CN106566834A - 瘿椒树dyt1基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及瘿椒树DYT1基因，该基因的序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明的方法首次有效地克隆出雄全异株植物瘿椒树绒毡层发育核心转录因子DYT1基因的全序列，通过本发明所提供的引物组成和克隆方法，能够快速准确的得到瘿椒树DYT1基因的全序列，为后续进行DYT1分子调控机制，及对利用基因工程手段进行植物遗传育种打下重要理论基础。

Description

瘿椒树DYT1基因

技术领域

本发明涉及一种基因及克隆方法，特别是瘿椒树DYT1基因。

背景技术

瘿椒树(Tapiscia sinensis Oliver.)，也称银鹊树，属于瘿椒树科(Tapisciaceae)，瘿椒树属(Tapiscia Oliver.)，为我国特有的稀有古老树种，第三纪冰川孑遗植物，该树种分布虽广，但由于种子发育周期长，自然更新能力差，以及长期人为破坏，导致各居群内的个体数量急剧减少，使该植物已处于濒危状态。被列为国际自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录和中国国家三级保护植物(应俊生和张玉龙，1994；IUCN，2015)。

瘿椒树为雄全异株繁育系统，雄全异株(Androdioecy)繁育系统是被子植物中最为罕见的一类，为雄花、两性花异株，种群中雄性个体和两性个体共存。对瘿椒树独特的雄全异繁育系统的研究，有助于阐明雄全异株的演化途径，维持机制，及弄清雄全异株在雌雄同花向雌雄异株演化中所扮演的角色，同时在探明被子植物繁育系统的进化动力和演化方向、植物进化生活史方面具有重要理论意义。近些年来，有关瘿椒树的研究主要集中在分类学、形态解剖学、生态学、发育生物学、引种驯化繁殖、果实越冬策略及开花动态等方面。对基因克隆方面研究很少，尤其是绒毡层发育相关核心转录因子DYT1基因的克隆对瘿椒树两性花雄性繁殖适合度远低于雄性的分子机制的研究具有重要理论意义。

花是植物的繁殖器官，尤其是对于粮食作物，为动物和人类提供了食物的主要来源。植株雄性不育是指植物在有性繁殖过程中不能产生正常的花药、花粉或雄配子的遗传现象。雄性不育是作物育种和农业生产上杂种优势利用的重要途径，利用杂种优势产生的子代，体型增大、产量提高，在抗病、抗虫、抗逆力、成活力、生殖力、生存力等方面也具有优势。花药是植物的雄性生殖器官，是花粉发育的场所，而绒毡层，是四层花药壁细胞的最内层，与配子体直接相连，负责将雄配子体发育所需的营养物质从孢子体组织中输送过来，在小孢子或花粉的形成和发育过程中起着至关重要的作用，绒毡层结构和功能异常会导致花粉的败育，从而使植物雄性不育。拟南芥中DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT1)编码一个与花药发育以及绒毡层功能行使过程密切相关的basic helix-loop-helix(bHLH)家族转录因子(Zhang et al.，2006)。原位杂交结果显示，其在花药发育早期绒毡层及小孢子表达，控制着相当多下游基因的表达。在DYT突变体中，绒毡层结构和功能异常，导致雄性不育。水稻中UDT1与拟南芥DYT1直系同源，通过T-DNA插入Udt1基因可以获得水稻雄性不育株系(Junget al.，2005)。因此，对雄全异株植物瘿椒树绒毡层发育核心转录因子DYT1基因的克隆为后续利用基因工程手段生产雄性不育植株，获得高产、抗病抗逆等优势性状作物奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供瘿椒树DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT1)基因。

本发明的瘿椒树DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT1)基因序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本发明基因获取方法如下：

(1)以发育早期的瘿椒树花蕾为实验材料，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存，提取总RNA；

(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，以3′RACE Adaptor primer为引物进行反转录反应，合成3′-RACE-Ready cDNA。利用本实验室前期转录组测序得到的基因片段设计3′RACE外向引物和内向引物，进行巢式PCR得到瘿椒树DYT1的3′末端序列；

(3)以步骤(1)得到的总RNA为模板，以oligo(dT)primer为引物进行反转录反应，合成5′-RACE-Ready cDNA，利用本实验室前期转录组测序得到的基因片段设计5′RACE外向引物和内向引物，进行巢式PCR得到瘿椒树DYT1的5′末端序列；

(4)将已知片段、3′末端序列、5′末端序列，用DNAMAN 8.0进行拼接，得到DYT1的cDNA全长序列，在5′UTR区(非编码区)和3′UTR区(非编码区)，根据得到的序列设计引物，以步骤3)得到的5′-RACE-Ready cDNA为模板，PCR进行全长验证，得到瘿椒树DYT1基因ORF(开放阅读框)。

本发明的有益效果：

本发明的方法首次有效地克隆出雄全异株植物瘿椒树绒毡层发育核心转录因子DYT1基因的全序列，通过本发明所提供的引物组成和克隆方法，能够快速准确的得到瘿椒树DYT1基因的全序列，为后续进行DYT1分子调控机制，及对利用基因工程手段进行植物遗传育种打下重要理论基础。

附图说明

图1是瘿椒树发育早期花蕾总RNA琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2是瘿椒树DYT1基因3′-RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳结果图；

图3是瘿椒树DYT1基因5′-RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳结果图；

图4是瘿椒树DYT1基因cDNA全长片段扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

以瘿椒树发育早期花蕾为实验材料，液氮速冻后置于-80°超低温冰箱保存备用。

一、总RNA提取及检测：

采用RNAprep Pure Plant Kit(天根)提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳及ThermoNanoDrop 2000对纯度及浓度进行检测，合格后进行下步实验。如图1中RNA泳道所示，总RNA中28S rRNA和18S rRNA条带清晰，且28S rRNA亮度是18S rRNA亮度的两倍，OD260/OD280＝2.01，图1中M为DL2000 DNA Marker(TaKaRa)，说明提取的总RNA完整性好，纯度高，可以用于下游实验。

二、第一链cDNA合成

3′-RACE-Ready cDNA的合成：

(1)在RNase-Free的PCR管中配置下列反转录反应液，并短暂离心：

(2)在PCR仪中，42℃孵育60min，70℃孵育15min。

(3)反应结束后可以直接进行3′RACE实验或将反应产物于-20℃备存。

5′-RACE-Ready cDNA的合成：

(1)在RNase-Free的PCR管中配置下列反应液，并短暂离心，室温放置至步骤(6)：

(2)另取RNase-Free的PCR管，配置下列反应液并短暂离心

(3)在PCR仪中72℃孵育3min，42℃孵育2min。反应结束后离心10s，将反应液收集在离心管底部。

(4)向步骤(2)离心管中加入1μl SMARTer II A Oligonucleotide，短暂离心，得到12μl混合液。

(5)向步骤(1)离心管中配置下列反应液并短暂离心。

(6)将步骤(5)离心管中配置的8.0μl混合液加入到步骤(4)得到的12μl混合液中，得到20μl混合液。

(7)用移液器轻柔混匀，短暂离心。

(8)在PCR仪中42℃孵育90min，70℃孵育10min。

(9)用Tricine-EDTA Buffer稀释得到的第一链反应产物。

如果总RNA量＜200ng，则加入10μl

如果总RNA量＞200ng，则加入90μl

(10)反应产物可以直接进行5′RACE实验或将反应产物于-20℃备存。

三、DYT1基因的3′-RACE末端扩增

根据转录组测序获得的DYT1基因片段设计3′RACE特异性外向及内向引物，利用3′-Full RACE Core Set(TaKaRa)试剂盒进行3′RACE末端扩增。基因特异性引物如下：

DYT1-GSP1：5′-AAGCATATACAGAACAGGGAGC-3′

DYT1-GSP2：5′-AAACGAGGCGGATTCACTAA-3′

Outer PCR反应：

(1)在PCR管中配置下列反应液，并短暂离心

(2)进行PCR反应，反应条件：

(3)PCR反应结束后，取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。因为所得条带不清晰，所以进行Inner PCR反应，剩余1st产物于-20℃备存。Inner PCR反应：

(4)在PCR管中配置下列反应液，并短暂离心

(5)进行PCR反应，反应条件：

(6)PCR反应结束后，取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3′RACE扩增产物，如图2中A泳道所示，此步得到了长度600bp左右的清晰条带。图2中M为DL2000 DNAMarker(TaKaRa)。

(7)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶回收后，克隆至pMD^TM19-T Vector(TaKaRa)后进行DNA测序。

四、DYT1基因的5′RACE末端扩增

根据转录组测序获得的DYT1基因片段设计5′RACE特异性外向及内向引物，利用SMARTer RACE 5′/3′Kit(Clontech)进行5′末端扩增。基因特异性引物如下：

5-DYT1-GSP：5′-CCAGCAATTTAGTGAATCCGCCTCGT-3′

5-DYT1-NGSP：5′-TGCTCCCTGTTCTGTATATGCTTCCA-3′

Outer PCR反应：

(1)在PCR管中配置下列反应液，并短暂离心。

(2)进行PCR反应，反应条件：

(3)PCR反应结束后，取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。若目的条带清晰，可不进行第二轮PCR。1st产物于-20℃备存。

Inner PCR反应：

(1)在PCR管中配置下列反应液，并短暂离心。

(2)进行PCR反应，反应条件：

(3)PCR反应结束后，取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认5′RACE PCR扩增产物。如图3中B泳道所示，此步得到了长度700bp左右的清晰条带。图3中M为DL2000 DNAMarker(TaKaRa)。

(4)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶回收后，克隆至pMD^TM19-T Vector(TaKaRa)后进行DNA测序。

五、瘿椒树DYT1基因cDNA全长克隆

(1)用DNAMAN 8.0将已知片段、3′端序列、5′端序列进行拼接，得到DYT1基因的cDNA全长序列，进行翻译之后，进行起始密码子和终止密码子查找后，分别在起始5′UTR区(非编码区)和3′UTR区(非编码区)位置处设计引物以，5′-RACE-Ready cDNA为模板，PCR进行全长验证。引物序列如下：

DYT1-CDS-F：5′-CTGCCTCTCTCCAACTAAAAATC-3′

DYT1-CDS-R：5′-CATGTACGATAACTAGTAAATTGAA-3′

(2)在PCR管中配置下列反应液，并短暂离心：

(3)进行PCR反应，反应条件：

(4)PCR反应结束后，取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认cDNA全长扩增产物。如图4中C泳道所示，此步得到了长度760bp左右的清晰条带。图4中M为DL2000 DNAMarker(TaKaRa)。

(5)对平末端DNA片段需要进行加“A”处理。在PCR管中配置下列反应液，并短暂离心：

dNTP Mixture(2.5mM each) 3μl

TaKaRa LA Taq(5U/μl) 0.5μl

反应体系(2)产物 50μl

(6)在PCR仪中72℃孵育20min。

(7)将孵育后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(8)利用Universal DNA Purification Kit(天根)进行切胶回收，具体步骤如下：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。

3)向胶块中加入等体积溶液PC(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μl PC溶液)，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块，胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱。为了提高DNA的回收量，此步可重复。

4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

5)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

6)重复操作步骤5。

7)将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于37℃烘箱，打开盖子静置5分钟，彻底晾干。

8)将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加35μl的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液。得到DNA产物可直接用于下步连接反应或者于-20℃备存。为了提高DNA的回收量，此步可重复。

(8)连接转化，具体步骤如下：

1)在PCR管中按照顺序配置下列反应液，并短暂离心：

2)在16℃连接仪中连接2小时

3)将10μl连接产物，加入至50μl DH5α(TaKaRa)感受态细胞中，冰中放置30分钟。

4)42℃水浴热激90秒，然后迅速转移到冰浴中放置2分钟，该过程不要摇动离心管。

5)加入800μl不含抗生素的液体LB培养基，37℃振荡培养60分钟，使菌体复苏。

6)6000rpm离心1min，去除培养基至剩余300μl，用枪头吹吸混匀离心管中的菌液，吸取150μl已转化的感受态细胞加到含氨苄抗生素的LB固体培养基上，用无菌涂布器涂布均匀，37℃过夜培养。

7)挑选阳性克隆，将单克隆菌株挑入500μl含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，置于37℃摇床中培养2h。

8)菌液的PCR检测和测序：

在PCR管中按照顺序配置下列反应液，并短暂离心：

9)进行PCR反应，反应条件：

10)反应结束后，用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，若能得到目的片段，则证明重组质粒构建成功。将转化成功的菌液送至上海生工生物技术公司进行测序。

核苷酸序列表电子文件

<110西北大学

<120>瘿椒树DYT1基因

<141>

<160>

<210>1

<211>925

<212>DNA

<213>瘿椒树DYT1基因cDNA全长核苷酸序列

<220>

<223>

<400>1

1 ACATGGGGACTGTTGCAAGAGTTCTCTGCCTCTCTCCAACTAAAAATCTC

51 CAGCAGTGACCAACCTTCCTGAAAATGGAGTTTGCATGCTCTGCCTTGGA

101 TGAATTGTGCATAACTGAAGAAGGTGCCGGTAAGCCAGGAAGGATGGGTC

151 GGAGGAGTCACAGCTATGAAATAGATACCACAATGTACAAATCTAAGAAC

201 CTCCACGCCGAGAGACGTAGGAGGCAGAAGCTCAGTGACAGGCTCCTGGC

251 GCTGCGTGCATTAGTCCCAATTATCACAAATATGAATAAAGCAACAATAA

301 TTAAGGATGCAATTACCTACATACAAGAGCTGCAGATGAATGTAAAGGTT

351 CTCAGTGACCAGCTTCTTGAAATGGAAGCATATACAGAACAGGGAGCAAA

401 GCCAAGGAGCGATGAGGTCGATGCTGCAGAAGAGATGAAGAAACGCGGGA

451 TAAAGGAAGATGTTAAGGTGACTAATATTGATGGGAACAAGCTTTGGATA

501 AAGATTATCTTTGAGAAGAAACGAGGCGGATTCACTAAATTGCTGGAGGC

551 CATGACTTACCTTGGCTTTGAACTCACTGATACCAGTGTTACTACCTCCA

601 AAGGAGCAACTCTTGTTTCATCCTGTGTAGAAGGAACTTATGGTGATATG

651 CCAGCAGCTCAGCAAGCAAGGGAGATGCTGCTAGAAATTATCAGAGGCAT

701 ATAAAGATCAATTCTGGAAGTGTTATTCATCATTCATTGATTTATGACAT

751 TACAAAGAAGATGTCTACATTGCTGCAGTAATATTAAGAATTTTCAATTT

801 ACTAGTTATCGTACATGATCTGATAAACTTTGATAAGTAATTCACTAAGT

851 CTGGATATTAAGAAATAATATGTGCATGTTAAATTAAGAATGATATGATG

901 TTAGTGGATTGACCCAAAAAAAAAA

<210>2

<211>630

<212>DNA

<213>瘿椒树DYT1基因cDNA的ORF（开放阅读框）核苷酸序列

<220>

<223>

<400>2

1 ATGGAGTTTGCATGCTCTGCCTTGGATGAATTGTGCATAACTGAAGAAGG

51 TGCCGGTAAGCCAGGAAGGATGGGTCGGAGGAGTCACAGCTATGAAATAG

101 ATACCACAATGTACAAATCTAAGAACCTCCACGCCGAGAGACGTAGGAGG

151 CAGAAGCTCAGTGACAGGCTCCTGGCGCTGCGTGCATTAGTCCCAATTAT

201 CACAAATATGAATAAAGCAACAATAATTAAGGATGCAATTACCTACATAC

251 AAGAGCTGCAGATGAATGTAAAGGTTCTCAGTGACCAGCTTCTTGAAATG

301 GAAGCATATACAGAACAGGGAGCAAAGCCAAGGAGCGATGAGGTCGATGC

351 TGCAGAAGAGATGAAGAAACGCGGGATAAAGGAAGATGTTAAGGTGACTA

401 ATATTGATGGGAACAAGCTTTGGATAAAGATTATCTTTGAGAAGAAACGA

451 GGCGGATTCACTAAATTGCTGGAGGCCATGACTTACCTTGGCTTTGAACT

501 CACTGATACCAGTGTTACTACCTCCAAAGGAGCAACTCTTGTTTCATCCT

551 GTGTAGAAGGAACTTATGGTGATATGCCAGCAGCTCAGCAAGCAAGGGAG

601 ATGCTGCTAGAAATTATCAGAGGCATATAA

<210>3

<211>209

<212>DNA

<213>瘿椒树DYT1基因编码的氨基酸序列

<220>

<223>

<400>3

1 MEFACSALDELCITEEGAGKPGRMGRRSHSYEIDTTMYKSKNLHAERRRR

51 QKLSDRLLALRALVPIITNMNKATIIKDAITYIQELQMNVKVLSDQLLEM

101 EAYTEQGAKPRSDEVDAAEEMKKRGIKEDVKVTNIDGNKLWIKIIFEKKR

151 GGFTKLLEAMTYLGFELTDTSVTTSKGATLVSSCVEGTYGDMPAAQQARE

201 MLLEIIRGI

Claims (1)

1.瘿椒树DYT1基因，其特征在于，该基因的序列如SEQ.ID.NO.1所示。