶⁰ RNAi 카세트를 구축시키기 위하여 사용된 영역을 나타낸다. 붉은색으로 표기된 부분은 개시코돈 및 종결코돈을 나타낸다.
도 7은 소송채에 대한 SP11 벡터의 구조를 나타낸 도면이다.
도 8은 RNAi 형질전환 식물체의 발육에 관한 도면이다 (A: 캘러스 유도배지(감염 후 7일 경과), B: 재분화 배지(감염 후 42일 경과), C: 성숙 배지(감염 후 63일 경과) 및 D: 발근 배지(감염 후 84일 경과)).
도 9는 형질전환된 식물체 (T₀) 내에서의 SP11 (A 및 B) 및 NPTII (C 및 D) 특이적 프라이머의 PCR 분석결과이다 (A: SP11S⁶⁰ 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 카세트, B: SP11S⁹ 프로모터::SP11S⁵² RNAi 카세트, C: SP11S⁶⁰ 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 카세트 및 D: SP11S⁹ 프로모터::SP11S⁵² RNAi 카세트).
도 10은 UV 형광 현미경 분석에 의해 시험된 화분관의 사진이다 (A: 야생형, B: SP11S⁹ 프로모터::SP11S⁵² RNAi 카세트 및 C: SP11S⁶⁰ 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 카세트).
도 11은 T1 식물체 내에서의 뇌수분(bud-selfing; BS) 및 자가수분(flower selfing; FS)을 나타내는 사진이다 (A: C7-13, SP11S⁶⁰ 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 카세트, B: C21-12, SP11S⁹ 프로모터::SP11S⁵² RNAi 카세트).
도 12는 RNAi 식물체 발현에 대한 RT-qPCR (quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석 결과를 나타낸 그래프이다 (S⁶⁰: 야생형; 6-10, 11-8 및 18-7: RNAi 형질전환 식물체).
도 13은 T2 세대의 자가수분 과정을 나타낸 사진이다 (A, B: T2 세대의‘Osome’-배양; C, D: flower selfing).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: 재료 및 방법

(1-1) SP11 클로닝 및 벡터 구축

1) 식물 재료

시판중인 F₁ 소송채(S⁵²S⁶⁰)의 F₂세대로부터 S⁵²S⁵² 및 S⁶⁰S⁶⁰ 동형접합체를 동정하였다. 동정된 동형접합체는 SP11-S⁵² 유전자 및 SP11-S⁶⁰ 유전자의 클로닝 소재로 활용하였다. 또한 소송채 S⁶⁰S⁶⁰ 동형접합체에서 SP11-S⁶⁰ 프로모터 영역을 클로닝하였으며, SP11-S⁹ 프로모터는 배추 S⁹-반수체형 (haplotype)을 육성하여 클로닝을 위한 소재로 활용하였다.

2) SP11S52 및 SP11S60의 cDNA 합성

개화전의 화뢰로부터 약을 채취하여, Micro-FactTrack mRNA isolation kit (Invitrogen, San Diego, CA, USA)를 이용하여 poly(A)⁺ RNA를 추출하였다. 추출된 mRNA는 First-Strand cDNA synthesis kit(Amersham-Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 이용하여 역전사하여 cDNA를 합성하였다. S52-반수체형은 SP11-F52 (5'-CTG CAA GTA AAA GAG TAT CT-3'; 서열번호 1)과 SP11-R52 (5'-TTA GCA TAT TTT ACA ACG ACA A-3'; 서열번호 2), S60-반수체형은 SP11-F60 (5'-GCG AAA ATC TTA TAT ACT CAT AAG TC-3'; 서열번호 3)와 SP11-R60 (5'-TTA TGA TTT AAC TTT GCA ACA G-3'; 서열번호 4)의 프라이머 세트(primer set)를 이용하여 PCR 증폭하였다. Perkin-elmer사의 PE-9700을 이용하여, 2분간 94℃에서 예비 변성 (pre-denaturation) 시킨 후, 변성 (denaturation)을 94℃에서 1분, 어닐링 (annealing)은 50℃에서 2분, 신장 (extension)은 72℃에서 3분간 30회 반응시켰다. 후신장 (Post-extension)은 72℃에서 5분간 수행하였다. PCR 증폭 반응용액은 10 x reaction buffer(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 8.3, 15mM MgCl₂) 2.5㎕, 2.5mM dNTP 2㎕, Genomic DNA 50ng, 100pM Primer 0.1㎕, 0.5unit ExTaq 폴리머라아제 0.25㎕(TaKaRa, Japan) 및 멸균수를 이용하여 전체 부피 25㎕가 되도록 조성하였다.

3) SP11S ⁹ , SP11S ⁶⁰ 프로모터 영역의 PCR 증폭

배추 및 소송채의 S⁹- 및 S⁶⁰-반수체형으로부터 CTAB법에 의해 genomic DNA를 추출하였다(Doyle & Doyle, 1990). 프로모터 영역은 forward primer에 KpnI과 reverse primer에는 SalI의 adaptor를 붙여 합성하였으며, S⁹ 반수체형은 SP11-ProF9 (5`-GGT ACC TAG TAC GTA CAA TCT GGT-3`; 서열번호 5)와 SP11-ProR9 (5`-GTC GAC TAT TAA GAA AGT GAT AAA GAT TC-3'; 서열번호 6)를, S⁶⁰-반수체형은 SP11-ProF60 (5`-GGT ACC CAA CCA TAA CAT TAA ACT TTA-3`; 서열번호 7)과 SP11-ProR60 (5`-GTC GAC GAC TTA TGA GTA TAT AAG ATT-3`; 서열번호 8)의 프라이머를 이용하여 프로모터 영역을 증폭하였다. gDNA (S9, S60 genome) 2㎕, Ex 10×buffer 5㎕, dNTP 4㎕, forward primer 1㎕(20 uM), reverse primer 1㎕(20 uM), Ex Taq 0.25㎕, DDW 36.75㎕를 넣어 전체 부피 50㎕의 PCR mixture를 만들었다. 94℃ 30초간 hot step, 94℃ 30 초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 신장 과정을 30 cycle 수행하였다.

4) SP11 RNAi 카세트 구축(안티센스 SP11::GUS 787-1809::센스 SP11 복합체)

RNAi 카세트 구축은 도 1과 같이 안티센스 SP11::GUS(787~1809 bp)::센스 SP11로 설계하였다. 먼저 각각의 영역을 PCR 증폭 후 템플릿으로 이용하여 PCR 증폭으로 연결하였다.

SP11/SCR RNAi 카세트를 구축하기 위하여 adaptor primer를 도 1과 같이 프라이머 위치를 디자인 한 후, 하기 표 1과 같이 합성하였다. SP11 안티센스 영역(표 1의 ① 및 ② primer 사용)과 GUS 영역(표 1의 ③ 및 ④ primer 사용) 및 SP11 센스 영역(표 1의 ⑤ 및 ⑥ primer 사용)을 각각 증폭하였다. 증폭된 산물은 전기영동 확인 후 남은 45㎕를 1.5ml 튜브로 옮긴 후 PCR 과정에서 Taq polymerase에 의해 생긴 A말단을 제거하기 위하여 Klenow flagment(TaKaRa, Japan)를 처리하였다. 처리조건은 dNTP 4㎕, 1XTE 1㎕, Klenow flagment 0.6㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 처리하였으며, EtOH 침전하였다. 정제된 SP11 안티센스와 GUS영역을 템플릿으로 하여 표 1에 기재된 ①과 ④ primer를 사용하여 안티센스::GUS영역을 증폭하였다. 또한 GUS영역과 센스 영역을 템플릿으로 하여 ③과 ⑥ primer를 사용하여 PCR를 통해 GUS::센스영역을 증폭하였다. 증폭된 산물은 전기영동 확인 후 남은 산물은 Klenow flagment(TaKaRa, Japan)처리후 EtOH 침전하여 안티센스::GUS::센스의 RNAi 카세트의 PCR 증폭을 위한 템플릿으로 이용하였으며, primer는 ①과 ⑥ primer를 사용하였으며, 증폭된 산물은 전기영동확인 후 겔에서 회수하여 TOPO TA 벡터 (Invitrogen, USA)에 클로닝하여 DH5α의 대장균에 형질전환하였다.

5) RNAi 벡터 구축

pBI101 이원체(binary) 벡터를 SalI과 SacI으로 소화하여 GUS 영역을 제거한 후 겔에서 회수하였으며 (도 2 참조), 또한 SP11S⁵², SP11S⁶⁰의 RNAi 카세트 (안티센스::GUS::센스)를 포함한 pCR2.1 벡터를 SalI과 SacI으로 소화하여 겔에서 회수하였다. 회수된 RNAi 카세트산물을 GUS영역이 제거된 이원체 벡터에 ligation하였다(도 3 참조).

프로모터 삽입을 위하여 SP11 RNAi 카세트가 삽입된 pBI101 이원체 벡터를 KpnI과 SalI으로 소화하여 SSH 영역을 제거 후 겔에서 회수하였으며, 또한 pCR2.1 벡터에 클로닝된 SP11S⁹ 및 SP11S⁶⁰ 프로모터를 KpnI과 SalI으로 소화하여 겔에서 회수하였다. 겔에서 회수된 산물을 ligation하여 제거된 SSH 영역에 프로모터를 삽입하였다(도 4 참조).

회수된 산물의 삽입을 위하여, 이원체 벡터 X₁㎕ (0.03pmol)와 Insert DNA X₂㎕ (0.3pmol)[예를 들어, 이원체 벡터의 크기가 15 kbp 일 때 약 300ng 사용, Insert DNA의 크기가 2 kbp 일 때 약 400ng 사용], DDW (deionized distilled water) X₃㎕ (X₁+X₂+X₃≒100㎕), 3M NaOAc 10㎕, 100% EtOH 250㎕, Glycogen 1㎕를 넣고 혼합하였다. -80℃에 20-30분 동안 놓아두었다가 15,000rpm, 4℃로 20분간 원심분리한 후 70% EtOH 750㎕를 넣고 15,000rpm, 4℃로 5분간 다시 한번 원심분리하였다. EtOH를 완전히 제거하기 위해 실온에서 5분간 건조시킨 후 5㎕ DDW로 녹이고 ligation mix (Takara, Kit 내의 A tube, 40㎕; Kit 내의 B tube, 5㎕)를 첨가한 다음 혼합하였다. Ligation을 위하여 16℃에서 4hr이상 반응시켰다. 반응산물의 대장균에의 형질전환은 heat shock법을 이용하였다. Ligation reaction 5㎕를 One shot cell에 첨가하고 얼음에 5분 동안 넣어둔 후 42℃에 30초간 놓아두었다가 250㎕의 SOC 배지를 첨가한 후 5000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그리고 카나마이신이 포함된 LB 배지에 도말하여 대장균 생육온도인 37℃에서 16시간 이상 배양하였다.

(1-2) Brassica rapa ('소송채')의 형질전환

1) 식물재료

B. rapa 의 '소송채' F₁(S⁵²S⁶⁰)을 공시하였다.

2) 아그로박테리움 ( Agrobacterium )의 배양

식물 발현의 벡터구축을 위해 확인된 플라스미드는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA101에 형질전환 시켰다. 구체적으로 아그로박테리움 투메파시엔스 캄피텐트 세포(Agrobacterium tumefaciens competent cell) EHA105를 얼음에서 녹인 후 plasmid DNA 1㎕와 섞어서 electorporation cuvette에 주입하였다. 그 다음 1440V로 전기충격을 가해서 형질전환 시킨 후 SOC 배지 1ml을 주입하여 혼합한 후, 멸균된 시험관에 넣고 28℃에서 200rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 배양액은 카나마이신 50mg/L을 포함한 LB agar 배지에 200㎕를 피펫으로 분주하여 도말하고, 28℃ incubator에서 샤레를 2일 동안 배양하여 콜로니를 관찰하였다. 콜로니는 모두 PCR 방법으로 형질전환 여부를 확인하고, 확인된 균주는 다시 카나마이신 50mg/L을 포함한 LB 액체배지에 접종한 후, 2일 동안 28℃ incubator에서 200rpm으로 배양하여 최종적으로 60% 글리세롤을 종량 첨가하여 초저온 냉장고(-80℃)에 저장하였다.

저장된(-80℃) 글리세롤 스톡을 꺼내어 항생제(하이그로마이신 및 카나마이신 50mg/L)가 들어간 YEB 한천배지에 스트리킹하고, 28℃, 암소에 거꾸로 하여 48시간 배양하였다. 이후, 4℃에 저장하였다가, 절출 하루 전날 항생제 (하이그로마이신 및 카나마이신 50mg/L)가 첨가된 YEB 액체 배지 15㎖에 콜로니를 접종한 후, 28℃, 180rpm에서 흡광도가 OD₆₈₀에서 0.9 내지 1.0이 될 때까지 진탕 배양하였다.

3) 배축법에 의한 식물의 형질전환

(1) 종자멸균 및 파종

반으로 자른 티백(6cm

4.5cm)에 종자 (250립 정도)를 넣고 봉하고 멸균한 100㎖ 비커에 75% 에탄올을 80ml 정도 넣고 티백을 적신 후, 핀셋으로 잡고 종자를 2분간 각반 하였다. 1% 차아염소산 용액이 들어있는 멸균한 100㎖ 비커에 티백을 옮긴 후 15분간 각반 하였다. 멸균수가 들어있는 비커에 티백을 옮기고 1분씩 3회 수세하였다. 티백을 샤레에 옮기고 3방향으로 메스를 이용해 자른 후, 한 개의 애그리포트에 18립 정도 1cm 정도의 간격으로 phytoagar 0.6%의 1/10 MS 배지[1/10 MS salts stock, 1/10 vitamins, pH 5.8]에 치상하였다. 치상한 종자는 22 내지 25℃에서 16/8시간 일장으로 직광을 피하여 7일간 배양하였다.

(2) 절출(파종으로부터 6일째)

0.6%의 한천이 첨가된 MS-1배지[MS salts, Ms vitamins, 200mgL^-1 KH₂PO_4,1mgL^-12,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D), 3%(W/V) 수크로오스, pH5.8]에 담배 현탁 배양액을 1.5ml씩 분주하고, 간극이 생기지 않도록 잘 펼친 후, 멸균한 여지를 공기가 들어가지 않도록 깔았다. 식물체를 애그리포트에서 핀셋으로 자엽을 잡고 취한 후, 끊어지지 않도록 뽑아 샤레에 놓고 생장점을 완전히 제거했다. 배축을 5-7mm정도로 자른 후, 한 개의 샤레에 50절편씩 나열하였으며 써지컬 테이프로 봉해서 24시간, 25℃에서 암소 배양하였다.

(3) 감염(파종으로부터 7일째)

아그로박테리움의 배양액이 탁하게 보인 후 흡광도 (OD)값을 측정하였다. OD₆₈₀에서 1.0이 될 때까지 배양한 후, 아세토시링곤을 포함한 액체 MS-1배지(pH 5.2) 9㎖과 아그로박테리움 배양액을 1㎖ 샤레를 천천히 기울여 혼합하였다. 한 샤레 당 배축 100본을 넣고 파라필름으로 봉한 후, 실온에서 40rpm으로 30분간 진탕 배양하였다. 배양 후 피펫으로 배지를 흡수하여 버리고, 배축 200본 당 킴타올 1매를 사용하여 배축에 남은 아그로박테리움 배양액을 닦아내었다. 배축을 본래의 MS-1 배지에 50본씩 나누어 치상한 후 파라필름으로 봉한 뒤, 뚜껑에 일자와 시간을 적고 3일간 25℃에서 암소 배양하였다.

(4) 캘러스 유도 배지에 계대 (파종으로부터 11일째)

B5-1배지[B5 salts, B5 vitamins, 1mgL^-12,4-D, 3%(W/V) 수크로오스, 500mgL^-1carbenicillin, 0.6%(W/V)agar, pH 5.8]의 샤레 1매에 40본씩 나열하였다. 배축이 흑색을 띄거나, 신장하였거나, 담배 현탁 배양액이 증식하여 여지 위로 올라와도 관계없다고 판단되었다. 캘러스 유도 배지는 써지컬 테이프로 봉하여 뚜껑에 일자를 적고 25℃에서 16시간 일장으로 캘러스가 충분히 유도되도록 10일간 배양하였다.

(5) 재분화 배지에 계대(파종으로부터 18일째)

B5-BZ배지[B5 염 및 비타민, 3mgL^-1 6-벤질아미노 퓨린 (BA), 1mgL^-1 제아틴 (zeatin), 500mgL^-1 카베니실린 및 50mgL^-1 카나마이신 및 하이그로마이신, 1%(W/V) 수크로오스, 0.6%(W/V)agar, pH 5.8]에 계대한다. 샤레 1매당 배축을 30본씩 나열하였다. 계대배양은 7일 후에 1회 및 14일 후에 2회씩 총 3회 실시하였다. AgNO₃는 최초 계대 배양 7일 동안만 첨가하였으며 항생제의 농도는 하이그로마이신의 경우, 10mgL^-1을 시작으로 10mgL^-1씩 높여가며 최종적으로 50mgL^-1까지 높여서 선발하였다. 또한 카나마이신은 10mgL^-1로 시작하여 20mgL^-1에서선발하였다. 2회째의 계대시는 21본, 3회째는 14본을 한 샤레에 나열하였다. 캘러스에서 신장해 있는 반투명인 신초와 컴팩트한 엽의 형을 하고 있지 않은 신초는 이탈 (escaping)이 많았고, 작고 아름다운 신초는 적중의 경우가 많았다. 형질전환된 신초는 늦게 나오는 경우가 많기 때문에 3회째의 계대가 끝나도 계속 계대하였다.

(6) 성숙 배지에 계대 (파종으로부터 60일째)

신초를 캘러스로부터 절출하여 B5-0배지[B5 염 및 비타민, 1%(W/V) 수크로오스, 50mgL^-1카나마이신 및 하이그로마이신, 500mgL^-1카베니실린, 0.6%(W/V) agar, pH5.8]의 샤레 1매에 신초를 4-5개씩 치상하였다. 치상 후 써지컬 테이프로 봉하여 3주간 배양하였고, 3주가 지나도 자라지 않은 신초는 다시 한 번 B5-0 배지에 계대하였다.

(7) 발근 배지에 계대(파종으로부터 81일째)

B5-0배지에서 신장한 신초의 남아있는 캘러스를 완전히 제거한 후 B5-R[B5 염 및 비타민, 1mgL^-1 인돌-3-부티르산 (IBA), 3%(W/V) 수크로오스, 50mgL^-1카나마이신 및 하이그로마이신, 500mgL^-1카베니실린, 0.6%(W/V) agar, pH 5.8]배지에 계대하였다. 너무 큰 것은 반정도 잘라서 재식하였다. B5-0배지에서 발근되어 있는 경우는 계대하지 않았다. B5-R에 옮길 때는 격자 상의 상처를 내어서 계대하는 등, 근을 자르지 않도록 주의하였다. 3주가 지나도 발근하지 않는 경우는 캘러스가 남아 있을 가능성이 있는 신초이기 때문에 뿌리 부분을 잘라 새로운 B5-R배지에 옮겼다.

(8) 순화(파종으로부터 102일째)

포트의 하부 구멍을 사방 2cm 종이로 막고 멸균한 흙 (버미큘라이트: 원예용 상토 = 1: 1)을 넣은 후 물을 주어 습하게 하였다. 증류수가 들어 있는 용기 속에다 각 배지에서 꺼낸 식물체를 구분하여 넣고 배지를 조심해서 떼어내었다. 뿌리 부분이 완전히 묻히도록 심고 라벨을 하였다. 포트마다 투명한 비닐봉지를 씌우고 5일 정도 경과한 후, 비닐봉지에 두 개 정도의 구멍을 뚫었으며, 그 후에 잎의 모양을 보면서 구멍을 크게 뚫어갔다. 최종적으로 10일 정도 지나면 비닐을 벗겨내었으며 2주 정도 배양실에서 키운 후 정식하였다.

4) PCR분석에 의한 형질전환체 확인

유전자 도입식물(T₀)은PCR분석에 의하여 확인하였다. 식물체의 잎에서 게놈성(genomic) DNA를 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)법을 이용하여 추출하였다. 0.2g의 잎을 채취하여 액체질소를 이용하여 잎을 미세하게 분쇄 후, DNA extraction buffer 200㎕ 및 2X CTAB 용액 200㎕를 넣고 20회의 invert로 혼합하였다. 이후 10% SDS를 넣고 조심스럽게 혼합한 후, 65℃에 20분간 방치하였다. 5M 칼륨 아세테이트 200㎕를 첨가한 후 혼합, PCI(25:24:1)를 700㎕ 넣은 후 5분간 invert하였다. 실온에서 12,000rpm, 10분간 원심분리하여 단백질을 분리해 내었다. 상층 400㎕ 정도를 새 1.5ml 튜브로 옮긴 후 400㎕의 이소프로판올로 DNA를 침전시켰으며 70%의 에탄올로 세척하였다. 에탄올을 완전히 건조시킨 후 RNase 10mg/ml를 넣고 50㎕의 DDW로 녹여 PCR에 사용하였다. RNAi 벡터가 도입된 형질전환체는 NPTⅡ 유전자를 검출하기 위하여 primer1(5'-CAA GAT GGA TTG CAC GCA GG-3'; 서열번호 21) 및 primer2(5'-GAA GAA CTC GTC AAG AAG GCG-3'; 서열번호 22)을 사용하였고, RNAi 특이적 밴드를 검출하기 위해 S⁹ 프로모터 primer1(5'-TAG TAC GTA CAA TCT GGT-3'; 서열번호 23) 및 S⁶⁰ 프로모터 primer1 (5'-CAA CCA TAA CAT TAA ACT TTA-3'; 서열번호 24)과 S⁹ 및 S⁶⁰ 공통 primer2 (5'-CCT TTG CCA CGT AAG TCC GC-3'; 서열번호 25)를 이용하였다. 각각의 PCR 증폭은 GeneAmp 9700(PERKIN-ELMER, USA)를 사용하여 예비-변성을 5분간 실시하였고, 변성을 94℃로 1분, 어닐링은 60℃로 1분간, 신장반응은 72℃에서 2분간 35회 실시하였다. RNAi 특이적 primer는 어닐링 온도만 52℃로 달리하여 증폭하였다.

5) 화분관 검경 및 RT-PCR법에 의한 SP11/SCR 의 사일런싱 확인 및 발현 검토

(1) 화분관 검경에 의한 자가화합성 개체 검토 및 선발

오염되지 않은 꽃의 주두에 신선한 화분을 묻혀 교배한 후, 1.5%의 agar 배지에 꽂아 24시간 실온에 방치하여 화분이 충분히 신장하도록 하였다. 아닐린 블루를 사용하여 염색한 후, 현광현미경에 의한 화분관 관찰을 실시하였다. 교배 24시간이 지난 꽃의 주두만 취한 후, 화분관을 고정하기 위하여 96 well plate에 에탄올: 아세트산 (3: 1) 용액을 넣고 5시간 이상 반응시켰다. 1N NaOH 용액으로 주두를 옮긴 후 60℃에서 2시간동안 normalization을 시켰다. 주두를 0.01% 아닐린 블루 용액에 옮겨 2시간 동안 화분관을 염색하였다.

(2) real time RT-PCR법에 의한 SP11/SCR 의 발현 검토

형질전환체의 미숙한 꽃봉오리에서 0.2g의 약을 채취하여 Straight A's mRNA　Isolation System (Novagen, Inc., Madison, Wis.) kit를 이용하여 mRNA를 추출하여 사용하였고, RT-PCR에는 Access RT-PCR System(Promega, USA)을 사용하였다. 5㎕의 AMV/Tfi 5 X Reaction buffer, dNTP Mix(10mM) 1㎕, primer1 (SP11S⁵²: ATG AAA TCC GTT CTT TAT GC(서열번호 26), SP11S⁶⁰: ATG AGA TAT GCT ACT TCT ATA TAT ACA(서열번호 28)) 및 primer2(SP11S⁵²: GCA TAT TTT ACA ACG ACA AAA TCG(서열번호 27), SP11S⁶⁰: TGA TTT AAC TTT GCA ACA GTA GCA(서열번호 29))를 1μM 넣고, 25mM MgSO₄를 2㎕, AMV Reverse Transcriptase(5u/㎕), Tfi DNA Polymerase(5μ/㎕) 1㎕, 템플릿 RNA를 2㎕ 넣은 후 X㎕의 Nuclease - Free Water로 채워 최종 부피가 25㎕가 되도록 조제하였다. PCR 조건은 45℃에서 45분, 1회 반응시키고 94℃에서 2분간 1회 반응켜 first strand cDNA를 합성하였으며, second strand cDNA 합성 조건으로 94℃ 30초, 55℃ 1분 및 68℃ 2분간 40회 반응한 후 68℃에서 7분간 최종 신장과정으로 증폭하였다.

(1-3) 자가화합성 계통 육성 및 자가결실율 분석

1) '소송채' T ₁ 세대의 RNAi 벡터 도입 개체 선발 및 개화유도

T₁ 세대를 72공 육묘트레이에 파종하여 5℃ 파이트트론에서 춘화처리 한 후, 정식하여 T₁세대를 진전시켰다. 이 중 자가화합성 개체를 선발하기 위하여 먼저 식물체의 잎을 채취하여 gDNA를 CTAB법에 의해 추출하였다. NPTⅡ 유전자를 검출하기 위하여 primer1 (5'-CAA GAT GGA TTG CAC GCA GG-3'; 서열번호 21) 및 primer2 (5'-GAA GAA CTC GTC AAG AAG GCG-3'; 서열번호 22)을 사용하였고, PCR증폭은 GeneAmp 9700 (PERKIN-ELMER, USA)를 사용하여 예비-변성 94℃에서 5분간 실시하였고, 변성을 94℃로 1분, 어닐링은 60℃로 1분간, 신장반응은 72℃에서 2분간 35회 실시하였다. NPTⅡ 유전자가 증폭된 개체는 SP11 RNAi 벡터가 들어간 개체로 결론지어 선발하였고, 선발된 개체는 식물체를 성장시켜 개화를 유도하였다.

2) '소송채' T ₁ 세대의 S -유전형 결정

선발된 개체의 S-유전형을 알아보기 위해 SP11 RNAi 벡터 구축시 들어가지 않은 영역, 즉 UTR(untranslation region) primer를 합성 (SP11S⁵² primer1: ATG AAA TCC GTT CTT TAT GC(서열번호 26), SP11S⁵² primer3: CGG AAA TTA AGC TGA TAT AT(서열번호 30), SP11S⁶⁰ primer1: ATG AGA TAT GCT ACT TCT ATA TAT ACA(서열번호 28), SP11S⁶⁰ primer3: CTC TGG ATG TTT CGT TGA TC(서열번호 31))하여 PCR법에 의해 결정하였다. Gene Amp 9700(PERKIN-ELMER, USA)를 사용하여 예비-변성을 94℃에서 5분간 실시하였고, 변성을 94℃로 30초, 어닐링은 52(S⁵²) 및 55℃(S⁶⁰)로 30초간, 신장반응은 72℃에서 2분간 35회 실시하였으며, 최종 신장은 72℃에서 5분간 실시하였다.

3) 화분관 검경 및 자가화합성 개체 선발

선발된 개체들의 화분관 검경을 실시하였다. 오염되지 않은 꽃의 주두에 신선한 화분을 묻혀 교배한 후 1.5%의 agar 배지에 꽂아 24시간 실온에 방치하여 화분이 충분히 신장하도록 하였다. 한 개체당 3개의 꽃을 교배하여 정확도를 높였다.

아닐린 블루 염색 후 현광현미경에 의한 화분관 관찰을 실시하였다. 교배 24시간이 지난 꽃의 주두만 취한 후 화분관을 고정하기 위하여 96 well plate에 에탄올 : 아세트산 (3 : 1) 용액을 넣고 5시간 이상 반응시켰다. 1N NaOH 용액으로 주두를 옮긴 후 60℃에서 2시간 동안 normalization을 시켰다. 주두를 0.01% 아닐린 블루 용액에 옮겨 2시간 동안 화분관을 염색하였다. 주두를 슬라이드글라스에 올려놓은 다음 50% 글리세롤을 몇 방울 떨어뜨려 산화를 막고, 커버글라스로 덮어 형광현미경 상에서 관찰하였다.

4) RT-PCR 및 Real time-PCR에 의한 SP11 의 사일런싱 확인

T₁세대의 미숙한 꽃봉오리에서 0.2g의 약을 채취하여 Straight A's mRNA　Isolation System (Novagen, Inc., Madison, Wis.) kit를 이용하여 mRNA를 추출하여 사용하였고, RT-PCR kit는 Access RT-PCR System (Promega, USA)을 이용하여 증폭하였다. 5㎕의 AMV/Tfi 5× Reaction buffer, dNTP Mix(10mM) 1㎕, primer1 (SP11S⁵²: ATG AAA TCC GTT CTT TAT GC(서열번호 26), SP11S⁶⁰: ATG AGA TAT GCT ACT TCT ATA TAT ACA(서열번호 28)) 및 primer2 (SP11S⁵²: GCA TAT TTT ACA ACG ACA AAA TCG(서열번호 27), SP11S⁶⁰: TGA TTT AAC TTT GCA ACA GTA GCA(서열번호 29))를 1uM 넣고, 25mM MgSO₄를 2㎕, AMV Reverse Transcriptase(5u/㎕), Tfi DNA Polymerase(5u/㎕) 1㎕, 템플릿 RNA를 2㎕ 넣은 후 X㎕의 Nuclease - Free Water로 채워 최종 부피가 25㎕로 되도록 조제하였다. PCR 조건은 45℃에서 45분, 1회 반응시키고 94℃에서 2분간 1회 반응시켜 cDNA를 합성하였으며, 94℃ 30초, 55℃ 1분, 68℃ 2분간 40회 반응한 후 68℃에서 7분간 최종 신장 과정으로 증폭하였다. mRNA를 템플릿으로 하여 Real-time RT-PCR을 실시하였으며 RT-PCR과 동일한 primer를 사용하였다. 또한 house keeping gene (primer1: 5'-GCG AGG GCA TGA CTC GTA AA-3'(서열번호 32), primer2: 5'-GCG ACT GGA AGA TGT TGC GTG T-3'(서열번호 33))을 이용하여 mRNA양을 보정하였다. SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO, Lot. 44160G4) 10㎕에 상기 primer1 (10uM)-0.4㎕ 및 primer2 (10uM)-0.4㎕, mRNA 2㎕, DDW로 채워 최종 부피가 20㎕로 되도록 조제하였다. Takara의 Smart Cycler System II를 이용하여 50℃에서 30분, 95℃ 15분간 cDNA를 합성한 후 Step 1: 94℃, hold 15 secs, Step 2: 53℃ , 30초 유지, Step 3: 72℃ , 30초 유지에서 40 회 반응시켰다.

5) 자가화합성 T ₁ 세대의 개화유도 및 T ₂ 자식종자를 획득

벌이나 나비 등 매개충의 출입을 막기 위해 하우스에 보호막을 치고 bud selfing 및 flower selfing을 이용하여 T₂자식종자를 획득하였다.

6) 항생제 선발

하이그로마이신 50mg?L^-1에서 선발하였다. 획득한 종자를 개체당 각 30립씩 소독하여 1/10 MS 배지 [1/10 MS salts stock, 1/10 vitamins, 하이그로마이신 50mg?L^-1,pH 5.8]에 치상하였다. 치상한 종자는 22-25℃에서 16/8시간 일장으로 14일간 배양하였다.

7) 자가화합성 T ₂ 세대의 Real-time PCR

형질전환체의 약으로부터 mRNA를 추출한 후 Access RT-PCR System(Promega, USA)을 이용하여 PCR 증폭하였다. 5㎕의 AMV/Tfi 5 X Reaction buffer, dNTP Mix (10mM) 1㎕, primer4 (SP11S⁶⁰: 5'- ACT AGA TGT GGG AGC TTG GAA ATG C-3') 및 primer5 (SP11S⁶⁰: 5'- CAA GTA ATC CTC GCA GGA TTT TGC -3')를 1uM 넣고, 25mM MgSO₄를 2㎕, AMV Reverse Transcriptase(5u/㎕), Tfi DNA Polymerase(5u/㎕) 1㎕, 템플릿 RNA를 2㎕ 넣은 후 X㎕의 Nuclease - Free Water로 채워 최종 부피가 25㎕로 되도록 조제하였다. PCR 조건은 45℃에서 45분, 1회 반응시키고 94℃에서 2분간 1회 반응시켜 first strand cDNA를 합성하였으며, second strand cDNA 합성 조건으로 94℃ 30초, 55℃ 1분, 68℃ 2분간 40회 반응한 후 68℃에서 7분간 final extension 과정으로 증폭하였다. 또한 mRNA를 템플릿으로 하여 Real-time RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR과 동일한 primer를 사용하였으며 mRNA량의 보정에는 house keeping gene (primer3: 5'-TCC TCA GTG GTG GTT CGA CCA T-3', primer4: 5'-GCG ACC ACC TTG ATC TTC ATG CT-3')을 이용하였다. Real-time PCR의 standard curve 작성을 위해 S60 sample의 cDNA (mRNA 사용량 기준 5ng/㎕)를 합성한 후 6 단계로 희석하여 이용하였다 (표 2). 희석된 cDNA를 템플릿으로하여 2종(SP11S⁶⁰ 및 actin)의 primer를 이용하여 정량 PCR을 수행하였다. SmartCycler II (TaKaRa)와 SYBR RT-PCR kit (Perfect Real Time)을 이용하였고, 증폭된 DNA와 결합한 SYBR Green I을 검출하는 방법을 사용하였다.

Target gene과 reference gene의 정량은 standard curve 범위 내에서 sample의 target gene과 reference gene의 발현을 정량하였다. 검출된 Ct값으로부터 standard curve를 이용하여 상대 발현량을 계산하였으며 각 sample에 대해 2반복으로 측정하고 평균값을 분석에 이용하였다. 각 샘플의 reference gene의 발현량을 1로 보정하고 (상대량-보정), 그 값에 대한 target gene의 발현량 (보정)을 계산하였다.

실시예 2: 결과 및 고찰

(2-1) SP11 클로닝 및 벡터 구축

1) SP11S ⁹ 및 SP11S ⁶⁰ 프로모터 영역 PCR 증폭 및 클로닝

B. rapa의 웅성측 자가불화합성 유전자 S⁹ 및 S⁶⁰ 유전자를 클로닝하여 SP11 classⅠ (SP11S⁹) 및 classⅡ (SP11S⁶⁰) 화분 특이적 프로모터를 작제하였다. '소송채'의 gDNA로부터 PCR 산물을 획득, 전기영동 후 아가로스 겔로부터 DNA 회수하였다. 회수산물은 TOPO TA 벡터(pCR 2.1)에 클로닝 하였고, E. coli에 형질전환시킨 후 plasmid를 추출하여 염기서열 분석 및 제한효소 링커의 위치를 확인(도 5)하였다.

2) SP11S ⁵² 및 SP11S ⁶⁰ RNAi 카세트 구축

SP11S⁵² 및 SP11S⁶⁰ RNAi 카세트를 각각 구축하기 위하여 도 6의 밑줄친 영역을 사용하였다.

(1) 안티센스, GUS(787??1809) 및 센스 영역의 PCR 증폭 (First PCR)

SP11 안티센스 영역의 PCR 증폭을 위하여 SP11 cDNA를 템플릿으로 이용하였으며, 표 1의 ①과 ②의 primer(서열번호 9 및 10, 서열번호 15 및 16)로 증폭하여 서열번호 38 및 39의 염기서열로 이루어진 SP11 안티센스 영역을 제조하였다. GUS 영역의 PCR 증폭(787~1809)은 pBI101 이원채 벡터를 템플릿으로 이용하였고, 표 1의 ③과 ④의 primer(서열번호 11 및 12, 서열번호 17 및 18)를 사용하여 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 영역을 제조하였다. SP11 센스 영역의 PCR 증폭은 SP11 cDNA를 템플릿으로 이용하여 표 1의 ⑤와 ⑥의 primer(서열번호 13 및 14, 서열번호 19 및 20)로 센스 영역을 증폭하여 서열번호 41 및 42의 염기 서열로 이루어진 SP11/SCR 센스 영역을 제조하였다 (First PCR).

(2) SP11 안티센스::GUS 및 GUS::SP11 센스의 PCR 증폭(Second PCR)

SP11 안티센스::GUS 연결된 영역의 PCR 증폭은 first PCR에 의해 증폭된 SP11 안티센스와 GUS 영역을 혼합하여 템플릿으로 이용하였고, 표 1의 ①과 ④의 primer(서열번호 9 및 12, 서열번호 15 및 18)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 연결하였다. GUS::SP11 센스가 연결된 영역의 PCR 증폭은 first PCR에 의해 증폭된 GUS와 SP11 센스영역을 혼합하여 템플릿으로 이용하였고, 표 1의 ③과 ⑥의 primer(서열번호 11 및 14, 서열번호 17 및 20)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 연결하였다.

(3) SP11 안티센스::GUS::SP11 센스의 PCR 증폭(Third PCR)

Second PCR 증폭에 의해 연결된 SP11 안티센스::GUS와 GUS::SP11 센스증폭 산물을 혼합하여 템플릿으로 이용하였으며, 표 1의 ①과 ⑥의 primer(서열번호 9 및 14, 서열번호 15 및 27)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 SP11 안티센스::GUS::SP11 센스(RNAi 카세트)를 연결하였다. 최종적인 Third PCR 산물은 전기영동 후 agarose 겔로부터 DNA 단편을 회수하였다. 회수된 산물은 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하고 염기를 확인한 Sal I과 Sac I으로 소화하여 pBI101 binary 벡터에 ligation 후 E. coli에 형질전환하였다(도 7 참조).

(2-2) Brassica rapa ('소송채')의 형질전환

1) B. rapa (‘ 소송채 ')의 RNAi 형질전환체 획득

(1) RNAi 형질전환체 및 프로모터 발현용 형질전환체(T ₀ 세대) 획득

아그로박테리움 매개법을 이용한 배축법에 의해 다수의 '소송채' 형질전환체를 획득하였다 {'소송채': SP11S⁶⁰ 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 카세트 (65개체), SP11S⁹ 프로모터::SP11S⁵² RNAi 카세트 (31개체)} (도 8).

(2) PCR법에 의한 RNAi 형질전환체의 유전자 도입 확인

형질전환체의 잎에서 gDNA를 CTAB법에 의해 추출한 후, NPTII 유전자 및 S9 및 S60의 프로모터 부분에서 합성한 특이적 primer로 PCR 증폭하여, RNAi 벡터의 유전자 도입 유무를 확인하였다(도 9).

(3) 화분관 검경

화분관 검경에 의하여 자가화합성(SP11S⁹ 프로모터::SP11S⁵² RNAi 이형성 벡터 및 SP11S⁶⁰ 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 이형성 벡터) 개체를 선발하였다(도 10). 선발된 형질전환체는 뇌수분에 의하여 T₁자식 종자를 획득하였다.

(2-3) 자가화합성 계통 육성 및 자가결실율 분석

1) 자가화합성 개체의 개화유도 및 T ₂ 자식종자 획득

벌이나 나비 등의 매개충이 들어오지 못하게 하우스에 보호망을 치고 bud selfing(BS) 및 flower selfing(FS)을 이용하여 자가화합성 26개체의 T₂자식종자를 획득하였다. T2 종자를 획득하는 과정에서 BS와 FS 두 방법 모두 자가결실이 되는 것을 화인하였다(도 11).

2) 자가결실성 계통 선발

획득한 T₂ 종자를 이용하여 하이그로마이신 50mg.L^-1에서 약제 선발을 실시하였다. 항생제 배지상에서 모두 살아남은 자가결실성(doubled haploid lines) 계통을 선발하였다. 또한 자가화합성 23개체 (SP11S⁶⁰ 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 카세트 및 SP11S9 프로모터::SP11S⁶⁰ RNAi 카세트)를 선발하였다. 또한 자가결실성 계통의 T₂ 종자를 파종 후 개화를 유도하여 화분관검경을 실시하였다. 그 결과 화분관이 완벽하게 신장하여 자가불화합성 (SI)이 자가화합성 (SC)으로 완벽하게 개변되었음을 확인하였다.

3) 자가결실성 계통의 SP11 발현분석 및 자가결실성 확인

자가결실성 계통은 real-time PCR을 이용하여 SP11 유전자의 발현량을 분석하여 SP11 유전자가 넉아웃 되었음을 확인하였으며, 자가결실성 계통 중 6-10이 가장 낮은 발현량을 나타내었다(도 12). 또한 SP11 유전자의 사일런싱이 확인된 3 계통은 flower selfing으로 자식종자를 획득하였다(도 13).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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배추속 식물의 자가불화합성(Self-interference, SI) 인자에 대한 RNA 간섭(RNAi) 카세트로서, 서열번호 43 및 44의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 RNAi 카세트.
제4항의 RNAi 카세트를 포함하는 벡터.
제5항에 있어서, RNAi 카세트의 프로모터를 더 포함하는 벡터.
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제5항의 벡터를 이용하여 형질전환된 배추속 식물체.
제8항에 있어서, 상기 배추속 식물체는 배추 (Brassica rapa. ssp.) 또는 소송채 (Brassica rapa. cv. Osome)인 식물체.
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