CN112522272B - 一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法，涉及植物基因工程技术领域。本方法主要是：①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6‑SMI2和BnS7‑SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；②根据BnS6‑SMI2基因的特异序列设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。本发明证明BnS6‑SMI2调控自交不亲和性，并利用CRISPR/Cas9创造了不同突变类型的株系；其自交后代表现明显的自交不亲和表型，为甘蓝型油菜自交不亲和杂交育种提供了新的种质资源，同时在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前景。

Description

一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法，具体是利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnS6-SMI2基因进行编辑，进而获得自交不亲和的油菜种质资源。
背景技术
油菜(Brassica napus L.)属芸薹科芸薹属，是我国重要的油料作物之一。杂种优势利用是提高甘蓝型油菜产量的重要途径。自交不亲和杂种是油菜杂种优势利用途径之一。与细胞质雄性不育和细胞核雄性不育相比，自交不亲和杂种优势利用具有育种程序简单、杂交种选育周期短、杂种优势强、亲本繁育程序简便、良种生产成本低等优势。
近年来，研究人员在芸薹科自交不亲和调控机制方面取得许多重要研究进展。芸薹科自交不亲和性主要受S单倍型内两个特异性识别的关键基因控制：S位点受体激酶SRK(S-locus receptor kinase)和花药外被蛋白SCR/SP11(S-locus cysteine richprotein/S-locus protein 11)。在杂合S单倍型白菜中，显性S单倍型产生SCRmethylation inducer 2(Smi2)调控隐性SCR转录水平表达，调控其自交不亲和性。迄今为止，甘蓝型油菜BnSmi2对其自交不亲和性的调控尚未被研究和应用。
目前，甘蓝型油菜自交不亲和系的创建主要有两种方法：一，将甘蓝型油菜与自交不亲和的白菜或甘蓝杂交创建自交不亲和甘蓝型油菜；二，利用转基因的方式，使调控甘蓝型油菜自交不亲和性的BnSCR1表达，创建自交不亲和甘蓝型油菜。这两种方法均存在着很大不足，前者需经过多代回交方可得到稳定遗传的自交不亲和油菜；后者自交不亲和性与转基因事件连锁，无法得到非转基因的自交不亲和油菜。
近年来，以CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats and CRISPR associated)技术为代表的基因组定点编辑技术成为植物育种技术的研究热点，同时也为油菜种质资源创新利用提供了安全、高效的新途径。
利用CRISPR/Cas9技术定点编辑BnS6-SMI2创制一种自交不亲和油菜新种质资源，为自交不亲和杂种新品种的培育和基础研究奠定基础，具有重要的理论和实践价值。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法；本发明的目的还在于BnS6-Smi2编辑自交不亲和油菜在杂种优势中的应用。
本发明的目的是这样实现的：
一、一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法(简称方法)
具体地说，本方法包括下列步骤：
①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6-SMI2和BnS7-SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
②根据BnS6-SMI2基因的特异序列设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；针对三个sgRNA序列设计的引物BnS6-SMI2-sR1-F、BnS6-SMI2-sR1-R、BnS6-SMI2-sR2-F、BnS6-SMI2-sR2-R、BnS6-SMI2-sR3-F、BnS6-SMI2-sR3-R序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
③构建三靶点基因编辑载体pRGEBn-BnS6-SMI2，载体构建所需引物L5AD5-F、L3AD5-R、S5AD5-F、S3AD5-R序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15所示；
④采用农杆菌转化的方式将pRGEBn-BnS6-SMI2载体转至受体材料‘326’中，获得转基因植株；
⑤在转基因后代中筛选阳性苗植株，利用特异引物进行扩增，并将PCR产物送天一辉远生物科技公司进行测序，将测序结果进行比对，确定编辑形式。
二、利用CRISPR/Cas9编辑BnS6-SMI2创制自交不亲和油菜种质的应用
通过CRISPR/Cas9编辑BnS6-SMI2，获得BnS6-Smi2编辑的突变体L3、L8和L19；进一步观测基因编辑BnS6-SMI2突变体的自交不亲和性状表型，发现突变体材料与受体材料相比表现明显的自交不亲和表型；证明BnS6-Smi2突变体可以控制甘蓝型油菜自交不亲和性；利用CRISPR/Cas9系统定向突变BnS6-Smi2获得稳定遗传的甘蓝型油菜的方法为甘蓝型油菜自交不亲和杂种选育提供了新的种质资源，在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前景。
本发明具有下列优点和积极效果：
①采用本方法在甘蓝型油菜中特异性敲除BnS6-SMI2基因，获得BnS6-SMI2不同突变类型的单株，其自交亲和性相比受体材料326显著降低；
②利用CRISPR/Cas9系统定向突变BnS6-SMI2获得自交不亲和且稳定遗传的甘蓝型油菜的方法为甘蓝型油菜自交不亲和杂种选育提供了新的种质资源，同时极大提高育种效率，大大加快育种进程；
③为扩大油菜新杂交品种的培育和基础研究奠定基础，具有重要的理论和实践意义。
总之，本发明证明BnS6-SMI2调控自交不亲和性，并利用CRISPR/Cas9创造了不同突变类型的株系，其自交亲和性比受体材料326显著降低；其自交后代表现明显的自交不亲和表型，表明这项技术能够快速获得自交不亲和且稳定遗传的甘蓝型油菜，为甘蓝型油菜自交不亲和杂交育种提供了新的种质资源，同时在油菜分子设计育种中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为pRGEBn-BnS6-SMI2载体示意图，其中：
包含一个由UBI启动子启动的Cas9、一个由35S启动子启动的HPTII(潮霉素抗性基因)、U3启动子启动tRNA-sgRNA表达元件组和BsaI酶切位点。
图2为本发明获得的T0代部分转基因单株的编辑类型分析图。
图3为本发明获得的突变体材料T1代部分株系编辑类型和自交结籽考察，其中：
3a为BnS6-SMI2基因模式图，深灰色表示BnS6-Smi2前体序列，浅灰色表示BnS6-Smi2，S1、S2和S3表示三个sgRNA；T1代L3、L8、L19株系BnS6-Smi2编辑类型；
3b、3c为突变体自交结籽差异，L3-3、L8-2、L19-1为不同突变类型株系；
图4为本发明获得的突变体T2代部分株系自交和正反交结籽考察，其中：
4a为突变体自交和正反交结籽表型差异，L8-2、L19-1为不同突变株系；
4b为突变体自交和正反交结籽表型统计差异，L8-2、L19-1为不同突变株系。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
下述试验方法如无特殊说明，均为本技术领域的常规方法和技术，所用试剂和耗材均可通过商业途径获取。
一、实施例
1、实施例1，基于CRISPR/Cas9系统定向突变甘蓝型油菜BnS6-SMI2载体的构建：
A、确定调控自交不亲和基因并确定基因编辑的sgRNA靶点序列
根据甘蓝型油菜参考基因组网站(http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus/index.php)中参考基因组ZS11的序列信息，鉴定出2个SMI2的同源序列，分别命名为BnS6-SMI2和BnS7-SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
将BnS6-SMI2基因序列提交CRISPR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)网站，筛选确定脱靶率低的基因编辑靶点序列sgRNA1(核苷酸序列号如SEQ ID NO.3所示，TGG为PAM序列)、sgRNA2(核苷酸序列号如SEQ ID NO.4所示，TGG为PAM序列)和sgRNA3(核苷酸序列号如SEQ ID NO.5所示，TGG为PAM序列)。
B、表达盒构建
以1ng的pGTR为模板进行PCR扩增；BnS6-SMI2-sR1-F、BnS6-SMI2-sR1-R、BnS6-SMI2-sR2-F、BnS6-SMI2-sR2-R、BnS6-SMI2-sR3-F、BnS6-SMI2-sR3-R、L5AD5-F、L3AD5-R的核苷酸序列号依次如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；分别以L5AD5-F和BnS6-SMI2-sR1-R、BnS6-SMI2-sR1-F和BnS6-SMI2-sR2-R、BnS6-SMI2-sR2-F和BnS6-SMI2-sR3-R、BnS6-SMI2-sR3-F和L3AD5-R引物对，建立如下PCR体系，以如下PCR程序扩增DNA片段：
Figure BDA0002867066950000041
纯化回收PCR产物，测量浓度，建立以下PCR反应体系：
Figure BDA0002867066950000042
Figure BDA0002867066950000051
将上一步反应产物用180ul ddH2O稀释，以稀释产物为模板，建立如下PCR体系，以如下PCR程序扩增DNA片段：
Figure BDA0002867066950000052
纯化回收PCR产物，FokI(NEB)酶切纯化回收后的PCR产物，1％琼脂糖凝胶切胶纯化回收FokI酶切产物，BsaI(NEB)酶切CRISPR/Cas9载体pRGEBn，纯化回收BsaI酶切后的载体pRGEBn；用T4 DNA连接酶(NEB)连接纯化回收的FokI酶切产物和纯化回收BsaI酶切后的载体pRGEBn。
C、构建三靶点基因编辑载体pRGEBn-BnS6-SMI2
取连接产物5ul转化大肠杆菌感受态DH5α，卡那霉素抗性的LB平板筛选抗性菌落，送天一辉远生物科技公司测序确定序列准确性；测序正确的克隆，提取质粒转化农杆菌感受态GV3101，挑取阳性单克隆，用于农杆菌介导的遗传转化，载体pRGEBn-BnS6-SMI2示意图如图1所示。
实施例2 pRGEBn-BnS6-Smi2载体转化至甘蓝型油菜下胚轴
1、种子灭菌及播种
挑选籽粒饱满的326种子，75％酒精浸泡1min，倒掉酒精；50％的84消毒8-10min，无菌水清洗3-5遍，每次浸泡5min。消毒后的种子，播种于M0培养基上，25℃暗培养5-6天。
2、菌液准备
播种3-4天后，取出-80℃保存的农杆菌，于三抗(卡那霉素、庆大霉素和利福平)LB平板上划线，28℃培养48h；挑取单菌落接种到三抗(卡那霉素、庆大霉素和利福平)LB培养基中(5mL)，28℃摇床(180r/min)培养24h。取100ul菌液接种到含100mL三抗(卡那霉素、庆大霉素和利福平)LB培养基的三角瓶中，28℃培养至OD600≈0.5-0.8(约需12-14h)；4000r/min离心10min收集菌液，加入等体积的DM培养基(AS终浓度为0.05mmol)重悬浮，倒入培养皿中备用。
3、侵染与共培养
取出暗培养6天的幼苗，用经高温杀菌的镊子和解剖刀切下下胚轴于DM溶液中(已加入AS)，切取时尽量快速垂直切下，保证切口平整，长度在0.8-1cm为好。切好后，加入事先准备好的菌液，浸染8-10min(时间不能过长)；倒出菌液，外植体铺于灭菌的滤纸上，吸取表面过多的菌液。用镊子将外植体均匀摆到M1培养基上，摆放时要让外植体两端充分接触到培养基，暗培养36-48h。
4、选择培养及愈伤诱导
将共培养后的外植体从暗处取出，转到选择及诱导愈伤的M2培养基上，其中12.5mg/L潮霉素为筛选抗生素，300mg/L的特美汀和硫代硫酸银抑制农杆菌过快生长及外植体褐化；外植体25℃16/8h培养2-3周诱导愈伤。
5、再分化
选择出来的外植体转到分化培养基M3上，每2周继代一次，期间淘汰褐化死亡的外植体，其中两端膨大并有绿点的外植体为佳。
6、芽生长与生根
待分化出来的芽苗建成植株形态后，用手术刀切下芽苗，插入M4培养基中生长4周；待生根后可先经光照培养箱炼苗后，可转到温室培养。
实施例3：转基因植株编辑情况检测
1、转基因植株DNA的提取
采集新鲜、幼嫩的组织材料，存放在2mL离心管中，放入钢珠后加入250ul的CTAB，在磨样机上研磨6min，再将剩下500ul的CTAB补加到离心管中。将有植物组织匀浆的离心管装到离心管盒里，然后放到65℃的水浴锅里进行水浴60min，每隔10-15min摇晃一次，原则是充分摇匀。将水浴好的匀浆放置冷却至室温，加入等体积的“24:1(氯仿：异戊醇)”溶液，摇床混匀10-15min，原则是混匀即可。然后12000rpm离心10min。将离心好的离心管按顺序摆放在操作板上，将上清液吸到新的1.5mL离心管中，吸取量为400ul，不能将位于上清液下面的残留组织吸到新离心管中。向上清液中加入等体积的冰乙醇，盖上离心管盖子，再轻轻摇晃几下，将冰乙醇与上清液充分混匀，放入-20℃的冰箱中静置30min。将静置后的离心管在12000rpm下离心7min，再倒掉上清液，加入500μL75％的乙醇后静置5-6min，在12000rpm下离心5min。将75％乙醇倒掉，然后将含有DNA的离心管置于室温进行自然晾干。加入200ulddH2O到晾干的含有DNA的离心管中进行DNA溶解，溶解时间大概为1天左右或者过夜，室温进行即可。
2、阳性苗的鉴定
利用引物pBnCas9-F、pBnCas9-R，其序列如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示，进行PCR扩增，水和326gDNA为阴性对照，质粒pRGEBn-BnS6-SMI2为阳性对照，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测。
3、PCR产物鉴定
在距离靶点sgRNA1、sgRNA3100-200bp左右设计特异引物BnS6-SMI2-2F、BnS6-SMI2-2R其序列如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示，选取阳性苗植株的DNA利用特异引物进行扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测后将PCR产物送天一辉远生物科技公司进行测序，将测序结果进行比对，确定编辑形式。
4、TA克隆
对测序双峰的植株利用特异引物进行PCR扩增，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后对PCR产物进行回收。回收后将片段和PMD18-T载体在22℃连接3小时，然后进行大肠杆菌DH5α热激转化，氨苄霉素抗性的LB平板筛选抗性菌落，PCR检测，检测引物为M13-47，M13-48其序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示，检测后挑选单克隆送天一辉远生物科技公司测序，将测序结果进行比对，确定编辑形式，其编辑类型如图2所示。
实施例4：基因编辑植株表型观察
为进一步观测基因编辑BnS6-Smi2编辑类型突变体自交不亲和表型，对T1和T2代突变体自交不亲和性进行考察。
对T1代突变体自交不亲和性考察如图3所示，突变体材料与受体材料相比，其自交结籽明显减少，表明BnS6-Smi2可能抑制油菜自交亲和性。
为进一步确定BnS6-Smi2突变体是自交不亲和的，对T2代突变体材料自交不亲和性进行自交和正反交考察如图4所示，突变体材料花粉授到受体材料326柱头上是不结籽的，326花粉授到突变体上是结籽的。证明BnS6-Smi2突变体是自交不亲和的且其表型可稳定遗传。
本发明涉及到的培养基如下：
LB(1L)：10g Peptone+5g Yeast extract+10g NaCl；
固体LB(1L)：10g Peptone+5g Yeast extract+10g NaCl+10g Agar；
M0(400ml)：0.44g MS+2g Sucrose(5g/L)+2.4g Agarose；
DM(200ml)：0.88g MS+6g Sucrose(30g/L)+200uL(灭后加)AS(100uM)；
M1(400ml)：1.76g MS+12g Sucrose(30g/L)+7.2g Mannitol(18g/L)+400uL 2，4-D(1.0mg/L)+400uL KT(0.3mg/L)+400uL AS(100uM)+2.4g Agarose；
M2(400ml)：1.76g MS+12g Sucrose(30g/L)+7.2g Mannitol(18g/L)+400uL 2，4-D(1.0mg/L)+400uL KT(0.3mg/L)+2.4g Agarose+60uL STS+100uL Hyg(12.5mg/L)+400uLTMT(300mg/L)；
M3(400ml)：1,76g MS+4g Glucose(10g/L)+0.1g Xylose(0.25g/L)+0.24g MES(0.6g/L)+2.4g Agarose+40uL IAA(1mg/L)+400uL TMT(300mg/L)+400uL TZ(2mg/L)+100uL Hyg(12.5mg/L)；
M4(400ml)：1.76g MS+4g Sucrose(10g/L)+4g Agarose；
STS：[Ag(SO3)2]3-现用现配，时间过长有沉淀；
母液：硫代硫酸钠，0.1M(1.58g溶于100mLddH2O)；AgNO3，0.1M(1.7g溶于100mLddH2O)VNa2SO3:VAgNO3＝4：1，将AgNO3溶于硫代硫酸钠中；
2，4-D：1mg/mL母液，0.25g 2，4-D加入少量95％酒精和1M的NaOH溶液，定容至250mL；
KT：0.03g KT先溶于1M HCL中，加水定容至100mL；
AS：100mmol/L母液，0.392gAS先溶于少量甲醇中，再加二甲基亚砜，定容至20mL；
TZ：反式Zeatin(玉米素)，2mg/mL母液，称0.04gTZ粉末溶于少量75％
酒精中，加水定容至20mL；
IAA：1mg/mL，100mgIAA溶于少量1mol/LNaOH中，再加ddH2O定容至100mL，抽滤分装，保存于-20℃；
Kana(100mg/mL)：10g卡那粉末溶于100mL灭菌的ddH2O中，震荡混匀，抽滤分装，保存于-20℃；
TMT：(300mg/mL)3.2g特美汀粉末溶于10.6mL灭菌的ddH2O中，震荡混匀，抽滤分装，保存于-20℃；
HYG(50mg/mL)：1g潮霉素B溶于20mL灭菌的ddH2O中，震荡混匀，抽滤分装，保存于-20℃。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界，或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种新的自交不亲和油菜种质的创制方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcttcactc ctcttcctcc accctactcc aactttctca ctttttctac catgtgttct 60
acattttcct atttctcttc attcttcact cttcactctc ctttttaact cctctttttt 120
cttcctcctc cttctatact tctccctctt gctcctccct attcactctt catttctctc 180
ttttcatttc cttgtactat tattattgtt atattactaa ggaaatcaaa ttctttattt 240
ttagttacat ttctgtttaa aaatctattt tatattgata ttatagatga aagagtattc 300
tgtttttgtg tgcgttgaat atacacatgc gctgtaaaca ttgcaatgtc cagttgtatt 360
gtaaattgac acatatttta agagatggtt attttgtaaa ttattatcgt ataatggtta 420
tataacaagt taaccctatg ttaattgtca ctctttttcg cttgaacatt tagaacacac 480
cttatttgtg tatatctttg tgaccgagac tcacacgtga tctataacgt gtcaagtaac 540
aacaaagtta tacatgtata aggtgtgttt ctgaatcttt acgtgtaaag aaagacactt 600
ataatttata tgagcataaa tatatatttt accaataaga cacacatata tattaaatat 660
<210> 2
<211> 706
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcttcactc ctcttcctcc accctactcc cactttctca ctttttccaa catgtgacat 60
tttcctattt ctcttcattc ttcacttttc acgtttcact cttcactctc ctttttcatt 120
ccccttcatt cttcctcctt ctatacttat ccctctttat cctccctact cactcctcat 180
ttctctcttt tcattttctt gtactattat tattgttata ttacaaagga aatcaaattc 240
ttttattttt agttacattt ctgtttaaaa atctatttta tattgatatt ataaatacaa 300
gagtattctg tttttgtgtg tgttaaatat atacatgcgc tgtaaagtta gcaatgtcca 360
tttgtattat aaattgacac atattttaag agatggttat tttattactt attatcgtat 420
aatggttatt caacaaatta accctatgtt aatttggtta attgtcactc ttttgcacgt 480
gaacattcag aacacacgtt attcgtgtat atctttgtga ctgatagact cacaagtagt 540
ctataacgtg ttgataacgt gtcaagtaac gacaaaggta tacacgtaca aggtgtgttt 600
ctgaatattt acgtgtaaag aaagacactt ataatatata tgtgatagca agatatgaac 660
ataaatatac attttaccaa taaaacacac atatatatat atatat 706
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggagaagta tagaaggagg agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacaaagata tacacaaata agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatagatcac gtgtgagtct cgg 23
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taggtctcct atagaaggag ggttttagag ctagaa 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggtctcat atacttctcc ctgcaccagc cgggaa 36
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taggtctcca tatacacaaa tagttttaga gctagaa 37
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggtctcaa tatctttgtg tgcaccagcc gggaa 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taggtctccc gtgtgagtct gttttagagc tagaa 35
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggtctcac acgtgatcta tatgcaccag ccgggaa 37
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggt cacaaagcac cagtgg 46
<210> 13
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggt c 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa c 31
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaagtgaaat acgtgaccga ggga 24
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gattgtcttg ccggactgct tg 22
<210> 18
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<212> DNA
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tccaccctac tccaactttc tca 23
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gccagggttt tcccagtcac gac 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agcggataac aatttcacac agga 24

Claims (2)

1.一种利用CRISPR/Cas9编辑BnS6-SMI2创制自交不亲和油菜种质的方法，其特征在于包括下列步骤：
①在隐性亲和系油菜基因组中鉴定出2个SMI2的同源序列：分别命名为BnS6-SMI2和BnS7-SMI2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；
②根据BnS6-SMI2基因的特异序列设计基于CRISSPR/Cas9的三个sgRNA，sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；针对三个sgRNA序列设计的引物BnS6-SMI2-sR1-F、BnS6-SMI2-sR1-R、BnS6-SMI2-sR2-F、BnS6-SMI2-sR2-R、BnS6-SMI2-sR3-F、BnS6-SMI2-sR3-R序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；
③构建三靶点基因编辑载体pRGEBn-BnS6-SMI2，载体构建所需引物L5AD5-F、L3AD5-R、S5AD5-F、S3AD5-R序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；
④采用农杆菌转化的方式将pRGEBn-BnS6-SMI2载体转至受体材料‘326’中，获得转基因植株；
⑤在转基因后代中筛选阳性苗植株，利用特异引物进行扩增，并将PCR产物送天一辉远生物科技公司进行测序，将测序结果进行比对，确定编辑形式。
2.按权利要求1所述方法在创制甘蓝型油菜自交不亲和性种质资源的应用，其特征在于：
通过CRISPR/Cas9编辑BnS6-SMI2。
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